CZ20032281A3

CZ20032281A3 - Antagonisté somatostatinu

Info

Publication number: CZ20032281A3
Application number: CZ20032281A
Authority: CZ
Inventors: William A. Murphy; Walajapet G. Rajeswaran; David H. Coy
Original assignee: The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2004-01-14
Also published as: CA2439498A1; ATE394114T1; US7408024B2; WO2002072602A2; DK1372688T3; RU2328504C2; NO20033911D0; PL362838A1; EP1372688A4; US20040181032A1; ES2306766T3; HUP0401535A2; RU2263678C2; US20080020970A1; JP4204322B2; RU2005117614A; NO20033911L; EP1372688A2; JP2004532824A; WO2002072602A3

Description

Antagonisté somatostatinu

Oblast techniky

Vynález se týká antagonistů somatostatinu a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Somatostatin (dále jen SRIF), tetradekapeptid, který objevil Brazeau a kol., prokázal, že má silné inhibiční účinky na různé sekreční procesy v tkáních jako jsou hypofýza, slinivka břišní a gastrointestinální trakt. SRIF také působí jako neuromodulátor v centrálním nervovém systému. Tyto biologické účinky SRIF, všechny inhibiční z hlediska povahy, jsou vyvolány prostřednictvím řady G proteinem vázaných receptorů, z nichž bylo charakterizováno pět různých podtypů (sstn až sstrs) . Těchto pět podtypů má podobné aifinity pokud jde o endogenní ligandy SRIF, ale vykazuje odlišnou distribuci v různých tkáních. Somatostatin se váže k pěti podtypům odlišných receptorů (SSTR) s relativně vysokou a stejnou afinitou pro každý potyp. Vázání k různým typům podtypů somatostatinu je spojováno s léčením různých stavů a/nebo nemocí. („sstr2) (Raynor a kol., Molecular Pharmacol., 43, 838 (1993); Lloyd a kol., Am. J. zatímco inhibice insulinu somatostatinu typu-5 („sstrs) (1993) ) hormonu hormon) (akromegalie) :tyreostimulační hormon)

Physiol., 268, G 102 (1995)), je připisována receptorů (Coy a kol., 197, 366 až 371

Aktivace typů 2 a 5 je spojována se supresí růstového a podrobněji s adenomy vylučujícími GH (růstový a adenomy vylučujícími TSH Aktivace typu 2, ale nikoliv typu 5, je spojována s léčením adenomů vylučujících prolaktin. Jiné indikace spojované s aktivací podtypů receptorů somatostatinu

jsou inhibice insulinu a/nebo glukagonu pro léčení cukrovky, angiopatie, proliferativní retinopatie, Downova jevu a nefropatie; inhibice sekrece žaludeční kyseliny a podrobněji peptických vředů, enterokutánního a pankreatikokutánního píštěle, dráždivého střevního syndromu, Dumpingová syndromu, syndromu vodové stolice, diarey spojené s AIDS, chemoterapií vyvolané diarey, akutní nebo chronické pankreatitidy a nádorů vylučujících gastroíntestinální hormon; léčení rakoviny jako je hepatom; inhibice angiogeneze, léčení zánětlivých poruch jako je artritida; retinopatie; chronické odmítnutí štěpu; angioplastie; odmítnutí cévního štěpu a gastroíntestinální krvácení. Je výhodné mít analog, který je selektivní pro subtyp nebo subtypy specifického receptorů somatostatinu zodpovědné za požadovanou biologickou odezvu, a tak snižující interakci s jinými podtypy receptorů, která by mohla vést k nežádoucím vedlejším účinkům.

Vývoj silných agonistů SRIF s menší molekulou vedl k objevu odlišných afinit různých omezených ligandů pro různé podtypy. Zdá se, že sekvence Trp⁸-Lys⁹ je často přítomná o

v ligandech, které jsou rozlišovány receptorem. Sekvence Trp -Lys⁹ tvoří část β-vazby, která je obvykle stabilizována cestou (substituce D- za L-Trp, cyklizací hlavního řetězce, disulfidového můstku nebo všech sférických napětí. Jedním z nezamýšlených důsledků takového strukturálního zjednodušení, které bylo prováděno před objevením mnohočetných podtypů receptorů, byla ztráta širokého spektra vazebné afinity. To je symbolizováno pomocí vysokých afinit peptidů typu 2 ale nízkých afinit typu 1, 3, 4 a 5 v řadě OCTREOTIDU®. Tudíž mnoho základních biologických studií s tímto typem analogu neuspělo při zjištění účinků zprostředkovávaných pomocí všech, s výjimkou jednoho, z typů receptorů somatostatinu. Od té doby pak bylo na jedné straně vynaloženo mnoho práce na

• ΦΦΦ znovuzavedení širšího spěktra vázání do malých, biologicky stabilních peptidů a do vývoje peptidů a peptidomimetik s odlišnou specificitou pro jednotlivý receptor.

Původci zjistili, že sterické napětí hlavního řetězce může být zavedeno pomocí N-alkylace jednotlivých aminokyselin. Tato modifikace do značné míry omezuje postižený zbytek a aminokyselinu, která ho v rozšířené konformaci předchází. Tudíž, navíc blokuje potenciální intramolekulárrií vazebná místa vodíku a také místa štěpení proteolytického enzymu a tak silně zvyšuje farmakokinetické vlastnosti peptidů. Pouze málo N-methylovaných aminokyselin je průmyslově dostupných a jejich syntéza je obtížná. Avšak v některých aspektech předkládaného vynálezu, původci objevili postup k analogům somatostatinu omezeným v každém zbytku aminokyseliny N-methylátem za použití způsobu přípravy v pevné fázi, přejatého z nedávno vydané publikace, kterou zveřejnili Miller a Scanlan.

Podstata vynálezu

V jednom aspektu je předkládaný vynález směrován k peptidů obecného vzorce (I)

A¹~cyklo { D-Cys-A²-D-Trp-A³-A⁴-Cys } -A^Y¹ (I) ve kterém:

A¹ je popřípadě substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A² je popřípadě substituovaná aromatická oí-aminokyselina,

A³ je Dab, Dap, Lys nebo Orn,

A⁴ je β-hydroxývalin, Ser, Hser nebo Thr,

A⁵ je popřípadě substituovaná D- nebo L-aromatická α-aminokyselina, a • · *

Y¹ je skupina OH, NH2 nebo NHR¹, kde R¹ je (C1-6) alkyl;

ve kterém každá uvedená popřípadě substituovaná aromatická oí-aminokyselina je popřípadě substituovaná jedním nebo více substituenty, z nichž každý je nezávisle vybrán ze souboru skládajícího se z halogenu, skupin NO2, OH, CN, (Ci-e) alkylu, (C2-6) alkenylu, (C2-6) alkynylu, (Ci-g) alkoxyskupiny, skupin Bzl, O-Bzl a NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle H, 0 nebo (C1-6) alkyl, a ve kterém aminový dusík každé z amidových vazeb peptidu a aminových skupin z A¹ podle obecného vzorce (I) je popřípadě substituován methylovou skupinou, za předpokladu, že tam se tam vyskytuje při nejmenším jedna uvedená methylová skupina, nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

V jednom ztělesnění tento vynález věnuje pozornost peptidům obecného vzorce (í), ve kterém:

A¹ je Cpa, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tfm, Tyr nebo Tyr(I),

A² je 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tyr nebo Tyr(I), a

A⁵ je Dip, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe nebo D-Trp, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V jiném ztělesnění tento vynález věnuje pozornost peptidu z bezprostředně předcházející skupiny peptidů, ve kterém A¹ je

Cpa.

I

V dalším ztělesnění tento vynález věnuje pozornost peptidu z bezprostředně předcházející skupiny peptidů, ve kterém A³ je NMeLys.

V ještě dalším ztělesnění tento vynález věnuje pozornost peptidu obecného vzorce (I), ve kterém je uvedeným peptidem:

NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo (NMteD-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys) -2-Nal-NHMe;

Cpa-cyklo(D-Cys-NMe-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NMe-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(NMeD-Óys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Dip-NHMe;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Tfm-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2;

Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2; nebo

3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NEb;

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2/

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2;

Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-Nfte; nebo

3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2;

nebo jeho farmaceutický přijatelná sůl.

V stále ještě dalším ztělesnění tento vynález věnuje pozornost peptidu obecného vzorce (I) , ve kterém je uvedeným peptidem:

NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo (D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-NMeLys-Thr-Cys.) -2-Nal-NH2;

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; nebo

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2;

nebo jeho farmaceuticky přijatelná $ůl.

Ve stále ještě dalším ztělesnění tento vynález věnuje pozornost peptidu z bezprostředně předcházející skupiny peptidů, ve kterém je uvedeným peptidem:

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; nebo

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

V jiném aspektu předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu vázání jednoho nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5, který zahrnuje krok přivedení do kontaktu sloučeniny podle patentového nároku 1

• · « 9 « »

9

Ί nebo její farmaceuticky přijatelné soli s jedním nebo více z uvedených podtypů receptorů somatostatinu.

V jednom ztělesnění bezprostředně předcházejícího aspektu věnuje předkládaný vynález pozornost způsobu vázání jednoho nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5 v lidském pacientovi nebo jiném zvířecím pacientovi, který zahrnuje krok podávání účinného množství sloučeniny podle patentového nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pacientovi, který to potřebuje.

V jiném ztělesnění aspektu podle předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu vylákání antagonistického působení vůči somatostatinu z buňky, ve kterém uvedená buňka obsahuje jeden nebo více receptorů somatostatinu, přičemž uvedený způsob zahrnuje přivedení této buňky do kontaktu s účinným množstvím sloučeniny podle nároku Ϊ nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

V jiném ztělesnění předkládaný vynález poskytuje způsob pro vyvolání antagonistického účinku vůči somatostatinu v lidském pacientovi nebo jiném živočišném pacientovi, který zahrnuje krok podávání účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pacientovi, který to potřebuje.

V dalším ztělesnění předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu podpory uvolňování růstového hormonu v lidském nebo živočišném pacientovi, který zahrnuje podávání uvedenému pacientovi účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

« · 9 9 e · 9 9 • 9 * » 9 «99999

9 « 999999 9 ««9 999» <9 99 99999 99 99

V jiném ztělesnění předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu podpory uvolňování inzulínu v lidském nebo živočišném pacientovi, který to potřebuje, který zahrnuje podávání uvedenému pacientovi účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

V jiném ztělesnění předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu zvýšení hojení poranění u lidského nebo živočišného pacienta, který to potřebuje, který zahrnuje podávání uvedenému pacientovi účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

V ještě dalším ztělesnění předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu podpory angiogeneze v lidském nebo živočišném pacientovi, který to potřebuje, který zahrnuje podávání uvedenému pacientovi účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

V jiném ztělesnění předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu léčení nemoci nebo stavu lidského nebo jiného živočišného pacienta, který to potřebuje, který zahrnuje krok podávání účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli uvedenému pacientovi, při kterém uvedená nemoc nebo stav je vybrán ze skupiny, která se skládá z nedostatečného vzrůstu, sešlosti, chřadnutí, diabetů typu 2, nedostatečného oběhu a podobných.

V jiném aspektu předkládaného vynálezu je věnována pozornost způsobu reprodukce buněk, které obsahují receptory somatostatinu, který zahrnuje přivedení uvedených buněk do kontaktu s účinným množstvím sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, která obsahuje Tyr(I).

• ···· · · · ·· ···· ft ft · ftftftft · · · * · ft····» ft · ft ftftft··· · • · ft·· « · ft · «·· i ·«· ftft «· ··

Popis obrázků na výkrese

Obr. 1 je graf zobrazující in vitro inhibici mobilizace nitrobuněčného vápníku (Ca²⁺) zprostředkovanou hsstr-5.

Dále následuje podrobný popis vynálezu.

Odborník v oboru může, na základě zde uvedeného popisu, využít předkládaný vynález v jeho nejpinějším rozsahu. Následující typická ztělesnění jsou proto vytvořena jako pouhá znázornění tohoto vynálezu a není záměrem je vytvořit jako omezení plného rozsahu tohoto vynálezu.

Jak je dobře známo odborníkovi v oboru, známá a potenciální použití somatostatinu jsou různá a mnohočetná. Je známo, že somatostatin a jeho analogy jsou užitečné při léčení nemocí a/nebo stavů jejichž seznam je uveden dále. Různá použití somatostatinu mohou být shrnuta následovně: Cushingova riemoc (viz Clark R. V. a kol., Clin. Res., 38, 943A (1990)), gonadotropinomie (viz Ambrosi B. a kol., Acta Endocr., Kodaň, 122, 569 až 576 (1990)), hyperparatyreidismus (viz Miller D. a kol., Canad. Med. Ass. J., 145, 227 až 228 (1991), Pagetova nemoc (viz Palmieri G. M. A. a kol., J. of Bone and Minerál Research, Ί_ (dodatek 1), S240 (abstrakt 591) (1992)), nemoc

VIP (viz Koberstein B. a kol., Z. Gastroenterologý, 28, 295 až 301 (1990) a Christensen C., Acta Chir. Scand., 155, 541 až

543 (1989)), nesidioblastomie a hyperinzulinismus (viz Laron

Z., Israel J. Med. Sci., 26 (_1) , 1 až 2 (1990), Wilson D. C.,

Irish J. Med. Sci., 158 (jL) , 31 až 32 (1989) a Micic D. a kol., Digestion, 16 (dodatek 1), 70 (abstrakt 193) (1990)), gastrinomie (viz Bauer E. E. a kol., Europ. J. Pharmacol., 183, 55 (1990)), nemoc Zollinger-Ellison (viz Mozell E. a kol., Surg. Gynec. Obstet., 17 0, 476 až 484 (1990)), « ·· · ··· · «· *· hypersekreční diarhea spojená s AIDS a jiné stavy (způsobené AIDS viz Cello J. P. a kol., Gastroenterology, 98 (5_) , část 2, dodatek, A163 (1990)), způsobené ^výšeným obsahem peptidu uvolňujícím gastrin viz Alhindawi R. a. kol., Can. J. Surg., 33, 139 až 142 (1990), druhotné proti střevnímu štěpu versus

onemocnění hostitele viz Bianco J. A. a kol.,	Transplantation,
£9, 1194 až	1195 (1990), diarhea	spojená s	chemoterapii	viz
Petrelli N.	a kol.,	Proč. Amer.	Soc. Clin.	Oncol., 10»	138
(abstrakt č	. 417)	(1991)), dráždivě onemocnění střev	(viz
0' Donnel L.	J. D. a	kol. , Aliment.	Phármacol.	Therap . , £,	177

až 181 (1990)), pankreatitida (viz Tulassay Z. a kol.,

Gastroenterology, 98 (.5) , (část 2, dodatku), A238 (1990)),

Crohnova nemoc (viz Fedorak R. N. a kol., Can. J. Gasroenterology, 3 (2), 53 až 57 (1989)), systémová skleróza (viz Soudah H. a kol., Gastroenterology, 98 (5), část 2 (dodatek), A129 (1990)), rakovina štítné žlázy (viz Modiglianí E. a kol., Výroční endokrinologické sympozium (Ann., Endocr.) (Paříž), 50, 483 až 488 (1989)), psoriáza (viz Camisa C. a kol., Cleveland Clinic J. Med., 57 (£) , 71 až 76 (1990)), hypotenze (viz Hoeldtke R. D. a kol., Arch. Phys. Med. Rehabil., 69, 895 až 898 (1988) a Koonep J. S. a kol., Brit.

J. Clin. Phariftacol., 28, 735P až 736P (1989)), záchvaty úzkosti (viz Abelson J. L. a kol., Clin. Psychopharmacol., 10, 128 až 132 (1990)), skleredém (viz Soudah H. a kol., Clin.

Res., 39, 303A (1991)), malá střevní obstrukce (viz Nott D. M. a kol., Brit. J. Surg., 77, A691 (1990)), gastroesof agální reflux (viz Branch M. S. a kol., Gastroenterology, 100 (5), část 2 (dodatek), A425 (1991)), duodenogastrický reflux (viz

Hasler W. a kol., Gastroenterology, 10, (5), část 2 (dodatek),

A448 (1991)), Gřavesova nemoc (viz Chang T. C. a kol., Brit.

Med. J., 304, 158 (1992)), polycystická nemoc vaječníku (viz

Prelevic G. M. a kol., Metabolism Clinical and Experímental, 41, dodatek 2, 76 až 79 (1992)), krvácení z horního <<· · gastrointestinálního traktu (viz Jenkins S. A. a kol., Gut., 33, 404 až 407 (1992) a Arrigoni A. a kol., American Journal of Gastroenterology, 87, 1311 (abstrakt 275) (1992)), ankreatické nepravé cysty a břišní vodnatelnost (viz Hartley J. E. a kol., J. Roy. Soc. Med., 85, 107 až 108 (1992)), leukemie (viz Santini a kol., 78 (dodatek 1), 429A (abstrakt 1708) (1991), meningiom (viz Koper J. W. a kol., J. Clin. Endocr. Metab., 7 4, 543 až 547 (1992) a rakovinná kachexie (viz Bartlett D.L. a kol., Surg. Fórum, 42, 14 až 16 (1991) .

Obsahy předázejících odkazů jsou zde zahrnuty formou odkazů.

Peptidy podle tohoto vynálezu jsou užitečné jako. antagonisté k působení nebo působením somatostatinu. Například peptidy podle tohoto vynálezu mohou být použity pro podporu uvolňování růstového hormonu nebo insulinu v pacientovi (např. savci, jakým je lidský pacient). Tudíž tyto peptidy jsou užitečné při léčení fyziologických stavů, při kterých je podpora uvolňování růstového hormonu nebo insulinu prospěšná. Peptidy podle tohoto vynálezu mohou také být použity při zvýšení hojení poranění nebo při podpoře angiogeneze. Dále mohou být použity peptidy podle tohoto vynálezu, které obsahují zbytek Tyr(I) pro reprodukci buněk, které obsahují receptory somatostatinu. Takové peptidy podle tohoto vynálezu mohou být použity buď in vivo pro zjištění buněk, které obsahují receptory somatostatinu (např. rakovinových buněk) nebo in vitro jako radioligand při zkoušce vázání receptoru somatostatinu. Peptidy podle tohoto vynálezu mohou být také použity jako vektory pro označení buněk pomocí radioaktivních izotopů.

Do rámce tohoto vynálezu je také zahrnovaný peptid krytý pomocí výše uvedeného generického vzorce, jak pokud jde o použití při léčení nemocí nebo poruch spojených s potřebou • · · ·

podpory uvolňování růstového hormonu nebo insulinu, tak použití při zjišťování receptoru somatostatinu např. radíoznačením.

Sloučenina obecného vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl může být podávána orálně, parenterálně (např. nitrosvalovými, nitropobřišnicovými, nitrožilními nebo subkutáními injekcemi nebo implantáty), nasálními, vaginálními, rektálními, subligválními nebo lokálními způsoby podávání a může být formulována s farmaceuticky přijatelnými nosiči pro získání dávkových forem vhodných pro každý způsob podávání.

Dávkové formy v pevnétn stavu pro orální podávání zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V takových dávkových formách v pevném stavu je aktivní sloučenina smíchána s nejméně jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako jsou sacharóza, lgktóza nebo škrob. Takové dávkové formy mohou také obsahovat, jak je běžné v praxi, pomocné látky jiné než taková inertní ředidla, např. lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý. V případě kapslí, tablet nebo pilulek, mohou dávkové formy také obsahovat pufrovací činidla. Tablety a pilulky mohou být připraveny s enterickými povlaky.

Kapalné dávkové formy pro orální podávání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry obsahující inertní ředidla běžně používaná v oboru, jako je voda. Kromě takóvých inertních ředidel, může kompozice také zahrnovat adjuvans, jako jsou zvhlčovací činidla, emulgační a suspenzační činidla, a sladidla, příchuti a parfumační činidla.

Prostředky pro parénterální podávání podle tohoto vynálezu zahrnují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Příklady nevodných rozpouštědel nebo vehikul jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako jsou olivový olej a kukuřičný olej, želatina, a ipjektovatelné organické estery, jako je ethyl-oleát. Takové dávkové formy mohou také obsahovat adjuvans, taková jako jsou konzervační činidla, zvlhčovadla, emulgační a dispergační činidla. Mohou být sterilizovány, například filtrací přes bakterie zadržující filtr, začleněním sterilizačního činidla do kompozice, pomocí ozařování kompozice nebo zahříváním kompozice. Mohou být také vyráběny ve formě sterilních kompozic v pevném stavu, které mohou být rozpuštěny v sterilní vodě nebo některých jiných sterilních injektovatelných prostředích bezprostředně před použitím.

Kompozicemi pro rektální nebo vaginální podávání jsou výhodně čípky, které mohou obsahovat, navíc k aktivní látce, excipiens, jako je kakaové máslo nebo čípkový vosk.

Kompozice pro nasální nebo sublingvální podávání jsou také připravovány se standarními excipiens dobře známými v oboru.

Dávka aktivní složky v kompozicích podle tohoto vynálezu se může lišit, avšak je nezbytné, aby množství aktivní složky bylo takové, že je získána vhodná dávková forma. Zvolená dávka závisí na požadovaném léčebném účinku, na způsobu podávání a na době trvání léčení. Obecně jsou pro získání požadovaného léčebného účinku podávány úrovně dávek mezi 25 pg/kg/den a 100 mg/kg/den tělesné hmotnosti denně jako jedna dávka nebo rozdělené do více dávek lidem nebo jiným živočichům, např. savcům.

9999 · ·· ·· ·«· • · · <99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99

Výhodný obecný rozsah dávky je od 250 pg/kg/den do 5,0 mg/kg/den tělesné hmotnosti denně, který může být podáván jako jedna dávka nebo rozdělena do více dávek.

Kromě toho může být sloučenina obecného vzorce (I) podávána v kompozici se setrvalým uvolňováním, jako jsou kompozice popsané v následujících patentech. Mezi těmito prostředky, jsou výhodné prostředky se 14-denním nebo 28denním pomalým uvolňováním. US patent č. 5 672 659 zdůrazňuje kompozice se setrvalým uvolňováním obsahující peptid a polyester. US patent č. 5 595 760 zdůrazňuje kompozice se stervalým uvolňováním obsahující peptid v gelovatelné formě. US patent č. 5 821 221 zdůrazňuje polymerní kompozice se stervalým uvolňováním obsahující peptid a chitosan. US patent č. 5 916 883 zdůrazňuje kompozice se setrvalým uvolňováním peptid a cyklodextrin. Mezinárodní patentová č. PCT/US99/01180 (publikace WO 99/38536, z 5.

srpna, 1999) zdůrazňuje absorbovatelné kompozice peptidu se setrvalým uvolňováním. Obsahy dříve uvedených patentů a přihlášek jsou zde zahrnuty ve formě odkazů.

obsahuj ící přihláška

Použití kompozic s okamžitým nebo setrvalým uvolňováním závisí na typu indikací, které jsou cílem. Jestliže indikaci tvoří akutní nebo nadakutní poruchy, bude upřednostňováno léčení pomocí formy s okamžitým uvolňováním prpti stejnému léčení pomocí kompozice se setrvalým uvolňováním. Proti tomu pro preventivní dlouhodobé léčení bude obecně upřednostňována kompozice s prodlouženým uvolňováním.

Dále následuje vysvětlení zkratek.

Nomenklatura pro podtypy receptorů somatostatinu je v souladu s doporučeními IUPHAR, ve kterých se sstr₄ týká

A Α A · ···· ♦AAA «

A A A A ·

AAAAA A * · · · A · receptoru, který původně klonoval Bruno a kol., a sstrs se týká receptoru, který klonoval 0'Carrol a kol.

Zkratky běžných aminokyselin jsou v souladu s doporučeními IUPAC-IUB. Kromě toho jak jsou používány zde, jsou vysvětlení pro určité zkratky následující:

Abu

Aib β-Ala

Amp

Ava

Cha

Cpa

Dab

Dap

Dip

Gaba

HSer

1- Nal

2- Nal

Nle

Nva

2- Pal

3- Pal

4- Pal

Tfm

TfmA Tyr(I) α-aminobutyrová kyselina, α-aminoisobutyrová kyselina, β-alanin,

4- aminofenylalanin,

5- aminovalerová kyselina, cyklohexylalanin,

3-(4-chlorfenyl)alanin,

2,4-diaminobutyrová kyselina,

2,3-diaminobutyrová kyselina,

3,3'-difenylalanin, γ-aminobutyrová kyselina, homoserin,

3-(1-naftyl)alanin,

3-(2-naftyl)alanin, norleucin, norvalin,

3-(2-pyridyl)alanin,

3-(3-pyridyl)alanin,

3- (4-pyridyl)alanin, trifluormethyl, a

4- trifluormethylfenylalanin.

Iodidovaný tyrosinový zbytek (např. 3-1-Tyr,

5- 1-Tyr, 3,5-1-Tyr), ve kterém jodem může být radioaktivní izotop , např. I125, I127 nebo I131.

<· · · · « · · ·· · · · ♦ 4 · · 4 « * «····· ·♦ · 4 4 4 4 4· 4 z- ·· ·**····

IQ ··· · ·44 4» «· «· *· «···

Mohou se zde také objevit následující zkratky určitých

činidel:
DBU	1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en,
DCM	dichlormethan,
DIC	diisopropylkarbodiimid,
DIEA	diisopropylethylamin,
DMF	dimethylformamid,
MTBD	1,3,4,6,7,8-hexahydro-l-methyl-2H~pyrimidol- [1,2-a]pyrimidin,
O-NBS	2-nitrobenzensulfonyl,
TBTU	o-benztriazol-l-yl-N,N,Ν',Ν'-tetramethyl- uroniumtetrafluorborát, a
TFA	trifluoroctová kyselina.

S výjimkou N-konce aminokyseliny, všechny zkratky (napřCpa pro A¹) aminokyselin v tomto vynálezu představují strukturu -NH-CH(R)-C0-, ve které R je vedlejší řetězec aminokyseliny (např. CH₃ pro Ala). Pokud jde o N-konec aminokyseliny, zkratka představuje sttukturu (R¹R²) —lSf—CH (R) -C0-, ve které R je vedlejší řetězec aminokyseliny a každý z R¹ a R² je nezávisle H nebo takový, jak je zde jinak blíže určeno.

Alifatickou aminokyselinou je α-aminokyselina, která obsahuje jeden nebo dva vedlejší řetězce, které, nezávisle, jšou uhlovodíky např. přímý nebo rozvětvený řetězec z 1 až 6 atomů uhlíku. Příklady alifatických aminokyselin zahrnují Ala, Aib, Val, Leu, Tle, Ile, Nle, Nva nebo Abu.

To co je míněno „aromatickou α-aminokyselinou je zbytek aminokyseliny obecného vzorce • 9·9 • 9 «999 • •9 · • 9 9 9 · 9 9 · 9 «99 • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • 99 99 99 99

Z^H-Z, —NH-CH-COkde Zi je částice obsahující aromatický kruh a Z2 je vodík nebo částice obsahující aromatický kruh. Příklady takových aromatický kruh obsahujících částic zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, benzenový nebo pyridinový kruh a následující struktury s nebo bez jednoho nebo více substituentu X na aromatickém kruhu (kde X je, nezávisle pro každý výskyt, halogen, skupina NO2, CH3, OCH3, CF3 nebo OH) :

Jinými příklady aromatické α-aminokyseliny podle tohoto vynálezu jsou substituované kyseliny His, jako jsou MeHis, His(t-Me) nebo His(n-Me).

Jak je používán zde, výraz „alkyl je zamýšlen tak, že zahrnuje takové alkylové skupiny, které mají označenou délku, a jsou buď v lineární nebo rozvětvené konfiguraci. Příkladně jsou takovými alkylovými skupinami methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sek-butyl,teriární butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, isohexyl a podobné. Když je ve vysvětlení obsažen výraz Co-alkyl, je určený pro označení jednoduché kovalentní vazby.

0 0 0 • · 0 0 0 0

Výraz „nižší alkyl je zamýšlen tak, že zahrnuje alkylové skupiny s jak rozvětveným tak přímým řetězcem, které mají 1 až 6 atomů uhlíku.

Jak je používán zde, výraz „aryl je zamýšlen tak, že zahrnuje jakýkoliv stabilní monocyklický, bicyklický nebo tricyklický kruh(y) o až 7 členech v každém kruhu, ve kterém je nejméně jeden kruh aromatický. Příklady arylových skupin zahrnují fenyl, naftyl, ahthracenyl, bifenyl, tetrahydronaftyl, indanyl, fenanthrenyl a podobné.

Výraz „heterocyklový radikál, jak je používán zde, představuje stabilní 5- až 7-členný monocyklický nebo stabilní 8- až 11-členný bicyklický nebo stabilní 11- až 15-členný tričyklický heterocyklický kruh, který je buď nasycený nebo nenasycený a který se skládá z atomů uhlíku a od jednoho do čtyřech heteroatomů vybraných ze skupiny, která se skládá z dusíku, kyslíku a síry, a který obsahuje jakoukoliv bicyklickou skupinu, ve které je kterýkoliv z výše popsaných heterocyklických kruhů kondenzovaný k benzenovému kruhu. Tento heterocyklický kruh může být připojen ke kterémukoliv heteroatomů nebo atomu uhlíku, což má za následek vytvoření stabilní struktury. Příklady takových heterocyklických prvků zahrnují, ale bez omezení na ně, azepinyl, benzoimidazolyl, benzoisoxazolyl, benzofurazanyl, benzopyranyl, benzothiopyranyl, benzofuryl, benzothiazolyl, benzothienyl, benzoxazolyl, chromanyl, cinnolinyl, dihydrobenzofuryl, dihydrobenzothienyl, dihydrobenzothiopyranyl, dihydrobenzothiopyranylsulfon, furyl, imidazolidinyl, imidazolinyl, imidazolyl, indolinyl, indolyl, isochromanyl, isoindolinyl, isochinolinyl, isothiazolidinyl, isothiazolyl, isothiazolidinyl, morfolinyl, nafthyridinyl, oxadiazolyl, 2-oxoazepinyl, 2-oxopiperazinyl,

2-oxo2-oxopiperidinyl,

9 9 9 ♦ 999

• 9 9 · * • · 9 9 9

9 9 9 9 9

99 9 9 pyrrolidinyl, piperidyl, piperazinyl, pyridyl, pyridyl N-oxid, chinoxalinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydroisochinolinyl, teťrahydrochinolinyl, thiamorfolinyl, thiamorfolinyl sulfoxid, thiazolyl, thiazolinyl, thienofuryl, thienothienyl, thienyl a podobné.

Výraz „substituovaný je míněn tak, že zahrnuje uvedenou chemickou skupinu (např. nižší alkyl, aryl, cykloalkyl atd.) substituovanou jedním nebo více z uvedených substituentů (např. halogenem, hydroxyskupinou, nižším alkylem atd.). Substituenty mohou být připojeny k jakémukoliv atomu v chemické skupině.

Zkratka „NMe je výrazem pro „N-methyl-,,. Jak je používán zde NMe označuje, žé dusík amidové skupiny z připojené aminokyseliny je methylován. Tudíž „NmeCpa označuje -N(CH3)-CH(R)-CO-, kde R je 4-chlorfenyl, „Nme-2-Nal označuje -N (CH3)-CH(R)-C0-, kde R je 2-naftyl a tak dále.

alkoxyskupin propoxyskupina, butoxyskupina,

Výraz alkoxy je míněn tak, že zahrnuje takové alkoxyskupiny, které mají označenou délku a jsou buď v lineární nebo rozvětvené konfiguraci. Příklady takových jsou methoxyskupina, ethoxyskupina, isopropoxyskupina, butoxyskupina, isoterciární butoxyskupina, pentoxyskupina, isopentoxyskupina, hexoxyskupina, isohexoxyskupina a podobné.

Výraz halogen nebo halogenová skupina je míněn tak, že zahrnuje atomy halogenu, jako jsou fluor, chlor, brom a jod.

Když je zbytek aminokyseliny opticky aktivní, je to L-forma, která je tím míněna^ pokud není výslovně uvedena D-forma.

• 99 9 • 9 9 9 • · 9 · 9

9 9 · 9

99

Dále následuje popis použitých látek.

4-Methylbenzohydrylaminhydrochloridová pryskyřice (0,25 nebo 0,5 miliekvi valentu. g¹) byla získána od společnosti AdvancedChemTech lne., Louisville, KY. N^a-terc-butyloxykarbonylem (Boc) bráněné aminokyseliny byly zakoupeny od společností Bachem lne., Torránce, Ca; AdvancedChemTech lne. a Synthetech lne., Albany, OR. Reaktivní vedlejší řetězce aminokyselin byly kryty jednou z následujících skupin: Cys, 4-methylbenzyloxykarbonyl; Lys, 2-chlrobenzyloxykarbonyl; Thr, O-benzyl; Tyr, 0-2,6-dichlorbenzyl. Všechna činidla a rozpouštědla měla stupeň čistoty podle standardu ACS (ACS (American Chemical Society) = Americká chemická společnost) nebo vyšší a byla používána bez dalšího čištění.

Příklady provedení vynálezu

Syntéza peptidu

Syntéza peptidu se může rekapitulovat pomocí následující reakce

Schéma:

H2N—(AA)r—©

2-nitrobenzensulfonylchlorid 02

Kolidin, Ch^CI.

(AA)n—O

MTBD/DMF, Methyl_v -4-nitrobenzensulfonát

1) Boc-AA-OH TBTU/DMF

2) Boc-AA-OH HATU/DMF

X_MA^ dbu/dm HN-(AA>r-<J ^Λ HSCH2CH2C

HSCH2CH2OH qV

Ijst^- (AA)ň—©

Me

B01

Sloučeniny obecného vzorce (I) se mohou a jsou syntetizovány na 4-methylbenzhydrylaminem funkcionalizované z 1 % křížově zesíťované polystyrénové pryskyřici (0,25 nebo 0,5 miliekvalentu.g ^x)

0,25mmol měřítku v syntetizéru společnosti AdvancedChemTech (model 2000), za využití následujícího protokolu: deblokace, 40% TFA (2 min, 20 min); cyklus promytí DCM (tři promytí); neutralizace, 10% DIEA (1 min, 5 min); cyklus promytí DMF, cyklus promytí DCM (dvě promytí); dvojnásobná kondenzace; první s estery 1,3-diisopropylkarbodiimidu (3 ekv. ) , 30 min v DCM; promytí DCM (tři promytí); druhá kondenzace s předem připravenými estery TBTU (3 ekv.), 90 min v DMF s katalytickým nožstvím DIEA; promytí DMF (jedno promytí); promytí DCM (tři promytí). Kondenzační reakce jsou sledovány pomocí kvalitativní analýzy.

Bránění N^a

Po zbavení aminoskupiny ochrany v žádoucím místě methylace, se pryskyřice suspenduje v DCM (20 ml). K této suspenzi se přidá kolidin (3 ekv.) a o-nitrobenzensulfonylchlorid (3 ekv.) a směs se protřepává za použití syntetizéru společnosti AdvancedChemTech (model 2000) po 2 h. Potom se pryskyřice promyje DCM (dvě promytí) a DMF (tři promytí). Bránění se sleduje způsoby kvalitativní analýzy pomocí ninhydrinového testu.

Methylace N⁰¹

Pryskyřice bráněná o-nitrobenzensulfonamidem se suspenduje v DMF (20 ml), kterému se přidá MTBD (3 ekv.) a methyl-4-nitrobenzensulfonát nebo dimethylsulfát (pokud jde o Cys) . Směs se potom protřepává za použití syntetizéru společnosti

• ·· •	♦ ·· · • •	• ·· · • · · · ·	• ···· • ·
22	• •	• · · · · · • · · ·	• · • · • · ·
	•	··* ·· · · *1
Advanced-ChemTech (model 2000) po 0,5 h	a	pryskyřice	se
promyje DMF (4 promytí).
Zbavení ochrany N“-Me
Jakmile se požadovaný zbytek zmethyluje,	pryskyřice	se
znovu suspenduje v DMF (20 ml) . K suspenzi	se	přidá DBU	(3
ekv.) a 2-merkaptoethanol (3 ekv.) a směs se	protřepává po	0,5

h v syntetizéru od společnosti AdvancedChemTech (model 2000) . Pryskyřice se potom pečlivě promyje DMF (5 promytí).

Předcházející postup methylace, který je dobře zpracován pro všechny zbytky kromě D-Cys⁶, pro který má za výsledek dimethylované deriváty (viz např. sloučeniny 2 a 10). Avšak nahrazení D-Cys⁶ Cys⁶ poskytuje monomethylované peptidy.

Odštěpení peptidu

Peptidy se odštěpí od pryskyřicového nosiée tím, že se postranní řetězec simultánně zbaví ochrany acidolýzou za použití bezvodého fluorovodíku, který jako látku zachycující vedlejší produkty obsahuje anisol (~30 % objem/objem), působícího po 45 min při 0 °C. Peptidy se cyklizují v 90% kyselině octové (~600 ml) s mírným přebytkem I2 (15 min.). Přebytek I2 se poté odstraní přidáním kyseliny askorbové.

Čištění

Surové peptidy se čistí pomocí preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi (RP-HPLC) na

C-18 chemicky vázaném silikagelu za použití axiálních kompresních kolon (Dynamax-30 nm, 5 nebo 8 pm, 21,4 x 250 mm) .

Používá se eluční systém s lineárním gradientem při rychlosti ···· ·· ····

······ * • · · fcfcfc ««<···· · fcfcfc · · · · »·» ·· fcfc ·· toku 20 ml.min¹: A, 0,1 % TFA; B, 0,1 % TFA v 80 % MeCN, 20 % B : 50 % B při 1 % min¹. Separace se sledují pomocí analytické vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi při 215 nm. Frakce obsahující produkt se spojí, odpařují se ve vakuu a lyofilizují se. Každý peptid se získá lyofilizací z vodné kyseliny octové jako chmýřovitý bílý prášek o konstantní hmotnosti. Čistota finálních peptidů se hodnotí při 215 nm pomocí analytické vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi. Analytická vysokotlaká kapalinová chromatografie s reverzními fázemi se provádí za použití nosiče Vydac C-18 (4,6 x 250 mm, 5 pm, velikost pórů 30 nm,

Liquid Separations Group). Lineární gradientový systém se používá při rychlosti toku 1,5 ml.min¹: HPLC-1, A, 0,1 % TFA; B, 0,1 % TFA v 80 % MeCN; 20 % B : 50 % B při 1 % min¹; HPLC-2, C, 5 % MeCN v TEAP (0,1 M, pH 3); D, 20 % C v MeCN, 10 % D : 70 % D při 1 % min¹. Eluent kolony se sleduje při 215 nm. Retenční čas a čistota každého peptidů se hodnotí pomocí způsobu řízení vysokotlaké kapalinové chromatografie Rainin Dynamax (Rainin Dynamax HPLC Method Manager). U každého peptidů se zjistilo, že má čistotu >98 %. Výsledné retenční časy vysokotlaké kapalinové chromatografie jsou uvedeny v tabulce 1.

9999 ···· • 9 ···

Tabulka 1. N-methylové analogy a analytická data • ··

9 ·

9 9 • · · • · ·

999 ·· • 9 9 • 99

9 9

9 9 9

99

Peptid č.	Sekvence N-Me	Hmotnostní spektrum (M-H⁺)	Vysokotlaká kapalinová chromatografie^c(HPLC^c)
vypočtené³	,ύ pozorované	( tR-l ) ^d	(t_R-₂)^e
1	NMeCpa-cyklo- (DCys-3-Pal-DTrp- -Lys-Thr-Cys)-2- -Nal-NH₂	1178,7	1179,2	18,3	19,3
2	Cpa-cyklo(NMe- -DCys-3-Pal-DTrp- -Lys-Thr-Cys) -2- -Nal-NHMe	1192,7	1193,4	19, 6	19,3
3	Cpa-cyklo(DCys- -NMe-3-Pal-DTrp- -Lys-Thr-Cys)- -2-Nal-NH₂	1178,7	1178,9	20,3	22,5
4	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-NMeDTrp-Lys- -Thr-Cys)-2-Nal- -nh₂	1178,7	1179,2	17,9	17,2
5	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-NMeLys- -Thr-Cys)-2-Nal- -nh₂	1178,7	1178,9	19,2	18,7
6	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-Lys- -NMeThr-Cys)-2- -Nal-NH₂	1178,7	1179,3	17,4	15,1

Tabulka 1 - pokračování

7	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-Lys-Thr- -NMeCys)-2-Nal- -nh₂	1178,7	1179,0	18,5	16,7
8	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-Lys-Thr- -Cys)-(NMe)-2-Nal- -nh₂	1178,7	1179,0	20,3	19, 0
9	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-Lys-Thr- -Cys)-Nal-NH₂	1164,8	1164,7	17,2	17,2
10	Cpa-cyklo(NMeDCys- -3-Pal-DTrp-Lys- -Thr-Cys)-Dip-NHMe	1218,9	1218,9	21,9	20,8
11	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-NMeDTrp- -NMeLys-Thr-Cys) - -2-Nal-NH₂	1192,7	1192,3	19, 9	19,7
12	Cpa-cyklo(DCys- -Tyr-DTrp-NmeLys- -Thr-Cys)-2-Nal- -NH₂	1193,8	1193,6	24,9	23,1
13	Tfm-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-NMeLys- -Thr-Cys)-2-Nal- -nh₂	1212,2	1212,2	21,4	20,7
14	Cpa-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-NMeLys- -Thr-Cys)-DTrp- -NH₂	1167,8	1168,0	16, 6	14,9

9·

Tabulka 1 - pokračování

15	Nal-cyklo(DCys-3- -Pal-DTrp-NMeLys- -Thr-Cys)-DTrp- -nh₂	1183,2	1183,5	18,0	16, 4
16	3-Pal-cyklo(DCys- -3-Pal-DTrp- -NMeLys-Thr-Cys) - -DTrp-NH2	1135,0	1134,8	11,5	9,8

^a teoretická molekulová hmotnost (M-H⁺, daltonů). ^b pozorovaná molekulová hmotnost (M-H⁺, daltonů).

^c retenční časy (min) vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzními fázemi (C-18, 5 pm, 4,6 x 250 mm, λ = 215 nm) .

Pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie se zjistilo, že každá sloučenina má čistotu >98 %.

^d Eluční systém vysokotlaké kapalinové chromatografie: A, 0,1 % TFA; B, 0,1 % TFA v 80 % MeCN, 20 % B : 50 % B při 1 % min'¹ a

1,5 ml.min'¹.

^e Eluční systém vysokotlaké kapalinové chromatografie-2 (HPLC-2): C, 5 % MeCN v TEAP (0,lM, pH 3); D, 20 % C v MeCN, 10 % Ď : 50 % D při 1 % min'¹ a 1,5 ml.min'¹.

Analýza aminokyseliny

Peptidy se hydrolyzují ve vakuu (110 °C, 20 h) v 4M kyselině methansulfonové obsahující 0,2 % 3-(2-aminoethyl)indolu (Pierce). Analýza aminokyseliny se provádí na hydrolyzátech po derivatizaci s o-ftalidaldehydovým činidlem (Sigma Chemical Co.) za použití automatického systému vysokotlaké kapalinové chromatografie (Rainin Instrument Co.) vybaveného 100 x 4,6 mm, 3 pm C18 axiální kompresní kolonou s integrální predkolonou (Microsorb AAAnalysis , type O; Rainin Instrument Co.). Derivatizované primární aminokyseliny • · se eluují za použití binárního gradientu pufru A, 0,l0M roztok octanu sodného obsahující 4,5 % objem/objem methanolu a 0,5 % objem/objem tetrahydrofuranu při pH 7,2 a pufru B, methanol. Používá se sled gradientu; 0 % A v čase 0 min.; 35 % A v čase

16.5 min; 90 % A v čase 30 min a 90 % A v čase 33 min s rychlostí toku 1,0 ml.min”¹ při teplotě místnosti. Eluent se sleduje při 340 nm a integruje pomocí způsobu řízení Dyndmax HPLC Method Manager (Rainin). Standardní retenční časy jsou následující: Asp, 6,6 min; Arg, 19,9 min; Trp, 25,4 min a Lys,

29.5 min. Každý peptid z tabulky 1 poskytuje pro primární aminokyseliny očekávané analytické výsledky. Cystein není kvantifikován.

Hmotnostní spektrometrie spektrometrie paprsku při

Peptidy se analyzují pomocí hmotnostní prováděné měřením doby průletu laserového desorpci/ionizaci podporované základní hmotou za použiti hmotnostního spektrometru LaserMat 2000 (Thermal Bioanalysis, San Jose, CA.) za použití kyseliny a-kyano-4-hydroxyskořicové jako základní hmoty s látkou P (Substance P) (1348,7 daltonů) jako vnitřního standardu. V každém případě se spektrum skládá z píku hlavního iontu M-H⁺ pro vnitřní standard, očekávaného píku stanovovaného M-H⁺ a několika píků spojených se základní hmotou (<500 daltonů). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Antagonismus inhibice somatostatinu (SRIF) podle uvolňování růstového hormonu (GH)

Přední laloky hypofýzy z dospělých samců krys se odeberou a dispergují se pomocí dříve popsaného způsobu trypsin/DNase (Murphy W. A., Taylor J., Moreau J.-P. a Coy D. H., Peptide Res., 2, 128 až 132 (1989)). Dispergované buňky se zředí • · · · sterilně filtrovaným mediem Eagle modifikovaným podle Dulbeka (Dulbecco's modified Eagle medium) (MEM, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) , které se doplní 2,5 % fetálního telecího séra (Gibco), 3 % koňského séra (Gibco), 10 % čerstvého krysího séra (skladovaného na ledu ne déle než 1 h) z hypofýz dárců, 1 % MEM neesenciální aminokyseliny (Gibco), gentamycinem (10 ng/ml; Sigma) a nystatinem (10 000 jednotek/ml; Gibco). Buňky se nahodile plotnují v hustotě přibližně 200 000 buněk/jamku (Costar cluster 24; Rochester Scientific Co., Rochester, NY) . Plotnované buňky se udržují v dříve uvedeném Dulbekově mediu ve zvlhčoVané atmosféře z 95 % vzduchu/5 % oxidu uhličitého při 37 °C po 4 až β dní. Při přípravě na vyvolání hormonální odezvy se buňky promyji mediem 199 (Gibco, 3x1 ml). Každá dávka sloučeniny podle tohoto vynálezu (6 dávek na plotnu) se zkouší na buňkách triplicitně za přítomnosti 1 nM SRIF v celkovém objemu 1 ml media 199 obsahujícího 1 % BSA (frakce V; Sigma Chemical Co. ) . Všechny jamky obsahují GHRH(1-29)NH2 (1 nM) . Kontrolní skupina stimulovaná GHRH(1-29)NH2 (1 nM) a kontrolní skupina inhibovaná SRIF (1 nM) s GHRH(1-29)NH2 (1 nM) je obsažena v každé plotně s buněčnou kulturou. Po 3 hodinách inkubace v atmosféře vzduch/oxid uhličitý (95/5 %, 3 h při 37 °C) se medium odstraní a skladuje se při -20 °C dokud není testováno na obsah hormonu. Růstový hormon v mediu se měří pomocí standardní dvojité protilátky RIA za použití složek, které běžně dodává Dr. A. F. Parlow z Národního hormonálního a hypofýzového programu (National Hormone and Pituitary Program (NHHP)), Torrance, CA.

Hodnoty IC50 antagonisty proti SRIF (1 nM) se počítají za použití programu Sigmaplot (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměrná hodnota IC50 (nM)iexponenciální vyrovnání průměru (dále jen SEM) a jsou uvedeny v tabulce 2.

• · • · ·

Tabulka 2. Hodnoty vazebných afinit (Ki) pro klonované lidské receptory ssti-5 a antagonisty

Pep- tid č.	Místo N°- -meth- ylace	Ki^a±SEM (nM)	IC50+SEM (nM)^b
hssti	hsst₂	hsst3	hsst4	hssts
SRIF- -14	N/A^c	2,010,35	0,25+0,03	1,2+0,2	2,010,3	1,410,3	N/A^c
SRIF- -28	N/A^c	1,9+0,4	0,31+0,06	1,3±0,3	5,412,5	0,410,1	N/A^c
1	Cpa^b	1000	36±7,6	3301126	1000	40,1+18,8	7,812,7
2^a	D- -Cys⁶	1000	89,018,0	576147	1000	106136	nd^e
3	3- -Pal⁷	1000	189,0±35	450+132	1000	1000	nd^e
4	D- -Trp⁸	1000	51,812,6	3901114	1000	93+17,7	nd^e
5	Lys^a	1000	17,1±5,5	66,0+5,8	1000	5,98+0,91	0,73+0, 33
6	Thr^lu	395+202	1000	315112,5	1000	88,5+45,7	nd^e
7	Cys¹¹	1000	810	68,714,7	575	161152	nd^e
8	2- -Nal¹²	1000	197+55	1000	1000	1000	nd^e
9	N/A^c	1395	12,1±1,9	38,2+2,4	1000	140+4,6	2,610,7
10^d	D-Cys^b	1000	117+24,6	584+305	1000	766+110	nd^e
11	DTrp⁸ a Lys⁹	1000	9,33 + 0,62	140+10,4	1000	112+19	2,5 + 0, 2 0
12	Lys⁹	1000	5,51±1,85	115,1+16,9	1000	70,7+25,8	0,53+0, 17
13	_ y Lys	1000	11,3	40,2	1246	45,5	nd^e

Tabulka 2 - pokračování

14	Lys^y	1000	5,45±0,3	91,4±11,9	1000	101+14,1	11,6+4, 2
15	Lys^a	1000	27,3±1,45	148+13,2	1000	176±65,1	96+13,8
16	Lys^y	1000	24,7±1,61	537±44,8	1000	313+4,1	2871138

^a vyjadřuje se jako průměrná hodnota+SEM, jednotlivé hodnoty udávají výsledky jednoho vazebného pokusu.

^b IC50 (nM) krysího anatgonisty in vitro versus SRIF (1,0 nM) , vyjádřená jako průměrná hodnota+SEM. ^c neaplikovatelné.

^d peptidy 2 a 10 jsou odlišné peptidy ^e nestanoveno.

Funkční exprese klonovaných receptorů lidského somatostatinu

Genomické klony obsahující receptory lidského somatostatinu (hsstri-5) (Yamada Y. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 8 9, 251 až 255 (1992); Yasuda K. a kol., J. Biol. Chem., 267, 20 422 až 20 428 (1992); Yamada Y. a kol., Mol.

Pharmacol., 42, 2136 až 2142 (1992); Rohrer L. a kol., Proč.

Nati. Acad. Sci., USA, 90, 4196 až 4200 (1993)), laskavě poskytl Dr. Graeme I. Bell (University of Chicago). Tyto hsstn, hsstr2, hsstr3, hsstr4, hsstrs komplementárních DNA se izolují jako 1,5-kilobázový fragment Pstl-Xmnl, 1,7-kilobázový fragment BamHI-HindlII, 2,0-kilobázový fragment Ncol-HindlII,

1,4-kilobázový fragment Nhel-Ndel a 1,2-kilobázový fragment HindlII-Xbal, z nichž každý obsahuje úplnou kódující oblast o celé délce receptorů. Tyto fragmenty se nezávisle subklonují do příslušných míst restrikční endonukleázy v savčím vektoru exprese pCMV5, po směru exprese od lidského cytomegalovirového (CMV) promotoru, pro přípravu plasmidů exprese pCMV5/hsstn, pCMV5/hsstr2, pCMV5/hsstr3, pCMV5/hsstr4 a pCMV5/hsstrs. Pro transfekci do buněk CHO-K1 se přidá plasmid pRSV-neo (Sbírka amerických typových kultur (American Type Culture Collection), Rockville, MD), který nese selektovatelný neomycinový signální znak savčí buňky.

Exprese a transfekce receptoru

Transfekce se provádí kalciumfosfátovým způsobem. Buňky CHO-K1 se uchovávají v oí-minimálnim základním mediu (oí-MEM; Gibco) doplěném 10% fetálním telecím sérem a transfekují se s každým z plasmidů exprese za použití precipitace fosforečnanem vápenatým. Klony, které zdědily plasmid exprese se vybírají v oí-MEM doplněném 500 pg/ml geneticinu (G418; Gibco). Nezávislé klony CHO-K1 se vyberou pomocí klonování glass-ring a rozšiřují se v kultuře v selektivním mediu. Z izolovaných klonů se připraví membrány a exprese hsstr se zpočátku posuzuje pokud jde o vázáni s [ I]Tyr -SRIF a [¹²⁵I]MK-678 (pro sstrž) .

Zkoušky vázáním radioligandů

Buněčné membrány z 5 typů receptorů se získají z homogenátů (nastavení Polytronu 6, 15 s) příslušných buněk

CHO-K1, v ledově studené tris-HCl (50 mM) a odstředěných (39 000 g, 10 min x 2), s resuspenzací meziproduktu v čerstvém pufru. Finální pelety se pro zkoušku resuspendují v tris-HCl (10 mM). Stejné podíly z membrán se inkubují (30 min při 37 °C) s 0,05 nM [¹²⁵I ] Tyrⁿ-SRIF (typy 1, 3, 4, 5) nebo [¹²⁵I]MK-678 (typ 2) v 50 mM HEPES (pH 7,4) obsahujícího BSA (10 mg.ml^-1), chlorid hořečnatý (5 mM), trasylol (200 tisíc mezinárodních jednotek.ml^-1) , bacitracin (0,02 mg.ml^-1) a fenylmethansulfonylfluorid (0,02 mg.ml^-1). Objem finální zkoušky je 0,3 ml a inkubace se zastaví rychlou filtrací přes filtry GF/C předem nasáknuté v 0,3% póly(ethyleniminu) za použití Brandelova

modulu pro rychlou filtraci. Každé trubice a filtr se potom promyje stejnými podíly studeného pufru (3x5 ml).

Specifické vázání se definuje jako celková vazba radioligandu minus tato vazba za přítomnosti 1,0 μΜ SRIF. Následující hodnoty celkového vázání radioligandu a nespecifického vázání (nsb) se obvykle získají s pomocí těchto testovacích systémů: hsstri, celkově 7000 cyklů za minutu (cpm) proti 3500 cyklů za minutu nsb; hsstr2, celkově 9000 cyklů za mihutu proti 1000 cyklům za minutu nsb; hsstr3, celkově 8000 cyklů za minutu proti 1000 cyklům za minutu; hsstr₄, celkově 6000 cyklů za minutu proti 3500 cyklům za minutu nsb a hsstrs, celkově 7500 cyklů za minutu proti 3500 cyklům za minutu nsb. Vazebné afinity se vyjadřují jako hodnoty Ki±SEM (nM) pro každý z pěti podtypů receptorů a jsou uvedeny v tabulce 2.

Nitrobuněčná mobilizace Ca²⁺ zprostředkovaná typem 5

Buňky CHO-K1, exprimující lidský receptor ssts se sklidí pomocí inkubace v 0,3% EDTA/fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (25 °C) a dvakrát se promyjí pomocí odstředění. Promyté buňky se potom resuspendují v Hanksově pufrovaném fyziologickém roztoku (HBSS) pro dávkování fluorescenčního indikátoru Ca²⁺ Fura-2AM. Suspenze buněk z přibližně 10⁶buněk/ml se inkubují s 2 μΜ Fura-2AM po 30 minut při 25 °C. Nevázaný Fura-2AM se odstraní odstředěním dvakrát v HBSS a konečné suspenze se převedou do spektrofluorometru (Hitachi F-2000) vybaveném magnetickým míchacím mechanismem držákem kyvety s regulací teploty. Po dosažení rovnovážného stavu pro 37 °C se pro měření nitrobuněčné mobilizace Ca²⁺ přidají somatostatinové peptidy. Excitované a emitované vlnové délky jsou 340 a 510 nm.

1, který zobrazuje zkoušky za použití • fc na počítači Silicon použití softwaru pro

Příkladná data se uvádějí na obr výsledky z bezprostředně předcházející analogu 5 jako zkušební sloučeniny.

Molekulární modelování

Molekulární modelování se provádí

Graphics Indigo² High Impact 10 000 za molekulární modelování SYBYL, verze 6.6 (Tripos Associates lne., St. Louis MO, ϋβΑ) pomocí Kollmanova celoatomového silového pole (Weiner S. J. a kol., J. Comp. Chem., Ί_, 230 až

252 (1986) . Kartotéka PDB pro tři roztoky NMR struktur výchozí sloučeniny somatostatin/oktreotid: Ď-Phe⁵-cyklo [Cys⁶-Phe⁷-D-Trp⁸-Lys⁹-Thr¹⁰-Cys¹¹]-Thr¹²-o] (1SOC a 2SOC) se získají z databáze PDB. Tyto struktury se importují do SYBYL 6.6 a mutují se do formy N-methylovaných sloučenin založených na analogu 9. Kollmanovy parciální atomové náboje se vloží podle slovníku monomerů. Struktury se optimalizují pomocí spojení mutovaných zbytků a potom pomocí úplné minimalizace energie za použití konjugovaného algoritmu gradientu do finálního čtverce — 1 průměrné hodnoty kořene (rms) gradientu ^0,4184 kJ.mol.nm (0,01 Kcal .mol .Á¹) . Dielektrická funkce závislá na vzdálenosti (McCammon J. A. a kol., Biochem. , 18, 927 až 942 (1979)) se použije společně s nastavením prodlevy pro všechny ostatní minimalizační volby. Výsledky jsou podrobně uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3. Kollmanova celková změna energie atomu při sekvenciální methylaci každého zbytku z Cpa-cyklo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH₂ (analog 9) v každé ze tří konformací roztoku vyjádřená jako kJ.mol’¹ (Kcal.mol ^x) .

Analog č.	Místo methylace	I	II	III
1	NmeCpa⁰	-8,368 (-2)	1, 674 (0,4)	-4,184
2	NmeDCys⁶, NHMe	71,128 (17)	50,208 (12)	129,704 (31)
3	NMe-3-Pal'	29,288 (7)	71,128 (17)	25,104 (6)
4	NmeDTrp“	20, 92 (5)	25,104 (6)	20, 92 (5)
5	y NmeLys	25,104 (6)	25,104 (6)	20, 92 (5)
6	NMeThr^iU	66,944 (16)	41,84 (10)	50,208 (12)
7	NMeCys¹¹	50,208 (12)	58,576 (14)	96,232 (23)
8	NMe-2-Nalⁱ²	16, 736 (4)	79,496 (19)	29,288 (7)

Jiná ztělesnění

Rozumí se, že zatímco tento vynález byl popsán v kombinaci se svým podrobným popisem, je následující popis zamýšlen pro ilustraci a ne pro omezení rozsahu tohoto vynálezu, který je vymezen rozsahem připojených patentových nároků. Jiné aspekty, výhody a modifikace jsou v těchto nárocích zahrnuty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Slouqenina obecného vzorce (I)

A¹-cyklo { D-Cys-A²-D-Trp-A³-A⁴-Cys } -A⁵-Y¹ (I) ve kterém

A¹ je popřípadě substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A² je popřípadě substituovaná aromatická a-aminokyselina,

A³ je Dab, Dap, Lys nebo Orn,

A⁴ je β-hydroxyvalin, Ser, Hser nebo Thr,

A⁵ je popřípadě substituovaná D- nebo L-aromatická α-aminokyselina, a

Y¹ je skupina OH, NH2 nebo NHR¹, kde R¹ je (C1-6) alkyl;

ve kterém každá uvedená popřípadě substituovaná aromatická α-aminokyselina je substituovaná jedním nebo více substituenty, z nichž každý je nezávisle vybrán ze souboru skládajícího se z halogenu, skupin NO2, OH, CN, (C1-6) alkylu, (C2-6) alkenylu, (C2-6) alkynylu, (C1-6) alkoxyskupina, skupiny Bzl, O-Bzl a NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou každý nezávisle H, 0 nebo (C1-6) alkyl, a ve kterém aminový dusík každé z amidových vazeb peptidů a aminových skupin z A¹ podle obecného vzorce (I) je popřípadě substituován methylovou skupinou, za předpokladu, že tam je při nejmenším jedna uvedená methylová skupina, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
2.

Sloučenina podle nároku 1, ve které:

• Φ ··· · • · · • · · • « « « · · · ·· ··

A¹ je Cpa, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tfm, Tyr nebo Tyr(I),

A² je 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Tyr nebo Tyr(I), a

A⁵ je Dip, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, Phe nebo D-Trp, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

3. Sloučenina podle nároku 2, ve které A¹ je Cpa. 4 . Sloučenina podle nároku 2, ve které A³ je NMeLys. 5. Sloučenina podle nároku 1, ve kterém je uvedenou

sloučeninou sloučenina podle vzorce:

NMeCpa-cyklo (D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys) -2-Nal-NH2,‘ Cpa-cyklo(NMeD-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe; Cpa-cyklo(D-Cys-NMe-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH₂; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NMe2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(NMeD-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Dip-NHMé; Cpa-cyklo (D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-NMeLys-Thr-Cys) -2-Nal-NH2,’ Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Tfm-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-Nřh; Nal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-Nřh;

nebo
3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NFte;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

6. Sloučenina podle nároku 4, ve kterém je uvedenou sloučeninou sloučenina podle vzorce:

NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal~NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NPU; Nal-cyklo (D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys) -D-r-Trp-NíU; nebo

3-Pal-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

7. Sloučenina podle nároku 5, ve kterém je uvedenou sloučeninou sloučenina podle vzorce:

NMeCpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2/ Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-NMeD-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; nebo Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-D-Trp-NH2;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

8. Sloučenina podle nároku 6, ve kterém je uvedenou sloučeninou sloučenina podle vzorce:

Cpa-cyklo(D-Cys-3-Pal-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; nebo

Cpa-cyklo(D-Cys-Tyr-D-Trp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

• fl • · • • 38 ·^:· ♦ 9 · · · · • · · · · 9 · · · • · · · · • · · · • 999 99 99 9999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 9. Způsob vázání jednoho nebo více podtypů receptorů somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5, vyznačující se tím, že zahrnuje krok při kterém se přivede do kontaktu sloučenina podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl s jedním nebo více z Uvedených podtypů receptorů somatostatinu. 10. Způsob vázání jednoho nebo více podtypů receptorů

somatostatinu -1, -2, -3, -4 a -5 v lidském pacientovi nebo jiném živočišném pacientovi, vyznačující se tím, že zahrnuje krok při kterém se podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pacientovi, který to potřebuje.

11. Způsob vylákání antagonistického působení z buňky, vyznačující se tím, že uvedená buňka obsahuje jeden nebo více receptorů somatostatinu, přičemž uvedený způsob zahrnuje krok při kterém se přivede do kontaktu uvedená buňka s účinným množstvím sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

12. Způsob vyvolání antagonistického působéní vůči somatostatinu v lidském nebo živočišném pacientovi, vy z n ačující se tím, že zahrnuje krok při kterém se podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pacientovi, který to potřebuje.

13. Způsob podpory uvolňování růstového hormonu v lidském nebo živočišném pacientovi, vyznačující se tím, že zahrnuje, že se podává uvedenému pacientovi účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

····
4 4 4 4 4 4 • ······ • 4 444444 4

14. Způsob podpory uvolňování insulinu v lidském nebo živočišném pacientovi, který to potřebuje, vyznačující se t í m, že zahrnuje, že se podává uvedenému pacientovi účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

15. Způsob zvýšení hojení poranění v lidském nebo živočišném pacientovi, který to potřebuje, vyznačující se tím, že zahrnuje, že se podává uvedenému pacientovi účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

16. Způsob podpory angiogeneze v lidském nebo živočišném pacientovi, který to potřebuje, vyznačující se t í m, že zahrnuje, že se podává uvedenému pacientovi účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

17. Způsob reprodukce buněk obsahujících receptory somatostatinu, vyznačující se tím, že zahrnuje, že se uvedené buňky přivedou do kontaktu s účinným množstvím sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, která obsahuje Tyr(I).

18. Způsob léčení nemoci nebo stavu u lidského nebo jiného živočišného pacienta, který to potřebuje, vyznačující se tím, že zahrnuje krok při kterém se uvedenému pacientovi podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, při kterém je uvedená nemoc nebo stav vybrán ze souboru, který se skládá z nedostatečného vzrůstu, kachexie, chřadnutí, diabetů typu 2 a nedostatečného oběhu.

·· ····

Obr. 1: In vitro inhibice nitrobuněčné mobilizace Ca²⁺» zprostředkovaná hsstr-5