JP2002529097A - アデノウィルスを介する遺伝子治療 - Google Patents
アデノウィルスを介する遺伝子治療Info
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Abstract
(57)【要約】
機能的なチミジンキナーゼ遺伝子を有するアデノウィルスは、脳腫瘍の処置に有用である。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、遺伝子治療を用いた脳腫瘍の処置に関する。
【０００２】発明の背景 悪性神経膠腫の処置は、依然として臨床医および科学者にとって難題であり続
けている。単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（HSVtk）遺伝子を用いるチ
ミジンキナーゼ遺伝子治療は、悪性神経膠腫の患者の生存を変更することを意図
する、最も成功率の高い治療モダリティーのうちの１つである。HSVtk遺伝子治
療は、ガンシクロビル(GCV)のリン酸化を触媒するチミジンキナーゼの能力に基
づく。リン酸化されたGCVは、標的細胞の死を導く毒性のヌクレオチドアナログ
として作用する。さらに、トランスフェクションされていない周囲の細胞さえも
また破壊されるという周囲への影響により、この現象はさらに増強される。この
効果は、トランスフェクトされた細胞から周囲の細胞へとギャップ結合を介して
毒性のヌクレオチドアナログが放出されることが原因であると考えられている。
けている。単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（HSVtk）遺伝子を用いるチ
ミジンキナーゼ遺伝子治療は、悪性神経膠腫の患者の生存を変更することを意図
する、最も成功率の高い治療モダリティーのうちの１つである。HSVtk遺伝子治
療は、ガンシクロビル(GCV)のリン酸化を触媒するチミジンキナーゼの能力に基
づく。リン酸化されたGCVは、標的細胞の死を導く毒性のヌクレオチドアナログ
として作用する。さらに、トランスフェクションされていない周囲の細胞さえも
また破壊されるという周囲への影響により、この現象はさらに増強される。この
効果は、トランスフェクトされた細胞から周囲の細胞へとギャップ結合を介して
毒性のヌクレオチドアナログが放出されることが原因であると考えられている。
【０００３】 レトロウィルスおよびアデノウィルスは、遺伝子治療のためのベクターとして
使用されてきた。両方のベクターは、特定の利点と限界を有する。脳腫瘍にはレ
トロウィルス媒介性遺伝子移入が特に適している。なぜならば、レトロウィルス
は増殖細胞にのみ感染することができ、正常な分裂していない脳組織は無傷なま
まで残るからである。レトロウィルスの遺伝子移入効率は比較的低いが、単離し
たウィルスの代わりにレトロウィルスパッケージング細胞を使用することにより
改善することができる。形質導入時間は理論的に長期化することができ、そして
トランスフェクトされる細胞の数も増加させることができる。レトロウィルスを
用いる場合、トランスフェクトした遺伝子は標的細胞のゲノム中に一体化するこ
とにより長期遺伝子発現を達成することができる。
使用されてきた。両方のベクターは、特定の利点と限界を有する。脳腫瘍にはレ
トロウィルス媒介性遺伝子移入が特に適している。なぜならば、レトロウィルス
は増殖細胞にのみ感染することができ、正常な分裂していない脳組織は無傷なま
まで残るからである。レトロウィルスの遺伝子移入効率は比較的低いが、単離し
たウィルスの代わりにレトロウィルスパッケージング細胞を使用することにより
改善することができる。形質導入時間は理論的に長期化することができ、そして
トランスフェクトされる細胞の数も増加させることができる。レトロウィルスを
用いる場合、トランスフェクトした遺伝子は標的細胞のゲノム中に一体化するこ
とにより長期遺伝子発現を達成することができる。
【０００４】発明の要旨 本発明は、チミジンキナーゼ遺伝子治療を使用する脳腫瘍の処置が、遺伝子を
腫瘍細胞へと輸送するビヒクルとしてアデノウィルスを使用すると、より効率よ
く達成されうるという驚くべき知見に基づく。
腫瘍細胞へと輸送するビヒクルとしてアデノウィルスを使用すると、より効率よ
く達成されうるという驚くべき知見に基づく。
【０００５】 本発明によると、アデノウィルスはチミジンキナーゼをコードする遺伝子を有
し、そしてこれを含む医薬は脳腫瘍の処置に有用である。特に、腫瘍はガンシク
ロビルまたは等価な化合物の投与に続いて処置される。
し、そしてこれを含む医薬は脳腫瘍の処置に有用である。特に、腫瘍はガンシク
ロビルまたは等価な化合物の投与に続いて処置される。
【０００６】 代表的には、チミジンキナーゼ遺伝子は単純ヘルペスウィルス（HSVtk）に由
来するものである。
来するものである。
【０００７】 アデノウィルス／チミジンキナーゼ遺伝子構築物は、レトロウィルス移入より
も有益であることが示されている。
も有益であることが示されている。
【０００８】本発明の説明 本発明の構築物は、腫瘍を処置するために使用しうる。処置は、以下の工程： （ｉ）チミジンキナーゼをコードする遺伝子を有するアデノウィルスを腫瘍腔（
tumour cavity）の壁に投与する工程；および （ii）リン酸化された場合に細胞傷害性化合物を形成する化合物を投与する工程
、を含みうる。
tumour cavity）の壁に投与する工程；および （ii）リン酸化された場合に細胞傷害性化合物を形成する化合物を投与する工程
、を含みうる。
【０００９】 工程（ii）で使用する化合物は、ガンシクロビルまたはその誘導体でありうる
。この方法は、任意の腫瘍を処置するために使用し得るが、脳腫瘍、例えば悪性
神経膠腫が好ましい。工程（ｉ）で使用する組成物は、反復的に投与することが
でき、40〜80回の適用に分けて投与することが好ましい。
。この方法は、任意の腫瘍を処置するために使用し得るが、脳腫瘍、例えば悪性
神経膠腫が好ましい。工程（ｉ）で使用する組成物は、反復的に投与することが
でき、40〜80回の適用に分けて投与することが好ましい。
【００１０】 本発明に使用する組成物は、好ましくは、（アデノウィルスに関連するタンパ
ク質以外の）タンパク質を添加せずに処方される。これは、活性成分に対する分
解酵素の影響を減少させるためにアルブミンを添加される組成物よりも、好まし
い点であると考えられる。好ましくは、この組成物は、安定剤としてグリセロー
ルを含有する。
ク質以外の）タンパク質を添加せずに処方される。これは、活性成分に対する分
解酵素の影響を減少させるためにアルブミンを添加される組成物よりも、好まし
い点であると考えられる。好ましくは、この組成物は、安定剤としてグリセロー
ルを含有する。
【００１１】 本発明での使用における、患者に投与されるべき活性物質の量は、本明細書中
で提供される情報、および投与経路、処置されるべき状態および段階などのよう
な有用な考察に基づき、当業者が決定することができる。 以下の実施例により本発明を例示する。
で提供される情報、および投与経路、処置されるべき状態および段階などのよう
な有用な考察に基づき、当業者が決定することができる。 以下の実施例により本発明を例示する。
【００１２】実施例 本実施例において、レトロウィルスパッケージング細胞媒介性HSVtk遺伝子治
療と、アデノウィルス媒介性HSVtk遺伝子治療との安全性および有効性を、悪性
神経膠腫の処置に関して比較した。この試行では、レトロウィルスパッケージン
グ細胞遺伝子治療は、lacZをトランスフェクトした対照群と比較して悪性神経膠
腫患者の生存を改善しなかった。腫瘍の進行は、腫瘍切除および遺伝子移入の３
ヶ月後に磁気共鳴映像法（MRI）により評価した全ての患者に存在した。しかし
ながら、アデノウィルス遺伝子治療は患者の結果を有意に改善した。また、アデ
ノウィルスで処置した患者７人のうちの３人では、腫瘍に変化がないことがMRI
により示された。
療と、アデノウィルス媒介性HSVtk遺伝子治療との安全性および有効性を、悪性
神経膠腫の処置に関して比較した。この試行では、レトロウィルスパッケージン
グ細胞遺伝子治療は、lacZをトランスフェクトした対照群と比較して悪性神経膠
腫患者の生存を改善しなかった。腫瘍の進行は、腫瘍切除および遺伝子移入の３
ヶ月後に磁気共鳴映像法（MRI）により評価した全ての患者に存在した。しかし
ながら、アデノウィルス遺伝子治療は患者の結果を有意に改善した。また、アデ
ノウィルスで処置した患者７人のうちの３人では、腫瘍に変化がないことがMRI
により示された。
【００１３】 （レトロウィルスおよびレトロウィルスパッケージング細胞株） Poptaniら、Cancer Gene Ther. 5: 101-109（1998）に記載されているように
、PA317/tkパッケージング細胞株を調製した。簡単に述べると、1.2 kb HSV1-TK
cDNA (McKnight、Nucleic Acid Res. 8: 5949-5964 (1980））を、pLXSNレトロ
ウィルスプラスミド（Millerら、Mol. Cell. Biol.、5：2985-3902 (1986））に
サブクローニングしてpLTKSNプラスミドを作製した。HSV1-TKの発現は、５’モ
ロニーマウス肉腫ウィルスLTRにより駆動される。また、このベクターはネオマ
イシン耐性（NEO）遺伝子を駆動する内部SV40プロモーターを含有する。PA317細
胞株を、pLTKSNプラスミドを用いてリン酸カルシウム沈殿法でトランスフェクト
した。PA317/3.0D5細胞株（PA317/tk）は、209F繊維芽細胞アッセイで測定する
と10６cfu/mlのレトロウィルスを生成した（Yla-Herttualaら、J. Clin. Invest
.95：2692-2698 (1995））。注入（注射）前にパッケージング細胞を増殖させ、
トリプシン処理し、そして10９細胞/10 ml Ｏptimem（Gibco BRL）まで希釈した
。細胞は、マイコプラズマ、他の微生物混入および野生型ウィルスを含有してい
ないこと示した。
、PA317/tkパッケージング細胞株を調製した。簡単に述べると、1.2 kb HSV1-TK
cDNA (McKnight、Nucleic Acid Res. 8: 5949-5964 (1980））を、pLXSNレトロ
ウィルスプラスミド（Millerら、Mol. Cell. Biol.、5：2985-3902 (1986））に
サブクローニングしてpLTKSNプラスミドを作製した。HSV1-TKの発現は、５’モ
ロニーマウス肉腫ウィルスLTRにより駆動される。また、このベクターはネオマ
イシン耐性（NEO）遺伝子を駆動する内部SV40プロモーターを含有する。PA317細
胞株を、pLTKSNプラスミドを用いてリン酸カルシウム沈殿法でトランスフェクト
した。PA317/3.0D5細胞株（PA317/tk）は、209F繊維芽細胞アッセイで測定する
と10６cfu/mlのレトロウィルスを生成した（Yla-Herttualaら、J. Clin. Invest
.95：2692-2698 (1995））。注入（注射）前にパッケージング細胞を増殖させ、
トリプシン処理し、そして10９細胞/10 ml Ｏptimem（Gibco BRL）まで希釈した
。細胞は、マイコプラズマ、他の微生物混入および野生型ウィルスを含有してい
ないこと示した。
【００１４】 β-ガラクトシダーゼ（lacZ）含有BAG-レトロウィルスを、φpCRIP中で生産し
た。力価６×1O５cfu/mlの生成物を濃縮していない培養上清として使用した（DM
EM、0.5％NCS、Gibco）。
た。力価６×1O５cfu/mlの生成物を濃縮していない培養上清として使用した（DM
EM、0.5％NCS、Gibco）。
【００１５】 （アデノウィルス） HSVtkアデノウィルスでは、ヒトサイトメガロウィルス（hCMV）エンハンサー
およびプロモーターエレメント-HSV 1-TK cDNA-シミアンウィルス40（SV40）ポ
リアデニル化シグナルから構成される発現カセットを、pAdenogalプラスミド（B
arrら、Gene Ther. 1: 51-58 (1994））にサブクローニングしてpAdCMVTKプラス
ミドを作製した。線状化したpAdCMVTKおよびsub360アデノウィルス性DNA（McCla
ne ら、Hum. Gene Ther. 8: 739-746 (1997））を、293細胞（ATCC CRL1573）に
コトランスフェクトし、相同的組換えを介して組換えアデノウィルスであるAdCM
VTKを作製した。ウィルスクローンを、３回のプラークアッセイにより精製し、
各精製段階毎にアデノウィルスゲノム中のTK発現カセットの存在についてPCRで
確認した。AdCMVTKのラージスケールでの調製は293細胞中で行い、ウィルス溶解
物をCsCl勾配中で精製および濃縮し、透析し、-80℃で保存した。ウィルス力価
は293細胞でのプラークアッセイにより決定した。アデノウィルス調製物を、制
限酵素消化、続いてサザンブロット分析を使用してTK発現カセットの一体性につ
いて分析した。HeLa（ATCC CCL-2）細胞およびA549（ATCC CC 185）細胞に対す
る細胞変性アッセイにより野生型複製コンピテントウィルスが存在しないことを
確認した。また、ウィルス調製物が、微生物夾雑物およびリポ多糖を含んでいな
いことも試験した（Limulusアッセイ、Sigma）。
およびプロモーターエレメント-HSV 1-TK cDNA-シミアンウィルス40（SV40）ポ
リアデニル化シグナルから構成される発現カセットを、pAdenogalプラスミド（B
arrら、Gene Ther. 1: 51-58 (1994））にサブクローニングしてpAdCMVTKプラス
ミドを作製した。線状化したpAdCMVTKおよびsub360アデノウィルス性DNA（McCla
ne ら、Hum. Gene Ther. 8: 739-746 (1997））を、293細胞（ATCC CRL1573）に
コトランスフェクトし、相同的組換えを介して組換えアデノウィルスであるAdCM
VTKを作製した。ウィルスクローンを、３回のプラークアッセイにより精製し、
各精製段階毎にアデノウィルスゲノム中のTK発現カセットの存在についてPCRで
確認した。AdCMVTKのラージスケールでの調製は293細胞中で行い、ウィルス溶解
物をCsCl勾配中で精製および濃縮し、透析し、-80℃で保存した。ウィルス力価
は293細胞でのプラークアッセイにより決定した。アデノウィルス調製物を、制
限酵素消化、続いてサザンブロット分析を使用してTK発現カセットの一体性につ
いて分析した。HeLa（ATCC CCL-2）細胞およびA549（ATCC CC 185）細胞に対す
る細胞変性アッセイにより野生型複製コンピテントウィルスが存在しないことを
確認した。また、ウィルス調製物が、微生物夾雑物およびリポ多糖を含んでいな
いことも試験した（Limulusアッセイ、Sigma）。
【００１６】 lacZでは、β-アクチンプロモーターおよびCMVエンハンサー制御下のアデノウ
ィルス核標的型β-ガラクトシダーゼcDNAを、相同的組換えを使用してアデノウ
ィルスゲノムのEl欠損領域にクローニングした。アデノウィルスを３×10１０pf
u/mlの力価まで超遠心により濃縮した。精製したウィルスを回収し、５mM Hepes
（pH 7.8）そして最終的に20％グリセロールを含有する５mM Hepes（pH 7.8）中
で透析した。
ィルス核標的型β-ガラクトシダーゼcDNAを、相同的組換えを使用してアデノウ
ィルスゲノムのEl欠損領域にクローニングした。アデノウィルスを３×10１０pf
u/mlの力価まで超遠心により濃縮した。精製したウィルスを回収し、５mM Hepes
（pH 7.8）そして最終的に20％グリセロールを含有する５mM Hepes（pH 7.8）中
で透析した。
【００１７】 （患者） 14人の患者の14個の腫瘍を、HSVtk遺伝子治療を用いて処置した。さらに、切
除の４〜５日前に、７人の対照患者を対照lacZマーカー遺伝子をもちいてトラン
スフェクトした。全患者は、70を超えるKarnofskyスコアを有していた。患者の
平均年齢は、51歳だった（範囲は20歳〜70歳）。腫瘍は13症例で再発性であった
（59％）。全ての患者はコルチコステロイドおよび抗癲癇薬を投与されており、
そして新規な（デノボ）腫瘍では放射線療法を使用した。
除の４〜５日前に、７人の対照患者を対照lacZマーカー遺伝子をもちいてトラン
スフェクトした。全患者は、70を超えるKarnofskyスコアを有していた。患者の
平均年齢は、51歳だった（範囲は20歳〜70歳）。腫瘍は13症例で再発性であった
（59％）。全ての患者はコルチコステロイドおよび抗癲癇薬を投与されており、
そして新規な（デノボ）腫瘍では放射線療法を使用した。
【００１８】 （手術および遺伝子移入） 患者は全員、開頭術および腫瘍切除を受けた。切除は、顕微鏡下で可能な限り
徹底的に行った。悪性神経膠腫の診断は、手術の時点で凍結切片により確認した
。腫瘍切除の後に、HSVtkレトロウィルスパッケージング細胞（10９細胞/10ml）
またはアデノウィルス（3×10１０pfu/lOml）を、0.1-0.3mlの量で、10mmの深さ
で30-70注入/患者で、腫瘍腔の壁に注入した。GCV処置（５mg/kg/d）を鎖骨下静
脈に１日に２回、14日間静脈内投与した。腫瘍切除および、レトロウィルスまた
はアデノウィルス処置患者それぞれへの遺伝子移入の14日後または５日後から投
薬を開始した。定位的に腫瘍に挿入したカテーテルを用いて７人の対照患者群に
β-ガラクトシダーゼ遺伝子を移入した。腫瘍を開頭術で切除するまでカテーテ
ルはその場に残した。遺伝子移入ベクター（BAGレトロウィルス、力価６×10５c
fu、および、アデノウィルス、力価３×10８〜３×10１０pfu）を連続３日間、
腫瘍に注入し、続いて１〜２日後に腫瘍を切除した。β-ガラクトシダーゼマー
カー遺伝子を保有する患者はGCVで処置しなかった。全ての患者を、放射線療法
をもちいる標準的な臨床業務に従って処置した。
徹底的に行った。悪性神経膠腫の診断は、手術の時点で凍結切片により確認した
。腫瘍切除の後に、HSVtkレトロウィルスパッケージング細胞（10９細胞/10ml）
またはアデノウィルス（3×10１０pfu/lOml）を、0.1-0.3mlの量で、10mmの深さ
で30-70注入/患者で、腫瘍腔の壁に注入した。GCV処置（５mg/kg/d）を鎖骨下静
脈に１日に２回、14日間静脈内投与した。腫瘍切除および、レトロウィルスまた
はアデノウィルス処置患者それぞれへの遺伝子移入の14日後または５日後から投
薬を開始した。定位的に腫瘍に挿入したカテーテルを用いて７人の対照患者群に
β-ガラクトシダーゼ遺伝子を移入した。腫瘍を開頭術で切除するまでカテーテ
ルはその場に残した。遺伝子移入ベクター（BAGレトロウィルス、力価６×10５c
fu、および、アデノウィルス、力価３×10８〜３×10１０pfu）を連続３日間、
腫瘍に注入し、続いて１〜２日後に腫瘍を切除した。β-ガラクトシダーゼマー
カー遺伝子を保有する患者はGCVで処置しなかった。全ての患者を、放射線療法
をもちいる標準的な臨床業務に従って処置した。
【００１９】 （磁気共鳴映像法） HSVtkで処置した患者に、手術後１日目、遺伝子移入の後４、８、１２週間目
、そしてそのあと２ヶ月毎に、MRIを行った。MRI画像化は、1.5 T Magnetom Vis
ion (Siemens）で行い、そしてＴ１強調（580/14/1=繰り返し時間／エコー時間
／収集（aquicition））アキシャル（軸）、コロナル（冠状）およびサジタル（
矢状）系列、ならびに、造影剤（ガドペンテト酸ジメグルミン、0.1 mmol/kg）
の投与後、高速Ｔ２強調（5400/99/2）およびFLAIR（流体緩和反転回復法（flui
d attenuated inversion recovery）；TR=9000、TE=119、AC=1）系列から構成さ
れていた。画像は全て、５mmの厚さの連続断片で、256×256マトリックスで収集
した。手術後１日目のMRIにより、外科切除は、腫瘍体積の98％より多くが取り
除かれた場合は全切除（total resection）；66％より多く、しかし98％未満の
場合には準全切除（subtotal resection）、そして腫瘍容量の66％未満が取り除
かれている場合には部分切除（partial resection）として段階分けした。追跡
調査MRIにより、腫瘍の挙動に関しては、わずかでも腫瘍再増殖の徴候があれば
進行（progressive）、腫瘍の状態が同じままであれば安定（stable）、そして
腫瘍体積が減少していれば後退（regressive）として段階分けした。
、そしてそのあと２ヶ月毎に、MRIを行った。MRI画像化は、1.5 T Magnetom Vis
ion (Siemens）で行い、そしてＴ１強調（580/14/1=繰り返し時間／エコー時間
／収集（aquicition））アキシャル（軸）、コロナル（冠状）およびサジタル（
矢状）系列、ならびに、造影剤（ガドペンテト酸ジメグルミン、0.1 mmol/kg）
の投与後、高速Ｔ２強調（5400/99/2）およびFLAIR（流体緩和反転回復法（flui
d attenuated inversion recovery）；TR=9000、TE=119、AC=1）系列から構成さ
れていた。画像は全て、５mmの厚さの連続断片で、256×256マトリックスで収集
した。手術後１日目のMRIにより、外科切除は、腫瘍体積の98％より多くが取り
除かれた場合は全切除（total resection）；66％より多く、しかし98％未満の
場合には準全切除（subtotal resection）、そして腫瘍容量の66％未満が取り除
かれている場合には部分切除（partial resection）として段階分けした。追跡
調査MRIにより、腫瘍の挙動に関しては、わずかでも腫瘍再増殖の徴候があれば
進行（progressive）、腫瘍の状態が同じままであれば安定（stable）、そして
腫瘍体積が減少していれば後退（regressive）として段階分けした。
【００２０】 （血液、尿および組織サンプルの分析） 白血球差示的側定（leucocyte differential count）を除いて（これはGCV投
薬の間は２日毎に測定した）、手術後１日目、及び病院収容の間は１週間毎に、
血液および尿サンプルを遺伝子移入の前に常法に従い分析した。遺伝子移入の前
および２週間後に、抗ウィルス抗体を測定した。遺伝子移入の前ならびに３、５
、７および21日後に血漿サンプルおよび尿サンプルでPCRおよび野生型ウィルス
アッセイを行った。
薬の間は２日毎に測定した）、手術後１日目、及び病院収容の間は１週間毎に、
血液および尿サンプルを遺伝子移入の前に常法に従い分析した。遺伝子移入の前
および２週間後に、抗ウィルス抗体を測定した。遺伝子移入の前ならびに３、５
、７および21日後に血漿サンプルおよび尿サンプルでPCRおよび野生型ウィルス
アッセイを行った。
【００２１】 手術時の凍結切片を用いて組織学的診断を行い、そしてその後にヘマトキシリ
ン-エオシン染色およびGFAP（Boehringer）染色を使用してパラフィン切片を用
いて組織学的診断を確認した。腫瘍の増殖活性はKi67（Dako）染色で測定した。
切除後、lacZをトランスフェクトした腫瘍を、Puumalainenら、Hum. Gene Ther.
、9：1769-1774（1998）に記載されるように、X-gal染色により分析した。
ン-エオシン染色およびGFAP（Boehringer）染色を使用してパラフィン切片を用
いて組織学的診断を確認した。腫瘍の増殖活性はKi67（Dako）染色で測定した。
切除後、lacZをトランスフェクトした腫瘍を、Puumalainenら、Hum. Gene Ther.
、9：1769-1774（1998）に記載されるように、X-gal染色により分析した。
【００２２】 （神経心理学） 認知機能および生活の質（quality of life）を決定するため、手術前および
処置後２ヶ月毎に神経心理学試験を行った。記憶機能の評価には、ウェクスラー
記憶尺度検査法（Wechsler Memory Scale）(WMS) （これは、学習試験、遅延思
い出し、注意力および感情処理の融通性に関連する短期記憶能力に関する７つの
サブ試験を含む）を使用した。生活の質は、睡眠困難、疲労、記憶機能、身体傷
害、気分、感覚機能および運動機能、緊張、活発さ、鬱、いらだち、無能および
不信の基準化された評価に従って決定した。LacZをトランスフェクトした患者は
、神経心理学試験に供さなかった。
処置後２ヶ月毎に神経心理学試験を行った。記憶機能の評価には、ウェクスラー
記憶尺度検査法（Wechsler Memory Scale）(WMS) （これは、学習試験、遅延思
い出し、注意力および感情処理の融通性に関連する短期記憶能力に関する７つの
サブ試験を含む）を使用した。生活の質は、睡眠困難、疲労、記憶機能、身体傷
害、気分、感覚機能および運動機能、緊張、活発さ、鬱、いらだち、無能および
不信の基準化された評価に従って決定した。LacZをトランスフェクトした患者は
、神経心理学試験に供さなかった。
【００２３】 （統計） MRIの結果の統計分析を、SPSSのKruskal Wallis試験を用いて行った。SPSSの
フィッシャーの直接法を用いて患者の結果を分析した。実験室および神経分析学
的分析の統計は、SPSSのAnovaを用いて評価した。
フィッシャーの直接法を用いて患者の結果を分析した。実験室および神経分析学
的分析の統計は、SPSSのAnovaを用いて評価した。
【００２４】 （結果） 遺伝子治療研究の結果を表１に示す。 全患者を腫瘍切除により処置した。７人の患者にレトロウィルスパッケージン
グ細胞（PA317/tk）を使用し、７人の患者にアデノウィルス（Adv/tk）を使用し
た。１人の患者（＃）には２つの異なる腫瘍に対してPA317/tk細胞を用いて繰り
返し処置した。これらの症例のうち６人がデノボ腫瘍であり、その他は、先の手
術（op)、放射線療法（rd）または化学療法（ch）から再発したものであった。
腫瘍は側頭部（temp）、後頭部（occ）、前頭部（front）または頭頂部（pariet
）の突出部分に位置した。（sin）は左側を示し、（dx）は右側を示す。遺伝子
治療の前および２週間後にウィルス抗体を抹消血から測定した。８２％の患者で
膠芽腫（gb）との診断を確認し、２人の患者は未分化の星状細胞腫（aa）を有し
ており、そして２人の患者が未分化の稀突起神経膠腫（ao）を有していた。腫瘍
の増殖活性はki67免疫組織化学染色により測定した。腫瘍の同一性に関しては、
グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）免疫染色で確認した。結果を数ヶ月間測定
し、（＊）は患者が死亡したことを示す。フィッシャーの直接法によると、レト
ロウィルスで処置した患者とアデノウィルスで処置した患者との生存率による差
異は、有意であった（p＜0.05）。１回目の手術後MRIは腫瘍切除および遺伝子治
療の手施術後１日または２日目に行い、２回目の手術後MRIは３ヵ月目に行った
。切除は、98％より多くの腫瘍質量が切除された場合にはtotalとし、66〜98％
の間で切除されているならばsubtotalとし、66％未満の腫瘍が切除されている場
合にはpartialとした。追跡調査MRIでは、腫瘍再増殖の徴候がわずかでも存在す
れば、増殖が進行中である（prog）とした。レトロウィルスで処置した患者とア
デノウィルスで処置した患者との、MRIの結果による進行性増殖の差異は有意で
あった（ｐ＜0.05）；Kruskal Wallis検定。NA＝分析せず。
グ細胞（PA317/tk）を使用し、７人の患者にアデノウィルス（Adv/tk）を使用し
た。１人の患者（＃）には２つの異なる腫瘍に対してPA317/tk細胞を用いて繰り
返し処置した。これらの症例のうち６人がデノボ腫瘍であり、その他は、先の手
術（op)、放射線療法（rd）または化学療法（ch）から再発したものであった。
腫瘍は側頭部（temp）、後頭部（occ）、前頭部（front）または頭頂部（pariet
）の突出部分に位置した。（sin）は左側を示し、（dx）は右側を示す。遺伝子
治療の前および２週間後にウィルス抗体を抹消血から測定した。８２％の患者で
膠芽腫（gb）との診断を確認し、２人の患者は未分化の星状細胞腫（aa）を有し
ており、そして２人の患者が未分化の稀突起神経膠腫（ao）を有していた。腫瘍
の増殖活性はki67免疫組織化学染色により測定した。腫瘍の同一性に関しては、
グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）免疫染色で確認した。結果を数ヶ月間測定
し、（＊）は患者が死亡したことを示す。フィッシャーの直接法によると、レト
ロウィルスで処置した患者とアデノウィルスで処置した患者との生存率による差
異は、有意であった（p＜0.05）。１回目の手術後MRIは腫瘍切除および遺伝子治
療の手施術後１日または２日目に行い、２回目の手術後MRIは３ヵ月目に行った
。切除は、98％より多くの腫瘍質量が切除された場合にはtotalとし、66〜98％
の間で切除されているならばsubtotalとし、66％未満の腫瘍が切除されている場
合にはpartialとした。追跡調査MRIでは、腫瘍再増殖の徴候がわずかでも存在す
れば、増殖が進行中である（prog）とした。レトロウィルスで処置した患者とア
デノウィルスで処置した患者との、MRIの結果による進行性増殖の差異は有意で
あった（ｐ＜0.05）；Kruskal Wallis検定。NA＝分析せず。
【００２５】 重篤な副作用を生じないレトロウィルスおよびアデノウィルスベクターの両方
を用いる遺伝子移入は、臨床上安全である。しかしながら、アデノウィルスを投
与した患者のうちの２人では、これらの患者は２人とも癲癇症状を以前から示し
ていたが、癲癇の発作が増加した。１人の患者では、二焦点性前頭部腫瘍切除の
合併症として、部分的に可逆的な不全麻痺および失語症を示した。その患者は、
腫瘍切除と合わせてレトロウィルスパッケージング細胞遺伝子治療を受けていた
。２人の患者は、アデノウィルス媒介性遺伝子移入と脳室開口の後に発熱反応を
示した。体温が39.0℃まで上昇したが、反応は短期間のものであり、残留する症
状はなく可逆的なものであった。
を用いる遺伝子移入は、臨床上安全である。しかしながら、アデノウィルスを投
与した患者のうちの２人では、これらの患者は２人とも癲癇症状を以前から示し
ていたが、癲癇の発作が増加した。１人の患者では、二焦点性前頭部腫瘍切除の
合併症として、部分的に可逆的な不全麻痺および失語症を示した。その患者は、
腫瘍切除と合わせてレトロウィルスパッケージング細胞遺伝子治療を受けていた
。２人の患者は、アデノウィルス媒介性遺伝子移入と脳室開口の後に発熱反応を
示した。体温が39.0℃まで上昇したが、反応は短期間のものであり、残留する症
状はなく可逆的なものであった。
【００２６】 慣用的な実験室での測定では主要な変化は観察されなかった。GCV処置の間、
１人の患者のみが軽い、治癒可能な白血球減少症に罹患したが、症状は現れなか
った。Adv/tkで処置した７人の患者のうち３人でアデノウィルス抗体が顕著に上
昇し、また、二人は発熱反応を示した。肝機能および腎機能には有意な変化は現
れなかった。PCRおよび野生型ウィルスアッセイでは、血漿サンプルおよび尿サ
ンプル中にウィルスの全身性送達は検出されなかった。一人の患者からの死亡後
のサンプルをPCRで分析すると、遺伝子移入の６ヶ月後には腫瘍および他の分析
した組織はトランスジーンに関しては陰性であることが示された。
１人の患者のみが軽い、治癒可能な白血球減少症に罹患したが、症状は現れなか
った。Adv/tkで処置した７人の患者のうち３人でアデノウィルス抗体が顕著に上
昇し、また、二人は発熱反応を示した。肝機能および腎機能には有意な変化は現
れなかった。PCRおよび野生型ウィルスアッセイでは、血漿サンプルおよび尿サ
ンプル中にウィルスの全身性送達は検出されなかった。一人の患者からの死亡後
のサンプルをPCRで分析すると、遺伝子移入の６ヶ月後には腫瘍および他の分析
した組織はトランスジーンに関しては陰性であることが示された。
【００２７】 MRIでの追跡調査の結果は、レトロウィルスパッケージング細胞遺伝子治療は
効果がほとんどないか、または非常に限定されていることを示した。全ての患者
が、腫瘍切除および遺伝子治療の３ヵ月後に進行性の疾患を有していた。アデノ
ウィルス媒介性遺伝子治療に関しては、MRIの結果は、７人の患者のうち３人が
処置の３ヵ月後に疾患が進行しておらず、有意に良好であること（p＜0.05）を
示した。
効果がほとんどないか、または非常に限定されていることを示した。全ての患者
が、腫瘍切除および遺伝子治療の３ヵ月後に進行性の疾患を有していた。アデノ
ウィルス媒介性遺伝子治療に関しては、MRIの結果は、７人の患者のうち３人が
処置の３ヵ月後に疾患が進行しておらず、有意に良好であること（p＜0.05）を
示した。
【００２８】 lacZで処置した対照群と比較して、レトロウィルス処置群の患者の生存率には
何ら改善を認めなかった。レトロウィルスで処置した患者の結果とアデノウィル
スで処置した患者の結果との差異は有意であった（p＜0.05）。
何ら改善を認めなかった。レトロウィルスで処置した患者の結果とアデノウィル
スで処置した患者の結果との差異は有意であった（p＜0.05）。
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 35/00 35/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｎ 7/00 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アヌ−マーリア・サンドマイル フィンランド、エフイーエン−70211クオ ピオ、ペー・オー・ボックス1627、ユニバ ーシティ・オブ・クオピオ、アー・イー・ ビルタネン・インスティテュート (72)発明者 サミ・ロイマス フィンランド、エフイーエン−70211クオ ピオ、ペー・オー・ボックス1627、ユニバ ーシティ・オブ・クオピオ、アー・イー・ ビルタネン・インスティテュート (72)発明者 マッティ・ヴァパラハティ フィンランド、エフイーエン−70211クオ ピオ、ペー・オー・ボックス1627、ユニバ ーシティ・オブ・クオピオ、アー・イー・ ビルタネン・インスティテュート Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA02 DA02 EA02 HA17 4B065 AA93X AA95X AB01 BA02 CA29 CA44 4C084 AA13 AA19 MA02 NA14 ZA021 ZB261 4C086 AA01 AA02 CB07 MA02 MA04 NA05 ZA02 ZB26 ZC75 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA02 ZB26 ZC75
Claims (17)
- 【請求項１】 機能的なチミジンキナーゼ遺伝子を有するアデノウィルス。
- 【請求項２】 アデノウィルスに天然で関連しているタンパク質以外のタン
パク質を含有していない、請求項１に記載のアデノウィルス。 - 【請求項３】 前記チミジンキナーゼ遺伝子が単純ヘルペスウィルスチミジ
ンキナーゼ遺伝子である、請求項１または２に記載のアデノウィルス。 - 【請求項４】 治療用途のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のア
デノウィルス。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデノウィルスと、安
定剤とを含有する医薬。 - 【請求項６】 前記安定剤がグリセロールである、請求項５に記載の医薬。
- 【請求項７】 腫瘍または腫瘍腔の壁への投与に適合されている、請求項５
または６に記載の医薬。 - 【請求項８】 脳腫瘍の処置用の医薬の製造のための、請求項１〜３のいず
れか１項に記載のアデノウィルスの使用。 - 【請求項９】 前記脳腫瘍が悪性神経膠腫である、請求項７に記載の使用。
- 【請求項１０】 前記医薬が請求項５〜７のいずれか１項に定義されている
医薬である、請求項８または９に記載の使用。 - 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウィルスまた
は請求項５〜７のいずれか１つに記載の医薬と、リン酸化された場合に細胞傷害
性誘導体を形成する化合物とを含有する、腫瘍の処置の際に同時、連続してまた
は別個に使用するための製品。 - 【請求項１２】 前記化合物がガンシクロビルである、請求項１１に記載の
製品。 - 【請求項１３】 （ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウィル
ス、または請求項５〜７のいずれか１項に定義されている医薬を、腫瘍または腫
瘍腔の壁に投与する工程；ならびに （ii）リン酸化された場合に細胞傷害性誘導体を形成する化合物を投与する工
程を含む、腫瘍の処置方法。 - 【請求項１４】 前記工程（ii）の化合物がガンシクロビルである、請求項
１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記工程（ｉ）に、または各工程に注入を含む、請求項１
３または１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記工程（ｉ）に、または各工程に複数回の注入を含む、
請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記工程（ｉ）が40〜80回の注入を含む、請求項１６に記
載の方法。
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| PCT/EP1999/009017 WO2000028059A1 (en) | 1998-11-06 | 1999-11-05 | Adenovirus-mediated gene therapy |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| GB0916997D0 (en) | 2009-09-28 | 2009-11-11 | Ark Therapeutics Ltd | Combination therapy |
| US20130296407A1 (en) * | 2011-01-18 | 2013-11-07 | Ark Therapeutics, Ltd. | Combination Therapy for Cancer |
| WO2013119880A1 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Global Bio Therapeutics Usa, Inc. | Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof |
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| KR20240099460A (ko) | 2021-11-11 | 2024-06-28 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | Cd20-pd1 결합 분자 및 이의 사용 방법 |
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|---|---|---|---|---|
| JPS62192327A (ja) * | 1986-02-18 | 1987-08-22 | Kao Corp | 抗腫瘍物質徐放性製剤 |
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