CZ292586B6

CZ292586B6 - Somatostatinový nebo bombesidový derivát a jejich použití

Info

Publication number: CZ292586B6
Application number: CZ1996390A
Authority: CZ
Inventors: Sun Hyuk Kim; Zheng Xin Dong; John E. Taylor; Sylviane Moreau; Susan Riley Keyes
Original assignee: Societe De Conseils De Recherches Et D´Application
Priority date: 1993-08-09
Filing date: 1994-08-08
Publication date: 2003-10-15
Also published as: RO117259B1; ATE284413T1; RU2133252C1; LT96025A; HUT73491A; SI0788509T1; DE69432758T2; GEP20002146B; ES2309131T3; ATE241643T1; US5552520A; MD1591B2; EP0788509A4; PT1288223E; ZA945966B; PT788509E; KR100325972B1; JP2005015488A; LV11549A; SI9420051A

Abstract

Jsou popsány somatostatinové nebo bombesinové peptidové deriváty, které obsahují jeden nebo více substituentů obecného vzorce III, které jsou odděleně napojeny amidovou, aminovou nebo sulfonamidovou vazbou na aminovou skupinu buď N-konce nebo postranního řetězce biologicky aktivní peptidové části. Tyto peptidové deriváty mají relativně zvýšenou biologickou aktivitu při srovnání s odpovídajícím samotným peptidem.ŕ

Description

Somatostatinový nebo bombesinový derivát a jejich použití

Oblast techniky

Tento vynález se týká terapeutických somatostatinových nebo bombesinových peptidových derivátů a způsobu jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Byly dělány pokusy prodloužit aktivitu biologicky aktivních peptidů. Peptidy byly například modifikovány chemicky syntetickým přidáním cukerných skupin, aby se zvýšila doba, během níž jsou peptidy aktivní (Sandoz: spis WO 88/02756, Sandoz: spis WO 89/09786, SRN patent 3910667 Al, evropská patentová přihláška číslo 0 374 089 A2 (1990) a Breipohl: USA patent č. 4 861 755 (1989).). Pro zvýšení životnosti peptidu se používá také přidání kationtových zakotvení (evropská patentová přihláška 0 363 589 A2 (1990).) a lipidních skupin (Whittaker: spis WO 91/09837, Jung: USA patent č. 4 837 303 (1989).).

Podstata vynálezu

Obecně tento vynález poskytuje deriváty biologicky aktivních somatostatinových nebo bombesinových peptidů, které obsahují jeden nebo více substituentů odděleně navázaných na aminovou skupinu umístěnou na N-konci nebo na postranním řetězci peptidové skupiny. V této modifikované formě mají tyto deriváty vyšší a prodlouženější biologickou aktivitu při srovnání s odpovídajícími nemodifikovanými peptidy.

Peptidové deriváty jsou výhodné v tom, že nejsou drahé, jsou vysoce biokompatibilní, chybí jim škodlivé vedlejší účinky a jsou slučitelné s různými formami terapeutického podávání. Zvláště pak mnoho derivátů, které mají jako peptidovou část somatostatin, mají značně zlepšenou účinnost a selektivitu při srovnání s nemodifikovaným somatostatinem.

V jednom aspektu se tento vynález týká peptidového derivátu, který obsahuje biologicky aktivní peptidovou část a alespoň jeden substituent připojený na peptidovou skupinu, tento substituent je sloučenina obecného vzorce ΙΠ (CH₂)_mR19-R20^_R21“R22^_R23R24^_(CH2)p-R25‘(CH2)q-R26 (ΠΙ), (CH2)_n kde

R19 znamená atom vodíku, skupinu NH2, aromatickou funkční skupinu, skupinu OH, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu H(R₂7)(R2s), skupinu SO3H nebo není přítomna, přičemž R₂7 a R28 nezávisle na sobě znamenají atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

R20 znamená atom kyslíku nebo není přítomna,

R21 znamená atom dusíku, skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo není přítomna,

-1 CZ 292586 B6

R22 znamená atom dusíku, skupinu CH, atom kyslíku nebo atom uhlíku,

-R23- znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo není přítomna,

R₂4 znamená atom dusíku, skupinu CH nebo atom uhlíku,

R₂₅ znamená skupinu NH, atom kyslíku nebo není přítomna,

R₂6 znamená skupinu SO₂, CO, CH₂ nebo není přítomna, m znamená číslo mezi 0 a 5 včetně, n znamená číslo mezi 0 a 5 včetně, p znamená číslo mezi 0 a 5 včetně a q znamená číslo mezi 0 a 5 včetně.

Ve sloučenině obecného vzorce ΙΠ je peptidová část připojena ke každému substituentu vazbou CO-N, CHr-N nebo SO₂-N mezi substituentem a atomem dusíku N-konce nebo postranního řetězce uvedené peptidové skupiny.

Ve výhodných provedeních -R₂3- znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, R₂₂znamená atom dusíku, atom uhlíku nebo skupinu CH a R₂₄ znamená atom uhlíku. Nebo R₂₂znamená atom kyslíku, Ri₉, R₂₀, R₂i a -R₂3- nejsou přítomny a součet m + n znamená číslo 3, 4 nebo 5.

V ještě jiných provedeních podle vynálezu substituent znamená sloučeninu obecného vzorce ΙΠ, v tomto provedení -R23- není přítomna a alespoň jedna ze skupin R₂₂ a R₂₄ znamená atom dusíku. Také může jak R₂₂ tak R₂₄ znamenat atom dusíku.

V jiném provedení substituent znamená jednu ze skupinu:

HO(CM2)2“N^- (CH₂)COa

HO(CH₂)₂ - NJM - (CH₂)₂SO₂-.

Peptidová skupina je s výhodou vybrána ze skupiny sestávající ze somatostatinu, bombesinu, kalcitoninu, peptidu souvisejícího s kalcitoninovým genem (CRGP), amylinu, parathyroidního hormonu (PTH), peptidu uvolňujícího gastrin (GRP), hormonu stimulující melanocyty (MSH), adrenokortikotropního hormonu (ACTH), peptidu souvisejícího s příštitným tělískem (PTHrP), hormonu uvolňujícího luteinizační hormon (LHRH), faktoru uvolňujícího růstový hormon (GHRF), peptidu uvolňujícího růstový hormon (GHRP), cholecystokininu (CCk), glukagonu, gradykininu, peptidu podobného glukagonu (GLP), gastrinu, enkefalinu, neoromedinu, endothelinu, látky P, neuropeptidu Y (NPY), peptidu ΥΎ (ΡΥΎ), vazoaktivního intestinálního peptidu (VIP), guanylinu, polypeptidu aktivujícího hypofýzovou adenylcyklázu (PACAP), betabuněčného tropinu, adrenomedulinu a jejich derivátů, fragmentů a analogů.

Peptidová skupina s výhodou znamená somatostatin nebo jeho derivát, fragment nebo analog. Nej výhodnějším somatostatinovým analogem je jedna z následujících sloučenin: H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂, H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal

-2CZ 292586 B6

NH₂ a H-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂. Peptidovým zbytkem je s výhodou také bombesin nebo jeho derivát, fragment nebo analog.

V ještě jiných výhodných provedeních je peptidovým derivátem jedna ze sloučenin:

HÓ(CH₂)₂-NN-(CH₂)CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cýs]-Thr-NH₂,

U—z a

r\

HO(CH₂)2-NN-(CH2)SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂. W

V jiném aspektu tento vynález poskytuje dimemí peptidový derivát obsahující dvě biologicky aktivní peptidové skupiny a alespoň jeden substituent napojený na každou peptidovou skupinu. Substituent je sloučenina obecného vzorce V, který je generickým strukturním ekvivalentem sloučeniny obecného vzorce ΙΠ. V dimeru je každá peptidová skupina připojena na substituenty vazbou CO-N, CH₂-N nebo SO₂-N mezi substituentem a atomem dusíku na N-konci nebo na postranním řetězci jedné z peptidových skupin.

V ještě jiném aspektu tento vynález poskytuje způsob léčení onemocnění jako je rakovina, pacienta. Tento způsob zahrnuje stupeň podávání terapeutického množství zde popsaných peptidových derivátů pacientovi. Ve vhodných provedeních se při léčení jako peptidová část používá somatostatin.

Pojem „biologicky aktivní“ tak, jak se zde používá, znamená přirozeně se vyskytující, rekombinantní a syntetický peptid, který má fyziologickou nebo terapeutickou aktivitu. Obecně tento pojem zahrnuje všechny deriváty, fragmenty a analogy biologicky aktivních peptidů, které vykazují kvalitativně podobný nebo opačný účinek při srovnání s účinkem nemodifikovaného peptidu. Obrázek 1 je graf dvou růstových křivek buněk AR42J v přítomnosti různých somatostatinových derivátů.

V další části tohoto spisu budou popsána výhodná provedení. Nejdříve budou popsány peptidové deriváty.

Peptidové deriváty podle vynálezu obecně obsahují dvě oddělené složky: 1) biologicky aktivní peptid a 2) alespoň jeden substituent, který má strukturu sloučeniny obecného vzorce ΙΠ. Peptidové deriváty vyrobené podle způsobů zde popsaných zahrnují následující tři skupiny sloučenin:

Deriváty odvozené od sloučeniny obecného vzorce ΠΙ (CH₂)_m ^r19“^r20-H21“R22-^r23 R24-(CH₂)p-R₂5-(CH₂)_q-R₂6 (III), (CH₂)_n v němž R19, R₂₀, R₂i, R₂₂, R₂3, R₂₄, R₂s, R₂6, m, n, p a NH-P' znamená jak shora uvedeno.

Vedle shora uvedených struktur sloučeniny vyrobené podle vynálezu obsahují peptidové deriváty obsahující dva nebo více substituentů připojených na jednu peptidovou skupinu. Tato provedení podle vynálezu jsou deriváty biologicky aktivních peptidů, které mají více než jednu volnou aminovou skupinu, např. zbytek lysinu.

-3CZ 292586 B6

Tento vynález také poskytuje dimemí peptidové deriváty obsahující dvě peptidové skupiny navázané na jediný substituent, např. dva bradykinové analogy navázané na substituent sloučeniny obecného vzorce V.

Peptidové deriváty podle vynálezu jsou deriváty biologicky aktivních peptidů, které jsou vybrány ze skupiny sestávající ze somatostatinu, bombesinu, kalcitoninu, peptidu souvisejícího s kalcitoninovým genem (CRGP), amylinu, parathyroidního hormonu (PTH), peptidu uvolňujícího gastrin (GRP), hormonu stimulujícího melanocyty (MSH), adrenokortikotropního hormonu (ACTH), peptidu souvisejícího s pří štítným tělískem (PTHrP), hormonu uvolňujícího luteinizační hormon (LHRH), faktoru uvolňujícího růstový hormon (GHRF), peptidu uvolňujícího růstový hormon (GHRP), cholecystokininu (CCK), glukagonu, bradykininu, peptidu podobného glukagonu (GLP), gastrinu, enkefalinu, neuromedinů, endothelinu, látky P, neuropeptidu Y (NPY), peptidu YY (PYY), vazoaktivního intestinálního peptidu (VIP), guanylinu, polypeptidu aktivujícího hypofýzovou adenylcyklázu (PACAP), betabuněčného tropinu, adrenomedulinu a jejich derivátů, fragmentů a analogů.

Ve zvláště výhodných provedeních peptidová skupina znamená somatostatin nebo derivát, fragment nebo analog somatostatinu. Mezi somatostatinové analogy, která se mohou používat podle tohoto vynálezu, patří, ale nejsou na ně omezeny, následující sloučeniny:

H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr, H-Gly-Pen-Peh-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr, H-Phe-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr, H-Phe-Pen-peh-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-Thr-NH₂, H-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-Trp-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-Phe-Lys*-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Asp-Thr-NH₂, Ac-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cas-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Bu)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-L-hArg(Et)₂-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Trh-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-€ys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt,

-4CZ 292586 B6

Ac-L-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂,

Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NH₂,

Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NHEt, Ac-hArg(CH₃,hexyl)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-hArg(hexyl)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Trh-Cys-Thr-NHEt, Ac-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH₂, propionyl-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(iPr)-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-Nal-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Gly-hArg(Et)₂-NH₂, Ac-D-Lys(iPr)_Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-D-dArg(Et)₂-GIy-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-Cys-Lys-Asn-4-Cl-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-NH₂, BmjJ-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-Thr-NH₂,

Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-Phe-NH₂, Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH₂, Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-Nal-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Nasl-NH₂, H-pentafluor-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-Nal-Cys-pentafluor-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH₂,

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-T rp-Lys-V al-Cys-Nal-NH₂,

H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr~NH₂, Ac-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-TrP-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-p-Cl-Phe-Cys-Trp-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-phe-Cys-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂,

H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH₂, cyklo(Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-N-Me-Phe), cyklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-L·-Trp-Lys-Trh-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-Trp(E)-Lys-Thr-Phe),

-5CZ 292586 B6 cyklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe), cyklo(D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-Trp-D-Phe), cyklo(D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Phe), cyklo(D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-Lys-D-Trp-D-Phe), cyklo(D-Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr), cyklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-lys-Val-Phe), cyklo(Pro-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe), cyklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba), cyklo(Asn-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-NH(CH₂)4CO, cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-lys-Thr-Phe-Ala), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-lys-Thr-Phe-D-Glu)-OH, cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Trh-Phe), cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly), cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp(NO₂)-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-Trp(Br)-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe(I)Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr(But)-Gaba), cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Trp-Pro-Cys)-OH, cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Trp-Pro-Cysý-OH, cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Trp-Tpo-Cys)-OH, cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Trp-MeLeu-Cys)-OH, cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Thr-Phe-Phe-Gaba), cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Thr-Phe-D-Phe-Gaba), cyklo(Phe-Phe-D-Trp(5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Ac)-Thr-Phe-NH-(CH₂)₃CO), cyklo(Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba) a cyklo(Om-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), kde Lys* znamená amidový můstek vytvořený mezi Lys* a Asp.

Peptidové sloučeniny, jejichž seznam je shora uveden, jsou popsány v následujících odkazech, které jsou zde zahrnuty jako citace: evropská patentová přihláška P5 164 EU, Van Binst G. A spol.: Peptide Research 5, 8 (1992), Horvath A. a spol.: Abstrakt „Conformation of Somatostatin Analogs Having AntiTumor Activity“, 22. evropské peptidové symposium, 13. až 19. září 1992, Interlaken, Švýcarsko, PCT přihláška WO 91/09056 (1991), evropská patentová přihláška 0 363 589 A2 (1990) a 0 203 031 A2 (1986), US patenty č. 4 904 642, 4 871 717, 4 853 371, č. 4 725, 577, 4 684 620, 4 650 787, 4 603 120, 4 585 755 číslo 4 522 813, 4 486 415, 4 485 101, 4 435 385, 4 395 403, číslo 4 369 179, 4 360 516, 4 358 439, 4 328 214, 4 316 890, číslo

-6CZ 292586 B6

310 518, 4 291 022, 4 238 481, 4 235 886, 4 224 190, číslo 4 211 693, 4 190 648, 4 146 612 a 4 133 782.

Každý zbytek aminokyseliny shora uvedených somatostatinových analogů má strukturu obecného vzorce NH-C(R)H-CO-, v němž R znamená postranní řetězec. Čárky mezi zbytky aminokyselin představují peptidové vazby, které spojují aminokyseliny. Jestliže je zbytek aminokyseliny opticky aktivní, má L-konfíguraci, pokud není výslovně uvedena D-forma. Jestliže jsou v peptidu přítomny dva zbytky Cys, tvoří se mezi těmito zbytky disulfídový můstek. Tato vazba však není uváděna v seznamu zbytků.

Dalšími výhodnými somatostatinovými analogy podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce ^Ri /

Aj-A2-A3-D-Trp-Lys-A6-A7-A8-R3, /

»2 v němž A] znamená D- nebo L-formu -Nal, Trp, -pyridyl-Ala-Phe, substituovaného Phe nebo je vynechána a A₂ a A₇ nezávisle na sobě znamenají Cys, Asp nebo Lys. Tyto skupiny jsou navzájem kovalentně svázány disulfídovým můstkem nebo amidovým můstkem. Z dalších pak A₃ znamená - Nal, Phe nebo o-, m- nebo -substituovaný X-Phe, kde X znamená atom halogenu, skupinu OH, NH₂, NO₂ nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, A₆ znamená Val, Thr, Ser, Ala, Phe, -Nal, Abu, Ile, Nle nebo Nva a Ag znamená Phe, Thr, Tyr, Trp, Ser, -Nal, alkoholovou skupinu nebo je vynechána, Rj a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší acylovou nebo nižší alkylovou skupinu a R₃ znamená skupinu OH nebo NH₂ nebo je vynechána. Jestliže buď A₂ nebo A₇ znamená Cys, potom s výhodou druhá skupina znamená také Cys, jestliže A_gznamená a-aminoalkohol, potom R₃ je vynechána a jestliže ani A₂ ani A₇ neznamená Cys, potom A₂ znamená jinou skupinu než A₇.

Zvláště výhodnými somatostatinovými analogy podle tohoto provedení jsou:

Me-D-Phe-Cys-Tyr-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol.

Ve výhodných provedeních mají lineární somatostatinové analogy podle vynálezu strukturu obecného vzorce ^R1 /

A¹-A²-A³-D-Trp-Lys-A⁶-A⁷-A⁸-R3, /

^R2 v němž

-7CZ 292586 B6

A¹ znamená D-nebo L-izomer Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, -Nal, -pyridyl-Ala, Trp, Phe, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X znamená CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A² znamená Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, -Nal, pyridyl-Ala, Trp, 2,4-dichlor-Phe, pentafluorPhe, o-X-Phe nebo p-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃ atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A³ znamená pyridyl-Ala, Trp, Phe, -Nal, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, o-X-Phe nebo 10 p-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃nebo NO₂,

A⁶ znamená Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Thr, Abu nebo Ser,

A⁷ znamená Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, -Nal, pyridyl-Ala, Trp, 2,4-dichlor-Phe, pentafluorPhe, o-X-Phe nebo p-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A⁸ znamená D- nebo L-izomer Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, Phe, -Nal, pyridyl-Ala, Trp, 20 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂, nebo jeho alkohol a

Ri a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší acylovou nebo nižší alkylovou skupinu a R₃ znamená skupinu OH nebo NH₂ nebo je vynechána. S výhodou buď A¹ nebo A⁸ a buď A²25 nebo A⁷ musí znamenat aromatickou aminokyselinu a jestliže A⁸ znamená alkohol, potom musí být R₃ vynechána.

Dále A¹, A², A⁷ a A⁸ nemohou současně všechny znamenat aromatické aminokyseliny. Mezi zvláště vhodné analogy podle tohoto aspektu patří:

H-D-Phe-p-chlor-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂,

H-D-Phe-p-NO₂-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂,

H-D-Nal-p-chlor-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂, H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂,

H-D-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂,

H-D-Phe-p-chlor-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Phe-Thr-NH₂ a H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-Nal-NH₂.

V ještě jiných výhodných provedeních peptidový zbytek znamená bombesin nebo derivát, 40 fragment nebo analog bombesinu. Mezi bombesinové analogy, které se mohou používat podle předloženého vynálezu, patří, ale nejsou na ně omezeny: neuromedin C, neuromedin B, litorin a peptid uvolňující gastrin (GRP), který mají následující sekvenci aminokyselin:

H-Ala-Pro-V al-Ser-V al-Gly-Gly-Gly-Thr-V al-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn45 His-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

Další bombesinové analogy, které se mohou používat v předloženém vynálezu, zahrnují sloučeniny, které jsou popsány v následujících odkazech, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako citace: Coy a spol.: Peptides, Proceedings of the 1 lthe Amer. peptide Symposium, Rivier a spol. (red.), 50 ESCOM, str. 65 až 67 (1990), Wang a spol.: Joumal Biol. Chemistry 265, 15695 (1990).

Mahmooud a spol., Cancer Research 51, 1798 (1991), Wang a spol.: Biochemistiy 29, 616 (1990), Heimbrook a spol.: „Synthetic Peptides: Approaches to Biological Problems“, UCLA Symposium on Mol and Cell. Biol. New Series, díl 86, Tam a Kaise (red.), Martinez a spol.:

-8CZ 292586 B6

J. Med. Chem. 28, 1974 (1985), Gargosky a spol.: Biochem. J. 247.427 (1987), Dubreuil a spol.: Drug Design Deliveiy 2, 49, Harwood Academie Publishers, Anglie (1987), Heikkila a spol.: J. Biol. Chem. 262, 16456 (1987), Caranikas a spol.: J. Med. Chem. 25, 1313 (1982), Saeed a spol: Peptides 10, 597 (1989), Rosell a spol.: Trends in Pharmacological Sciences 3, 211 (1982), Ludnberg a spol.: proč. Nati. Acad. Sci. 80, 1120 (1983), Engberg a spol: Nátuře 293.222 (1984), Mizrahi a spol.: Euro, J. Pharm. 82, 101 (1982), Leander a spol.: Nátuře 294, 467 (1981), Woll a spol.: Biochem. Bipohys. Res. Comm. 155, 359 (1988), Rivier a spol.: Biochem. 17, 1766 (1978), Cuttitta a spol.: Cancer Surveys 4, 707 (1985), Aumelas a spol.: Int. J. Peptide Res. 30, 596 (1987), Szepeshazi a spol.: Cancer Research 51, 5980 (1991), Jensen a spol.: Trends Pharmacol. Sci. 12.13 (1991), US patenty číslo 5 028 692,4 943 561,4 207 311, 5 068 222, 5 081 107 a číslo 5 084 555, evropské patentové přihlášky č. 0 315 367 A2 (1989), 0 434 979 Al (1991), 0 468 497 A2 (1992), 0 313 158 A2 (1989) a 0 339 193 Al (1989), PCT přihlášky č. WO 90/01037 (1990) a 90/02545 (1992) a anglická přihlášky

GB 1 231 051 A (1990).

Peptidy podle vynálezu se mohou připravovat ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Příklady výhodných solí jsou soli s terapeuticky přijatelnými organickými kyselinami, např. kyselinou octovou, mléčnou, maleinovou, citrónovou, jablečnou, askorbovou, jantarovou, benzoovou, salicylovou, methansulfonovou, toluensulfonovou nebo pamovou, a také s polymemími kyselinami, jako je tanin nebo karboxymethylcelulóza, a soli s anorganickými kyselinami, jako jsou halogenovodíkové kyseliny včetně kyseliny chlorovodíkové, kyselina sírová a kyselina fosforečná.

V další části tohoto spisu je popsána syntéza sloučeniny obecného vzorce ΙΠ. Při popisu syntéz sloučenin podle předloženého vynálezu se používá následující zkratky:

Nal znamená naftylalanin (1 nebo 2),

Abu znamená a-aminomáselná kyselina,

D znamená pravotočivá,

L znamená levotočivá,

HOAc znamená kyselina octová,

BOP znamená benzotriazol-l-yloxytri(dimethylamino)fosfonium -hexafluorfosfát,

BOC znamená terc.butyloxykarbonylová skupina,

DCC znamená dicyklohexylkarbodiimid,

EDC znamená l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid,

DEPC znamená diethylkyanofosfonát,

DMF znamená dimethylformamid,

CH2CI2 znamená dichlormethan,

MeOH znamená methanol,

EtOH znamená ethanol,

DIEA znamená N,N-diizopropylethylamin,

HOBT znamená 1-hydroxybenzotriazol,

HBTU znamená 0-benzotriazol-l-yl,N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorfosfát a

TFA znamená trifluoroctová kyselina.

Výchozí materiály a meziprodukty pro sloučeninu obecného vzorce ΙΠ jsou komerčně dostupné. Výchozí materiály se mohou také snadno připravovat způsoby, které jsou dobře známy odborníkům a jsou obsaženy v odborné literatuře. Například chemii derivátů souvisejících s kyselinou askorbovou je možno vést v J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1,1220 (1974), Carbohyd. Res. 67.127 (1978), Yakugaku Zasshi 86. 376 (1966), US patent č. 4 552 888, Je. Med. Chem. 31. 793 (1988), 34, 2152 (1992) a 35. 1618 (1992), jejichž obsahy jsou zde zahmutyjako odkazy. Chemii

-9CZ 292586 B6 derivátů souvisejících stris lze nalézt v Arch. Biochem. Biophy. 96, 653 (1962) a Biochem. 5, 467 (1966), jejichž obsahy jsou zde také zahrnuty jak odkazy.

V obecném smyslu lze kondenzaci sloučeniny obecného vzorce ΠΙ na příslušné volné skupiny chráněných aminokyselin nebo peptidů provádět podle dobře známých způsobů používaných při syntéze peptidů (např. DCC, DCC-HOBT, Dic-HOBT PPA, EDC-HOBT, DEPT, BOP, HBTU) s použitím báze (např. DIEA) v inertním rozpouštědle (např. DMF, THF, dichlormethanu, ethylacetátu nebo v jejich kombinacích). Odstranění chránících skupin se také může provádět dobře známými způsoby (např. odstraněním skupiny přidáním kyseliny nebo báze, TFA, dioxanu s HC1, amoniaku, methoxidu sodného, piperidinu). Ve většině případů by se reakční teplota měla pohybovat v rozmezí od -30 °C do teploty místnosti.

První stupeň syntézy obecně zahrnuje reakci mezi epoxidem a volnou aminovou skupinou chráněné aminokyseliny nebo peptidu. Komplexace a odstranění chránících skupin se dosáhne dobře známými způsoby, jako jsou ty, které popsal McManus a spol.: Synth. Communications 3, 177 (1973), jejichž obsahy jsou zde zahrnuty jak odkazy. Následující syntézy, čištění meziproduktů a produktů se mohou provádět konvenčními způsoby, jako je chromatografíe nebo HPLC. Sloučeniny se identifikují konvenčními technikami, jako je NNR, aminokyselinová analýza a hmotnostní spektrometrie.

Následující příklady ilustrují výhodné způsoby přípravy sloučenin podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Syntéza BIM-23107

Podle tohoto vynálezu byl syntetizován následující somatostatinový derivát, který se označuje také BIM-23107: (AcO-CH₂)₃-C-NH-CO(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-ValCys]-Thr-NH₂.

Příklad 2,1 (AcOCHsjí-C-NH-CO-ÍC^jrCO-D-Nal-cICys-Tyr-D-Trp-Lys-ÍBOCj-Val-CysJ-Thrnh₂

0,03 ml DIEA a přidá k ledem ochlazenému roztoku diacetátu 2-N-(sukcinyl)amino-2-(acetoxymethyl)-l,3-propandiolu (83 mg) a HBTU (92 mg) ve 2 ml DMF. Po 30 minutách míchání při 0 až 5 °C se přidá roztok D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂ (100 mg) ve 2 ml DMF obsahující 0,03 ml DIEA. Směs se nejdříve míchá 1 h při 0 až 5 °C, potom přes noc za teploty místnosti. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Získá se tak suchý odparek, který se roztřepe mezi ethylacetát a vodný nasycený NaCl, ethylacetátová vrstva se promyje vodným 5% (hmotn.) roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nakonec vodným nasyceným NaCl. Výsledný roztok se vysuší síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odpaří. Zůstane odparek, který obsahuje (AcO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-NaI-c[Cys-Tyr-DTrp-lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂ (0,14 g). TLC (silikagel, eluce směsí chloroformu sMEOH a AcOH v poměru 4:1:0,l):Rf = 0,82.

-10CZ 292586 B6

Příklad 2,2 Odstranění skupiny BOC mg shora uvedené sloučeniny se nechá 45 minut reagovat s 50% (hmotn.) TFA v chloroformu za teploty místnosti. Těkavé sloučeniny se za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak odparek. Stopy TFA se několikrát odpaří společně s ethanolem. Odparek se titruje etherem a potom se vysuší. Získá se tak 30 mg produkt TLC (silikagel, eluce chloroform s MeOH a AcOH v poměru 3:1:1): RF = 0,24.

Příklad 2,3 Jiná provedení

Podobným způsobem se syntetizují také následující somatostatinové deriváty:

(HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂BIM-23158 (HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH₂BIM-23167 (HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂BIM-23173 (HO-CH₂)₃-C-NH-CH₂-Co-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂BIM-23179 (HO-CH₂)₃-C-NH-CH₂-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂BOM-23182

Příklad 3 Syntéza BI-23201

Podle tohoto vynálezu se syntetizuje následující somatostatinový derivát, který je označován také jako BIM-23201:

(HO-CH₂)₃-C-CH₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂.

Příklad 3,1 (HO—CH₂)₃-C-CH₂-D-Phe-c[Cys-Tyr~D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂

Po dávkách se přidají 2g molekulového síta (0,3 nm) a NaCNBH₃ (36 mg) během 15 minut k roztoku D-Phe-c[Cys-Tyr(OBt)-D-Trp-Lys(BOC>-Thr(OBt)-Cys]-Nal-NH₂ (250 mg) a tris(acetoxymethyl)acetaldehydu (120 mg) získaného oxidací tricetyl-pentaerythritolu pyridiniumdichromátem nebo směsí DMSO/oxalylchlorid//triethylamin) v methanolu (10 ml) obsahujícím 10 % (hmotn.) kyseliny octové. Směs se pak míchá 30 minut za teploty místnosti a zahřívá se 4 h. Po fíltradci se zbytek roztřepe mezi ethylacetát a vodu. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou, potom vodným hydrogenuhličitanem sodným a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odpaří. Získá se odparek (0,4 g), který se rozpustí v methanolu (5 ml), nechá se zreagovat s roztokem NaOMe v MeOH (pH 10), míchá se 1 h a nakonec se zneutralizje IN HC1 na pH 5 až 6. Po odpaření rozpouštědla se odparek rozpustí v 90% (hmotn.) vodné THF a směs se míchá 30 minut. Těkavé podíly se za sníženého tlaku odstraní. Stopy TFA a vody ve výsledném odparku se odstraní společným odpařováním s ethanolem (dvakrát). Odparek se vysuší ztitruje se etherem a nakonec se vyčiší HPLC za podobných odmínek jak shora popsáno. Získá se 41 mg (HO-CH₂)₃-C-CH₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂ jako bezbarvá pevná látka. Hmotnostní spektrum (m/e): 1262,8

-11 CZ 292586 B6

Příklad 3,2 Jiná provedení

Podobným způsobem se syntetizuje následující somatostatinový derivát, který je označován také 5 jako BIM-23195:

(HO-CH₂)3-C-CH₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂.

i 10 Příklad 4 Syntéza BIM-23197

Podle tohoto vynálezu se syntetizuje následující somatostatinový derivát, který je označován také jako BIM-23197:

(HO-CH2)2-NN-(CH2)2-SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂.

Vy

Příklad 4,1

2-Bromethansulfonylchlorid

2-Bromethansulfonát sodný (4,0 g) se nechá reagovat s PC1₅ (11,8 g) za chlazení v ledové lázni. 20 Po získání kapalné fáze se roztok zahřívá 1,5 h v oleji na 90 až 120 °C, ochladí se na teplotu místnosti, vlije se do 50 g rozdrceného ledu a pak se míchá 15 minut. Směs se extrahuje dichlormethanem (3 x 20 ml) a spojené extraktry se promyjí vodou (2 x), 5% (hmotn.) hydrogenuhličitanem sodným (2 x) a opět vodou (2 x). Vysušením nad bezvodým síranem hořečnatým a destilací za sníženého tlaku se získá 2-bromethansulfonylchIorid jako bezbarvá kapalina 25 (1,95 g, 42 až 44 °C/133 Pa).

Příklad 4,2

Br-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Abu-Cyx]-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropyl-l-methyl)-ethyl

Roztok 2-bromethansulfonylchloridu (30 mg) v DMF (1 ml) se přikape k roztoku H-D-Phec[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Abu-Cys]-Thr(tBu)-(l-cyklopropyl-l-methyl)-ethylu (150 mg) a DDEA (55 mg) v DMF (2 mí) pod dusíkem při 0 °C. Reakční směs se míchá 3 h při až 5 °C, rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku, odparek se rozpustí v ethylacetátu a promyje se 5% (hmotn.) kyselinou citrónovou (2 x) 5% (hmotn.) hydrogenuhličitanem sodným (2 x) a solným roztokem (2 x). Roztok se pak vysuší nad bezvodým síranem hořečnatým, zfiltruje a za sníženého tlaku se zahustí do sucha. Produkt se dále přečistí na krátké koloně silikagelu, 40 eluce ethylacetátem. Frakce, které obsahují produkt, se spojí a rozpouštědlo se za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak 105 mg Br-(CH₂)₂-SO₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-AbuCys]-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropyl-l-methyl)-ethylu jako světle žlutá pevná látka. TLC (silikagel, chloroform//MEOH/HOAc v poměru 9:1:0,l):Rf = 0,36.

-12CZ 292586 B6

Příklad 4,3 /-i

HO-(CH2)2N N-(CH2)2-SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Abu-CysJ-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropyH-methyl)-ethyl

Roztok Br-(CH2)2-SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Abu-Cys]Thr(tBu)-NH(lcyklopropyl-l-methyl)-ethylu (100 mg) a 2-hydroxyethylpiperazinu (55 mg) ve 2 ml 1propanolu se vaří pod zpětným chladičem pod dusíkem 2,5 h. Roztok se pak ochladí na teplotu místnosti a rozpouštědlo se za sníženého tlaku odstraní. Odparek se rozpustí v ethylacetátu, který obsahuje 5 % (hmotn.) methanolu, a promyje se roztokem chloridu sodného (3 x). Nakonec se roztok vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a za sníženého tlaku se odpaří do sucha. Získá se tak 110 mg shora uvedené pevné sloučeniny. Tato sloučenina se bez dalšího čištění použije pro následující stupeň.

Příklad 4,4

HO-(CH2)2-NN-(CH2)2SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH2 Z

110 mg chráněného somatostatinového derivátu získaného v předcházejícím stupni se rozpustí v 10 ml 90% (hmotn.) vodného roztoku TFA. Směs se míchá 1 h za teploty místnosti pod dusíkem. Za sníženého tlaku se odstraní voda a TFA. Odparek se ztitruje studeným etherem (3x10 ml). Získá se nepatrně žlutá pevná látka. Tento materiál se dále čistí preparativní HPLC na obrácených fázích, eluce 1) vodným roztokem octanu amonného a 2) vodným roztokem kyseliny octové. Lyofilizace spojených frakcí obsahujících shora uvedený produkt poskytla bílou pevnou látku (18 mg). Hmotnostní spektrum (ESI, m/e): 1252,7 (M⁴’ +1).

Příklad 4,5 Jiná provedení

HO-(CH2)2-NN-(CH2)2-CO-D-Ph€-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂

W

BIM-23190,

ZN HO-(CH2)2-NN-(CH2)2-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NIl2

BIM-23191,

HO-(CH2)2C-NH-(CH₂)2-SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-ThrNH₂

BIM-23196 a

HO-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂NN-(CH₂)-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]Thr-NH₂BIM-23202.

- 13CZ 292586 B6

Příklad 5 Syntéza bombesinových derivátů

Podobným způsobem jako shora popsáno se syntetizuje následující bombesinový derivát, který se označuje také BIM-26333:

Analogickým způsobem použitím syntetických modifikací známých z oblasti techniky se syntetizují další peptidové deriváty podle vynálezu.

V další části jsou uvedeny výsledky testů testovaných peptidů.

Příklad 6 Vazebné testy

Pro demonstrování vazebné afinity somatostatinových (SRIF) analogů na somatostatinový recepis tor se shora popsané vyčištěné sloučeniny testují v testu navázání somatostatinu, zahrnujícím měření in vitro inhibice navázání [¹²⁵I-Tyrⁿ]SRIF-14 na krysí AR42J pankretové membrány. Jak je uvedeno v tabulce I, vyčištěné somatostatinové analogy podle tohoto vynálezu vykazují vysoké vazebné afinity na tyto receptory. V tabulce je pro každý somatostatinový derivát uvedena molekulová hmotnost, stanovená hmotnostní spektrometrií a vypočtená z molekulární struktury.

Podobně byl v testu navázání bombesinu testován vyčištěný shora popsaný bombesinový analog. Test navázání spočíval v měřeních in vitro inhibice navázání [¹²⁵I-Tyr^H]bombesinu na krysí AR42J pankreatové membrány. V tomto testu byla stanovena vazebná afinita bombesinového analogu na GRP receptor kolem 21 nM.

Příklad 7 Test inhibice růstového hormonu (GH)

Skupině 5 krysích samců Sprague Dawley (každý o hmotnosti mezi 250 a 300 g) byl injekčně s.e. 30 podán somatostatinový derivát nebo solný roztok. Třicet minut před zvolenou dobou po podání léčivého přípravku uvedenou v tabulce II (2 h, 4 h, 6 h, 8 h) byly krysy anestetizovány Nembutalem (i.p., 50 mg/kg). 15 minut po anestezi byl odebrán podíl krve kardiálním vpichem přes heparin, aby se změřil základní GH. Dále byla podána s.e. injekce D-Ala²-GRF (10 pg/kg). Po 15 minutách byla odebrána krev, ab byl kvantitativně stanoven stimulovaný Gh, který se měří 35 v plazmě radioimunoanalytickým testem dodaným NIADDKD. Ze získaných rozdílů mezi základní a stimulovanou hodnotou GH se vypočte inhibice GH.

Tabulka Π ukazuje účinek různých vyčištěných somatostatinových analogů jako funkci času. Účinnost D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH2 (BIM-23060) na inhibo40 vání růstového hormonu u krys je srovnána s jinými somatostatinovými deriváty (BIM-32167,

BIM-23179 a BIM-23181) podle vynálezu. Všechny deriváty vykazují překvapující prodloužené trvání působení, které klesá v závislosti na času.

Pro stanovení ED₅₀ (tj. koncentrace každé sloučeniny potřebné pro inhibování 50 % uvolněného 45 růstového hormonu po příslušné době) příslušné sloučeniny byly provedeny další pokusy se somatostatinovým analogem D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂ a s BIM23190, BIM-23195 a BIM-23197. Pokusy byly prováděny v dávkovém rozmezí mezi 25 pg/kg a 0,25 pg/kg. Tabulka III ukazuje překvapující zlepšení somatostatinových derivátů proti nemodifikovanému peptidu v různých časových intervalech, což ukazuje na to, že inhibice uvolňování 50 stimulovaného GH sloučeninami podle vynálezu závisí na čase.

-14CZ 292586 B6

Příklad 8 Antiproliferační test

Shora popsané vyčištěné somatostatinové anlogy byly testovány také na aktivitu proti rychle proliferujícím buňkám. Tabulka IV popisuje účinek těchto peptidů na růst AR42J nádorových buněk krysího pakreatu. Na rozdíl od přírodního somatostatinu vykazují deriváty podle vynálezu podstatnou anti-proliferační aktivitu. Na obrázku 1 je vidět, že jak BIM-B23041C (somatostatinový analog) tak BIM-23118 (derivát sloučeniny BIM-23014) inhibují růst AR42J nádorových buněk krysího pankreatu v závislosti na koncentraci, přičemž BIM-23118 je z těchto dvou sloučenin aktivnější. Obě sloučeniny inhibují růst nádorových buněk ve větším rozsahu než nemodifikované somatostatinové analogy v ekvivalentních koncentracíh.

Příklad 9 Test příjmu thymidinu

V tomto testu se zásobní kultury švýcarských 3T3 buněk pěstují v Dulbeccem modifikovaném Eaglesově médiu (DMEM) doplněném 10 % plodového telecího séra ve vlhké atmosféře s 10 % hmotn. CO₂ a 90 % hmotn. vzduchu při 37 °C. Buňky se pak vysejí do klastrových misek s 24 jamkami a použijí se 4 dny po poslední změně média. Aby se buňky zachovaly na fázi G1/G0 buněčného cyklu, DMEM médium bez séra se použije 24 h před testem přijmu thymidinu. Buňky se pak dvakrát promyjí 1 ml podíly DMEM (bez séra, 0,5 μΜ) a [methyl³H]thymidinu (20 Ci/mmol, New England Nuclar). Bombesinové deriváty se nejdříve testují při koncentraci 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 a 100 mM. Po 28 h při 37 °C se testují inkorporace [methyl-³H]thymidinu v podílech nerozpustných v kyselině. Buňky se nejdříve dvakrát promyjí ledem ochlazeným 0,9% NaCl (1 ml podíly). Radioaktivita rozpustná v kyselině se pak odtraní 30minutovou inkubací při 40 °C s 5% (hmotn.) trichloroctovou kyselinyou (TCA). Kultury se pak jednou promyjí (1 ml) 95% (hmotn.) ethanolm a solubilizují se 30minutovou inkubací s 1 ml 0,lN NaOH. Solubilizovaný materiál se přenese do baněk obsahujících 10 ml ScintA (Packerd). Radioaktivita se stanoví kapalinovou scintilační spektrometrií. Tento test ukazuje schopnost bombesinových derivátů stimulovat příjem thymidinu do buněk. Vypočtená EC50 byla 0,48 nm, což ukazuje, že bombesinové deriváty podle vynálezu jsou účinnými stimulátory příjmu thymidinu.

Peptidové deriváty podle vynálezu se mohou podávat savcům, zvláště člověku, jedním z tradičních způsobů podávání (např. orálně, parenterálně, transdermálně nebo transmukozálně) v prostředcích s trvalým uvolňováním použitím biodegradovatelného a bioslučitelného polymeru nebo místním podáváním (např. v případě protirakovinových bombesinových nebo somatostatinových derivátů do plic) pomocí micel, gelů nebo liposomů. Dávkování je obvykle stejné jako běžně používané dávkování u terapeutických peptidů u lidí.

Peptidové deriváty podle vynálezu jsou vhodné také pro zlepšení léčení těch onemocnění, která jsou citlivá na léčení odpovídajícím nemodifikovaným peptidem. Zvláště shora popsané somatostatinové deriváty jsou vhodné pro léčení rakoviny, akromegalie, pankreatitidy, proliferace, způsobené úrazem, diabetes, diabetické retinopatie, restonózy po angioplastii, AIDSu, neurogenního zánětu artritidy a gastrointestinálních problémů včetně diarey.

-15CZ 292586 B6

Tabulka I

In vitro vazebné afinity a molekulové hmotnosti somatostatinových peptidových derivátů

	Molekulová hmotnost TEST	Molekulová hmotnost VYP	IC₅₀ (nM)
SRIF-14	—	-	0,17
SRIF-28	—	—	0,23
BIM-23107	1340,4	1340,40	0,30
BIM-23118	1313,5	1313,52	0,30
BIM-23158	1426,2	1426,64	2,52
BIM-23167	1347,6	1347,55	0,09
BIM-23173	1235,5	1235,46	0,11
BIM-23179	1305,9	1305,55	0,12
BIM-23181	1435,0	1434,62	0,25
BIM-23182	1193,8	1193,42	0,12
BIM-23183	1323,0	1322,49	0,22
BIM-23190	1202,8	1202,47	0,20
BIM-23191	1314,9	1314,61	0,08
BIM-23195	1150,8	1150,39	0,08
BJM-23196	1243,7	1243,50	0,09
BIM-23197	1252,7	1252,55	0,29
BIM-23201	1262,8	1262,53	0,14
BIM-23202	1247,0	1246,53	0,18

Tabulka Π

Inhibice uvolňování stimulovaného růstového hormonu u krys somatostatinovými peptidovými deriváty

Inhibice v % ke kontrole při dávce 25 pg/kg:__________________________________________

2h 4h 6h 8h

BIM-23060	86,39	64,96	47,62	38,15
BIM-23167	92,67	79,54	59,72	50,14
BIM-23179	92,79	63,85	67,78	68,26
BIM-23181	99,24	77,07	60,56	56,12

Tabulka ΠΙ

Inhibice uvolňování stimulovaného růstového hormonu u krys somatostatinovými peptidovými deriváty podávanými s.c.

ED₅q (pg/kg)

	2h	4h	6h	8h
BIM-23023	0,48	1,H	2,26	4,32
BIM-23190	0,68	0,57	0,76	1,04
BIM-23195	1,19	3,13	2,08	3,23
BIM-23197	1,01	0,59	1,14	1,59

-16CZ 292586 B6

Tabulka IV

Antiproliferační aktivita somatostatinových peptidových derivátů

růst buněk (procenta ke kontrole)¹
SRIF-14	91,3
SROF-28	98,0
BIM-23014C	74,1
BIM-23107	67,5
BIM-23109	72,1
BIM-23118	61,0
BIM-23135	62,9
BIM-23167	60,2
BIM-23173	67,9
BIM-23181	69,1
BIM-23182	68,7
BIM-23183	69,1
BIM-23195	69,2
BIM-23197	66,4

¹ Koncentrace 100 nM, nádorové buňky AR42J krysího pankreatu po 8 dnech.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Somatostatinový nebo bombesinový derivát, který obsahuje jeho biologicky aktivní peptidový podíl a alespoň jeden substituent připojený na tento peptidový podíl, přičemž tímto substituentem je zbytek obecného vzorce ΠΙ (CH₂)_m

R^!9-R²⁰-R²¹-R²²-R²⁴-(CH2)p-(CH2)q-R²⁶- (III), \ f (CH₂)_n v němž

R¹⁹ znamená atom vodíku, skupinu OH nebo hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

R²⁰ znamená atom kyslíku nebo není přítomen,

R²¹ znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

R²² znamená atom dusíku,

R²⁴ znamená atom dusíku

R²⁶ znamená skupinu SO₂, CO, m znamená číslo mezi 0 a 5 včetně, n znamená číslo mezi 0 a 5 včetně,

-17CZ 292586 B6 p znamená číslo mezi 0 a 5 včetně a q znamená číslo mezi 0 a 5 včetně.

5 přičemž peptidový podíl je připojen ke každému substituentu vazbou CO-N, CH₂-N nebo SO₂-N mezi tímto substituentem a atomem dusíku N-konce nebo postranního řetězce, peptidového podílu.
2. Somatostatinový nebo bombesinový derivát podle nároku 1, v němž R²⁰ není přítomen 1 10 a součet m + n je 3, 4 nebo 5.
3. Somatostatinový nebo bombesinový derivát podle nároku 2, v němž substituent vzorce ΠΙ znamená jednu ze skupin

HO(GH₂)₂N N-(CH₂),-SO“

Vj ² a r-A

HO(CH₂)₂N N-(CH₂),-CO-.

15
4. Derivát podle nároku 3, v němž jeho peptidový podíl znamená somatostatin nebo jeho derivát, fragment nebo analog.
5. Derivát podle nároku 4 v němž somatostatinový analog znamená jednu z následujících sloučenin:

H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂,

H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH2 a H-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂.

25
6. Derivát podle nároku 3, v němž peptidový podíl znamená bombesin nebo jeho derivát, fragment nebo analog.
7. Derivát podle nároku 1, kterým je jedna z následuj ících sloučenin

Ζ~Λ

HO(CH2)2-NN-(CH2)CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH2, a

HO(CH2)2-N N-(CH2)2SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH2·

30
8. Dimemí somatostatinový nebo bombesinový derivát, který obsahuje jeho dva biologicky aktivní peptidové podíly a alespoň jeden substituent připojený na tyto peptidové podíly, přičemž tímto substituentem je sloučenina obecného vzorce V:

(CH₂)_m

-R'^,9-R²⁰-R²¹-R²²-R²⁴-(CH2)p-(GH2)a-R²⁶ - (V), \ / (CH₂)n v němž

-18CZ 292586 B6

R'¹⁹ znamená skupinu SO₂, CO nebo CH₂,

R²⁰ znamená atom kyslíku nebo není přítomen,

R²¹ znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

R²² znamená atom dusíku,

R²⁴ znamená atom dusíku, i

R²⁶ znamená skupinu SO₂CO, m znamená číslo mezi 0 a 5 včetně, n znamená číslo mezi 0 a 5 včetně, p znamená číslo mezi 0 a 5 včetně a q znamená číslo mezi 0 a 5 včetně, přičemž alespoň jeden z peptidových podílů je připojen k substituentu vazbou CO-N, CH₂-N nebo SO₂-N mezi tímto substituentem a atomem dusíku N-konce nebo postranního řetězce peptidového podílu.
9. Dimemí derivát podle nároku 8, v němž R²⁰ není přítomen a součet m + n je 3,4 nebo 5.
10. Použití bombesinového derivátu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení onemocnění pacienta.
11. Použití somatostatinového derivátu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení onemocnění pacienta.
12. Použití podle nároku 10 nebo 11, kde onemocněním je rakovina.
13. Bombesinový derivát podle nároku 1 pro použití jako léčiva pro léčení rakoviny.
14. Somatostatinový derivát podle nároku 1 pro použití jako léčiva pro léčení rakoviny.