CZ289552B6

CZ289552B6 - Somatostatinový nebo bombesinový derivát a jejich pouľití

Info

Publication number: CZ289552B6
Application number: CZ20001033A
Authority: CZ
Inventors: Sun Hyuk Kim; Zheng Xin Dong; John E. Taylor; Sylviane Moreau; Susan Riley Keyes
Original assignee: Biomeasure, Inc.
Priority date: 1993-08-09
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2002-02-13
Also published as: CZ289590B6; EP1288223B1; HUT73491A; DK1288224T3; ATE399177T1; NZ271238A; PT1288223E; JP3785179B2; EP1288224A1; SK15096A3; CA2168113C; ES2309131T3; FI960584A0; CN1133047A; JP2004339237A; UA44707C2; KR100325972B1; LV11549A; RO117259B1; US5552520A

Abstract

Jsou pops ny peptidov deriv ty, kter obsahuj jeden nebo v ce substituent obecn ho vzorce I, kde jednotliv symboly maj specifick² v²znam, kter jsou odd len napojeny amidovou, aminovou nebo sulfonamidovou vazbou na aminovou skupinu bu N-konce nebo postrann ho °et zce biologicky aktivn peptidov sti. Tyto peptidov deriv ty maj relativn zv² enou biologickou aktivitu p°i srovn n s odpov daj c m samotn²m peptidem.\

Description

Somatostatinový nebo bombesinový derivát a jejich použití

Oblast techniky

Tento vynález se týká terapeutických peptidových derivátů a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Byly dělány pokusy prodloužit aktivitu biologicky aktivních peptidů. Peptidy byly například modifikovány chemicky syntetickým přidáním cukerných skupin, aby se zvýšila doba, během níž jsou peptidy aktivní (Sandoz: spis WO 88/02756, Sandoz: spis WO 89/09786, DE patent 3910667 AI, evropská patentová přihláška EP číslo 0 374 089 A2 (1990) a Breipohl: US patent č. 4 861 755 (1989)). Pro zvýšení životnosti peptidu se používá také přidání kationtových zakotvení (evropská patentová přihláška EP 0 363 589 A2 (1990).) a lipidních skupin (Whittaker: spis WO 91/09837, Jung: US patent č. 4 837 303 (1989).).

Podstata vynálezu

Obecně tento vynález poskytuje deriváty biologicky aktivních peptidů, které obsahují jeden nebo více substituentů odděleně navázaných na aminovou skupinu umístěnou na N-konci nebo na postranním řetězce peptidové skupiny. V této modifikované formě mají tyto deriváty vyšší a prodlouženější biologickou aktivitu při srovnání s odpovídajícími nemodifikovanými peptidy.

Peptidové deriváty jsou výhodné v tom, že nejsou drahé, jsou vysoce biokompatibilní, chybí jim škodlivé vedlejší účinky a jsou slučitelné s různými formami terapeutického podávání. Zvláště pak mnoho derivátů, které mají jako peptidovou část somatostatin, mají značně zlepšenou účinnost a selektivitu při srovnání s nemodifikovaným somatostatinem.

V jednom aspektu se tento vynález týká peptidového derivátu, který obsahuje biologicky aktivní peptidovou část a alespoň jeden substituent připojený na peptidovou skupinu, tento substituent je vybrán ze skupiny zahrnující sloučeniny obecného vzorce I,

(Dr v němž

Ro znamená atom kyslíku, síry nebo skupinu NR5, v níž R5 znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

Ri a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, skupinu obecného vzorce (CH₂)_mOR6 nebo CH(OR)₇CH₂ORg, v nichž R^ znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku a R₇ a Rg nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku nebo skupinu C(R₉)(Rio), v níž R9 a R₁₀ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, nebo skupiny Ri i R₂ společně

-1 CZ 289552 B2 znamenají skupinu =CHCH₂ORn, v níž Rn znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku a m znamená číslo od 1 do 5 včetně, a jedna ze skupin R₃ a R4 znamená skupinu (CH₂)_nR_]2 nebo (CH₂)_nCH(OH)R₎₂, v nichž R_]2znamená skupinu CO, CH₂ nebo skupinu SO₂ a n znamená číslo mezi 1 a 5 včetně, a zbývající skupina Rj nebo R4 znamená atom vodíku, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku.

Ve sloučenině obecného vzorce I je peptidová část připojena ke každému substituentu vazbou CO-N, CH₂-N nebo SOt-N mezi substituentem a atomem dusíku N-konce nebo postranního řetězce uvedené peptidové skupiny. V jiném výhodném provedení podle vynálezu substituent znamená sloučeninu obecného vzorce I, v tomto provedení R_í2 znamená s výhodou skupinu CH₂nebo SO₂. Ve zvláště výhodných provedeních substituent znamená skupinu (HOCH₂)₃-C-NH(CHj^SC^ nebo skupinu (HOCH₂)₃C-CH₂.

Peptidová skupina je s výhodou vybrána ze skupiny sestávající ze somatostatinu, bombesinu, kalcitoninu, peptidu souvisejícího s kalcitoninovým genem (CRGP), amylinu, parathyroidního hormonu (PTH), peptidu uvolňujícího gastrin (GRP), hormonu stimulujícího melanocyty (MSH), adrenokortikotropního hormonu (ACTH), peptidu souvisejícího s příštitným tělískem (PTHrP), hormonu uvolňujícího luteinizační hormon (LHRH), faktoru uvolňujícího růstový hormon (GHRF),peptidu uvolňujícího růstový hormon (GHRP), cholecystokininu (CCK), glukagonu, bradykininu, peptidu podobného glukagonu (GLP), gastrinu, enkefalinu, neuromedinů, endothelinu, látky P, neuropeptidu Y (NPY), peptidu ΥΎ (ΡΥΎ), vazoaktivního intestinálního peptidu (VIP), guanylinu, polypeptidu aktivujícího hypofýzovou adenylcyklázu (PACAP), betabuněčného tropinu, adrenomedulinu a jejich derivátů, fragmentů a analogů.

Peptidová skupina s výhodou znamená somatostatin nebo jeho derivát, fragment nebo analog. Nejvýhodnějším somatostatinovým analogem je jedna z následujících sloučenin: H-D-Phec[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-HN₂, H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]Nal-NH₂ a H-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂. Peptidovým zbytkem je s výhodou také bombesin nebo jeho derivát, fragment nebo analog.

V jiném aspektu tento vynález poskytuje dimemí peptidový derivát obsahující dvě biologicky aktivní peptidové skupiny a alespoň jeden substituent napojený na každou peptidovou skupinu. Substituent je sloučenina obecného vzorce IV, kde sloučenina obecného vzorce IV je generickým strukturním ekvivalentem sloučeniny obecného vzorce I. V dimeru je každá peptidová skupina připojena na substituenty vazbou CO-N, CH₂-N nebo SOr-N mezi substituentem a atomem dusíku na N-konci nebo na postranním řetězci jedné z peptidových skupin.

Pojem „biologicky aktivní“ tak, jak se zde používá, znamená přirozeně se vyskytující, rekombinantní a syntetický peptid, který má fyziologickou nebo terapeutickou aktivitu. Obecně tento pojem zahrnuje všechny deriváty, fragmenty a analogy biologicky aktivních peptidů, které vykazují kvalitativně podobný nebo opačný účinek při srovnání s účinkem nemodifikovaného peptidu.

Obrázek 1 je graf dvou růstových křivek buněk AR42J v přítomnosti různých somatostatinových derivátů.

V další části tohoto spisu budou popsána výhodná provedení. Nejdříve budou popsány peptidové deriváty.

Peptidové deriváty podle vynálezu obecně obsahují dvě oddělené složky: 1. biologicky aktivní peptid a 2. alespoň jeden substituent, který má strukturu sloučeniny obecného vzorce I. Peptidové deriváty vyrobené podle způsobů zde popsaných zahrnují následující tři skupiny sloučenin:

-2CZ 289552 B2

Deriváty odvozené od sloučeniny obecného vzorce I

R3O O-fCHol^j^-NH-P·

R* -NH-R_l2 (CH₂)_n-0 OR v němž Ro, R_b R₂, R₃, R4, R₁₂ a n znamenají jak shora uvedeno a NH-P' znamená biologicky aktivní peptidovou skupinu. V těchto provedeních je skupina NH umístěna na N-konci nebo na postranním řetězci peptidu a P' znamená zbytek peptidu.

Vedle shora uvedených struktur sloučeniny vyrobené podle vynálezu obsahují peptidové deriváty obsahující dva nebo více substituentů připojených na jednu peptidovou skupinu. Tato provedení podle vynálezu jsou deriváty biologicky aktivních peptidů, které mají více než jednu volnou aminovou skupinu, např. zbytek lysinu.

Peptidové deriváty podle vynálezu jsou deriváty biologicky aktivních peptidů, které jsou vybrány ze skupiny sestávající ze somatostatinu, bombesinu, kalcitoninu, peptidu souvisejícího s kalcitoninovým genem (CRGP), amylinu, parathyroidního hormonu (PTH), peptidu uvolňujícího gastrin (GRP), hormonu stimulujícího melanocyty (MSH), adrenokortikotropního hormonu (ACTH), peptidu souvisejícího s příštitným tělískem (PTHrP), hormon uvolňujícího luteinizační hormon (LHRH), faktoru uvolňujícího růstový hormon (GHRF), peptidu uvolňujícího růstový hormon 20 (GHRP), cholecystokininu (CCK), glukagonu, bradykininu, peptidu podobného glukagonu (GLP), gastrinu, enkefalinu, neuromedinů, endothelinu, látky P, neuropeptidu Y (NPY), peptidu ΥΎ (PYY), vazoaktivního intestinálního peptidu (VIP), guanylinu, polypeptidu aktivujícího hypofyzou adenylcyklázu (PACAP), betabuněčného tropinu, adrenomedulinu a jejich derivátů, fragmentů a analogů.

Ve zvláště výhodných provedeních peptidová skupina znamená somatostatin nebo derivát, fragment nebo analog somatostatinu. Mezi somatostatinová analoga, která se mohou používat podle tohoto vynálezu, patří, ale nejsou na ně omezena, následující sloučeniny:

H-D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-beta-Nal-NH₂, H-D-beta-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH₂,

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr, H-D-Phe-Cys-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Pen-Thr, H-Gly-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr, H-Phe-Pen-Tyr-D-T rp-Lys-Thr-Cys-Thr,

H-Phe-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr, H-D-Phe-Cys-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂,

-3CZ 289552 B2

H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂,

H-D-T rp-Cys-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cy s-Tyr-D-T rp-Ly s-V al-Cy s-T rp-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-T rp-Lys-V al-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-Phe-Lys*-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Asp-Thr-NH₂, Ac-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-h-Arg(Bu)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-Cys-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-L-hArg(Et)₂-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt, Ac-L-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-'nir-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NHEt, Ac-hAg(CH₃, hexyl)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-hArg(hexyl₂)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg(Et₂)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt, Ac-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH₂, propionyl-D-hArgEt)₂-Giy-Cys-Phe-D-Trp-Lys(iPr)-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-bety-Nal-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Gly-hArg(Et)₂,-NH₂, Ac-D-Lys(iPr)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-hArg-hArg(CH₂CF₃)₂-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Tri>-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂, Ac-D-hArg(CH₂CF₃)₂-D-hArg(CH₂CF₃)₂-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH₂, Ac-D-hArg(Et)₂-D-hArg(Et)₂-Gly-Cys-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, Ac-Cys-Lys-Asn-4-Cl-Phe-Phe-D-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-NH₂, Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH₂,

Bmp-Tyr-D-T rp-Lys-V al-Cys-p-C 1-Phe-NH₂, Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- -Nal-NH₂, H-D- -Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH₂, H-pentafluor-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-beta-Nal-Cys-pentafluor-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-V al-Cys-beta-Nal-NH₂, H-D-beta-Nal-cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, Ac-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys--Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH₂, cyklo(Pro-Phe-D-T rp-N-Me-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-N-Me-Phe), cyklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-L-T rp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-Trp(F)-Lys-Thr-Phe),

-4CZ 289552 B2 cyklo(Pro-Phe-D-T rp-Lys-Ser-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-T rp-Lys-Thr-p-C 1-Phe), cyklo(D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-Trp-D-Phe), cyklo(D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Phe), cyklo(D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-Lys-D-Trp-D-Phe), cyklo(D-Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr), cyklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe), cyklo(Pro-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe), cyklo(Pro-Phe-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe), cyklo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba), cyklo(Asn-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-NH(CH₂)₄CO, cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-beta-Ala), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Glu)-OH, cyklo(Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe), cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly), cyklo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp(NO₂)-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-Trp(Br)-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe(I)-Gaba), cyklo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr(But)-Gaba), cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys)-OH, cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys)-OH, cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-I>-T rp-Lys-Thr-Phe-Thr-T po-Cys)-OH, cyklo(Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-MeLeu-Cys)-OH, cyclo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba), cyclo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Phe-Gaba), cyclo(Phe-Phe-D-Trp(5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba), cyclo(Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Ac)-Thr-Phe-NH-(CH₂)3CO), cyclo(Lys-Phe-Phe-D-Tip-Lys-Thr-Phe-Gaba), cyclo(Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba) a cyclo(Om-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba), kde Lys* znamená amidový můstek vytvořený mezi Lys* a Asp.

Peptidové sloučeniny, jejichž seznam je shora uveden, jsou popsány v následujících odkazech, které jsou zde zahrnuty jako citace: evropská patentová přihláška PF5 164 EU, Van Binst G. A spol: Peptide Research 5, 8 (1992), Horvath A. a spol.: Abstrakt „Conformations of Somatostatin Analogs Having Anti-Tumor Activity“, 22. evropské peptidové symposium, 13. až 19. září 1992, Interlaken, Švýcarsko, PCT přihláška WO 92/09059 (1991), evropská patentová přihláška EP 0 363 589 A2 (1992) a 0 203 031 A2 (1986), US patenty č. 4 904 642, 4 871 717, 4 853 371, č. 4 725 577, 4 684 620, 4 650 787, 4 603 120, 4 585 755, číslo 4 522 813,4 486 415, 4 485 101, 4 435 385, 4 395 403, číslo 4 369 179, 4 360 516, 4 358 439, 4 328 214, 4 316 890, číslo 4310518, 4 291 022, 4238481, 4235 886, 4224 190, číslo 4211 693, 4 190648, 4 146 612 a 4 133 782.

Každý zbytek aminokyseliny shora uvedených somatostatinových analogů má strukturu obecného vzorce NH-C(R)H-CO-, v němž R znamená postranní řetězec. Čárky mezi zbytky aminokyselin představují peptidové vazby, které spojují aminokyseliny. Jestliže je zbytek aminokyseliny opticky aktivní, má L-konfiguraci, pokud není výslovně uvedena D-forma. Jestliže jsou v peptidu přítomny dva zbytky Cys, tvoří se mezi těmito zbytky disulfidový můstek. Tato vazba však není uváděna v seznamu zbytků.

-5CZ 289552 B2

Dalšími výhodnými somatostatinovými analogy podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce

Ri

I

A]—A2^-A₃—D—Trp—Lys—Ag—A7—Ag—R₃,

I r₂ v němž A] znamená D- nebo L-formu -Nal, Trp, -pyridyl-Ala, Phe, substituovaného Phe nebo je vynechána a A₂ a A₇ nezávisle na sobě znamenají Cys, Asp nebo Lys. Tyto skupiny jsou navzájem kovalentně svázány disulfidovým můstkem nebo amidovým můstkem. Z dalších pak A₃ znamená -Nal, Phe nebo 0-, m- nebo -substituovaný X-Phe, kde X znamená atom halogenu, skupinu OH, NH₂, NO₂ nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, A₆ znamená Val, Thr, Ser, 10 Ala, Phe -Nal, Abu, Ile, Nle nebo Nva a A_s znamená Phe, Thr, Tyr, Trp, Ser, -Nal, alkoholovou skupinu nebo je vynechán, R] a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší acylovou nebo nižší alkylovou skupinu a R₃ znamená skupinu OH nebo NH₂ nebo je vynechán. Jestliže buď A₂ nebo A₇ znamená Cys, potom s výhodou druhá skupina znamená také Cys, jestliže A_gznamená a-aminoalkohol, potom R₃ je vynechán a jestliže ani A₂ ani A₇ neznamená Cys, potom 15 A₂ znamená jinou skupinu než A₇.

Zvláště výhodnými somatostatinovými analogy podle tohoto provedení jsou:

Me-D-Phe-Cys-Tyr-Tyr-D-T rp-Lys-V al-Cys-Thr-NH₂,

H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH₂, H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol.

Ve výhodných provedeních mají lineární somatostatinové analogy podle vynálezu strukturu obecného vzorce

Ri

A'-A²-A³-D-Trp-Lys-A⁶-A⁷-A⁸-R₃,

I r₂ v němž

A¹ znamená D- nebo L-izomer Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, beta-Nal, beta-pyridyl-Ala, Trp, Phe, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, p-X-Phe nebo ο-X-Phe, kde X znamená CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A² znamená Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, beta-Nal, pyridyl-Ala, Trp, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, ο-X-Phe nebo p-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A³ znamená pyridyl-Ala, Trp, Phe, beta-Nal, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, ο-X-Phe nebo p-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A⁶ znamená Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Thr, Abu nebo Ser,

-6CZ 289552 B2

A⁷ znamená Ala, Leu, lle, Val, Nle, Phe, beta-Nal, pyridyl-Ala, Trp, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, o-X-Phe nebo p-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃ nebo NO₂,

A⁸ znamená D- nebo L-izomer Ala, Leu, lle, Val, Nle, Thr, Ser, Phe, -Nal, pyridyl-Ala, Trp, 2,4-dichlor-Phe, pentafluor-Phe, p-X-Phe nebo o-X-Phe, kde X znamená skupinu CH₃, atom chloru, bromu nebo fluoru, skupinu OH, OCH₃, nebo NO₂, nebo jeho alkohol a

Ri a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší acylovou nebo nižší alkylovou skupinu a R₃ znamená skupinu OH nebo NH₂ neboje vynechán. S výhodou buď A¹ nebo A⁸ a buď A²nebo A⁷ musí znamenat aromatickou aminokyselinu a jestliže A⁸ znamená alkohol, potom musí být R₃ vynechán.

Dále A¹, A², A⁷ a A⁸ nemohou současně všechny znamenat aromatické aminokyseliny. Mezi zvláště výhodné analogy podle tohoto aspektu patří:

H-D-Phe-p-chlor-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Phe-Thr-NH₂, H-D-Phe-p-NOj-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NHj, H-D-Nal-p-chlor-Phe-Tyr-D-T rp-Lys-V al-Phe-Thr-NH₂, H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂, H-D-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂,

H-D-Phe-p-chlor-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH₂ a H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala--Nal-NH₂.

V ještě jiných výhodných provedeních peptidový zbytek znamená bombesin nebo derivát, fragment nebo analog bombesinu. Mezi bombesinové analogy, které se mohou používat podle předloženého vynálezu, patří, ale nejsou na ně omezeny: neuromedin C, neuromedin B, litorin a peptid uvolňující gastrin (GRP), který mají následující sekvenci aminokyselin:

H-Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-AsnHis-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂,

Další bombesinové analogy, které se mohou používat v předloženém vynálezu, zahrnují sloučeniny, které jsou popsány v následujících odkazech, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako citace: Coy a spol.: Peptides, Proceedings of the llth Amer. Peptide Symposium, Rivier a spol. (red.), ESCOM, str. 65 až 67 (1990), Wang a spol.: Joumal Biol. Chemistry 265. 15695 (1990). Mahmoud a spol.: Cancer Research 51.1798 (1991), Wang a spol.: Biochemistiy 29, 616 (1990), Heimbrook a spol.: „Synthetic Peptides: Approaches to Biological Prolems“, UCLA Symposium on Mol. and Cell. Biol. New Series, díl 86, Tam a Kaiser (red.), Martinez a spol.: J. Med. Chem. 28, 1874 (1985), Gargosky a spol.: Biochem. J. 247, 427 (1987), Dubreuil a spol.: Drug Design Delivery 2, 49, Harwood Academie Publishers, Anglie (1987), Heikkila a sol.: J. Biol. Chem. 262,16456 (1987), Caranikas a spol.: J. Med. Chem. 25.1313 (1982), Saeed a spol.: Peptides 10. 597 (1989), ROsell a spol.: Trends in Pharmacological Sciences 3,211 (1982), Lundberg a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 80, 1120 (1983), Engberg a spol.: Nátuře 293.222 (1984), Mizrahi a spol.: Euro. J. Pharm. 82,101 (1982), Leander a spol.: Nátuře 294, 467 (1981), Woll a spol.: Biochem. Blpohys. Res. Comm. 155, 359 (1988), Rivier a spol.: Biochem. 17,1766 (1978), Cuttitta a spol.: Cancer Survey 4, 707 (1985), Aumelas a spol.: Int. J. Peptide Res. 30, 596 (1987), Szepeshazi a spol.: Cancer Research 51, 5980 (1991), Jensen a spol.: Trends Pharmacol. Sci. 12, 13 (1991), US patenty číslo 5 028 692, 4 943 561, 4 207 311, 5 068 222, 5 081 107 a číslo 5 084 555, evropské patentové přihlášky EP č. 0 315 367 A2 (1989), 0 434 979 AI (1991), 0 468 497 A2 (1992), 0 313 158 A2 (1989) a 0 339 193 AI (1989), PCT přihlášky č. WO 90/01037 (1990) a 90/02545 (1992) a anglická přihláška GB 1 231 051 A (1990).

Peptidy podle vynálezu se mohou připravovat ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Příklady výhodných solí jsou soli s terapeuticky přijatelnými organickými kyselinami, např. kyselinou

-7CZ 289552 B2 octovou, mléčnou, maleinovou, citrónovou, jablečnou, askorbovou, jantarovou, benzoovou, salicylovou, methansulfonovou, toluensulfonovou nebo pamovou, a také s polymemími kyselinami, jako je tanin nebo karboxymethylcelulóza, a soli s anorganickými kyselinami, jako jsou halogenovodíkové kyseliny včetně kyseliny chlorovodíkové, kyselina sírová a kyselina fosforečná.

V další části tohoto spisu je popsána syntéza sloučeniny obecného vzorce I. Při popisu syntéz sloučenin podle předloženého vynálezu se používají následující zkratky:

Nal znamená naftylalanin (1 nebo 2),

Abu znamená a-aminomáselná kyselina,

D znamená pravotočivá,

L znamená levotočivá,

HOAc znamená kyselina octová,

BOP znamená benzotriazol-l-yloxytri(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát,

BOC znamená terč, butyloxykarbonylová skupina,

DCC znamená dicyklohexylkarbodiimid,

EDC znamená l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid,

DEPC znamená diethylkyanofosfonát,

DMF znamená dimethylformamid, CH₂C1₂ znamená dichlormethan, MeOH znamená methanol

EtOH znamená ethanol

DIEA znamená N,N-diizopropylethylamin,

HOBT znamená O-benzotriazol-l-yl,N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorfosfát a TFA znamená trifluoroctová kyselina.

Výchozí materiály a meziprodukty pro sloučeninu obecného vzorce I jsou komerčně dostupné. Výchozí materiály se mohou také snadno připravovat způsoby, které jsou dobře známy odborníkům a jsou obsaženy v odborné literatuře. Například chemii derivátů souvisejících s kyselinou askorbovou je možno nalézt vJ. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1220 (1974), Carbohyd. Res. 67, 127 (1978), Yakugaku Zasshi 86, 376 (1966), US patentu č. 4 552 888, J. Med. Chem. 31, 793 (1988), 34,2152 (1992) a 35.1618 (1992), jejichž obsahy jsou zde zahrnuty jako odkazy. Chemii derivátů souvisejících s tris lze nalézt v Arch. Biochem. Biophy. 96, 653 (1962) a Biochem. 5,467 (1966), jejichž obsahy jsou zde také zahrnuty jako odkazy.

V obecném smyslu lze kondenzaci sloučeniny obecného vzorce I na příslušné volné skupiny chráněných aminokyselin nebo peptidů provádět podle dobře známých způsobů používaných při syntéze peptidů (např. DCC, DCC-HOBT, DIC-HOBT PPA, EDC-HOBT, DEPT, BOP, HBTU) s použitím báze (např. DIEA) v inertním rozpouštědle (např. DMF, THF, dichlormethanu, ethylacetátu nebo v jejich kombinacích). Odstranění chránících skupin se také může provádět dobře známými způsoby (např. odstraněním skupiny přidáním kyseliny nebo báze, TFA, dioxanu sHCl, amoniaku, methoxidu sodného, piperidinu). Ve většině případů by se reakční teplota měla pohybovat v rozmezí od -30 °C do teploty místnosti.

První stupeň syntézy obecně zahrnuje reakci mezi epoxidem a volnou aminovou skupinou chráněné aminokyseliny nebo peptidů. Komplexace a odstranění chránících skupin se dosáhne dobře známými způsoby, jako jsou ty, které popsal McManus a spol.: Synth. Communications 3, 177 (1973), jejichž obsahy jsou zde zahrnuty jako odkazy. Následující syntézy, čištění meziproduktů a produktů se mohou provádět konvenčními způsoby, jako je chromatografie nebo HPLC. Sloučeniny se identifikují konvenčními technikami, jako je NMR, aminokyselinová analýza a hmotnostní spektrometrie.

Následující příklady ilustrují výhodné způsoby přípravy sloučenin podle vynálezu.

-8CZ 289552 B2

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza somatostatinových derivátů

Podle tohoto vynálezu byl syntetizován následující somatostatinový derivát, který je označován také jako BIM-23118:

HO O- (CHj^CO-D-Nal-clCys-TyT-D-Trp-Lys-Val-QysJ -Thr-NH^

Příklad 1,1

3-0-(Benzyloxykarbonylmethyl)-2,5,6-triacetyl-askorbová kyselina

Anhydrid kyseliny octové (6 ml) se přikape k roztoku

3-0-(benzyloxykarbonylmethyl)askorbové kyseliny (2,2 g) v pyridinu (30 ml). Tato směs se míchá přes noc za teploty místnosti. Pyridin se za sníženého tlaku odpaří. Zbylý odparek se roztřepe mezi ethylacetát a IN HCI. Ethylacetátová vrstva se promyje IN HCI a vodou. Po vysušení nad síranem hořečnatým se ethylacetát za sníženého tlaku odpaří. Zbylé stopy pyridinu a anhydridu kyseliny octové se odstraní několikanásobným odpařením s toluenem. Výsledná 3-0-(benzyloxykarbonylmethyl)-2,5,6-triacetyl-askorbová kyselina vysušením ve vakuu poskytne viskózní gel, který zůstává ve zbytku (2,4 g). TLC (silikagel-chloroform-aceton v poměru 9:1): Rf=0,52.

Příklad 1,2

3-O-(Karboxymethy 1)-2,5,6-triacetylaskorbová kyselina

Suspenze palladia na uhlí (100 mg) ve vodě (2 ml) se přidá k roztoku 3-0-(benzyloxykarbonylmethyl)-2,5,6-triacetyl-askorbové kyseliny (2,4 g) v ethanolu (30 ml). Suspenze se třepe 6 h pod vodíkem (116 kPa). Katalyzátor se odfiltruje vrstvou celitu. Odpařením filtrátu za sníženého tlaku se získá 3-0-(karboxymethyl)-2,5,6-triacetylaskorbová kyselina. TLC (silikagel-chloroform/methanol/kyselina octová v poměru 9:1:0,1): Rf = 0,2.

Příklad 1,3

5,6-O-Izopropylidenaskorbová kyselina

K rychle míchané suspenzi kyseliny askorbové (8,0 g) v acetonu (80 ml) se přidá acetylchlorid (0,67 ml). Směs se míchá za teploty místnosti přes noc. Sraženina se odfiltruje, promyje se ethylacetátem a vysuší se za sníženého tlaku. Získá se tak 8,29 g 5,6-O-izopropylidenaskorboé

-9CZ 289552 B2 kyseliny jako bezbarvá pevná látka. TLC (silikagel/chloroform/methanol/kyselina octová v poměru 3:1:0,1): Rf= 0,54.

Příklad 1,4

3-0-(Ethoxykarbonylpropyl)-5,6-izopropylidenaskorbová kyselina

Roztok 5,6-izopropylidenaskorbové kyseliny (2,0 g) v 10 ml DMF se přikape k suspenzi NaH (0,44 g 50% (hmotn.) disperze NaH v minerálním oleji, několikrát promytá hexanem) v 5 ml DMF. Když skončí uvolňování plynu, přikape se roztok 1,43 ml ethylesteru kyseliny 4-brommáselné v 5 ml DMF a směs se míchá za teploty místnosti přes noc. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odpaří. Výsledný odparek se chromatografuje na silikagelu (55 g), eluce směsí chloroformu s methanolem v poměru 19:1. Příslušné frakce se spojí a rozpouštědla se za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak viskózní odparek, který obsahuje 3-0-(ethoxykarbonylpropyl)-5,6-izopropylidenaskorbovou kyselinu (1,1 g).

Příklad 1,5

3-O-(Karboxypropyl)-5,6-izopropylidenaskorbová kyselina

4,6 ml 2N-NaOH se přidá k roztoku 3-0-(ethoxykarbonylpropyl)-5,6-izopropylidenaskorbové kyseliny (1,02 g) v 15 ml ethanolu. Po 1 h se většina ethanolu za sníženého tlaku odstraní, odparek se zředí vodou (10 ml) a okyselí zředěnou HC1 (pH3). Roztok se pak nasytí NaCl a několikrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odpaří. Získá se tak viskózní odparek, který obsahuje 3-0(karboxypropyl)-5,6-izopropylidenaskorbovou kyselinu (0,84 g). TLC (silikagel: chloroform/methanol/kyselina octová v poměru 5:1:0,l): Rf= 0,55.

Příklad 1,6

D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH2

Roztok diterc. butyldikarbonátu (0,36 g) v 10 ml DMF se přikape k roztoku acetátu D-Nalc[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 (2 g, BIM-23014) ve 45 ml DMF. Po 2 h za teploty místnosti se rozpouštědlo za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak odparek, který se zchromatografuje na silikagelu (150 g), eluce směsí chloroformu s methanolem v poměru 9:1. Příslušné frakce se spojí a rozpouštědlo se za sníženého tlaku odstraní. Získá se odparek, kteiý obsahuje D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH2 (1,45 g). TLC (silikagel, chloroform s methanolem v poměru 3:1): Rf = 0,52.

-10CZ 289552 B2

0,2 ml diizopropylethylaminu se přidají k roztoku D-Nal-cyklo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)Val-Cys]-Thr-NH₂ (300 mg), 3-0-(karboxypropyl)-5,6-izopropylidenaskorbové kyseliny (56 mg) a HBTU (113 mg) v 5 ml DMF. Směs se pak míchá za teploty místnosti přes noc a rozpouštědlo se za sníženého tlaku odstraní. Odparek se roztřepe mezi směs ethylacetátu s methanolem a nasycený vodný roztok chloridu sodného. Ethylacetátová vrstva se promyje nasyceným vodným chloridem sodným, potom nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Odparek se preparativně zchromatografuje na TLC, eluce směsí chloroformu s methanolem v poměru 8:1. Odpovídající UF-pozitivní zóna se izoluje a extrahuje se směsí chloroformu s methanolem. Rozpouštědla se za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak shora uvedený produkt (0,20 g). TLC (silikagel, chloroform/MeOH v poměru 5:1): Rf = 0,54.

Příklad 1,8

Odstranění skupiny BOC

Shora uvedený derivát kyseliny askorbové obsahující

D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂ (95 mg) se nechá 45 minut reagovat s 25% (hmotn.) TFA v chloroformu za teploty místnosti. Těkavé látky se za sníženého tlaku odstraní. Získá se suchý odparek, který se vyčistí HPLC na koloně Vydac C_l8, eluce acetonitril/0,1% (hmotn.) vodná TFA. Konečný výtěžek byl 90 mg. FAB-MS (m/e): 1341.

Příklad 1,9

Jiná provedení

Analogickým způsobem se syntetizují také následující somatostatinové deriváty:

HO o-CH2-CO-D-Mal-c(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂

BIM-23135,

-11 CZ 289552 B2

BIM-23181 a

BIM-23183.

Příklad 2

Syntéza BIM-23107

Podle tohoto vynálezu byl syntetizován následující somatostatinový derivát, který se označuje také BIM-23107: (AcO-CH₂)j-C-NH-CO(CH₂)r-CO-I>-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-ValCys]-Thr-NH₂

Příklad 2,1 (AcO-CH₂)3-C-NH-CO(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂0,03 ml DIEA se přidá k ledem ochlazenému roztoku diacetátu 2-N-(sukcinyl)amino-2(acetoxymethyl)-l,3-propandiolu (83 mg) a HBTU (92 mg) ve 2 ml DMF. Po 30 minutách míchání při 0 až 5 °C se přidá roztok D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys-]-ThrNH₂ (100 mg) ve 2 ml DMF obsahující 0,03 ml DIEA. Směs se nejdříve míchá 1 h při 0 až 5 °C, potom přes noc za teploty místnosti. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Získá se tak suchý odparek, který se roztřepe mezi ethylacetát a vodný nasycený NaCl, ethylacetátová vrstva se promyje vodným 5% (hmotn.) roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nakonec vodným nasyceným NaCl. Výsledný roztok se vysuší síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odpaří. Zůstane odparek, který obsahuje (AcO-CH₂)3-C-NH-CO-(CH2)2-CO-D-Nalc[Cys-Tyr-D-Trp-Lys(BOC)-Val-Cys]-Thr-NH₂ (0,14 g). TLC (silikagel, eluce směsí chloroformu s MeOH a AcOH v poměru 4:1:0,1): Rf = 0,82.

-12CZ 289552 B2

Příklad 2,2

Odstranění skupiny BOC mg shora uvedené sloučeniny se nechá 45 minut reagovat s 50% (hmotn.) TFA v chloroformu za teploty místnosti. Těkavé sloučeniny se za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak odparek. Stopy TFA se několikrát odpaří společně s ethanolem. Odparek se titruje etherem a potom se vysuší. Získá se tak 30 mg produktu. TLC (silikagel, eluce chloroform s MeOH a AcOH v poměru 3:1:1): Rf = 0,24.

Příklad 2,3

Jiná provedení

Podobným způsobem se syntetizují také následující somatostatinové deriváty:

(HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂BIM-23158 (HO-CH₂)₃-€-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH₂BIM-23167 (HO-CH₂)₃-C-NH-CO-(CH₂)₂-CO-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂BIM-23173 (HO-CH₂)₃-C-NH-CH2-CHO-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂BIM-23179 (HO-CH₂)₃-C-NH-CH₂-CC)-D-Phe-c[Cys~Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr--NH₂BIM-23182

Příklad 3

Syntéza BI-23201

Podle tohoto vynálezu se syntetizuje následující somatostatinový derivát, který je označován také jako BIM-23201:

(HO-CH₂)₃-C-CH2-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys--Thr-Cys]-Nal-NH₂.

Příklad 3,1 (HO-CH₂)₃-C-CH₂-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂

Po dávkách se přidají 2 g molekulového síta (0,3 nm) a NaCNBH₃ (36 mg) během 15 min k roztoku

D-Phe-c[Cys-Tyr(OBt)-D-Trp-Lys(BOC)-Thr(OBt)-Cys]-Nal-NH₂ (250 mg) a tris(acetoxymethyl)acetaldehydu (120 mg) získaného oxidací tricetyl-pentaerythritolu pyridiniumdichromátem nebo směsí DMSO/oxalylchlorid/triethylamin) v methanolu (10 ml)

-13CZ 289552 B2 obsahujícím 10% hmotn. kyseliny octové. Směs se pak míchá 30 minut za teploty místnosti a zahřívá se 4 h. Po filtraci se zbytek roztřepe mezi ethylacetát a vodu. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou, potom vodným hydrogenuhličitanem sodným a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odpaří. Získá se odparek (0,4 g), který se rozpustí v methanolu (5 ml), nechá se zreagovat s roztokem NaOMe vMeOH (pH 10), míchá se 1 h a nakonec se zneutralizuje 1N HC1 na pH 5 až 6. Po odpaření rozpouštědla se odparek rozpustí v 90% (hmotn.) vodné TFA a směs se míchá 30 minut. Těkavé podíly se za sníženého tlaku odstraní. Stopy TFA a vody ve výsledném odparku se odstraní společným odpařováním sethanolem (dvakrát). Odparek se vysuší, ztitruje se etherem a nakonec se vyčistí HPLC za podobných podmínek jak shora popsáno. Získá se 41 mg (HO-CH₂)₃-C-CH₂-D-Phe-c[Cys~ Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂ jako bezbarvá pevná látka. Hmotnostní spektrum (m/e); 1262,8.

Příklad 3,2

Jiná provedení

Podobným způsobem se syntetizuje následující somatostatinový derivát, který je označován také jako BIM-23195:

(HO-CHzjj-C-CHr-D-Phe-ctCys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-CysJ-Thr-NHz.

Příklad 4

2-Bromethansulfonylchlorid

2-Bromethanusulfonát sodný (4,0 g) se nechá reagovat s PC1₅ (11,8 g) za chlazení v ledové lázni. Po získání kapalné fáze se roztok zahřívá 1,5 h v oleji na 90 až 120 °C, ochladí se na teplotu místnosti, vlije se do 50 g rozdrceného ledu a pak se míchá 15 minut. Směs se extrahuje dichlormethanem (3 ^x 20 ml) a spojené extrakty se promyjí vodou (2^X), 5% (hmotn.) hydrogenuhličitanem sodným (2*) a opět vodou (2*). Vysušením nad bezvodým síranem hořečnatým a destilací za sníženého tlaku se získá 2-bromethansulfonylchlorid jako bezbarvá kapalina (1,95 g, 42 až 44 °C/133 Pa).

Příklad 4,1

Br-(CH₂)₂-SO2-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Abu-Cys]-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropyl-l-methyl)-ethyl

Roztok 2-bromethansulfonylchloridu (30 mg) v DMF (1 ml) se přikape k roztoku H-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Abu-Cys]-Thr(tBu)-(l-cyklopropyl-l-methyl)ethylu (150 mg) a DIEA (55 mg) v DMF (2 ml) pod dusíkem při 0 °C. Reakční směs se míchá 3 h při 0 až 5 °C, rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku, odparek se rozpustí v ethylacetátu a promyje se 5% (hmotn.) kyselinou citrónovou (2^X), 5% (hmotn.) hydrogenuhličitanem sodným (2x) a solným roztokem (2x). Roztok se pak vysuší nad bezvodým síranem hořečnatým, zfíltruje a za sníženého tlaku se zahustí do sucha. Produkt se dále přečistí na krátké koloně silikagelu, eluce ethylacetátem. Frakce, které obsahují produkt, se spojí a rozpouštědlo se za sníženého tlaku odstraní. Získá se tak 105 mg Br-(CH₂)2-S0₂-D-Phe-c[Cys-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-AbuCys]-Thr(tBu)-NH(l-cyklopropyl-l-methyl)-ethylu jako světle žlutá pevná látka. TLC (silikagel, chloroform/MeOH/HOAc v poměru 9:1:0,1): Rf = 0,36.

-14CZ 289552 B2

Příklad 5

Syntéza bombesinových derivátů

Podobným způsobem jako shora popsáno se syntetizuje následující bombesinový derivát, který se označuje také BIM-26333:

HO OH^-a^-^-CO-D-Pte-Gln-Txp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NHj

Analogickým způsobem použitím syntetických modifikací známých z oblasti techniky se 10 syntetizují další peptidové deriváty podle vynálezu. V další části jsou uvedeny výsledky testů testovaných peptidů.

Příklad 6

Vazebné testy

Pro demonstrování vazebné afinity somatostatinových (SRIF) analogů na somatostatinový receptor se shora popsané vyčištěné sloučeniny testují v testu navázání somatostatinu zahrnujícím 20 měření in vitro inhibice navázání [¹²⁵I-Tyrⁿ]SRIF-14 na krysí AR42J pankreasové membrány.

Jak je uvedeno v tabulce I, vyčištěné somatostatinové analogy podle tohoto vynálezu vykazují vysoké vazebné afinity na tyto receptory. V tabulce je pro každý somatostatinový derivát uvedena molekulová hmotnost, stanovená hmotností spektrometrií a vypočtená z molekulární struktury.

Podobně byl v testu navázání bombesinu testován vyčištěný shora popsaný bombesinový analog. Test navázání spočíval v měřeních in vitro inhibice navázání [¹²⁵I-Tyr^H]bombesinu na kiysí AR42J pankreasové membrány. V tomto testu byla stanovena vazebná afinita bombesinového analogu na GRP receptor kolem 21 nM.

Příklad 7

Test inhibice růstového hormonu (GH)

Skupině 5 krysích samců Sprague Dawley (každý o hmotnosti mezi 250 a 300 g) byl injekčně s.c. podán somatostatinový derivát nebo solný roztok. Třicet minut před zvolenou dobou po podání léčivého přípravku uvedené v tabulce II (2 h, 4 h, 6 h, 8 h) byly krysy anestetizovány Nembutalem (i.p., 50 mg/kg). 15 minut po anestezi byl odebrán podíl krve kardiálním vpichem 40 přes heparin, aby se změřil základní GH. Dále byla podána s.c. injekce D-Ala²-GRF (10 pg/kg).

Po 15 minutách byla odebrána krev, aby byl kvantitativně stanoven stimulovaný GH, který se měří v plazmě radioimunoanalytickým testem dodaným NIADDKD. Ze získaných rozdílů mezi základní a stimulovanou hodnotou GH se vypočte inhibice GH.

Tabulka II ukazuje účinek různých vyčištěných somatostatinových analogů jako funkci času. Účinnost D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH2 (BIM-23060) na inhibování

-15CZ 289552 B2 růstového hormonu u krys je srovnána s jinými somatostatinovými deriváty (BIM-23167, BIM23179 a BIM-23181) podle vynálezu. Všechny deriváty vykazují překvapující prodloužené trvání působení, které klesá v závislosti na času.

Pro stanovení ED50 (tj. koncentrace každé sloučeniny potřebné pro inhibování 50 % uvolněného růstového hormonu po příslušné době) příslušné sloučeniny byly provedeny další pokusy se somatostatinovým analogem D-Ph e-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂ a s BIM23190, BIM-23195 a BIM-23197. Pokusy byly prováděny v dávkovém rozmezí mezi 25 pg/kg a 0,25 pg/kg. Tabulka III ukazuje překvapující zlepšení somatostatinových derivátů proti nemodifikovanému peptidů v různých časových intervalech, což ukazuje na to, že inhibice uvolňování stimulovaného GH sloučeninami podle vynálezu závisí na čase.

Příklad 8

Antiproliferační test

Shora popsané vyčištěné somatostatinové analogy byly testovány také na aktivitu proti rychle proliferujícím buňkám. Tabulka IV popisuje účinek těchto peptidů na růst AR42J nádorových buněk krysího pankreasu. Na rozdíl od přírodního somatostatinu vykazují deriváty podle vynálezu podstatnou anti-proliferační aktivitu. Na obrázku 1 je vidět, že jak BIM-23041C (somatostatinový analog) tak BIM-23118 (derivát sloučeniny BIM-23014) inhibují růst AR42J nádorových buněk krysího pankreasu v závislosti na koncentraci, přičemž BIM-23118 je z těchto dvou sloučenin aktivnější. Obě sloučeniny inhibují růst nádorových buněk ve větším rozsahu než nemodifikované somatostatinové analogy v ekvivalentních koncentracích.

Příklad 9

Test příjmu thymidinu

V tomto testu se zásobní kultury švýcarských 3T3 buněk pěstují v Dulbeccem modifikovaném Eaglesově médiu (DMEM) doplněném 10 % plodového telecího séra ve vlhké atmosféře s 10 % hmotn. CO₂ a 90 % hmotn. vzduchu při 37 °C. Buňky se pak vysejí do klastrových misek s 24 jamkami a použijí se 4 dny po poslední změně média. Aby se buňky zachovaly ve fázi G1/G0 buněčného cyklu, DMEM médium bez séra se použije 24 h před testem příjmu thymidinu. Buňky se pak dvakrát promyjí 1 ml podíly DMEM (bez séra, 0,5 μΜ) a [methyl-³H]thymidinu (20 Ci/mmol, New England Nuclear).

Bombesinové deriváty se nejdříve testují při koncentraci 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 a 100 nM. Po 28 h při 37 °C se testuje inkorporace [methyl-³H]thymidinu v podílech nerozpustných v kyselině. Buňky se nejdříve dvakrát promyjí ledem ochlazeným 0,9% NaCl (1 ml podíly). Radioaktivita rozpustná v kyselině se pak odstraní 30 minutovou inkubací při 40 °C s 5% (hmotn.) trichloroctovou kyselinou (TCA). Kultury se pak jednou promyjí (1 ml) 95% (hmotn.) ethanolem a solubilizují se 30 minutovou inkubací s 1 ml 0,lN NaOH. Solubilizovaný materiál se přenese do baněk obsahujících 10 ml ScintA (Packard). Radioaktivita se stanoví kapalinovou scintilační spektrometrií. Tento test ukazuje schopnost bombesinových derivátů stimulovat příjem thymidinu do buněk. Vypočtená EC50 byla 0,48 nm, což ukazuje, že bombesinové deriváty podle vynálezu jsou účinnými stimulátory příjmu thymidinu.

Peptidové deriváty podle vynálezu se mohou podávat savcům, zvláště člověku, jedním z tradičních způsobů podávání (např. orálně, parenterálně, transdermálně nebo transmukozálně), v prostředcích s trvalým uvolňováním použitím biodegradovatelného a bioslučitelného polymeru nebo místním podáváním (např. v případě protirakovinových bombesinovových nebo somato

-16CZ 289552 B2 statinových derivátů do plic) pomocí micel, gelů nebo liposomů. Dávkování je obvykle stejné jako běžně používané dávkování u terapeutických peptidů u lidí.

Peptidové deriváty podle vynálezu jsou vhodné také pro zlepšené léčení těch onemocnění, která jsou citlivá na léčení odpovídajícím nemodifikovaným peptidem. Zvláště shora popsané somatostatinové deriváty jsou vhodné pro léčení rakoviny, akromegalie, pankreatitidy, proliferace způsobené úrazem, diabetes, diabetické retinopatie, restenózy po angioplastii, AIDSu, neurogenního zánětu, artritidy a gastrointestinálních problémů včetně diarey.

Tabulka I

In vitro vazebné afinity a molekulové hmotnosti somatostatinových peptidových derivátů

(nM)	MWtest	MWvyp	ic₅₀
SRIF-14	—	-	0,17
SRIF-28	—	—	0,23
BIM-23107	1340,4	1340,40	0,30
BIM-23118	1313,5	1313,52	0,30
BIM-23135	1426,2	1426,64	2,52
BIM-23158	1299,6	1299,54	0,33
BIM-23167	1347,6	1347,55	0,09
BIM-23173	1235,5	1235,46	0,11
BIM-23179	1305,9	1305,55	0,12
BIM-23181	1435,0	1434,62	0,25
BIM-23182	1193,8	1193,42	0,12
BIM-23183	1323,0	1322,49	0,22
BIM-23190	1202,8	1202,47	0,20
BIM-23191	1314,9	1314,61	0,08
BIM-23195	1150,8	1150,39	0,08
BIM-23196	1243,7	1243,50	0,09
BIM-23197	1252,7	1252,55	0,29
BIM-23201	1262,8	1262,53	0,14
BIM-23202	1247,0	1246,53	0,18

Tabulka II

Inhibice uvolňování stimulovaného růstového hormonu u kiys somatostatinovými peptidovými deriváty

Inhibice v % ke kontrole při dávce 25 pg/kg:
	2h	4h	6h	8h
BIM-23060	86,39	64,96	47,62	38,15
BIM-23167	92,67	79,54	59,72	50,14
BIM-23179	92,79	63,85	67,78	68,26
BIM-23181	99,24	77,07	60,56	56,12

-17CZ 289552 B2

Tabulka III

Inhibice uvolňování stimulovaného růstového hormonu u krys somatostatinovými peptidovými deriváty podávanými s.c.

ED₅₀ (gg/kg)
	2h	4h	6h	8h
BIM-23023	0,48	1,11	2,26	4,32
BIM-23190	0,68	0,57	0,76	1,04
BIM-23195	1,19	3,13	2,08	3,23
BIM-23197 1,01 0,59 1,14 1,59

Tabulka IV

Antiproliferační aktivita somatostatinových peptidových derivátů růst buněk (procenta ke kontrole)¹

SRIF-14	91,3
SROF-28	98,0
BIM-23014C	74,1
BIM-23107	67,5
BIM-23109	72,1
BIM-23118	61,0
BIM-23135	62,9
BIM-23167	60,2
BIM-23173	67,9
BIM-23181	69,1
BIM-23182	68,7
BIM-23183	69,1
BIM-23195	69,2
BIM-23197	66,4

¹ Koncentrace 100 nM, nádorové buňky AR42J krysího pankreasu po 8 dnech.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Somatostatinový nebo bombesinový derivát, který obsahuje jeho biologicky aktivní peptidový podíl a alespoň jeden substituent připojený na tento peptidový podíl, přičemž tímto substituentem je sloučenina obecného vzorce I (Dr

- 18CZ 289552 B2 v němž

Ro znamená atom kyslíku, síry nebo skupinu NR₅, v níž R₅ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

Ri a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, skupinu obecného vzorce (CH₂)_ra-OR6 nebo CH(OR₇)CH₂OR8, v nichž R^ znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku a R₇ a Rj nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku nebo skupinu C(R₉)(Rio), v níž R₉ a R]₀ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, nebo skupinu R] i R₂ znamenají společně skupinu =CHCH₂ORn, v níž Rn znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku a m znamená číslo od 1 do 5 včetně, a jedna ze skupin R₃ a R, znamená skupinu (CH₂)_nR_I2 nebo (CH₂)_nCH(OH)Ri₂, v nichž R₎₂ znamená skupinu CO, CH₂ nebo SO₂ a n znamená číslo mezi 1 a 5 včetně, a zbývající skupina R₃ nebo R, znamená atom vodíku, hydroxyalkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku, přičemž peptidový podíl je připojen ke každému substituentu vazbou CO-N, CHr-N nebo SO₂-N mezi tímto substituentem a atomem dusíku N-konce nebo postranního řetězce uvedeného peptidového podílu.
2. Somatostatinový nebo bombesinový derivát podle nároku 1, v němž substituent připojený na peptidový podíl znamená sloučeninu obecného vzorce I.
3. Somatostatinový nebo bombesinový derivát podle nároku 1, v němž substituent Ri₂ znamená skupinu CH₂ nebo SO₂.
4. Derivát podle nároku 1, v němž peptidový podíl znamená somatostatin nebo jeho derivát, fragment nebo analog.
5. Derivát podle nároku 4, v němž somatostatinový analog znamená jednu z následujících sloučenin:

H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH₂, H-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Nal-NH₂ a H-D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂.
6. Derivát podle nároku 1, v němž peptidový podíl znamená bombesin nebo jeho derivát, fragment nebo analog.
7. Somatostatinový nebo bombesinový derivát podle nároku 2, který obsahuje dva biologicky aktivní peptidové podíly a alespoň jeden substituent připojený na jeden z peptidových podílů, přičemž tímto substituentem sloučenina obecného vzorce IV kde Ro znamená atom kyslíku, síry nebo skupiny NR₅, v níž R₅ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, Ri a R₂ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, skupinu obecného vzorce (CH₂)_raOR nebo CH(OR₇)CH₂ ORg, v nichž R^ znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku a R₇ a Rg nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku nebo skupinu C(R₉)(R]₀), v níž R₉ a R_!0nezávisle na sobě znamenají atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, nebo skupiny Ri i R₂ znamenají skupinu =CHCH₂ORn, v níž Rn nezávisle na tom, zda jde o R] nebo R₂, znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu se 2 až 7 atomy uhlíku a m znamená číslo od 1 do 5 včetně, a

R₃ a R4 nezávisle na sobě znamenají skupinu (CH₂)_nR]₂ nebo (CH₂)_nCH(OH)Ri₂, v nichž Ri₂znamená skupinu CO, CH₂ nebo SO₂ a n znamená číslo od 1 do 5 včetně, a alespoň jedna

-19CZ 289552 B2 z peptidových částí je připojena k substituentu vazbou CO-N, CHr-N nebo SO₂-N mezi tímto substituentem a atomem dusíku N-konce nebo postranního řetězce uvedené peptidové části.
8. Použití somatostatinového derivátu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení onemocnění 5 pacienta.
9. Použití bombesinového derivátu podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro léčení onemocnění pacienta.

io
10. Použití derivátů podle nároku 8 nebo 9, kde onemocnění je rakovina.
11. Somatostatinový derivát podle nároku 1 pro použití jako léčiva pro léčení rakoviny.
12. Bombesinový derivát podle nároku 1 pro použití jako léčiva pro léčení rakoviny.