DE69933468T3

DE69933468T3 - Adenovirus-vermittelte gentherapie

Info

Publication number: DE69933468T3
Application number: DE69933468T
Authority: DE
Inventors: Seppo YLA-HERTTUALA; Anu-Maaria Sandmair; Sami LOIMAS; Matti Vapalahti
Original assignee: Ark Therapeutics Ltd
Current assignee: Ark Therapeutics Ltd
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2012-01-19
Anticipated expiration: 2019-11-06
Also published as: CY1106198T1; AU1385100A; JP4733833B2; ES2273521T3; CA2348624A1; EP1135513B2; EP1135513A1; HUP0104046A2; PL193076B1; JP2002529097A; GB9824437D0; KR20020013473A; PT1135513E; NO330776B1; DE69933468D1; US6579855B1; NO20012220L; CN1325450A; NO20012220D0; CN1184321C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Behandlung von Hirntumoren unter Verwendung von Gentherapie.
Hintergrund der Erfindung
Die Behandlung von malignen Gliomen stellt eine andauernde Herausforderung für Ärzte und Wissenschaftler dar. Eine Thymidinkinase-Gentherapie unter Verwendung des Thymidinkinasegens des Herpes simplex-Virus (HSVtk) ist eine der vielversprechendsten Behandlungsmodalitäten im Bemühen, das Überleben von Patienten mit malignen Gliomen zu verändern. Die HSVtk-Gentherapie beruht auf der Fähigkeit der Thymidinkinase, die Phosphorylierung von Ganciclovir (GCV) zu katalysieren. Phosphoryliertes GCV wirkt als ein toxisches Nukleotidanalog, welches zum Tod der Zielzellen führt. Dieses Phänomen wird weiter verstärkt durch einen Nebeneffekt, wobei benachbarte Zellen ebenfalls zerstört werden, sogar ohne Transfektion. Es wird angenommen, dass dieser Effekt auf die Freisetzung von toxischen Nukleotidanaloga aus den transfizierten Zellen an benachbarte Zellen über offene Zellkontakte zurückzuführen ist.
Retroviren und Adenoviren sind als Vektoren für die Gentherapie verwendet worden. Beide Vektoren haben bestimmte Vorteile und Einschränkungen. Hirntumore sind für einen retroviral vermittelten Gentransfer besonders geeignet, da Retroviren nur proliferierende Zellen infizieren können, während normales, sich nicht teilendes Hirngewebe intakt bleibt. Die Gentransfer-Effizienz von Retroviren ist relativ niedrig, könnte aber verbessert werden durch Verwendung von Retrovirus-verpackenden Zellen anstelle von isolierten Viren. Die Transduktionszeit kann theoretisch verlängert und die Anzahl von transfizierten Zellen erhöht werden. Bei Retroviren baut sich das transfizierte Gen in das Genom der Zielzelle ein und dementsprechend kann eine Langzeit-Genexpression erzielt werden.
Experimentelle Gliome sind mit einer adenoviral vermittelten Gentherapie durch Transduzieren von Tumorzellen in situ mit replikationsdefekten ADV, welche das HSV-tk-Gen tragen, behandelt worden: Perez-Cruet et al., 1994. Journal of Neuroscience Research, 39: 506, und Chen, S.-H., et al., 1994, PNAS, 91: 3054.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung, dass eine Behandlung von Hirntumoren wirksamer bewerkstelligt werden kann, wenn ein Adenovirus als das Vehikel, um das Gen in Tumorzellen zu transferieren, verwendet wird.
Ein Adenovirus umfasst ein Thymidinkinase kodierendes Gen, und Arzneimittel, die dieses enthalten, sind nützlich für das Behandeln eines Hirntumor-Hohlraums, gemäß Anspruch 1. Der Tumor-Hohlraum wird insbesondere nach Verabreichung von Ganciclovir oder einer äquivalenten Verbindung behandelt.
Das Thymidinkinasegen wird typischerweise jenes sein, das von dem Herpes simplex-Virus abgeleitet ist (HSVtk).
Es erweist sich, dass das Adenovirus/Thymidinkinasegen-Konstrukt nützlicher ist als ein retroviraler Gentransfer.
Beschreibung der Erfindung
Ein Konstrukt der Erfindung kann verwendet werden, um einen Tumor-Hohlraum zu behandeln. Die Behandlung kann die Schritte umfassen:

(i) Verabreichen eines Adenovirus, umfassend ein eine Thymidinkinase kodierendes Gen, in die Wand des Tumor-Hohlraums; und
(ii) Verabreichen einer Verbindung, die, wenn sie phosphoryliert wird, eine zytotoxische Verbindung bildet.

Die in Schritt (ii) verwendete Verbindung kann Ganciclovir oder ein Derivat davon sein. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um einen jeglichen Tumor-Hohlraum, vorzugsweise einen Hirntumor-Hohlraum, z. B. ein malignes Gliom, zu behandeln. Die in Schritt (i) verwendete Zusammensetzung wird wiederholt verabreicht.
Die im Rahmen der Erfindung verwendete Zusammensetzung wird vorzugsweise formuliert ohne das Hinzufügen von Proteinen (anderen als jenen, die mit dem Adenovirus assoziiert sind). Es wird angenommen, dass dies zu bevorzugen ist gegenüber jenen Zusammensetzungen, wo Albumin zugesetzt ist, um die Auswirkungen von abbauend wirkenden Enzymen auf die aktiven Bestandteile zu verringern. Diese Zusammensetzung umfasst vorzugsweise Glycerol als einen Stabilisator.
Die Menge an Wirkstoffen, die einem Patienten bei einer Verwendung der Erfindung verabreicht werden sollte, kann durch die Fachleute auf diesem Gebiet basierend auf hier bereitgestellten Informationen und auf den üblichen Erwägungen, wie der Verabreichungsroute, dem Leiden, welches behandelt wird, und dessen Status u. s. w., bestimmt werden.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
Beispiel
In diesem Beispiel wurden die Sicherheit und Wirksamkeit einer durch Retrovirus-verpackende Zellen vermittelten und durch Adenoviren vermittelten HSVtk-Gentherapie für die Behandlung von malignen Gliomen verglichen. In dem Versuch verbesserte die Gentherapie mittels Retrovirus-verpackenden Zellen das Überleben der Patienten mit malignen Gliomen verglichen mit einer mit lacZ transfizierten Kontrollgruppe nicht. Bei allen Patienten lag ein Fortschreiten des Tumors vor, wie anhand von Kernspinresonanztomographie (MRI) drei Monate nach Tumorresektion und Gentransfer ausgewertet wurde. Eine durch Adenoviren vermittelte Gentherapie verbesserte jedoch das Ergebnis (weitere Überleben) der Patienten signifikant. Auch zeigte die MRI bei drei der sieben mit Adenoviren behandelten Patienten an, dass die Tumore stabil blieben.
Retroviren und Retrovirus-verpackende Zelllinie
Eine PA317/tk verpackende Zelllinie wurde hergestellt, wie in Poptani et al., Cancer Gene Ther. 5: 101–109 (1998) beschrieben. Kurz zusammengefasst, wurde eine HSV1-TK-cDNA von 1,2 kb (McKnight, Nucleic Acid Res. 8: 5949–5964 (1980)) in das retrovirale Plasmid pLXSN (Miller et al., Mol. Cell Biol., 5: 2985–3902 (1986)) subkloniert, wodurch das Plasmid pLTKSN erzeugt wurde. Eine Expression der HSV1-TK wird durch den 5'-LTR des Moloney-Mäusesarkom-Virus gesteuert. Der Vektor enthält auch einen internen SV40-Promotor, der ein Neomycinresistenz(NEO)-Gen steuert. Die PA317-Zelllinie wurde mit dem Plasmid pLTKSN unter Verwendung einer Calciumphosphat-Präzipitation transfiziert. Die PA317/3.0D5-Zelllinie (PA317/tk) erzeugte 106 cfu/ml Retroviren, wie in einem 209F-Fibroblasten-Assay bestimmt wurde (Ylä-Herttuala et al., J. Clin. Invest. 95: 2692–2698 (1995)). Vor den Injektionen wurden Verpackungszellen expandiert, trypsinisiert und auf 10⁹ Zellen/10 ml Optimem (Gibco BRL) verdünnt. Es wurde gezeigt, dass die Zellen frei von Mycoplasmen, anderen mikrobiologischen Verunreinigungen und Wildtyp-Viren waren.
β-Galactosidase(lacZ)-enthaltende BAG-Retroviren wurden in φCRIP erzeugt. Es wurden Titer von 6 × 10⁵ cfu/ml erzeugt und als ein nicht aufkonzentrierter Kulturüberstand (DMEM, 0,5% NCS, Gibco) verwendet.
Adenovirus
Bei dem HSVtk-Adenovirus wurde die Expressionskassette, bestehend aus humaner Zytomegalievirus(hCMV)-Enhancer und -Promotorelement – HSV1-TK-cDNA – Simian-Virus 40(SV40)-Polyadenylierungssignal, in das Plasmid pAdenogal (Barr et al., Gene Ther. 1: 51–58 (1994)) subkloniert, wodurch das Plasmid pAdCMVTK erzeugt wurde. 293-Zellen (ATCC CRL1573) wurden mit linearisierter pAdCMVTK- und adenoviraler sub360-DNA (McClane et al., Hum. Gene Ther. 8: 739–746 (1997)) cotransfiziert und rekombinantes Adenovirus, AdCMVTK, wurde durch homologe Rekombination erzeugt. Der Virusklon wurde durch drei Runden Plaque-Assay gereinigt und nach jeder Runde wurde das Vorhandensein der TK-Expressionskassette in dem Adenovirusgenom durch PCR bestätigt. Eine Herstellung von AdCMVTK in großem Maßstab erfolgte in 293-Zellen und das Viruslysat wurde in einem CsCl-Gradienten gereinigt und aufkonzentriert, dialysiert und bei –80°C aufbewahrt. Der Virustiter wurde durch einen Plaque-Assay in 293-Zellen bestimmt. Das Adenoviruspräparat wurde auf Unversehrtheit der TK-Expressionskassette unter Verwendung eines Restriktionsenzymverdaus, gefolgt von einer Southern-Blot-Analyse, analysiert. Das Fehlen von replikationskompetentem Wildtyp-Virus wurde durch einen Zytopathogenitätsassay an HeLa(ATCC CCL-2) und A549(ATCC CC185)-Zellen bestätigt. Es wurde auch getestet, dass das Viruspräparat frei von mikrobiologischen Verunreinigungen und Lipopolysaccharid war (Limulus Assay, Sigma).
In lacZ wurde eine adenovirale, auf den Zellkern gerichtete β-Galactosidase-cDNA unter einem β-Actin-Promotor und einem CMV-Enhancer in die eine Deletion der E1-Region aufweisende Region des adenoviralen Genoms unter Anwendung von homologer Rekombination kloniert. Adenoviren wurden durch Ultrazentrifugation bis zu einem Titer von 3 × 10¹⁰ pfu/ml aufkonzentriert. Gereinigtes Virus wurde gesammelt und mit 5 mM Hepes (pH 7,8) und schließlich in 5 mM Hepes (pH 7,8), enthaltend 20% Glycerol, dialysiert.
Patienten
Fünfzehn Tumore bei 14 Patienten wurden mit einer HSVtk-Gentherapie behandelt. Zusätzlich wurden 7 Kontrollpatienten mit dem lacZ-Kontrollmarkergen 4–5 Tage vor der Resektion transfiziert. Alle Patienten hatten einen Karnofsky-Index über 70. Das mittlere Alter der Patienten betrug 51 Jahre (Bereich 20–70 Jahre). Der Tumor war in 13 Fällen (59%) rezidivierend. Alle Patienten erhielten Korticosteroide und antiepileptische Medikation und bei de novo-Tumoren wurde eine Strahlentherapie verwendet.
Operation und Gentransfer
Alle Patienten unterzogen sich einer Kraniotomie und Tumorresektion. Die Resektion erfolgte unter dem Mikroskop so radikal wie möglich. Die Diagnose eines malignen Glioms wurde durch gefrorene Schnitte zum Zeitpunkt der Operation bestätigt. Nach der Tumorresektion wurden HSVtk-Retroviren verpackende Zellen (10⁹ Zellen/10 ml) oder Adenoviren (3 × 10¹⁰ pfu/10 ml) in die Wand des Tumor-Hohlraums in 0,1–0,3 ml-Mengen 10 mm tief mit 30–70 Injektionen/Patient injiziert. Die GCV-Behandlung (5 mg/kg/Tag) wurde intravenös durch die Vena subclavia zweimal täglich für 14 Tage verabreicht. Die Medikation begann 14 Tage oder 5 Tage nach der Tumorresektion und dem Gentransfer bei Retrovirus- bzw. Adenovirus-Patienten. In sieben Patienten einer Kontrollgruppe wurde das β-Galactosidasegen über einen Katheter, der stereotaktisch in den Tumor eingeführt worden war, transferiert. Der Katheter verblieb an Ort und Stelle, bis der Tumor im Rahmen einer Kraniotomie operativ entfernt wurde.
Gentransfervektoren (BAG-Retroviren, Titer 6 × 10⁵ cfu, und Adenoviren, Titer von 3 × 10⁸ bis 3 × 10¹⁰ pfu) wurden in den Tumor während dreier aufeinanderfolgender Tage injiziert, gefolgt von einer Tumorresektion 1–2 Tage später. Patienten mit dem β-Galactosidase-Markergen wurden nicht mit GCV behandelt. Alle Patienten wurden gemäß der klinischen Standardpraxis mittels einer Strahlentherapie behandelt.
Kernspinresonanztomographie
HSVtk-behandelte Patienten wurden durch MRI am ersten postoperativen Tag, 4, 8 und 12 Wochen nach dem Gentransfer und jeden zweiten Monat danach verfolgt. Die MRI-Bildgebung erfolgte an einem 1.5 T Magnetom Vision (Siemens) und bestand aus T1-gewichteten (580/14/1 = Repetitionszeit/Echozeit/Akquisition) axialen, koronalen und sagittalen Sequenzen auch nach Kontrastmedium (Gadopentetatedimeglumine 0,1 mmol/kg); einer turbo-T2-gewichteten (5400/99/2) und FLAIR(„fluid-attenuated inversion recovery”, TR = 9000, TE = 119, AC = 1)-Sequenzen. Alle Bilder wurden mittels 5 mm dicker aneinander angrenzender Schnitte und einer 256×256-Matrix erfasst. Gemäß der MRI am ersten postoperativen Tag wurde die chirurgische Resektion als eine vollständige Resektion, wenn mehr als 98% des Tumorvolumens entfernt worden waren, eine subtotale Resektion, wenn mehr als 66%, aber weniger als 98% des Tumorvolumens entfernt worden waren, und als partielle Resektion, wenn weniger als 66% des Tumorvolumens entfernt worden waren, eingestuft. Gemäß der Nachsorge-MRI wurde das Tumorverhalten eingestuft als: progressiv, wenn es sogar nur das geringfügigste Anzeichen für ein erneutes Tumorwachstum gab, stabil, wenn der Tumorstatus der gleiche blieb, und regressiv, wenn das Tumorvolumen abnahm.
Analyse von Blut-, Urin- und Gewebeproben
Blut- und Urinproben wurden unter Verwendung von Routinemethoden vor dem Gentransfer, an dem ersten postoperativen Tag und wöchentlich während des Krankenhausaufenthaltes analysiert mit Ausnahme der Leukozytenzahl („leukocyte differential count”), die während der GCV-Medikation jeden zweiten Tag gemessen wurde. Anti-Virus-Antikörper wurden vor und zwei Wochen nach dem Gentransfer gemessen. Ausgehend von Plasma- und Urinproben wurden PCR- und Wildtyp-Virus-Assays vor dem Gentransfer und 3, 5, 7 und 21 Tage nach dem Gentransfer ausgeführt.
Eine histologische Diagnose wurde ausgehend von gefrorenen Schnitten zum Zeitpunkt der Operation gestellt und später mittels Paraffinschnitten unter Verwendung von Hämatoxylin-Eosin- und GFAP(Boehringer)-Färbungen bestätigt. Die Proliferationsaktivität der Tumore wurde durch Ki67(Dako)-Färbung gemessen. Nach der Resektion wurden lacZ-transfizierte Tumore durch X-gal-Färbung analysiert, wie in Puumalainen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1769–1774 (1998), beschrieben.
Neuropsychologie
Es wurde vor der Operation und jeden zweiten Monat nach der Behandlung eine neuropsychologische Untersuchung ausgeführt, um die kognitiven Funktionen und die Lebensqualität zu bestimmen. Die Auswertung der Gedächtnisfunktionen verwendete den Wechsler Memory Scale (WMS), der sieben Untertests für Kurzzeitgedächtnisfähigkeiten, für einen assoziativen Lerntest, verzögertes/längerfristiges Behalten („delayed recall”), Aufmerksamkeit und Flexibilität der mentalen Verarbeitung umfasste. Die Lebensqualität wurde gemäß einer standaridisierten Auswertung von Schlafschwierigkeiten, Müdigkeit, Gedächtnisfunktionen, somatischen Störungen, Stimmung, sensorischen und motorischen Funktionen, Anspannungszustand, Aktivität, Depression, Reizzustand, Ineffizienz und Unsicherheit gemessen. Mit LacZ transfizierte Patienten wurden keiner neuropsychologischen Untersuchung unterzogen.
Statistik
Die statistische Analyse der MRI-Ergebnisse erfolgte mittels des Kruskal Wallis-Tests für SPSS. Das Ergebnis (weitere Überleben) der Patienten wurde mittels des exakten Unabhängigkeitstests von Fisher für SPSS analysiert. Die Statistiken für die Labor- und neuropsychologischen Analysen wurden mittels Anova für SPSS ausgewertet.
Ergebnisse
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse aus den Gentherapieexperimenten.
Alle Patienten wurden mittels Tumorresektion behandelt. Für sieben Patienten wurden Retrovirus-verpackende Zellen (PA317/tk) und für sieben Patienten Adenoviren (Adv/tk) verwendet. Ein Patient (#) erhielt eine wiederholte Behandlung mit PA317/tk-Zellen für zwei unterschiedliche Tumore. Sechs der Fälle waren de novo-Tumore, andere waren Rezidive mit vorheriger Operation (op), Strahlentherapie (rd) oder Chemotherapie (ch). Der Tumor befand sich in dem Temporal- (temp), Okzipital- (occ), Frontal- (front) oder Parietallappen (pariet). (Sin) bezeichnet die linke Seite und (dx) die rechte Seite. Virusantikörper wurden ausgehend von peripherem Blut vor und zwei Wochen nach der Gentherapie gemessen. Die Diagnose wurde bei 82% der Patienten als Glioblastom (gb) bestätigt, zwei Patienten hatten ein buntes Glioblastom (aa) und zwei ein anaplastisches Oligodendrogliom (ao). Die Proliferationsaktivität der Tumore wurde durch eine immunhistologische ki67-Färbung gemessen. Die Tumoridentität wurde bestätigt durch Anfärbung des „glial fibrillary acid protein” (GFAP; saures Gliafibrillenprotein). Das Ergebnis (weitere Überleben) wurde in Monaten gemessen und (*) zeigt den Tod des Patienten an. Anhand des exakten Unabhängigkeitstests von Fisher war der Unterschied zwischen retro- und adenoviral behandelten Patienten entsprechend dem Überleben signifikant (p < 0,05). Die erste postoperative MRI erfolgte 1 oder 2 postoperative Tage nach der Tumorresektion und Gentherapie und die zweite postoperative MRI erfolgte 3 Monate später. Die Resektion war total, wenn mehr als 98% des Tumors operativ entfernt wurden, subtotal, wenn die Resektion zwischen 66 und 98% betrug, und partiell, wenn weniger als 66% des Tumors operativ entfernt wurden. Bei der Nachsorge-MRI wurde das Wachstum ausgewertet als progressiv (prog), wenn es auch nur das geringfügigste Anzeichen eines erneuten Wachstums des Tumors gab. Gemäß den MRI-Ergebnissen war der Unterschied bei dem progressiven Wachstum zwischen retro- und adenoviral behandelten Patienten signifikant (p < 0,05); Kruskal-Wallis-Test. NA = nicht analysiert.
Sowohl mit den retro- als auch den adenoviralen Vektoren waren die Gentransfere klinisch sicher, wobei keine schweren abträglichen Wirkungen hervorgerufen wurden. Jedoch waren bei zwei Patienten, die Adenoviren erhalten hatten, epileptische Anfälle erhöht, obwohl beide Patienten zuvor unter epileptischen Symptomen gelitten hatten. Ein Patient wies als Komplikation einer bifokalen frontalen Tumorresektion eine teilweise reversible Halbseitenlähmung und Aphasie auf. Sie hatte eine Gentherapie mittels Retrovirus-verpackenden Zellen kombiniert mit Tumorresektion erhalten. Zwei Patienten zeigten Fieberreaktionen nach einem Adenovirus-vermittelten Gentransfer mit ventrikulären Öffnungen. Die Körpertemperatur stieg bis auf 39,0°C an, aber die Reaktionen waren kurzzeitig und reversibel ohne irgendwelche zurückbleibenden Symptome.
Bei Routine-Labormessungen wurden keine bedeutenderen Veränderungen festgestellt. Nur ein Patient wies während der GCV-Behandlung eine milde und reversible Leukopenie ohne Symptome auf. Adenovirus-Antikörper nahmen bei 3 von 7 Adv/tk-behandelten Patienten deutlich zu; zwei zeigten auch eine Fieberreaktion. Es gab keine signifikanten Veränderungen bei den Leber- und Nierenfunktionen. Bei Verwendung von PCR- und Wildtyp-Virus-Assays wurde in Plasma- und Urinproben keine systemische Abgabe von Viren detektiert. Postmortem-Proben von einem Patienten wurden durch PCR analysiert, welche zeigte, dass der Tumor und alle anderen analysierten Gewebe hinsichtlich des Transgens 6 Monate nach dem Gentransfer negativ waren.
MRI-Nachsorge-Ergebnisse zeigten keine oder eine sehr begrenzte Wirkung für eine Gentherapie mittels Retrovirus-verpackender Zellen. Alle Patienten wiesen drei Monate nach der Tumorresektion und Gentherapie eine progressive Erkrankung auf, Für die Adenovirus-vermittelte Gentherapie waren die MRI-Ergebnisse signifikant besser (p < 0,05) mit einer stabilen Erkrankung bei 3 von 7 Patienten drei Monate nach der Behandlung.
Im Vergleich zu der lacZ-behandelten Kontrollgruppe zeigte das Überleben der Patienten in der Retrovirus-Gruppe keinerlei Verbesserung. Der Unterschied zwischen dem Ergebnis (weiteres Überleben) der retro- und adenoviral behandelten Patienten war signifikant (p < 0,05).
Tabelle 1.

Claims

Verwendung eines Adenovirus, das ein funktionales Thymidinkinasegen aufweist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines durch Tumorresektion entstandenen Hirntumorhohlraums mittels Verabreichung in die Wand des Hirntumorhohlraums, wobei die Adenoviruskonzentration 3 × 10¹⁰ PFU/10 ml beträgt, in Mengen von 0,1–0,3 ml, 10 mm tief, mit 30 bis 70 Injektionen pro Patient.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Adenovirus frei von Proteinen ist, mit Ausnahme der natürlich mit dem Adenovirus assoziierten Proteine.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Thymidinkinasegen das Thymidinkinasegen des Herpes-simplex-Virus ist.
Verwendung gemäß einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament einen Stabilisator umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei der Stabilisator Glyzerin ist.
Verwendung gemäß einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Hirntumor ein malignes Gliom ist.