PL180612B1

PL180612B1 - Pochodna peptydu PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180612B1
Application number: PL94312989A
Authority: PL
Inventors: Sun H Kim; Zhengxin Dong; John E Taylor; Sylviane Moreau; Susan R Keyes
Original assignee: Biomeasure
Priority date: 1993-08-09
Filing date: 1994-08-08
Publication date: 2001-03-30
Also published as: PT788509E; US5552520A; CZ289552B6; LT96025A; JPH09501177A; AU7481994A; RU2133252C1; ES2196031T3; EP0788509A4; DE69435105D1; SI9420051A; LV11549B; WO1995004752A1; ES2229045T3; PT1288223E; KR100325972B1; FI960584A0; DK1288223T3; DE69434181D1; JP2004339237A

Abstract

1. Pochodna peptydu, zawierajaca ugrupowanie peptydu stanowiace som atostatyne lub jej analogi, i co najmniej jeden podstawnik, przylaczony do ugrupowania peptydu; przy czym podstawnik ten wybrany jest z grupy zawierajacej zw iazki I, II i III, przy czym zw iazkiem I jest zw iazek o wzorze w którym: kazdy z R 1 i R 2 oznacza niezaleznie H lub C H (O H)CH2OH, jeden z R3 lub R4 oznacza (CH 2)nR 1 2, gdzie R 12 oznacza CO, a n je st liczba calkow ita m iedzy 1 a 5, w lacznie; zas pozostale R3 lub R4 oznacza H lub hydroksyalkil C 1-C6, a zw iazek II jest zw iazkiem o wzorze. w którym kazdy z podstawników R 13, R 14 i R 15 niezaleznie oznacza H lub acyl C2-C24; R16 oznacza NH lub jest nieobecny, R17 oznacza C O lub jest nieobecny; R 1 8 oznacza CO , CH2, SO2 lub jest nieobecny, m oznacza liczbe calkow ita m iedzy 1 a 5, w lacznie; n oznacza liczbe calkowita m iedzy 0 a 5, w lacznie, zas zwiazek III jest zwiazkiem o w zorze: w którym R 19 oznacza H, OH lub hydroksyalkil C 1-C 6; R20 oznacza O lub jest nieobecny, R21 oznacza alkil C 1-C6, R2b oznacza SO2 lub CO ; m oznacza liczbe calkow ita m iedzy 0 a 5, w lacznie, n oznacza liczbe calkow ita m iedzy 0 a 5, w lacznie; p oznacza liczbe calkow ita m iedzy 0 a 5, w lacznie; a q oznacza liczbe calk ow ita m iedzy 0 a 5, w lacznie; gdzie ugrupowanie peptydu jest przylaczone do kazdego z w ym ienionych podstaw ników poprzez w iazanie CO-N , CH2-N lub SO2-N m iedzy podstawnikiem a atom em azotu N -kon ca lub dow olna grupa am inowa lancucha bocznego ugrupowania peptydowego PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest pochodna peptydu o właściwościach terapeutycznych.

Czyniono wiele prób przedłużenia czynności czynnych biologicznie peptydów. Na przykład modyfikowano peptydy chemicznie przez syntetyczne dołączenie grup cukrowych w celu zwiększenia okresu czasu, w którym peptyd jest czynny (Sandoz, WO 88/02756; Sandoz, WO 89/09786; DE 3910667A1; EPO 0374089A2 (1990); i Breipohl, patent USA Nr 4861755 (1989)). Do zwiększenia czasu życia peptydu stosowano także dołączenie kationowych kotwic (EPO 0363589A2 (1990)) oraz ugrupowań cukrowych (Whittaker, WO 91/09837; Jung, patent USA nr 4837303 (1980)).

Generalnie przedmiotem wynalazku są pochodne czynnych biologicznie peptydów, które zawierają jeden lub więcej podstawników, oddzielnie związanych z grupą aminową umiejscowioną na N-końcu lub z łańcuchem bocznym ugrupowania peptydowego. W swojej postaci zmo4

180 612 dyfikowanej pochodne wykazująsilniejsząi przedłużoną czynność biologicznąw porównaniu z odpowiadającymi peptydami niezmodyfikowanymi.

Pochodne peptydowe są korzystne przez to że są tanie, wysoce biokompatybilne, nie posiadają szkodliwych działań ubocznych i są kompatybilne z różnymi postaciami do podawania terapeutycznego. W szczególności wiele z tych pochodnych, posiadających jako ugrupowanie peptydowe somatostatynę, ma silnie zwiększoną siłę działania i selektywność w porównaniu ze somatostatynąniezmodyfikowaną. Pochodna peptydu według wynalazku zawiera ugrupowanie peptydu stanowiące somatostatynę lub jej analogi, i co najmniej jeden podstawnik, przyłączony do ugrupowania peptydu; przy czym podstawnik ten wybrany jest z grupy zawierającej związki I, II i III, przy czym związkiem I jest związek o wzorze:

R3O w którym:

każdy z Rj i R₂ oznacza niezależnie H lub CH(OH)CH₂OH, jeden z R₃ lub R₄ oznacza (CH₂)_nR₁₂, gdzie R₁₂ oznacza CO, a n jest liczbą całkowitą między 1 a 5, włącznie;

zaś pozostałe R₃ lub R₄ oznacza H lub hydroksyalkil C_rC₆, a związek Π jest związkiem o wzorze:

r₁₃-o-ch₂

R₁₄-O-CH₂-C- (CH₂) _m-Ri6-R17- (CH₂) _n-Rie

R₁₅-O-CH₂ w którym:

każdy z podstawników R₁₃, R₁₄ i R₁₅ niezależnie oznacza H lub acyl C₂-C₂₄;

R₁₆ oznacza NH lub jest nieobecny;

R₁₇ oznacza CO lub jest nieobecny;

R₁₈ oznacza CO, CH₂, SO₂ lub jest nieobecny;

m oznacza liczbę całkowitą między 1 a 5, włącznie;

n oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie, zaś związek ΠΙ jest związkiem o wzorze:

(CH2)_m

R19 - R₂₀ - R21 - N N - (CH₂)p - (CH₂)q - R₂₆ (CH₂)_n w którym:

R₁₉ oznacza H, OH lub hydroksyalkil Ο_ΓΟ₆;

R₂₀ oznacza O lub jest nieobecny;

R₂₁ oznacza alkil C_rC₆;

R₂₆ oznacza SO₂ lub CO;

m oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie;

n oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie;

180 612 p oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie; a q oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie;

gdzie ugrupowanie peptydu jest przyłączone do każdego z wymienionych podstawników poprzez wiązanie CO-N, CH2-N lub SO2-N między podstawnikiem a atomem azotu N-końca lub dowolną grupą aminową łańcucha bocznego ugrupowania peptydowego.

W korzystnych postaciach wynalazku podstawnikiem jest związek I; w tej postaci R₁₂ jest korzystnie CH₂ lub SO₂. Alternatywnie, podstawnikiem może być związek II, w którym to przypadku R_]8 jest korzystnie CH₂ lub SO₂; R₁₃, R₁₄ i R₁₅ oznaczająH, a R₁₇ jest nieobecny. W szczególnie korzystnych postaciach, podstawnikiem jest (HOCH₂)₃C-NH-(CH)₂-SO₂ lub (HOCH₂)₃C-CH₂.

W jeszcze innych korzystnych postaciach wynalazku podstawnikiem jest związek ΠΙ; korzystnie w tej postaci -R₂₃-jest nieobecny i co najmniej jeden z R₂₂ i R₂₄ oznacza N. Alternatywnie, oba podstawniki R₂₂ i R₂₄ mogą być N.

W następnych postaciach podstawnikiem jest jeden z następujących podstawników:

HO(CH₂)2N-(CH₂)₂COHO(CH₂)₂-N N-(CH₂)₂SO₂Najbardziej korzystnie analogiem somatostatyny jest jeden z następujących:

H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₀,H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Thr-Cys]-Nal-NH₂ i H-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Val-Cys]-Thr-NH₂.

W jeszcze innych korzystnych postaciach wynalazku pochodną peptydową jest jedna z:

HO(CH2)₂N N- (CH₂)CO-D-Phe-c(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH

HO(CH₂)₂-N N- (CH2)2SO₂-D-Phe-c(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH

Sposób leczenia choroby, takiej jak rak, u pacjenta polega na tym, że podaje się pacjentowi terapeutyczną ilość pochodnych peptydowych według wynalazku.

Stosowane tu określenie „czynny biologicznie” oznacza peptyd występujący naturalnie, rekombinacyjny lub syntetyczny, mający czynność fizjologiczną lub terapeutyczną. Generalnie termin ten obejmuje wszystkie pochodne, fragmenty i analogi peptydów czynnych biologicznie, które wykazują efekt jakościowo podobny lub przeciwny do peptydu niezmodyfikowanego.

Na figurze 1 przedstawiono wykres dwóch krzywych wzrostu komórek AR42J w obecności różnych pochodnych somatostatyny.

Generalnie pochodne peptydowe według wynalazku zawierajądwa oddzielne składniki: 1) peptyd czynny biologicznie; i 2) co najmniej jeden podstawnik mający strukturę związków I, II i III. Pochodne peptydowe otrzymane opisanymi tu sposobami obejmują następujące związki.

a) pochodne na bazie związku I

180 612

w których Ro, Ri, R₂, R3, R4, R12 i n są takie jak zdefiniowano powyżej, NH-F jest czynnym biologicznie ugrupowaniem peptydowym. W tych postaciach grupa NH jest umiejscowiona na N-końcu lub łańcuchu bocznym peptydu, a P' oznacza pozostałą część peptydu.

b) pochodne na bazie związku Π r₁₃-o-ch₂

R₁₄-O-CH₂-C- (CH₂)_m-Ri₆-Ri7- (CH₂)_n-Ri₈-NH-P^z r₁₅-o-ch₂ w którym R₁₃, R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R_lg, m, n i NH-F są takie jak zdefiniowano powyżej.

c) pochodne na bazie związku III (CH₂)_m

R19-R₂₀-R₂i-N - N-(CH₂)_p-(CH₂)_q-R₂₆-NH-P' (CH₂)_n w którym R19, R20, R21, R26, m, n, p i NH-F są takie jak zdefiniowano powyżej.

Oprócz struktur przedstawionych powyżej związki otrzymane zgodnie z wynalazkiem obejmują pochodne peptydowe zawierające dwa lub więcej podstawników przyłączonych do j ednego ugrupowania peptydowego. Te postacie wynalazku sąpochodnymi peptydów czynnych biologicznie, które mają więcej niż jedną wolną grupę aminową na przykład resztę lizynową.

Do analogów somatostatyny, które mogąbyć stosowane zgodnie z wynalazkiem należą ale bez ograniczania się do nich, następujące związki:

H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-p-Nal-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-p-Nal-NH₂;

H-D-P-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

180 612

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2;

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NHs;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr;

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr;

H-Gly-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr;

H-Phe-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr;

H-Phe-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr;

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol;

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-KH₂ ;

H-D-Trp-Cy s -Phe-D-Trp-Ly s-Thr-Cy s -Thr-NH₂ ;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Ly3-Val-Cys-Thr-NH₂ ;

Ac-D-Phe-Lys*-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Asp-Thr-NH₂Ac-hArg(Et) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-CysThr-NH₂;

Ac-D-hArg(Et) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂;

Ac-D-hArg (Bu) -Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂;

Ac-D-hArg (Et) ₂ ^-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

Ac-L-hArg (Et) ₂-cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-cys-Thr-NH₂; Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂;

Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-g ly-cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-CysThr-NH₂;

Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-Gly-cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cy3Phe-NH₂;

Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cy3Thr-NHEt;

Ac-L-hArg (CH₂-CF₃) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-cys Thr-NH₂;

Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys (Me) -ThrCys-Thr-NH₂;

180 612

Ac-D-hArg(CH₂CF₃) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys (Me) -ThrCys-Thr-NHEt;

Ac-hArg (CH₃, hexy 1) -Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-CysThr-NH₂;

H-hArg(hexyl₂)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂;

Ac-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNHEt;

Ac-D-hArg (Et) ₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-PheNH₂;

Propionyl-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(iPr)Thr-Cys-Thr-NH₂;

Ac-D-^-Nal-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-GlyhArg(Et)₂-NH₂;

Ac-D-Lys(iPr)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂;

Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-Gly-Cys-Phe-DTrpLys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

Ac-D-hArg (CH₂CF₃) ₂-D-hArg(CH₂CF₃) ₂-Gly-Cys-PheD-Trp-Lys-Thr-cys-Phe-NH₂;

Ac-D-hArg (Et) ₂-D-hArg(Et) ₂-GLy-Cys-Phe-D-Trp-LysThr-Cys-Thr-NH₂;

Ac-Cys-Lys-Asn-4-Cl-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr~PheThr-Ser-D-Cys-NH₂;

Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

Bmp-Tyr~D-Trp-Ly3-Val-Cys-Phe-NH₂;

Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH₂;

Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-j?-Nal-NH₂

H-D-^-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-^-Nal-NH₂;

H-pentafluoro-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-tfal-Cys-ThrNH₂;

Ac-D-0-Nal-Cys-pentafIuoro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cy3Thr-NH₂;

H-D-^-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-^-=Nal-NH₂;

180 612

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-^-Nal-NH₂;

H-d-jS -Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys -Thr-NH₂ ;

H-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂;

Ac-D-p-Cl-Phe-Cy3-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-oys-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Cys-4-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cy3-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH₂;

cyklo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe) ;

cyklo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe);

cyklo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-N-Me-Phe);

cyklo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe);

cyklo (Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe);

cyklo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) ;

cyklo (Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe) ;

cyklo (Pro-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe);

cyklo (Pro-Phe-Trp (F) -Lys-Thr-Phe) ;

cyklo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe) ;

cyklo (Pro-Ph.e-0-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe);

cyklo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-Trp-D-Phe) ;

cyklo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Phe) ;

cyklo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-Lys-D-Trp-D-Phe) ;

cyklo (D-Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr) ;

cyklo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe);

cyklo (Pro-Tyr-D-Trp-4-Aaphe-Thr-Phe) ;

cyklo (Pro-Phe-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe);

cyklo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe);

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba);

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba) ;

cyklo (Asn-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe);

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-NH(CH₂) ₄CO) ;

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-^-Ala) ;

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Glu) -OH;

cyklo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe);

cyklo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly);

cyklo (Phe-Pbe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba);

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lya-Thr-Phe-Gly);

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp (F)-Lys-Thr-Phe-Gaba) ;

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp(NO₂)-Lys-Thr-Phe-Gaba) ;

180 612 cyklo (Asn-Phe-Phe-Trp(Br) -Lys-Thr-Phe-Gaba) ;

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe(I) -Gaba) ;

cyklo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr(But)-Gaba);

cyklo (Bap-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-ThrPro-Cys)-OH;

cyklo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-ThrPro-Cys)-OH;

cyklo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-ThrTpo-Cys)-OH;

cyklo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-ThrMeLeu-Cys)-OH;

cyklo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba);

cyklo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Phe-Gaba);

cykxo tPhe-Phe-D-Trp(5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba);

cy lo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Ac)-Thr-Phe-NH(CH₂)₃-CO) ;

cyklo (Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba);

cyklo (Om-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba) gdzie Lys* wskazuje mostek amidowy utworzony między Lys* a Asp.

Wymienione powyżej związki peptydowe są opisane w poniższych odnośnikach:

Zgłoszenie EP Nr P5164EU; Van Binst, G. i współpr., Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. i współpr., Skrót, „Conformations of Somatostatin Analogs Having Anti-tumor Activity, 22nd European peptide Symposium, September 13-19, 1992, Interlaken, Szwajcaria; Zgłoszenie PCT WO 91/09056 (1991); zgłoszenie EP 0363589A2 (1990); zgłoszenie EP 0203031A2 (1986); patenty USA o nr:

4,904,642; 4,871,717; 4,853,371; 4,725,577; 4,684,620; 4,650,787; 4,603,120; 4,585,755; 4,522,813; 4,486,415; 4,485,101 ;4,435,385; 4,395,403; 4,369,179; 4,360,516; 4,358,439; 4,328,214; 4,316,890; 4,310,518; 4,291,022; 4,238,481; 4,235,886; 4,224,190; 4,211,693; 4,190,648; 4,146,612; and 4,133,782.

W analogach somatostatyny wymienionych powyżej każda reszta aminokwasu ma strukturę NH-C(R)H-CO-, w której R jest łańcuchem bocznym; linie między resztami aminokwasów oznaczają wiązania peptydowe, które łączą aminokwasy. Gdy reszta aminokwasu jest czynna optycznie, to jest konfiguracja formy L, jeśli wyraźnie nie wskazano formy D. Gdy w peptydzie obecne są dwie reszty Cys, to między dwoma ugrupowaniami utworzony jest mostek disiarczkowy. Wiązanie to jednakże nie jest pokazane w wymienionych resztach.

Dodatkowo korzystnymi analogami somatostatyny według wynalazku są analogi o następującym wzorze:

180 612

A₁-A₂-A₃-D-Trp-Lys-A₆-A₇-A_e-R₃

Rz

w którym Ai oznacza izomer D lub L β-Nal, Trp, β-pirydylo-Ala, Phe, podstawiony Phe, lub jest usunięty; a każda z grup A2 i A7 niezależnie oznacza Cys, Asp lub Lys. Ugrupowania te sąniezależnie związane ze sobą albo poprzez mostek disiarczkowy albo poprzez mostek amidowy. Ponadto A3 oznacza β-Nal, Phe lub 0-, m- lub p-podstawiony X-Phe, gdzie X oznacza chlorowiec, OH, NH2, NO2 lub alkil C1.3; Ae oznacza Val, Thr, Ser, Ala, Phe, β-Nal, Abu, Ile, Nie lub Nva; a Ag oznacza Phe, Thr, Tyr, Trp, Ser, β-Nal, grupę alkoholową lub jest usunięty; każdy z Ri i R2 niezależnie oznacza H, niższą grupę acylową lub niższą grupę alkilową; a R3 oznacza OH, NH2 lub jest usunięty. Korzystnie, gdy jeden z podstawników A2 i A₇ oznacza Cys, drugi również oznacza Cys; gdy Ag jest alfa -aminoalkoholem, R3 jest usunięty; a gdy żadna z grup A2 i A7 nie jest Cys, to A2 jest różne od A7.

Szczególnie korzystnymi analogami somatostatyny w tej postaci wynalazku są: Me-D-Phe-Cys- Tyr-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂; H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Abu-Cys- Thr-NH₂; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Nal-NH₂; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-ol.

W innych postaciach liniowe analogi somatostatyny według wynalazku mają następującą strukturę:

A^A^A^D-Trp-Lys-A^A^A^Ra

Rz w której A¹ oznacza izomer D lub L Ala, Leu, Ile, Val, Nie, Thr, Ser, β-Nal, β-pirydylo-Ala, Trp, Phe, 2,4-dichloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe lub o-X-Phe, gdzie X oznacza CH₃, Cl, Br, F, OH, OCH₃ lub NO₂;

A² oznacza Ala, Leu, Ile, Val, Nie, Phe, β-Nal, pirydylo-Ala, Trp, 2,4-dichloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe lub p-X-Phe, gdzie X oznacza CH₃, Cl, Br, F, OH, OCH₃ lub NO₂;

A³ oznacza pirydylo-Ala, Trp, Phe, β-Nal, 2,4-dichloroPhe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe lub p-X-Phe, gdzie X oznacza CH₃, Cl, Br, F, OH, OCH₃ lub NO₂;

A⁶ oznacza Val, Ala, Leu, Ile, Nie, Thr, Abu lub Ser;

A⁷ oznacza Ala, Leu, Ile, Val, Nie, Phe, β-Nal, pirydylo-Ala, Trp, 2,4-dichloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe lub p-X-Phe, gdzie X oznacza CH₃, Cl, Br, OH, OCH₃ lub NO₂;

A⁸ oznacza izomer D lub L Ala, Leu, Ile, Val, Nie, Thr, Ser, Phe, β-Nel, pirydylo-Ala, Trp, 2,4-dichloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe lub o-X-Phe, gdzie X oznacza CH₃, Cl, Br, F, OH, OCH₃ lub NO₂ lub ich alkohole; a

180 612 każdy z Rj i R₂ n iezależnie oznacza H, niższy acyl lub niższy alkil; a R₃ oznacza OH, NH₂lub jest usunięty. Korzystnie co najmniej jedna z grup A¹ i A⁸ i jedna z grup A² i A⁷ musi być aminokwasem aromatycznym; a gdy A⁸ oznacza alkohol, R₃ jest usunięty. Ponadto A¹, A², A⁷, i A⁸nie mogą być wszystkie aminokwasami aromatycznymi. Szczególnie korzystne analogi w tej postaci wynalazku obejmują:

H-D-Phe-p-chloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂;

H-D-Phe-p- NO₂-Phe-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Phe-Thr-NH₂;

H-D-Nal-p-chloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂;

H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂;

H-D-Phe-p-chloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂; i

H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-P-Nal-NH₂.

Peptydy według wynalazku mogą mieć formę dopuszczalnych farmaceutycznie soli.

Przykładami korzystnych soli są sole z dopuszczalnymi terapeutycznie kwasami organicznymi, na przykład kwasem octowym, mlekowym, maleinowym, cytrynowym, jabłkowym, askorbinowym, bursztynowym, benzoesowym, salicylowym, metanosulfonowym, toluenosulfonowym lub pamoesowym, jak również kwasami polimerycznymi, takimi jak kwas garbnikowy lub karboksymetyloceluloza, oraz sole z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwasy chlorowcowodorowe, w tym kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy i kwas fosforowy.

SYNTEZA ZWIĄZKÓW

Obecnie opisane zostaną syntezy związków I, Π i ΠΙ.

W opisie syntez związków według wynalazku zastosowano następujące skróty:

Nal: naftyloalanina (1 lub 2)

Abu: kwas alfa-aminomasłowy

D: prawoskrętny

L: lewoskrętny

HO AC: kwas octowy

BOP: heksafluorofosforan benzotriazol-1 -iloksytris-(dimetyloamino)fosfonium

BOC: tert-butyloksykarbonyl

DCC: dicykloheksylokarbodiimid

EDC: 1 -(3 -dimetyloaminopropylo)-3 -etylokarbodiimid

DEPC: dietylocyjanofosfonian

DMF: dimetyloformamid

CH₂C1₂: dichlorometan

MeOH: metanol

EtOH: etanol

DIEA: N,N-diizopropyloetyloamina

HOBT: 1-hydroksybenzotriazol

HBTU: heksafluorofosforan O-benzotriazol-l-ilo, Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametylouronium

THF: tetrahydrofuran

TFA: kwas trifluorooctowy

Materiały wyjściowe i związki pośrednie do związków I, II i III są dostępne w handlu. Alternatywnie, materiały wyjściowe mogą być łatwo otrzymane sposobami, które są dobrze znane z literatury. Na przykład chemię pochodnych kwasu askorbinowego można znaleźć w J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1220 (1974); Carbohyd.Res., 67:127 (1978); Yakugaku Zasshi, 86:376 (1966); patent USA Nr 4552888; J. Med. Chem., 31:793 (1988); ibid 34:2152 (1991) i 35:1618 (1992). Chemię pochodnych tris można znaleźć w Arch. Biochem. Biophys. 96, 653 (1962), Biochem., 5:467 (1966).

SYNTEZA POCHODNYCH PEPTYDOWYCH

Generalnie sprzęganie związków I, II lub ΠΙ z odpowiednią wolną grupą aminową zabezpieczonego peptydu można osiągnąć dobrze znanymi sposobami, stosowanymi w chemii peptydów (na przykład DCC, DCC-HOBT, DIC-HOBT PPA, EDC-HOBT, DEPT, BOP, HBTU),

180 612 stosując zasadę (na przykład DIEA) w rozpuszczalniku obojętnym (na przykład DMF, THF lub CH₂C1₂, octan etylu lub ich połączenia). Odblokowanie grup zabezpieczających można również przeprowadzić dobrze znanymi sposobami (na przykład usunięcie grupy przez dodanie kwasu lub zasady, TFA, dioksan-HCl, amoniaku, NaOMe, piperydyny). W większości przypadków temperatura reakcji powinna być zawarta w zakresie od -30°C do temperatur)' pokojowej.

Generalnie pierwszy etap syntezy polega na reakcji między epoksydem a wolną grupą aminową zabezpieczonego peptydu; kompleksowanie i odbezpieczenie można przeprowadzić stosując dobrze znane sposoby, takie jak sposoby opisane w McManus i współpr., Synth. Communications 3, 177 (1973). Poniższe syntezy, oczyszczanie związków pośrednich’) produktów można przeprowadzić zwykłymi sposobami, takimi jak chromatografia lub HPLC. Identyfikacja związków może być przeprowadzona zwykłymi technikami, takimi jak NMR, analiza aminokwasów i spektrometria masowa.

Poniższe przykłady ilustruj ąkorzystne sposoby otrzymywania związków według wynalazku.

Przykładl - Synteza pochodnych somatostatyny /syntetyzowano poniższąpochodną somatostatyny, oznaczoną również jako BIM-23118.

^OH

HO O-(CH₂)₃CO-D-Na!-c(Cys-TyrD-Trp-Lys-Val-Cys]-ThrNH₂

Przykład 1.1. Kwas 3-O-(Benzyloksykarbonylometylo)-2,5,6-triacetyloaskorbinowy

Bezwodnik octowy (6 ml) wkroplono do roztworu kwasu 3-0- benzyloksykarbonylometylojaskorbinowego (2,2 g) w pirydynie (30 ml); mieszaninę mieszano następnie przez noc w temperaturze pokojowej. Pirydynę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość, którą następnie rozdzielono między octan etylu i IN HC1. Warstwę octanowąprzemyto IN HC1 a następnie wodą. Po wysuszeniu (MgSO₄) octan etylu odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem; ślady pirydyny i kwasu octowego, które jeszcze pozostały, usunięto przez wielokrotne odparowania razem z toluenem. Uzyskany kwas 3-O-(benzylokśykarbonylo-metylo)-2,5,6-triacetyloaskorbinowy wysuszono pod próżnią, otrzymując jako pozostałość lepki żel (2,4 g). TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/aceton [9:1], R_f-0,52).

Przykład 1.2. Kwas 3-O-(karboksymetylo)-2,5,6-triacetyloaskorbinowy

Zawiesinę Pd-C (100 mg) w wodzie (2 nąl) dodano do roztworu kwasu 3-O-benzyloksykarbonylometylo)- 2,5,6-triacetyloaskorbinowego (2,4 g) w etanolu (30 ml) i zawiesinę wytrząsano w atmosferze wodoru (17 psi) przez sześć godzin. Następnie katalizator usunięto przez odsączenie poprzez warstwę celitu, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując kwas 3-O-(karboksymetylo)-2,5,6-triacetyloaskorbinowy. TLC (żel krzemionkowy: CHC1₃ /MeOH/HOAc [9:1:0,1], R_f=0,2).

Przykład 1.3. Kwas 5, 6-O-izopropyłidenoaskorbinowy

Do szybko mieszanej zawiesiny kwasu askorbinowego (8,0 g) w acetonie (80 ml) dodano chlorek acetylu (0,67 ml) i mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Osad odsączono przez odsączenie, przemyto octanem etylu i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 8,29 g kwasu 5, 6-O-izopropylidenoaskorbinowego w postaci bezbarwnego osadu. TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/MeOH/HOAc [3:1:0,1], R_f=0,54).

Przykład 1.4. Kwas 3-O-(etoksykarbonylopropylo)-5,6- izopropylidenoaskorbinowy

Roztwór kwasu 5,6-izopropylidenoaskorbinowego (2,0 g) w 10 ml DMF wkroplono do zawiesiny NaH (0,44 g 50% dyspersji NaH w oleju mineralnym, przemytej kilka razy heksanem) w 5 ml DMF. Po zakończeniu wydzielania gazu wkroplono roztwór 1,43 ml 4-bromomaślanu etylu w 5 ml DMF i mieszano mieszaninę w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik odpa

180 612 rowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a uzyskaną pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym (55 g), stosując CHCl₃/MeOH (19:1) jako eluent. Odpowiednie fracje połączono i usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując lepką pozostałość, zawierającą kwas 3-O-(etoksy-karbonylopropylo)-5,6-izopropylidenoaskorbinowy (1,1 g).

Przykład 1.5. Kwas 3-0-( karboksypropylo)-5,6-izopropylidenoaskorbinowy.

4,6 nil 2N NaOH dodano do roztworu kwasu 3-O-(etoksykarbonylopropylo)-5,6- izopropylidenoaskorbinowego (1,02 g) w 15 ml EtOH. Po jednej godzinie, większość etanolu usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (10 ml) i zakwaszono rozcieńczonym HC1 (pH 3). Następnie roztwór nasycono NaCl i ekstrahowano kilka razy octanem etylu; połączone ekstrakty wysuszono MgSO₄. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując lepką pozostałość zawierającą kwas 3-O-(karboksypropylo)-5,6-izopropyłidenoaskorbinowy (0,84 g). TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/MeOH/HOAc [5:1:0,1], Rf=0,55).

Przykład 1.6. D - Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂

Roztwór diwęglanu di-tertbutylu (0,36 g) w 10 ml DMF wkroplono do roztworu octanu D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Val-Cys]-Thr-NH₂ (2 g,BIM-23014) w 45 ml DMF. Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość, którą następnie chromatografowano na żelu krzemionkowym (150 g), stosując CHCl₃/MeOH (9:1) jako eluent. Odpowiednie frakcje połączono i usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość zawierającą D-Nal-c[CysTyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂ (1,45 g). TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/MeOH [3:1], Rf=0,52).

Przykład 1.7

OH

HO

O-(CH₂)₃CO-D-Nal-c[Cys-TyrD-Trp-Lys(BOC)-Val-CysFThrNH₂

Do roztworu D-Nal-cyklo-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂ (300 mg), kwasu 3 -O-( karboksypropylo)-5,6-izopropylidenoaskorbinowego (5 6 mg) i HBTU (113 mg) w 5 ml DMF dodano 0,2 ml diizopropyloetyloaminy. Następnie mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc i usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozdzielono między mieszaninę octan etylu/MeOH a nasycony wodny roztwór NaCl, warstwę octanową przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie nasyconym wodnym roztworem NaHCO₃ i wysuszono (MgSO₄). Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddano preparatywnej HPLC, stosując jako rozpuszczalnik rozwijający mieszaninę CHCl₃/MeOH (8:1). Odpowiednią strefę UV-pozytywną wyizolowano i ekstrahowano CHCl₃/MeOH. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując zidentyfikowany powyżej produkt (0,20 g). TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/MeOH [5:1], R_f = 0,54).

Przykład 1.8. Usuwanie grupy BOC

Na pochodną kwasu askorbinowego zawierającąD-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Va1-Cys]-Thr-NH₂ (95 mg) przedstawioną powyżej działano przez 45 minut 25% TFA w CHC1₃. Substancje lotne usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując suchą pozostałość, którą oczyszczono, stosuj ąc kolumnę do HPLC Vydac C_{} 8} i CH₃CN/0,1 % wodny roztwór TFA. Wydajność końcowa wyniosła 90 mg (FAB-MS) (m/e 1341).

Przykład 1.9. Inne postaci

W analogiczny sposób zsyntetyzowano również następujące pochodne somatostatyny:

180 612 _-ΟΗ

HO O-CH₂-CO-D-Nal-c[Cys-TyrD-Trp-Lys-Val-Cys]-ThrNH₂

BIM-23135 ^-OH

HO O-CH₂-CO-D-Phe-c[Cys-TyrD-Trp-Lys-Abu-Cys]-ThrNH₂

BIM-23181 ^-OH

HO O-CH₂-CO-D-Phe-c[Cys-TyrD-Trp-Lys-7hrCys]-Nal-NH₂

BIM-23183

Przykład2 - Synteza BIM-23107

Zsyntetyzowano poniższąpochodnąsomatostatyny, określaną również jako BIM-23107. (AcO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂Przykład 2.1. (AcO-CH^-C-NH-CO-iCH^-CO-D-Nal-cfCys-Tyr-D-TrpLys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂

Do chłodzonego lodem roztworu dioctanu 2-N-(sukcynylo)-amino-2-(acetoksymetylo)-1,3-propanodiolu (83 mg) i HBTU (92 mg) w 2 ml DMF dodano 0,03 ml DIEA. Mieszano w 0-5°C przez 30 minut, po czym dodano roztwór D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-ValCys]-Thr-NH₂ (100 mg) w 2ml DMF, zawierający 0,03 ml DIEA. Mieszaninę mieszano najpierw w 0-5°C przez 1 h, a następnie w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując suchą pozostałość, którą rozdzielono między octan etylu i wodny nasycony roztwór NaCl, a warstwę octanową przemyto 5% wodnym roztworem NaHCO₃ i na końcu nasyconym wodnym roztworem NaCl; uzyskany roztwór wysuszono, stosując MgSO₄. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość zawierającą (AcO-CH^-C-NH-CO-^^-CO-D-Nal-ctCys^ (0,14 g). TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/MeOH/HOAc [4:1:0,1], Rf=0,82).

180 612

Przykład 2.2. Usuwanie grupy BOC

Na 30 mg powyżej zidentyfikowanego związku działano przez 45 minut w temperaturze pokojowej 50% TFA w CHC1₃, następnie substancje lotne usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość. Ślady TFA odparowano kilkakrotnie razem z etanolem, a pozostałość roztarto z eterem i wysuszono, otrzymując 30 mg produktu (30 mg). TLC (żel krzemionkowy: CHCl₃/MeOH/HOAc [3:1:1], R_f= 0,24).

Przykład 2.3. Inne postaci

W analogiczny sposób zsyntetyzowano następujące pochodne somatostatyny.

(HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂ -CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂

BIM-23158 (HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂ -CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂

BIM-23167 (HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂ -CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂

BIM-23173 (HO-CH₂)₃-C-NH-CO-CH₂ -CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂

BIM-23179 (HO-CH₂)₃-C-NH-CH₂-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂

BIM-23182

Przykład3 - Synteza BIM-23021

Zsyntetyzowano również poniższą pochodną somatostatyny, określaną również jako BIM-23201.

(HO-CH₂)₃-C-CH₂ -D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂

Przykład 3.1. (HO-CH₂)₃-C-CH₂ -D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-ThrCys]-Nal-NH₂

Do roztworu D-Phe-c[Cys-Tyr(OBt)-D-Trp-Lys(BOC)-Thr(OBt)-Cys]-Nal-NH₂ (250 mg) i tris(acetoksymetylo)acetaldehydu (120 mg), otrzymanego przez utlenianie triacetylopentaerytrytolu dichromianem pirydynium lub układem DMS/chlorek oksalilu/trietyloamina) w metanolu (10 ml), zawierającego 10% kwas octowy dodano dwa gramy sit molekularnych 3 A, a następnie porcjami w odstępach 15-minutowych NaCNBH₃ (36 mg). Mieszaninę mieszano następnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej i ogrzewano przez 4 h. Po odsączeniu pozostałość rozdzielono między octan etylu i wodę. Warstwę octanową przemyto wodą następnie wodnym roztworem NaHCO₃ i wysuszono (MgSO₄). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość (0,4 g), którą następnie rozpuszczono w metanolu (5 ml), podziałano roztworem NaOMe/MeOH (pH 10), mieszano przez 1 h i na końcu zobojętniono IN HC1 do pH 5-6. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość rozpuszczono w 90% wodnym roztworze TFA (5 ml) i mieszano przez 30 minut. Substancje lotne usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a ślady TFA i wody z pozostałości usunięto przez odparowane razem z etanolem (2x). Pozostałość wysuszono, następnie roztarto z eterem i na końcu oczyszczono przez HPLC, stosując warunki podobne jak opisane wcześniej, otrzymując 41 mg (HO-CH₂)₃C-CH₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂ w postaci bezbarwnego osadu. MS (m/e) 1262,8.

180 612

Przykład 3.2. Inne postaci

W analogiczny sposób zsyntetyzowano następującą pochodną somatostatyny określaną również jako BIM-23195.

(HO-CH₂)₃-C-CH₂ -D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂

BIM-23195

Przykład4 - Synteza BIM-23197

Zsyntetyzowano również poniższąpochodnąsomatostatyny, określaną jako BIM-23197.

(HO-CH₂)₂-N N-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂

Przykład 4.1. Chlorek2-bromoetanosulfonylu

Na 2-bromoetanosulfonian sodu (4,0 g) podziałano PC1₅(11,8 g), chłodząc w łaźni lodowej . Po osiągnięciu fazy ciekłej roztwór ogrzewano w oleju w temperaturze 90-120°C przez 1,5 h, ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do 50 g pokruszonego lodu, po czym mieszano przez 15 min. Mieszaninę ekstrahowano CH₂C1₂ (3 x 30 ml), a połączone ekstrakty przemyto H₂O (2 x), 5% NaHCO₃ (2 x) i ponownie H₂O (2 x). Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄ i destylacji pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano chlorek 2-bromoetanosulfonylu w postaci bezbarwnej cieczy (1,95 g, 42-24°C/l mm Hg).

Przykład 4.2. Br-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(BOC)-AbuCys]-Thr(tBu)-NH(l -cyklopropylo- l-metylo)etyl

Roztwór chlorku 2-bromoetanosulfonylu (30 mg) w DMF (1 ml) wkroplono do roztworu H-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(BOC)-Abu-Cys]-Thr(tBu)-(l-cyklopropylo-l-metylo)etyl (150 mg) i DIEA (55 mg) w DMF (2 ml) w atmosferze N₂ w 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0-5°C przez 3 godziny, następnie usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto 5% kwasem cytrynowym (2 x), 5% NaHCO₃ (2 x) i solanką (2 x). Następnie roztwór wysuszono nad bezwodnym MgSO₄, odsączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono dalej na krótkiej kolumnie z żelem krzemionkowym, eluowanej octanem etylu. Frakcje zawierające produkt połączono i usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 105 mg Br-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(BOC)-Abu-Cys]-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropylo-l-metylo)etylu w postaci jasnożółtego osadu. (Żel krzemionkowy, CHCl₃/MeOH/HOAc [9:1:1], R_f =0,36).

Przykład 4.3.

HO(CH₂)₂-N N-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(BOC)-AbuCys]-Thr(tBu)-NH( 1 -cyklopropylo-1 -metylo)etyl

RoztwórBr-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(BOC)-AbuCys]-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropylo-1-metylo)etylu (100 mg) i 2-hydroksyetylopiperazyny (55 mg) w 2 ml 1 -propanolu ogrzewano do wrzenia pod N₂ przez 2,5 h. Następnie roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie pozostałość rozpuszczono w octanie etylu zawierającym 5% MeOH i przemyto solanką(3 x). Na końcu roztwór wysuszono nad bezwodnym MgSO₄, odsączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 110 mg zidentyfikowanego powyżej osadu. Związek ten bez dalszego oczyszczania użyto bezpośrednio do następnego etapu.

Przykład 4.4.

HO(CH₂)₂-N N-(CH₂)₂- SO₂-D-Phe-c [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys] -Thr-NH₂

180 612

110 mg zabezpieczonej pochodnej somatostatyny otrzymanej w poprzednim etapie rozpuszczono w 10 ml 90% wodnego roztworu TFA i mieszano w temperaturze pokojowej pod N₂przez jednągodzinę. TFA i H₂O usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, apozostałość roztarto z zimnym eterem (3 x 10 ml). Otrzymano jasnożółty osad, który dalej oczyszczano napreparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, eiuując: 1) wodnym roztworem NH₄OAc i 2) wodnym roztworem HOAc. Po liofilizacji połączonych frakcji zawierających powyżej zidentyfikowany produkt otrzymano biały osad. (18 mg. ESI-MS, ((m+l)/e) 1252,7).

Przykład 4.5. Inne postaci

W analogiczny sposób zsyntetyzowano również poniższe pochodne somatostatyny:

HO(CH₂)₂-N N-(CH₂)-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂ \BIM-23190

HO(CH₂)₂-N N-(CH₂)-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂

BIM-23191 (HOCH₂)₃NH-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂

BIM-23196

HO-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-N ^N-(CH₂)-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]

-Thr-NH₂ \/

BIM-23202

Wyniki badań peptydów testowych

Przykład 5. Badanie wiązania

W celu wykazania powinowactwa wiązania analogów somatostatyny (SRIF) do receptora somatostatyny oczyszczone związki opisane powyżej testowano w próbach wiązania somatostatyny, polegających na pomiarze in vitro hamowania wiązania [ ¹²⁵I-Tyr¹¹]SRIF-14 do membran trzustkowych szczura AR42J. Jak wskazano w tabeli I, oczyszczone analogi somatostatyny według wynalazku wykazują silne powinowactwa wiązania do tych receptorów. Ponadto w tabeli przestawiono dla każdej pochodnej somatostatyny ciężar cząsteczkowy, oznaczony za pomocą spektrometrii masowej i oszacowany ze struktury cząsteczkowej.

Przykład 6. Próba hamowania hormonu wzrostu (GH)

Grupom po pięć szczurów samców Sprague-Dawley (każdy o wadze 250-300 g) wstrzykiwano s.c. pochodną somatostatyny lub solankę. Trzydzieści minut po wybranych okresach po podaniu leku przedstawionych w tabeli II (2 godziny, 4 godziny, 6 godzin, 8 godzin) szczury usypiano podanym i.p. nembutałem (50 mg/kg). Piętnaście minut po uśpieniu pobierano próbki krwi przez punkcję sercową wobec heparyny w celu zmierzenia podstawowego GH. Ponadto podawano iniekcje s.c. D-Ala²-GRF (10 μ/kg). Piętnaście minut później pobierano krew w celu oznaczenia ilościowego stymulowanego GH, który mierzono w osoczu, stosując test radioimmunologiczny dostarczony przez NIADDKD. Procent hamowania GH obliczono z różnic uzyskanych między wartościami GH podstawowego i stymulowanego.

Tabela II pokazuje wpływ różnych oczyszczonych analogów somatostatyny w funkcji czasu. Efektywność D-Phe-c[Cys-Tyr -D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂ (BIM-23060) w hamowaniu hormonu wzrostu u szczurów porównano z innymi pochodnymi somatostatyny według wynalazku (BIM-23167, BIM-23179 i BIM-23181). Wszystkie pochodne wykazały zaskakująco przedłużony czas działania, które słabnie w sposób zależny od czasu.

W celu oznaczenia ED₅₀ (to jest stężenia każdego ze związków, wymaganego do hamowania w 50 procentach uwalniania hormonu wzrostu po określonym czasie) przeprowadzono

180 612 dodatkowe eksperymenty z analogiem somatostatyny D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-AbuCys]-Thr-NH₂, BIM-23190, BIM-23195 i BIM-23197. Eksperymenty prowadzono w zakresie dawek między 25pg/kg a 0,25 μ/kg. Tabela ΠΙ przedstawia nieoczekiwane ulepszenie pochodnych somatostatyny w stosunku do peptydu niezmodyfikowanego w różnych przedziałach czasowych, wskazując na zależne od czasu hamowanie stymulowanego uwalniania GH przez związki według wynalazku.

Przykład 7. Próbaantyproliferacyjna

Opisane powyżej oczyszczone analogi somatostatyny testowano również na czynność w stosunku do gwałtownie proliferujących komórek. Tabela IV przedstawia wpływ tych peptydów na wzrost szczurzych komórek raka trzustki AR42L. Inaczej niż naturalna somatostatyna, pochodne według wynalazku wykazują znaczną czynność antyproliferacyjną, jak wynika z fig. 1, zarówno BIM-23014C (analog somatostatyny) jak i BIM-23118 (pochodna BIM-23014) hamują wzrost szczurzych komórek raka trzustki AR42J w sposób zależny od stężenia, przy czym BIM-23118 jest bardziej z tych dwu związków efektywny. Oba związki hamują wzrost komórek nowotworowych w większym stopniu niż niemodyfikowane analogi somatostatyny w równorzędnych stężeniach.

SPOSOBY STOSOWANIA

Pochodne peptydów według wynalazku mogąbyć podawane ssakowi, zwłaszcza człowiekowi, na jeden z tradycyjnych sposobów (na przykład doustnie, pozajelitowe, transdermalnie lub przezśluzówkowo), w postaci preparatu o przedłużonym działaniu przy użyciu biodegradowalnego, biokompatybilnego polimeru lub przez dostarczenie domiejscowe (na przykład w przypadku przeciwnowotworowych pochodnych bombezyny lub somatostatyny do płuc) przy użyciu miceli, żeli i liposomów. Dawki są generalnie te same jak obecnie stosowane dawki peptydów terapeutycznych dla ludzi.

Dodatkowo pochodne peptydowe według wynalazku są odpowiednie do ulepszonego leczenia chorób, które są podatne na leczenie za pomocą odpowiednich peptydów niezmodyfikowanych. W szczególności opisane powyżej pochodne somatostatyny są odpowiednie do leczenia raka, akromegalii, zapalenia trzustki, proliferacji indukowanej urazem, cukrzycy, retinopatii cukrzycowej, restenozy po angioplastyce, AIDS, neurogennych stanów zapalnych, artretyzmu i problemów żołądkowo-jelitowych, w tym biegunki.

TABELA I

POWINOWACTWA IN VITRO I CIĘŻARY CZĄSTECZKOWE PEPTYDÓW POCHODNYCH SOMATOSTATYNY

	MWtest	MWobl	ICsonM		MW_w	MWobl	IC₅₀nM
SRIF - 14	-	-	0.17	BIM-23182	1193.8	1193.42	0.12
SRIF - 28	-	-	0.23	BIM-23183	1323.0	1322.49	0.22
BIM- 23107	1340.4	1340.40	0.30	BIM-23190	1202.8	1202.47	0.20
BIM-23118	1313.5	1313.52	0.30	BIM-23191	1314.9	1314.61	0.08
BIM-23135	1426.2	1426.64	2.52	BIM-23195	1150.8	1150.39	0.08
BIM-23158	1299.6	1299.54	0.33	BIM-23196	1243.7	1243.50	0.09
BIM-23167	1347.6	1347.55	0.09	BIM-23197	1252.7	1252.55	0.29
BIM-23173	1235.5	1235.46	0.11	BIM-23201	1262.8	1262.53	0.14
BIM-23179	1305.9	1305.55	0.12	BIM - 23202	1247.0	1246.53	0.18
BIM-23181	1435.0	1434.62	0.25

180 612

T A B E L A II HAMOWANIE STYMULOWANEGO UWALNIANIA HORMONU WZROSTU U SZCZURÓW

PRZEZ POCHODNE PEPTYDU SOMATOSTATYNY __________HAMOWANIE (PROCENT KONTROLI) 25 μ/KG_________

	2 Godz.	4 Godz.	6 Godz.	8 Godz.
BIM- 23060	86.39	64.96	47.62	38.15
BIM-23167	92.67	79.54	59.72	50.14
BIM-23179	92.79	63.85	67.78	68.26
BIM-23181	99.24	77.07	60.56	56.12

TABELA III

HAMOWANIE STYMULOWANEGO UWALNIANIA HORMONU WZROSTU U SZCZURÓW PRZEZ POCHODNE PEPTYDU SOMATOSTATYNY PODAWANE S.C.

ED 50 (pg/kg)

	2 Godz.	4 Godz.	6 Godz.	8 Godz.
BIM- 23023	0.48	1.11	2.26	4.32
BIM-23190	0.68	0.57	0.76	1.04
BIM-23195	1.19	3.13	2.08	3.23
BIM-23197	1.01	0.59	1.14	1.59

TABELA IV

CZYNNOŚĆ ANTYPROLIFERACYJNA POCHODNYCH PEPTYDU SOMATOSTATYNY

WZROST KOMÓREK (PROCENT KONTROLI)¹
SRIF - 14	91.3	BIM-23167	60.2
SRIF - 28	98.0	BIM-23173	67.9
BIM -23014 C	74.1	BIM-23181	69.1
BIM -23107	67.5	BIM-23182	68.7
BIM-23109	72.1	BIM -23183	69.1
BIM-23118	61.0	BIM-23195	69.2
BIM-23135	62.9	BIM-23197	66.4

Stężenie 100 nM, szczurze komórki raka trzustki AR42J po 8 dniach.

180 612

Wpływ analogów somastatyny na proliferacje szczurzych komórek raka trzustki AR42J

Wzrost komórek (procent kontroli)

Steżenie (nM)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodna peptydu, zawierająca ugrupowanie peptydu stanowiące somatostatynę lub jej analogi, i co najmniej jeden podstawnik, przyłączony do ugrupowania peptydu; przy czym podstawnik ten wybrany jest z grupy zawierającej związki I, II i IH, przy czym związkiem I jest związek o wzorze:

w którym:

każdy z R] i R₂ oznacza niezależnie H lub CH(OH)CH₂OH, jeden z R₃ lub R₄ oznacza (CH₂)_nR₁₂, gdzie R₁₂ oznacza CO, a n jest liczbą całkowitą między 1 a 5, włącznie; zaś pozostałe R₃ lub R4 oznacza H lub hydroksyalkil C_rC₆, a związek II jest związkiem o wzorze:

r₁₃-o-ch₂

R₁₄-O-CH₂-C- (CH₂) _m-Ri6-Ri7- (CH₂) _n-Ri8

R15-O-CH₂ w którym:

każdy z podstawników R_]3, R₁₄ i R₁₅ niezależnie oznacza H lub acyl C₂-C₂₄;

R₁₆ oznacza NH lub jest nieobecny;

R_i7 oznacza CO lub jest nieobecny;

R₁₈ oznacza CO, CH₂, SO₂ lub jest nieobecny;

m oznacza liczbę całkowitą między 1 a 5, włącznie;

n oznacza liczbę całkowitąmiędzy 0 a 5, włącznie, zaś związek ΙΠ jest związkiem o wzorze: (OhU

R₁₉ - R₂₀ - R₂i - N N - (CH₂)p - (CH₂)q - R₂₆(CH^n w którym:

R_]9 oznacza H, OH lub hydroksyalkil Cj-C₆;

R₂₀ oznacza O lub jest nieobecny;

R₂₁ oznacza alkil Ćj-C₆;

R₂₆ oznacza SO₂ lub CO;

m oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie;

n oznacza liczbę całkowitą między 0 a 5, włącznie;

p oznacza liczbę całkowitąmiędzy 0 a 5, włącznie; a q oznacza liczbę całkowitąmiędzy 0 a 5, włącznie;

180 612 gdzie ugrupowanie peptydu jest przyłączone do każdego z wymienionych podstawników poprzez wiązanie CO-N, CH2-N lub SO2-N między podstawnikiem a atomem azotu N-końca lub dowolną grupą aminową łańcucha bocznego ugrupowania peptydowego.
2. Pochodna peptydu według zastrz. 1, w której podstawnikiem jest związek I.
3. Pochodna peptydu według zastrz. 1, w której podstawnikiem jest związek II.
4. Pochodna peptydu według zastrz. 3, w której R₁₈ oznacza CH₂ lub SO₂.
5. Pochodna peptydu według zastrz. 4, w której R₁₃, R₁₄ i R₁₅ oznaczająH, a R₁₇ jest nieobecny.
6. Pochodna peptydu według zastrz. 5, w której wspomnianym podstawnikiem jest (HOCH₂)₃C-NH-(CH)₂-SO₂ lub (HOCH₂)₃C-CH₂.
7. Pochodna peptydu według zastrz. 1, w której wspomnianym podstawnikiem jest związek ΠΙ.
8. Pochodna peptydu według zastrz. 1, w której wspomnianym podstawnikiem jest jeden z następujących podstawników:

HO(CH2)2 -N N - (CH2)2COHO(CH₂)2-N N-(CH₂)2SO₂-
9. Pochodna peptydu według zastrz. 1, w której wspomnianym analogiem somatostatyny jest jeden z:

H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂,H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Thr-Cys]-Nal-NH₂ i H-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Val-Cys]-Thr-NH₂.
10. Pochodna peptydu według zastrz. 1, w której wspomnianąpochodnąpeptydujest jedna z:

HO(CH2)2~N N— (CH2)CO-D-Phe-c(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2 i

HO(CH₂)2-N^/ N - (CH2)2SO2 -D-Phe-c(Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Abu-Cys)-Thr-NH2 * * *