CZ299362B6

CZ299362B6 - Antagonisté somatostatinu

Info

Publication number: CZ299362B6
Application number: CZ20032281A
Authority: CZ
Inventors: H. Coy@David; A. Murphy@William; G. Rajeswaran@Walajapet
Original assignee: The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2008-07-02
Also published as: PL362838A1; EP1372688B1; US20080020970A1; JP2004532824A; CZ20032281A3; US7408024B2; CA2439498A1; WO2002072602A3; RU2328504C2; HUP0401535A3; NO20033911L; JP2006342171A; JP4204322B2; WO2002072602A2; ES2306766T3; HUP0401535A2; DK1372688T3; NO20033911D0; RU2263678C2; EP1372688A2

Abstract

Rešení se týká antagonistu somatostatinu obecnéhovzorce I A.sup.1.n.-cyklo{D-Cys-A.sup.2.n.-D-Trp-A.sup.3.n.-A.sup.4.n.-Cys}-A.sup.5.n.-Y.sup.1.n. (I), ve kterém A.sup.1.n. je volitelne substituovaná aromatická .alfa.-aminokyselina, A.sup.2.n. je volitelne substituovaná aromatická .alfa.-aminokyselina, A.sup.3 .n.je Dab, Dap, Lys nebo Orn, A.sup.4 .n.je .beta.-hydroxyvalin, Ser, Hser nebo Thr, A.sup.5 .n.je volitelne substituovaná D- nebo L-aromatická .alfa.-aminokyselina, a Y.sup.1 .n.je skupina OH, NH.sub.2.n. nebo NHR.sup.1.n., kde R.sup.1.n. je (C.sub.1-6.n.)alkyl; ve kterém každá uvedená volitelne substituovaná aromatická .alfa.-aminokyselina je substituovaná jedním nebo více substituenty, z nichž každý je nezávisle vybrán ze souboru skládajícího se z halogenu, skupinNO.sub.2.n., OH, CN, (C.sub.1-6.n.)alkylu, (C.sub.2-6.n.)alkenylu, (C.sub.2-6.n.)alkynylu, (C.sub.1-6.n.)alkoxyskupiny, skupiny Bzl, O-Bzl a NR.sup.9.n.R.sup.10.n., kde R.sup.9.n. a R.sup.10.n. jsou každý nezávisle H, O nebo (C.sub.1-6.n.)alkyl, ave kterém je aminový dusík alespon jedné z vazeb peptidu mezi A.sup.1.n. a D-Cys, D-Cys a A.sup.2.n., A.sup.2.n. a D-Trp, D-Trp a A.sup.3.n., A.sup.3.n. a A.sup.4.n., A.sup.4.n. a Cys, nebo Cys a A.sup.5.n. podle obecného vzorce (I) substituován methylovou skupinou; nebo farmaceuticky prijatelné soli slouceniny, a jejich použití ve farmacii.

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká antagonistů somatostatinu obecného vzorce I A¹-cyklo{D-Cys-A²-D-Trp-A³-A⁴-Cys}-A⁵-Y^l (I), ve kterém

A¹ je volitelně substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A² je volitelně substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A³ je Dab, Dap, Lys nebo Om,

A⁴je β-hydroxyvalin, Ser, Hser nebo Thr,

A⁵ je volitelně substituovaná D- nebo L-aromatická aaminokyselina, a

Y¹ je skupina OH, NH2 nebo NHR¹, kde R¹ je (C].6)alkyl;

ve kterém každá uvedená volitelně substituovaná aromatická α-aminokyselina je substituovaná jedním nebo více substituenty, z nichž každý je nezávisle vybrán ze souboru skládajícího se z halogenu, skupin NO₂, OH, CN, (Q.Jalkylu, (C₂.6)alkenylu, (C₂_6)alkynylu, (G^jalkoxyskupiny, skupiny Bzl, O-Bzl a NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle H, O nebo (C].₆)alkyl, a ve kterém je aminový dusík alespoň jedné z vazeb peptidu mezi A¹ a D-Cys, D-Cys a A², A² a D-Trp, D-Trp a A³, A³ a A⁴, A⁴ a Cys, nebo Cys a A⁵ podle obecného vzorce (1) substituován methylovou skupinou;

nebo farmaceuticky přijatelné soli sloučeniny, a jejich použití ve farmacii.

Antagonisté somatostatinu

Oblast techniky

Vynález se týká antagonistů somatostatinu a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Somatostatin (dále jen SRIF), tetradekapeptid, který objevil Brazeau a kol., prokázal, že má silné inhibiční účinky na různé sekreční procesy v tkáních jako jsou hypoíyza, slinivka břišní a gastrointestinální trakt. SRIF také působí jako neuromodulátor v centrálním nervovém systému. Tyto biologické účinky SRIF, všechny inhibiční z hlediska povahy, jsou vyvolány prostřednic15 tvím řady G proteinem vázaných receptorů, z nichž bylo charakterizováno pět různých podtypů (sstr, až sstr₅). Těchto pět podtypů má podobné aifinity pokud jde o endogenní ligandy SRIF, ale vykazuje odlišnou distribuci v různých tkáních. Somatostatin se váže k pěti podtypům odlišných receptorů (SSTR) s relativně vysokou a stejnou afinitou pro každý podtyp. Vázání k různým typům podtypů somatostatinu je spojováno s léčením různých stavů a/nebo nemocí. („sstr₂“) (Raynor a kol., Molecular Pharmacol., 43, 838 (1993); Lloyd a kol., Am. J. Physiol., 268, G 102 (1995)), zatímco inhibice inzulínu je připisována receptoru somatostatinu typu-5 („sstr₅“) (Coy a kol., 197, 366 až 371 (1993)). Aktivace typů 2 a 5 je spojována se supresí růstového hormonu a podrobněji s adenomy vylučujícími GH (růstový hormon) (akromegalie) a adenomy vylučujícími TSH (tyreostimulační hormon). Aktivace typu 2, ale nikoliv typu 5, je spojována s léčením ade25 nomů vylučujících prolaktin. Jiné indikace spojované s aktivací podtypů receptoru somatostatinu jsou inhibice inzulínu a/nebo glukagonu pro léčení cukrovky, angiopatie, proliferativní retinopatie, Downova jevu a nefropatie; inhibice sekrece žaludeční kyseliny a podrobněji peptických vředů, enterokutánního a pankreatikokutánního píštěle, dráždivého střevního syndromu, Dumpingová syndromu, syndromu vodové stolice, diarey spojené s AIDS, chemoterapií vyvola30 né diarey, akutní nebo chronické pankreatitidy a nádorů vylučujících gastrointestinální hormon; léčení rakoviny jako je hepatom; inhibice angiogeneze, léčení zánětlivých poruch jako je artritida; retinopatie; chronické odmítnutí štěpu; angioplastie; odmítnutí cévního štěpu a gastrointestinální krvácení. Je výhodné mít analog, který je selektivní pro subtyp nebo subtypy specifického receptoru somatostatinu, zodpovědné za požadovanou biologickou odezvu, a tak snižující inter35 akci s jinými podtypy receptorů, která by mohla vést k nežádoucím vedlejším účinkům.

Vývoj silných agonistů SRIF s menší molekulou vedl k objevu odlišných afinit různých omezených ligandů pro různé podtypy. Zdá se, že sekvence Trp⁸-Lys⁹ je často přítomná v ligandech, které jsou rozlišovány receptorem. Sekvence Trp⁸-Lys⁹ tvoří část β-vazby, která je obvykle stabi40 lizována cestou substituce D- za L-Trp, cyklizací hlavního řetězce, disulfidového můstku nebo všech sterických napětí. Jedním z nezamýšlených důsledků takového strukturálního zjednodušení, které bylo prováděno před objevením mnohočetných podtypů receptoru, byla ztráta širokého spektra vazebné afinity. To je symbolizováno pomocí vysokých afinit peptidů typu 2 ale nízkých afinit typu 1, 3, 4 a 5 v řadě OCTREOTIDU®. Tudíž mnoho základních biologických studií s tímto typem analogu neuspělo při zjištění účinků zprostředkovávaných pomocí všech, s výjimkou jednoho, z typů receptoru somatostatinu. Od té doby pak bylo na jedné straně vynaloženo mnoho práce na znovuzavedení širšího spektra vázání do malých, biologicky stabilních peptidů a do vývoje peptidů a peptidomimetik s odlišnou specificitou pro jednotlivý receptor.

Původci předloženého vynálezu zjistili, že sterické napětí hlavního řetězce může být zavedeno pomocí N-alkylace jednotlivých aminokyselin. Tato modifikace do značné míry omezuje postižený zbytek a aminokyselinu, která ho v rozšířené konformaci předchází. Tudíž, navíc blokuje potenciální intramolekulámí vazebná místa vodíku a také místa štěpení proteolytického enzymu a tak silně zvyšuje farmakokinetické vlastnosti peptidu. Pouze málo N-methylovaných aminokyse55 lin je průmyslově dostupných a jejich syntéza je obtížná. Avšak v některých aspektech předklá- 1 CZ 299362 B6 daného vynálezu, původci objevili postup k analogům somatostatinu omezeným v každém zbytku aminokyseliny N-methylátem za použití způsobu přípravy v pevné fázi, přejatého z nedávno vydané publikace, kterou zveřejnili Miller a Scanlan.

Podstata vynálezu

Podstatou tohoto vynálezu je sloučenina obecného vzorce (I) i o A¹ -cyklo {D-Cys-A²-D-Trp-A³-A⁴-Cys} -A⁵-Y¹ (I), ve kterém

A¹ je volitelně substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A² je volitelně substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A³ je Dab, Dap, Lys nebo Om,

A⁴ je β-hydroxyvalin, Ser, Hser nebo Thr,

A⁵ je volitelně substituovaná D- nebo L-aromatická a-aminokyselina, a Y¹ je skupina OH, NH2 nebo NHR¹, kde R¹ je (Ci_6)alkyl;

ve kterém každá uvedená volitelně substituovaná aromatická α-aminokyselina je substituovaná jedním nebo více substituenty, z nichž každý je nezávisle vybrán ze souboru skládajícího se z halogenu, skupin NO₂, OH, CN, (Ci.₆)alkylu, (C₂.₆)alkenylu, (C₂.₆)alkynylu, (Ci_₆)alkoxyskupina, skupiny Bzl, O-Bzl a NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle H, O nebo (C,.₆)alkyl, a ve kterém je aminový dusík alespoň jedné z vazeb peptidu mezi A¹ a D-Cys, D-Cys a A², A² a D-Trp, D-Trp a A³, A³ a A⁴, A⁴ a Cys, nebo Cys a A⁵ podle obecného vzorce (1) substituován methylovou skupinou;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

V jednom z výhodných provedení tohoto vynálezu je sloučenina výše uvedeného obecného vzorce (1) definována tak, že

A¹ je Cpa, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tfm, Tyr nebo Tyr(I),

A² je 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tyr nebo Tyr(I), a

A⁵ je Dip, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe nebo D-Trp, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Přitom A¹ může být Cpa, dále A³ může být NMe-Lys.

V dalším provedení je předmětem vynálezu sloučenina podle výše uvedeného obecného vzorce (I), kde touto sloučeninou může být:

Cpa-cyklo(Nme-D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(NMe-D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe; Cpa-cyklo(D-Cys-NMe-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH₂;

-2CZ 299362 B6

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NMe2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(NMeD-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Dip-NHMe;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Tfm-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; nebo

3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Opět dalším předmětem vynálezu je sloučenina podle obecného vzorce (I), kde peptidem je:

NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂;

Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; nebo 3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Dalším předmětem vynálezu je sloučenina podle obecného vzorce (I), kde peptidem je: NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; nebo

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

V jiném provedení je předmětem vynálezu sloučenina podle předcházející skupiny peptidů, ve kterém je uvedeným peptidem:

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; nebo Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob vázání jednoho nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje krok, při kterém se přivede do kontaktu sloučenina podle některého z dále uvedených nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl s jedním nebo více z uvedených podtypů receptorů somatostatinu, za předpokla45 du, že tento způsob není způsobem terapeutického nebo chirurgického ošetřování lidského nebo zvířecího těla, ani diagnostickou metodou, používanou na lidském nebo zvířecím těle.

Předmětem vynálezu je dále použití účinného množství sloučeniny podle některého z dále uvedených nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro vázání jednoho

-3 CZ 299362 B6 nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5 v lidském pacientovi nebo jiném živočišném pacientovi.

Dalším předmětem vynálezu je způsob vyvolání antagonistického působení z buňky, spočívající v tom, že uvedená buňka obsahuje jeden nebo více receptorů somatostatinu, přičemž uvedený způsob zahrnuje krok při kterém se přivede do kontaktu uvedená buňka s účinným množstvím sloučeniny podle některého z dále uvedených nároků 1, 7 nebo 8 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, za předpokladu, že tento způsob není způsobem terapeutického nebo chirurgického ošetřování lidského nebo zvířecího těla, ani diagnostickou metodou, používanou na lidském nebo ío zvířecím těle.

Opět dalším předmětem vynálezu je použití účinného množství sloučeniny podle některého z dále uvedených nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro vyvolání antagonistického působení vůči somatostatinu v lidském nebo živočišném pacientovi, nebo pod15 póru uvolňování růstového hormonu v lidském nebo živočišném pacientovi, případně pro podporu uvolňování inzulínu v lidském nebo živočišném pacientovi, nebo pro zvýšení hojení poranění v lidském nebo živočišném pacientovi, nebo podporu angiogeneze v lidském nebo živočišném pacientovi.

Dalším předmětem vynálezu je způsob zobrazování buněk obsahujících receptory somatostatinu, spočívající vtom, že zahrnuje přivedení uvedených buněk do kontaktu s účinným množstvím sloučeniny podle některého z dále uvedených nároků 1, 7 nebo 8 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, která obsahuje Tyr(I).

Opět dalším předmětem tohoto vynálezu je použití účinného množství sloučeniny podle některého z dále uvedených nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro léčení nemoci nebo stavu u lidského nebo jiného živočišného pacienta, který to potřebuje, při kterém jsou uvedená nemoc nebo stav vybrány ze skupiny, zahrnující nedostatečný vzrůst, kachexii, chřadnutí, diabetů typu 2 a nedostatečný oběh.

Popis obrázku na výkrese

Obr. 1 je graf zobrazující in vitro inhibici mobilizace nitrobuněčného vápníku (Ca²⁺) zprostředko35 vanou hsstr-5.

Příklady provedení vynálezu

Odborník v oboru může, na základě zde uvedeného popisu, využít předkládaný vynález v jeho nejplnějším rozsahu. Následující typická ztělesnění jsou proto vytvořena jako pouhá znázornění tohoto vynálezu a není záměrem je vytvořit jako omezení plného rozsahu tohoto vynálezu.

Jak je dobře známo odborníkovi v oboru, známá a potenciální použití somatostatinu jsou různá a mnohočetná. Je známo, že somatostatin ajeho analogy jsou užitečné při léčení nemocí a/nebo stavů jejichž seznam je uveden dále. Různá použití somatostatinu mohou být shrnuta následovně: Cushingova nemoc (viz Clark R. V. a kol., Clin. Res., 38, 943A (1990)), gonadotropinomie (viz Ambrosi B. a kol., Acta Endocr., Kodaň, 122, 569 až 576 (1990)), hyperparatyreidismus (viz Miller D. a kol., Canad. Med. Ass. J., 145, 227 až 228 (1991), Pagetova nemoc (viz Palmieri G.

M. A. a kol., J. of Bone and Minerál Research, 7 (dodatek 1), S240 (abstrakt 591) (1992)), nemoc VIP (viz Koberstein B. a kol., Z. Gastroenterology, 28, 295 až 301 (1990) a Christensen C., Acta Chir. Scand., 155, 541 až 543 (1989)), nesidioblastomie a hyperinzulinismus (viz Laron Z., Israel J. Med. Sci., 26 (1), 1 až 2 (1990), Wilson D. C., Irish J. Med. Sci., 158 (1), 31 až 32 (1989) a Micic D. a kol., Digestion, 16 (dodatek 1), 70 (abstrakt 193) (1990)), gastrinomie (viz Bauer F. E.

a kol., Europ. J. Pharmacol., 183, 55 (1990)), nemoc Zollinger-Ellison (viz Mozell E. a kol.,

-4CZ 299362 B6

Surg. Gynec. Obstet., 170, 476 až 484 (1990)), hypersekreční diarhea spojená s AIDS a jiné stavy (způsobené AIDS viz Cello J. P. a kol., Gastroenterology, 98 (5), část 2, dodatek, A163 (1990)), způsobené zvýšeným obsahem peptidu uvolňujícím gastrin viz Alhindawi R. a kol., Can. J. Surg., 33, 139 až 142 (1990), druhotné proti střevnímu štěpu versus onemocnění hostitele viz Bianco J.

A. a kol., Transplantation, 49, 1194 až 1195 (1990), diarhea spojená s chemoterapií viz Petrelli N. a kol., Proč. Amer. Soc. Clin. Oncol., 10, 138 (abstrakt č. 417) (1991)), dráždivě onemocnění střev (viz 0’Donnel L. J. D. a kol., Aliment. Pharmacol. Therap., 4, 177 až 181 (1990)), pankreatitida (viz Tulassay Z. a kol., Gastroenterology, 98 (5), (část 2, dodatku), A238 (1990)), Crohnova nemoc (viz Fedorak R. N. a kol., Can. J. Gasroenterology, 3 (2), 53 až 57 (1989)), ío systémová skleróza (viz Soudah H. a kol., Gastroenterology, 98 (5), část 2 (dodatek), A129 (1990)), rakovina štítné žlázy (viz Modigliani E. a kol., Výroční endokrinologické sympozium (Ann., Endocr.) (Paříž), 50, 483 až 488 (1989)), psoriáza (viz Camisa C. a kol., Cleveland Clinic J. Med., 57 (1), 71 až 76 (1990)), hypotenze (viz Hoeldtke R. D. a kol., Arch. Phys. Med. Rehabil., 69, 895 až 898 (1988) a Kooner J. S. a kol., Brit. J. Clin. Pharmacol., 28, 735P až 736P (1989)), záchvaty úzkosti (viz Abelson J. L. a kol., Clin. Psychopharmacol., 10, 128 až 132 (1990)), skleredém (viz Soudah H. a kol., Clin. Res., 39, 303A (1991)), malá střevní obstrukce (viz Nott D. M. a kol., Brit. J. Surg., 77, A691 (1990)), gastroesofagální reflux (viz Branch M. S. a kol., Gastroenterology, 100 (5), část 2 (dodatek), A425 (1991)), duodenogastrický reflux (viz Hasler W. a kol., Gastroenterology, 10, (5), část 2 (dodatek), A448 (1991)), Gravesova nemoc (viz Chang T. C. a kol., Brit. Med. J., 304, 158 (1992)), polycystická nemoc vaječníku (viz Prelevic G. M. a kol., Metabolism Clinical and Experimental, 41, dodatek 2, 76 až 79 (1992)), krvácení z horního gastrointestinálního traktu (viz Jenkins S. A. a kol., Gut., 33, 404 až 407 (1992) a Arrigoni A. a kol., American Journal of Gastroenterology, 87, 1311 (abstrakt 275) (1992)), ankreatické nepravé cysty a břišní vodnatelnost (viz Hartley J. E. a kol., J. Roy. Soc.

Med., 85, 107 až 108 (1992)), leukemie (viz Santini a kol., 78 (dodatek 1), 429A (abstrakt 1708) (1991), meningiom (viz Koper J. W. a kol., J. Clin. Endocr. Metab., 74, 543 až 547 (1992) a rakovinná kachexie (viz Bartlett D.L. a kol., Surg. Fórum, 42, 14 až 16 (1991). Obsahy předcházejících odkazů jsou zde zahrnuty formou odkazů.

Peptidy podle tohoto vynálezu jsou užitečné jako antagonisté k působení nebo působením somatostatinu. Například peptidy podle tohoto vynálezu mohou být použity pro podporu uvolňování růstového hormonu nebo inzulínu v pacientovi (např. savci, jakým je lidský pacient). Tudíž tyto peptidy jsou užitečné při léčení fyziologických stavů, při kterých je podpora uvolňování růstového hormonu nebo inzulínu prospěšná. Peptidy podle tohoto vynálezu mohou také být použity při zvýšení hojení poranění nebo při podpoře angiogeneze. Dále mohou být použity peptidy podle tohoto vynálezu, které obsahují zbytek Tyr(I) pro reprodukci buněk, které obsahují receptory somatostatinu. Takové peptidy podle tohoto vynálezu mohou být použity buď in vivo pro zjištění buněk, které obsahují receptory somatostatinu (např. rakovinových buněk) nebo in vitro jako radioligand při zkoušce vázání receptorů somatostatinu. Peptidy podle tohoto vynálezu mohou být také použity jako vektory pro označení buněk pomocí radioaktivních izotopů.

Do rámce tohoto vynálezu je také zahrnovaný peptid krytý pomocí výše uvedeného generického vzorce, jak pokud jde o použití při léčení nemocí nebo poruch spojených s potřebou podpory uvolňování růstového hormonu nebo inzulínu, tak použití při zjišťování receptorů somatostatinu např. radioznačením.

Sloučenina obecného vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl může být podávána orálně, parenterálně (např. nitrosvalovými, nitropobřišnicovými, nitrožilními nebo subkutáními injekcemi nebo implantáty), nasálními, vaginálními, rektálními, subligválními nebo lokálními způsoby podávání a může být formulována s farmaceuticky přijatelnými nosiči pro získání dávkových forem vhodných pro každý způsob podávání.

Dávkové formy v pevném stavu pro orální podávání zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V takových dávkových formách v pevném stavuje aktivní sloučenina smíchána s nejmé55 ně jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako jsou sacharóza, laktóza nebo škrob.

-5CZ 299362 B6

Takové dávkové formy mohou také obsahovat, jak je běžné v praxi, pomocné látky jiné než taková inertní ředidla, např. lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý. V případě kapslí, tablet nebo pilulek, mohou dávkové formy také obsahovat pufrovací činidla. Tablety a pilulky mohou být připraveny s enterickými povlaky.

Kapalné dávkové formy pro orální podávání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry obsahující inertní ředidla běžně používaná v oboru, jako je voda. Kromě takových inertních ředidel, může kompozice také zahrnovat adjuvans, jako jsou zvlhčovači činidla, emulgační a suspenzační činidla, a sladidla, příchuti a parfumační činidla.

Prostředky pro parenterální podávání podle tohoto vynálezu zahrnují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Příklady nevodných rozpouštědel nebo vehikul jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako jsou olivový olej a kukuřičný olej, želatina, a injektovatelné organické estery, jako je ethyl-oleát. Takové dávkové formy mohou také obsaho15 vat adjuvans, taková jako jsou konzervační činidla, zvlhčovadla, emulgační a dispergační činidla. Mohou být sterilizovány, například filtrací přes bakterie zadržující filtr, začleněním sterilizačního činidla do kompozice, pomocí ozařování kompozice nebo zahříváním kompozice. Mohou být také vyráběny ve formě sterilních kompozic v pevném stavu, které mohou být rozpuštěny v sterilní vodě nebo některých jiných sterilních injektovatelných prostředích bezprostředně před použitím.

Kompozicemi pro rektální nebo vaginální podávání jsou výhodně čípky, které mohou obsahovat, navíc k aktivní látce, excipiens, jako je kakaové máslo nebo čípkový vosk.

Kompozice pro nasální nebo sublingvální podávání jsou také připravovány se standardními excipiens dobře známými v oboru.

Dávka aktivní složky v kompozicích podle tohoto vynálezu se může lišit, avšak je nezbytné, aby množství aktivní složky bylo takové, že je získána vhodná dávková forma. Zvolená dávka závisí na požadovaném léčebném účinku, na způsobu podávání a na době trvání léčení. Obecně jsou pro získání požadovaného léčebného účinku podávány úrovně dávek mezi 25 gg/kg/den a 100 mg/kg/den tělesné hmotnosti denně jako jedna dávka nebo rozdělené do více dávek lidem nebo jiným živočichům, např. savcům.

Výhodný obecný rozsah dávky je od 250 pg/kg/den do 5,0 mg/kg/den tělesné hmotnosti denně, který může být podáván jako jedna dávka nebo rozdělena do více dávek.

Kromě toho může být sloučenina obecného vzorce (I) podávána v kompozici se setrvalým uvolňováním, jako jsou kompozice popsané v následujících patentech. Mezi těmito prostředky, jsou výhodné prostředky se 14-denním nebo 28-denním pomalým uvolňováním. US 5 672 659 zdůrazňuje kompozice se setrvalým uvolňováním obsahující peptid a polyester. US 5 595 760 zdůrazňuje kompozice se setrvalým uvolňováním obsahující peptid v gelovatelné formě. US 5 821 221 zdůrazňuje polymemí kompozice se setrvalým uvolňováním obsahující peptid a chitosan. US 5 916 883 zdůrazňuje kompozice se setrvalým uvolňováním obsahující peptid a cyklodextrin. Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/US99/01180 (publikace WO 99/38536, z 5. srpna, 1999) zdůrazňuje absorbovatelné kompozice peptidu se setrvalým uvolňováním. Obsahy dříve uvedených patentů a přihlášek jsou zde zahrnuty ve formě odkazů.

Použití kompozic s okamžitým nebo setrvalým uvolňováním závisí na typu indikací, které jsou cílem. Jestliže indikaci tvoří akutní nebo nadakutní poruchy, bude upřednostňováno léčení pomocí formy s okamžitým uvolňováním proti stejnému léčení pomocí kompozice se setrvalým uvolňováním. Proti tomu pro preventivní dlouhodobé léčení bude obecně upřednostňována kompozice s prodlouženým uvolňováním.

-6CZ 299362 B6

Dále následuje vysvětlení zkratek.

Nomenklatura pro podtypy receptorů somatostatinu je v souladu s doporučeními IUPHAR, ve kterých se sstr₄ týká receptoru, který původně klonoval Bruno a kol., a sstr₅ se týká receptoru, který klonoval O’Carrol a kol.

Zkratky běžných aminokyselin jsou v souladu s doporučeními IUPAC-IUB. Kromě toho jakjsou používány zde, jsou vysvětlení pro určité zkratky následující:

Abu Aib β-Ala Amp Ava

Cha Cpa Dab Dap Dip

Gaba HSer

1- Nal

2- Nal Nle

Nva

2- Pal

3- Pal

4- Pal Tfm

Tfm A

Tyr(I) α-aminobutyrová kyselina, α-aminoizobutyrová kyselina, β-alanin,

4- aminofenylalanin,

5- aminovalerová kyselina, cyklohexylalanin,

3-(4-chlorfenyl)alanin,

2,4-diaminobutyrová kyselina,

2,3-diaminobutyrová kyselina,

3,3’-difenylalanin, γ-aminobutyrová kyselina, homoserin,

3-(l-naftyl)alanin,

3-(2-naftyl)alanin, norleucin, norvalin,

3- (2-pyridyl)alanin,

-(3 -pyridy l)alan i n,

-(4-pyridyl)alanin, trifluormethyl, a

4- trifluormethylfenylalanin.

Iodidovaný tyrosinový zbytek (např. 3-1-Tyr, 5-1-Tyr, 3,5-1Tyr), ve kterém jodem může být radioaktivní izotop, např. I125, I127 nebo I₁₃₁.

Mohou se zde také objevit následující zkratky určitých činidel:

DBU

DCM

DIC

DIEA DMF MTBD o-NBS TBTU

TFA

1.8- diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en, dichlormethan, diizopropylkarbodiimid, diizopropylethylamin, dimethylformamid,

1.3.4.6.7.8- hexahydro-l-methyl-2H-pyrimidol[l,2-a]pyrimidin, 2-nitrobenzensulfonyl, o-benztriazol-l-yl-N,N,N’,N’-tetramethyluroniumtetrafluorborát, a

trifluoroctová kyselina.

-7CZ 299362 B6

S výjimkou N-konce aminokyseliny, všechny zkratky (např. Cpa pro A¹) aminokyselin v tomto vynálezu představují strukturu -NH-CH(R)-CO-, ve které R je vedlejší řetězec aminokyseliny (např. CH₃ pro Ala). Pokud jde o N-konec aminokyseliny, zkratka představuje strukturu (R^²)N-CH(R)-CO-, ve které R je vedlejší řetězec aminokyseliny a každý z R¹ a R² je nezávisle H nebo takový, jak je zde jinak blíže určeno.

Alifatickou aminokyselinou je α-aminokyselina, která obsahuje jeden nebo dva vedlejší řetězce, které, nezávisle, jsou uhlovodíky např. přímý nebo rozvětvený řetězec z 1 až 6 atomů uhlíku. Příklady alifatických aminokyselin zahrnují Ala, Aib, Val, Leu, Tle, Ile, Nle, Nva nebo Abu.

To co je míněno „aromatickou α-aminokyselinou“ je zbytek aminokyseliny obecného vzorce z₇—CH-Z.

² I ¹ —NH-CH-CO15 kde Z, je částice obsahující aromatický kruh a Z₂ je vodík nebo částice obsahující aromatický kruh. Příklady takových aromatický kruh obsahujících částic zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, benzenový nebo pyridinový kruh a následující struktury s nebo bez jednoho nebo více substituentů X na aromatickém kruhu (kde X je, nezávisle pro každý výskyt, halogen, skupina NO₂, CH₃, OCH₃, CF₃ nebo OH):

Jinými příklady aromatické α-aminokyseliny podle tohoto vynálezu jsou substituované kyseliny His, jako jsou MeHis, His(x-Me) nebo His(n-Me).

Jak je používán zde, výraz „alkyl“ je zamýšlen tak, že zahrnuje takové alkylové skupiny, které mají označenou délku, a jsou buď v lineární nebo rozvětvené konfiguraci. Příkladně jsou tako30 vými alkylovými skupinami methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, sek-butyl, teriární butyl, pentyl, izopentyl, hexyl, izohexyl a podobné. Když je ve vysvětlení obsažen výraz C₀-alkyl, je určený pro označení jednoduché kovalentní vazby.

Výraz „nižší alkyl“ je zamýšlen tak, že zahrnuje alkylové skupiny s jak rozvětveným tak přímým řetězcem, které mají 1 až 6 atomů uhlíku.

Jak je používán zde, výraz „aryl“ je zamýšlen tak, že zahrnuje jakýkoliv stabilní monocyklický, bicyklický nebo tricyklický kruh(y) o až 7 členech v každém kruhu, ve kterém je nejméně jeden kruh aromatický. Příklady arylových skupin zahrnují fenyl, nafityl, anthracenyl, bifenyl, tetra40 hydronafityl, indanyl, fenanthrenyl a podobné.

-8CZ 299362 B6

Výraz „heterocyklový radikál“, jak je používán zde, představuje stabilní 5- až 7-členný monocyklický nebo stabilní 8- až 11-členný bicyklický nebo stabilní 11- až 15-členný tricyklický heterocyklický kruh, který je buď nasycený nebo nenasycený a který se skládá z atomů uhlíku a od jednoho do čtyřech heteroatomů vybraných ze skupiny, která se skládá z dusíku, kyslíku a síry, a který obsahuje jakoukoliv bicyklickou skupinu, ve které je kterýkoliv z výše popsaných heterocyklických kruhů kondenzovaný k benzenovému kruhu. Tento heterocyklický kruh může být připojen ke kterémukoliv heteroatomu nebo atomu uhlíku, což má za následek vytvoření stabilní struktury. Příklady takových heterocyklických prvků zahrnují, ale bez omezení na ně, azepinyl, benzoimidazolyl, benzoizoxazolyl, benzofurazanyl, benzopyranyl, benzo-thiopyranyl, benzolů furyl, benzothiazolyl, benzothienyl, benzoxazolyl, chromanyl, cinnolinyl, dihydrobenzofuryl, dihydrobenzothienyl, dihydrobenzothiopyranyl, dihydrobenzo-thiopyranylsulfon, furyl, imidazolidinyl, imidazolinyl, imidazolyl, indolinyl, indolyl, izochromanyl, izoindolinyl, izochinolinyl, izothiazolidinyl, izothiazolyl, izo-thiazolidinyl, morfolinyl, nafthyridinyl, oxadiazolyl, 2-oxoazepinyl, 2-oxopiperazinyl, 2-oxopiperidinyl, 2-oxo-pyrrolidinyl, piperidyl, piperazinyl, pyridyl, pyridyl N-oxid, chinoxalinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydroizochinolinyl, tetrahydrochinolinyl, thiamorfolinyl, thiamorfolinyl sulfoxid, thiazolyl, thiazolinyl, thienofuryl, thienothienyl, thienyl a podobné.

Výraz „substituovaný“ je míněn tak, že zahrnuje uvedenou chemickou skupinu (např. nižší alkyl, aryl, cykloalkyl atd.) substituovanou jedním nebo více z uvedených substituentů (např. halogenem, hydroxyskupinou, nižším alkylem atd.). Substituenty mohou být připojeny k jakémukoliv atomu v chemické skupině.

Zkratka „NMe“ je výrazem pro „N-methyl-„. Jak je používán zde NMe označuje, že dusík ami25 dové skupiny z připojené aminokyseliny je methylován. Tudíž „NmeCpa“ označuje -N(CH₃)CH(R)-CO-, kde R je 4-chlorfenyl, „Nme-2-Nal“ označuje -N(CH₃)-CH(R)-CO-, kde R je 2naftyl a tak dále.

Výraz alkoxy je míněn tak, že zahrnuje takové alkoxyskupiny, které mají označenou délku a jsou buď v lineární nebo rozvětvené konfiguraci. Příklady takových alkoxyskupin jsou methoxyskupina, ethoxyskupina, propoxyskupina, izopropoxyskupina, butoxyskupina, izo-butoxyskupina, terciární butoxyskupina, pentoxyskupina, izopentoxyskupina, hexoxyskupina, izohexoxyskupina a podobné.

Výraz halogen nebo halogenová skupina je míněn tak, že zahrnuje atomy halogenu, jako jsou fluor, chlor, brom a jod.

Když je zbytek aminokyseliny opticky aktivní, je to L-forma, která je tím míněna, pokud není výslovně uvedena D-forma.

Dále následuje popis použitých látek.

4-Methylbenzohydrylaminhydrochloridová pryskyřice (0,25 nebo 0,5 miliekvivalentu.g¹) byla získána od společnosti AdvancedChemTech lne., Louisville, KY. N“-terc-butyloxykarbonylem (Boc) bráněné aminokyseliny byly zakoupeny od společností Bachem lne., Torrance, Ca; AdvancedChemTech lne. a Synthetech lne., Albany, OR. Reaktivní vedlejší řetězce aminokyselin byly kryty jednou z následujících skupin: Cys, 4-0-methylbenzyloxykarbonyl; Lys, 2-chlorobenzyloxykarbonyl; Thr, O-benzyl; Tyr, 0-2,6-dichlorbenzyl. Všechna činidla a rozpouštědla měla stupeň čistoty podle standardu ACS (ACS (American Chemical Society) = Americká chemická společnost) nebo vyšší a byla používána bez dalšího čištění.

-9CZ 299362 B6

Příklady provedení vynálezu

Syntéza peptidu

Syntéza peptidu se může rekapitulovat pomocí následující reakce

Schéma:

Sloučeniny obecného vzorce (I) se mohou a jsou syntetizovány na 4-methylbenzhydrylaminem funkcionalizované z 1 % křížově zesíťované polystyrénové pryskyřici (0,25 nebo 0,5 miliekvalentu.g'¹), v 0,25mmol měřítku v syntetizéru společnosti AdvancedChemTech (model 2000), za využití následujícího protokolu: deblokace, 40% TFA (2 min, 20 min); cyklus promytí DCM (tři promytí); neutralizace, 10% DIEA (1 min, 5 min); cyklus promytí DMF, cyklus promytí DCM (dvě promytí); dvojnásobná kondenzace; první s estery 1,3-diizopropylkarbodiimidu (3 ekv.), 30 min v DCM; promytí DCM (tri promytí); druhá kondenzace s předem připravenými estery TBTU (3 ekv.), 90 min v DMF s katalytickým množstvím DIEA; promytí DMF (jedno promytí); promytí DCM (tři promytí). Kondenzační reakce jsou sledovány pomocí kvalitativní analýzy.

Bránění N“

Po zbavení aminoskupiny ochrany v žádoucím místě methylace, se pryskyřice suspenduje v DCM (20 ml). K této suspenzi se přidá kolidin (3 ekv.) a o-nitro-benzensulfonylchlorid (3 ekv.) a směs se protřepává za použití syntetizéru společnosti AdvancedChemTech (model 2000) po 2 h. Potom se pryskyřice promyje DCM (dvě promytí) a DMF (tři promytí). Bránění se sleduje způsoby kvalitativní analýzy pomocí ninhydrinového testu.

Methylace N“

Pryskyřice bráněná o-nitrobenzensulfonamidem se suspenduje v DMF (20 ml), ke kterému se přidá MTBD (3 ekv.) a methyl-4-nitrobenzensulfonát nebo dimethylsulfát (pokud jde o Cys). Směs se potom protřepává za použití syntetizéru společnosti Advanced-ChemTech (model 2000) po 0,5 h a pryskyřice se promyje DMF (4 promytí).

- 10CZ 299362 B6

Zbavení ochrany N“-Me

Jakmile se požadovaný zbytek zmethyluje, pryskyřice se znovu suspenduje v DMF (20 ml).

K suspenzi se přidá DBU (3 ekv.) a 2-merkaptoethanol (3 ekv.) a směs se protřepává po 0,5 h v syntetizéru od společnosti AdvancedChemTech (model 2000). Pryskyřice se potom pečlivě promyje DMF (5 promytí).

Předcházející postup methylace, který je dobře zpracován pro všechny zbytky kromě D-Cys⁶, pro který má za výsledek dimethylované deriváty (viz např. sloučeniny 2 a 10). Avšak nahrazení DCys⁶ Cys⁶ poskytuje monomethylované peptidy.

Odštěpení peptidů

Peptidy se odštěpí od pryskyřicového nosiče tím, že se postranní řetězec simultánně zbaví ochrany acidolýzou za použití bezvodého fluorovodíku, který jako látku zachycující vedlejší produkty obsahuje anisol (~30 % objem/objem), působícího po 45 min při 0 °C. Peptidy se cyklizují v 90% kyselině octové (-600 ml) s mírným přebytkem I₂ (15 min.). Přebytek I₂ se poté odstraní přidáním kyseliny askorbové.

Čištění

Surové peptidy se čistí pomocí preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi (RP-HPLC) na C-18 chemicky vázaném silikagelu za použití axiálních kompresních kolon (Dynamax-30 nm, 5 nebo 8 pm, 21,4 x 250 mm). Používá se eluční systém s lineárním gradientem při rychlosti toku 20 ml.min'¹: A, 0,1 % TFA; B, 0,1 % TFA v 80 % MeCN, 20 % B : 50 % B při 1 % min'¹. Separace se sledují pomocí analytické vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi při 215 nm. Frakce obsahující produkt se spojí, odpařují se ve vakuu a lyofilizují se. Každý peptid se získá lyofilizací z vodné kyseliny octové jako chmýřovitý bílý prášek o konstantní hmotnosti. Čistota finálních peptidů se hodnotí při 215 nm pomocí analytické vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi. Analytická vysokotlaká kapalinová chromatografie s reverzními fázemi se provádí za použití nosiče Vydac C-18 (4,6 x 250 mm, 5 pm, velikost pórů 30 nm, Liquid Separations Group). Lineární gradientový systém se používá při rychlosti toku 1,5 ml.min'¹: HPLC-1, A, 0,1 % TFA; B, 0,1 % TFA v 80 % MeCN;

20 % B : 50 % B při 1 % min'¹; HPLC-2, C, 5 % MeCN v TEAP (0,1 M, pH 3); D, 20 % C v MeCN, 10 % D : 70 % D při 1 % min¹. Eluent kolony se sleduje při 215 nm. Retenční čas a čistota každého peptidů se hodnotí pomocí způsobu řízení vysokotlaké kapalinové chromatografie Rainin Dynamax (Rainin Dynamax HPLC Method Manager). U každého peptidů se zjistilo, že má čistotu >98 %. Výsledné retenční časy vysokotlaké kapalinové chromatografie jsou uvede40 ny v tabulce 1.

- 11 CZ 299362 B6

Tabulka 1. N-methylové analogy a analytická data

Peptid č.	Sekvence N-Me	Hmotnostní spektrum (M-H⁺)	Vysokotlaká kapalinová ehromatografie^c (HPLC^C)
vypočtené³	pozorované^b	(ÍR-l)^d	(tR-₂)^e
1	NMeCpa-cyklo-(DCys-3 Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂	1178,7	1179,2	18,3	19,3
2	Cpa-cyklo(NMe- -DCys-3-Pal-DTrp-Lys- -Thr-Cys)-2- -Nal-NHMe	1192,7	1193,4	19,6	19,3
3	Cpa-cyklo(DCys- -NMe-3-Pal-DTrp- -Lys-Thr-Cys)- -2-Nal-NH₂	1178,7	1178,9	20,3	22,5
4	Cpa-cyklo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-Ly s-Thr-Cys)-2-Nal-nh₂	1178,7	1179,2	17,9	17,2
5	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-NMeLys- -Thr-Cys)-2-Nal- -nh₂	1178,7	1178,9	19,2	18,7
6	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-Lys- -NMeThr-Cys)-2- -Nal-NH₂	1178,7	1179,3	17,4	15,1
7	Cpa-cyklo(DCys-3-Pal-DT rp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-nh₂	1178,7	1179,0	18,5	16,7
8	Cpa-cyklo(DCy s-3 -Pal-DT rp-Ly s-Thr-Cys)-(NMe)-2-Nal-nh₂	1178,7	1179,0	20,3	19,0
9	Cpa-cyklo(DCys-3-Pal-DT rp-Lys-Thr-Cys)-Nal-NH₂	1164,8	1164,7	17,2	17,2
10	Cpa-cyklo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Dip-N HMe	1218,9	1218,9	21,9	20,8
11	Cpa-cyklo(DCy s-3 -Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂	1192,7	1192,3	19,9	19,7
12	Cpa-cyklo(DCys- -Tyr-DTrp-NmeLys- -Thr-Cys)-2-Nal- -nh₂	1193,8	1193,6	24,9	23,1

- 12CZ 299362 B6

Tabulka 1 - pokračování

13	T fm-cyklo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂	1212,2	1212,2	21,4	20,7
14	Cpa-cyklo(DCys-3-Pal-DT rp-N MeLys-Thr-Cys)-DTrp-nh₂	1167,8	1168,0	16,6	14,9
15	Nal-cyklo(DCys-3-Pal-DT rp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-nh₂	1183,2	1183,5	18,0	16,4
16	3 -Pal-cyklo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH₂	1135,0	1134,8	11,5	9,8

^a teoretická molekulová hmotnost (M-H⁺, daltonů). ^b pozorovaná molekulová hmotnost (M-H⁺, daltonů).

^c retenční časy (min) vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi (C-18, 5 pm, 4,6 x 250 mm, λ = 215 nm). Pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie se zjistilo, že každá sloučenina má čistotu >98 %.

ío ^d Eluční systém vysokotlaké kapalinové chromatografie: A, 0,1 % TFA; B, 0,1 % TFA v 80 % MeCN, 20 % B : 50 % B při 1 % min¹ a 1,5 ml.min'¹.

Eluční systém vysokotlaké kapalinové chromatografie-2 (HPLC-2): C, 5 % MeCN v TEAP (0,lM, pH 3); D, 20 % C v MeCN, 10 % D : 50 % D při 1 % min'¹ a 1,5 ml.min'¹.

Analýza aminokyseliny

Peptidy se hydrolyzují ve vakuu (110 °C, 20 h) v 4M kyselině methansulfonové obsahující 0,2 % 3-(2-amino-ethyl)indolu (Pierce). Analýza aminokyseliny se provádí na hydrolyzátech po derivatizaci s o-ftalidaldehydovým činidlem (Sigma Chemical Co.) za použití automatického systému vysokotlaké kapalinové chromatografie (Rainin Instrument Co.) vybaveného 100 x 4,6 mm, 3 pm

Cl8 axiální kompresní kolonou s integrální předkolonou (Microsorb AAAnalysis™, type O; Rainin Instrument Co.). Derivatizované primární aminokyseliny se eluují za použití binárního gradientu pufru A, 0,10M roztok octanu sodného obsahující 4,5 % objem/objem methanolu a 0,5 % objem/objem tetrahydrofuranu při pH 7,2 a pufru B, methanol. Používá se sled gradientu;

0 % A v čase 0 min.; 35 % A v čase 16,5 min; 90 % A v čase 30 min a 90 % A v čase 33 min s rychlostí toku 1,0 ml.min'¹ při teplotě místnosti. Eluent se sleduje při 340 nm a integruje pomocí způsobu řízení Dynamax HPLC Method Manager (Rainin). Standardní retenční časy jsou následující: Asp, 6,6 min; Arg, 19,9 min; Trp, 25,4 min a Lys, 29,5 min. Každý peptid z tabulky 1 poskytuje pro primární aminokyseliny očekávané analytické výsledky. Cystein není kvantifiko30 ván.

Hmotnostní spektrometrie

Peptidy se analyzují pomocí hmotnostní spektrometrie prováděné měřením doby průletu lasero35 vého paprsku při desorpci/ionizaci podporované základní hmotou za použití hmotnostního spektrometru LaserMat 2000 (Thermal Bioanalysis, San Jose, CA.) za použití kyseliny a-kyano-4hydroxyskořicové jako základní hmoty s látkou P (Substance P) (1348,7 daltonů) jako vnitřního

-13CZ 299362 B6 standardu. V každém případě se spektrum skládá z píku hlavního iontu M-H⁺ pro vnitřní standard, očekávaného píku stanovovaného M-H⁺ a několika píku spojených se základní hmotou (<500 daltonů). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Antagonismus inhibice somatostatinu (SRIF) podle uvolňování růstového hormonu (GH)

Přední laloky hypoíýzy z dospělých samců krys se odeberou a dispergují se pomocí dříve popsaného způsobu trypsin/DNase (Murphy W. A., Taylor J., Moreau J.-P. a Coy D. H., Peptide Res., 2, 128 až 132 (1989)). Dispergované buňky se zředí sterilně filtrovaným mediem Eagle modifiío kovaným podle Dulbeka (Dulbecco’s modified Eagle medium) (MEM, Gibco Laboratories,

Grand Island, NY), které se doplní 2,5 % fetálního telecího séra (Gibco), 3 % koňského séra (Gibco), 10 % čerstvého krysího séra (skladovaného na ledu ne déle než 1 h) zhypofýz dárců, % MEM neesenciální aminokyseliny (Gibco), gentamycinem (10 ng/ml; Sigma) a nystatinem (10 000 jednotek/ml; Gibco). Buňky se nahodile plotnují v hustotě přibližně 200 000 buněk/15 jamku (Costar cluster 24; Rochester Scientific Co., Rochester, NY). Plotnované buňky se udržují v dříve uvedeném Dulbekově mediu ve zvlhčované atmosféře z 95 % vzduchu/5 % oxidu uhličitého při 37 °C po 4 až 6 dní. Při přípravě na vyvolání hormonální odezvy se buňky promyjí mediem 199 (Gibco, 3 x 1 ml). Každá dávka sloučeniny podle tohoto vynálezu (6 dávek na plotnu) se zkouší na buňkách triplicitně za přítomnosti 1 nM SRIF v celkovém objemu 1 ml media 199 obsahujícího 1 % BSA (frakce V; Sigma Chemical Co.). Všechny jamky obsahují

GHRH(1-29)NH₂ (1 nM). Kontrolní skupina stimulovaná GHRH(1-29)NH₂ (1 nM) a kontrolní skupina inhibovaná SRIF (1 nM) s GHRH(1-29)NH₂ (1 nM) je obsažena v každé plotně s buněčnou kulturou. Po 3 hodinách inkubace v atmosféře vzduch/oxid uhličitý (95/5 %, 3 h při 37 °C) se medium odstraní a skladuje se při -20 °C dokud není testováno na obsah hormonu. Růstový hormon v mediu se měří pomocí standardní dvojité protilátky RIA za použití složek, které běžně dodává Dr. A. F. Parlow z Národního hormonálního a hypofýzového programu (National Hormone and Pituitary Program (NHHP)), Torrance, CA.

Hodnoty IC₅₀ antagonisty proti SRIF (1 nM) se počítají za použití programu Sigmaplot (Jandel

Scientific, San Rafael, CA). Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměrná hodnota IC₅₀ (nM)±exponenciální vyrovnání průměru (dále jen SEM) a jsou uvedeny v tabulce 2.

- 14CZ 299362 B6

Tabulka 2. Hodnoty vazebných afinit (Κ;) pro klonované lidské receptory ssti_₅ a antagonisty

Pep- tid č.	Místo N“- -meth- ylace	Ki^a±SEM (nM)	ICbo+SEM (nM)^b
hssti	hsst₂	hsstí	hsst₄	hssts
SRXF- -14	N/A^c	2,0+0,35	0,25±0,03	1,210,2	2,010,3	1,410,3	N/A^c
SRIF- -28	N/A^c	1,910,4	0,31+0,06	1,3+0,3	5,412,5	0,410,1	N/A^c
1	Cpa⁵	1000	36+7,6	3301126	1000	40,1+18,8	7,812,7
2^a	D- -Cys⁶	1000	89,0±8,0	576147	1000	106+36	nd^e
3	3- -Pal⁷	1000	189,0135	450+132	1000	1000	nd^e
4	D- -Trp⁸	1000	51,812,6	3901114	1000	93117,7	nď’
5	Lys^{9 *}	1000	17,115,5	66,0+5,8	1000	5,98+0,91	0,7310, 33
6	Thr^lu	395+202	1000	315+12,5	1000	88,5+45,7	nd^e
7	Cys¹¹	1000	810	68,714,7	575	161+52	nd^c
8	2- -Nal¹²	1000	197+55	1000	1000	1000	nd®
9	N/A^c	1395	12,111,9	38,212,4	1000	14014,6	2,610,7
10°	D-Cys⁶	1000	117+24,6	584+305	1000	7661110	nd^e
11	DTrp⁸ a Lys⁹	1000	9,3310,62	140+10,4	1000	112119	2,510,2 0
12	Lys⁹	1000	5,51+1,85	115,1+16,9	1000	70,7125,8	0,53+0, 17
13	Lys⁹	1000	11,3	40,2	1246	45,5	nd®

14	Lys⁹	1000	5,4510,3	91,4111,9	1000	101+14,1	11,614, 2
15	Lys⁹	1000	27,311,45	148+13,2	1000	176165,1	96+13,8
16	Lys⁹	1000	24,7+1,61	537+44,8	1000	313+4,1	287+138

^a vyjadřuje se jako průměrná hodnota±SEM, jednotlivé hodnoty udávají výsledky jednoho vazebného pokusu.

^b IC₅₀ (nM) krysího anatgonisty in vitro versus SRIF (1,0 nM), vyjádřená jako průměrná hodnotaiSEM.

^c neaplikovatelné.

ío ^d peptidy 2 a 10 jsou odlišné peptidy ^e nestanoveno.

-15CZ 299362 B6

Funkční exprese klonovaných receptorů lidského somatostatinu

Genomické klony obsahující receptory lidského somatostatinu (hsstr_b5) (Yamada Y. a kol., Proč.

Nati. Acad. Sci, USA, 89, 251 až 255 (1992); Yasuda K. a kol., J. Biol. Chem., 267, 20 422 až 20 428 (1992); Yamada Y. a kol., Mol. Pharmacol., 42, 2136 až 2142 (1992); Rohrer F. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 90, 4196 až 4200 (1993)), laskavě poskytl Dr. Graeme I. Bell (University of Chicago). Tyto hsstr _b hsstr₂, hsstr₃, hsstr₄, hsstr₅ komplementárních DNA se izolují jako 1,5kilobázový fragment Pstl-Xmnl, 1,7-kilobázový fragment BamHI-HindlII, 2,0-kilobázový fragio ment Ncol-HindlII, 1,4-kilobázový fragment Nhel-Ndel a 1,2-kilobázový fragment HindlII-Xbal, z nichž každý obsahuje úplnou kódující oblast o celé délce receptorů. Tyto fragmenty se nezávisle subklonují do příslušných míst restrikční endonukleázy v savčím vektoru exprese pCMV5, po směru exprese od lidského cytomegalovirového (CMV) promotoru, pro přípravu plazmidů exprese pCMV5/hsstr_b pCMV5/hsstr₂, pCMV5/hsstr₃, pCMV5/hsstr₄ a pCMV5/hsstr₅. Pro trans15 fekci do buněk CHO-K1 se přidá plazmid pRSV-neo (Sbírka amerických typových kultur (American Type Culture Collection), Rockville, MD), který nese selektovatelný neomycinový signální znak savčí buňky.

Exprese a transfekce receptoru

Transfekce se provádí kalciumfosfátovým způsobem. Buňky CHO-K1 se uchovávají v a-minimálním základním médiu (α-MEM; Gibco) doplněném 10% fetálním telecím sérem a transfekují se s každým z plazmidů exprese za použití precipitace fosforečnanem vápenatým. Klony, které zdědily plazmid exprese se vybírají v α-MEM doplněném 500 pg/ml geneticinu (G418; Gibco).

Nezávislé klony CHO-K1 se vyberou pomocí klonování glass-ring a rozšiřují se v kultuře v selektivním mediu. Z izolovaných klonů se připraví membrány a exprese hsstr se zpočátku posuzuje pokud jde o vázání s ['^IjTyr^SRIF a [¹²⁵I]MK-678 (pro sstr₂).

Zkoušky vázáním radioligandů

Buněčné membrány z 5 typů receptorů se získají zhomogenátů (nastavení Polytronu 6, 15 s) příslušných buněk CHO-K1, v ledově studené tris-HCl (50 mM) a odstředěných (39 000 g, 10 min x 2), s resuspenzací meziproduktu v čerstvém pufru. Finální pelety se pro zkoušku resuspendují v tris-HCl (10 mM). Stejné podíly z membrán se inkubují (30 min při 37 °C) s 0,05 nM [^,25I]Tyr”-SRIF (typy 1, 3, 4, 5) nebo [¹²⁵I]MK-678 (typ 2) v 50 mM HEPES (pH 7,4) obsahujícího BSA (lOmg.mf¹), chlorid hořečnatý (5 mM), trasylol (200 tisíc mezinárodních jednotek.ml'¹), bacitracin (0,02 mg.mf¹) a fenylmethansulfonyl-fluorid (0,02 mg.mr'). Objem finální zkoušky je 0,3 ml a inkubace se zastaví rychlou filtrací přes filtry GF/C předem nasáknuté v 0,3% poly(ethyleniminu) za použití Brandelova modulu pro rychlou filtraci. Každá trubice a filtr se potom promyje stejnými podíly studeného pufru (3x5 ml).

Specifické vázání se definuje jako celková vazba radioligandů minus tato vazba za přítomnosti 1,0 μΜ SRIF. Následující hodnoty celkového vázání radioligandů a nespecifického vázání (nsb) se obvykle získají s pomocí těchto testovacích systémů: hsstr_b celkově 7000 cyklů za minutu (cpm) proti 3500 cyklů za minutu nsb; hsstr₂, celkově 9000 cyklů za minutu proti 1000 cyklům za minutu nsb; hsstr₃, celkově 8000 cyklů za minutu proti 1000 cyklům za minutu; hsstr₄, celkově 6000 cyklů za minutu proti 3500 cyklům za minutu nsb a hsstr₅, celkově 7500 cyklů za minutu proti 3500 cyklům za minutu nsb. Vazebné afinity se vyjadřují jako hodnoty Kj±SEM (nM) pro každý z pěti podtypů receptorů ajsou uvedeny v tabulce 2.

Nitrobuněčná mobilizace Ca²⁺ zprostředkovaná typem 5

Buňky CHO-K1, exprimující lidský receptor sst₅ se sklidí pomocí inkubace v 0,3% EDTA/fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (25 °C) a dvakrát se promyjí pomocí odstředění. Promyté buňky se potom resuspendují v Hanksově pufrovaném fyziologickém roztoku (HBSS) pro dávko- 16CZ 299362 B6 vání fluorescenčního indikátoru Ca²⁺ Fura-2AM. Suspenze buněk z přibližně 10⁶ buněk/ml se inkubují s 2 μΜ Fura-2AM po 30 minut při 25 °C. Nevázaný Fura-2AM se odstraní odstředěním dvakrát v HBSS a konečné suspenze se převedou do spektrofluorometru (Hitachi F-2000) vybaveném magnetickým míchacím mechanismem držákem kyvety s regulací teploty. Po dosa5 žení rovnovážného stavu pro 37 °C se pro měření nitrobuněčné mobilizace Ca²⁺ přidají somatostatinové peptidy. Excitované a emitované vlnové délky jsou 340 a 510 nm.

Příkladná data se uvádějí na obr. 1, který zobrazuje výsledky z bezprostředně předcházející zkoušky za použití analogu 5 jako zkušební sloučeniny.

Molekulární modelování

Molekulární modelování se provádí na počítači Silicon Graphics Indigo² High Impact 10 000 za použití softwaru pro molekulární modelování SYBYL, verze 6.6 (Tripos Associates lne., St.

Louis MO, USA) pomocí Kollmanova celoatomového silového pole (Weiner S. J. a kol., J.

Comp. Chem., 7, 230 až 252 (1986). Kartotéka PDB pro tři roztoky NMR struktur výchozí sloučeniny somatostatin/oktreotid: D-Phe⁵-cyklo[Cys⁶-Phe⁷-D-Trp⁸-Lys⁹-Thr’°-Cys¹¹]-Thr¹²-o] (1SOC a 2SOC) se získají z databáze PDB. Tyto struktury se importují do SYBYL 6.6 a mutují se do formy N-methylovaných sloučenin založených na analogu 9. Kollmanovy parciální atomo20 vé náboje se vloží podle slovníku monomerů. Struktury se optimalizují pomocí spojení mutovaných zbytků a potom pomocí úplné minimalizace energie za použití konjugovaného algoritmu gradientu do finálního čtverce průměrné hodnoty kořene (rms) gradientu <0,4184 kJ.mol.nm'¹(0,01 Kcal.mol.Á'¹). Dielektrická funkce závislá na vzdálenosti (McCammon J. A. a kol., Biochem., 18, 927 až 942 (1979)) se použije společně s nastavením prodlevy pro všechny ostatní minimalizační volby. Výsledky jsou podrobně uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3. Kollmanova celková změna energie atomu při sekvenciální methylaci každého zbytku z Cpa-cyklo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂ (analog 9) v každé ze tří konformací roztoku vyjádřená jako kJ.mol'¹ (Kcal.mol'¹).

Analog č.	Místo methylace	1	II	III
1	NmeCpa⁵	-8,368 (-2)	1,674 (0,4)	-4,184
2	NmeDCys⁶, NHMe	71,128(17)	50,208(12)	129,704 (31)
3	NMe-3-Pal⁷	29,288 (7)	71,128(17)	25,104 (6)
4	NmeDTrp⁸	20,92 (5)	25,104 (6)	20,92 (5)
5	NmeLys⁹	25,104 (6)	25,104 (6)	20,92 (5)
6	NMeThr¹⁰	66,944(16)	41,84(10)	50,208(12)
7	NMeCys¹¹	50,208 (12)	58,576(14)	96,232 (23)
8	NMe-2-Nal¹²	16,736(4)	79,496(19)	29,288 (7)

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný při výrobě léčiva pro vyvolání antagonistického působení vůči somatostatinu v lidském nebo živočišném pacientovi, pro podporu uvolňování růstového hormonu v lidském nebo živočišném pacientovi, uvolňování inzulínu v lidském nebo živočišném pacientovi, zvýšení hojení poranění v lidském nebo živočišném pacientovi, podporu angiogeneze v lidském nebo živočišném pacientovi a pro léčení nemoci nebo stavu u lidského nebo jiného živočišného pacienta, který to potřebuje, při kterém jsou uvedená nemoc nebo stav vybrány ze skupiny, zahrnující nedostatečný vzrůst, kachexii, chřadnutí, diabetes typu 2 a nedostatečný oběh.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Součenina obecného vzorce (I)

A‘-cyklo{D-Cys-A²-D-Trp-A³-A⁴-Cys}-A⁵-Y' (I), ío ve kterém

A¹ je volitelně substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A² je volitelně substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A³ je Dab, Dap, Lys nebo Om,

A⁴ je β-hydroxyvalin, Ser, Hser nebo Thr,

15 A⁵ je volitelně substituovaná D- nebo L-aromatická α-aminokyselina, a Y¹ je skupina OH, NH
2 nebo NHR¹, kde R¹ je (Ci_6)alkyl;

ve kterém každá uvedená volitelně substituovaná aromatická α-aminokyselina je substituovaná jedním nebo více substituenty, z nichž každý je nezávisle vybrán ze souboru skládajícího se

20 z halogenu, skupin NO₂, OH, CN, (Ci.₆)alkylu, (C₂.₆)alkenylu, (C₂.₆)alkynylu, (Ciňjalkoxyskupina, skupiny Bzl, O-Bzl a NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle H, O nebo (C|.₆)alkyl, a ve kterém je aminový dusík alespoň jedné z vazeb peptidu mezi A¹ a D-Cys, D-Cys a A², A² a D25 Trp, D-Trp a A³, A³ a A⁴, A⁴ a Cys, nebo Cys a A⁵ podle obecného vzorce (I) substituován methylovou skupinou; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

30 2. Sloučenina podle nároku 1, ve které:

A¹ je Cpa, l-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tfrn, Tyr nebo Tyr(I),

A² je 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tyr nebo Tyr(I), a

A⁵ je Dip, l-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe nebo D-Trp,

35 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
3. Sloučenina podle nároku 2, ve které A¹ je Cpa.
4. Sloučenina podle nároku 2, ve které A³ je NMe-Lys.
5. Sloučenina podle nároku 1, kde uvedenou sloučeninou je sloučenina vzorce: Cpa-cyklo(NMe-D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(NMe-D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe; Cpa-cyklo(D-Cys-NMe-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

45 Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-NMe-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3 -Pal-D-T rp-Lys-Thr-NMe-Cys)-2-N al-N H₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NMe-2-Nal-NH₂;

50 Cpa-cyklo(NMe-D-Cys-3 -Pal-D-T rp-Lys-Thr-Cys)-Dip-N HMe;

- 18CZ 299362 B6

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Tfm-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂;

5 Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂;

nebo

3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
6. Sloučenina podle nároku 4, kde uvedenou sloučeninou je sloučenina vzorce: NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

15 Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂; nebo 3 -Pal-cyklo(D-Cys-3 -Pal-D-T rp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-T rp-NH₂;

20 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
7. Sloučenina podle nároku 5, kde uvedenou sloučeninou je sloučenina vzorce: NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

25 Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMe-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; nebo Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-D-Trp-NH₂;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
8. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedenou sloučeninou je sloučenina vzorce: Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂; nebo Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMe-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

35 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
9. Způsob vázání jednoho nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, při kterém se přivede do kontaktu sloučenina podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, s jedním nebo více

40 z uvedených podtypů receptorů somatostatinu, za předpokladu, že tento způsob není způsobem terapeutického nebo chirurgického ošetřování lidského nebo zvířecího těla, ani diagnostickou metodou, používanou na lidském nebo zvířecím těle.
10. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farma45 ceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro vázání jednoho nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5 v lidském pacientovi nebo jiném živočišném pacientovi.
11. Způsob vyvolání antagonistického působení z buňky, vyznačující se tím, že uvedená buňka obsahuje jeden nebo více receptorů somatostatinu, přičemž uvedený způsob zahr50 nuje krok při kterém se přivede do kontaktu uvedená buňka s účinným množstvím sloučeniny

-19CZ 299362 B6 podle některého z nároků 1, 7 nebo 8 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, za předpokladu, že tento způsob není způsobem terapeutického nebo chirurgického ošetřování lidského nebo zvířecího těla, ani diagnostickou metodou, používanou na lidském nebo zvířecím těle.

5
12. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro vyvolání antagonistického působení vůči somatostatinu v lidském nebo živočišném pacientovi.
13. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaio ceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro podporu uvolňování růstového hormonu v lidském nebo živočišném pacientovi.
14. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro podporu uvolňování inzulínu v lidském nebo živočiš15 ném pacientovi.
15. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro zvýšení hojení poranění v lidském nebo živočišném pacientovi.
16. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro podporu angiogeneze v lidském nebo živočišném pacientovi.

25 17. Způsob zobrazování buněk obsahujících receptory somatostatinu, vyznačující se tím, že zahrnuje přivedení uvedených buněk do kontaktu s účinným množstvím sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, která obsahuje Tyr(I).

30 18. Použití účinného množství sloučeniny podle některého z nároků 1, 7 nebo 8, nebo její farmaceuticky účinné soli při výrobě léčiva pro léčení nemoci nebo stavu u lidského nebo jiného živočišného pacienta, který to potřebuje, při kterém jsou uvedená nemoc nebo stav vybrány ze skupiny, zahrnující nedostatečný vzrůst, kachexii, chřadnutí, diabetů typu 2 a nedostatečný oběh.