ES2817877T3

ES2817877T3 - Macrociclos peptidomiméticos

Info

Publication number: ES2817877T3
Application number: ES13748983T
Authority: ES
Inventors: Vincent Guerlavais; Carl Elkin; Huw Nash; Tomi Sawyer; Bradford Graves; Eric Feyfant
Original assignee: Aileron Therapeutics Inc
Current assignee: Aileron Therapeutics Inc
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2021-04-08
Anticipated expiration: 2033-02-14
Also published as: CN112500466A; RU2642299C2; TW201339177A; AU2013221432B2; IL233710A0; AU2013221432A1; SG11201404648PA; ZA201405691B; MX2014009880A; IL233710B; JP2015509940A; JP6694459B2; CA2862038A1; JP2020109106A; US20170281720A1; EP3769776A1; AU2018202672A1; CN114853866A; RU2014137107A; CA2862038C

Abstract

Un macrociclo peptidomimético de la fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal aceptable farmacéuticamente de este, en donde: cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9 y Xaa10 es independientemente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9 y Xaa10 son los mismos aminoácidos que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Ala8-Gln9-Leu10-X11-Ser12 (SEQ ID NO: 8), en donde cada X4 y X11 es independientemente un aminoácido; cada D es independientemente un aminoácido; cada E es independientemente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala (alanina), D-Ala (D-alanina), Aib (ácido a-aminoisobutírico), Sar (N-metilglicina), y Ser (serina); R1 y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E; cada R3 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R5; L y L' son independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula L1-L2-; cada L1 y L2 es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno o [-R4-K-R4-]n, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R5; cada R4 es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es independientemente O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un número entero de 1-1000; w es un número entero de 3-1000; y n es un número entero de 1-5.

Description

DESCRIPCIÓN

Macrociclos peptidomiméticos

Antecedentes de la invención

La proteína p53 factor de transcripción humano induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en respuesta al daño del ADN y al estrés celular, y por lo tanto juega un papel crítico en la protección de las células de la transformación maligna. La ubiquitina ligasa E3 MDM2 (también conocida como HDM2) regula negativamente la función de p53 a través de una interacción de unión directa que neutraliza la actividad de transactivación de p53, conduce a la exportación de la proteína p53 desde el núcleo, y dirige a p53 para su degradación a través de la vía de ubiquitilaciónproteosomal. La pérdida de la actividad de p53, ya sea por deleción, mutación, o sobreexpresión de MDM2, es el defecto más común en los cánceres humanos. Los tumores que expresan p53 de tipo silvestre son vulnerables a agentes farmacológicos que estabilizan o aumentan la concentración de p53 activa. En este contexto, la inhibición de las actividades de MDM2 ha surgido como un enfoque validado para restaurar la actividad de p53 y sensibilizar nuevamente a las células cancerosas a la apoptosis in vitro e in vivo. MDMX (MDM4) se ha identificado más recientemente como un regulador negativo de p53 similar, y los estudios han revelado una homología estructural significativa entre las interfaces de unión a p53 de MDM2 y MDMX. Las interacciones proteína-proteína p53-MDM2 y p53-MDMX están mediadas por el mismo dominio de transactivación de hélice alfa de 15 residuos de p53, que se inserta en hendiduras hidrófobas en la superficie de MDM2 y MDMX. Tres residuos dentro de este dominio de p53 (F19, W23, y L26) son esenciales para la unión a MDM2 y m Dm X.

Persiste una necesidad considerable de compuestos capaces de unirse y modular la actividad de p53, MDM2 y/o MDMX. En la presente descripción se describen macrociclos peptidomiméticos basados en p53 que modulan una actividad de p53. Además, en la presente descripción se describen macrociclos peptidomiméticos basados en p53 que inhiben las interacciones entre las proteínas p53, MDM2 y/o MDMX. Además, en la presente descripción se describen macrociclos peptidomiméticos basados en p53 que pueden usarse para tratar enfermedades que incluyen, pero no se limitan a cáncer y a otras enfermedades hiperproliferativas.

El documento WO2008/095063 describe compuestos peptidomacrocíclicos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona peptidomacrociclos, su uso en el tratamiento del cáncer y sus composiciones farmacéuticas en donde los peptidomacrociclos son de la Fórmula

o una sal aceptable farmacéuticamente de este,

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es independientemente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son los mismos aminoácidos que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2 (SEQ ID NO: 8), en donde cada X4 y X ii es independientemente un aminoácido;

cada D es independientemente un aminoácido;

cada E es independientemente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala (alanina), D-Ala (D-alanina), Aib (ácido a-aminoisobutírico), Sar (N-metilglicina), y Ser (serina);

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E;

cada R3 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, arilo, o heteroarilo, opcionalmente sustituido con Rs;

L y L' son independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula Li-L2-;

cada Li y L2 es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, o [-R4-K-R4-K cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R5;

cada R4 es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno;

cada K es independientemente O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D;

Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E;

v es un número entero de 1 -1000;

w es un número entero de 3-1000; y

n es un número entero de 1-5.

En la presente descripción se describen péptidos reticulados de forma estable relacionados con una porción de p53 humana ("macrociclos peptidomiméticos de p53"). Estos péptidos reticulados contienen al menos dos aminoácidos modificados que juntos forman una reticulación intramolecular que puede ayudar a estabilizar la estructura secundaria alfa helicoidal de una porción de p53 que se cree que es importante para la unión de p53 a MDM2 y para la unión de p53 a MDMX. Por consiguiente, un polipéptido reticulado descrito en la presente descripción puede tener una actividad biológica mejorada en relación con un polipéptido correspondiente que no está reticulado. Se cree que los macrociclos peptidomiméticos de p53 interfieren con la unión de p53 a MDM2 y/o de p53 a MDMX, de esa manera se libera la p53 funcional y se inhibe su destrucción. Los macrociclos peptidomiméticos de p53 descritos en la presente descripción pueden usarse terapéuticamente, por ejemplo, para tratar cánceres y otros trastornos caracterizados por un nivel indeseablemente bajo o una baja actividad de p53, y/o para tratar cánceres y otros trastornos caracterizados por un nivel o actividad indeseablemente alto de MDM2 o MDMX. Los macrociclos peptidomiméticos de p53 pueden ser, además, útiles para el tratamiento de cualquier trastorno asociado con la interrupción de la regulación de la vía transcripcional de p53, lo que conduce a condiciones de exceso de supervivencia y proliferación celular tal como cáncer y autoinmunidad, además de condiciones de detención inapropiada del ciclo celular y apoptosis tal como neurodegeneración e inmunodeficiencias. En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos de p53 se unen a MDM2 (por ejemplo, núm. de acceso del GenBank®: 228952; GI:228952) y/o Md MX (también denominado MDM4; núm. de acceso del GenBank®: 88702791; GI:88702791).

En la presente descripción se describe un macrociclo peptidomimético que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60 %, 80 %, 90 %, o 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la Tabla 1, Tabla 1a, Tabla 1b, o Tabla 1c. Alternativamente, se elige una secuencia de aminoácidos de dicho macrociclo peptidomimético del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la Tabla 4. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético no es un péptido como se muestra en la Tabla 2a o 2b. En otros casos, el macrociclo peptidomimético no comprende una estructura como se muestra en la Tabla 2a o 2b. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos que se elige de la Tabla 1. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos que se elige de la Tabla 1a. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos que se elige de la Tabla 1b. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una secuencia de aminoácidos que se elige de la Tabla 1c.

Alternativamente, se elige una secuencia de aminoácidos de dicho macrociclo peptidomimético como anteriormente, y además, en donde el macrociclo no incluye un tioéter o un triazol. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético comprende una hélice, tal como una hélice a. En otros casos, el macrociclo peptidomimético comprende un a,aaminoácido disustituido. Un macrociclo peptidomimético puede comprender un reticulante que une las posiciones a de al menos dos aminoácidos. Al menos uno de dichos dos aminoácidos puede ser un a,a-aminoácido disustituido.

En la presente descripción se describen el macrociclo peptidomimético de la fórmula:

en donde:

cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido;

B es un aminoácido,

[-NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-], o [-NH-L3-];

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E;

R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5;

cada L o L' es independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -L1-L2-;

Li y L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-K cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R5;

cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v y w son independientemente números enteros de 1-1000, por ejemplo, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10;

u es un número entero de 1-10, por ejemplo, 1-5, 1-3 o 1-2;

x, y, y z son independientemente números enteros de 0-10, por ejemplo, la suma de x+y+z es 2, 3, o 6; y n es un número entero de 1-5.

En algunos casos, w> 2 y cada uno de los dos primeros aminoácidos representados por E comprende una cadena lateral sin carga o una cadena lateral con carga negativa.

En algunos casos, el primer aminoácido C-terminal y/o el segundo aminoácido C-terminal representado por E comprenden una cadena lateral hidrófoba. Por ejemplo, el primer aminoácido C-terminal y/o el segundo aminoácido C-terminal representado por E comprenden una cadena lateral hidrófoba, por ejemplo, una cadena lateral hidrófoba grande.

En algunos casos, w está entre 3 y 1000. Por ejemplo, el tercer aminoácido representado por E comprende una cadena lateral hidrófoba grande.

En otros casos, el macrociclo peptidomimético como se reivindica excluye la secuencia de:

Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2, Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2,

Ac-$r8SQQTFS$LWRLLAibQN-NH2, Ac-QSQ$r8TFSNLW$LLAibQN-NH2,

Ac-QS$r5QTFStNLW$LLAibQN-NH2, o Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2.

Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2.

En la presente descripción se describen macrociclos peptidomiméticos de la fórmula:

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2, donde cada X es un aminoácido;

cada D y E es independientemente un aminoácido;

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -L¹-L²-;

Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R⁴-K-R⁴-]n, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R⁵;

R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R⁵;

cada R⁴es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

cada Rs es independientemente halógeno, alquilo, -OR⁶, -N(R⁶)², -SR⁶, -SOR⁶, -SO²R⁶, -CO²R⁶, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con Rs, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con Rs, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un número entero de 1-1000, por ejemplo, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10;

w es un número entero de 3-1000, por ejemplo, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y

n es un número entero de 1-5.

En algunos casos, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula:

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia P t^^-G lus-T y^-T ^-A las-G ^-Leu io /C ba io -X ii-A la^, donde cada X es un aminoácido; cada D es independientemente un aminoácido;

cada E es independientemente un aminoácido, por ejemplo, un aminoácido seleccionado de Ala (alanina), D-Ala (D-alanina), Aib (ácido a-aminoisobutírico), Sar (N-metilglicina), y Ser (serina);

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -Li-L2-;

Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-]n, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R5;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un número entero de 1-1000, por ejemplo, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20, o 1-10;

n es un número entero de 1-5.

En algunos casos, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula:

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos dos de Xaa3 Xaa5, Xaa6, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2, donde cada X es un aminoácido;

cada D y E es independientemente un aminoácido;

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -Li-L2-, donde L comprende al menos un doble enlace en la configuración E;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un número entero de 1-1000; w es un número entero de 3-1000;

n es un número entero de 1-5; y

Xaa7 es triptófano protegido con Boc.

En algunos casos de cualquiera de las Fórmulas descritas en la presente descripción, [D]v es -Leui-Thr2. En otros casos de las Fórmulas descritas en la presente descripción, cada E distinto del tercer aminoácido representado por E es un aminoácido seleccionado de Ala (alanina), D-Ala (D-alanina), Aib (ácido a-aminoisobutírico), Sar (N-metilglicina) y Ser (serina).

En algunos casos, w es un número entero de 3-10, por ejemplo, 3-6, 3-8, 6-8, o 6-10. En algunos casos, w es 3. En otros casos, w es 6. En algunos casos, v es un número entero del 1 -10, por ejemplo, 2-5. En algunos casos, v es 2.

En algunos casos, los péptidos descritos en la presente descripción se unen a un sitio de unión definido al menos en parte por las cadenas laterales de los aminoácidos L17, V46, M50, Y96 (que forman el borde del bolsillo) y L99 de MDMX. Sin estar atado por la teoría, la unión a tal sitio de unión mejora una o más propiedades tales como la afinidad de unión, inducción de apoptosis, eficacia antitumoral in vitro o in vivo, o la relación de afinidades de unión a MDMX reducida con respecto a MDM2.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una afinidad de unión mejorada a MDM2 o MDMX en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene una relación de afinidades de unión a MDMX reducida con respecto a MDM2 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. Aun en otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene una eficacia antitumoral in vitro mejorada contra líneas celulares tumorales positivas para p53 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético muestra una inducción de apoptosis in vitro mejorada en líneas de células tumorales positivas para p53 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En otros casos, el macrociclo peptidomimético de la reivindicación 1, en donde el macrociclo peptidomimético tiene una relación de eficacia antitumoral in vitro mejorada para las líneas de células tumorales positivas de p53 con respecto a las negativas o mutantes de p53 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En algunos casos, la relación de eficacia mejorada in vitro es 1-29, >30-49, o >50. Aún en otros casos, el macrociclo peptidomimético ha mejorado la eficacia antitumoral in vivo contra tumores positivos para p53 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En algunos casos, la relación de eficacia mejorada in vivo es -29, >30-49, o >50. Aún en otros casos, el macrociclo peptidomimético ha mejorado la inducción de apoptosis in vivo en tumores positivos para p53 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una permeabilidad celular mejorada en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2. En otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene una solubilidad mejorada en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde w es 0, 1 o 2.

En algunos casos, Xaa4 es Glu o un aminoácido análogo de este. En algunos casos, Xaas es Glu o un aminoácido análogo de este y en donde el macrociclo peptidomimético tiene una propiedad mejorada, tal como afinidad de unión mejorada, solubilidad mejorada, eficacia celular mejorada, permeabilidad celular mejorada, eficacia antitumoral in vivo o in vitro mejorada, o inducción de apoptosis mejorada en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una afinidad de unión mejorada a MDM2 o MDMX en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente en donde Xaas es Ala. En otros casos, el macrociclo peptidomimético tiene una relación de afinidades de unión a MDMX reducida con respecto a MDM2 en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una solubilidad mejorada en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala, o el macrociclo peptidomimético tiene una eficacia celular mejorada en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala.

En algunos casos, Xaas es Glu o un aminoácido análogo de este y en donde el macrociclo peptidomimético tiene actividad biológica mejorada, tal como afinidad de unión mejorada, solubilidad mejorada, eficacia celular mejorada, helicidad mejorada, permeabilidad celular mejorada, eficacia antitumoral in vivo o in vitro mejorada, o inducción de apoptosis mejorada en relación con un macrociclo peptidomimético correspondiente donde Xaas es Ala.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una actividad contra una línea celular p53+/+ que es al menos 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 70 veces, o 100 veces mayor que su afinidad de unión contra una línea celular p53-/-. En algunos casos, el macrociclo peptidomimético tiene una actividad contra una línea celular p53+/+ que es entre 1 y 29 veces, entre 30 y 49 veces, o >50 veces mayor que su afinidad de unión contra una línea celular p53-/-. La actividad puede medirse, por ejemplo, como un valor de IC50. Por ejemplo, la línea celular p53+/+ es SJSA-1, RKO, HCT-116, o MCF-7 y la línea celular p53-/- es RKO-E6 o SW-480. En algunos casos, el péptido tiene una IC50 contra la línea celular p53 /+ de menos de 1 |jM.

En algunos casos, Xaas es Glu o un aminoácido análogo de este y el macrociclo peptidomimético tiene una actividad contra una línea celular p53+/+ que es al menos 10 veces mayor que su afinidad de unión contra una línea celular p53-/-.

Además, se describe un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético. En algunos casos, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de mama, o glioma.

Además, se describe un método para modular la actividad de p53 o MDM2 o MDMX en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético, o un método para antagonizar la interacción entre las proteínas p53 y MDM2 y/o MDMX en un sujeto, que comprende administrar al sujeto tal macrociclo peptidomimético.

En la presente descripción se describe un método para preparar una composición que comprende un macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I):

que comprende una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos en la Tabla 1, Tabla 1a, Tabla 1b, o Tabla 1c, el método que comprende tratar un compuesto de la Fórmula (II)

con un catalizador para dar como resultado el compuesto de la Fórmula I

en donde en el compuesto(s) de las Fórmulas (I) y (II)

cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido;

cada B es independientemente un aminoácido,

[-NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-], o [-NH-L3-];

cada Ri y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halógeno; o al menos uno de Ri y R2 forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de los aminoácidos D o E; cada R3 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5;

cada L' es independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -L1-L2-;

cada Li, L2 y L3 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno o [-R4-K-R4'-]n, cada uno está opcionalmente sustituido con R5; cada R4 y R4' es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, o heteroarileno;

cada K es independientemente O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

cada R6 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

cada R7 es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R 5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; cada Rs es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; cada v y w son independientemente números enteros de 1-1000;

u es un número entero de 1-10;

cada x, y, y z son independientemente números enteros de 0-10;

cada n es independientemente un número entero de 1-5;

cada o es independientemente un número entero de 1 a 15;

cada p es independientemente un número entero de 1 a 15;

"(E)" indica un doble enlace trans; y

uno o más de los aminoácidos A, C y/o B cuando B es un aminoácido, presente en los compuestos de las Fórmulas (I) y (II), tiene una cadena lateral que porta un grupo protector.

En algunos casos, el grupo protector es un grupo protector del átomo de nitrógeno.

En algunos casos, el grupo protector es un grupo Boc.

En algunos casos, la cadena lateral del aminoácido que porta el grupo protector comprende un indol protegido. En algunos casos, el aminoácido que porta el grupo protector en su cadena lateral es triptófano (W) que está protegido por el grupo protector en su nitrógeno indol. Por ejemplo, el grupo protector es un grupo Boc.

En algunos casos, después de la etapa de poner en contacto el compuesto de la Fórmula II con el catalizador, el compuesto de la Fórmula (I) se obtiene en cantidades iguales o mayores que un compuesto correspondiente que es un isómero Z. Por ejemplo, después de la etapa de poner en contacto el compuesto de la Fórmula II con el catalizador, el compuesto de la Fórmula (I) se obtiene en una cantidad 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces mayor que el compuesto correspondiente que es un isómero Z.

En algunos casos, el catalizador es un catalizador de rutenio.

En algunos casos, el método comprende, además, la etapa de tratar los compuestos de la Fórmula (I) con un agente reductor o un agente oxidante.

En algunos casos, el compuesto de la Fórmula (II) se une a un soporte sólido. En otros casos, el compuesto de la Fórmula (II) no está unido a un soporte sólido.

En algunos casos, el método comprende, además, eliminar el grupo(s) protector(es) de los compuestos de la Fórmula (I).

En algunos casos, la metátesis de cierre del anillo se realiza a una temperatura que varía de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 80 °C.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) tiene la Fórmula:

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos dos de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2, donde cada X es un aminoácido;

cada D y E es independientemente un aminoácido;

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o al menos uno de Ri y R2 forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E; cada L o L' es independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -L1-L2-, donde L comprende al menos un doble enlace en la configuración E;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un número entero de 1 -1000;

w es un número entero de 3-1000;

n es un número entero de 1-5; y

Xaa7 es triptófano protegido con Boc.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) comprende una hélice a.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención mediante referencia a la siguiente descripción detallada que establece casos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los cuales:

La Figura 1 muestra una estructura del macrociclo peptidomimético 46 (Tabla 2b), un macrociclo peptidomimético de p53, complejado con MDMX (número de acceso de SwissProt Primario Q7ZUW7; Entrada MDm 4_DANRE).

La Figura 2 muestra las estructuras superpuestas del macrociclo peptidomimético 142 de p53 (Tabla 2b) y SP43 unidos a MDMX (Número de acceso de SwissProt Primario Q7ZUW7; Entrada MDM4_DANRE).

La Figura 3 muestra el efecto de SP154, un macrociclo peptidomimético, sobre el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MCF-7 en ratón.

La Figura 4 muestra el efecto de SP249, un macrociclo peptidomimético, sobre el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MCF-7 en ratón.

La Figura 5 muestra el efecto de SP315, un macrociclo peptidomimético, sobre el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MCF-7 en ratón.

La Figura 6 muestra el efecto de SP252, una mutación puntual de SP154, sobre el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto MCF-7 en ratón.

La Figura 7 muestra un gráfico de solubilidad para macrociclos peptidomiméticos con extensiones C-terminales variables.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en la presente descripción, el término "macrociclo" se refiere a una molécula que tiene una estructura química que incluye un anillo o ciclo formado por al menos 9 átomos unidos covalentemente.

Como se usa en la presente descripción, el término "macrociclo peptidomimético" o "polipéptido reticulado" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos unidos por una pluralidad de enlaces peptídicos y al menos un enlazador formador de macrociclo que forma un macrociclo entre un primer residuo de aminoácido (o análogo) de origen natural o no natural y un segundo residuo de aminoácido (o análogo) de origen natural o no natural dentro de la misma molécula. El macrociclo peptidomimético incluye casos donde el enlazador formador de macrociclo conecta el carbono a del primer residuo de aminoácido (o análogo) con el carbono a del segundo residuo de aminoácido (o análogo). Los macrociclos peptidomiméticos incluyen opcionalmente uno o más enlaces no peptídicos entre uno o más residuos de aminoácidos y/o residuos de análogos de aminoácidos, y opcionalmente incluyen uno o más residuos de aminoácidos o residuos de análogos de aminoácidos de origen no natural además de cualquiera que forme el macrociclo. Se entiende que un "polipéptido no reticulado correspondiente" cuando se hace referencia en el contexto de un macrociclo peptidomimético se refiere a un polipéptido de la misma longitud que el macrociclo y que comprende los aminoácidos naturales equivalentes de la secuencia de tipo silvestre correspondiente al macrociclo.

Como se usa en la presente descripción, el término "estabilidad" se refiere al mantenimiento de una estructura secundaria definida en solución mediante un macrociclo peptidomimético medido mediante dicroísmo circular, NMR u otra medida biofísica, o resistencia a la degradación proteolítica in vitro o in vivo. Los ejemplos no limitantes de estructuras secundarias contempladas en la presente descripción son a-hélices, 3io hélices, giros p, y las hojas p plegadas.

Como se usa en la presente descripción, el término "estabilidad helicoidal" se refiere al mantenimiento de la estructura a helicoidal mediante un macrociclo peptidomimético como se mide por dicroísmo circular o NMR. Por ejemplo, en algunos casos, un macrociclo peptidomimético exhibe al menos un aumento de 1,25, 1,5, 1,75 o 2 veces en a-helicidad como se determina mediante dicroísmo circular en comparación con un macrociclo no reticulado correspondiente.

El término "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, tanto los isómeros D como L de los aminoácidos de origen natural, así como también los aminoácidos de origen no natural preparados mediante síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. El término aminoácido, como se usa en la presente descripción, incluye, sin limitación, a-aminoácidos, aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, y análogos de aminoácidos.

El término "a-aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unido a un carbono que se denomina carbono a.

El término "p-aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo en una configuración p.

El término "aminoácido de origen natural" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos que se encuentran comúnmente en péptidos sintetizados en la naturaleza, y conocidos por las abreviaturas de una letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V.

La siguiente tabla muestra un resumen de las propiedades de los aminoácidos naturales:

(continuación)

Los "aminoácidos hidrófobos" incluyen aminoácidos hidrófobos pequeños y aminoácidos hidrófobos grandes. Los "aminoácidos hidrófobos pequeños" son glicina, alanina, prolina, y análogos de estos. Los "aminoácidos hidrófobos grandes" son valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, metionina, triptófano, y análogos de estos. Los "aminoácidos polares" son serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, tirosina, y análogos de estos. Los "aminoácidos cargados" son lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato y análogos de estos.

El término "análogo de aminoácido" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar a un aminoácido y que puede sustituirse por un aminoácido en la formación de un macrociclo peptidomimético. Los análogos de aminoácidos incluyen, sin limitación, p-aminoácidos y aminoácidos donde el grupo amino o carboxilo están sustituidos por un grupo reactivo similar (por ejemplo, sustitución de la amina primaria con una amina secundaria o terciaria, o sustitución del grupo carboxilo con un éster).

El término "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los veinte aminoácidos que se encuentran comúnmente en los péptidos sintetizados en la naturaleza, y conocido por las abreviaturas de una letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V. Los aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos incluyen, sin limitación, estructuras de acuerdo con lo siguiente:

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de p-aminoácidos. Los ejemplos de análogos de p-aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: análogos de p-aminoácidos cíclicos; p - alanina; (R) - p - fenilalanina; ácido (R) - 1,2,3,4 - tetrahidro - isoquinolina - 3 - acético; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(1 - naftil) - butírico; ácido (R) - 3 -amino - 4 -(2,4 - diclorofenil)butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - clorofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 -cianofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - fluorofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - furil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - metilfenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - naftil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - tienil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(2 - trifluorometilfenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3,4 -diclorofenil) butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3,4 - difluorofenil) butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - benzotienil) -butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - clorofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - cianofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - fluorofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - metilfenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino -4 -(3 - piridil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - tienil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(3 - trifluorometilfenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - bromofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - clorofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - cianofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - fluorofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino -4 -(4 - iodofenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - metilfenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - nitrofenil) -butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - piridil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 -(4 - trifluorometilfenil) - butírico; ácido (R) - 3 - amino - 4 - pentafluoro - fenilbutírico; ácido (R) - 3 - amino - 5 - hexenoico; ácido (R) - 3 - amino - 5 - hexinoico; ácido (R) - 3 - amino - 5 - fenilpentanoico; ácido (R) - 3 - amino - 6 - fenil - 5 - hexenoico; ácido (S) - 1,2,3,4 - tetrahidro - isoquinolina - 3 - acético; ácido (S) - 3 - amino - 4 - (1 - naftil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 - (2,4 -diclorofenil)butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - clorofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 - (2 - cianofenil) -butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - fluorofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - furil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - metilfenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - naftil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - tienil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(2 - trifluorometilfenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3,4 - diclorofenil)butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3,4 - difluorofenil)butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - benzotienil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - clorofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - cianofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 -fluorofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - metilfenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - piridil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - tienil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(3 - trifluorometilfenil) - butírico; ácido (S) - 3 -amino - 4 -(4 - bromofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - clorofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 -cianofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - fluorofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - iodofenil) -butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - metilfenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - nitrofenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - piridil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino - 4 -(4 - trifluorometilfenil) - butírico; ácido (S) - 3 - amino -4 - pentafluoro - fenilbutírico; ácido (S) - 3 - amino - 5 - hexenoico; ácido (S) - 3 - amino - 5 - hexinoico; ácido (S) - 3 -amino - 5 - fenilpentanoico; ácido (S) - 3 - amino - 6 - fenil - 5 - hexenoico; ácido 1,2,5,6 - tetrahidropiridina - 3 -carboxílico; ácido 1,2,5,6 - tetrahidropiridina - 4 - carboxílico; ácido 3 - amino - 3 -(2 - clorofenil) - propiónico; ácido 3 - amino - 3 -(2 - tienil) - propiónico; ácido 3 - amino - 3 -(3 - bromofenil) - propiónico; ácido 3 - amino - 3 -(4 - clorofenil) - propiónico; ácido 3 - amino - 3 -(4 - metoxifenil) - propiónico; ácido 3 - amino - 4,4,4 - trifluoro - butírico; ácido 3 aminoadípico; D- p - fenilalanina; p - leucina; L - p - homoalanina; ácido L - p - homoaspártico y - benzil éster; ácido L - p - homoglutámico 6 - benzil éster; L - p - homoisoleucina; L - p - homoleucina; L - p - homometionina; L - p -homofenilalanina; L - p - homoprolina; L - p - homotriptofano; L - p - homovalina; L - Nw - benziloxicarbonilo - p -homolisina; Nw - L - p - homoarginina; O - benzil - L - p - homohidroxiprolina; O - benzil - L - p - homoserina; O - benzil - L - p - homotreonina; O - benzil - L - p - homotirosina; y - tritil - L - p - homoasparagina; (R) - p - fenilalanina; ácido L - p - homoaspártico y - t - butil éster; ácido L - p - homoglutámico 6 - t - butil éster; L - Nw - p - homolisina; N6 - tritil -L - p - homoglutamina; Nw - 2,2,4,6,7 - pentametil - dihidrobenzofuran - 5 - sulfonil - L - p - homoarginina; O - t - butil -L - p - homohidroxi - prolina; O - t - butil - L - p - homoserina; O - t - butil - L - p - homotreonina; O - t - butil - L - p -homotirosina; ácido 2- aminociclopentano carboxílico; y ácido 2-aminociclohexano carboxílico.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de alanina, valina, glicina o leucina. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de alanina, valina, glicina y leucina incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:

a - metoxiglicina; a - alil - L - alanina; ácido a - aminoisobutírico; a - metil - leucina; p -(1 - naftil) - D - alanina; p -(1 - naftil) - L - alanina; p -(2 - naftil) - D - alanina; p -(2 - naftil) - L - alanina; p -(2 - piridil) - D - alanina; p -(2 -piridil) - L - alanina; p -(2 - tienil) - D - alanina; p -(2 - tienil) - L - alanina; p -(3 - benzotienil) - D - alanina; p -(3 -benzotienil) - L - alanina; p -(3 - piridil) - D - alanina; p -(3 - piridil) - L - alanina; p -(4 - piridil) - D - alanina; p -(4 -piridil) - L - alanina; p - cloro - L - alanina; p - ciano - L - alanina; p - ciclohexil - D - alanina; p - ciclohexil - L - alanina; p - ciclopenten - 1 - il - alanina; p - ciclopentil - alanina; sal de p - ciclopropil - L - Ala - OH • diciclohexilamonio; p - t - butil - D - alanina; p - t - butil - L - alanina; ácido y - aminobutírico; ácido L - a,p - diaminopropiónico; 2,4 -dinitro - fenilglicina; 2,5 - dihidro - D - fenilglicina; ácido 2 - amino - 4,4,4 - trifluorobutírico; 2 - fluoro - fenilglicina; ácido 3 - amino - 4,4,4 - trifluoro - butírico; 3 - fluoro - valina; 4,4,4 - trifluoro - valina; sal de 4,5 - dehidro - L - leu -OH • diciclohexilammonio; 4 - fluoro - D - fenilglicina; 4 - fluoro - L - fenilglicina; 4 - hidroxi - D - fenilglicina; ácido 5.5.5 - trifluoro - leucina; ácido 6 - aminohexanoico; sal de ciclopentil - D - Gly - OH • diciclohexilamonio; sal de ciclopentil - Gly - OH • diciclohexilamonio;

Ácido D - a,p - diaminopropiónico; ácido D - a - aminobutírico; D - a - t - butilglicina; D -(2 - tienil)glicina; D -(3 -tienil)glicina; ácido D - 2 - aminocaproico; D - 2 - indanilglicina; sal de D - alilglicinaAdiciclohexilamonio; D -ciclohexilglicina; D - norvalina; D - fenilglicina; ácido p - aminobutírico; ácido p - aminoisobutírico; (2 - bromofenil)glicina; (2 - metoxifenil)glicina; (2 - metilfenil)glicina; (2 - tiazoil)glicina; ácido (2 - tienil)glicina; 2 - amino - 3 -(dimetilamino) - propiónico; ácido L - a,p - diaminopropiónico; ácido L - a - aminobutírico; L - a - t - butilglicina; L -(3 - tienil)glicina; ácido L - 2 - amino - 3 -(dimetilamino) - propiónico; sal de ácido L - 2 - aminocaproico diciclohexil - amonio; L - 2 - indanilglicina; sal de L - alilglicina^diciclohexil amonio; L - ciclohexilglicina; L - fenilglicina; L -propargilglicina; L - norvalina; N - a - aminometil - L - alanina; ácido D - a,Y - diaminobutírico; ácido L - a,Y -diaminobutírico; p - ciclopropil - L - alanina; ácido (N - p -(2,4 - dinitrofenil)) - L - a,p - diaminopropiónico; ácido (N - p - 1 -(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxociclohex - 1 - ilideno)etil) - D - a,p - diaminopropiónico; ácido (N - p - 1 -(4,4 -dimetil - 2,6 - dioxociclohex - 1 - ilideno)etil) - L - a,p - diaminopropiónico; ácido (N - p - 4 - metiltritil) - L - a,p -diaminopropiónico; ácido (N - p - aliloxicarbonil) - L - a,p - diaminopropiónico; ácido (N - y - 1 -(4,4 - dimetil - 2,6 -dioxociclohex - 1 - ilideno)etil) - D - a,Y - diaminobutírico; ácido (N - y - 1 -(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxociclohex - 1 -ilideno)etil) - L - a,Y - diaminobutírico; ácido (N - y - 4 - metiltritil) - D - a,Y - diaminobutírico; ácido (N - y - 4 - metiltritil) - L - a,Y - diaminobutírico; ácido (N - y - aliloxicarbonil) - L - a,Y - diaminobutírico; ácido D - a,Y - diaminobutírico; 4.5 - dehidro - L - leucina; ciclopentil - D - Gly - OH; ciclopentil - Gly - OH; D - alilglicina; D - homociclohexilalanina; L - 1 - pirenilalanina; ácido L - 2 - aminocaproico; L - alilglicina; L - homociclohexilalanina; y N -(2 - hidroxi - 4 -metoxi - Bzl) - Gly - OH.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de arginina o lisina. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de arginina y lisina incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: citrulina; ácido L - 2 - amino - 3 - guanidinopropiónico; ácido L - 2 - amino - 3 - ureidopropiónico; L - citrulina; Lys(Me)2 - OH; Lys(N3) - OH; N6 - benziloxicarbonil - L - ornitina; Nw - nitro - D - arginina; Nw - nitro - L - arginina; a - metil - ornitina; ácido 2,6 - diaminoheptanodioico; L - ornitina; (N6 - 1 -(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxo - ciclohex - 1 - ilideno)etil) - D - ornitina; (N6 - 1 -(4,4 - dimetil - 2,6 - dioxo - ciclohex - 1 - ilideno)etil) - L - ornitina; (N6 - 4 - metiltritil) - D - ornitina; (N6 - 4 - metiltritil) - L - ornitina; D - ornitina; L - ornitina; Arg(Me)(Pbf) - OH; Arg(Me)2 - OH (asimétrico); Arg(Me)2 - OH (simétrico); Lys(ivDde) - OH; Lys(Me)2 - OH • HCl; Lys(Me3) - OH cloruro; Nw - nitro - D - arginina; y Nw - nitro - L - arginina.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de los ácidos aspártico o glutámico. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de los ácidos aspártico y glutámico incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: ácido a - metil - D -aspártico; ácido a - metil - glutámico; ácido a - metil - L - aspártico; ácido y - metileno - glutámico; ácido (N - y - etil) -L - glutamina; ácido [N - a -(4 - aminobenzoil)] - L - glutámico; ácido 2,6 - diaminopimelico; ácido L - a - aminosubérico; ácido D - 2 - aminoadípico; ácido D - a - aminosubérico; ácido a - aminopimélico; ácido iminodiacético; ácido L - 2 -aminoadípico; ácido treo - p - metil - aspártico; ácido y - carboxi - D - glutámico y,y - di - t - butil éster; ácido y - carboxi - L - glutámico y,y - di - t - butil éster; Glu(OAll) - OH; L - Asu(OtBu) - OH; y ácido piroglutámico.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de cisteína y metionina. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de cisteína y metionina incluyen, pero no se limitan a, Cys(farnesil) - OH, Cys(farnesil) - OMe, a - metil - metionina, Cys(2 - hidroxietil) - OH, Cys(3 - aminopropil) - OH, ácido 2 - amino - 4 -(etiltio)butírico, butionina, butioninasulfoximina, etionina, cloruro de metionina metilsulfonio, selenometionina, ácido cisteico, [2 -(4 - piridil)etil] - DL - penicilamina, [2 -(4 - piridil)etil] - L - cisteína, 4 - metoxibenzil - D - penicilamina, 4 - metoxibenzil - L - penicilamina, 4 - metilbenzil - D - penicilamina, 4 - metilbenzil - L - penicilamina, benzil-D-cisteína, benzil - L - cisteína, benzil - DL - homocisteína, carbamoil - L - cisteína, carboxietil - L - cisteína, carboximetil - L - cisteína, difenilmetil - L - cisteína, etil - L - cisteína, metil - L - cisteína, t-butil - D - cisteína, tritil - L-homocisteína, tritil - D - penicilamina, cistationina, homocistina, L-homocistina, (2-aminoetil) - L - cisteína, seleno - L - cistina, cistationina, Cys(StBu) - OH, y acetamidometil - D -penicilamina.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de fenilalanina y tirosina. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de fenilalanina y tirosina incluyen p - metil - fenilalanina, p - hidroxifenilalanina, a - metil - 3 - metoxi - DL - fenilalanina, a - metil - D - fenilalanina, a - metil - L - fenilalanina, ácido 1,2,3,4 - tetrahidroisoquinolina - 3 - carboxílico, 2,4 - dicloro - fenilalanina, 2 -(trifluorometil) - D -fenilalanina, 2 -(trifluorometil) - L - fenilalanina, 2 - bromo - D - fenilalanina, 2 -bromo - L - fenilalanina, 2 - cloro - D - fenilalanina, 2 - cloro - L - fenilalanina, 2 - ciano - D - fenilalanina, 2 - ciano - L -fenilalanina, 2 - fluoro - D - fenilalanina, 2 - fluoro - L - fenilalanina, 2 - metil - D - fenilalanina, 2 - metil - L - fenilalanina, 2 - nitro - D - fenilalanina, 2 - nitro - L - fenilalanina, 2;4;5 - trihidroxi - fenilalanina, 3,4,5 - trifluoro - D - fenilalanina, 3,4,5 - trifluoro - L - fenilalanina, 3,4 - dicloro - D - fenilalanina, 3,4 - dicloro - L - fenilalanina, 3,4 - difluoro - D -fenilalanina, 3,4 - difluoro - L - fenilalanina, 3,4 - dihidroxi - L - fenilalanina, 3,4 - dimetoxi - L - fenilalanina, 3,5,3' -triiodo - L - tironina, 3,5 - diiodo - D - tirosina, 3,5 - diiodo - L - tirosina, 3,5 - diiodo - L - tironina, 3 -(trifluorometil) - D -fenilalanina, 3 -(trifluorometil) - L - fenilalanina, 3 - amino - L - tirosina, 3 - bromo - D - fenilalanina, 3 - bromo - L -fenilalanina, 3 - cloro - D - fenilalanina, 3 - cloro - L - fenilalanina, 3 - cloro - L - tirosina, 3 - ciano - D - fenilalanina, 3 -ciano - L - fenilalanina, 3 - fluoro - D - fenilalanina, 3 - fluoro - L - fenilalanina, 3 - fluoro - tirosina, 3 - iodo - D -fenilalanina, 3 - iodo - L - fenilalanina, 3 - iodo - L - tirosina, 3 - metoxi - L - tirosina, 3 - metil - D - fenilalanina, 3 - metil - L - fenilalanina, 3 - nitro - D - fenilalanina, 3 - nitro - L - fenilalanina, 3 - nitro - L - tirosina, 4 -(trifluorometil) - D -fenilalanina, 4 -(trifluorometil) - L - fenilalanina, 4 - amino - D - fenilalanina, 4 - amino - L - fenilalanina, 4 - benzoil - D - fenilalanina, 4 - benzoil - L - fenilalanina, 4 - bis(2 - cloroetil)amino - L - fenilalanina, 4 - bromo - D - fenilalanina, 4 -bromo - L - fenilalanina, 4 - cloro - D - fenilalanina, 4 - cloro - L - fenilalanina, 4 - ciano - D - fenilalanina, 4 - ciano - L -fenilalanina, 4 - fluoro - D - fenilalanina, 4 - fluoro - L - fenilalanina, 4 - iodo - D - fenilalanina, 4 - iodo - L - fenilalanina, homofenilalanina, tiroxina, 3,3 - difenilalanina, tironina, etil-tirosina, y metil-tirosina.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de prolina. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de prolina incluyen, pero no se limitan a, 3,4-deshidro-prolina, 4-fluoro-prolina, cis-4-hidroxi-prolina, ácido tiazolidina-2-carboxílico, y trans-4-fluoro- prolina.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de serina y treonina. Los ejemplos de análogos de aminoácidos de serina y treonina incluyen, entre otros, ácido 3 - amino - 2 - hidroxi - 5 - metilhexanoico, ácido 2 - amino - 3 - hidroxi -4 - metilpentanoico, ácido 2 - amino - 3 - etoxibutanoico, ácido 2 - amino - 3 - metoxibutanoico, ácido 4 - amino - 3 -hidroxi - 6 - metilheptanoico, ácido 2 - amino - 3 - benziloxipropiónico, ácido 2 - amino - 3 - benziloxipropiónico, ácido 2 - amino - 3 - etoxipropiónico, ácido 4 - amino - 3 - hidroxibutanoico, y a-metilserina.

Los análogos de aminoácidos incluyen análogos de triptófano. Los ejemplos de análogos de aminoácidos del triptófano incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: a - metil - triptófano; p -(3 - benzotienil) - D - alanina; p -(3 - benzotienil) - L - alanina; 1 - metil - triptófano; 4 - metil - triptófano; 5 - benziloxi - triptófano; 5 - bromo - triptófano; 5 - cloro -triptófano; 5 - fluoro - triptófano; 5 - hidroxi - triptófano; 5 - hidroxi - L - triptófano; 5 - metoxi - triptófano; 5 - metoxi - L - triptófano; 5 - metil - triptófano; 6 - bromo - triptófano; 6 - cloro - D - triptófano; 6 - cloro - triptófano; 6 - fluoro -triptófano; 6 - metil - triptófano; 7 - benziloxi - triptófano; 7 - bromo - triptófano; 7 - metil - - triptófano; ácido D - 1,2,3,4 - tetrahidro - norarmano - 3 - carboxílico; ácido 6 - metoxi - 1,2,3,4 - tetrahidronorarmano - 1 - carboxílico; ácido 7 -azatriptófano; L - 1,2,3,4 - tetrahidro - norarmano - 3 - carboxílico; 5 - metoxi - 2 - metil - triptófano; y 6 - cloro - L -triptófano.

En algunos casos, los análogos de aminoácidos son racémicos. En algunos casos, se usa el isómero D del análogo de aminoácido. En algunos casos, se usa el isómero L del análogo de aminoácido. En otros casos, el análogo de aminoácido comprende centros quirales que están en la configuración R o S. Aún en otros casos, el grupo(s) amino de un análogo de p-aminoácido está sustituido con un grupo protector, por ejemplo, terc-butiloxicarbonilo (grupo BOC), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), tosilo, y similares. Aún en otros casos, el grupo funcional ácido carboxílico de un análogo de p-aminoácido está protegido, por ejemplo, como su derivado éster. En algunos casos se usa la sal del análogo de aminoácido.

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo silvestre de un polipéptido sin abolir o alterar sustancialmente su actividad biológica o bioquímica esencial (por ejemplo, unión o activación de receptor). Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera de la secuencia de tipo silvestre del polipéptido, resulta en la abolición o en la abolición sustancial de la actividad biológica o bioquímica esencial del polipéptido.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, K, R, H), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, D, E), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, G, N, Q, S, T, Y, C), cadenas laterales no polares (por ejemplo, A, V, L, I, P, F, M, W), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, T, V, I) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, Y, F, W, H). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido, por ejemplo, se reemplaza con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Otros ejemplos de sustituciones aceptables son sustituciones basadas en consideraciones isoestéricas (por ejemplo, norleucina por metionina) u otras propiedades (por ejemplo, 2-tienilalanina por fenilalanina o 6-Cl-triptófano por triptófano).

El término "grupo de protección" se refiere a la porción química que se encuentra en el extremo carboxi o amino de la cadena polipeptídica del macrociclo peptidomimético sujeto. El grupo protector de un extremo carboxilo terminal incluye un ácido carboxílico no modificado (es decir, -COOH) o un ácido carboxílico con un sustituyente. Por ejemplo, el extremo carboxilo terminal puede sustituirse con un grupo amino para producir una carboxamida en el extremo C terminal. Varios sustituyentes incluyen, pero no se limitan a aminas primarias y secundarias, que incluye las aminas secundarias pegiladas. Los grupos de protección de amina secundaria representativos para el extremo C terminal incluyen:

Isopropilamida Propilamida sec-butilamida butilamída Isobutilamida

(-NHPr) (-NHnPr) (-NHsBu) (-NHnBu) (NHiBu)

El grupo de terminación de un extremo amino terminal incluye una amina no modificada (es decir, -NH2) o una amina con un sustituyente. Por ejemplo, el extremo amino puede sustituirse con un grupo acilo para producir una carboxamida en el extremo N-terminal. Varios sustituyentes incluyen, pero no se limitan a grupos acilo sustituidos, que incluyen carbonilos C1-C6, carbonilos C7-C30, y carbamatos pegilados.

Los grupos protectores representativos para el extremo N terminal incluyen, pero no se limitan a, 4-FBzl (4-fluorobencilo) y los siguientes:

El término "miembro" como se usa en la presente descripción junto con macrociclos o enlazadores formadores de macrociclo se refiere a los átomos que forman o pueden formar el macrociclo, y excluye átomos sustituyentes o de cadena lateral. Por analogía, el ciclodecano, el 1,2-difluoro-decano y el 1,3-dimetilciclodecano se consideran todos macrociclos de diez miembros ya que los sustituyentes de hidrógeno o flúor o las cadenas laterales de metilo no participan en la formación del macrociclo.

El símbolo1 cuando se usa como parte de una estructura molecular se refiere a un enlace único o un enlace doble trans o cis".

El término "cadena lateral de aminoácidos" se refiere a una porción unida al carbono a (u otro átomo de la cadena principal) en un aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoácidos para alanina es metilo, la cadena lateral de aminoácidos para fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de aminoácidos para cisteína es tiometilo, la cadena lateral de aminoácidos para aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoácidos para tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etcétera. Además, se incluyen otras cadenas laterales de aminoácidos no naturales, por ejemplo, las que se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, un metabolito de aminoácido) o las que se fabrican sintéticamente (por ejemplo, un a,a aminoácido disustituido).

El término "a,a aminoácido disustituido" se refiere a una molécula o porción que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unido a un carbono (el carbono a) que está unido a dos cadenas laterales de aminoácidos naturales o no naturales.

El término "polipéptido" abarca dos o más aminoácidos naturales o no naturales unidos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida). Los polipéptidos como se describen en la presente descripción incluyen proteínas de longitud completa (por ejemplo, proteínas completamente procesadas) así como también secuencias de aminoácidos más cortas (por ejemplo, fragmentos de proteínas de origen natural o fragmentos de polipéptidos sintéticos).

El término "primer aminoácido C-terminal" se refiere al aminoácido que está más cerca del extremo C-terminal. El término "segundo aminoácido C-terminal" se refiere al aminoácido unido al N-terminal del primer aminoácido C-terminal.

El término "reactivo de macrociclización" o "reactivo formador de macrociclo" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier reactivo que pueda usarse para preparar un macrociclo peptidomimético a través de mediar la reacción entre dos grupos reactivos. Los grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, una azida y un alquino, en cuyo caso los reactivos de macrociclización incluyen, sin limitación, reactivos de Cu tales como reactivos que proporcionan especies reactivas de Cu(I), tales como CuBr, CuI o CuOTf, así como también sales de Cu(II) tales como Cu(CO2CH3)2, CuSO4, y CuCl2 que pueden convertirse in situ en un reactivo de Cu(I) activo mediante la adición de un agente reductor tal como ácido ascórbico o ascorbato de sodio. Los reactivos de macrociclización pueden incluir adicionalmente, por ejemplo, reactivos de Ru conocidos en la técnica tal como Cp*RuCl(PPh3)2, [Cp*RuCl]4 u otros reactivos de Ru que pueden proporcionar una especie reactiva de Ru(II). En otros casos, los grupos reactivos son olefinas terminales. En tales casos, los reactivos de macrociclización o los reactivos formadores de macrociclo son catalizadores de metátesis que incluyen, pero no se limitan a, catalizadores de complejo de carbeno de metal de transición tardía estabilizados tales como catalizadores carbeno de metal de transición del Grupo VIII. Por ejemplo, tales catalizadores son centros metálicos Ru y Os que tienen un estado de oxidación 2, un conteo de electrones de 16 y pentacoordinados. En otros ejemplos, los catalizadores tienen centros W o Mo. Se describen varios catalizadores en Grubbs y otros, "Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452, patente de EE.UU. núm.

5,811,515; patente de EE.UU. núm. 7,932,397; Solicitud de EE.UU. núm. 2011/0065915; Solicitud de EE.UU. núm.

2011/0245477; Yu y otros, "Synthesis of Macrocyclic Natural Products by Catalyst-Controlled Stereoselective Ring-Closing Metathesis," Nature 2011, 479, 88; y Peryshkov y otros, "Z-Selective Olefin Metathesis Reactions Promoted by Tungsten Oxo Alkylidene Complexes," J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20754. Aún en otros casos, los grupos reactivos son grupos tiol. En tales casos, el reactivo de macrociclización es, por ejemplo, un enlazador funcionalizado con dos grupos reactivos tiol tales como grupos halógenos.

El término "halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo o un radical de estos.

El término "alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada que es una cadena lineal o una cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C1-C10 indica que el grupo tiene de 1 a 10 (inclusive) átomos de carbono en él. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 1 a 20 (inclusive) átomos de carbono en ella.

El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir, -R-).

El término "alquenilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada que es una cadena lineal o una cadena ramificada que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. La porción alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo tiene de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono en él. El término "alquenilo inferior" se refiere a una cadena de alquenilo C2-C6. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquenilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono en ella.

El término "alquinilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada que es una cadena lineal o ramificada que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. La porción alquinilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo tiene de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono en él. El término "alquinilo inferior' se refiere a una cadena alquinilo C2-C6. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquinilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono en ella.

El término "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 6 carbonos o bicíclico de 10 carbonos en donde 0, 1,2, 3, o 4 átomos de cada anillo están sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y similares. El término "arilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con arilo.

"Arilalquilo" se refiere a un grupo arilo, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado por un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente. Los ejemplos representativos de un grupo arilalquilo incluyen, pero no se limitan a, 2-metilfenilo, 3-metilfenilo, 4-metilfenilo, 2-etilfenilo, 3-etilfenilo, 4-etilfenilo, 2-propilfenilo, 3-propilfenilo, 4-propilfenilo, 2-butilfenilo, 3-butilfenilo, 4-butilfenilo, 2-pentilfenilo, 3-pentilfenilo, 4-pentil-fenilo, 2-isopropilfenilo, 3-isopropilfenilo, 4-isopropilfenilo, 2-isobutilfenilo, 3-isobutilfenilo, 4-isobutilfenilo 2-sec-butilfenilo, 3-sec-butilfenilo, 4-sec-butilfenilo, 2-t-butilfenilo, 3-t-butilfenilo y 4-t-butilfenilo.

"Arilamido" se refiere a un grupo arilo, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado con uno o más grupos -C(O)NH2. Ejemplos representativos de un grupo arilamido incluyen 2-C(O)NH2-fenilo, 3-C(O)NH2-fenilo, 4-C(O)NH2-fenilo, 2-C(O)NH2-piridilo, 3-C(O)NH2-piridilo, y 4-C(O)NH2-piridilo,

"Alquilheterociclo" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, tal como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un heterociclo. Los ejemplos representativos de un grupo alquilheterociclo incluyen, pero no se limitan a, -CH2CH2-morfolina, -CH2CH2-piperidina, -CH2CH2CH2-morfolina, y CH2CH2CH2-imidazol.

"Alquilamido" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un grupo -C(O)NH2. Los ejemplos representativos de un grupo alquilamido incluyen, pero no se limitan a, -CH2-C(O)NH2, -CH2CH2-C(O)NH2, - CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, - CH2CH(C(O)NH2)CH3, -CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3, -CH(C(O)NH2)CH2CH3, - C(CH3)2CH2C(O)NH2, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH3, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH3-CH3, y -CH2-CH2-NH-C(O)-CH=CH2.

"Alcanol" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un grupo hidroxilo. Los ejemplos representativos de un grupo alcanol incluyen, pero no se limitan a, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, - CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2 CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3, -CH2CH(OH)CH2CH3, - CH(OH)CH3 y -C(CH3)2CH2OH.

"Alquilcarboxi" se refiere a un grupo alquilo C1-C5, como se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo alquilo C1-C5 se ha reemplazado con un grupo --COOH. Los ejemplos representativos de un grupo alquilcarboxi incluyen, pero no se limitan a, -CH2COOH, -CH2CH2COOH, - CH2CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH3, - CH2CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH2CH3, -CH(COOH)CH2CH3 y - C(CH3)2CH2COOH.

El término "cicloalquilo" como se emplea en la presente descripción incluye grupos hidrocarbonados cíclicos saturados y parcialmente insaturados que tienen de 3 a 12 carbonos, preferentemente, de 3 a 8 carbonos, y con mayor preferencia de 3 a 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo adicionalmente está opcionalmente sustituido. Algunos grupos cicloalquilo incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, y ciclooctilo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros, o tricíclico de 11-14 miembros que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico, o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, dichos heteroátomos seleccionados de O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de O, N, o S si son monocíclicos, bicíclicos, o tricíclicos, respectivamente), en donde 0, 1, 2, 3, o 4 átomos de cada anillo están sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo, y similares.

El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo no aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8 12 miembros, o tricíclico de 11-14 miembros que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico, o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, dichos heteroátomos seleccionados de O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6, o 1-9 heteroátomos de O, N, o S si son monocíclicos, bicíclicos, o tricíclicos, respectivamente), en donde 0, 1, 2 o 3 átomos de cada anillo están sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo, y similares.

El término "sustituyente" se refiere a un grupo que reemplaza un segundo átomo o grupo tal como un átomo de hidrógeno en cualquier molécula, compuesto o porción. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, grupos halo, hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alcoxicarbonilo, amido, carboxi, alcanosulfonilo, alquilcarbonilo, y ciano.

En algunos casos, los compuestos descritos en la presente descripción contienen uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, se presentan como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros individuales, diastereómeros individuales y mezclas diastereoméricas. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen a menos que se describa expresamente de cualquier otra manera. En algunos casos, los compuestos descritos en la presente descripción además se representan en múltiples formas tautoméricas, en tales casos, los compuestos incluyen todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en la presente descripción (por ejemplo, si la alquilación de un sistema de anillos resulta en la alquilación en múltiples sitios, la invención incluye todos estos productos de reacción). Todas estas formas isoméricas de tales compuestos se incluyen a menos que se describa expresamente de cualquier otra manera. Todas las formas cristalinas de los compuestos descritos en la presente descripción se incluyen a menos que se describa expresamente de cualquier otra manera.

Como se usa en la presente descripción, los términos "aumentar" y "disminuir" significan, respectivamente, causar un aumento o disminución estadísticamente significativo (es decir, p < 0,1) de al menos un 5 %.

Como se usa en la presente descripción, la enumeración de un intervalo numérico para una variable tiene la intención de transmitir que la variable es igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por lo tanto, para una variable que es intrínsecamente discreta, la variable es igual a cualquier valor entero dentro del intervalo numérico, que incluye los puntos extremos del intervalo. De manera similar, para una variable que es inherentemente continua, la variable es igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, que incluye los puntos extremos del intervalo. Como un ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe con valores entre 0 y 2 toma los valores 0, 1 o 2 si la variable es inherentemente discreta, y toma los valores 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 o cualquiera de otros valores reales >0 y < 2 si la variable es inherentemente continua.

Como se usa en la presente descripción, a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera, la palabra "o" se usa en el sentido inclusivo de "y/o" y no en el sentido exclusivo de "uno u otro".

El término "en promedio" representa el valor medio derivado de realizar al menos tres réplicas independientes para cada punto de datos.

El término "actividad biológica" abarca las propiedades estructurales y funcionales de un macrociclo. La actividad biológica es, por ejemplo, estabilidad estructural, alfa-helicidad, afinidad por una diana, resistencia a la degradación proteolítica, penetrabilidad celular, estabilidad intracelular, estabilidad in vivo o cualquier combinación de estas.

El término "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de unión de una interacción, por ejemplo, entre un macrociclo peptidomimético y una diana. La afinidad de unión puede expresarse, por ejemplo, como una constante de disociación de equilibrio ("K^d"), que se expresa en unidades que son una medida de concentración (por ejemplo, M, mM, pM, nM, etcétera). Numéricamente, la afinidad de unión y los valores de K^dvarían inversamente, de manera que una afinidad de unión más baja corresponde a un valor de K^dmás alto, mientras que una afinidad de unión más alta corresponde a un valor de K^dmás bajo. Cuando es conveniente una alta afinidad de unión, la afinidad de unión "mejorada" se refiere a una mayor afinidad de unión y, por lo tanto, valores más bajos de K^d.

El término "eficacia in vitro" se refiere al grado en que un compuesto de prueba, tal como un macrociclo peptidomimético, produce un resultado beneficioso en un sistema de prueba o ensayo in vitro. La eficacia in vitro puede medirse, por ejemplo, como un valor de "IC50" o "EC50", que representa la concentración del compuesto de prueba que produce el 50 % del efecto máximo en el sistema de prueba.

El término "relación de eficacias in vitro" o "relación de eficacia in vitro" se refiere a la relación de IC50 o valores de EC50 a partir de un primer ensayo (el numerador) versus un segundo ensayo (el denominador). En consecuencia, una relación de eficacia in vitro mejorada para el Ensayo 1 versus el Ensayo 2 se refiere a un valor más bajo para la relación expresada como IC50(Ensayo 1)/IC50(Ensayo 2) o alternativamente como EC50(Ensayo 1)/EC50(Ensayo 2). Este concepto puede caracterizarse, además, como una "selectividad mejorada" en el Ensayo 1 versus el Ensayo 2, que puede deberse bien sea a una disminución en el valor de IC50 o EC50 para la Diana 1 o a un aumento en el valor de IC50 o valor de EC50 para la Diana 2.

Los detalles de uno o más casos particulares de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción más abajo. Otras características, objetos, y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Macrociclos Peptidomiméticos

En algunos casos, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula (I):

Fórmula I

en donde:

cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido (que incluye aminoácidos naturales o no naturales y análogos de aminoácidos) y los terminales D y E incluyen opcionalmente independientemente un grupo protector; B es un aminoácido (que incluye aminoácidos naturales o no naturales y análogos de aminoácidos),

[-NH-L3-CO-], [-NH-L3-SO2-], o [-NH-L3-];

Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-;

L es un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -L1-L2-;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

u es un número entero de 1-10, por ejemplo, 1-5, 1-3 o 1-2;

En algunos casos, v y w son números enteros entre 1-30. En algunos casos, w es un número entero de 3-1000, por ejemplo, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10. En algunos casos, la suma de x+y+z es 3 o 6. En algunos casos, la suma de x+y+z es 3. En otros casos, la suma de x+y+z es 6.

En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos también se describen de la fórmula:

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-His5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2, donde cada X es un aminoácido;

cada D y E es independientemente un aminoácido;

R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con Rs;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

cada Rs es independientemente halógeno, alquilo, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con Rs, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con Rs, o parte de una estructura cíclica con un residuo E; v es un número entero de 1-1000, por ejemplo, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-20 o 1-10;

w es un número entero de 3-1000, por ejemplo, 3-500, 3-200, 3-100, 3-50, 3-30, 3-20, o 3-10; y n es un número entero de 1-5.

En algunos casos de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente descripción, al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Hiss-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2. En otros casos, al menos cuatro de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Hiss-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2. En otros casos, al menos cinco de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Hiss-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2. En otros casos, al menos seis de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Hiss-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-Xii-Seri2. En otros casos, al menos siete de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Hiss-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio-X ii-S eri2.

En algunos casos, un macrociclo peptidomimético tiene la Fórmula:

en donde:

cada uno de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio es individualmente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa3, Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glus-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2, donde cada X es un aminoácido;

cada D es independientemente un aminoácido;

Li y L2 son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-]n, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con Rs;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

En algunos casos de la Fórmula anterior, al menos tres de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2. En otros casos de la Fórmula anterior, al menos cuatro de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2. En otros casos de la Fórmula anterior, al menos cinco de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2. En otros casos de la Fórmula anterior, al menos seis de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2. En otros casos de la Fórmula anterior, al menos siete de Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaa9, y Xaaio son el mismo aminoácido que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe3-X4-Glu5-Tyr6-Trp7-Alas-Gln9-Leuio/Cbaio-Xii-Alai2.

En el caso de cualquiera de las Fórmulas descritas en la presente descripción, Li y L2, ya sea solos o en combinación, no forman un triazol o un tioéter.

En un ejemplo, al menos uno de Ri y R2 es alquilo, no sustituido o sustituido con halo-. En otro ejemplo, tanto Ri como R2 son independientemente alquilo, no sustituido o sustituido con halo-. En algunos casos, al menos uno de Ri y R2 es metilo. En otros casos, Ri y R2 son metilo.

En algunos casos, x+y+z es al menos 3. En otros casos, x+y+z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunos casos, la suma de x+y+z es 3 o 6. En algunos casos, la suma de x+y+z es 3. En otros casos, la suma de x+y+z es 6. Cada aparición de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor de macrociclo se selecciona independientemente. Por ejemplo, una secuencia representada por la fórmula [A]x, cuando x es 3, abarca los casos donde los aminoácidos no son idénticos, por ejemplo, Gln-Asp-Ala, así como también los casos donde los aminoácidos son idénticos, por ejemplo, Gln-Gln-Gln. Esto se aplica a cualquier valor de x, y, o z en los intervalos indicados. De manera similar, cuando u es mayor que 1, cada compuesto puede abarcar macrociclos peptidomiméticos que son iguales o diferentes. Por ejemplo, un compuesto puede comprender macrociclos peptidomiméticos que comprenden diferentes longitudes de enlazadores o composiciones químicas.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético comprende una estructura secundaria que es una hélice a y Rs es -H, lo que permite el enlace de hidrógeno intrahélice. En algunos casos, al menos uno de A, B, C, D o E es un a,aaminoácido disustituido. En un ejemplo, B es un a,a-aminoácido disustituido. Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutírico. En otros casos, al menos uno de A, B, C, D o E es

Rs O

^■N ^{.. - ■ ' L . .}

En otros casos, la longitud del enlazador formador de macrociclo L, como se mide desde un primer Ca hasta un segundo Ca, se selecciona para estabilizar una estructura peptídica secundaria conveniente, tal como una hélice a formada por residuos del macrociclo peptidomimético que incluye, pero no necesariamente limitado a aquellos entre el primer Ca y un segundo Ca.

En un caso, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) es:

en donde cada Ri y R2 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo, o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-.

En casos relacionados, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) es:

en donde cada R i y R2' es independientemente un aminoácido.

En otros casos, el macrociclo peptidomimético de la Fórmula (I) es un compuesto de cualquiera de las fórmulas que se muestran más abajo:

en donde "AA" representa cualquier cadena lateral de aminoácido natural o no natural y V ” es[D]v, [E]w como se definió anteriormente, y n es un número entero entre 0 y 20, 50, 100, 200, 300, 400 o 500. En algunos casos, n es 0. En otros casos, n es menor que 50.

Los casos ilustrativos del enlazador L formador de macrociclo se muestran más abajo.

donde X, Y = -CH²-, O, S, o NH donde X, Y = -CH²-, O, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o = 0-10

R = H, alquilo, otro sustituyente

En otros casos, D y/o E en el compuesto de la Fórmula I se modifican adicionalmente para facilitar la captación celular. En algunos casos, la lipidación o PEGilación de un macrociclo peptidomimético facilita la captación celular, aumenta la biodisponibilidad, aumenta la circulación sanguínea, altera la farmacocinética, disminuye la inmunogenicidad y/o disminuye la frecuencia de administración necesaria.

En otros casos, al menos uno de [D] y [E] en el compuesto de la Fórmula I representa una porción que comprende un enlazador formador de macrociclo adicional de manera que el macrociclo peptidomimético comprende al menos dos enlazadores formadores de macrociclo. En un caso específico, un macrociclo peptidomimético comprende dos enlazadores formadores de macrociclo. En un caso, u es 2.

En algunos casos, cualquiera de los enlazadores formadores de macrociclo descritos en la presente descripción puede usarse en cualquier combinación con cualquiera de las secuencias mostradas en la Tabla 1, Tabla 1a, Tabla 1b, o Tabla 1c y además con cualquiera de los sustituyentes R indicados en la presente descripción.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético comprende al menos un motivo de hélice a. Por ejemplo, A, B y/o C en el compuesto de la Fórmula I incluyen una o más hélices a. En general, las hélices a incluyen entre 3 y 4 residuos de aminoácidos por vuelta. En algunos casos, la hélice a del macrociclo peptidomimético incluye de 1 a 5 vueltas y, por lo tanto, de 3 a 20 residuos de aminoácidos. En casos específicos, la hélice a incluye 1 vuelta, 2 vueltas, 3 vueltas, 4 vueltas, o 5 vueltas. En algunos casos, el enlazador formador de macrociclo estabiliza un motivo de hélice a incluido dentro del macrociclo peptidomimético. Por tanto, en algunos casos, la longitud del enlazador L formador del macrociclo desde un primer Ca hasta un segundo Ca se selecciona para aumentar la estabilidad de una hélice a. En algunos casos, el enlazador formador de macrociclo abarca desde 1 vuelta a 5 vueltas de la hélice a. En algunos casos, el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 vuelta, 2 vueltas, 3 vueltas, 4 vueltas, o 5 vueltas de la hélice a. En algunos casos, la longitud del enlazador formador de macrociclo es aproximadamente de 5 A a 9 A por vuelta de la hélice a, o aproximadamente de 6 A a 8 A por vuelta de la hélice a. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 vuelta de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 5 enlaces carbono-carbono a 13 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 7 enlaces carbono-carbono a 11 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 9 enlaces carbono-carbono. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 vueltas de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 8 enlaces carbono-carbono a 16 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 10 enlaces carbono-carbono a 14 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 12 enlaces carbono-carbono. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 3 vueltas de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 14 enlaces carbono -carbono a 22 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 16 enlaces carbono-carbono a 20 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 18 enlaces carbono-carbono. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 4 vueltas de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 20 enlaces carbono-carbono a 28 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 22 enlaces carbono-carbono a 26 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 24 enlaces carbono-carbono. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 5 vueltas de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 26 enlaces carbono-carbono a 34 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 28 enlaces carbono-carbono a 32 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 30 enlaces carbono-carbono. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 vuelta de una hélice a, el enlace contiene aproximadamente 4 átomos a 12 átomos, aproximadamente 6 átomos a 10 átomos, o aproximadamente 8 átomos. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 vueltas de la hélice a, el enlace contiene aproximadamente 7 átomos a 15 átomos, aproximadamente 9 átomos a 13 átomos, o aproximadamente 11 átomos. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 3 vueltas de la hélice a, el enlace contiene aproximadamente 13 átomos a 21 átomos, aproximadamente 15 átomos a 19 átomos, o aproximadamente 17 átomos. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 4 vueltas de la hélice a, el enlace contiene aproximadamente 19 átomos a 27 átomos, aproximadamente 21 átomos a 25 átomos, o aproximadamente 23 átomos. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 5 vueltas de la hélice a, el enlace contiene aproximadamente 25 átomos a 33 átomos, aproximadamente 27 átomos a 31 átomos, o aproximadamente 29 átomos. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 1 vuelta de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente de 17 miembros a 25 miembros, aproximadamente de 19 miembros a 23 miembros, o aproximadamente 21 miembros. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 2 vueltas de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 29 miembros a 37 miembros, aproximadamente 31 miembros a 35 miembros, o aproximadamente 33 miembros. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 3 vueltas de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 44 miembros a 52 miembros, aproximadamente 46 miembros a 50 miembros, o aproximadamente 48 miembros. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 4 vueltas de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 59 miembros a 67 miembros, aproximadamente 61 miembros a 65 miembros, o aproximadamente 63 miembros. Cuando el enlazador formador de macrociclo abarca aproximadamente 5 vueltas de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 74 miembros a 82 miembros, aproximadamente 76 miembros a 80 miembros, o aproximadamente 78 miembros.

En otros casos, se describen macrociclos peptidomiméticos de la Fórmula (IV) o (IVa):

en donde:

cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y los D y E terminales incluyen opcionalmente, independientemente, un grupo protector;

B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido,

[-NH-L³-CO-], [-NH-L³-SO²-], o [-NH-L³-];

R³es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R⁵;

L es un enlazador formador de macrociclo de la fórmula -L¹-L²-;

Lⁱy L²son independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R⁴-K-R⁴-]ⁿ, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R⁵;

cada K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

cada R⁵es independientemente halógeno, alquilo, -OR⁶, -N(R⁶)², -SR⁶, -SOR⁶, -SO²R⁶, -CO²R⁶, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

cada R⁶es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

R⁷es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, opcionalmente sustituido con R⁵;

v y w son independientemente números enteros de 1 -1000;

u es un número entero de 1-10;

x, y, z son independientemente números enteros de 0-10; y

n es un número entero de 1-5.

En un ejemplo, L¹y L², solos o en combinación, no forman un triazol o un tioéter.

En un ejemplo, al menos uno de R¹y R²es alquilo, no sustituido o sustituido con halo-. En otro ejemplo, tanto R¹como R²son independientemente alquilo, no sustituido o sustituido con halo-. En algunos casos, al menos uno de R¹y R²es metilo. En otros casos, R¹y R²son metilo.

En algunos casos, x+y+z es al menos 1. En otros casos, x+y+z es al menos 2. En otros casos, x+y+z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Cada aparición de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor de macrociclo se selecciona independientemente. Por ejemplo, una secuencia representada por la fórmula [A]^x, cuando x es 3, abarca los casos donde los aminoácidos no son idénticos, por ejemplo, Gln-Asp-Ala, así como también los casos donde los aminoácidos son idénticos, por ejemplo, Gln-Gln-Gln. Esto se aplica a cualquier valor de x, y, o z en los intervalos indicados.

En algunos casos, el macrociclo peptidomimético comprende una estructura secundaria que es una hélice a y R^ses -H, lo que permite el enlace de hidrógeno intrahélice. En algunos casos, al menos uno de A, B, C, D o E es un a,aaminoácido disustituido. En un ejemplo, B es un a,a-aminoácido disustituido. Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutírico. En otros casos, al menos uno de A, B, C, D o E es

Los casos ilustrativos del enlazador formador de macrociclo -L1-L2- se muestran más abajo.

R = H, alquilo, otro sustituyente

A menos que se indique de cualquier otra manera, cualquier compuesto (que incluye macrociclos peptidomiméticos, precursores de macrociclo y otras composiciones) también pretende abarcar compuestos que difieren solo en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las estructuras d e s c r i t a s e x c e p t o p o r e l r e e m p l a z o d e u n h i d r ó g e n o p o r u n d e u t e r i o o t r i t i o , o e l r e e m p l a z o d e u n c a r b o n o p o r c a r b o n o e n r i q u e c i d o c o n 13 C o 14 C e s t á n d e n t r o d e l a l c a n c e d e e s t a i n v e n c i ó n .

E n a l g u n o s c a s o s , l o s c o m p u e s t o s d e s c r i t o s e n l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n p u e d e n c o n t e n e r p r o p o r c i o n e s n o n a t u r a l e s 5 d e i s ó t o p o s a t ó m i c o s e n u n o o m á s d e l o s á t o m o s q u e c o n s t i t u y e n t a l e s c o m p u e s t o s . P o r e j e m p l o , l o s c o m p u e s t o s p u e d e n m a r c a r s e r a d i a c t i v a m e n t e c o n i s ó t o p o s r a d i a c t i v o s , t a l e s c o m o p o r e j e m p l o t r i t i o ( 3 H ) , y o d o - 1 2 5 ( 125 I ) o c a r b o n o - 1 4 ( 14 C ) . E n o t r o s c a s o s , u n o o m á s á t o m o s d e c a r b o n o s e r e e m p l a z a n c o n u n á t o m o d e s i l i c i o . T o d a s l a s v a r i a c i o n e s i s o t ó p i c a s d e l o s c o m p u e s t o s d e s c r i t o s e n l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n y a s e a n r a d i a c t i v o s o n o , s e c o n t e m p l a n e n l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n .

0

P r e p a r a c i ó n d e M a c r o c i c l o s P e p t i d o m i m é t i c o s

L o s m a c r o c i c l o s p e p t i d o m i m é t i c o s p u e d e n p r e p a r a r s e m e d i a n t e c u a l q u i e r a d e u n a d i v e r s i d a d d e m é t o d o s c o n o c i d o s e n l a t é c n i c a . P o r e j e m p l o , c u a l q u i e r a d e l o s r e s i d u o s i n d i c a d o s p o r " $ " o " $ r 8 " e n l a T a b l a 1 , T a b l a 1 a , T a b l a 1 b , o 5 T a b l a 1 c p u e d e s u s t i t u i r s e c o n u n r e s i d u o c a p a z d e f o r m a r u n r e t i c u l a n t e c o n u n s e g u n d o r e s i d u o e n l a m i s m a m o l é c u l a o u n p r e c u r s o r d e t a l r e s i d u o .

S e c o n o c e n e n l a t é c n i c a d i v e r s o s m é t o d o s p a r a e f e c t u a r l a f o r m a c i ó n d e m a c r o c i c l o s p e p t i d o m i m é t i c o s . P o r e j e m p l o , l a p r e p a r a c i ó n d e m a c r o c i c l o s p e p t i d o m i m é t i c o s d e l a F ó r m u l a I s e d e s c r i b e e n S c h a f m e i s t e r y o t r o s , J . A m . C h e m .

0 S o c . 1 2 2 : 5 8 9 1 - 5 8 9 2 ( 2 0 0 0 ) ; S c h a f m e i s t e r & V e r d i n e , J . A m . C h e m . S o c . 1 2 2 : 5 8 9 1 ( 2 0 0 5 ) ; W a l e n s k y y o t r o s , S c i e n c e 3 0 5 : 1 4 6 6 - 1 4 7 0 ( 2 0 0 4 ) ; p a t e n t e d e l o s E E . U U . n ú m . 7 , 1 9 2 , 7 1 3 y s o l i c i t u d P C T W O 2 0 0 8 / 1 2 1 7 6 7 . L o s a , a - a m i n o á c i d o s d i s u s t i t u i d o s y l o s p r e c u r s o r e s d e a m i n o á c i d o s d e s c r i t o s e n l a s r e f e r e n c i a s c i t a d a s p u e d e n e m p l e a r s e e n l a s í n t e s i s d e l o s p o l i p é p t i d o s p r e c u r s o r e s d e l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o . P o r e j e m p l o , e l " a m i n o á c i d o o l e f í n i c o S 5 " e s ( S ) - a -( 2 ' - p e n t e n i l ) a l a n i n a y e l " a m i n o á c i d o o l e f í n i c o R 8 " e s ( R ) - a - ( 2 ' - o c t e n i l ) a l a n i n a . D e s p u é s d e l a i n c o r p o r a c i ó n d e t a l e s 5 a m i n o á c i d o s e n p o l i p é p t i d o s p r e c u r s o r e s , l a s o l e f i n a s t e r m i n a l e s s e h a c e n r e a c c i o n a r c o n u n c a t a l i z a d o r d e m e t á t e s i s , l o q u e c o n d u c e a l a f o r m a c i ó n d e l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o . E n v a r i o s c a s o s , l o s s i g u i e n t e s a m i n o á c i d o s p u e d e n e m p l e a r s e e n l a s í n t e s i s d e l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o :

0

5

0

E n o t r o s c a s o s , l o s m a c r o c i c l o s p e p t i d o m i m é t i c o s s o n d e l a F ó r m u l a I V o I V a . L o s m é t o d o s p a r a l a p r e p a r a c i ó n d e t a l e s m a c r o c i c l o s s e d e s c r i b e n , p o r e j e m p l o , e n l a p a t e n t e d e l o s E E . U U . n ú m . 7 , 2 0 2 , 3 3 2 .

5

L o s m é t o d o s a d i c i o n a l e s p a r a f o r m a r m a c r o c i c l o s p e p t i d o m i m é t i c o s q u e s e c o n c i b e n c o m o a d e c u a d o s i n c l u y e n l o s d e s c r i t o s p o r M u s t a p a , M . F i r o u z M o h d y o t r o s , J . O r g . C h e m ( 2 0 0 3 ) , 6 8 , p p . 8 1 9 3 - 8 1 9 8 ; Y a n g , B i n y o t r o s , B i o o r g M e d . C h e m . L e t t . ( 2 0 0 4 ) , 14 , p p . 1 4 0 3 - 1 4 0 6 ; p a t e n t e d e l o s E E . U U . n ú m . 5 , 3 6 4 , 8 5 1 ; p a t e n t e d e l o s E E . U U . n ú m .

^{5 , 4 4 6 , 1 2 8 ; p a t e n t e d e l o s}EE.Uu . ^{n ú m . 5 , 8 2 4 , 4 8 3 ; p a t e n t e d e l o s E E . U U . n ú m . 6 , 7 1 3 , 2 8 0 ; y p a t e n t e d e l o s E E . U U .}

0 n ú m . 7 , 2 0 2 , 3 3 2 . E n t a l e s c a s o s , s e u s a n p r e c u r s o r e s d e a m i n o á c i d o s q u e c o n t i e n e n u n s u s t i t u y e n t e R - a d i c i o n a l e n l a p o s i c i ó n a l f a . T a l e s a m i n o á c i d o s s e i n c o r p o r a n e n e l p r e c u r s o r d e l m a c r o c i c l o e n l a s p o s i c i o n e s c o n v e n i e n t e s , q u e p u e d e n s e r e n l a s p o s i c i o n e s d o n d e e l r e t i c u l a n t e e s t á s u s t i t u i d o o , a l t e r n a t i v a m e n t e , e n c u a l q u i e r o t r o l u g a r e n l a s e c u e n c i a d e l p r e c u r s o r d e l m a c r o c i c l o . D e s p u é s s e e f e c t ú a l a c i c l a c i ó n d e l p r e c u r s o r d e a c u e r d o c o n e l m é t o d o i n d i c a d o .

5

E n s a y o s

L a s p r o p i e d a d e s d e l o s m a c r o c i c l o s p e p t i d o m i m é t i c o s s e e v a l ú a n , p o r e j e m p l o , m e d i a n t e e l u s o d e l o s m é t o d o s d e s c r i t o s m á s a b a j o . E n a l g u n o s c a s o s , u n m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o t i e n e p r o p i e d a d e s b i o l ó g i c a s m e j o r a d a s e n 0 r e l a c i ó n c o n u n p o l i p é p t i d o c o r r e s p o n d i e n t e q u e c a r e c e d e l o s s u s t i t u y e n t e s d e s c r i t o s e n l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n .

E n s a y o p a r a d e t e r m i n a r a - h e l i c i d a d

E n s o l u c i ó n , l a e s t r u c t u r a s e c u n d a r i a d e l o s p o l i p é p t i d o s c o n d o m i n i o s a - h e l i c o i d a l e s a l c a n z a r á u n e q u i l i b r i o d i n á m i c o 5 e n t r e l a s e s t r u c t u r a s h e l i c o i d a l e s a l e a t o r i a s y l a s e s t r u c t u r a s a - h e l i c o i d a l e s , e x p r e s a d o a m e n u d o c o m o u n " p o r c e n t a j e d e h e l i c i d a d " . P o r l o t a n t o , p o r e j e m p l o , l o s d o m i n i o s d e h é l i c e a l f a s o n p r e d o m i n a n t e m e n t e a r r o l l a m i e n t o s a l e a t o r i o s en solución, con un contenido de hélice alfa habitualmente inferior al 25 %. Los macrociclos peptidomiméticos con enlazadores optimizados, por otro lado, poseen, por ejemplo, una alfa-helicidad que es al menos dos veces mayor que la de un polipéptido no reticulado correspondiente. En algunos casos, los macrociclos poseerán una alfahelicidad superior al 50 %. Para evaluar la helicidad de macrociclos peptidomiméticos, los compuestos se disuelven en una solución acuosa (por ejemplo, solución de fosfato de potasio 50 mM a pH 7, o H2O destilada, a concentraciones de 25-50 pM). Los espectros de dicroísmo circular (CD) se obtienen en un espectropolarímetro (por ejemplo, Jasco J-710) mediante el uso de parámetros de medición estándar (por ejemplo, temperatura, 20 °C; longitud de onda, 190 260 nm; resolución escalonada, 0,5 nm; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 segundo; ancho de banda, 1 nm; longitud de la trayectoria, 0,1 cm). El contenido a-helicoidal de cada péptido se calcula dividiendo la elipticidad media del residuo (por ejemplo, [0]222obs) por el valor informado para un decapéptido helicoidal modelo (Yang y otros, (1986), Methods Enzymol. 130:208)).

Ensayo para Determinar la Temperatura de Fusión (Tm).

Un macrociclo peptidomimético que comprende una estructura secundaria tal como una hélice a exhibe, por ejemplo, una temperatura de fusión más alta que un polipéptido no reticulado correspondiente. Típicamente, los macrociclos peptidomiméticos exhiben una Tm de > 60 °C que representa una estructura muy estable en soluciones acuosas. Para evaluar el efecto de la formación de macrociclo sobre la temperatura de fusión, se disuelven macrociclos peptidomiméticos o péptidos no modificados en H2O destilada (por ejemplo, a una concentración final de 50 pM) y la Tm se determina midiendo el cambio de elipticidad en un intervalo de temperatura (por ejemplo, 4 a 95 °C) en un espectropolarímetro (por ejemplo, Jasco J-710) mediante el uso de parámetros estándar (por ejemplo, longitud de onda 222 nm; resolución escalonada, 0,5 nm; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 seg; ancho de banda, 1 nm; velocidad de aumento de temperatura: 1 °C/min; longitud de la trayectoria, 0,1 cm).

Ensayo de Resistencia a Proteasas.

El enlace amida de la cadena peptídica es susceptible de hidrólisis por proteasas, lo que hace que los compuestos peptídicos sean vulnerables a una rápida degradación in vivo. Sin embargo, la formación de hélice de los péptidos típicamente entierra la cadena amida y, por lo tanto, puede protegerla de la escisión proteolítica. Los macrociclos peptidomiméticos pueden someterse a proteólisis de tripsina in vitro para evaluar cualquier cambio en la velocidad de degradación en comparación con un polipéptido no reticulado correspondiente. Por ejemplo, el macrociclo peptidomimético y un polipéptido no reticulado correspondiente se incuban con tripsina agarosa y las reacciones se inactivan en varios puntos de tiempo mediante centrifugación y posterior inyección en HPLC para cuantificar el sustrato residual mediante absorción ultravioleta a 280 nm. Brevemente, el macrociclo peptidomimético y el precursor peptidomimético (5 mcg) se incuban con tripsina agarosa (Pierce) (S/E ~125) durante 0, 10, 20, 90, y 180 minutos. Las reacciones se inactivan mediante centrifugación de mesa a alta velocidad; el sustrato restante en el sobrenadante aislado se cuantifica mediante detección de picos basada en HPLC a 280 nm. La reacción proteolítica muestra una cinética de primer orden y la constante de velocidad, k, se determina a partir de una gráfica de ln[S] versus al tiempo (k=-1Xpendiente).

Ensayo de Estabilidad Ex Vivo.

Los macrociclos peptidomiméticos con enlazadores optimizados poseen, por ejemplo, una vida media ex vivo que es al menos dos veces mayor que la de un polipéptido no reticulado correspondiente, y poseen una vida media ex vivo de 12 horas o más. Para los estudios de estabilidad del suero ex vivo, pueden usarse una diversidad de ensayos. Por ejemplo, un macrociclo peptidomimético y un polipéptido no reticulado correspondiente (2 mcg) se incuban con suero fresco de ratón, rata y/o humano (2 mL) a 37 °C durante 0, 1,2, 4, 8, y 24 horas. Para determinar el nivel de compuesto intacto, puede usarse el siguiente procedimiento: Las muestras se extraen mediante la transferencia de 100 pl de suero a tubos de centrífuga de 2 mL, seguido de la adición de 10 pL de ácido fórmico al 50 % y 500 pL de acetonitrilo y centrifugación a 14 000 RPM durante 10 minutos a 4 ± 2 °C. Después los sobrenadantes se transfieren a tubos frescos de 2 mL y se evaporan en TurboVap bajo N2 < 10 psi, 37 °C. Las muestras se reconstituyen en 100 pl de acetonitrilo:agua 50:50 y se someten a análisis por LC-MS/MS.

Ensayos de Unión in vitro.

Para evaluar la unión y la afinidad de macrociclos peptidomiméticos y precursores peptidomiméticos a proteínas aceptoras, se usa, por ejemplo, un ensayo de polarización de fluorescencia (FPA). La técnica FPA mide la orientación y la movilidad molecular mediante el uso de luz polarizada y un trazador fluorescente. Cuando se excitan con luz polarizada, los trazadores fluorescentes (por ejemplo, FITC) unidos a moléculas con altos pesos moleculares aparentes (por ejemplo, péptidos marcados con FITC unidos a una proteína grande) emiten niveles más altos de fluorescencia polarizada debido a sus velocidades de rotación más lentas en comparación a trazadores fluorescentes unidos a moléculas más pequeñas (por ejemplo, péptidos marcados con FITC que están libres en solución).

Por ejemplo, se incuban macrociclos peptidomiméticos fluoresceinados (25 nM) con la proteína aceptora (25-1000 nM) en tampón de unión (NaCl 140 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de unión se mide, por ejemplo, mediante polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia (por ejemplo, Perkin-Elmer LS50B). Los valores de Kd pueden determinarse a través del análisis de regresión no lineal mediante el uso de, por ejemplo, el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Un macrociclo peptidomimético muestra, en algunos casos, Kd similar o menor que un polipéptido no reticulado correspondiente.

Ensayos de Desplazamiento In Vitro Para Caracterizar Antagonistas de Interacciones Péptido-Proteína.

Para evaluar la unión y la afinidad de compuestos que antagonizan la interacción entre un péptido y una proteína aceptora, se usa, por ejemplo, un ensayo de polarización de fluorescencia (FPA) que utiliza un macrociclo peptidomimético fluoresceinado derivado de una secuencia precursora peptidomimética. La técnica FPA mide la orientación y la movilidad molecular mediante el uso de luz polarizada y un trazador fluorescente. Cuando se excitan con luz polarizada, los trazadores fluorescentes (por ejemplo, FITC) unidos a moléculas con altos pesos moleculares aparentes (por ejemplo, péptidos marcados con FITC unidos a una proteína grande) emiten niveles más altos de fluorescencia polarizada debido a sus velocidades de rotación más lentas en comparación a trazadores fluorescentes unidos a moléculas más pequeñas (por ejemplo, péptidos marcados con FITC que están libres en solución). Un compuesto que antagoniza la interacción entre el macrociclo peptidomimético fluoresceinado y una proteína aceptora se detectará en un experimento de FPA de unión competitiva.

Por ejemplo, los compuestos antagonistas putativos (1 nM a 1 mM) y un macrociclo peptidomimético fluoresceinado (25 nM) se incuban con la proteína aceptora (50 nM) en tampón de unión (NaCl 140 mM, Tris-HCL 50 mM, pH 7,4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de unión del antagonista se mide, por ejemplo, mediante polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia (por ejemplo, Perkin-Elmer LS50B). Los valores de Kd pueden determinarse a través del análisis de regresión no lineal mediante el uso de, por ejemplo, el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Cualquier clase de molécula, tales como moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, oligonucleótidos o proteínas, puede examinarse como antagonistas putativos en este ensayo.

Ensayo de Unión Proteína-ligando mediante Espectrometría de Masas de Selección por Afinidad

Para evaluar la unión y la afinidad de los compuestos de prueba por las proteínas, se usa, por ejemplo, un ensayo de espectrometría de masas de selección por afinidad. Los experimentos de unión proteína-ligando se realizaron de acuerdo con el siguiente procedimiento representativo descrito para un experimento de control de todo el sistema mediante el uso de macrociclo peptidomimético 1 pM más hMDM25 pM. Se disuelve una alícuota de 1 pL de DMSO de una solución madre 40 pM de macrociclo peptidomimético en 19 pL de PBS (solución salina tamponada con Fosfato: 50 mM, tampón Fosfato pH 7,5 que contiene NaCl 150 mM). La solución resultante se mezcla mediante pipeteo repetido y se clarifica mediante centrifugación a 10 000 g durante 10 minutos. A una alícuota de 4 pl del sobrenadante resultante se le añaden 4 pl de hMDM2 10 pM en PBS. Por lo tanto, cada muestra experimental de 8,0 pL contiene 40 pmol (1,5 pg) de proteína a una concentración de 5,0 pM en PBS más macrociclo peptidomimético 1 pM y DMSO al 2,5 %. Las muestras duplicadas preparadas de esta manera para cada punto de concentración se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, y después se enfriaron a 4 °C antes del análisis de cromatografía de exclusión por tamaño LC-MS de inyecciones de 5,0 pl. Las muestras que contienen una proteína diana, complejos proteína-ligando, y compuestos no unidos se inyectan en una columna s Ec , donde los complejos se separan del componente que no está unido mediante una etapa rápido en SEC. El eluido de la columna s Ec se controla mediante el uso de detectores UV para confirmar que la fracción de proteína de elución temprana, que eluye en el volumen vacío de la columna SEC, está bien separada de los componentes no unidos que se retienen en la columna. Después de que el pico que contiene la proteína y los complejos proteína-ligando eluye del detector UV primario, ingresa a un bucle de muestra donde se escinde de la corriente de flujo de la etapa SEC y se transfiere directamente a la LC-MS mediante un mecanismo de válvula. El ion (M 3H)3+ del macrociclo peptidomimético se observa mediante ESI-MS en el m/z esperado, lo que confirma la detección del complejo proteína-ligando.

Ensayo para Experimentos de Titulación de Kd de Proteína-ligando.

Para evaluar la unión y la afinidad de los compuestos de prueba por las proteínas, se realiza, por ejemplo, un experimento de titulación de Kd proteína-ligando. Los experimentos de titulaciones de Kd proteína-ligando se realizaron como sigue: se prepararon alícuotas de 2 pL de DMSO de una solución madre diluida en serie del macrociclo peptidomimético titulable (5, 2, 5,..., 0,098 mM), después se disolvió en 38 pL de PBS. Las soluciones resultantes se mezclan pipeteando repetidamente y se clarificaron mediante centrifugación a 10000 g durante 10 min. A las alícuotas de 4,0 pl de los sobrenadantes resultantes se añaden 4,0 pl de hMDM2 10 pM en PBS. Por lo tanto, cada muestra experimental de 8,0 pL contiene 40 pmol (1,5 pg) de proteína a una concentración de 5,0 pM en PBS, concentraciones variables (125, 62, 5,..., 0,24 pM) del péptido titulable, y DMSO al 2,5 %. Las muestras duplicadas preparadas de esta manera para cada punto de concentración se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, después se enfriaron a 4 °C antes del análisis SEC-LC-MS de inyecciones de 2,0 pL. El ion (M H)1+, (M 2H)2+, (M 3H)3+, y/o (M Na)1+ se observa mediante ESI-MS; los cromatogramas de iones extraídos se cuantifican, después se ajustan a las ecuaciones para derivar la afinidad de unión Kd como se describe en "A General Technique to Rank ProteinLigand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; además en "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, y N. Nazef. En Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Editores de la Serie): Methods and Principies in Medicinal Chemistry.

Ensayo para Experimentos de Unión Competitiva mediante Selección de Afinidad-Espectrometría de Masas

Para determinar la capacidad de los compuestos de prueba para unirse competitivamente a proteínas, se realiza, por ejemplo, un ensayo de espectrometría de masas de selección por afinidad. Se prepara una mezcla de ligandos a 40 |jM por componente mediante la combinación de alícuotas de 2 jL de soluciones madres de 400 jM de cada uno de los tres compuestos con 14 jL de DMSO. Después, se combinan alícuotas de 1 j l de esta mezcla de 40 jM por componente con alícuotas de 1 jL de DMSO de una solución madre diluida en serie de macrociclo peptidomimético titulable (10, 5, 2, 5,..., 0,078 mM). Estas muestras de 2 jL se disuelven en 38 jL de PBS. Las soluciones resultantes se mezclaron pipeteando repetidamente y se clarificaron mediante centrifugación a 10000 g durante 10 minutos. A las alícuotas de 4,0 j l de los sobrenadantes resultantes se añaden 4,0 j l de proteína hMDM2 10 jM en PBS. Por lo tanto, cada muestra experimental de 8,0 jL contiene 40 pmol (1,5 jg ) de proteína a una concentración de 5,0 jM en PBS más ligando 0,5 jM , DMSO al 2,5 % y concentraciones variables (125, 62, 5,..., 0,98 jM ) del macrociclo peptidomimético titulable. Las muestras duplicadas preparadas de esta manera para cada punto de concentración se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min, después se enfriaron a 4 °C antes del análisis SEC-LC-MS de inyecciones de 2,0 jL . Los detalles adicionales sobre estos y otros métodos se describen en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495 15503; además en "ALIS: An Affinity SelectionMass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, y N. Nazef. En Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Editores de la Serie): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Ensayos de Unión en Células Intactas.

Es posible medir la unión de péptidos o macrociclos peptidomiméticos a sus aceptores naturales en células intactas mediante experimentos de inmunoprecipitación. Por ejemplo, las células intactas se incuban con compuestos fluoresceinados (marcados con FITC) durante 4 horas en ausencia de suero, seguido de reemplazo de suero y una incubación adicional que varía de 4 a 18 horas. Después, las células se sedimentan y se incuban en tampón de lisis (Tris 50 mM [pH 7,6], NaCl 150 mM, CHAPS al 1 % y coctel inhibidor de proteasa) durante 10 minutos a 4 °C. Los extractos se centrifugan a 14000 rpm durante 15 minutos y los sobrenadantes se recolectan y se incuban con 10 j l de anticuerpo anti-FITC generado en cabra durante 2 horas, rotando a 4 °C seguido de otras 2 horas de incubación a 4 °C con proteína A/G Sepharosa (50 j l de suspensión de perlas al 50 %). Después de una centrifugación rápida, los sedimentos se lavan en tampón de lisis que contiene una concentración de sal creciente (por ejemplo, 150, 300, 500 mM). Después, las perlas se vuelven a equilibrar en NaCl 150 mM antes de la adición de tampón de muestra que contiene SDS y se hierven. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se someten a electroforesis opcionalmente mediante el uso de geles Bis-Tris en gradiente de 4 %-12 % seguido de transferencia a membranas Immobilon-P. Después del bloqueo, las transferencias se incuban opcionalmente con un anticuerpo que detecta FITC y además con uno o más anticuerpos que detectan las proteínas que se unen al macrociclo peptidomimético.

Ensayos de Penetrabilidad Celular.

Un macrociclo peptidomimético es, por ejemplo, más penetrable en las células en comparación con un macrociclo no reticulado correspondiente. Los macrociclos peptidomiméticos con enlazadores optimizados poseen, por ejemplo, una penetrabilidad celular que es al menos dos veces mayor que un macrociclo no reticulado correspondiente y, a menudo, se observará que el 20 % o más del macrociclo peptidomimético aplicado ha penetrado en la célula después de 4 horas. Para medir la penetrabilidad celular de los macrociclos peptidomiméticos y el macrociclo no reticulado correspondiente, las células intactas se incubaron con macrociclos peptidomiméticos marcados con fluorescencia (por ejemplo, fluoresceinados) o el macrociclo no reticulado correspondiente (10 jM ) durante 4 horas en medio sin suero a 37 °C, se lavaron dos veces con medio y se incubaron con tripsina (0,25 %) durante 10 minutos a 37 °C. Las células se lavaron de nuevo y se suspenden nuevamente en PBS. La fluorescencia celular se analizó, por ejemplo, mediante el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur o un lector KineticScan® HCS de Cellomics.

Ensayos de Eficacia Celular.

La eficacia de determinados macrociclos peptidomiméticos se determina, por ejemplo, en ensayos basados en destrucción de células mediante el uso de una diversidad de líneas celulares tumorigénicas y no tumorigénicas y células primarias derivadas de poblaciones de células humanas o de ratón. La viabilidad celular se controla, por ejemplo, durante más de 24-96 horas de incubación con macrociclos peptidomiméticos (0,5 a 50 jM ) para identificar los que destruyen a ECso<10 jM . Numerosos ensayos estándar que miden la viabilidad celular están disponibles comercialmente y se usan opcionalmente para evaluar la eficacia de los macrociclos peptidomiméticos. Además, los ensayos que miden Anexina V y la activación de caspasa se usan opcionalmente para evaluar si los macrociclos peptidomiméticos destruyen las células mediante la activación de la maquinaria apoptótica. Por ejemplo, se usa el ensayo Cell Titer-glo que determina la viabilidad celular en función de la concentración de ATP intracelular.

Ensayo de Estabilidad In Vivo.

Para investigar la estabilidad in vivo de los macrociclos peptidomiméticos, los compuestos se administraron, por ejemplo, a ratones y/o ratas por vía IV, IP, PO o inhalación en concentraciones que oscilan entre 0,1 y 50 mg/kg y las muestras de sangre se extrajeron a 0', 5', 15', 30', 1 hora, 4 horas, 8 horas y 24 horas después de la inyección. Después, se miden los niveles de compuesto intacto en 25 pl de suero fresco mediante LC-MS/MS como se indicó anteriormente.

Eficacia In Vivo en Modelos Animales.

Para determinar la actividad antioncogénica de macrociclos peptidomiméticos in vivo, los compuestos se administraron, por ejemplo, solos (IP, IV, PO, por inhalación o vías nasales) o en combinación con dosis subóptimas de quimioterapia relevante (por ejemplo, ciclofosfamida, doxorrubicina, etopósido). En un ejemplo, 5 x 106 células RS4;11 (establecidas a partir de la médula ósea de un paciente con leucemia linfoblástica aguda) que expresan de manera estable la luciferasa se inyectaron por la vena de la cola en ratones NOD-SCID 3 horas después de haberlos sometidos a tratamiento con irradiación corporal total. En este modelo, si no se trata, esta forma de leucemia es fatal en 3 semanas. La leucemia se monitorea fácilmente, por ejemplo, mediante la inyección a los ratones con D-luciferina (60 mg/kg) y se obtienen imágenes de los animales anestesiados (porejemplo, Sistema de Imágenes In Vivo Xenogen, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). La bioluminiscencia corporal total se cuantifica mediante la integración del flujo fotónico (fotones/seg) mediante el programa informático Living Image (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Los macrociclos peptidomiméticos solos o en combinación con dosis subóptimas de agentes quimioterapéuticos relevantes se administran, por ejemplo, a ratones leucémicos (10 días después de la inyección/día 1 del experimento, en un intervalo de bioluminiscencia de 14-16) por la vena de la cola o vía IP en dosis que varían desde 0,1 mg/kg a 50 mg/kg durante 7 a 21 días. Opcionalmente, se toman imágenes de los ratones a lo largo del experimento cada dos días y se monitorea la supervivencia diariamente durante la duración del experimento. Los ratones fallecidos opcionalmente se someten a una necropsia al final del experimento. Otro modelo animal es la implantación en ratones NOD-SCID de DoHH2, una línea celular derivada de linfoma folicular humano, que expresa luciferasa de manera estable. Estas pruebas in vivo opcionalmente generan datos farmacocinéticos, farmacodinámicos y toxicológicos preliminares.

Ensayos Clínicos.

Para determinar la idoneidad de los macrociclos peptidomiméticos para el tratamiento de seres humanos, se realizan ensayos clínicos. Por ejemplo, los pacientes diagnosticados con cáncer y que necesitan tratamiento pueden seleccionarse y separarse en grupos de tratamiento y uno o más grupos de control, en donde al grupo de tratamiento se le administra un macrociclo peptidomimético, mientras que los grupos de control reciben un placebo o un fármaco anticanceroso conocido. Por lo tanto, la seguridad y eficacia del tratamiento de los macrociclos peptidomiméticos pueden evaluarse mediante la realización de comparaciones de los grupos de pacientes con respecto a factores tales como supervivencia y calidad de vida. En este ejemplo, el grupo de pacientes tratado con un macrociclo peptidomimético puede mostrar una supervivencia a largo plazo mejorada en comparación con un grupo de pacientes control tratado con un placebo.

Composiciones Farmacéuticas y Vías de Administración

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción incluyen macrociclos peptidomiméticos y derivados o profármacos aceptables farmacéuticamente de estos. Un "derivado aceptable farmacéuticamente" significa cualquier sal, éster, sal de un éster, profármaco u otro derivado aceptable farmacéuticamente de un compuesto descrito en la presente descripción que, tras su administración a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto descrito en la presente descripción. Los derivados aceptables farmacéuticamente particularmente favorecidos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, mediante el aumento de la absorción en la sangre de un compuesto administrado por vía oral) o que aumentan la liberación del compuesto activo a un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) en relación con la especie parental. Algunos derivados aceptables farmacéuticamente incluyen un grupo químico que aumenta la solubilidad acuosa o el transporte activo a través de la mucosa gastrointestinal.

En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos se modifican mediante la unión covalentemente o no covalentemente de grupos funcionales apropiados para mejorar las propiedades biológicas selectivas. Tales modificaciones incluyen las que aumentan la penetración biológica en un compartimiento biológico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfático, sistema nervioso central), aumentan la disponibilidad oral, aumentan la solubilidad para permitir la administración mediante inyección, alteran el metabolismo, y alteran la tasa de excreción.

Las sales aceptables farmacéuticamente de los compuestos descritos en la presente descripción incluyen las derivadas de ácidos y bases, inorgánicos y orgánicos, aceptables farmacéuticamente. Los ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen acetato, adipato, benzoato, bencenosulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodohidrato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2- naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y undecanoato. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amonio y N-(alquil)4+

Para preparar composiciones farmacéuticas a partir de los compuestos descritos en la presente descripción, los vehículos aceptables farmacéuticamente incluyen vehículos sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios, y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias, que también actúan como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes desintegradores de comprimidos, o un material encapsulante. Los detalles sobre las técnicas de formulación y administración están bien descritos en la bibliografía científica y de patentes, ver, por ejemplo, la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA.

En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido, que está mezclado con el componente activo finamente dividido. En los comprimidos, el componente activo se mezcla con el vehículo que tiene las propiedades aglutinantes necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño convenientes.

Los excipientes sólidos adecuados son rellenos de carbohidratos o proteínas que incluyen, pero no se limitan a, azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa, u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas que incluyen arábica y tragacanto; así como también proteínas tales como gelatina y colágeno. Si es conveniente, se añaden agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal de estos, tal como alginato de sodio.

Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones de agua/propilenglicol. Para inyección parenteral, las preparaciones líquidas pueden formularse en solución en una solución acuosa de polietilenglicol.

La preparación farmacéutica puede estar en forma de dosificación unitaria. En tal forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, el envase contiene cantidades discretas de la preparación, tales como comprimidos, cápsulas, y polvos envasados en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, sello, o pastilla en sí misma, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma empaquetada.

Cuando una o más composiciones descritas en la presente descripción comprenden una combinación de un macrociclo peptidomimético y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deben estar presentes a niveles de dosificación de entre aproximadamente 1 a 100 %, y con mayor preferencia entre aproximadamente 5 a 95 % de la dosificación administrada normalmente en un régimen de monoterapia. En algunos casos, los agentes adicionales se administran por separado, como parte de un régimen de dosis múltiple, de uno o más compuestos descritos en la presente descripción. Alternativamente, esos agentes son parte de una forma de dosificación única, mezclados junto con los compuestos descritos en la presente descripción en una composición única.

Métodos de Uso

En un aspecto, en la presente descripción se describen macrociclos peptidomiméticos novedosos que son útiles en ensayos de unión competitiva para identificar agentes que se unen al ligando(s) natural(es) de las proteínas o péptidos sobre los que se modelan los macrociclos peptidomiméticos. Por ejemplo, en el sistema p53/MDMX, los macrociclos peptidomiméticos marcados basados en p53 pueden usarse en un ensayo de unión a MDMX junto con moléculas pequeñas que se unen competitivamente a MDMX. Los estudios de unión competitiva permiten una rápida evaluación in vitro y la determinación de candidatos a fármacos específicos para el sistema p53/MDMX. Tales estudios de unión pueden realizarse con cualquiera de los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente descripción y sus compañeros de unión.

Además, se describen métodos para la generación de anticuerpos contra los macrociclos peptidomiméticos. En algunos casos, estos anticuerpos se unen específicamente tanto al macrociclo peptidomimético como a los péptidos precursores, tales como p53, con los que están relacionados los macrociclos peptidomiméticos. Tales anticuerpos, por ejemplo, interrumpen la interacción proteína-proteína nativa, por ejemplo, la unión entre p53 y MDMX.

En otros aspectos, en la presente descripción se describen métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante (por ejemplo, insuficiente o excesiva) de las moléculas que incluyen p53, MDM2 o MDMX.

En otro caso, un trastorno es causado, al menos en parte, por un nivel anormal de p53 o MDM2 o MDMX, (por ejemplo, expresión excesiva o insuficiente), o por la presencia de p53 o MDM2 o MDMX que exhiben actividad anormal. Como tal, la reducción en el nivel y/o actividad de p53 o MDM2 o MDMX, o el incremento del nivel y/o actividad de p53 o MDM2 o MDMX, por macrociclos peptidomiméticos derivados de p53, se usa, por ejemplo, para mejorar o reducir los síntomas adversos del trastorno.

En otro aspecto, en la presente descripción se describen métodos para tratar o prevenir una enfermedad que incluye enfermedad hiperproliferativa y trastorno inflamatorio mediante la interferencia con la interacción o unión entre compañeros de unión, por ejemplo, entre p53 y MDM2 o p53 y MDMX. Estos métodos comprenden administrar una cantidad eficaz de un compuesto a un animal de sangre caliente, que incluye un ser humano. En algunos casos, la administración de uno o más compuestos descritos en la presente descripción induce la detención del crecimiento celular o la apoptosis.

Como se usa en la presente descripción, el término "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición a una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, mitigar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, beneficiar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.

En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos pueden usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar cánceres y afecciones neoplásicas. Como se usa en la presente descripción, los términos "cáncer", "hiperproliferativo" y "neoplásico" se refieren a células que tienen la capacidad de crecimiento autónomo, es decir, un estado o afección anormal caracterizado por un crecimiento celular que prolifera rápidamente. Los estados de enfermedad hiperproliferativos y neoplásicos pueden clasificarse como patológicos, es decir, que caracterizan o constituyen un estado de enfermedad, o pueden categorizarse como no patológicos, es decir, una desviación de lo normal pero no asociado con un estado de enfermedad. El término pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados de forma maligna, independientemente del tipo histopatológico o de la etapa de invasividad. Un tumor metastásico puede surgir a partir de una multitud de tipos de tumores primarios, que incluye, pero no se limita a, los de origen de mama, pulmón, hígado, colon y ovario. Las células "patológicas hiperproliferativas" se producen en estados de enfermedad caracterizados por el crecimiento de tumores malignos. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociadas con la reparación de heridas. Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, o trastornos metastásicos. En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos son agentes terapéuticos novedosos para controlar el cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de pulmón, metástasis de tales cánceres y similares.

Los ejemplos de cánceres o afecciones neoplásicas incluyen, pero no se limitan a, fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de recto, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de cerebro, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, o sarcoma de Kaposi.

En algunos casos, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de mama, o glioma.

Los ejemplos de trastornos proliferativos incluyen trastornos neoplásicos hematopoyéticos. Como se usa en la presente descripción, el término "trastornos neoplásicos hematopoyéticos" incluye enfermedades que involucran células hiperplásicas/neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, que surgen de linajes mieloides, linfoides o eritroides, o células precursoras de estas. Las enfermedades pueden surgir de leucemias agudas poco diferenciadas, por ejemplo, leucemia eritroblástica y leucemia megacarioblástica aguda. Los trastornos mieloides ilustrativos adicionales incluyen, pero no se limitan a, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia mielógena crónica (CML) (revisado en Vaickus (1991), Crit Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97); las neoplasias linfoides incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda (ALL) que incluye ALL de linaje B y ALL de linaje T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM). Las formas adicionales de linfomas malignos incluyen, pero no se limitan a, linfoma no Hodgkin y variantes de este, linfomas periféricos de células T, leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), linfoma cutáneo de células T (CTCL), leucemia linfocítica granular grande (LGF), Enfermedad de Hodgkin y enfermedad de Reed-Stemberg.

Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación de la mama incluyen, pero no se limitan a, enfermedad mamaria proliferativa que incluye, por ejemplo, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante, y papilomas de conductos pequeños; tumores, por ejemplo, tumores estromales tales como fibroadenoma, tumor filoides, y sarcomas, y tumores epiteliales tales como papiloma de conductos grandes; carcinoma de mama, que incluye el carcinoma in situ (no invasivo) que incluye el carcinoma ductal in situ (que incluye la enfermedad de Paget) y el carcinoma lobulillar in situ, y el carcinoma invasivo (infiltrante) que incluye, pero no se limita a, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma medular, carcinoma coloide (mucinoso), carcinoma tubular, y carcinoma papilar invasivo, y neoplasias malignas diversas. Los trastornos en la mama masculina incluyen, pero no se limitan a, ginecomastia y carcinoma.

Los exámenes de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación de la piel incluyen, pero no se limitan a, enfermedades proliferativas de la piel tales como melanomas, que incluyen melanoma mucoso, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, léntigo (por ejemplo, léntigo maligno, melanoma léntigo maligno o melanoma lentiginoso acral), melanoma amelanótico, melanoma desmoplásico, melanoma con características de un nevo de Spitz, melanoma con células pequeñas similares a nevo, melanoma polipoide, y melanoma de tejidos blandos; carcinomas basocelulares que incluyen carcinoma basocelular micronodular, carcinoma basocelular superficial, carcinoma basocelular nodular (úlcera de roedor), carcinoma basocelular quístico, carcinoma basocelular cicatricial, carcinoma basocelular pigmentado, carcinoma basocelular aberrante, carcinoma basocelular infiltrativo, síndrome de carcinoma basocelular nevoide, carcinoma basocelular polipoide, carcinoma basocelular en forma de poro, y fibroepitelioma de Pinkus; carcinomas de células escamosas que incluyen acantoma (acantoma de células grandes), carcinoma de células escamosas adenoides, carcinoma de células escamosas basaloides, carcinoma de células escamosas de células claras, carcinoma de células escamosas de células en anillo de sello, carcinoma de células escamosas de células fusiformes, úlcera de Marjolin, eritroplasia de Queyrat, y enfermedad de Bowen; u otros tumores cutáneos o subcutáneos.

Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación del pulmón incluyen, pero no se limitan a, carcinoma broncogénico, que incluye los síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores diversos, y tumores metastásicos; patologías de la pleura, que incluye derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, neumotórax, y tumores pleurales, que incluyen tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.

Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación del colon incluyen, pero no se limitan a, pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorrectal, carcinoma colorrectal, y tumores carcinoides.

Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación del hígado incluyen, pero no se limitan a, hiperplasias nodulares, adenomas, y tumores malignos, que incluyen el carcinoma primario del hígado y tumores metastásicos.

Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o de diferenciación del ovario incluyen, pero no se limitan a, tumores de ovario tales como tumores del epitelio celómico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores endometrioides, adenocarcinoma de células claras, cistoadenofibroma, tumor de Brenner, tumores epiteliales superficiales, tumores de células germinales tales como teratomas maduros (benignos), teratomas monodérmicos, teratomas malignos inmaduros, disgerminoma, tumor del seno endodérmico, coriocarcinoma; tumores del estoma del cordón sexual tales como tumores de células de teca-granulosa, tecomafibromas, androblastomas, tumores de células de colina, y gonadoblastoma; y tumores metastásicos tales como los tumores de Krukenberg.

Aunque se han mostrado y descrito en la presente descripción casos preferidos de la presente invención, será obvio para los expertos en la técnica que tales casos se describen únicamente a modo de ejemplo. A los expertos en la técnica se les ocurrirán ahora numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse varias alternativas a los casos descritos en la presente descripción al poner en práctica la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos por ellos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis de aminoácidos 6-clorotriptófano Fmoc

Terc-butil 6-cloro-3-formil-1H-indol-1-carboxilato, 1. A una solución agitada de DMF seca (12 mL) se le añadió gota a gota POCla (3,92 mL, 43 mmol, 1,3 equiv) a 0 °C bajo Argón. La solución se agitó a la misma temperatura durante 20 minutos antes de añadir gota a gota una solución de 6-cloroindol (5,0 g, 33 mmol, 1 eq.) en DMF anhidro (30 mL). La mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 2,5 horas adicionales. Se añadió agua (50 mL) y la solución se neutralizó con NaOH acuoso 4 M (pH ~ 8). El sólido resultante se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío. Este material se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. A una solución agitada del formil indol crudo (33 mmol, 1 eq.) en THF (150 mL) se le añadió sucesivamente Boc2O (7,91 g, 36,3 mmol, 1,1 equiv) y DMAP (0,4 g, 3,3 mmol, 0,1 equiv) a temperatura ambiente bajo N2. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas y el disolvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se recolectó en EtOAc y se lavó con HCl 1N, se secó y se concentró para dar el formil indol 1 (9 g, 98 % en 2 etapas) como un sólido blanco. 1H NMR (CDCla) ó: 1,70 (s, Boc, 9H); 7,35 (dd, 1H); 8,21 (m, 3H); 10,07 (s, 1H).

Terc-butil 6-cloro-3-(hidroximetil)-1H-indol-1-carboxilato, 2. A una solución del compuesto 1 (8,86 g, 32 mmol, 1 eq.) en etanol (150 mL) se le añadió NaBH4 (2,4 g, 63 mmol, 2 eq.). La reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se vertió en éter dietílico y agua. La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró para dar un sólido blanco (8,7 g, 98 %). Este material se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. * 1H NMR (CDCh) ó: 1,65 (s, Boc, 9H); 4,80 (s, 2H, CH2); 7,21 (dd, 1H); 7,53 (m, 2H); 8,16 (bs, 1H).

Terc-butil 3-(bromometil)-6-cloro-1H-indol-1-carboxilato, 3. A una solución del compuesto 2 (4,1 g, 14,6 mmol, 1 eq.) en diclorometano (50 mL) bajo argón se le añadió una solución de trifenilfosfina (4,59 g, 17,5 mmol, 1,2 eq.) en diclorometano (50 mL) a -40 °C. La solución de reacción se agitó durante 30 minutos adicionales a 40 °C. Después se añadió NBS (3,38 g, 19 mmol, 1,3 eq.). La mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se evaporó el diclorometano, se añadió Tetracloruro de Carbono (100 mL) y la mezcla se agitó durante 1 hora y se filtró. El filtrado se concentró, se cargó en un tapón de sílice y se eluyó rápidamente con EtOAc al 25 % en Hexanos. La solución se concentró para dar una espuma blanca (3,84 g, 77 %). 1H NMR (CDCh) ó: 1,66 (s, Boc, 9H); 4,63 (s, 2H, CH2); 7,28 (dd, 1H); 7,57 (d, 1H); 7,64 (bs, 1H); 8,18 (bs, 1H).

aMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4. A S-Ala-Ni-S-BPB (2,66 g, 5,2 mmol, 1 eq.) y KO-Bu (0,87 g, 7,8 mmol, 1,5 eq.) se le añadieron 50 mL de DMF bajo argón. El compuesto derivado de bromuro 3 (2,68 g, 7,8 mmol, 1,5 eq.) en solución de DMF (5,0 mL) se añadió mediante una jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, la solución se inactivó con ácido acético acuoso al 5 % y se diluyó con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, se secó y se concentró. El producto aceitoso 4 se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (carga de sólidos) en fase normal mediante el uso de EtOAc y Hexanos como eluyentes para dar un sólido rojo (1,78 g, rendimiento del 45 %). aMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4 : M+H calc. 775,21, M+H obs. 775,26; 1H NMR (CDCh) ó: 1,23 (s, 3H, aMe); 1,56 (m, 11H, Boc CH2); 1,82-2,20 (m, 4H, 2 CH2); 3,03 (m, 1H, CH^a); 3,24 (m, 2H, CH2); 3,57 y 4,29 (sistema AB, 2H, CH2 (bencilo), J= 12,8Hz); 6,62 (d, 2H); 6,98 (d, 1H); 7,14 (m, 2H); 7,23 (m, 1H); 7,32-7,36 (m, 5H); 7,50 (m, 2H); 7,67 (bs, 1H); 7,98 (d, 2H); 8,27 (m, 2H).

Fmoc-aMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6. A una solución de HCl 3N/MeOH (1/3, 15 mL) a 50 °C se añadió una solución del compuesto 4 (1,75 g, 2,3 mmol, 1 eq.) gota a gota, en MeOH (5 mL). El material de partida desapareció en 3-4 horas. Después, la solución ácida se enfrió a 0 °C con un baño de hielo y se inactivó con una solución acuosa de Na2CO3 (1,21 g, 11,5 mmol, 5 eq.). Se eliminó el metanol y a la suspensión se añadieron 8 equivalentes más de Na2CO3 (1,95 g, 18,4 mmol). Después se añadió la sal dihidrato disódica de EDTA depuradora de níquel (1,68 g, 4,5 mmol, 2 eq.) y la suspensión se agitó durante 2 horas. Se añadió una solución de Fmoc-OSu (0,84 g, 2,5 mmol, 1,1 eq.) en acetona (50 mL) y la reacción se agitó durante la noche. Posteriormente, la reacción se diluyó con éter dietílico y HCl 1N. Después, la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío. El producto deseado 6 se purificó en fase normal mediante el uso de acetona y diclorometano como eluyentes para dar una espuma blanca (0,9 g, rendimiento del 70 %). Fmoc-aMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6: M+H calc. 575,19, M+H obs. 575,37; 1H NMR (CDCh) 1,59 (s, 9H, Boc); 1,68 (s, 3H, Me); 3,48 (bs, 2H, CH2); 4,22 (m, 1H, CH); 4,39 (bs, 2H, CH2); 5,47 (s, 1H, NH); 7,10 (m, 1H); 7,18 (m, 2H); 7,27 (m, 2H); 7,39 (m, 2H); 7,50 (m, 2H); 7,75 (d, 2H); 8,12 (bs, 1H).

6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5. A Gly-Ni-S-BPB (4,6 g, 9,2 mmol, 1 eq.) y KO-tBu (1,14 g, 10,1 mmol, 1,1 eq.) se le añadieron 95 mL de DMF bajo argón. El compuesto derivado de bromuro 3 (3,5 g, 4,6 mmol, 1,1 eq.) en solución de DMF (10 mL) se añadió mediante una jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, la solución se inactivó con ácido acético acuoso al 5 % y se diluyó con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, se secó y se concentró. El producto aceitoso 5 se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (carga de sólidos) en fase normal mediante el uso de EtOAc y Hexanos como eluyentes para dar un sólido rojo (5 g, rendimiento del 71 %). 6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5: M+H calc. 761,20, M+H obs. 761,34; 1H NMR (CDCh) ó: 1,58 (m, 11H, Boc CH2); 1,84 (m, 1H); 1,96 (m, 1H); 2,24 (m, 2H, CH2); 3,00 (m, 1H, CH^a); 3,22 (m, 2H, CH2); 3,45 y 4,25 (sistema AB, 2H, CH2 (bencil), J= 12,8Hz); 4,27 (m, 1H, CH^a); 6,65 (d, 2H); 6,88 (d, 1H); 7,07 (m, 2H); 7,14 (m, 2H); 7,28 (m, 3H); 7,35-7,39 (m, 2H); 7,52 (m, 2H); 7,96 (d, 2H); 8,28 (m, 2H).

Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7. A una solución de HCl 3N/MeOH (1/3, 44 mL) a 50 °C se añadió una solución del compuesto 5 (5 g, 6,6 mmol, 1 eq.) gota a gota, en MeOH (10 mL). El material de partida desapareció en 3-4 horas. Después, la solución ácida se enfrió a 0 °C con un baño de hielo y se inactivó con una solución acuosa de Na2CO3 (3,48 g, 33 mmol, 5 eq.). Se eliminó el metanol y a la suspensión se añadieron 8 equivalentes más de Na2CO3 (5,57 g, 52 mmol). La sal dihidrato disódica de EDTA depuradora de níquel (4,89 g, 13,1 mmol, 2 eq.) y la suspensión se agitaron durante 2 horas. Se añadió una solución de Fmoc-OSu (2,21 g, 6,55 mmol, 1,1 eq.) en acetona (100 mL) y la reacción se agitó durante la noche. Posteriormente, la reacción se diluyó con éter dietílico y HCl 1N. Después, la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío. El producto deseado 7 se purificó en fase normal mediante el uso de acetona y diclorometano como eluyentes para dar una espuma blanca (2,6 g, rendimiento del 69 %). Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7: M+H calc. 561,17, M+H obs. 561,37; 1H NMR (CDCh) 1,63 (s, 9H, Boc); 3,26 (m, 2H, CH2); 4,19 (m, 1H, CH); 4,39 (m, 2H, CH2); 4,76 (m, 1H); 5,35 (d, 1H, NH); 7,18 (m, 2H); 7,28 (m, 2H); 7,39 (m, 3H); 7,50 (m, 2H); 7,75 (d, 2H); 8,14 (bs, 1H).

Ejemplo 2: macrociclos peptidomiméticos

Se sintetizaron, purificaron y analizaron macrociclos peptidomiméticos como se describió previamente y como se describe más abajo (Schafmeister y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky y otros, Science 305:1466-1470 (2004); y la patente de los EE.UU. núm.

7,192,713). Los macrociclos peptidomiméticos se diseñaron mediante el reemplazo de dos o más aminoácidos de origen natural con los correspondientes aminoácidos sintéticos. Se realizaron sustituciones en las posiciones i e i+4, e i e i+7. La síntesis de péptidos se realizó manualmente o en un sintetizador de péptidos automático (Applied Biosystems, modelo 433A), mediante el uso de condiciones de fase sólida, resina AM de amida de pista (Novabiochem) y química del grupo protector de la cadena principal Fmoc. Para el acoplamiento de aminoácidos naturales protegidos con Fmoc (Novabiochem), se emplearon 10 equivalentes de aminoácido y una relación molar 1:1:2 de reactivos de acoplamiento HBTU/HOBt (Novabiochem)/DÉA. Se acoplaron aminoácidos no naturales (4 equiv.) con una relación molar 1:1:2 de HATU (Applied Biosystems)/HOBt/DIEA. Los extremos N terminales de los péptidos sintéticos se acetilaron, mientras que los extremos C terminales se amidaron.

La purificación de compuestos reticulados se logró mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Varian ProStar) en una columna C18 de fase inversa (Varian) para producir los compuestos puros. La composición química de los productos puros se confirmó mediante espectrometría de masas LC/MS (Micromass LCT en interfaz con el sistema de HPLC Agilent 1100) y análisis de aminoácidos (Applied Biosystems, modelo 420A).

El siguiente protocolo se usó en la síntesis de macrociclos peptidomiméticos reticulados con dialquino, que incluye SP662, SP663 y SP664. Se sintetizaron péptidos unidos a resina totalmente protegidos en una resina PEG-PS (cargando 0,45 mmol/g) en una escala de 0,2 mmol. La desprotección del grupo Fmoc temporal se logró por tratamientos de 10 minutos 3 x del péptido unido a resina con piperidina al 20 % (v/v) en DMF. Después de lavar con NMP (3x), diclorometano (3x) y NMP (3x), se logró el acoplamiento de cada aminoácido sucesivo con incubación 1 x 60 minutos con el derivado de aminoácido Fmoc preactivado apropiado. Todos los aminoácidos protegidos (0,4 mmol) se disolvieron en NMP y se activaron con HCTU (0,4 mmol) y DIEA (0,8 mmol) antes de transferir la solución de acoplamiento al péptido desprotegido unido a resina. Después del acoplamiento, se lavó la resina en preparación para el siguiente ciclo de desprotección/acoplamiento. La acetilación del extremo amino se realizó en presencia de acético anhídrido/DIEA en NMP. El análisis LC-MS de una muestra escindida y desprotegida que se obtiene de una alícuota del péptido unido a resina completamente ensamblado se realizó para verificar la finalización de cada acoplamiento. En un ejemplo típico, se añadieron tetrahidrofurano (4 mL) y trietilamina (2 mL) a la resina peptídica (0,2 mmol) en un vial de vidrio de 40 mL y se agitó durante 10 minutos. Después, se añadieron Pd(PPh3)2Cl2 (0,014 g, 0,02 mmol) y yoduro de cobre (0,008 g, 0,04 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó mecánicamente durante 16 horas mientras estaba abierta a la atmósfera. Los péptidos unidos a resina ciclados con diino se desprotegieron y se escindieron del soporte sólido mediante tratamiento con TFA/H2O/TIS (95/5/5 v/v) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Después de filtrar la resina, se precipitó la solución de TFA en éter dietílico frío y se centrifugó para producir el producto deseado como un sólido. El producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa.

El siguiente protocolo se usó en la síntesis de macrociclos peptidomiméticos reticulados con alquino único, que incluye SP665. Se sintetizaron péptidos unidos a resina completamente protegidos en una resina Rink amida MBHA (carga 0,62 mmol/g) en una escala de 0,1 mmol. La desprotección del grupo Fmoc temporal se logró por tratamientos de 20 minutos 2 x del péptido unido a resina con piperidina al 25 % (v/v) en NMP. Después de un lavado de flujo extenso con NMP y diclorometano, se logró el acoplamiento de cada aminoácido sucesivo con incubación 1 x 60 minutos con el derivado de aminoácido Fmoc preactivado apropiado. Todos los aminoácidos protegidos (1 mmol) se disolvieron en NMP y se activaron con HCTU (1 mmol) y DIEa (1 mmol) antes de transferir la solución de acoplamiento al péptido desprotegido unido a resina. Después de completar el acoplamiento, la resina se lavó abundantemente en flujo en preparación para el siguiente ciclo de desprotección/acoplamiento. La acetilación del extremo amino se realizó en presencia de acético anhídrido/DIEA en NMP /NMM. El análisis LC-MS de una muestra escindida y desprotegida que se obtiene de una alícuota del péptido unido a resina completamente ensamblado se realizó para verificar la finalización de cada acoplamiento. En un ejemplo típico, la resina peptídica (0,1 mmol) se lavó con DCM. La resina se cargó en un vial de microondas. El recipiente se evacuó y se purgó con nitrógeno. Se añadió molibdenohexacarbonilo (0,01 eq, Sigma Aldrich 199959). Se añadió clorobenceno anhidro al recipiente de reacción. Después, se añadió 2-fluorofenol (1 eq, Sigma Aldrich F12804). Después, la reacción se cargó en el microondas y se mantuvo a 130 °C durante 10 minutos. Es posible que sea necesario presionar la reacción un tiempo posterior para que se complete. Los péptidos unidos a resina metatizados con alquino se desprotegieron y se escindieron del soporte sólido mediante tratamiento con TFA/H2O/TIS (94/3/3 v/v) durante 3 horas a temperatura ambiente. Después de filtrar la resina, se precipitó la solución de TFA en éter dietílico frío y se centrifugó para producir el producto deseado como un sólido. El producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa.

La Tabla 1 muestra una lista de macrociclos peptidomiméticos preparados.

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_____ La Tabla 1a muestra una selección de macrociclos peptidomiméticos.

_ La Tabla 1b muestra una selección adicional de macrociclos peptidomiméticos.

Tabla 1b

En las secuencias mostradas anteriormente y en otras partes, se usan las siguientes abreviaturas: "Nle" representa norleucina, "Aib" representa ácido 2-aminoisobutírico, "Ac" representa acetilo, y "Pr" representa propionilo. Los aminoácidos representados como "$" son aminoácidos de olefina alfa-Me S5-pentenil-alanina conectados por un reticulante totalmente de carbono que comprende un doble enlace. Los aminoácidos representados como "$r5" son aminoácidos de olefina alfa-Me R5-pentenil-alanina conectados por un carbono que comprende un doble enlace. Los aminoácidos representados como "$s8" son aminoácidos de olefina alfa-Me S8-octenil-alanina conectados por un reticulante totalmente de carbono que comprende un doble enlace. Los aminoácidos representados como "$r8" son aminoácidos de olefina alfa-Me R8-octenil-alanina conectados por un reticulante totalmente de carbono que comprende un doble enlace. "Ahx" representa un enlazador de aminociclohexilo. Los reticulantes son reticulantes lineales totalmente de carbono que comprenden ocho u once átomos de carbono entre los carbonos alfa de cada aminoácido. Los aminoácidos representados como "$/" son aminoácidos de olefina alfa-Me S5-pentenil-alanina que no están conectados por ningún reticulante. Los aminoácidos representados como "$/r5" son aminoácidos de olefina alfa-Me R5-pentenil-alanina que no están conectados por ningún reticulante. Los aminoácidos representados como "$/s8" son aminoácidos de olefina alfa-Me S8-octenil-alanina que no están conectados por ningún reticulante. Los aminoácidos representados como "$/r8" son aminoácidos de olefina alfa-Me R8-octenil-alanina que no están conectados por ningún reticulante. Los aminoácidos representados como "Amw" son aminoácidos triptófano alfa-Me. Los aminoácidos representados como "Aml" son aminoácidos leucina alfa-Me. Los aminoácidos representados como "Amf' son aminoácidos alfa-Me fenilalanina. Los aminoácidos representados como "2ff' son aminoácidos 2-fluorofenilalanina. Los aminoácidos representados como "3ff' son aminoácidos 3-fluoro-fenilalanina. Los aminoácidos representados como "St" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de olefina de pentenil-alanina, cada una de las cuales está reticulada con otro aminoácido como se indica. Los aminoácidos representados como "St//' son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de olefina de pentenil-alanina que no están reticuladas. Los aminoácidos representados como "%St" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de olefina de pentenil-alanina, cada una de las cuales está reticulada con otro aminoácido como se indica mediante reticulaciones de hidrocarbonadas completamente saturados. Los aminoácidos representados como "Ba" son beta-alanina. El carácter en minúscula "e" o "z" dentro de la designación de un aminoácido reticulado (por ejemplo, "$er8" o "$zr8") representa la configuración del doble enlace (E o Z, respectivamente). En otros contextos, letras minúsculas como "a" o "f" representan D aminoácidos (por ejemplo, D-alanina, o D-fenilalanina, respectivamente). Los aminoácidos designados como "NmW" representan N-metiltriptófano. Los aminoácidos designados como "NmY" representan N-metiltirosina. Los aminoácidos designados como "NmA" representan N-metilalanina. "Kbio" representa un grupo biotina unido al grupo amino de la cadena lateral de un residuo de lisina. Los aminoácidos designados como "Sar" representan sarcosina. Los aminoácidos designados como "Cha" representan ciclohexilalanina. Los aminoácidos designados como "Cpg" representan ciclopentilglicina. Los aminoácidos designados como "Chg" representan ciclohexil glicina. Los aminoácidos designados como "Cba" representan ciclobutil alanina. Los aminoácidos designados como "F4I" representan 4-yodo fenilalanina. "7L" representa leucina isotópica N15. Los aminoácidos designados como "F3Cl" representan 3-cloro fenilalanina. Los aminoácidos designados como "F4cooh" representan 4-carboxifenilalanina. Los aminoácidos designados como "F34F2" representan 3,4-difluorofenilalanina. Los aminoácidos designados como "6clW" representan 6-cloro triptófano. Los aminoácidos designados como "$rda6" representan alfa-Me R6-hexinilalanina alquinil aminoácidos, reticulados mediante un enlace dialquino a un segundo alquinil aminoácido. Los aminoácidos designados como "$da5" representan alfa-Me S5-pentinil-alanina alquinil aminoácidos, en donde el alquino forma la mitad de un enlace dialquino con un segundo alquinil aminoácido. Los aminoácidos designados como "$ra9" representan alfa-Me R9-noninil-alanina alquinil aminoácidos, reticulados mediante una reacción de metátesis de alquino con un segundo alquinil aminoácido. Los aminoácidos designados como "$a6" representan alfa-Me S6-hexinil-alanina alquinil aminoácidos, reticulados mediante una reacción de metátesis de alquino con un segundo alquinil aminoácido. La designación "iso1" o "iso2" indica que el macrociclo peptidomimético es un isómero único.

Los aminoácidos designados como "Cit" representan citrulina. Los aminoácidos designados como "Cou4", "Cou6", "Cou7" y "Cou8", respectivamente, representan las siguientes estructuras:

En algunos casos, se obtiene un macrociclo peptidomimético en más de un isómero, por ejemplo, debido a la configuración de un doble enlace dentro de la estructura del reticulante (E vs Z). Tales isómeros pueden separarse o no mediante métodos cromatográficos convencionales. En algunos casos, un isómero tiene propiedades biológicas mejoradas con respecto al otro isómero. En un caso, un isómero de olefina reticulante E de un macrociclo peptidomimético tiene mejor solubilidad, mejor afinidad por la diana, mejor eficacia in vivo o in vitro, mayor helicidad, o permeabilidad celular mejorada en relación con su contraparte Z. En otro caso, un isómero de olefina reticulante Z de un macrociclo peptidomimético tiene mejor solubilidad, mejor afinidad por la diana, mejor eficacia in vivo o in vitro, mayor helicidad, o permeabilidad celular mejorada en relación con su contraparte E.

La Tabla 1c muestra un macrociclo peptidomimético ilustrativo:

Ċ

Tabla 1c

continuación

continuación

continuación

En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos excluyen los macrociclos peptidomiméticos que se muestran en la Tabla 2a:

Tabla 2a

En la Tabla 2a, X representa S o cualquier aminoácido. Los péptidos mostrados pueden comprender un grupo protector N-terminal tal como acetilo o un enlazador adicional tal como beta-alanina entre el grupo protector y el comienzo de la secuencia peptídica.

En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos no comprenden una estructura de macrociclo peptidomimético como se muestra en la Tabla 2a.

En otros casos, los macrociclos peptidomiméticos excluyen los macrociclos peptidomiméticos que se muestran en la Tabla 2b:

Tabla 2b

co n tin u a c ió n

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continuación

En algunos casos, los macrociclos apeptidomiméticos descritos en la presente descripción no comprenden una estructura de macrociclo peptidomimético como se muestra en la Tabla 2b.

La Tabla 2c muestra ejemplos de polipéptidos no reticulados que comprenden D-aminoácidos.

Ejemplo 3: cocristalografía de rayos X de macrociclos peptidomiméticos en complejo con MDMX

Para la cocristalización con el péptido 46 (Tabla 2b), se añadió una cantidad estequiométrica de compuesto de una solución madre 100 mM en DMSO a la solución de proteína MDMX de pez cebra y se dejó reposar durante la noche a 4 °C antes de preparar los experimentos de cristalización. Los procedimientos fueron similares a los descritos por Popowicz y otros, con algunas variaciones, como se indica más abajo. La proteína (residuos 15-129, L46V/V95L) se obtuvo de un sistema de expresión de E. coli BL21(DE3) mediante el uso del vector pET15b. Las células se cultivaron a 37 °C y se indujeron con IPTG 1 mM a una OD⁶⁰⁰de 0,7. Se permitió que las células crecieran durante 18 horas adicionales a 23 °C. La proteína se purificó mediante el uso de Ni-NT Agarosa seguido de Superdex 75 tamponado con NaPO⁴50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, TCEP 2 mM y después se concentró a 24 mg/mL. Para los experimentos de cristalización el tampón se cambió a Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, DTT 2 mM. Los cristales iniciales se obtuvieron con la pantalla AMS #94 de Nextal (Qiagen) y el depósito optimizado final fue AMS 2,6 M, Hepes 75 mM, pH 7,5. Los cristales crecieron de forma rutinaria como placas delgadas a 4 °C y se crioprotegieron mediante su paso a través de una solución que contenía malonato concentrado (3,4 M) seguido de enfriamiento rápido, almacenamiento, y envío en nitrógeno líquido.

La recolección de datos se realizó en el APS en la línea de luz 31-ID (SGX-CAT) a 100 °K y una longitud de onda de 0,97929 A. La línea de luz estaba equipada con un detector Rayonix 225-HE. Para la recolección de datos, los cristales se rotaron 180° en incrementos de 1° mediante el uso de tiempos de exposición de 0,8 segundos. Los datos se procesaron y redujeron mediante el uso de Mosflm/scala (CCP4; ver The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallogr. D50, 760-763 (1994); P.R. Evans. Joint CCP4 y ESF-EACBM Newsletter 33, 22-24 (1997)) en grupo espacial C2 (unidad de celda: a = 109,2786, b = 81,0836, c = 30,9058A, a = 90, p = 89,8577, y = 90°). El reemplazo molecular con el programa Molrep (CCP4; ver A.Vagin & A. Teplyakov. J. Appl. Cryst. 30, 1022 1025 (1997)) se realizó con el componente MDMX de la estructura determinada por Popowicz y otros, (2Z5S; ver G.M. Popowicz, A. Czarna, U. Rothweiler, A. Szwagierczak, M. Krajewski, L. Weber & T.A. Holak. Cell Cycle 6, 2386-2392 (2007)) e identificó dos moléculas en la unidad asimétrica. Refinamiento inicial de solo las dos moléculas del pez cebra MDMX con el programa Refmac (CCP4; ver G.N. Murshudov, A.A. Vagin & E.J. Dodson. Acta Crystallogr. D53, 240 255 (1997)) resultó en un factor R de 0,3424 (R ^{l ibre}= 0,3712) y valores rmsd para enlaces (0,018 A) y ángulos (1,698°). La densidad de electrones para los componentes peptídicos grapados, comenzando con Gln¹⁹e incluyendo toda la grapa alifática, fue muy clara. Un mayor refinamiento con CNX (Accelrys) mediante el uso de los datos a una resolución de 2,3 A resultó en un modelo (compuesto por 1448 átomos de MDMX, 272 átomos de los péptidos grapados y 46 moléculas de agua) que está bien refinado (R^f= 0,2601, R^{l ibre}= 0,3162, enlaces rmsd = 0,007 A y ángulos rmsd = 0,916°).

Los resultados de este ejemplo se muestran en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo 4: Análisis de dicroísmo circular (CD) de alfa-helicidad

Las soluciones de péptidos se analizaron por espectroscopía de CD mediante el uso de un espectropolarímetro Jasco J-815 (Jasco Inc., Easton, MD) con el programa informático del sistema Jasco Spectra Manager Ver.2. Se usó un controlador de temperatura Peltier para mantener el control de temperatura de la celda óptica. Los resultados se expresan como elipticidad molar media [0] (grados cm2 dmol-1) como se calcula a partir de la ecuación [0]=0obsMRW/1O*1*c donde 0obs es la elipticidad observada en milisegundos, MRW es el peso medio del residuo del péptido (peso molecular del péptido/número de residuos), l es la longitud de la trayectoria óptica de la celda en centímetros, y c es la concentración de péptido en mg/mL. Las concentraciones de péptidos se determinaron mediante análisis de aminoácidos. Se prepararon soluciones madre de péptidos en tampón CD benigno (ácido fosfórico 20 mM, pH 2). Las soluciones madres se usaron para preparar soluciones de péptidos de 0,05 mg/mL en tampón CD benigno o en tampón CD con trifluoroetanol (TFE) al 50 % para análisis en una celda de 10 mm de longitud de trayectoria. Se escanearon medidas de longitud de onda variable de soluciones de péptidos a 4 °C desde 195 a 250 nm, en incrementos de 0,2 nm, y una velocidad de escaneo de 50 nm por minuto. Se informó el promedio de seis escáneres.

La Tabla 3 muestra los datos de dicroísmo circular para macrociclos peptidomiméticos seleccionados:

Tabla 3

Ejemplo 5: ensayo de unión directa a MDM2 con polarización de Fluorescencia (FP)

El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir MDM2 (del laboratorio, 41 kD) en tampón FP (tampón con alto contenido de sal - NaCl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7,5) para obtener una solución madre de trabajo 10 pM.

2. Añadir 30 pl de solución madre de proteína 10 pM en los pocillos A1 y B1 de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices).

3. Llenar con 30 pl de tampón FP en la columna A2 a A12, B2 a B12, C1 a C12, y D1 a D12.

4. Diluir en serie de 2 o 3 veces de la solución madre de proteína de A1, B1 en A2, B2; A2, B2 a A3, B3; ... para alcanzar la concentración nM de un solo dígito en el último punto de dilución.

5. Diluir 1 mM (en DMSO al 100 %) de péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 pM (dilución 1:10). Después, diluir desde 100 pM hasta 10 pM con agua (dilución 1:10) y después diluir con tampón FP desde 10 pM hasta 40 nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que tendrá una concentración de 10 nM en el pocillo (dilución 1:4). Mantener en la oscuridad el péptido diluido marcado con FAM hasta su uso.

6. Añadir 10 pl de péptido marcado con FAM 10 nM en cada pocillo, incubar, y leer en diferentes momentos. Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH²es ~13,38 nM.

Ejemplo 6: Ensayo de polarización de Fluorescencia competitiva para MDM2

El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir MDM2 (del laboratorio, 41 kD) en tampón FP (tampón con alto contenido de sal- NaCl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7,5) para hacer una solución madre de trabajo 84 nM (2X).

2. Añadir 20 pl de la solución madre de proteína 84 nM (2X) en cada pocillo de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices)

3. Diluir 1 mM (en DMSO al 100 %) de péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 pM (dilución 1:10). Después, diluir desde 100 pM hasta 10 pM con agua (dilución 1:10) y después diluir con tampón FP desde 10 pM hasta 40 nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que tendrá una concentración de 10 nM en el pocillo (dilución 1:4). Mantener en la oscuridad el péptido diluido marcado con FAM hasta su uso.

4. Preparar una placa de dosis del péptido sin marcar con tampón FP comenzando con 1 pM (final) de péptido y haciendo diluciones en serie de 5 veces para 6 puntos mediante el uso del siguiente esquema de dilución.

Diluir 10 mM (en DMSO al 100 %) con Dm SO hasta 5 mM (dilución 1:2). Después, diluir desde 5 mM hasta 500 pM con H²O (dilución 1:10) y después diluir con tampón FP desde 500 pM hasta 20 pM (dilución 1:25). Hacer 5 diluciones en serie de 5 veces de 4 pM (4X) para 6 puntos.

5. Transferir 10 pl de péptidos no marcados diluidos en serie a cada pocillo que se llenó con 20 pl de proteína 84 nM.

6. Añadir 10 pl de péptido marcado con FAM de 10 nM (4X) en cada pocillo e incubar durante 3 horas para leer.

Ejemplo 7: Ensayo de unión directa de MDMX con polarización de Fluorescencia (FP)

El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir MDMX (del laboratorio, 40 kD) en tampón FP (tampón con alto contenido de sal: NaCl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7,5) para hacer una solución madre de trabajo 10 pM.

6. Añadir 10 pl de péptido marcado con FAM 10 nM en cada pocillo, incubar, y leer en diferentes momentos. Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH²es ~51 nM.

Ejemplo 8: Ensayo de polarización de Fluorescencia competitivo para MDMX

El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir MDMX (del laboratorio, 40 kD) en tampón FP (tampón con alto contenido de sal: NaCl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7,5) para obtener una solución madre de trabajo 300 nM (2X).

2. Añadir 20 pl de 300 nM (2X) de solución madre de proteína en cada pocillo de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices)

3. Diluir 1 pM (en DMSO al 100 %) de péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 pM (dilución 1:10). Después, diluir desde 100 pM hasta 10 pM con agua (dilución 1:10) y después diluir con tampón FP desde 10 pM hasta 40 nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que tendrá una concentración de 10 nM en el pocillo (dilución 1:4). Mantener en la oscuridad el péptido diluido marcado con FAM hasta su uso.

4. Hacer una placa de dosis de péptido sin marcar con tampón FP comenzando con 5 mM (final) de péptido y haciendo diluciones en serie de 5 veces para 6 puntos mediante el uso del siguiente esquema de dilución.

5. Diluir 10 mM (en DMSO al 100 %) con DMSO hasta 5 mM (dilución 1:2). Después, diluir desde 5 mM hasta 5 0 0 |j M c o n H 2 O ( d i l u c i ó n 1 : 1 0 ) y d e s p u é s d i l u i r c o n t a m p ó n F P d e s d e 5 0 0 p M h a s t a 2 0 j M ( d i l u c i ó n 1 : 2 5 ) . H a c e r d i l u c i o n e s e n s e r i e d e 5 v e c e s a p a r t i r d e 2 0 p M ( 4 X ) p a r a 6 p u n t o s .

6 ^{. T r a n s f e r i r 1 0 p l d e p é p t i d o s n o m a r c a d o s d i l u i d o s e n s e r i e a c a d a p o c i l i o q u e s e l l e n ó c o n 2 0 m L d e p r o t e í n a}3 0 0 n M .

7 . A ñ a d i r 1 0 p l d e p é p t i d o m a r c a d o c o n F A M d e 1 0 n M ( 4 X ) e n c a d a p o c i l l o e i n c u b a r d u r a n t e 3 h o r a s p a r a l e e r . L o s r e s u l t a d o s d e l o s E j e m p l o s 5 - 8 s e m u e s t r a n e n l a T a b l a 4 . S e u s a l a s i g u i e n t e e s c a l a : " " r e p r e s e n t a u n v a l o r m a y o r q u e 10 0 0 n M , " " r e p r e s e n t a u n v a l o r m a y o r q u e 1 0 0 y m e n o r o i g u a l a 10 0 0 n M , " " r e p r e s e n t a u n v a l o r m a y o r q u e 1 0 n M y m e n o r q u e o i g u a l a 1 0 0 n M , y " " r e p r e s e n t a u n v a l o r m e n o r o i g u a l a 1 0 n M .

Tabla 4

conti nuación

continuación

continuación

continuación

continuación

Ejemplo 9: ELISA de Unión Competitiva (MDM2 & MDMX)

En los pocillos de unas placas Immulon de 96 pocillos, se recubre con la proteína p53-His6 (30 nM/pocillo) durante la noche a temperatura ambiente. El día del experimento, las placas se lavan con PBS-Tween 20 1X (0,05 %) mediante el uso de un lavador de placas de ELISA automatizado, se bloquean con ELISA Micro well Blocking durante 30 minutos a temperatura ambiente; el exceso de agente de bloqueo se lava mediante el lavado de las placas con PBS-Tween 20 1X (0,05 %). Los péptidos se diluyen a partir de soluciones madres 10 mM en DMSO a soluciones de trabajo de 500 pM en agua estéril, y se realizan diluciones adicionales en DMSO al 0,5 % para mantener constante la concentración de DMSO en las muestras. Los péptidos se añaden a los pocillos a 2X de las concentraciones deseadas en volúmenes de 50 pl, seguido de la adición de proteína GST-MDM2 o GST-HMDX diluida (concentración final: 10 nM). Las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas, las placas se lavan con PBS-Tween 20 (0,05 %) antes de añadir 100 pl de anticuerpo anti-GST conjugado con HRP [Hypromatrix, INC] diluido a 0,5 pg/mL en tampón estabilizador de HRP. Después de 30 minutos de incubación con el anticuerpo de detección, las placas se lavan y se incuban con 100 pl por pocillo de solución de sustrato TMB-E hasta 30 minutos; las reacciones se detienen mediante el uso de HCL 1M y se mide la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas. Los datos se analizan mediante el uso del programa informático GraphPad PRISM.

Ejemplo 10: Ensayo de Viabilidad Celular

El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general:

Células sembradas en placas: Tripsinizar, contar y sembrar células a las densidades predeterminadas en placas de 96 pocillos un día antes del ensayo. Se usan las siguientes densidades celulares para cada línea celular en uso: SJSA-1: 7500 células/pocillo

RKO: 5000 células/pocillo

RKO-E6: 5000 células/pocillo

HCT-116: 5000 células/pocillo

SW-480: 2000 células/pocillo

MCF-7: 5000 células/pocillo

El día del estudio, se cambia el medio con medio fresco con FBS 11 % (medio de ensayo) a temperatura ambiente. Añadir 180 pl del medio de ensayo por pocilio. Los pocilios control sin células, reciben 200 pl de medio.

Dilución de péptidos: todas las diluciones se realizan a temperatura ambiente y se añaden a las células a temperatura ambiente.

• Preparar soluciones madres de 10 mM de los péptidos en DMSO. Diluir en serie la solución madre mediante el uso de un esquema de dilución 1:3 para obtener soluciones 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 mM mediante el uso de DMSO como diluyente. Diluir los péptidos diluidos en serie con DMSO 33,3 veces mediante el uso de agua estéril. Esto da un intervalo de soluciones de trabajo 10X. Además, preparar una mezcla de DMSO/agua estéril (DMSO 3 %) para los pocillos de control.

• Por lo tanto, el intervalo de concentración de las soluciones de trabajo pM será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 pM.

Mezclar bien en cada etapa de dilución mediante el uso de pipeta multicanal.

• La fila H tiene controles. H1-H3 recibirá 20 ul de medio de ensayo. H4-H9 recibirá 20 ul de vehículo DMSO-agua al 3 %. H10-H12 tendrá control de medio solo sin células.

• Control positivo: el inhibidor de molécula pequeña de MDM2, Nutlin-3a (10 mM) se usa como control positivo. Nutlin se diluyó mediante el uso del mismo esquema de dilución que los péptidos.

Adición de las soluciones de trabajo a las células:

• Añadir 20 pl de la concentración 10X deseada al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales en un volumen total de 200 pl en el pocillo. (20 pl de péptido 300 pM 180 pl de células en el medio = concentración final 30 pM en volumen de 200 pl en los pocillos). Mezclar suavemente unas cuantas veces mediante el uso de una pipeta. Por lo tanto, el intervalo de concentración final usado será 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 y 0 pM (para péptidos potentes se incluyen diluciones adicionales).

• Los controles incluyen pocillos que no tienen péptidos pero que contienen la misma concentración de DMSO que los pocillos que contienen los péptidos y que los pocillos que no contienen CÉLULAS.

• Incubar durante 72 horas a 37 °C en atmósfera humidificada de CO²al 5 %.

• La viabilidad de las células se determina mediante el uso del reactivo MTT de Promega. La viabilidad de las células SJSA-1, RKO, RKO-E6, HCT-116 se determina el día 3, las células MCF-7 el día 5, y las células SW-480 el día 6. Al final del tiempo de incubación designado, dejar que las placas alcancen la temperatura ambiente. Retirar 80 pl de medio de ensayo de cada pocillo. Añadir 15 pl del reactivo MTT descongelado a cada pocillo.

• Dejar la placa incubar durante 2 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO²al 5 % y añadir 100 pl de reactivo de solubilización según el protocolo del fabricante. Incubar con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 570 nM en el lector de placas múltiples Synergy Biotek.

• Analizar la viabilidad celular con respecto a los controles DMSO mediante el uso de las herramientas de análisis GraphPad PRISM.

Reactivos:

• Medios de cultivo de células Invitrogen

i.Placas tratadas de cultivo celular transparente Falcon de 96 pocillos (Nunc 353072)

• DMSO (Sigma D 2650)

• RPMI 1640 (Invitrogen 72400)

• MTT (Promega G4000)

Instrumentos: Lector de placas múltiples para lectura de absorbancia (Synergy 2).

Los resultados de los ensayos de viabilidad celular se muestran en las Tablas 5 y 6. Se usa la siguiente escala: "+" representa un valor superior a 30 pM, "++" representa un valor superior a 15 pM y menor o igual a 30 pM, "+++" representa un valor superior a 5 pM y menor o igual a 15 pM, y "++++" representa un valor menor o igual a 5 pM. La "relación de IC50" representa la relación de IC50 promedio en células p53+/+ con respecto a IC50 promedio en células p53-/-.

Tabla 5

continuación

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Tabla 6

continuación

n i n i n

5

0

5

0

5

E j e m p l o 1 1 : E n s a y o E L I S A d e P 2 1

0 E l e n s a y o s e r e a l i z ó d e a c u e r d o c o n e l s i g u i e n t e p r o t o c o l o g e n e r a l :

Células sembradas en Placa:

• T r i p s i n i z a r , c o n t a r y s e m b r a r c é l u l a s S J S A 1 a l a d e n s i d a d d e 7 5 0 0 c é l u l a s / 10 0 p l / p o c i l l o e n p l a c a s d e 9 6 p o c i l l o s 5 u n d í a a n t e s d e l e n s a y o .

• E l d í a d e l e s t u d i o , r e e m p l a z a r e l m e d i o c o n R P M I - F B S 1 1 % ( m e d i o d e e n s a y o ) f r e s c o . A ñ a d i r 9 0 p l d e l m e d i o d e e n s a y o p o r p o c i l l o . L o s p o c i l l o s c o n t r o l s i n c é l u l a s , r e c i b e n 1 0 0 p l d e m e d i o .

D i l u c i ó n d e p é p t i d o s :

0

• P r e p a r a r s o l u c i o n e s m a d r e s d e 1 0 m M d e l o s p é p t i d o s e n D M S O . D i l u i r e n s e r i e l a s o l u c i ó n m a d r e m e d i a n t e e l u s o d e u n e s q u e m a d e d i l u c i ó n 1 : 3 p a r a o b t e n e r s o l u c i o n e s 10 , 3 , 3 , 1 , 1 , 0 , 3 3 , 0 , 1 1 , 0 , 0 3 , 0 , 0 1 m M m e d i a n t e e l u s o d e D M S O c o m o d i l u y e n t e . D i l u i r l o s p é p t i d o s d i l u i d o s e n s e r i e c o n D M S O 3 3 , 3 v e c e s c o n a g u a e s t é r i l . E s t o d a u n i n t e r v a l o d e 1 0 X d e l a s s o l u c i o n e s d e t r a b a j o . A d e m á s , p r e p a r a r u n a m e z c l a d e D M S O / a g u a e s t é r i l ( D M S O 3 % ) 5 p a r a l o s p o c i l l o s d e c o n t r o l .

• P o r l o t a n t o , e l i n t e r v a l o d e c o n c e n t r a c i ó n d e l a s s o l u c i o n e s d e t r a b a j o p M s e r á 3 0 0 , 10 0 , 3 0 , 10 , 3 , 1 , 0 , 3 y 0 p M .

M e z c l a r b i e n e n c a d a e t a p a d e d i l u c i ó n m e d i a n t e e l u s o d e p i p e t a m u l t i c a n a l .

• L a f i l a H t i e n e c o n t r o l e s . H 1 - H 3 r e c i b i r á 1 0 u l d e m e d i o d e e n s a y o . H 4 - H 9 r e c i b i r á 1 0 u l d e v e h í c u l o d e a g u a - D M S O a l 3 % . H 1 0 - H 1 2 t e n d r á c o n t r o l d e m e d i o s o l o s i n c é l u l a s .

0 • C o n t r o l p o s i t i v o : e l i n h i b i d o r d e m o l é c u l a p e q u e ñ a d e M D M 2 , N u t l i n - 3 a ( 1 0 m M ) s e u s a c o m o c o n t r o l p o s i t i v o . N u t l i n s e d i l u y ó m e d i a n t e e l u s o d e l m i s m o e s q u e m a d e d i l u c i ó n q u e l o s p é p t i d o s .

A d i c i ó n d e l a s s o l u c i o n e s d e t r a b a j o a l a s c é l u l a s :

5 • A ñ a d i r 1 0 p l d e l a c o n c e n t r a c i ó n 1 0 X d e s e a d a a l p o c i l l o a p r o p i a d o p a r a l o g r a r l a s c o n c e n t r a c i o n e s f i n a l e s e n u n v o l u m e n t o t a l d e 1 0 0 p l e n e l p o c i l l o . ( 1 0 p l d e p é p t i d o 3 0 0 p M 9 0 p l d e c é l u l a s e n m e d i o = c o n c e n t r a c i ó n f i n a l 3 0 p M e n v o l u m e n d e 10 0 p l e n p o c i l l o s ) . P o r l o t a n t o , e l i n t e r v a l o d e c o n c e n t r a c i ó n f i n a l u s a d o s e r á 3 0 , 10 , 3 , 1 , 0 , 3 y 0 p M .

• L o s c o n t r o l e s i n c l u i r á n p o c i l l o s q u e n o t i e n e n p é p t i d o s p e r o q u e c o n t i e n e n l a m i s m a c o n c e n t r a c i ó n d e D M S O q u e 0 l o s p o c i l l o s q u e c o n t i e n e n p é p t i d o s , y p o c i l l o s q u e n o c o n t i e n e n C É L U L A S .

• 2 0 h o r a s d e s p u é s d e l a i n c u b a c i ó n , a s p i r a r l o s m e d i o s ; l a v a r l a s c é l u l a s c o n P B S 1 X ( s i n C a +/ M g ) y l i s a r e n 6 0 p l d e t a m p ó n d e l i s i s c e l u l a r 1 X ( t a m p ó n C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g i e s 1 0 X d i l u i d o a 1 X y s u p l e m e n t a d o c o n i n h i b i d o r e s d e p r o t e a s a e i n h i b i d o r e s d e f o s f a t a s a ) e n h i e l o d u r a n t e 3 0 m i n u t o s .

• C e n t r i f u g a r l a s p l a c a s a u n a v e l o c i d a d d e 5 0 0 0 r p m a 4 ° C d u r a n t e 8 m i n u t o s ; r e c o l e c t a r l o s s o b r e n a d a n t e s 5 t r a n s p a r e n t e s y c o n g e l a r a - 8 0 ° C h a s t a s u u s o p o s t e r i o r .

Estimación de proteínas:

• El contenido de proteína total de los lisados se mide mediante el uso del kit de detección de proteínas BCA y los estándares BSA de Thermofisher. Típicamente, se esperan aproximadamente 6-7 pg de proteína por pocillo. • Usar 50 pl de lisado por pocillo para configurar el ELISA de p21.

ELISA de p21 Humano Total: El protocolo de ensayo ELISA se sigue según las instrucciones del fabricante. Se usan 50 pl de lisado para cada pocillo y cada pocillo se prepara por triplicado.

Reactivos:

-Ensayo Basado en Células (-)-Nutlin-3 (10 mM): Cayman Chemicals, catálogo núm. 600034

-OptiMEM, catálogo de Invitrogen núm. 51985

-Tampón de Lisis de Señalización Celular (10X), Cell signaling technology, catálogo núm. 9803 -(mini)Comprimidos de coctel con inhibidor de proteasa, Roche Chemicals, catálogo núm. 04693124001 -Comprimido de coctel de Inhibidor de fosfatasa, Roche Chemicals, catálogo núm. 04906837001

-Kit ELISA de p21 total humano, R&D Systems, DYC1047-5

-Solución STOP (HCL 1M), Cell Signaling Technologies, catálogo núm. 7002

Instrumentos: Microcentrífuga Eppendorf 5415D y lector de placas múltiples para lectura de absorbancia (Synergy 2).

Ejemplo 12: Ensayo de detección de Caspasa 3:

El ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general:

Células sembradas en placa: tripsinizar, contar y sembrar células SJSA1 a la densidad de 7500 células/100 pl/pocillo en placas de 96 pocillos un día antes del ensayo. El día del estudio, reemplazar el medio con RPMI-FBS 11 % (medio de ensayo) fresco. Añadir 180 pl del medio de ensayo por pocillo. Los pocillos control sin células, reciben 200 pl de medio.

Dilución de péptidos:

• Preparar soluciones madres de 10 mM de los péptidos en DMSO. Diluir en serie la solución madre mediante el uso de un esquema de dilución 1:3 para obtener soluciones 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 mM mediante el uso de DMSO como diluyente. Diluir los péptidos diluidos en serie con DMSO 33,3 veces con agua estéril. Esto da un intervalo de 10X de las soluciones de trabajo. Además, preparar una mezcla de DMSO/agua estéril (DMSO 3 %) para los pocillos de control.

Mezclar bien en cada etapa de dilución mediante el uso de pipeta multicanal. Añadir 20 ul de soluciones de trabajo 10X a los pocillos apropiados.

Adición de las soluciones de trabajo a las células:

• Añadir 10 pl de la concentración 10X deseada al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales en un volumen total de 100 pl en el pocillo. (10 pl de péptido 300 pM 90 pl de células en medio = concentración final 30 pM en volumen de 100 pl en pocillos). Por lo tanto, el intervalo de concentración final usado será 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 pM.

• Los controles incluirán pocillos que no tienen péptidos pero que contienen la misma concentración de DMSO que los pocillos que contienen péptidos, y pocillos que no contienen CÉLULAS.

• 48 horas después de la incubación, aspirar 80 pl de medio de cada pocillo; añadir 100 pl de reactivo de ensayo Caspase3/7Glo (sistema de ensayo Promega Caspase 3/7 glo, G8092) por pocillo, incubar con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.

• leer en el lector de placas múltiple Synergy Biotek para obtener luminiscencia.

• Los datos se analizan como activación de Caspasa 3 sobre células tratadas con DMSO.

Los resultados de los Ejemplos 11 y 12 se muestran en la Tabla 7:

Ejemplo 13. Lisis Celular mediante Macrociclos Peptidomiméticos

Las células SJSA-1 se sembraron un día antes en placas transparentes de fondo plano (Costar, número de catálogo 353072) a 7500 células/pocillo con 100 ul/pocillo de medio de crecimiento, dejando vacías las columnas 10-12 de la fila H para el medio solo. El día del ensayo, el medio se intercambió con medio RPMI FBS 1 %, 90 ul de medio por pocillo.

Se prepararon soluciones madre 10 mM de los macrociclos peptidomiméticos en DMSO al 100 %. Después los macrociclos peptidomiméticos se diluyeron en serie, en DMSO al 100 %, y después se diluyeron 20 veces en agua estéril para preparar soluciones madre de trabajo en DMSO al 5 %/agua de cada macrociclo peptidomimético a concentraciones que varían desde 500 uM hasta 62,5 uM.

Se añadieron 10 pl de cada compuesto a los 90 pl de células SJSA-1 para producir concentraciones finales de 50 pM a 6,25 pM en medio que contenía DMSO al 0,5 %. La muestra de control negativo (no lítico) era DMSO al 0,5 % solo y las muestras de control positivo (lítico) incluyen Melittin 10 uM y Triton X-100 al 1 %.

Las placas de células se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después de 1 hora de incubación, se examina la morfología de las células al microscopio y después las placas se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se transfieren 40 ul de sobrenadante para cada macrociclo peptidomimético y muestra de control a placas de ensayo transparentes. La liberación de LDH se mide mediante el uso del kit de ensayo de citotoxicidad de LDH de Cayman, catálogo núm. 1000882.

Los resultados se muestran en la Tabla 8:

Tabla 8

continuación

n i n i n

5

0

E j e m p l o 14 : e n s a y o G R I P d e p 5 3

5

E j e m p l o 15 : E s t u d i o d e c á n c e r d e m a m a M C F - 7 m e d i a n t e e l u s o d e S P 3 1 5 , S P 2 4 9 y S P 1 5 4

S e r e a l i z ó u n e s t u d i o d e x e n o i n j e r t o p a r a e v a l u a r l a e f i c a c i a d e S P 3 1 5 , S P 2 4 9 y S P 1 5 4 e n l a i n h i b i c i ó n d e l c r e c i m i e n t o t u m o r a l e n r a t o n e s a t í m i c o s e n e l m o d e l o d e x e n o i n j e r t o d e c á n c e r d e m a m a M C F - 7 . U n p é p t i d o g r a p a d o d e c o n t r o l 0 n e g a t i v o . E l S P 2 5 2 , u n a m u t a c i ó n p u n t u a l d e S P 1 5 4 ( F a A e n l a p o s i c i ó n 1 9 ) s e e v a l u ó , a d e m á s , e n u n g r u p o ; e s t e p é p t i d o n o h a b í a m o s t r a d o a c t i v i d a d e n e l e n s a y o d e v i a b i l i d a d i n v i t r o d e S J S A - 1 . S e i m p l a n t a r o n g r á n u l o s d e 0 , 7 2 ^{m g d e 1 7 p - e s t r a d i o l d e l i b e r a c i ó n l e n t a d u r a n t e 9 0 d í a s ( I n n o v a t i v e R e s e a r c h , S a r a s o t a ,}Fl ) ^{p o r v í a s u b c u t á n e a ( s c )}e n l a n u c a u n d í a a n t e s d e l a i m p l a n t a c i ó n d e l a s c é l u l a s t u m o r a l e s ( D í a - 1 ) . E l D í a 0 , s e i m p l a n t a r o n c é l u l a s t u m o r a l e s M C F - 7 s c e n e l f l a n c o d e r a t o n e s d e s n u d o s h e m b r a ( C r l : N U - F o x n l n u ) . E l D í a 18 , l o s t u m o r e s s c r e s u l t a n t e s s e m i d i e r o n 5 m e d i a n t e e l u s o d e c a l i b r a d o r e s p a r a d e t e r m i n a r s u l o n g i t u d y a n c h o y s e p e s a r o n l o s r a t o n e s . L o s t a m a ñ o s d e l o s t u m o r e s s e c a l c u l a r o n m e d i a n t e e l u s o d e l a f ó r m u l a ( l a r g o x a n c h o 2 ) / 2 y s e e x p r e s a r o n c o m o m i l í m e t r o s c ú b i c o s ( m m 3 ) . L o s r a t o n e s c o n t u m o r e s m e n o r e s d e 8 5 , 3 m m 3 o m a y o r e s d e 4 1 7 , 4 m m 3 s e e x c l u y e r o n d e l a f o r m a c i ó n d e g r u p o s p o s t e r i o r . S e f o r m a r o n t r e c e g r u p o s d e r a t o n e s , 1 0 r a t o n e s p o r g r u p o , m e d i a n t e a l e a t o r i z a c i ó n d e m a n e r a q u e l o s t a m a ñ o s m e d i o s d e l o s t u m o r e s d e l g r u p o f u e r a n e s e n c i a l m e n t e e q u i v a l e n t e s ( m e d i a d e l o s g r u p o s ± d e s v i a c i ó n 0 e s t á n d a r d e l o s g r u p o s = 1 8 0 , 7 ± 1 7 , 5 m m 3 ).

L a s s o l u c i o n e s d e d o s i f i c a c i ó n d e S P 3 1 5 , S P 2 4 9 , S P 1 5 4 y S P 2 5 2 s e p r e p a r a r o n a p a r t i r d e p é p t i d o s f o r m u l a d o s e n u n v e h í c u l o q u e c o n t e n í a M P E G ( 2 K ) - D S P E a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 5 0 m g / m L e n u n a s o l u c i ó n s a l i n a t a m p o n a d a c o n h i s t i d i n a 1 0 m M a p H 7 . E s t a f o r m u l a c i ó n s e p r e p a r ó u n a v e z p a r a l a d u r a c i ó n d e l e s t u d i o . E s t e v e h í c u l o s e u s ó c o m o 5 c o n t r o l d e l v e h í c u l o e n e l e s t u d i o p o s t e r i o r .

A cada grupo se le asignó un régimen de tratamiento diferente. El grupo 1, como grupo de control negativo del vehículo, recibió el vehículo administrado a 8 mL/kg de peso corporal por vía intravenosa (iv) tres veces por semana desde los Días 18-39. Los grupos 2 y 3 recibieron SP154 como inyección intravenosa a 30 mg/kg tres veces por semana o 40 mg/kg dos veces por semana, respectivamente. El grupo 4 recibió SP2496,7 mg/kg como inyección intravenosa tres veces por semana. Los grupos 5, 6, 7 y 8 recibieron SP315 como una inyección intravenosa de 26,7 mg/kg tres veces por semana, 20 mg/kg dos veces por semana, 30 mg/kg dos veces por semana o 40 mg/kg dos veces por semana, respectivamente. El grupo 9 recibió SP25230 mg/kg como una inyección intravenosa tres veces por semana.

Durante el período de dosificación, se pesaron los ratones y se midieron los tumores 1-2 veces por semana. Los resultados en términos de volumen tumoral se muestran en las Figuras 3-6 y la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el grupo de vehículo, el cambio de peso corporal y el número de ratones con >20 % de pérdida de peso corporal o muerte se muestran en la Tabla 9. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó como %TGI = 100-[(TuVol^{T r a ta d ° - d ¡ a x -}TuVol^{T r a ta d ° - d í a 18})/(TuVol^{C ° n t r o l n e g a t i v o v e h í c u l o - d í a x -}TuVol^{C ° n t r ° l n e g a t i v o v e h í c u l o - d í a 18 ) *}100 donde x= día que se evalúa el efecto del tratamiento. El grupo 1, el grupo de control negativo del vehículo mostró una buena tasa de crecimiento tumoral para este modelo de tumor.

Para SP154, en el grupo que recibió una dosis de 40 mg/kg dos veces por semana, 2 ratones murieron durante el tratamiento, lo que indica que este régimen de dosificación no era tolerable. El régimen de dosificación de 30 mg/kg de SP154 tres veces por semana fue bien tolerado y produjo un TGI del 84 %.

Para SP249, el grupo al que se le administró 6,7 mg/kg tres veces por semana, 4 ratones murieron durante el tratamiento, lo que indica que este régimen de dosificación no era tolerable.

Todos los regímenes de dosificación usados para SP315 mostraron una buena tolerabilidad, sin pérdida de peso corporal o muertes. La dosificación con SP31540 mg/kg dos veces por semana produjo el TGI más alto (92 %). Los regímenes de dosificación de SP315 de 26,7 mg/kg tres veces por semana, 20 mg/kg dos veces por semana, 30 mg/kg dos veces por semana produjeron TGI de 86, 82, y 85 %, respectivamente.

Para SP252, la mutación puntual de SP154 que no muestra una actividad apreciable en ensayos in vitro, la dosificación de 30 mg/kg tres veces por semana fue bien tolerada sin pérdida de peso corporal o muertes registradas. Mientras que el TGI del 88 % se observó el Día 32, ese TGI se redujo al 41 % el Día 39.

Los resultados de este Ejemplo se muestran en las Figuras 3-6 y se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9

Ejemplo 21: Determinación de solubilidad para macrociclos peptidomiméticos

Los macrociclos peptidomiméticos se disuelven primero en N, N-dimetilacetamida pura (DMA, Sigma-Aldrich, 38840-1L-F) para preparar soluciones madre 20X en un intervalo de concentración de 20-140 mg/mL. Las soluciones madre de DMA se diluyen 20 veces en un vehículo acuoso que contiene Solutol-HS-15 al 2 %, Histidina 25 mM, Manitol 45 mg/mL para obtener concentraciones finales de 1-7 mg/mL de los macrociclos peptidomiméticos en DMA al 5 %, Solutol-HS-15 2 %, Histidina 25 mM, Manitol 45 mg/mL. Las soluciones finales se mezclan suavemente mediante pipeteo repetido o agitación ligera con vortex, y después las soluciones finales se someten a ultrasonido durante 10 minutos a temperatura ambiente en un baño de agua ultrasónico. Después se realiza una observación visual cuidadosa bajo la luz de la campana mediante el uso de un amplificador visual 7x para determinar si existe un precipitado en el fondo o como una suspensión. Se evalúan intervalos de concentración adicionales según sea necesario para determinar el límite máximo de solubilidad para cada macrociclo peptidomimético.

Los resultados de este Ejemplo se muestran en la Figura 7.

Ejemplo 22: Preparación de macrociclos peptidomiméticos mediante el uso de un aminoácido protegido con Boc.

Se prepararon precursores de macrociclo peptidomimético como se describe en el Ejemplo 2 que comprende un aminoácido R8 en la posición "i" y un aminoácido S5 en la posición "i+7". El aminoácido en la posición "i+3" era un triptófano protegido con Boc que se incorporó durante la síntesis en fase sólida.

Específicamente, el aminoácido triptófano protegido con Boc que se muestra a continuación (y disponible comercialmente, por ejemplo, de Novabiochem) se usó durante la síntesis en fase sólida:

La metátesis se realizó mediante el uso de un catalizador de rutenio antes de las etapas de escisión y desprotección. Se determinó por análisis de HPLC que la composición que se obtiene después de la ciclación contenía principalmente macrociclos peptidomiméticos que tienen un reticulante que comprende una trans olefina ("iso2", que comprende el doble enlace en una configuración E). Inesperadamente, se observó una relación de 90:10 para los productos trans y cis, respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un macrociclo peptidomimético de la fórmula:

o una sal aceptable farmacéuticamente de este,

en donde:

cada uno de Xaa³, Xaa⁵, Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa⁹y Xaa¹⁰es independientemente un aminoácido, en donde al menos tres de Xaa³, Xaa⁵, Xaa⁶, Xaa⁷, Xaa⁸, Xaa⁹y Xaa¹⁰son los mismos aminoácidos que el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia Phe³-X⁴-His⁵-Tyr⁶-Trp⁷-Ala⁸-Gln⁹-Leu¹⁰-Xⁿ-Ser¹²(SEQ ID NO: 8), en donde cada X ⁴y X ¹¹es independientemente un aminoácido;

cada D es independientemente un aminoácido;

cada E es independientemente un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala (alanina), D-Ala (D-alanina), Aib (ácido a-aminoisobutírico), Sar (N-metilglicina), y Ser (serina);

R¹y R²son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, no sustituido o sustituido con halo-; o forma un enlazador formador de macrociclo L' conectado a la posición alfa de uno de dichos aminoácidos D o E;

cada R³es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R⁵;

L y L' son independientemente un enlazador formador de macrociclo de la fórmula L¹-L²-;

cada L¹y L²es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno o [-R⁴-K-R⁴-]ⁿ, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con R⁵;

cada R⁴es independientemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno;

cada K es independientemente O, S, SO, SO2, CO, CO2, o CONR3;

cada R⁵es independientemente halógeno, alquilo, -OR⁶, -N(R⁶)², -SR⁶, -SOR⁶, -SO²R⁶, -CO²R⁶, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

cada R⁶es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico;

R⁷es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R⁵, o parte de una estructura cíclica con un residuo D;

R⁸es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con R⁵, o parte de una estructura cíclica con un residuo E;

v es un número entero de 1-1000;

w es un número entero de 3-1000; y

n es un número entero de 1-5.

2. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, en donde cada E es independientemente un aminoácido seleccionado de Ala (alanina), D-Ala (D-alanina) y Ser (serina).

3. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde v es un número entero de 2 a 10.

4. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde w es un número entero de 3 a 6.

5. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Xaa⁵es Glu.

6. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde v es 2.

7. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde w es un número entero de 6 a 10.

8^{. E l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o , o u n a s a l a c e p t a b l e f a r m a c é u t i c a m e n t e d e e s t e , d e c o n f o r m i d a d c o n c u a l q u i e r a}d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 7 , e n d o n d e ( a ) c a d a u n o d e L 1 y L 2 e s i n d e p e n d i e n t e m e n t e a l q u i l e n o o a l q u e n i l e n o y / o ( b ) c a d a L e s i n d e p e n d i e n t e m e n t e a l q u i l e n o , a l q u e n i l e n o o a l q u i n i l e n o .

5 9 . E l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o , o u n a s a l a c e p t a b l e f a r m a c é u t i c a m e n t e d e e s t e , d e c o n f o r m i d a d c o n c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8 , e n d o n d e c a d a R 1 y R 2 e s i n d e p e n d i e n t e m e n t e H o a l q u i l o .

1 1 . E l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o , o u n a s a l a c e p t a b l e f a r m a c é u t i c a m e n t e d e e s t e , d e c o n f o r m i d a d c o n c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 10 , e n d o n d e w e s 6 .

5

12 . E l m a c r o c i c l o p e p t i d o m i m é t i c o , o s a l a c e p t a b l e f a r m a c é u t i c a m e n t e d e e s t e , d e c o n f o r m i d a d c o n c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 1 1 , e n d o n d e [ D ] v e s - L e u 1 - T h r 2 .

(SEQ ID NO: 376)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 169)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 340)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 454)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 360)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 324)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 446)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 358)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 464)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 466)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 467)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 471)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 482)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este; o

(SEQ ID NO: 572)

o una sal aceptable farmacéuticamente de este.

14. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 570.

15. El macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 10-457.

16. Una composición farmacéutica que comprende un macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Un macrociclo peptidomimético, o una sal aceptable farmacéuticamente de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para usar en el tratamiento del cáncer en un sujeto.