JP2003277272A - ＤＮＡ損傷剤およびр５３を含有する組成物 - Google Patents

ＤＮＡ損傷剤およびр５３を含有する組成物

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エイ． ロース，ジャック
Toshiyoshi Fujiwara
俊義 藤原
Elizabeth A Grimm
エイ． グリム，エリザベス
Tapas Mukhopadhyay
マックホパッドハイアイ，タパス
Wei-Wei Zhang
ザン，ウェイ‐ウェイ
Laurie B Owen-Schaub
ビー． オーウェン‐シュアーブ，ローリー
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、細胞、および特にガン細胞を殺傷
することにおいて用いるためのDNA損傷剤または因子と
組み合わせた腫瘍抑制遺伝子の使用に関する。 【解決手段】 腫瘍抑制遺伝子であるp53は、化学療法
剤と組み合わせて、インビトロおよびインビボの両方で
組換えアデノウイルス仲介遺伝子転移により送達され
た。処置細胞は、特異的なDNAの断片化とともにアポト
ーシスをうけた。腫瘍へのp53アデノウイルス構築物の
直接皮下注入、続くDNA損傷剤であるシスプラチンの腹
腔内投与は、腫瘍の大規模なアポトーシス性の破壊を誘
導した。本発明はまた、ヒトのガンを処置するために複
製能欠損野生型p53アデノウイルスを用いる遺伝子置換
とDNA損傷薬とを組合せるレジメの臨床適用を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】発明の背景 １．発明の分野 本発明は、一般的に、化学療法介入の改善のための新規
な戦略の分野に関する。他の局面において、本発明は、
DNA損傷剤の効力と腫瘍抑制因子(suppressor)の組合せ
送達とを組み合せる新規な方法および新規な組成物を提
供する。DNA損傷因子と腫瘍抑制因子遺伝子の異種発現
との組合せは、個々の成分の作用を上回る明確な相乗作
用を導く。
【０００２】
【従来の技術】２．関連技術の説明 放射線療法、外科手術、および化学療法を含むガンに対
する現在の処置方法は、有効性が限られていることが知
られている。肺ガン単独で、合衆国において年間、140,
000名を上回る人々が死亡している。現在、肺ガンの年
齢調整死亡率は、女性の乳ガンの死亡率を上回る。喫煙
減少化プログラムの実行により喫煙の割合は減少してい
るが、肺ガン死亡率は、21世紀に向かって高いままであ
る。肺ガンに対する新しい治療の合理的な開発は、分子
レベルでの肺ガンの生物学の理解に依存する。
【０００３】種々のガンが、少なくとも一部は、１つ以
上の遺伝子の過剰発現または１つもしくは複数の異常遺
伝子もしくは変異遺伝子の発現のいずれかを生じる遺伝
的異常により引き起こされることは、今や十分に確立さ
れている。例えば、多くの場合、ガン遺伝子の発現が、
ガンを発達させることが知られている。「ガン遺伝子」
は遺伝子的に変化した遺伝子で、この変異した発現産物
は、正常な細胞機能または制御をある手段により分断す
る（Spandidosら、1989）。
【０００４】現在までに研究されたほとんどのガン遺伝
子は、正常細胞遺伝子（すなわち、「ガン原遺伝子」）
のコード領域における変異（ほとんど、点変異）の結果
として「活性化される」ことが見出されている。この変
異により、発現したタンパク質産物においてアミノ酸置
換が生じている。この変化した発現産物は、新生物形成
プロセスに関与する異常な生物学的機能を示す（Traval
iら、1990）。このもととなる変異は、種々の手段によ
り（例えば、化学的変異誘発または電離放射線により）
生じ得る。ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、
およびablを含む多くのガン遺伝子およびガン遺伝子フ
ァミリーが、現在、同定され、そして種々の程度で特徴
付られている（Travaliら、1990；Bishop、1987）。
【０００５】正常細胞増殖中、増殖促進ガン原遺伝子
は、増殖抑制的な腫瘍抑制遺伝子により平衡していると
考えられる。いくつかの因子が、新生物生成状態をもた
らすこれらの２つの力における不均衡を導き得る。この
ような１つの因子は、腫瘍抑制遺伝子における変異であ
る（Weinberg、1991）。
【０００６】１つの重要な腫瘍抑制遺伝子は、細胞性タ
ンパク質であるp53をコードする遺伝子である。このタ
ンパク質は、細胞増殖を制御する53kDの核リンタンパク
質である。p53遺伝子に対する変異および染色体17p（こ
の場に、本遺伝子が位置する）での対立遺伝子の喪失
は、ヒトの悪性腫瘍で同定される最も頻発する変異の１
つである。p53タンパク質は、進化を通じ高度に保存さ
れており、そしてほとんどの正常組織において発現され
ている。野生型p53は、細胞周期の制御（Mercer、199
2）、転写調節（Fieldsら、1990、およびMietzら、199
2）、DNA複製（WilcockおよびLane、1991、およびBargo
nettiら、1991）、およびアポトーシスの誘導（Yonish-
Rouachら、1991、および、Shawら、1992）に関与するこ
とが示されている。
【０００７】種々の変異p53対立遺伝子は、１塩基の置
換が全く異なる増殖調節特性を有し、そして最終的には
悪性腫瘍に導くタンパク質の合成を引き起こすことで知
られている（Hollsteinら、1991）。実際、p53遺伝子
は、一般的なヒトのガンにおいて最も変異の頻度の高い
遺伝子であることが分かっており（Hollsteinら、199
1；Weinberg、1991）、そして喫煙に関連するそれらの
ガンと特に関連がある（Hollsteinら,1991；Zakut-Hour
iら、1985）。胸部腫瘍におけるp53の過剰発現もまた、
報告されている（Caseyら、1991）。
【０００８】ガンのための遺伝子治療の最も魅力的な局
面の１つは、p53のような腫瘍抑制遺伝子の利用に関す
る。野生型p53を特定の型の乳ガン細胞および肺ガン細
胞へトランスフェクトすることにより、細胞株における
増殖抑制制御が回復され得ることが報告されている（Ca
seyら、1991；Takahashiら、1992）。DNAトランスフェ
クションは、患者細胞へのDNA導入のために実用的な手
段でないが、これらの結果は、p53遺伝子送達のための
改善された手段が開発され得る場合、変異p53遺伝子を
有するガン細胞への野生株p53の供給が、効果的な処置
方法であり得ることを示し得る。
【０００９】腫瘍抑制のための遺伝子治療に適用可能な
遺伝子送達系は、現在、研究中であり、そして開発中で
ある。ウイルスに基づく遺伝子転移媒体は、特に興味深
い。
【００１０】なぜなら、それは、実際の生存細胞の感染
におけるウイルスの効率、ウイルスの遺伝物質自体が転
移されるプロセスのためである。この点に関して、例え
ば種々の遺伝子を送達するために遺伝子操作されたレト
ロウイルスベクターの生成において、いくつかの進展が
なされた。しかし、遺伝子治療のためにレトロウイルス
ベクターを使用することで、大きな問題が想起される。
なぜなら、これらの感染効率は標的細胞におけるレトロ
ウイルスレセプターの利用性に依存し、それらを濃縮し
て精製することは困難であり、そして複製細胞中に効率
よく組み込むだけであるからである。
【００１１】化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性は、臨
床ガン学における大きな問題である。NSCLCは、少なく
とも80％の肺ガン患者に報告される；しかし、NSCLCを
有する患者は、化学療法に対して一般的に応答しない
（Doyle、1993）。現在のガン研究の目標の１つは、遺
伝子産物と化学療法薬との間の相互作用を研究すること
により、ガンのための遺伝子置換治療の効力を改善する
方法を見出すことである。
【００１２】単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HS-tK）
遺伝子は、レトロウイルスベクター系により脳腫瘍に送
達させた場合、抗ウイルス薬剤のガンシクロビルに対す
る感受性を首尾良く誘導した（Culverら、1992）。HS-t
K遺伝子産物は外来ウイルスの酵素であるが、wt-p53タ
ンパク質は正常組織において発現する。このことは、wt
-p53中の変化による化学耐性の調節が、内在性の遺伝的
プログラムにより仲介される経路を使用する代替アプロ
ーチであることを示唆する。
【００１３】アデノウイルス系は、インビボでの遺伝子
送達のための潜在的な利点を有する。例えば、高力価の
ウイルスの容易な生産、高い感染効率、および多くの型
の細胞に対する感染性である。しかし、導入した遺伝子
の発現の安定性および期間は、依然として議論されてい
る。化学療法薬に対して感受性の細胞におけるp53レベ
ルの増加が、DNA損傷刺激剤後の６時間以内に生じ得る
（Fritscheら、1993、Zhanら、1993）。しかし、刺激剤
を取り除くと、増加したp53 DNA結合活性は４時間の経
過にわたって逆転され得る。従って、高レベルのp53発
現は、薬物曝露の休止後でも維持され得る。wt-p53タン
パク質のAd-p53による発現は、感染後３日目でピークに
達し（内在性の野生型よりも14倍多い）、そして９日ま
でに低いレベルに減少する（Zhangら、1993）。このこ
とは、一時的に高いレベルのwt-p53発現が、ガン細胞に
おいて細胞障害プログラムを開始するに十分であること
を示唆する。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】p53は、ヒト肺ガン細
胞において化学感受性の決定因子として重要な役割を有
する。外科手術、化学療法、および放射線療法を含む種
々の処置プロトコルをヒトNSCLCに対して試みたが、長
期の生存率は満足していない。必要とされるのは、組み
合わせ治療であり、単独で、または原発性腫瘍の切除後
の局所的再発を防止するための有効なアジュバント処置
として、または薬物耐性の原発性の、転移性の、もしく
は局所的な再発性の肺ガンにおける病変内注射によりな
され得る処置として使用される。組成物および方法は、
ガンの処置のための新規な組成物の臨床上の適用性につ
いて開発し、探索し、そして改善することもまた必要と
される。さらに、これらの方法および組成物は、インビ
ボの環境においてその価値を明らかにしなければならな
い。
【００１５】
【課題を解決するための手段】発明の要旨 本発明は、腫瘍抑制遺伝子またはタンパク質とDNA損傷
薬剤または因子との効果を組み合わせることにより細胞
を殺傷するのに用いるための改善された治療調製物の必
要性を扱う。本発明はまた、標的細胞においてp53のよ
うな野生型腫瘍抑制遺伝子の発現を促進するためおよび
DNA損傷を誘導する薬剤または因子を送達するために、
ウイルス仲介遺伝子転移を用いる組成物および方法を含
む、組成物および方法を提供する。本発明者らは驚くべ
きことに、本明細書中に開示した組成物を用いて、非常
に多くの標的細胞においてプログラム細胞死（アポトー
シスとしても知られる）を誘導し得ることを見出した。
【００１６】本発明を用いて、本発明者らは細胞の増
殖、特に腫瘍細胞の増殖の制御において著しい効果を示
した。腫瘍細胞形成および増殖（「形質転換」としても
知られる）は、細胞分裂を制御する能力を失った細胞の
形成および増殖、つまり、それらがガン性であることを
記載する。多くの異なるタイプの形質転換された細胞
（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および広範な種類
の固体腫瘍など）が、本発明の方法および組成物の潜在
的な標的であることが想像される。悪性の細胞増殖を有
する任意の組織が標的であり得るが、肺組織および乳房
組織が好ましい標的である。本発明者らは、p53発現組
換え送達ベクターを、DNA損傷剤とともに用いた場合に
細胞の増殖速度を顕著に減少し得たことを本明細書にお
いて開示する。
【００１７】本発明は、特定の実施態様において、細胞
（単数および複数）(例えば、悪性細胞(単数および複
数))を殺傷するための方法および組成物であって、細胞
を殺傷するに有効な組合せ量でp53タンパク質または遺
伝子および１以上のDNA損傷剤に細胞または細胞集団を
接触させるまたは曝すことによる方法または組成物を提
供する。本発明を用いて殺傷され得る細胞は、例えば、
非所望だが良性の細胞（例えば、良性の前立腺過形成細
胞または過剰活動性甲状腺細胞）；自己免疫疾患関連細
胞（例えば、関節炎に関する抗体を産生するＢ細胞、狼
蒼、重症筋無力症、扁平上皮化生、形成異常など）を包
含する。一般に全ての非所望の細胞を殺傷するために適
用可能であるが、本発明は悪性細胞の殺傷に格別な有用
性を有する。「悪性細胞」は、細胞分裂周期を制御する
能力を失った細胞として定義され、「形質転換された」
または「ガン性の」表現型を導く。
【００１８】悪性細胞または転移細胞のような細胞を本
発明の方法および組成物を用いて殺傷するために、一般
に細胞を殺傷するに有効な組合せ量でp53タンパク質ま
たは遺伝子および少なくとも１つのDNA損傷剤と「標
的」細胞を接触させる。このプロセスは、細胞をp53タ
ンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤または因子（単
数または複数）と同時に接触させる工程を含み得る。こ
れは、細胞を両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理
学的処方物と接触させることにより、または細胞を２つ
の異なる組成物または処方物（ここで、一方の組成物は
p53タンパク質または遺伝子を含み、他方はDNA損傷剤を
含む）と同時に接触させることにより達成され得る。
【００１９】もちろん、標的細胞をまずDNA損傷剤に曝
し、次いでp53タンパク質または遺伝子と接触させ得る
こと、あるいはその逆もまた想像され得る。しかし、DN
A損傷因子およびp53が細胞に別々に適用される実施態様
においては、一般に、DNA損傷剤およびp53がなお有利に
組み合わせた効果を細胞に発揮し得るように、有効期間
がそれぞれの送達時の間に失効しないことを確実にす
る。このような例では、両方の薬剤とそれぞれ約12〜24
時間以内に、より好ましくはそれぞれが約６〜12時間以
内に、最も好ましくは約12時間のみの遅延時間で、細胞
を接触させることを意図する。
【００２０】用語「接触する」および「曝す」は、細胞
に適用される場合、本明細書においては腫瘍抑制遺伝子
またはタンパク質（例えば、p53）およびDNA損傷剤また
は因子が、標的細胞に送達されるまたは標的細胞と直接
並置されるプロセスを記載するために用いられる。細胞
の殺傷を達成するために、両方の薬剤は細胞を殺傷する
（すなわち、プログラム細胞死またはアポトーシスを誘
導する）に有効な組合せ量で細胞に送達される。用語
「殺傷」、「プログラム細胞死」および「アポトーシ
ス」は、本明細書において標的細胞の死を導く一連の細
胞内事象を記載するために互換性で用いられる。細胞死
のプロセスは、例えば、細胞核退化および核DNA断片化
を導く細胞内プロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性化
を伴う。種々の細胞内分子が相互作用して細胞死を達成
する正確な機構の理解は、本発明を実施するために必要
ではない。
【００２１】DNA損傷剤および因子は、細胞に適用され
た場合にDNA損傷を誘導する任意の化合物または処置方
法として本明細書において定義される。このような薬剤
および因子は、DNA損傷を誘導する放射線および電波
（例えば、γ線照射、Ｘ線、UV照射、マイクロ波、電子
放出など）を包含する。種々の化合物（「化学療法剤」
としても記載される）は、DNA損傷を誘導するように機
能する。それらの全てが、本明細書に開示した組み合わ
せ処置方法において有用であることが意図される。
【００２２】使用が意図される化学療法剤は、例えば、
アドリアマイシン、5-フルオロウラシル(5FU)、エトポ
シド(VP-16)、カンプトセシン、アクチノマイシンＤ、
マイトマイシンＣ、シスプラチン(CDDP)、および過酸化
水素までも包含する。本発明はまた、放射ベースまたは
実際の化合物のいずれであろうとも、１以上のDNA損傷
剤の組合せの使用（例えば、Ｘ線とシスプラチンとの使
用またはシスプラチンとエトポシドとの使用）もまた包
含する。１実施態様では、p53タンパク質または遺伝子
と組み合わせたシスプラチンの使用が、この化合物とし
て特に好ましい。
【００２３】細胞内の機能的なp53タンパク質レベルの
増加をもたらす方法であれば、細胞をp53と接触させる
ために任意の方法もまた用いられ得る。本方法は、細胞
へのp53タンパク質の直接送達、およびp53をコードする
遺伝子またはDNAセグメント（この遺伝子は、細胞内で
のp53の発現および生成を導く）の送達の両方を包含す
る。タンパク質送達はタンパク質分解および細胞への低
い取り込みのような障害を受けるために、p53タンパク
質を発現する組換えベクターの使用が特に利点を提供す
ることを意図する。
【００２４】広範な種々の組換えプラスミドおよびベク
ターは、p53タンパク質を発現するように遺伝子操作さ
れ得、そしてp53を細胞に送達するように用いられ得
る。これらは、例えば、細胞へ遺伝物質を直接転移する
ための裸のDNAおよびp53プラスミド(Wolfeら、1990)；
リポソーム(Ledleyら、1987)またはウイルスエンベロー
プレセプタータンパク質を含むプロテオリポソーム(Nic
olauら、1983)に閉じこめたp53コードDNAの処方物；お
よびポリリジン糖タンパク質キャリア複合体に結合した
p53コードDNAの使用を包含する。
【００２５】p53を発現するように遺伝子操作された組
換えウイルスの使用もまた想像される。Miller(Mille
r、1992)に記載のように種々のウイルスベクター、例え
ば、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス
（米国特許第5,288,641号、これは本明細書中に参考と
して援用されている）、サイトメガロウイルスなどが用
いられ得、これは、米国特許第5,139,941号（これは本
明細書中に参考として援用されている）に記載のものの
ような組換えアデノ随伴ウイルス（AAVベクター）、お
よび特に組換えアデノウイルスベクターが用いられ得
る。複製能欠損感染性ウイルスの調製のための技術は、
Ghosh-ChoudhuryおよびGraham(1987); McGroryら(198
8); およびGluzmanら（1982）（これらはそれぞれ本明
細書中に参考として援用されている）により例示される
ように当該分野では周知である。
【００２６】本発明に従って細胞を殺傷するために、一
般に、細胞を殺傷するに有効な組合せ量でp53タンパク
質または遺伝子およびDNA損傷剤と細胞を接触させる。
用語「細胞を殺傷するに有効な組合せ量」は、p53およ
びDNA損傷剤の量が、細胞内で組合せた場合に、細胞が
誘導されてアポトーシスをうけるに充分な量であること
を意味する。全ての実施態様において必要なわけではな
いが、p53およびDNA損傷剤の組合せ有効量は、好ましく
はいずれかの成分単独の使用よりも有意に多い細胞死を
誘導する量であり、そして最も好ましくは組合せ有効量
は、いずれかの成分単独を用いて観測される効果と比較
して相乗作用的に細胞死を誘導する量である。
【００２７】多くのインビトロでのパラメーターが、本
発明の組成物および方法により生じる効果を決定するた
めに用いられ得る。これらのパラメーターは、例えば、
本明細書に記載の組成物に曝す前後の正味の細胞数の観
測、ならびに形成される多細胞腫瘍球様体のサイズ（例
えば、組織培養で形成されたそれらのコロニー）を包含
する。インビトロでの細胞殺傷は、本開示の実施例７に
おいて特に示される。
【００２８】あるいは、プログラム細胞死をうける細胞
の指標となるパラメーターを測定し得る。このパラメー
ターは、例えば、細胞ゲノムDNAのヌクレオソームサイ
ズの断片への断片化であり、これは、一般に、断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離する工程、DNAを染色
する工程、およびDNAとDNAサイズラダーとを比較する工
程により同定される。ヌクレオソームサイズの断片は、
約200塩基対の塩基単位を有する単量体および多量体の
漸進的な段またはラダーとして同定される。
【００２９】同様に、「治療有効量」は、組み合わせて
動物に投与された場合、その動物内で細胞を殺傷するに
有効であるp53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤
の量である。これは特に、腫瘍を有する動物またはヒト
被験体内でのガン細胞（例えば、肺ガン細胞、乳ガン細
胞、または大腸ガン細胞）の殺傷により証明される。
【００３０】従って、「治療的に有効な併用」は、一般
にいずれかの成分単独より多くの細胞を殺傷するように
機能するp53およびDNA損傷剤の組合せ量であり、そして
好ましくは腫瘍負荷に相乗作用的な減少をもたらす組合
せ量である。
【００３１】従って、細胞死の特定のインビボまたはエ
キソビボのパラメーターの研究もまた、本発明の組成物
および方法の有効性を評価するために効果的な手段であ
る。
【００３２】例えば、腫瘍形成性の阻害に対する効果を
観測する。これは、病理分野の当業者に公知のように、
凍結組織切片のTdT発現によりまたは他の染色方法およ
び標的抗原の使用により測定される。当然、腫瘍の大き
さ、増殖、および生存力を決定する他の手段もまた、標
的細胞の殺傷を評価するために用いられ得る。特に、ヒ
トガン細胞が動物の中に局在するモデル系を含む、種々
の動物ガンモデル系において効果を評価し得る。ガンの
動物モデルは、AIDSの動物モデルと異なり、ヒトの処置
レジメについて非常に予測的であることが知られている
(Rothら編(1989))。予測的な動物モデルの１つの例示的
な実施態様は、ヒト小細胞肺ガン細胞(H358細胞)が皮下
で増殖する動物モデルである。この系を用いて、本発明
者らは、化学療法剤の同時投与とともに腫瘍内に注入し
たp53を有するアデノウイルスが、驚くほど有効な腫瘍
の減少を生じることを示した。
【００３３】p53タンパク質を細胞に送達する特に好ま
しい方法は、細胞を組換えアデノウイルスビリオンまた
は粒子と接触させることである。この組換えアデノウイ
ルスビリオンまたは粒子は、所定の細胞タイプにおいて
p53の発現を導き得るプロモーターの制御下に位置するp
53発現領域を含む組換えアデノウイルスベクターを含
む。
【００３４】ベクター中のp53発現領域は、ゲノム配列
を含み得るが、しかし簡略化のために、一般に、当該分
野で容易に入手できかつより容易に操作されるp53cDNA
配列を用いることが好ましいことを意図する。p53発現
単位およびプロモーター領域を含むことに加えて、ベク
ターはまた、一般に、SV40初期遺伝子、またはプロタミ
ン遺伝子、ポリアデニル化シグナルなどのようなポリア
デニル化シグナルを含む。
【００３５】好ましい実施態様において、p53発現領域
を強力な構成的プロモーター(例えば、CMVプロモータ
ー、ウイルスLTR、RSV、またはSV40プロモーター、また
は哺乳動物細胞において高レベルで発現される遺伝子に
付随するプロモーター(例えば、伸長因子１またはアク
チンプロモーター))の制御下に位置させることを所望す
ることが意図される。このような変形物は全て、本発明
において有用であると想像される。現在、特に好ましい
プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)IEプロモ
ーターである。
【００３６】p53遺伝子またはcDNAは、本発明に従っ
て、p53コード配列をウイルスゲノムに単に挿入または
付加することにより組換えアデノウイルスに導入され得
る。しかし、好ましいアデノウイルスは、複製および／
またはパッケージングに必須のウイルス遺伝子が、アデ
ノウイルスベクター構築物から欠損した複製能欠損ウイ
ルスであり、p53発現領域をその位置に導入させ得る。
複製に必須（例えば、E1A、E1B、E2、およびE4）である
かまたは非必須（例えば、E3）のいずれであっても、任
意の遺伝子が、欠失しそしてp53で置換され得る。特に
好ましいのは、図１のゲノム構造により例示するよう
に、アデノウイルスベクターのE1AおよびE1B領域が欠失
し、そしてその場所にp53発現領域が導入されているベ
クターおよびビリオンである。
【００３７】複製能欠損アデノウイルスを調製するため
の技術は、Ghosh-ChoudhuryおよびGraham(1987); McGro
ryら(1988); およびGluzmanら（各々は、本明細書中に
参考として援用されている）により例示されるように、
当該分野で周知である。存在し得る任意の複製能欠損を
相補する限り、種々の細胞株が組換えアデノウイルスの
増殖のために使用され得ることもまた周知である。好ま
しい細胞株は、ヒト293細胞株であるが、複製可能な他
の細胞株（すなわち、好ましい場合、E1AおよびE1Bを発
現する）も用いられ得る。さらに、細胞はそれらのウイ
ルスストックを得るためにプラスチックディッシュ上ま
たは懸濁培養中のいずれかで増殖させ得る。
【００３８】本発明は、E1欠損ウイルスおよびE1発現細
胞のみに限定されない。実際、ウイルスおよび宿主細胞
の他の相補的な組み合わせが、本発明に関して用いられ
得る。機能的なE2を欠くウイルスおよびE2発現細胞が使
用され得、機能的E4を欠くウイルスおよびE4発現細胞な
ども用いられ得る。複製に必須でない遺伝子が欠失およ
び置換された場合（例えば、E3遺伝子）、この欠損は宿
主細胞により特に相補される必要はない。
【００３９】アデノウイルスベクターを、p53を発現す
るように遺伝子操作することを必要とする以外、最初の
アデノウイルスの性質は本発明の好結果の実施に重大で
はないと考えられる。アデノウイルスは、42の異なる公
知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであり
得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明
の方法に使用するための条件的複製能欠損アデノウイル
スベクターを得るために好ましい出発材料である。これ
はなぜなら、アデノウイルス５型は、かなりの量の生化
学的および遺伝的情報が知られており、かつアデノウイ
ルスをベクターとして用いるほとんどの構築のために歴
史的に用いられてきたヒトアデノウイルスだからであ
る。
【００４０】本発明の方法および組成物は、インビトロ
およびインビボの両方で細胞（単数および複数）を殺傷
するために同等に適している。殺傷される細胞が動物内
に位置する場合（例えば、肺ガン細胞、乳ガン細胞、ま
たは大腸ガン、あるいはp53変異を有する他の細胞）、p
53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤は両方と
も、薬理学的に受容可能な形態で動物に投与される。用
語「薬理学的に受容可能な形態」は、本明細書中で用い
られるように、動物に投与され得る任意の組成物の形
態、および動物に照射を接触させる形態（すなわち、動
物体のある領域が、例えば、γ線照射、Ｘ線、UV照射、
マイクロ波、電子放出などで照射されるように）の両方
の形態をいう。DNA損傷照射およびDNA損傷波の使用は、
放射線療法の当業者には公知である。
【００４１】本発明はまた、ガンを処置するための有利
な方法を提供する。この方法は、一般に、ガンを有する
動物またはヒト患者に、p53タンパク質または遺伝子お
よびDNA損傷剤の治療的に有効な組み合わせを投与する
工程を含む。これは、組換えウイルス、特に腫瘍の細胞
中でp53を発現し得るベクターを有するアデノウイルス
を用いて達成され得る。p53遺伝子送達組成物は、一般
に、しばしば腫瘍と緊密に接触して、薬学的に受容可能
な組成物の形態で動物に投与され得る。組換えウイルス
内に収容したような治療有効量のp53遺伝子の腫瘍部位
への病変内直接注入は、好ましい方法の１つである。し
かし、他の非経口投与経路（例えば、静脈注射、経皮注
射、内視鏡、または皮下注射）もまた包含される。
【００４２】本発明に従ってガンを処置するには、腫瘍
細胞をp53タンパク質または遺伝子に加えてDNA損傷剤に
接触させる。これは、局在する腫瘍部位をDNA損傷放射
線（例えば、Ｘ線、UV光、γ線、またはマイクロ波まで
も）で照射することにより達成され得る。あるいは、腫
瘍細胞は、動物にDNA損傷化合物を含む治療有効量の薬
学的組成物を投与することによりDNA損傷剤と接触し得
る。この化合物は、例えば、アドリアマイシン、5-フル
オロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、アクチノ
マイシンＤ、マイトマイシンＣ、またはより好ましくは
シスプラチンである。DNA損傷剤は、上記のようにp53タ
ンパク質、遺伝子、または遺伝子送達系と組み合わせる
ことにより、組み合わせた治療組成物またはキットとし
て調製され、そして使用され得る。
【００４３】本発明の驚くべき成功は、シスプラチンと
組み合わせてAd5CMV-p53ウイルスを用いることにより、
ヌードマウスモデルを用いる研究において十分な結果が
得られたという発見により証明される。組み合わせたウ
イルスDNA損傷治療レジメは、H358細胞（通常、著しい
腫瘍集塊を生成する細胞）の腫瘍形成性を著しく阻害し
た。肺ガン細胞の腫瘍形成性は、Ad5CMV-p53による処置
を介して阻害されたが、しかしルシフェラーゼを発現す
るコントロールウイルスによっては阻害されなかった。
これは、DNA損傷剤と組み合わせたp53タンパク質が大き
な治療効力を有することを示す。
【００４４】DNA発現構築物を含む化学療法処方物を真
核細胞へ送達するための多くの方法が、当該分野で公知
である。本開示に照らしてみると、当業者は、DNA損傷
剤およびp53タンパク質または遺伝子の両方を多くの異
なる有効な方法で細胞に送達し得る。
【００４５】DNAのインビボ送達のために、本発明者ら
は、任意の遺伝子送達系（例えば、ウイルス仲介トラン
スフェクションおよびリポソーム仲介トランスフェクシ
ョン）の使用を想像する。本明細書で使用するように、
用語「トランスフェクション」は、送達系（例えば、ア
デノウイルス法、AAV法、レトロウイルス法、またはプ
ラスミド送達遺伝子転移法）を用いての真核細胞へのDN
Aの標的化送達を記載するために用いられる。ウイルス
遺伝子送達の特異性は、遺伝子を特定の標的細胞に優先
的に導くために選択され得る。これは、例えば、特定の
細胞タイプに感染し得るウイルスを用いることによる。
当然、異なるウイルス宿主範囲が遺伝子転移について選
択されるウイルス、ならびに所定の悪性細胞タイプを殺
傷するために発現される有望な腫瘍抑制遺伝子を指図す
る。
【００４６】種々の手段を通して（例えば、静脈注射お
よび皮下注射などの非経口送達方法を用いることによ
り）DNA損傷化学療法剤を提供し得るということもまた
想像される。このような方法は、薬物送達分野の当業者
には公知であり、そして本明細書の薬学的調製物および
処置に関する節においてさらに記載される。
【００４７】インビトロ遺伝子送達のために、例えば、
リン酸カルシウム仲介トランスフェクションまたは硫酸
デキストラン仲介トランスフェクション；エレクトロポ
レーション；ガラス投射物ターゲッティング(glass pro
jectile targeting)などの種々の方法が用いられ得る。
これらの方法は、当業者に公知であり、正確な組成物お
よび実施は、本開示に照らしてみれば明らかである。
【００４８】他の実施態様は、DNA損傷剤（例えば、シ
スプラチン）と組み合わせてp53タンパク質または遺伝
子を含む薬学的処方物を含む組成物に関する。このよう
な組成物において、p53は、動物細胞においてp53タンパ
ク質を発現し得るDNAセグメント、組換えベクター、ま
たは組換えウイルスの形態であり得る。アデノウイルス
粒子のような組換えウイルス遺伝子送達系を含むものを
含むこれらの組成物は、薬理学的に受容可能な溶液また
は緩衝液に分散させることによりインビボ投与のために
処方され得る。好ましい薬理学的に受容可能な溶液は、
リン酸塩、乳酸塩、Trisなどで緩衝化した中性生理食塩
水溶液を包含する。
【００４９】もちろん、ウイルス送達系を用いて、ベク
ター構築物をうける細胞内、動物内、または個体内で不
都合な反応を生じないように、欠陥のある干渉ウイルス
粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような
非所望の混入物が本質的にないようにするために、ビリ
オンを十分に精製することが望ましい。ベクターの好ま
しい精製手段は、塩化セシウム勾配遠心のような浮遊密
度勾配の使用を含む。
【００５０】本発明の好ましい薬学的組成物は、薬理学
的に受容可能な溶液または緩衝液の中に、化学療法DNA
損傷剤と組み合わせて、p53タンパク質、またはより好
ましくはp53遺伝子を含むものである。例示的な化学療
法剤は、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、カン
プトセシン、アクチノマイシンＤ、過酸化水素、マイト
マイシンＣ、シスプラチン(CDDP)、およびエトポシド(V
P-16)であり、シスプラチンの使用が特に好ましい。
【００５１】本発明のさらに別の実施態様は、悪性細胞
のような細胞の殺傷に使用するためのキットであり、ガ
ンの処置に使用するための治療キットに処方され得る。
本発明のキットは一般に、適切な容器手段、動物細胞に
おいてp53タンパク質を発現し得る組換えベクターの薬
学的処方物、およびDNA損傷剤の薬学的処方物を含む。
【００５２】組換えベクターおよびDNA損傷剤は、単一
の容器内に存在し得るか、またはこれらの成分は、異な
るまたは分かれた容器手段中に提供され得る。好ましい
実施態様において、組換えベクターは、アデノウイルス
粒子内に存在する組換えp53発現アデノウイルスベクタ
ーであり、そしてDNA損傷剤はシスプラチンである。
【００５３】キットの成分は、好ましくは液体溶液、ま
たは乾燥粉末として提供される。成分が液体溶液で提供
される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特
に好ましい。試薬または成分が乾燥粉末として提供され
る場合、粉末は適切な溶媒の添加により再構成され得
る。溶媒もまた別の容器手段において提供され得ること
が想像される。
【００５４】
【発明の実施の形態】好適な実施態様の詳細な説明 A．肺ガン発生における分子事象 本発明者により行われる研究は、ガンの発生と進行を導
く重要な分子事象を同定した。これにより、本発明者ら
は、インビボで特定の正常なタンパク質機能を回復して
悪性表現型を抑制し得る新たな方法を開発することが可
能になった。
【００５５】最も一般的な肺ガン組織学(80％)は、非小
細胞肺ガン(NSCLC)という用語のもとに分類され、そし
て、鱗状(squamous)、腺ガン、および未分化大細胞を包
含する。肺ガンの分子生物学に基づく現在の多くのデー
タは、より一般的でない小細胞肺ガン(SCLC)の研究に由
来する。SCLCは、細胞の神経内分泌の特徴によりNSCLC
と区別し得る；SCLCは化学療法に対し非常に応答的であ
るが、処置後すぐに再発する。NSCLCもまた、他の発ガ
ン物質に誘導される上皮ガンのモデルとしての役割を果
たし得る。本研究において開発されたアプローチおよび
観察は他の型の上皮ガンにも適用可能であり得る。
【００５６】悪性形質転換のプロセスは遺伝的パラダイ
ムにより仲介されるという多くの証拠が積み重ねられて
いる。ガン細胞において検出される主要な病変は、優性
なガン遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に存在する。優性ガ
ン遺伝子は、シグナル変換および転写を包含する重要な
正常細胞機能に関与する、ガン原遺伝子と呼ばれるクラ
スの遺伝子において変化を有する。形質転換する能力を
与える優性なガン遺伝子における主要な変化として、点
変異、転座、再配置、および増幅が挙げられる。形質転
換が起こるためには、腫瘍抑制遺伝子は、変異、欠失ま
たはこれらの組み合わせによる機能の同型喪失を必要と
するようである。いくつかの腫瘍抑制遺伝子は、転写の
調節により増幅の管理における役割を果たすようであ
る。優性なガン遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の発現の変
化は、悪性表現型に寄与する細胞の特定の特性に影響す
るようである。
【００５７】ガン遺伝子仲介形質転換に関係するメカニ
ズムの知識の増加にかかわらず、ガン遺伝子およびその
産物を特異的に標的とする治療戦略の開発においてはほ
とんど進歩がない。最初に、この領域における調査が優
性なガン遺伝子に焦点が置かれ、これらが第１に特徴付
けされた。DNA仲介遺伝子転移研究により、悪性ヒト腫
瘍由来のDNAの転移後の正常細胞による悪性表現型の獲
得が示された。
【００５８】B．ガンにおけるp53およびp53変異 現在、p53は腫瘍抑制遺伝子として認識されている(Mont
enarh，1992)。化学的発ガン、紫外線放射、およびいく
つかのウイルス(SV40を含む)により形質転換された多く
の細胞において高レベルが見出されている。p53遺伝子
は、しばしば、広範なヒト腫瘍における変異不活性化の
標的となり、そして一般的なヒトガンにおいて、もっと
も頻繁に変異が起こる遺伝子であることが既に裏付けさ
れている(Mercer，1992)。この遺伝子は、ヒトNSCLCの5
0％以上において(Hollesteinら、1991)および他の広範
な腫瘍において変異している。
【００５９】p53遺伝子は、大Ｔ抗原およびE1Bのような
宿主タンパク質と複合体を形成し得る375アミノ酸のリ
ンタンパク質をコードする。このタンパク質は、正常な
組織および細胞で見出されるが、その濃度は、形質転換
された細胞または腫瘍組織と比較して微小である。興味
深いことに、野生型p53は細胞の増殖および分裂の調節
において重要なようである。野生型p53の過剰発現は、
いくつかの場合においてヒト腫瘍細胞株において抗増殖
的であることが示されている。従って、p53は、細胞増
殖の負のレギュレーターとして作用し得(Weinberg，199
1)、そして非制御細胞増殖を直接抑制し得るか、または
間接的に、この増殖を抑制する遺伝子を活性化し得る。
従って、野生型p53の存在または非活性化は、形質転換
に寄与する。しかし、いくつかの研究は、遺伝子の形質
転換する潜在能力の完全な発現のためには、変異p53の
存在が必要であることを示す。
【００６０】野生型p53は、多くの細胞型において中心
的に重要な増殖レギュレーターとして認識されるが、そ
の遺伝子的特性および生化学的特性も、同様の役割を有
するようである。ミスセンス変異はp53遺伝子には一般
的であり、そしてガン遺伝子の形質転換能力に不可欠で
ある。点変異により促進される１つの遺伝的変化により
発ガン性p53を作製し得る。しかし、他のガン遺伝子と
異なり、p53の点変異は、少なくとも30の異なるコドン
において起こることが知られており、しばしば、同型接
合性を減少させることなく細胞表現型のシフトを生み出
す優性対立遺伝子を作製する。さらに、これらの優性ネ
ガティブ対立遺伝子の多くは、生物内で許容され、そし
て生殖細胞に伝えられる。種々の変異対立遺伝子は、最
小限の機能障害を起こした対立遺伝子から強力に影響を
与える優性ネガティブ対立遺伝子までの範囲であるよう
である(Weinberg，1991)。
【００６１】Caseyと共同研究者らは、２つのヒト乳ガ
ン細胞株への野生型p53をコードするDNAのトランスフェ
クションにより、このような細胞における増殖抑制制御
を回復することを報告している(Caseyら、1991)。同様
の効果がまた、ヒト肺ガン細胞株への野生型(しかし、
変異ではない)p53のトランスフェクションにおいても示
されている(Takahasiら、1992)。p53は変異遺伝子以上
に優性であるようであり、そして変異遺伝子を有する細
胞へトランスフェクトされる場合、増殖に対して選択を
行う。トランスフェクトされたp53の正常な発現は、内
因性p53を有する細胞の増殖に影響しない。従って、こ
のような構築物は、有害効果なく正常細胞により取り込
まれ得る。
【００６２】従って、野生型p53を用いるp53関連ガンの
処置により悪性細胞数を減少させることが可能である。
しかし、上記のような研究は、このような研究の達成か
らは程遠い。なぜなら、少なくとも特に、DNAトランス
フェクションは、患者の身体内のガン細胞へDNAを導入
するために使用され得ないからである。
【００６３】C．遺伝子治療技術 今日までに提示された遺伝子治療に対するいくつかの実
験的アプローチが存在するが、各々がその特有の欠点を
抱える(Mulligan，1993)。上記のように、目的の遺伝子
を有するDNAを、非生物学的に(例えば細胞膜を物理的に
または化学的に透過性にすることにより)細胞内へ導入
する基本的なトランスフェクション方法が存在する。本
来、このアプローチは、一時的に身体から取り出され
得、そして処置の細胞障害性に耐え得る細胞(すなわち
リンパ球)に限られる。特定の脂質および両親媒性ペプ
チドを用いて形成されるリポソームまたはタンパク質結
合体がトランスフェクションのために使用され得るが、
遺伝子組み込みの効率は依然として非常に低く、1,000
細胞〜100,000細胞当たり１つの組み込みの程度であ
り、そしてトランスフェクトされた遺伝子の発現は、し
ばしば、増殖中の細胞において何日間かに限られるか、
または非増殖中の細胞においては、何週間かに限られ
る。それ故、DNAトランスフェクションは明らかにガン
処置のための適切な方法ではない。
【００６４】第２のアプローチは、ウイルスの細胞へ進
入する自然の能力(ウイルスがそれ自身の遺伝物質をウ
イルスと共に持込むこと)を利用する。レトロウイルス
は、その遺伝子を宿主ゲノムへ組み込む能力、多量の外
来遺伝物質を転移し、広範な種および細胞型に感染し、
そして特定の細胞株中でパッケージされることにより遺
伝子送達ベクターとしての可能性を有する。しかし、３
つの大きな問題により、レトロウイルスベクターの実際
の使用が妨げられる。第１に、レトロウイルスの感染力
は、標的表面のウイルスのレセプターの利用可能性に依
存する。第２に、レトロウイルスのみが効率的に複製細
胞に取り込まれる。そして最後に、レトロウイルスは、
濃縮し、そして精製することが困難である。
【００６５】D．遺伝子治療における使用のためのアデ
ノウイルス構築物 ヒトアデノウイルスは、約36kbのゲノムサイズを有する
２本鎖DNA腫瘍ウイルスである(Tooza，1981)。真核生物
遺伝子発現のためのモデル系として、アデノウイルスは
広く研究され、そして十分に特徴付けされており、これ
は、遺伝子転移系としてのアデノウイルスの開発につい
て、アデノウイルスを魅力的な系にする。この群のウイ
ルスは、容易に増殖し、操作され、そしてインビトロお
よびインビボで広い宿主域を示す。溶解的に感染した細
胞において、アデノウイルスは宿主のタンパク質合成を
停止させ得、多量のウイルスタンパク質を合成する細胞
構造を誘導し、そして多量のウイルスを産生する。
【００６６】ゲノムのE1領域は、ウイルスゲノムの転写
調節に関与するタンパク質をコードするE1AおよびE1B、
ならびに小数の細胞遺伝子を含む。E2AおよびE2Bを含む
E2発現は、ウイルスの複製機能(例えば、DNA結合タンパ
ク質、DNAポリメラーゼ、および複製をプライムする末
端タンパク質)の合成を可能にする。E3遺伝子産物は、
細胞障害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を
妨げ、そしてウイルス増殖に重要であるようである。E4
タンパク質に関連する機能は、DNA複製、後期遺伝子発
現、および宿主細胞の停止(shutoff)を包含する。後期
遺伝子産物は、ほとんどのビリオンキャップシドタンパ
ク質を包含し、そしてこれらは、主要後期プロモーター
からの１つの一次転写物のプロセシングが生じた後にの
み発現される。主要後期プロモーター(MLP)は、感染の
後期相の間、高い効率を示す(Stratford-Perricaudetお
よびPerricaudet，1991a)。
【００６７】ウイルスゲノムの少しの部分のみがシスに
おいて必要であるようであるため(Tooza，1981)、アデ
ノウイルス由来ベクターは、293細胞のような細胞株に
関連して使用された場合、大きなDNA断片の置換のため
の優れた潜在能力を提供する。Ad-5により形質転換され
たヒト胎児腎臓細胞株(Grahamら、1977)が、トランスに
おける必須ウイルスタンパク質を提供するために開発さ
れている。従って、本発明者は、アデノウイルスの特質
により、アデノウイルスはインビボでガン細胞を標的化
するのに有用な候補物になると論じた(GrunhausおよびH
orwits，1992)。
【００６８】細胞への外来タンパク質の送達のためのア
デノウイルス系の特に有用な利点として、(i)外来DNAに
よりウイルスDNAの比較的大きな部分を置換する能力；
(ii)組換えアデノウイルスの構造安定性；(iii)ヒトへ
のアデノウイルス投与の安全性；および(iv)アデノウイ
ルス感染とガンまたは悪性腫瘍との公知の関連がないこ
と；(v)組換えウイルスの高い力価を得る能力；および
(vi)アデノウイルスの高い感染力、が挙げられる。
【００６９】レトロウイルス以上にアデノウイルスベク
ターのさらなる利点として、高レベルの遺伝子発現が挙
げられる。さらに、アデノウイルス複製は、レトロウイ
ルスの配列と異なり、宿主遺伝子複製から独立してい
る。E1領域のアデノウイルス形質転換遺伝子を容易に欠
失し得、そしてそれでもなお効率的な発現ベクターを提
供し得るため、アデノウイルスベクターのガン遺伝子的
な危険性は無視し得ると考えられる(GrunhausおよびHor
witz，1992)。
【００７０】一般に、アデノウイルス遺伝子転移系は、
E1のようなそのゲノムの一部の欠失により、複製不能に
されるが、それでも依然その感染能力を保持する組換
え、遺伝子操作アデノウイルスを基礎とする。さらなる
欠失がアデノウイルスゲノムにおいてなされる場合、比
較的大きな外来タンパク質を発現し得る。例えば、E1領
域およびE3領域の両方が欠失したアデノウイルスは10kb
までの外来DNAを有し得、そして293細胞において高い力
価に増殖し得る(Stratford-PerricaudetおよびPerricau
det，1991a)。驚くことに、アデノウイルス感染後の転
移遺伝子の持続的な発現もまた、報告されている。
【００７１】アデノウイルス仲介遺伝子転移は、最近、
真核生物細胞および全動物への遺伝子転移を仲介する手
段として研究されている。例えば、珍しい劣性遺伝子障
害であるオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損
症のマウスの処置において、アデノウイルス構築物が正
常なOTC酵素を補給するために用いられ得ることが見出
された。残念ながら、OTCの正常レベルの発現は、17例
の中４例において達成されたに過ぎなかった(Stratford
-Perricaudetら、1991b)。それ故、欠損症はほとんどの
マウスにおいて部分的に矯正されたに過ぎず、そして生
理的変化または表現型変化を導かなかった。それ故、こ
れらのタイプの結果は、ガン治療におけるアデノウイル
スベクターの使用をほとんど促進しない。
【００７２】ワタオオネズミ(cotton rat)の肺上皮細胞
への嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター
(CFTR)遺伝子を転移するためにアデノウイルスを使用す
る試みもまた、部分的に成功しているが、動物の上皮に
おける転移遺伝子の生物活性を評価することは不可能で
あった(Rosenfeldら、1992)。また、これらの研究は、
肺気道細胞におけるCFTRタンパク質の遺伝子転移および
発現を示したが、生理的な効果は示さなかった。1991年
のScienceの論文において、Rosenfeldらは、α１-アン
チトリプシンタンパク質の肺発現を示したが、これもま
た生理的効果を示さなかった。事実、彼らは、観察した
発現のレベルは、ヒトにおける肺の保護に必要なレベル
の約２％(すなわち、生理的効果に必要なレベルよりは
るかに低い)にすぎなかったと算定した。
【００７３】ヒトα１-アンチトリプシン遺伝子は、門
脈内注入により正常ラットの肝臓へ導入された。この場
合、遺伝子は発現し、そしてこの結果、これらのラット
の血漿中に導入されたヒトタンパク質を分泌した(Jaffe
ら、1992)。しかし、そして、残念なことに、得られた
レベルは治療値レベルには十分な高さではなかった。
【００７４】これらのタイプの結果は、アデノウイルス
が組換え細胞において十分なタンパク質の発現を導き、
生理的に関連する効果を達成し得ることを示さず、それ
故、ガン治療に関連した使用のためのアデノウイルス系
の有用性を示唆しない。さらに、本発明の以前には、p5
3は障害性であるため、アデノウイルスを調製するため
に用いられるようなパッケージング細胞中に取り込まれ
得ないと考えられた。
【００７５】アデノウイルスのE1Bはp53に結合するた
め、これは、アデノウイルスとp53技術は組み合わせら
れないさらなる理由と考えられた。
【００７６】E．p53アデノウイルス構築物および腫瘍抑
制 本発明は、新規なそしてさらに効果的な腫瘍抑制ベ
クターを用いるガン遺伝子治療を提供する。この組換え
ウイルスは、高力価、広い標的域、効率的な形質導入、
および標的細胞での非組み込みのようなアデノウイルス
ベクターの利点を利用する。本発明の１つの実施態様に
おいて、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御
下で野生型p53(Ad5CMV-p53)を発現する、複製能欠損、
ヘルパー非依存アデノウイルスが作製される。
【００７７】哺乳動物細胞において発現が所望される場
合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスから提
供される。例えば、一般的に使用されるプロモーター
は、ポリオーマ、アデノウイルス２およびシミアンウイ
ルス40(SV40)に由来する。SV40ウイルスの初期および後
期プロモーターは特に有用である。なぜなら、両方は、
SV40ウイルスの複製起点をも含む断片として容易にウイ
ルスから得られるからである。ウイルスの複製起点内に
位置するHindIII部位からBglI部位へ伸びる約250bpの配
列を含む場合、より短いかまたはより長いSV40断片もま
た使用され得る。
【００７８】さらに、含まれる遺伝子配列と通常、関連
するプロモーター配列または制御配列(そのような制御
配列が宿主細胞系と適合する場合)を、利用することも
また、可能であり、そしてしばしば望ましくある。
【００７９】複製起点は、ベクターの構築により提供さ
れて、SV40または他のウイルス(例えば、ポリオーマ、
アデノ、VSV、BPV)起源に由来し得る外因性起点を含み
得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供さ
れ得る。ベクターが宿主細胞染色体中に組み込まれる場
合、多くの場合、後者で十分である。
【００８０】好ましいp53アデノウイルスの設計および
増殖を図１に図示する。これと関連して、組換えアデノ
ウイルスを増殖させそして同定するための改善されたプ
ロトコルが開発された(以下で論じられる)。同定の後、
p53組換えアデノウイルスを、図２に示すように、PCR分
析により構造的に確認した。その構造体の単離および確
認後、p53アデノウイルスは、同型p53遺伝子欠失を有す
るヒト肺ガン細胞株H358を感染させるために用いられ
た。ウェスタンブロットは、外因性p53タンパク質は、
高レベルで発現され(図４および図５)、そして感染後３
日目でピークになったことを示した(図６)。
【００８１】p53点変異細胞株H322において、変異p53
は、外因性p53の発現によりダウンレギュレートされる
ことも示された。コントロール実験として、Ad5CMV-p53
ビリオンと構造的類似性を有するビリオン(Ad5/RSV/GL
2)を使用した。このビリオンは、ビリオンの発現カセッ
ト内にラウス肉腫ウイルスLTRプロモーターにより駆動
されるルシフェラーゼcDNAを含んだ。ビリオンAd5/RSV/
GL2により感染させた細胞において、p53発現およびアク
チン発現の変化はいずれも検出されなかった。
【００８２】非感染細胞またはコントロールビリオンで
感染させたH358細胞の増殖と対照的に、Ad5CMV-p53で感
染させたH358細胞の増殖は大きく阻害された(図７Ａ)。
H322細胞の増殖もまた、p53ビリオンにより大きく阻害
された(図７Ｂ)が、野生型p53を含有するヒト肺ガンH46
0細胞の増殖は、ほとんど影響を受けなかった(図７
Ｃ)。
【００８３】Ad5CMV-p53は、インビトロの肺ガン細胞増
殖における強力な阻害効果を仲介した。細胞をIPFU/細
胞未満のMOIでAd5CMV-p53で感染させた場合、増殖阻害
はそれ程明らかでなかったが、100PFU/細胞より高いMOI
ではコントロールウイルスAd5/RSV/GL2においても細胞
障害性が観察され得た。本発明者らの研究において、増
殖速度研究に最適な用量は10〜50PFU/細胞であった。こ
の用量範囲内で、細胞増殖阻害は、発現したp53タンパ
ク質に帰因し得た。
【００８４】ヌードマウスにおける試験は、Ad5CMV-p53
処置のH358細胞の腫瘍形成が大きく阻害されたことを示
した。正所性ヒト肺ガンのマウスモデルにおいて、p53
に点変異を有する腫瘍形成H226Br細胞を、ウイルス処置
の３日前に気管内接種した。
【００８５】Ad5CMV-p53の気管内点滴注入により、この
モデル系における腫瘍形成が妨げられた。これは、改変
されたアデノウイルスが、ヒトガン細胞において腫瘍抑
制遺伝子の転移および発現を仲介するための効率的なベ
クターであり、そしてAd5CMV-p53ウイルスは、ガン遺伝
子治療における使用のための治療薬剤としてさらに開発
され得ることを示唆する。
【００８６】Ad5CMV-p53は、ウェスタンブロット分析に
より示されたように、ヒト肺ガン細胞におけるp53遺伝
子の高レベルの発現を仲介した。H460細胞において、外
因性p53タンパク質は、内因性野生型p53より約14倍多
く、そしてH358細胞においてはβアクチン内部コントロ
ールより約２倍〜４倍多かった。高レベルの発現は、
(1)非常に効率的な遺伝子転移、(2)p53 cDNAを駆動する
強力なCMVプロモーター、および(3)p53 cDNA転写を増強
するアデノウイルスE1エンハンサー、に帰因し得る。H3
58細胞において、感染後のp53発現の持続期間は、15日
より長かった。しかし、感染後５日目以後、発現が急速
に減少した。感染H358細胞由来のDNAサンプルのPCR分析
は、タンパク質レベルの減少を伴うウイルスDNAレベル
の減少を示し、インビトロでのガン細胞の継続的な増殖
の間のウイルスDNAの喪失を示した。
【００８７】p53発現の減少はまた、p53発現を制御する
CMVプロモーターの細胞性弱化(attenuation)の結果であ
った。なぜなら、宿主細胞仲介のCMVプロモーターの停
止現象が以前に報告されているからである(Daiら、199
2)。アデノウイルスベクターは非組み込み遺伝子転移ベ
クターであり、それ故、遺伝子発現の持続期間は、宿主
細胞、転移される遺伝子、および関係するプロモーター
を包含する多くの要因に依存する。Crystalおよび共同
研究者は、ワタオネズミ上皮細胞における嚢胞性線維症
膜貫通コンダクタンスレギュレーター遺伝子の低レベル
発現が、感染後６週間で検出可能であることを示した(R
osenfeldら、1992)。Perricaudetの研究室は、mdxマウ
スの筋肉におけるミニジストロフィン(minidystrophin)
遺伝子の最小限の発現が、感染後３ヶ月より長く継続し
たことを示した。本研究において観察された野生型p53
タンパク質の短期間の高レベル発現は、インビボでのAd
5CMV-p53を用いる処置後の正常細胞における可能な副作
用を減少させる有利な効果を有し得る。
【００８８】本明細書において開示される研究は、p53
組換えアデノウイルスは腫瘍抑制の特性を有することを
示し、腫瘍抑制は、腫瘍細胞中でp53タンパク質機能を
回復することにより作用するようである。これらの結果
は、ガン処置のための治療薬剤としてのAd5CMV-p53ビリ
オンの使用についての支持を提供する。
【００８９】F．DNA損傷薬剤 広範な種々のDNA損傷薬剤が本発明に用いられ得る。例
えば、DNAを直接架橋する薬剤、DNAに挿入される薬剤、
そして核酸合成に影響を与えることにより、染色体異常
および有糸分裂異常を導く薬剤である。
【００９０】本明細書において、相乗作用的な抗新生物
的な組み合わせを導くDNA損傷に到る核酸、特にDNAを直
接架橋する薬剤が期待されそして示される。シスプラチ
ン、および他のDNAアルキル化剤のような薬剤が使用さ
れ得る。シスプラチンは、合計３段階の間、３週間ごと
に５日間20mg/m2の臨床適用において用いられる効率的
な用量で、ガンを処置するために広く使用されている。
シスプラチンは経口的に吸収されず、それ故静脈内、皮
下的、腫瘍内または腹腔内注射により送達されなければ
ならない。
【００９１】DNAに損傷を与える薬剤はまた、DNA複製、
有糸分裂、および染色体分離を妨げる化合物を包含す
る。これらの化合物の例として、ドクソルビシンとして
も知られるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミ
ル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。新生物の処
置のための臨床設定において広く使用されるこれらの化
合物は、ボーラス注射により、アドリアマイシンについ
ては21日間隔で25〜75mg/m 2の範囲の用量で静脈内投与
され、エトポシドについては、35〜50mg/m2の範囲の用
量で静脈内投与されるかまたは静脈内投与の２倍の用量
で経口投与される。
【００９２】核酸前駆体の合成および忠実度を破壊する
薬剤、およびサブユニットもまた、DNA損傷を導く。そ
のようなものとして、多くの核酸前駆体が開発されてい
る。
【００９３】拡大試験を受けそして容易に入手可能な薬
剤が特に有用である。そのようなものとして、5-フルオ
ロウラシル(5-FU)のような薬剤が、新生物組織により優
先的に使用されるが、これは新生物細胞に対する標的の
ために、この薬剤を特に有用にする。5-FUは相当に障害
性であるが、局所的を含めて広範なキャリア中で適用可
能である。しかし、３mg〜15mg/kg/日の範囲の静脈内用
量が一般的に使用される。
【００９４】DNA損傷を引き起こし、そして広く使用さ
れている他の因子は、一般にγ線、Ｘ線として知られる
もの、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の方向
付けされた送達を包含する。DNA損傷因子の他の形態は
また、マイクロ波および紫外線照射などが考慮される。
これらの全ての因子は、DNA前駆体、DNAの複製および修
復、ならびに染色体の組立および維持における広範な損
傷をもたらす。Ｘ線についての用量範囲は、長期間(３
〜４週間)について50〜200レントゲンの日常用量から20
00〜6000レントゲンの単回用量の範囲である。放射性同
位体についての用量範囲は、広く変化し、そして同位体
の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、なら
びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００９５】当業者は「Remington's Pharmaceutical S
ciences」第15版、第33章、特に624〜652頁を参照され
たい。処置される被験体の状態に依存して、用量のいく
らかの変更が必然的に起こり得る。投与に責任を負う人
が、いかなる場合でも、個々の被験体に適切な用量を決
定する。さらに、ヒト投与については、調製物は、FDA
のOffice of Biologics基準により要求される減菌度基
準、発熱性基準、一般的な安全性基準および純度基準に
合致すべきである。
【００９６】G．p53およびシスプラチン処置 ヒトガンにおける遺伝子置換治療と化学療法との組み合
わせの効力を測定する努力において、本発明者らは、Ad
-p53およびCDDPの連続投与がインビボでアポトーシスを
誘導し得るか否か調べた。Ad-p53の直接腫瘍内注射また
はCDDPの腹腔内投与の３日後、nu/nuマウスにおいて皮
下移植されたH358腫瘍は、増殖の多少の緩和を示した。
しかし、Ad-p53およびCDDPが同時に投与された場合、腫
瘍は部分的に退縮し、そして腫瘍サイズは、他のいずれ
の処置群のサイズより統計的に有意に小さいままであっ
た。増殖阻害効果は、処置の２サイクル後でさらに顕著
であった(図13Ａ)。組織学的検査は、CDDPで処置された
マウスにおいてAd-p53が注射された領域における腫瘍細
胞の大量の破壊を明らかにした。インサイチュ染色は、
無細胞空間の周りの多くのアポトーシス性の細胞を示し
た(図13Ｂ-図13Ｅ)。対照的に、CDDP単独かまたはAd-p5
3単独で処置された腫瘍は、無細胞領域およびアポトー
シス性領域のいずれも示さなかった。
【００９７】本発明は、DNA架橋剤を用いる従来の化学
療法と組み合わせたヒト遺伝子治療のための新規な戦略
を記載する。化学療法剤に耐性の腫瘍細胞は、臨床腫瘍
学における主要な問題を代表する。NSCLCは肺ガンの症
例の少なくとも80％を数える；しかし、NSCLCの患者
は、一般的に化学療法に対して非応答性である(Doyle,
1993)。現在のガン研究の１つの目標は、遺伝子産物と
化学療法薬剤との間の相互作用を研究することによりガ
ンのための遺伝子置換治療の効力を改善する方法を見い
出すことである。単純ヘルペスチミジンキナーゼ(HS-t
K)遺伝子は、レトロウイルスベクター系により脳腫瘍へ
送達される場合、抗ウイルス剤であるガンシクロビルに
対する感受性を首尾良く誘導した(Culverら、1992)。HS
-tK遺伝子産物は外因性ウイルス酵素であるが、wt-p53
タンパク質は正常組織中で発現される。これは、wt-p53
発現の変化による化学耐性の調整は、内因性遺伝子的プ
ログラムにより仲介される経路を用いる代替アプローチ
であり得ることを示唆する。
【００９８】アデノウイルス系は、高力価のウイルス産
生の容易さ、高い感染効率、および多くの細胞型に対す
る感染力のような、インビボでの遺伝子送達のための潜
在的な利点を有する。しかし、導入される遺伝子の発現
の安定性および持続期間は依然として議論の余地があ
る。化学-遺伝子治療について、発現のレベルおよび高
い感染力は発現の持続期間より重要であり得る。なぜな
ら、薬物は感染細胞を数日以内に殺傷し得るからであ
る。化学療法剤に感受性の細胞におけるp53レベルの増
加は、DNA損傷刺激後６時間以内に起こり得る(Fritsche
ら、1993、Zhanら、1993)が、増加したp53 DNA結合活性
は、刺激が除去される場合、４時間の経過の間逆となり
得る(Tishlerら、1993)。本発明のモデルにおいて、wt-
p53遺伝子の発現は、Ad-p53ベクターに含まれるサイト
メガロウイルスにより独立して駆動される。それ故、薬
物曝露の停止後でも高レベルのp53発現が維持され得
る。Ad-p53によるwt-p53タンパク質の発現は、感染後３
日目でピークとなり(内因性野生型の14倍を超える)、そ
して９日目までに低レベルに減少する(Zhangら、199
3)。これは、一時的な高レベルのwt-p53発現が、ガン細
胞において細胞障害プログラムを開始するには十分であ
ることを示唆する。
【００９９】H．患者および処置プロトコル 本発明者は、p53関連ガン（例えば、切除不能な閉塞性
気管支内ガン）患者における肺ガン細胞へのアデノウイ
ルスp53遺伝子構築物の部位的送達は、臨床疾患に対処
するために治療学的に有効な遺伝子を送達する非常に効
率的な方法であると提案する。p53遺伝子の送達は、DNA
損傷を導く薬剤または因子との組合せて行われるべきで
ある。この組み合わせアプローチは、現在のガン治療
（例えば、シスプラチン単独に対する感受性の喪失）に
対する大きな進歩である。この治療は、DNA損傷をもた
らすことにより末期ガン細胞を殺傷または除去する試み
に依存する。腫瘍細胞休止は確立された現象であるた
め、これにより効果的な殺傷を行うことは成功の見込み
が非常に少ない。
【０１００】NSCLC細胞によるアデノウイルス構築物の
取り込みはこれらの細胞の増殖速度を低下させることが
期待されるが、本実施例は、DNA損傷薬剤または因子のp
53アデノウイルスとの組み合わせ使用が、それぞれの因
子単独では見られない細胞増殖および腫瘍サイズの十分
な減少を導くことを示す。本明細書で開示する組成物お
よび方法は、冒された肺が肥大した状態である時間の長
さの増加を強く警告し、腫瘍の再増殖および腫瘍細胞の
分裂を阻止し、そして患者の生存を延長する。
【０１０１】部分的にまたは完全に気道を閉塞して、か
つ外部からのビーム放射線療法を受けられなかったかま
たは受けられ得ない切除不能な気管支内腫瘍再発を有す
る患者は、この組み合わせたプロトコルに対して考慮さ
れる。この状態について既存の治療は、短期間の緩和を
提供するのみである。ほとんどの患者は、外部ビーム放
射線療法にもかかわらず、再発する。近接照射療法（br
achytherapy）カテーテルを挿入し、そして付加的な放
射線療法、DNA損傷薬剤の静脈内投与を行うことは可能
であり得る。現行の処置を受けている患者は、その生存
が平均して６カ月である。近接照射療法が不可能な患者
はまた、遺伝子治療を受けることも望ましいとされる。
腫瘍は、レーザーまたはバイオプシー鉗子を用いて気道
から除去され得る。これはアデノウイルスの構築物の注
入と一緒に行われ得、従って注入しなければならない容
量を減らし得る。腫瘍が進行している場合、ウイルス構
築物の投与は、他の緩和治療を受けている患者を除外し
ない。
【０１０２】I．他の遺伝子転移技術 遺伝子治療の成功には、一般的に、遺伝子疾患を直し得
る遺伝子の宿主ゲノムへの組込みが必要とされる。この
場合、その遺伝子は、宿主DNAと共存して複製し、そし
て欠陥遺伝子を補償するレベルで発現される。理想的に
は、疾患は、重篤な副作用を伴わずに１つまたはいくつ
かの処置により治療される。遺伝子治療に対するいくつ
かのアプローチが今日までに提案されており、これらは
本発明とともに使用され得る。
【０１０３】第１のアプローチは、目的の遺伝子を含有
するDNAを細胞にトランスフェクトすることである（例
えば、化学的または物理的のいずれかにより細胞膜を透
過させることによる）。このアプローチは、一般的に、
身体から一時的に取り出され得、かつ処置の細胞障害性
に耐え得る細胞（すなわち、リンパ球）に限定される。
特定の脂質および両親媒性ペプチドとともに形成される
リポソームまたはタンパク質結合体が、インビボトラン
スフェクションのために使用され得る（Stewartら、199
2；Torchilinら、1992；Zhuら、1993）。しかし、現在
の遺伝子組込み効率は非常に低い。目的の遺伝子は、1,
000〜100,000においてわずか１個の細胞のゲノムに組み
込まれると推定される。組込みがない場合、組込まれな
かったDNAの崩壊のために、トランスフェクトされた遺
伝子の発現は、増殖細胞においては数日または非増殖細
胞においては数週間に限定される。
【０１０４】第２のアプローチは、細胞に進入するため
に、ウイルスとともに自身の遺伝物質を持ち込むウイル
スの本来の能力を利用する。レトロウイルスは、自身の
遺伝子を宿主ゲノムに組み込む能力のために、遺伝子送
達ベクターとしての可能性を有する。それは、大量の外
来遺伝物質を転移させ、広範囲の種および広範囲の細胞
タイプに感染し、そして特別な細胞株においてパッケー
ジされることによる（Miller、1992）。
【０１０５】第３の方法は他のウイルスを用いる。この
ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、単純ヘル
ペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、
およびアデノ関連ウイルス（AAV）が挙げられ、これら
は遺伝子転移用のベクターとして取り扱うために操作さ
れる。外来遺伝物質を受容し得るいくつかのウイルス
は、収容し得るヌクレオチド数および感染する細胞の範
囲において限定されるが、これらのウイルスは、遺伝子
発現を首尾良く達成することが示されている。しかし、
アデノウイルスは遺伝物質を宿主ゲノムに組み込まず、
それ故に遺伝子発現のための宿主の複製を必要としな
い。そのため、迅速で効率的な異種遺伝子発現に対して
理想的に適している。
【０１０６】本発明をある程度詳細に記載しているが、
多くの代替、改変、および変化が以下の開示に照らして
当業者に明白であることは明らかである。従って、本発
明の意図および範囲内にあるこのような代替、改変、お
よび変化は、定義される請求の範囲に包含されることを
意図する。
【０１０７】
【実施例】以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様
を示すために含まれる。以下の本実施例において開示さ
れる技術は、本発明の実施においてよく機能することが
本発明者により見出された技術を表し、そしてその実施
のための好ましい態様を構成すると見なされ得ること
は、当業者により理解されるべきである。しかし、当業
者は、本開示に照らして、開示され、そしてさらに本発
明の意図および範囲から逸脱することなく同様の結果ま
たは類似の結果が得られる特定の実施様態において多く
の変更をなし得ると理解すべきである。
【０１０８】実施例１p53発現ベクターの構築 本実施例はp53発現ベクターの構築を記載する。このベ
クターを、指示される通りに構築し、そしてアデノウイ
ルス株Ad5ゲノムのE1領域（1.3-9.2m.u.）を置換するた
めに使用して、実施例２に記載のアデノウイルスビリオ
ン（virion）を構築するために用いる。
【０１０９】図１に示すp53発現カセットは、ヒトサイ
トメガロウイルス（CMV）プロモーター（Boshartら、19
85）、p53cDNA、およびSV40初期ポリアデニル化シグナ
ルを含有し、これをpXCJL1（Frank L．Graham博士、McM
aster University、Canadaより提供された）のXbaI部位
とClaI部位との間に挿入した。
【０１１０】ゲノムサイズは約35.4kbであり、100マッ
プユニット（map unit）（１m.u.＝0.35kb）に分割され
る。p53発現カセットは、Ad5ゲノムのE1領域（1.3-9.2
m.u.）を置換した。
【０１１１】プライマー１は、配列5'-GGCCCACCCCCTTGG
CTTC-3'（配列番号：１）を有し、そしてヒトCMV主要IE
遺伝子プロモーター（Boshartら、1985）の下流の第１
イントロン中に位置する。プライマー２は、配列5'-TTG
TAACCATTATAAGCTGC-3'（配列番号：２）を有し、そして
SV40初期ポリアデニル化シグナル中に位置する。両方の
プライマー（p53 cDNA挿入物から両端で15bp〜20bp離れ
ている）は、1.40kb PCR産物を規定する。プライマー３
は、配列5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3'（配列番号：３）
を有し、そしてプライマー４は、配列5'-CATCTGAACTCAA
AGCGTGG-3'（配列番号：４）を有し、それぞれ、Ad5ゲ
ノムの11m.u.および13.4m.u.に位置し、これらは、0.86
kbウイルスゲノム特異的PCR産物を規定する。
【０１１２】実施例２組換えp53アデノウイルスの生成および増殖 本実施例は、p53を発現するヘルパー非依存的組換えア
デノウイルスを生成するために最適な１つの方法を記載
する。組換えアデノウイルスを作製するために用いた分
子戦略は、アデノウイルスのパッケージング限界のた
め、pJM17はそれ自身でウイルスを形成できないという
事実に基づく。従って、トランスフェクトされた細胞内
でのp53発現ベクタープラスミドとpJM17との間の相同組
換えの結果、必要なアデノウイルスタンパク質を発現す
る細胞内でのみパッケージされ得る生存可能なウイルス
が生じる。
【０１１３】本実施例の方法は、E1またはE3領域で異種
DNA発現カセットの置換を含有する、ウイルスを増殖さ
せるための宿主細胞として、293細胞を利用する。この
プロセスは、293細胞へのDNAのコトランスフェクション
(cotransfection)を必要とする。トランスフェクション
は、ウイルス増殖の効率を主として決定する。本発明以
前の293細胞へのDNAのトランスフェクションのために使
用された方法は、通常、リン酸カルシウム／DNA共沈殿
であった（Grahamおよびvan der Eb、1973）。
【０１１４】しかし、プラークアッセイを伴うこの方法
は、比較的困難であり、そして典型的にはウイルス増殖
効率が低い結果となる。本実施例で図示するように、ト
ランスフェクションおよび感染細胞のその後の同定は、
トランスフェクトされた細胞を細胞変性効果（CPE）に
より同定する場合、リポソーム仲介トランスフェクショ
ンを使用することにより著しく改善された。
【０１１５】293細胞株を、10％熱不活性化ウマ血清を
補充したダルベッコ改変最少必須培地中で維持した。相
同組換えのためのp53発現ベクターおよびプラスミドpJM
17（McGroryら、1988）を、製造者のプロトコル（Boehr
inger Mannheim Biochemicals、1992）に従い、DOTAP仲
介トランスフェクションにより293細胞にコトランスフ
ェクトした。これを、図１に模式的に示す。
【０１１６】293細胞（継代35、60％コンフルエント）
を60mmディッシュまたは24ウェルプレートのいずれかで
トランスフェクト前24時間インキュベートした。各ウェ
ル中の細胞を、30μl DOTAP、２μgのp53発現ベクタ
ー、および３μgのプラスミドpJM17とともにトランスフ
ェクトした。トランスフェクション後、CPEの開始ま
で、細胞にMEM培地を２〜３日毎に与えた。
【０１１７】実施例３組換えアデノウイルスの同一性の確認 本実施例は、適当な細胞株のコトランスフェクション後
の組換えビリオンの同一性を確認するための新しいポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイを示す。
【０１１８】細胞培養上清のアリコート（50μlから370
μl）を試験プレートから集め、プロテイナーゼＫ（0.5
％SDSおよび20mM EDTAとともに50μg/ml）で56℃で１時
間処理し、フェノール-クロロホルムで抽出し、そして
核酸をエタノール沈殿した。DNAペレットを20μl dH2O
中で再懸濁して、PCR増幅のための鋳型として使用し
た。PCRプライマーの相対的位置およびそれらの配列を
図１に示し、そして、それらはそれぞれ配列番号１、
２、３および４である。cDNA挿入物特異的プライマーは
1.4kb PCR産物を規定し、そしてウイルスゲノム特異的
プライマーは0.86kbPCR産物を規定する。PCR反応を、４
mM MgCl2、50mM KCl、0.1％triton X-100、200μMの各d
NTP、10mM Tris-Cl（pH9.0）、２μMの各プライマー、
および1.0ユニットのTaqポリメラーゼ（Promega）を含
有する50μl容量で行った。反応を、94℃、0.5分、56
℃、0.5分、そして72℃、１分で、30サイクル行った。
【０１１９】新たに増殖した組換えウイルスの同定の手
順を単純化するために、細胞培養培地上清からのDNAサ
ンプルに対する直接PCRアッセイを開発した。CPEを有す
る細胞培地上清のアリコート（50μlまたは370μl）
を、プロテイナーゼＫで処理し、そしてフェノール／ク
ロロホルム抽出した。エタノール沈殿後、DNAサンプル
を、挿入物特異的配列およびウイルスゲノム特異的配列
を増幅するための２組のプライマーを用いるPCRを使用
して分析した。PCRプライマー標的およびそれらの配列
を図１に示す。プライマー１、２、３および４は、それ
ぞれ配列番号１、２、３および４により表される。
【０１２０】結果として、1.4kb cDNA挿入物および0.86
kbウイルスゲノムフラグメントを、発現ベクター（ポジ
ティブコントロール）およびポジティブ細胞培養物のDN
Aサンプルから増幅した（図２Ｂ、それぞれレーン１お
よび４）。0.86kbフラグメントのみが、Ad5/RSV/GL2ウ
イルスのDNAサンプルから増幅された（ネガティブコン
トロール、レーン２）。いずれの未処理ポジティブ細胞
培養培地上清をも用いたPCR反応物からは、増幅された
バンドは見られなかった（レーン３）。
【０１２１】これらの結果は、細胞培養培地中に放出さ
れたアデノウイルスは、DNA鋳型調製のために50μl程度
の細胞培養培地上清を用いても、PCRにより検出可能で
あることを示した。これらの結果により、アデノウイル
ス力価（titer）の測定のためにこの技術を用いる定量
法の開発が可能となる（ウイルス力価の測定は、従来
は、プラークアッセイにより行われていた）。
【０１２２】Ad5CMV-p53ウイルスでのp53 cDNAの野生型
の配列を、CsCl勾配精製ウイルスDNAにおいてジデオキ
シDNA配列決定法により確認した。同様の方法で生成し
たコントロールウイルスAd5/RSV/GL2は、AD5CMV-p53と
同様の構造を有するが、ラウス（Rous）肉腫ウイルスプ
ロモーターおよびルシフェラーゼcDNAをその発現カセッ
ト内で使用したことが異なる。E.coliのβ-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（LacZ）を有する組換えアデノウイルス
（Ad5CMV-LacZ）もまた、Ad5CMV-p53と同様の構造を有
し、そしてZhangらに開示されるようにして、およびFra
nk L．Graham博士（Grahamら、1991を参照願いたい）か
ら得ることができる。
【０１２３】ウイルスのストック、力価、および感染。
Ad5CMV-p53、Ad5/RSV/GL2、およびAd5CMV-LacZウイルス
の個々のクローンを、GrahamおよびPrevec（1991）の方
法に従ってプラーク精製により得た。単一のウイルスク
ローンを293細胞中で増殖させた。完全な細胞変性効果
を示す293細胞の培養培地を集め、そして1000×gで10分
間遠心分離した。プールした上清をアリコートに小分け
し、そしてウイルスストックとして-20℃で保存した。
ウイルス力価をプラークアッセイ（GrahamおよびPreve
c、1991）により決定した。細胞株の感染を、ウイルス
溶液（60mmディッシュ当たり0.5ml）の細胞単層への添
加、および５分毎の短時間の撹拌を伴う30分間の室温で
のインキュベーションにより行った。この後、培養培地
を添加し、感染細胞を37℃の培養器に戻した。
【０１２４】組換えアデノウイルスの遺伝子転移効率も
また、一連の細胞株（たとえば、H226Br、H322、H460、
HeLa、Hep G2、LM2、およびVero）においてAd5CMV-LacZ
を用いて評価した。X-gal染色により、すべての細胞株
が、30PFU/細胞のMOIでのAd5CMV-LacZによる感染後、97
〜100％青に染色された。
【０１２５】実施例４ヒト肺ガン細胞におけるAd5CMV-p53により支配されるp5
3遺伝子発現 本実施例は、同型接合の（homozygous）p53遺伝子欠失
を有するヒト肺ガン細胞を感染させるための組換えp53
アデノウイルスの使用を示す。結果は、これらの細胞の
増殖および変異p53の発現が抑制されたことを示し、こ
のことは、転移性細胞の制御のための有用な薬剤として
のAd5CMV-p53ビリオンの可能性を示す。
【０１２６】3.8％ホルマリンで固定し、そしてメタノ
ール中３％ H2O2で５分間処理した感染細胞単層に対し
て、免疫組織化学を実施した。免疫組織化学的分析は、
Vectastain Eliteキット（Vector、Burlingame、CA）を
用いて実施した。使用した一次抗体は、抗p53抗体PAb 1
801（Oncogene Science、Manhasset、NY）であり；MOPC
-21(Organon Teknika Corp.、West Chester、PA）をネ
ガティブコントロールとして使用した。二次抗体は、ア
ビジン標識抗マウスIgG（Vector）であった。ビオチン
化西洋わさびペルオキシダーゼABC複合試薬を、抗原抗
体複合体を検出するために用いた。最後に、細胞を、ハ
リス（Harris）ヘマトキシリン（Sigma）で後染色し、
サイトシール(Cytoseal)60（Stephens Scientific、Riv
erdale、NJ）で固定した。
【０１２７】感染細胞株の免疫組織化学的分析を行い、
Ad5CMV-p53ウイルスのCMVプロモーターにより駆動され
るp53発現物のインサイチュ発現を調べた。H358細胞株
（本細胞株はp53の同型接合欠失を有する）において、p
53遺伝子は、30〜50プラーク形成単位(PFU)／細胞の感
染多重度でAd5CMV-p53を用いて細胞を感染させた場合、
97-100％の効率で転移された（免疫組織化学的分析によ
り検出：図４）。
【０１２８】組換えアデノウイルスの高転移効率が、Ad
5CMV-LacZにより確認された。本ウイルスは、ヒトCMV I
Eプロモーターにより転写されるLacZ遺伝子を有する。3
0〜50 PFU/細胞のMOIで、HeLa、Hep G2、LM2およびヒト
NSCLCガン細胞株を含む試験した細胞のすべては、X-gal
染色によりb-ガラクトシダーゼ活性について97〜100％
ポジティブであった。これらの結果は、アデノウイルス
ベクターがヒトガン細胞への遺伝子転移のための効率の
良い媒体であることを示す。
【０１２９】ウェスタンブロット分析を、リン酸緩衝化
生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄した後にSDS-PAGEサン
プル緩衝液（60mmディッシュ当たり0.5ml）を含むディ
ッシュ中で単層細胞を溶解することにより調製した、全
細胞溶解物について実施した。
【０１３０】SDS-PAGE分析について、レーンには、５×
104個の細胞に相当する細胞溶解液（10〜15ml）を載せ
た。ゲル中のタンパク質をHybondTM-ECL膜（Amersham、
Arlington Heights、IL）に転写した。膜をPBS中で0.5
％の粉ミルクでブロックして一次抗体（マウス抗ヒトp5
3モノクローナル抗体PAb 1801およびマウス抗ヒトβ-ア
クチンモノクローナル抗体（Amersham））とプローブさ
せ、洗浄して二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ結
合ウサギ抗マウスIgG（Pierce Chemical Co.、Rockfor
d、IL））とプローブさせた。膜を、Amershamの増強化
学発光プロトコルに従って現像した。発現した外因性p5
3の相対量を、デンシトメーター（Molecular Dynamics
Inc.、Sunnyvale、CA）により測定した。
【０１３１】ウェスタンブロットは、外因性p53タンパ
ク質が高レベルで発現していることを示した（図5A、レ
ーン２、３、および５、６）。タンパク質は、感染後３
日目でピークに達した（図６、挿入、0.5日から３
日）。コントロールとして、実施例１の組換えAd5CMV-p
53に類似する構造を有するビリオンを構築した。このビ
リオンは、ビリオンの発現カセットにおいてラウス肉腫
ウイルスLTRプロモーターにより駆動されるルシフェラ
ーゼcDNAを含有する。p53発現およびアクチン発現の変
化のいずれも、ビリオンAd5/RSV/GL2により感染させた
細胞においては検出されなかった。
【０１３２】組換えp53アデノウイルスを用いて、３つ
のヒト肺NSCLC細胞株を感染させた：細胞株H358（本細
胞株はp53遺伝子の同型接合欠失を有する）、細胞株H32
2（本細胞株は、コドン248にてp53遺伝子の点変異（Ｇ
からＴ）を有する）、および細胞株H460（本細胞株は野
生型のp53遺伝子を有する）。ヒトNSCLC細胞の増殖速度
を60mm培養ディッシュにおいてH322およびH460（１×10
5）またはH358（２×105）を接種した後ウイルス感染前
24時間に測定した。細胞には10PFU/細胞の感染多重度
（MOI）でウイルスを感染させた。培養培地を、偽感染
コントロールのために用いた。異なる処理を行ったそれ
ぞれの細胞株の３連(triplet)培養物を、感染後１日〜
６日の間の毎日、計測した。
【０１３３】Ad5CMV-p53を感染させたH358細胞の増殖
は、非感染細胞またはコントロールビリオンを感染させ
た細胞の増殖と対照的に、大きく阻害された（図７
Ａ）。H322細胞の増殖もまた、p53ビリオンにより大き
く阻害されたが（図７Ｂ）、一方野生型p53を含有する
ヒト肺ガンH460細胞の増殖は、ほとんど影響されなかっ
た（図７Ｃ）。Ad5CMV-p53ウイルス感染H358細胞の増殖
は79％阻害されたが、一方非感染細胞またはコントロー
ルウイルスを感染させた細胞の増殖は阻害されなかっ
た。p53の点変異を有する細胞株H322の増殖はAd5CMV-p5
3により72％阻害されたが、野生型p53を含有する細胞株
H460はそれ程影響を受けなかった（28％阻害）。
【０１３４】この結果は、p53組換えアデノウイルスは
腫瘍抑制の性質を有することを示し、これは腫瘍細胞に
おいてp53タンパク質機能の回復により機能している。
【０１３５】実施例５p53欠損細胞の処置におけるAd5CMV-p53 本実施例は、インビトロで腫瘍細胞の増殖抑制を回復さ
せ、それにより細胞の悪性または転移性増殖を処置する
ための組換えp53アデノウイルスの使用に関する。本実
施例は、本発明がアデノウイルス仲介遺伝子治療による
ガンの処置において有用であると想定される、いくつか
の方法を記載する。
【０１３６】H358細胞をAd5CMV-p53およびAd5/RSV/GL2
を用いて10PFU/細胞のMOIで感染させた。等量の細胞を
培地で処理して、偽感染とした。感染後24時間、処理細
胞を集め、PBSで２回リンスした。各処置について、0.1
mlの容量中に３百万（３×106）個の細胞を、各ヌード
マウスに皮下注射した（Harlan Co.、Houston、TX）。
【０１３７】５匹のマウスを各処置について使用した。
マウスを注射前に照射（300cGy、60Co）し、注射後週毎
に調べた。腫瘍形成を６週間の終わりで評価し、そして
腫瘍体積を、直交する直径の積の平方根として計算され
る平均腫瘍直径を有する球様体であると仮定して計算し
た。
【０１３８】Ad5CMV-p53により仲介された腫瘍形成能に
ついて阻害効果を測定するために、ヌードマウスにH358
細胞（ヒトNSCLC型細胞）を皮下注射して、腫瘍性増殖
を誘導した。各マウスには、10PFU/細胞で24時間、Ad5C
MV-p53またはAd5/RSV/GL2で感染させた細胞を、１回注
射した。培地単独で処理したH358細胞を、偽感染コント
ロールとして使用した。腫瘍（注射後14日で初めて明瞭
になる）は、表Ｉに示すように偽感染細胞またはコント
ロールウイルス感染細胞によってのみ誘導された：
【０１３９】
【表１】
【０１４０】表１に示すように、Ad5CMV-p53処理細胞を
受けたマウスは腫瘍を発達させなかった。６週間の終わ
りでの腫瘍は直径４〜10mmであった。この研究を、群当
たり５匹のマウスを用いて開始した；Ad5CMV-p53群また
はAd5/RSV/GL2群のそれぞれ１匹のマウスは研究を完了
できなかった。早期の死亡は、おそらく処置に伴う(nos
ocomial)感染のためであった。
【０１４１】実施例６肺ガンの処置におけるAd5CMV-p53 本実施例は、インビボで腫瘍細胞の増殖抑制を回復さ
せ、そしてそれにより動物におけるガンを処置するため
の組換えp53アデノウイルスの使用に関する。本実施例
は、本発明がアデノウイルス仲介遺伝子治療によるガン
の処置において有用であると想定される、いくつかの方
法を記載する。
【０１４２】腫瘍形成能の阻害におけるAd5CMV-p53の効
率を、正所性(orthotopic)ヒト肺ガンのマウスモデルに
おいてさらに評価した。H358細胞およびH322細胞はこの
モデルにおいて腫瘍を産生しないため、細胞株H226Brを
使用した。この細胞株は、鱗状肺ガン起源を有して、肺
から脳に転移した。H226Brは、p53遺伝子の第７エクソ
ンのコドン254での点変異（ATCからGTC）を有し、そし
てマウスにおいて腫瘍形成的である。
【０１４３】正所性ヒト肺ガンのマウスモデルにおける
試験手順を以前に記載した（Georgesら、1993）。簡潔
に説明すると、放射線（300cGy、60Co）処置したヌード
マウスを、気管内滴注(intratracheal instillation)に
よりH226Br細胞を接種した。
【０１４４】各マウスには、0.1ml PBSの容積中に２×1
06個の細胞が注入された。接種後３日で、群当たり10匹
のマウスを、２日間にわたり１日１回、気管内滴注によ
り0.1mlのウイルスまたは0.1mlの媒体（PBS）で処置し
た。用いたウイルス供与量は、マウス当たり５×107個
のAd5CMV-p53または５×107個のAd5/RSV/GL2であった。
【０１４５】マウスを６週間の終わりで安楽死させた。
腫瘍形成を、肺および縦隔組織を切開し、そして腫瘍サ
イズを測定することにより評価した。腫瘍塊の切片の組
織化学的分析により、腫瘍を確認した。
【０１４６】照射されたヌードマウスに、２×106個のH
226Br細胞／マウスを気管内滴注により接種した。接種
後３日で、それぞれのマウス（群当たり８〜10匹のマウ
ス）を、２日間にわたり１日に１回、気管内滴注により
Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2または媒体（PBS）のいず
れかの0.1mlで処置した。用いたウイルス供与量は５×1
07PFU/マウスであった。腫瘍形成を、肺および縦隔組織
を切開し、そして腫瘍サイズを測定することにより６週
間の終わりで評価した。手順の流れ図を図７に示し、図
８に代表的な切開図を示す。検出された腫瘍は組織学的
分析により確認された。腫瘍測定のデータを表IIに要約
する：
【０１４７】
【表２】
【０１４８】Ad5CMV-p53処置マウスの25％のみが腫瘍を
形成したが、媒体またはAd5/RSV/GL2コントロール群に
おいては、処置マウスの70〜80％が腫瘍を形成した。Ad
5CMV-p53群の平均腫瘍サイズは、コントロール群の平均
腫瘍サイズより有意に小さかった。これらの結果は、Ad
5CMV-p53が、正所性ヒト肺ガンのマウスモデルにおいて
H226Brが腫瘍を形成するのを阻止し得ることを示す。
【０１４９】実施例７p53とDNA損傷との間の共同作用 プログラム細胞死（アポトーシス）の生化学的性質は、
核DNAの切断に由来するDNAの切断化の特徴的なパターン
を示す。最近の研究は、化学療法薬または電離放射線に
よるアポトーシスの誘導はp53遺伝子の状態に関連し
得、そしてDNA損傷刺激薬は、アポトーシスの過程にあ
る細胞における細胞内p53タンパク質のレベルを上昇さ
せ得ることを示した（Loweら、1993、Clarkeら、1993、
Fritscheら、1993、Harperら、1993、El-Deiryら、199
3）。野生型p53（wt-p53）タンパク質の増加したレベル
によるG1期における細胞周期の阻害は、DNA修復のため
に多くの時間を必要とする；もし最適な修復が不可能な
場合、p53はプログラムされた細胞死の引き金を引き得
る。従って、p53は、化学療法剤によるアポトーシス性
の腫瘍細胞死の誘導に寄与し得る。
【０１５０】ミスセンス変異または欠失によるp53遺伝
子の不活性化は、ヒトガンにおける最もありふれた遺伝
的変化である（Levineら、1991、Hollsteinら、199
1）。p53機能の喪失が、種々の化学療法剤に対する細胞
の耐性を増強させることが報告されている（Loweら、19
93）。本発明者の研究は、ヒト非小細胞肺ガン（NSCL
C）H358細胞（本細胞においては、p53の両方の対立遺伝
子は欠失している）が化学療法薬に対して耐性であった
ことを示したが、細胞株WTH226b（本細胞株は内在性Wt-
p53を有する）は、シスプラチン（CDDP）およびエトポ
シド（VP-16）での処理後16時間で、アポトーシス性の
細胞死を容易に示した（T．Fujiwara、E.A．Grimm、T．
Mukhopadhyay、J.A．Roth、未公表データ）。従って、
本発明者は、アデノウイルスベクターによるwt-p53遺伝
子のH358細胞への導入が、インビトロおよびインビボで
のDNA架橋剤であるCDDPに対する細胞の感受性を増加さ
せ得るかどうかを決定することを試みた。
【０１５１】材料および方法 H358細胞は、A．GazdarおよびJ．Minnaにより快く提供
された（Takahashiら、1989）。アデノウイルスベクタ
ー ヒトwt-p53（Ad-p53）またはルシフェラーゼ（Ad-Lu
c）をコードするcDNAを含有する組換えアデノウイルス
ベクターの構築および同定は、以前に報告された（Zhan
gら、1993）。簡単に説明すると、ヒトサイトメガロウ
イルスプロモーター、wt-p53cDNA、およびSV40初期ポリ
アデニル化シグナルを含有するp53発現カセットをpXCJ
L.1のXbaI部位とClaI部位との間に挿入した。p53シャト
ルベクターおよび組換えプラスミドpJM17を、リポソー
ム仲介技術により293細胞（Ad5形質転換ヒト胎児腎臓細
胞株）にコトランスフェクトした。完全な細胞変性効果
を示す293細胞の培養上清を集めて、その後の感染のた
めに使用した。コントロールAd-Lucウイルスを同様に作
製した。Ad-p53ウイルスおよびAd-Lucウイルスを293細
胞で増殖させた。複製可能なウイルスの存在を、HeLa細
胞アッセイにより排除した。ウイルス力価をプラークア
ッセイにより測定した（Grahamら、1991）。
【０１５２】ヌクレオソームDNA断片化の検出 DNAを、
親細胞、Ad-Luc感染細胞、およびCDDP処置を受けたまた
は受けなかったAd-p53感染細胞から、細胞を55℃で６時
間溶解緩衝液（50mM Tris-HCl（pH 8.0）、100mM EDT
A、100mM NaCl、１％SDS、および50μg/mlプロテイナー
ゼＫ）中でインキュベートすることにより単離した。DN
Aを、等量のフェノールで２回およびクロロホルム−イ
ソアミルアルコール（24:1）で１回抽出して、次いでエ
タノールで沈殿させた。サンプルを、1.5％アガロース
ゲルで電気泳動に供し、そして臭化エチジウム染色によ
り可視化させた。
【０１５３】TdT仲介dUTPニック末端標識を、以前に報
告された手順に従い実施した（Gavrieliら、1992）。単
層の細胞を0.01％NP-40で処理した。スライドガラス
を、TdT緩衝液（30mM Tris-HCl、pH 7.2；140mMカコジ
ル酸ナトリウム；１mM塩化コバルト）中に浸し、そして
ビオチン化dUTP（Boehringer Mannheim、Indianapoli
s、IN）およびTdTと共に37℃で45分間インキュベートし
た。スライドガラスを、２％ウシ血清アルブミンで10分
間覆い、そしてアビジン−ビオチン複合体（Vectastain
Eliteキット；Vector Laboratory、Burlingame、CA）
と共に30分間インキュベートした。ジアミノ−ベンジジ
ンの使用により比色検出を実施した。
【０１５４】結果 H358細胞を、Ad-p53に曝すことによりヒトwt-p53 cDNA
でインビトロで形質導入した。ウェスタンブロット分析
は、Ad-p53での感染後24時間程度の早さで高レベルのwt
-p53タンパク質の発現を示したが、親（非感染）細胞ま
たはAd-Lucを感染させたコントロール細胞においては、
wt-p53は検出されなかった（データ示さず）。共に行っ
た免疫組織学的評価は、80％より多くの感染細胞におい
てwt-p53タンパク質が検出できたことを示し、AD-p53に
よるp53の転移および発現は非常に効率的であったこと
を示唆した（データ示さず）。
【０１５５】CDDPへのAd-p53感染H358細胞の連続曝露
は、その生存率を急激に減少させる一方で、親細胞およ
びAd-Luc感染細胞については、CDDPへの72時間の曝露後
のみで顕著な細胞死が生じた（図10Ａ）。生存率の喪失
は、Ad-p53で形質導入した細胞において大きく増大し
た。さらに、生存率の低下は、細胞を24時間の曝露後に
薬物非含有培地中で維持した場合でも観測され得た。こ
のことは、致死的損傷が24時間以内に誘導されたことを
示し得る（図10Ｂ）。wt-p53形質導入H358細胞のCDDPに
対する感受性は、用量依存的であった（図10Ｃ）。
【０１５６】DNA断片化の指標となるヌクレオソーム間D
NAラダーは、CDDPへの24時間の曝露後にwt-p53を発現し
ている細胞において明白であった；しかし、親細胞およ
びAd-Luc感染細胞は、DNA断片化を示さなかった（図11
Ａ）。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ（TdT）仲介2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸
（dUTP）ビオチンニック末端標識（これは、インサイチ
ュでのアポトーシスに特徴的なDNA断片化を検出する）
は、図11Ｇに示すように、24時間CDDPで処理したAd-p53
感染細胞において多数のアポトーシス性の細胞を示し
た。図11Ｇは、図11Ｂ〜図11Ｆに存在しない、濃く染ま
っている核および核断片を示す。
【０１５７】wt-p53の導入は、欠失したp53または変異
したp53を有する数種の腫瘍細胞株でアポトーシスを誘
導することが知られている（Yonish-Rouachら、1991、S
hawら、1992、Ramqvistら、1993）。しかし、wt-p53単
独の過剰発現は、p53ネガティブなH358細胞株においてD
NA断片化を促進し得なかった（図11）。しかし、その増
殖は、Ad-p53により抑制された（図10）。このことは、
安定なH358クローンがレトロウイルス仲介wt-p53転移後
に得られ得ること、そしてこのクローンは親細胞よりも
ゆっくりと増殖することを示す、本発明者の以前の観察
（Caiら、1993）と矛盾しない。
【０１５８】Ad-p53とCDDPとの組み合わせの潜在的な治
療効率を、H358球様体の体積の相対的変化によって評価
した。多細胞腫瘍球様体モデルは、初期腫瘍および微小
転移巣と類似した組織学的構造をインビトロで示す。CD
DPでの処理は、Ad-p53感染H358球様体で相対的体積の減
少を引き起こしたが、親球様体またはAd-Luc感染細胞球
様体において大きな変化はなかった（図12Ａ）。インサ
イチュTdT仲介dUTP標識は、Ad-p53感染球様体の表面上
でアポトーシスの過程にある多数の細胞を示したが、Ad
-p53を感染させなかった球様体ではアポトーシス性の細
胞は全く見られなかった（図12Ｂ〜図12Ｅ）。レトロウ
イルス仲介wt-p53発現が、トランスフォーミング増殖因
子α（TGF-α）により誘導されるH322a球様体の増殖を
阻害したと、本発明者は以前に報告している（Fujiwara
ら、1993）。しかし、レトロウイルスベクターはH358球
様体に感染し得なかった。なぜなら、これらの球様体内
の細胞は、外因性TGF-αに応答して急速に増殖しないか
らである。CDDPへの曝露により、Ad-p53に感染したH358
球様体のサイズが、その表面上でアポトーシスを誘導す
ることにより減少するという発見は、Ad-p53は非増殖細
胞に感染することおよびCDDPは休止細胞においてアポト
ーシスプロセスを開始させることを示唆する。
【０１５９】実施例８処置養生におけるp53およびDNA損傷剤の使用 動物モデルを、本明細書下記ならびに実施例５、６、お
よび７に記載するように、前臨床試験の一部として用い
た。アデノウイルス仲介遺伝子転移処置に関する医学上
の徴候が確立した患者を、アデノウイルスに対する抗体
の存在について試験した。抗体が存在し、そして患者が
薬理学的物質または天然に存在する物質のいずれかに対
するアレルギーの経歴を有する場合、綿密な臨床観察下
で、103〜106個のオーダーでの組換えアデノウイルスの
試験用量の適用が示され得た。
【０１６０】Ad5CMV-p53を用いるガンの処置のために、
適切なプロモーター／エンハンサーエレメント（例え
ば、CMVプロモーター）の制御下でp53を発現する組換え
アデノウイルスを調製し、そして、ヒト被験体への投与
のために食品医薬品局（the Food and Drug Administra
tion）(FDA)に受け入れられ得る方法に従って精製し
た。このような方法は、塩化セシウム密度勾配遠心分
離、続く効力および純度についての試験を包含するが、
これに限定されない。
【０１６１】２つの基本的な方法が、p53アデノウイル
ス処置方法について適切であると考えられる。それは、
直接的または局所的な投与およびより全身的な投与であ
る。
【０１６２】本発明の方法は、p53変異に関連している
ことが知られる任意の種々の異なるガンを処置すること
に適している。全身投与に関して、アデノウイルスの単
一の静脈内注射は、注射から離れた部位での組織のウイ
ルス感染を十分に起こし得ることが示されており（Stra
tford-Perricaudetら、1991b）、そして従って、すべて
のp53関連の悪性疾患の処置について適切である。ウイ
ルスは、任意の薬理学的に受容可能な溶液における静脈
内投与により、または一定期間にわたる注入として患者
に投与され得る。一般的に言って、投与されるべき機能
的ウイルス粒子の有効な数は１×1010個〜５×1012個の
範囲であると考えられる。
【０１６３】また、特に、肺ガンに関する場合、組換え
アデノウイルスのより直接的な身体上のターゲッティン
グが、所望であれば、襄胞性線維症膜貫通コンダクタン
スレギュレーターの気管内投与（Rosenfeldら、1992）
と類似の方法で使用され得る。これにより、標的細胞の
部位に対して、より接近した組換えp53アデノウイルス
の送達がもたらされ得る。
【０１６４】方法 アポトーシスの検出のためのTdTでのインサイチュdUTP
標識 H358球様体を３日目で固定し、そして実施例７に
記載するように染色した。簡潔に記すと、標識TdTプロ
ーブを、TdT緩衝液中に浸したスライドガラスと接触さ
せ、そしてビオチン化dUTPおよびTdTとともに37℃で45
分間インキュベートした。スライドガラスを、２％ウシ
血清アルブミンで10分間覆い、そしてアビジン−ビオチ
ン複合体とともに30分間インキュベートした。比色検出
を、ジアミノ−ベンジジンを用いて行った。
【０１６５】Ad-p53でのインビボ感染後のCDDPによるア
ポトーシスの誘導 0.1mlのハンクス平衡塩溶液中のH358
細胞（５×106個）を、BALB/c雌性nu/nuマウスの右腹部
に皮下注射した。30日後、200μlの培地単独またはAd-L
uc（108PFU/ml）またはAd-p53（108PFU/ml）を含む200
μlの培地を、５mm〜６mmの直径を有する腫瘍に注射し
た。腫瘍内注射（100μl）および２カ所の向かい合った
部位での腫瘍周辺への注射（それぞれ50μl）を行っ
た。CDDP(３mg/kg)またはコントロールの生理食塩水を
腹腔内投与した。(Ａ)腫瘍体積の変化。どれが処置群で
あるかを知らせずに、２つの直交する直径においてカリ
パスで腫瘍を測定し、そして断面直径の積の平方根とし
て計算される平均腫瘍直径を有する球体形状と仮定する
ことにより、腫瘍体積を計算した。５匹のマウスを各処
置群について使用した。そして平均+/-SEを示す。デー
タを、スチューデントのｔ検定を用いて解析した。矢は
処置の日を示す。２つの独立した測定を示す。試験１に
おいて、５日目からｐ＜0.05；試験２において７日目か
らｐ＜0.05である。TdT仲介ビオチンdUTP標識技術を用
いる組織学的研究。腫瘍を、処置の開始後５日で採取
し、そして直ちにO.C.T.コンパウンドに包埋した。凍結
組織を、低温保持装置(cryostat)で５μmの厚さに切断
した。切片を１μg/mlのプロテイナーゼＫで処理し、そ
して上記のように染色した。動物のすべての世話は、UT
M.D．Anderson Institutional Animal Care and Use C
ommitteeに従った。
【０１６６】結果 ヒトガンにおいて、遺伝子置換療法および化学療法の組
み合わせの方法のインビボでの効率および組成物の効率
を示すために、本発明者は、Ad-p53およびCDDPの連続投
与が、インビボでアポトーシスを誘導するか否かを試験
した。Ad-p53の直接的な腫瘍内注射またはCDDPの腹腔内
投与の３日後、nu/nuマウスにおいて皮下に移植したH35
8腫瘍は、適度なゆっくりした増殖を示した。しかし、A
d-p53およびCDDPを同時に投与した場合、腫瘍は部分的
に縮退し、そして腫瘍サイズは、他の処置群のいずれの
腫瘍よりも統計学的に有意に小さいままであった。増殖
阻害効果は、２つの処置サイクル後でもさらにより際立
っていた（図13Ａ）。組織学的検査は、CDDPで処置した
マウスにAd-p53を注射した領域における腫瘍細胞の大規
模な破壊を明らかにした。インサイチュ染色は、無細胞
領域周辺に多くのアポトーシス性の細胞を示した（図13
Ｂ〜図13Ｅ）。対照的に、CDDP単独またはAd-p53単独で
処置した腫瘍は、無細胞性(acellularity)またはアポト
ーシス性領域のどちらも示さなかった。
【０１６７】さらに詳細には、好ましい処置プロトコル
を、以下に沿って開発し得る。最初に、患者は気管支鏡
検査を受け、障害の程度を評価され得る。可能な限り大
きな腫瘍を内視鏡検査的に切除する。好ましくは、患者
は、局部麻酔または全身麻酔下で気管支鏡検査を受け
る。Stifcortm気管支経由(trnasbronchial)吸引用針（2
1g）を、気管支鏡のバイオプシーチャネルを通して入れ
る。次いで、残存腫瘍部位に、約10mlまたはそれ未満の
ような小容量でp53アデノウイルスを注射する。
【０１６８】いかなる場合においても、用いるアデノウ
イルスは複製不能であるため、健常被験体でのウイルス
自体の有害な作用は全く予想されない。しかし、急性ま
たは遅延の悪性反応を監視するために少なくとも48時間
の処置の間は、患者を入院させる。ヒトにおける遺伝子
転移媒体としての複製不全アデノウイルスの使用の安全
に関する事柄は過去に述べられている（Rosenfeldら、1
992；Jaffeら、1992）。しかし、投与し得るアデノウイ
ルスの用量は、都合の悪い副作用の可能性をさらに最小
にするために適時モニターされるべきである。
【０１６９】応答の必要の存在または毒性の存在を示す
として考慮すべき種々の判断基準がある。毒性の存在を
決定することを補助するために、腫瘍床(bed)を、治療
コースの前に写真撮影するべきである。最大直径および
その直交する直径を測定する。サイズは、直径の積とし
て記録する。これらのデータから、腫瘍の再増殖速度を
これらの数字から計算し得る。
【０１７０】進行に対する時間もまた、進行性疾患の徴
候があるまで、腫瘍塊の減少を伴う最初の観測から測定
され得る。進行性疾患を、測定病巣の直径の積の和にお
いて25％以上の増加として定義する。進行の指摘がなさ
れる前に、患者は、少なくとも２コースの治療を受けな
ければならない。患者の生存は、プロトコルへの参加か
ら測定される。
【０１７１】追跡試験は、ガン治療において日常的に用
いられるすべての試験を包含し得る。試験は、臨床上の
徴候を監視する工程ならびに種々のp53遺伝子の発現パ
ターンを評価する標準的な分子生物学的分析のためのバ
イオプシーを行う工程を包含する。これはまた、転移遺
伝子を受け入れた細胞数に関する情報およびインビボで
の相対的プロモーター強度に関する情報を提供する。得
られたデータに基づき、処置に対して調節することが望
ましいとされ得る。これらの調節は、異なるプロモータ
ーを使用するアデノウイルス構築物、または組換え遺伝
子の非生理学的な過剰発現を行うことなく、さらに多く
の、もしくはすべての腫瘍細胞の感染を確実にするため
に注射されるpfu数の変化を包含し得る。
【０１７２】アデノウイルスによりインビボで転移した
外因性遺伝子の発現が、長期間にわたり持続し得ること
が期待される。ウイルスにより転移された外因性遺伝子
の治療に有効な長期発現は、個別の事例ごとに検討され
なければならない。マーカー遺伝子は、それらの有用性
において、遺伝子発現の治療に関連した持続を評価する
ことに限定されている。なぜなら、任意の与えられた遺
伝子疾患の改善のために必要とされる発現レベルは、他
の疾患を完全に治癒するために必要とされるレベルとか
なり異なるからである。
【０１７３】本発明の組成物および方法を好ましい実施
態様によって記載してきたが、本発明の概念、意図およ
び範囲から逸脱しない限り、変化をこの組成物、方法、
本明細書に記載される工程または工程の順序において適
用し得ることは当業者にとって明らかである。さらに詳
細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の
薬剤は本発明に記載の薬剤と置換し得るが、同一の結果
または同様の結果を達成し得ることは明らかである。当
業者に明らかなこのような置換および改変のすべては、
添付の請求項により定義される本発明の意図、範囲およ
び概念内であると見なされる。請求事項および方法のす
べては行われ得、そして過度の試験を行うことなく実行
され得る。
【０１７４】
【表３】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【０１７５】以下の図面は、本明細書の一部を形成し、
そして本発明の特定の局面をさらに示すために含められ
る。本発明は、１つ以上のこれらの図面を本明細書中に
提供される具体的な実施態様の詳細な説明と組合わせて
参照することにより、さらに理解され得る。
【０１７６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> Method and compositions comprising DNA damaging agents and p53 <130> 11-310div <150> US 08/233,002 <151> 1994-04-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 1 <400> 1 ggcccacccc cttggcttc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 2 <400> 2 ttgtaaccat tataagctgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 3 <400> 3 tcgtttctca gcagctgttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 4 <400> 4 catctgaact caaagcgtgg 20
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えp53アデノウイルスの作製のスキーム。p
53発現カセットを、pXCJL.1のXbaI部位とClaI部位との
間に挿入した。p53発現ベクター(pEC53)および組換えプ
ラスミドpJM17を293細胞に同時トランスフェクトした。
トランスフェクトされた細胞を、細胞障害性効果が始ま
るまで培地中で維持した。プロテイナーゼＫおよびおよ
びフェノール抽出で処理したCPE上清から調製したDNAテ
ンプレートを用いるDNAのPCR分析による新たに作製した
p53組換えアデノウイルス(Ad5CMV-p53)の同定。
【図２Ａ】Ad5CMV-p53 DNAの構造分析のために使用され
るマップ。p53発現カセット、PCRプライマー、および制
限部位の位置を有する、Ad5CMV-p53ゲノムDNAのマッ
プ。ゲノムサイズは約35.4kbであり、100のマップユニ
ット(map unit)に分割される(１m.u.＝0.35kb)。Ad5ゲ
ノムのE1領域(1.3〜9.2 m.u.)を置換したp53発現カセッ
ト。プライマー１は、ヒトCMV主要IE遺伝子プロモータ
ーの下流の第１イントロン中に位置する。プライマー２
は、SV40初期ポリアデニル化シグナル中に位置する。両
方のプライマーは、両末端でp53cDNA挿入物から15〜20b
p離れて、1.4kbのPCR産物を規定する。プライマー３お
よびプライマー４は、それぞれAd5ゲノムの11m.u.およ
び13.4m.u.に位置し、0.86kbのウイルスゲノム特異的PC
R産物を規定する。
【図２Ｂ】PCR産物のアガロースゲル分析。それぞれの
反応において、1.4kb(p53)および0.86kb(Ad5)DNA断片を
規定する２組のプライマーを使用した。それぞれの反応
において使用したDNAテンプレートは、pEC53プラスミド
(レーン１)、Ad5/RSV/GL2DNA(レーン２)、DNAなし(レー
ン３)、およびAd5CMV-p53DNA(レーン４)であった。(M)
と標示されたレーンは分子量マーカーに対応する。
【図２Ｃ】Ad5CMV-p53 DNAの制限マッピング。CsCl勾配
精製したAd5CMV-p53 DNAサンプルを、それぞれ酵素なし
(U)、HindIII(H)、BamHI(B)、EcoRI(E)、およびClaI(C)
で消化し、そして１％アガロースゲルで分析した。(M)
と標示されたレーンは分子量マーカーである。
【図３Ａ】組換えアデノウイルスによる293における細
胞障害性効果の観察。図３Ａは、293細胞の一連の相対
比画像(×400)である。図３Ａは、１ページの図の４つ
のパネルである。図３Ａはトランスフェクション前であ
る。
【図３Ｂ】組換えアデノウイルスによる293における細
胞障害性効果の観察。図３Ｂは、293細胞の一連の相対
比画像(×400)である。図３Ｂは、１ページの図の４つ
のパネルである。図３Ｂはトランスフェクション後12日
目のネガティブコントロールである。
【図３Ｃ】組換えアデノウイルスによる293における細
胞障害性効果の観察。図３Ｃは、293細胞の一連の相対
比画像(×400)である。図３Ｃは、１ページの図の４つ
のパネルである。図３Ｃはトランスフェクション後12日
目のCPEの開始である。
【図３Ｄ】組換えアデノウイルスによる293における細
胞障害性効果の観察。図３Ｄは、293細胞の一連の相対
比画像(×400)である。図３Ｄは、１ページの図の４つ
のパネルである。図３Ｄは、トランスフェクション後14
日目のCPEの完了である。
【図４Ａ】組換えアデノウイルスに感染した細胞の免疫
組織学。図４Ａは、一連のH358細胞の免疫組織学的画像
である。図４Ａは、１ページの図の４つのパネルであ
る。H358細胞におけるAd5CMV-p53の感染性。H358細胞
を、50PFU/細胞で24時間、Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL
2で感染させた。培地単独を偽感染として用いた。感染
細胞を免疫染色により分析した。図４Ａは、抗p53抗体
でプローブした偽感染である。使用した抗p53抗体はPab
1801であり、そして染色のためにアビジン-ビオチン法
を用いた。
【図４Ｂ】組換えアデノウイルスに感染した細胞の免疫
組織学。図４Ｂは、一連のH358細胞の免疫組織学的画像
である。図４Ｂは、１ページの図の４つのパネルであ
る。H358細胞におけるAd5CMV-p53の感染性。H358細胞
を、50PFU/細胞で24時間、Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL
2で感染させた。培地単独を偽感染として用いた。感染
細胞を免疫染色により分析した。図４Ｂは、Ad5/RSV/GL
2コントロールで感染させ、そして抗p53抗体でプローブ
した細胞である。使用した抗p53抗体はPab 1801であ
り、そして染色のためにアビジン-ビオチン法を用い
た。
【図４Ｃ】組換えアデノウイルスに感染した細胞の免疫
組織学。図４Ｃは、一連のH358細胞の免疫組織学的画像
である。図４Ｃは、１ページの図の４つのパネルであ
る。H358細胞におけるAd5CMV-p53の感染性。H358細胞
を、50PFU/細胞で24時間、Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL
2で感染させた。培地単独を偽感染として用いた。感染
細胞を免疫染色により分析した。図４Ｃは、非関連抗体
(MOPC-21)でプローブしたAd5CMV-p53感染細胞である。
使用した抗p53抗体はPab 1801であり、そして染色のた
めにアビジン-ビオチン法を用いた。
【図４Ｄ】組換えアデノウイルスに感染した細胞の免疫
組織学。図４Ｄは、一連のH358細胞の免疫組織学的画像
である。図４Ｄは、１ページの図の４つのパネルであ
る。H358細胞におけるAd5CMV-p53の感染性。H358細胞
を、50PFU/細胞で24時間、Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL
2で感染させた。培地単独を偽感染として用いた。感染
細胞を免疫染色により分析した。図４Ｄは、抗p53抗体
でプローブしたAd5CMV-p53感染細胞である。使用した抗
p53抗体はPab 1801であり、そして染色のためにアビジ
ン-ビオチン法を用いた。
【図５Ａ】H358細胞における外因性p53の発現の相対的
なレベルを比較する、クマシーブルー染色したSDS-PAGE
ゲル。30PFU/細胞でAd5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2で感
染させたH358細胞サンプルを、感染後24時間および72時
間で調製した。SDS-PAGE分析のクマシーブルー染色は、
載せられたタンパク質サンプルの相対的な量を示す。レ
ーン１およびレーン４は、Ad5/RSV/GL2感染細胞のサン
プルを含む。レーン２およびレーン３は、感染後24時間
でAd5CMV-p53の２つの個々のストックで感染させた細胞
のサンプルを含む。レーン５およびレーン６は、感染後
72時間で採集したAd5CMV-p53感染細胞サンプルである。
レーン７は、感染後72時間の偽感染H358サンプルであ
る。レーンMは、kDa単位のあらかじめ染色された分子量
マーカーである(GIBCO-BRL)。
【図５Ｂ】図５ＡにおけるSDS-PAGEと同一のレーン設定
のゲルのウェスタンブロット分析。p53の発現の相対的
なレベルを抗p53を用いるウエスタンブロッティングに
より分析した。使用した一次抗体は、p53タンパク質に
対するモノクローナル抗体(PAb 1801，Oncogene Scienc
e Inc.)およびβ-アクチンに対するモノクローナル抗体
(Amersham Inc.)であった。HRP結合二次抗体およびECL
発色剤は、Amersham Inc.製であった。ウエスタンブロ
ッティングによるウイルス感染H358細胞。図５Bのウェ
スタンブロットは、図５Ａと等価な構成およびオーダー
を有する。
【図６Ａ】ウエスタンブロッティングにより測定したp5
3発現の時間経過。複数のディッシュのH358細胞を10PFU
/細胞でAd5CMV-p53で感染させた。細胞溶解物を感染後
の示された時間で調製した。ウエスタンブロッティング
を抗p53抗体および抗アクチン抗体で同時にプローブし
た。「Ｃ」と指定されるレーンはネガティブコントロー
ルを表す。ヒストグラムは、デンシトメーターにより測
定されたp53の相対的量を表す。
【図６Ｂ】ウエスタンブロッティングにより測定したp5
3発現の時間経過。複数のディッシュのH358細胞を10PFU
/細胞でAd5CMV-p53で感染させた。細胞溶解物を感染後
の示された時間で調製した。ウエスタンブロッティング
を抗p53抗体および抗アクチン抗体で同時にプローブし
た。「Ｃ」と指定されるレーンはネガティブコントロー
ルを表す。ヒストグラムは、デンシトメーターにより測
定されたp53の相対的量を表す。
【図７Ａ】ウイルス感染ヒト肺ガン細胞の細胞株H358の
増殖曲線。細胞を１ディッシュ(60mm)当たり105細胞
で、そして１細胞株あたり６ディッシュを接種した。24
時間後、細胞を10 m.o.i(感染多重度、すなわちPFU/細
胞)でAd5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2で感染させた。感染
後、６日間毎日細胞を計数した。増殖曲線は、４つの異
なる研究から得たデータを表す。
【図７Ｂ】ウイルス感染ヒト肺ガン細胞の細胞株H322の
増殖曲線。細胞を１ディッシュ(60mm)当たり105細胞
で、そして１細胞株あたり６ディッシュを接種した。24
時間後、細胞を、10 m.o.i(感染多重度、すなわちPFU/
細胞)でAd5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2で感染させた。感
染後、６日間毎日細胞を計数した。増殖曲線は、４つの
異なる研究から得られたデータを表す。
【図７Ｃ】ウイルス感染ヒト肺ガン細胞の細胞株H460の
増殖曲線。細胞を１ディッシュ(60mm)当たり105細胞
で、そして１細胞株あたり６ディッシュを接種した。24
時間後、細胞を、10 m.o.i(感染多重度、すなわちPFU/
細胞)でAd5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2で感染させた。感
染後、６日間毎日細胞を計数した。増殖曲線は、４つの
異なる研究から得られたデータを表す。
【図８】正常位の肺ガンモデルにおけるAd5CMV-p53の試
験のフローチャート。H226Br細胞およびウイルスで接種
したヌードマウスの処置用量および処置スケジュールを
フローチャートに要約する。
【図９】処置したマウスおよびコントロールマウス由来
の肺および縦腔洞切開のサンプル。図９Ａ、図９Ｂ、図
９Ｃ、および図９Ｄは、４つのパネルの１つの図であ
る。マウスを処置後６週間で屠殺した。肺および縦腔洞
組織を腫瘍形成の評価のために切開した。図９Ａは、正
常ヌードマウス由来の縦腔洞ブロックのサンプルであ
る；図９Ｂ，ベヒクル(PBS)処置マウス由来の縦腔洞ブ
ロックのサンプルである；図９Ｃは、Ad5CMV-p53処置マ
ウス由来の縦腔洞ブロックのサンプルである；図９Ｄ
は、Ad5/RSV/GL-2処置マウス由来の縦腔洞サンプルであ
る。矢印は腫瘍塊を示す。
【図１０Ａ】H358親細胞、Ad-Luc感染H358細胞およびAd
-p53感染H358細胞の増殖速度におけるCDDPに対する継続
曝露の効果。H358細胞(1.5×105細胞/ウェル)を２連で2
4ウェルプレートに播いた。24時間後、100μlの培地、A
d-Lucウイルスストック(108PFU/ml)またはAd-p53ウイル
スストック(108PFU/ml)を添加した。さらなる24時間の
インキュベーション後、ウイルスを含む培地を10μg/ml
のCDDPを含有する新鮮な培地と交換した。
【図１０Ｂ】H358親細胞、Ad-Luc感染H358細胞、および
Ad-p53感染H358細胞の増殖速度におけるCDDPに対する24
時間の曝露。細胞をCDDPに継続して(図10A)または24時
間(図10B)曝露し、続いて薬剤不含有培地中で回収し
た。付着した単層として残る細胞を、トリパンブルーの
取り込みを測定することにより５日間にわたって生存性
について評価した。平均値+/-SEを示す。Ad-p53：CDDP
群の５日目の細胞数は、ＡおよびＢの両方について全て
の他の群と顕著に異なる(Studentのt検定によるp＜0.0
5)。
【図１０Ｃ】Ad-p53感染H358細胞の生存性における異な
る濃度のCDDPの効果。Ad-LucウイルスまたはAd-p53ウイ
ルスに対して24時間の曝露後、細胞を０、10、または10
0μg/mlのCDDPで24時間処置し、次いで生存性について
評価した。
【図１１Ａ】CDDPに曝露したAd-p53感染H358細胞におけ
るヌクレオソームDNAの断片。細胞を感染させ、そして
図10に対する説明に記載するように24時間CDDPで処置し
た。チャンバースライド上で増殖させ、Ad-p53で24時間
感染させ、さらなる24時間CDDPで処置し、そしてDNA断
片のインサイチュ標識のために固定したH358細胞。
【図１１Ｂ】CDDP処置しなかったH358親細胞である。矢
印の先は、暗く染色された核断片の例を示す。バー＝10
0μm。
【図１１Ｃ】CDDP処理したH358親細胞である。矢印の先
は、暗く染色された核断片の例を示す。バー＝100μm。
【図１１Ｄ】CDDP処理しなかったAd-Luc感染細胞であ
る。矢印の先は、暗く染色された核断片の例を示す。バ
ー＝100μm。
【図１１Ｅ】CDDP処理したAd-Luc感染細胞である。矢印
の先は、暗く染色された核断片の例を示す。バー＝100
μm。
【図１１Ｆ】CDDP処理しなかったAd-p53感染細胞であ
る。矢印の先は、暗く染色された核断片の例を示す。バ
ー＝100μm。
【図１１Ｇ】CDDP処理したAd-p53感染細胞(Ｇ)である。
矢印の先は、暗く染色された核断片の例を示す。バー＝
100μm。
【図１２Ａ】H358腫瘍球状体におけるAd-p53感染とCDDP
処置との組み合わせの効果。H358細胞の多細胞腫瘍球状
体を以前に記載されたように(Takahashiら(1989))調製
した。０日目、直径150μm〜200μmの球状体を、24ウェ
ルの寒天でコートしたプレート内に置き、24時間Ad-p53
またはAd-Lucに曝露した。１日目、10μg/mlのCDDPを有
する培地を、ウイルスを含む培地の除去後に添加した。
２日目、24時間のインキュベーション後、上層(overla
y)を１mlの薬剤を含まない新鮮な培地と交換した。直交
する直径を倒立顕微鏡を用いて測定した。相対的な体積
変化を、式a2×b／a1 2×b1(ここで、aおよびbは、それ
ぞれ、球状体の最小直径および最大直径であり、a1およ
びb1は１日目の直径である)に従って算出した。Ad-p53/
CDDP球状体の相対的な容量のみがコントロール群(Ctl)
より顕著に低い(Studentのt検定によるp＜0.05)。
【図１２Ｂ】アポトーシスの検出のためのTdTを用いる
インサイチュdUTP標識。３日目にH358球状体を固定し、
そして実施例７の物質および方法に記載するように染色
した。コントロールの非処置球状体。バー＝100μm。
【図１２Ｃ】アポトーシスの検出のためのTdTを用いる
インサイチュdUTP標識。３日目にH358球状体を固定し、
そして実施例７の物質および方法に記載するように染色
した。CDDPで処置した球状体。バー＝100μm。
【図１２Ｄ】アポトーシスの検出のためのTdTを用いる
インサイチュdUTP標識。３日目にH358球状体を固定し、
そして実施例７の物質および方法に記載するように染色
した。Ad-p53感染球状体。バー＝100μm。
【図１２Ｅ】アポトーシスの検出のためのTdTを用いる
インサイチュdUTP標識。３日目にH358球状体を固定し、
そして実施例７の物質および方法に記載するように染色
した。CDDPで処置したAd-p53感染球状体。バー＝100μ
m。
【図１３Ａ】図13Ａ。腫瘍体積変化により測定した、イ
ンビボのAd-p53感染後のCDDPによるアポトーシスの誘
導。0.1ml ハンクス平衡化塩溶液中のH358細胞(５×1
06)をBALB/cメスnu/nuマウスの右脇腹に皮下注射した。
30日後、200μlの培地のみを、またはAd-Luc(108PFU/m
l)またはAd-p53(108PFU/ml)を含む培地を、５〜６mmの
直径の腫瘍に注射した。腫瘍内注射(100μl)および２つ
の対向部位での腫瘍周辺注射(それぞれ50μl)を行っ
た。CDDP(３mg/kg)またはコントロールの生理食塩水を
腹膜内投与した。処置群の区分なく、腫瘍を、２つの直
交する直径をカリパスで測定し、そして断面直径の積の
平方根として算定した腫瘍の平均直径を有する球状形を
想定することにより腫瘍の体積を算定した。５匹のマウ
スを各処置群に用いた。そして平均値+/-SEを示す。デ
ータをStudentのt検定を用いて分析した。矢印は処置の
日数を表す。２つの独立した測定を示す。試験１におい
ては５日目以降p＜0.05であり；試験２においては７日
目以降p＜0.05である(Ｂ〜Ｅ)。
【図１３Ｂ】TdT媒介ビオチンdUTP標識技術を用いる組
織学的研究。腫瘍を処置開始後５日目に採取し、そして
即座にO.C.T.化合物中に包埋した。凍結した組織を、低
温槽で５μm厚に切り出した。切片を１μg/mlのプロテ
イナーゼＫで処置し、そして図12に対する説明で記載し
たように染色した。CDDP単独で処置したH358腫瘍であ
る。バー＝0.5mm。全ての動物の取り扱いは、UT M.D．A
nderson InstitutionalAnimalCare and Use Committee
に従った。
【図１３Ｃ】TdT媒介ビオチンdUTP標識技術を用いる組
織学的研究。腫瘍を処置開始後５日目に採取し、そして
即座にO.C.T.化合物中に包埋した。凍結した組織を、低
温槽で５μm厚に切り出した。切片を１μg/mlのプロテ
イナーゼＫで処置し、そして図12に対する説明で記載し
たように染色した。Ad-p53単独で処置したH358腫瘍、で
ある。バー＝0.5mm。全ての動物の取り扱いは、UT M.
D．Anderson Institutional AnimalCare and Use Commi
tteeに従った。
【図１３Ｄ】TdT媒介ビオチンdUTP標識技術を用いる組
織学的研究。腫瘍を処置開始後５日目に採取し、そして
即座にO.C.T.化合物中に包埋した。凍結した組織を、低
温槽で５μm厚に切り出した。切片を１μg/mlのプロテ
イナーゼＫで処置し、そして図12に対する説明で記載し
たように染色した。CDDPと組み合わせたAd-p53で処置し
たH358腫瘍である。バー＝0.5mm。全ての動物の取り扱
いは、UT M.D．Anderson Institutional AnimalCare an
d Use Committeeに従った。
【図１３Ｅ】TdT媒介ビオチンdUTP標識技術を用いる組
織学的研究。腫瘍を処置開始後５日目に採取し、そして
即座にO.C.T.化合物中に包埋した。凍結した組織を、低
温槽で５μm厚に切り出した。切片を１μg/mlのプロテ
イナーゼＫで処置し、そして図12に対する説明で記載し
たように染色した。CDDPと組み合わせたAd-p53で処置し
たH358腫瘍である。バー＝0.5mm。全ての動物の取り扱
いは、UT M.D．Anderson Institutional AnimalCare an
d Use Committeeに従った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/704 Ａ６１Ｋ 31/704 31/7048 31/7048 33/24 33/24 35/76 35/76 38/00 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 藤原 俊義 〒700 岡山県岡山市門田本町３−１−４ (72)発明者 グリム，エリザベス エイ. アメリカ合衆国 テキサス 77030，ヒュ ーストン，ボルスオーバー 2324 (72)発明者 マックホパッドハイアイ，タパス アメリカ合衆国 テキサス 77030，ヒュ ーストン，スタッフォード シア 7338, アパートメント １ (72)発明者 ザン，ウェイ‐ウェイ アメリカ合衆国 イリノイ 60030，グレ イズレイク，カントリー ドライブ 1805，アパートメント 104 (72)発明者 オーウェン‐シュアーブ，ローリー ビ ー. アメリカ合衆国 テキサス 77478，シュ ガー ランド，ウォーカー スクール ロ ード 1006

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｐ５３タンパク質またはｐ５３遺伝子お
    よびＤＮＡ損傷剤をガンの治療に有効な組み合わせ量
    で、ヒトの細胞に接触させることを含み、少なくとも２
    コースの治療組成物が前記ヒトに投与される、ガンの治
    療のための薬剤を製造するためのｐ５３タンパク質また
    はｐ５３遺伝子およびＤＮＡ損傷剤の有効な組み合わせ
    の使用。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡ損傷剤が照射である請求項１に記
    載の使用。
  3. 【請求項３】 前記照射が、Ｘ線、ＵＶ光、γ照射、マ
    イクロ波照射または電子放出である請求項２に記載の使
    用。
  4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ損傷剤が化学療法薬である請
    求項１に記載の使用。
  5. 【請求項５】 前記化学療法薬が、シスプラチン、カン
    プトセシン、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、ア
    ドリアマイシン、5−フルオロウラシル、ドキソルビシ
    ン、ベラパミル、エトポシドまたはポドフィロトキシン
    である請求項４に記載の使用。
  6. 【請求項６】 前記化学療法薬が、ＤＮＡを架橋する薬
    剤である請求項４に記載の使用。
  7. 【請求項７】 ＤＮＡを架橋する前記薬剤が、マイトマ
    イシンＣである請求項６に記載の使用。
  8. 【請求項８】 ＤＮＡを架橋する前記薬剤が、ＤＮＡを
    アルキル化する薬剤である請求項６に記載の使用。
  9. 【請求項９】 ＤＮＡをアルキル化する前記薬剤が、シ
    スプラチンである請求項８に記載の使用。
  10. 【請求項１０】 前記化学療法薬が、ＤＮＡに挿入する
    薬剤である請求項４に記載の使用。
  11. 【請求項１１】 前記化学療法薬が、核酸合成に影響を
    与えることによって染色体異常および有糸分裂異常を導
    く薬剤である請求項４に記載の使用。
  12. 【請求項１２】 核酸合成に影響を与えることによって
    染色体異常および有糸分裂異常を導く前記薬剤が、5−
    フルオロウラシルである請求項１１に記載の使用。
  13. 【請求項１３】 前記化学療法薬が、ＤＮＡ複製、有糸
    分裂または染色体分離に影響を与える薬剤である請求項
    ４に記載の使用。
  14. 【請求項１４】 ＤＮＡ複製、有糸分裂または染色体分
    離に影響を与える前記薬剤が、アドリアマイシン、ドキ
    ソルビシン、ベラパミル、エトポシドまたはポドフィロ
    トキシンである請求項１３に記載の使用。
  15. 【請求項１５】 前記細胞が、ＤＮＡ損傷剤と組み合わ
    せて、該細胞においてｐ５３タンパク質を発現する組換
    えベクターと接触される、請求項１に記載の使用。
  16. 【請求項１６】 前記ｐ５３発現組換えベクターが、裸
    のＤＮＡプラスミド、リポソーム内のプラスミド、レト
    ロウイルスベクター、AAVベクター、または組換えアデ
    ノウイルスベクターである、請求項１５に記載の使用。
  17. 【請求項１７】 前記ｐ５３発現組換えベクターが組換
    えアデノウイルスベクターである、請求項１６に記載の
    使用。
  18. 【請求項１８】 前記ｐ５３発現組換えベクターが、サ
    イトメガロウイルスIEプロモーターの制御下に位置する
    ｐ５３発現領域を含む組換えアデノウイルスベクターで
    ある、請求項１７に記載の使用。
  19. 【請求項１９】 前記組換えアデノウイルスベクター
    が、ｐ５３発現領域、サイトメガロウイルスIEプロモー
    ター、およびSV40初期ポリアデニル化シグナルを含む、
    請求項１７に記載の使用。
  20. 【請求項２０】 前記組換えアデノウイルスベクターの
    E1A領域およびE1B領域が欠失しており、前記ｐ５３発現
    領域がそれらの場所に導入される、請求項１７に記載の
    使用。
  21. 【請求項２１】 前記組換えアデノウイルスベクターが
    組換えアデノウイルス内に存在する、請求項１７に記載
    の使用。
  22. 【請求項２２】 前記細胞がまずｐ５３タンパク質また
    はｐ５３遺伝子と接触され、次いでＤＮＡ損傷剤と接触
    される、請求項１に記載の使用。
  23. 【請求項２３】 前記細胞がまずＤＮＡ損傷剤と接触さ
    れ、次いでｐ５３タンパク質またはｐ５３遺伝子と接触
    される、請求項１に記載の使用。
  24. 【請求項２４】 前記細胞がｐ５３タンパク質またはｐ
    ５３遺伝子およびＤＮＡ損傷剤と同時に接触される、請
    求項１に記載の使用。
  25. 【請求項２５】 前記ｐ５３遺伝子またはｐ５３タンパ
    ク質およびＤＮＡ損傷剤が、薬理学的に受容可能な処方
    物中に分散される、請求項１に記載の使用。
  26. 【請求項２６】 前記細胞が腫瘍細胞である請求項１に
    記載の使用。
  27. 【請求項２７】 腫瘍細胞においてｐ５３を発現する組
    換えベクターを含有する組換えアデノウイルスを含む治
    療有効量の薬学的組成物を、腫瘍部位中に注入し、腫瘍
    をＤＮＡ損傷剤に接触させる、請求項２６に記載の使
    用。
  28. 【請求項２８】 ＤＮＡ損傷剤を含む治療有効量の薬学
    的組成物を動物に投与することにより、前記腫瘍がＤＮ
    Ａ損傷剤と接触される、請求項２７に記載の使用。
  29. 【請求項２９】 前記細胞がｐ５３遺伝子に変異を有す
    る、請求項１に記載の使用。
  30. 【請求項３０】 前記細胞が、ｐ５３タンパク質または
    ｐ５３遺伝子を含む第1の組成物およびＤＮＡ損傷剤を
    含む第2の組成物と接触される、請求項１に記載の使
    用。
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