DE60220157T2 - Verfahren zur modulierung der proliferation von medullären schilddrüsen-karzinomzellen - Google Patents

Verfahren zur modulierung der proliferation von medullären schilddrüsen-karzinomzellen Download PDF

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    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es wurde gezeigt, dass Somatostatin (SS), ein Tetradecapeptid, das von Brazeau et al. entdeckt wurde, starke inhibitorische Wirkungen auf zahlreiche sekretorische Prozesse in Geweben, wie beispielsweise in der Hypophyse, in der Bauchspeicheldrüse und im Gastrointestinaltrakt aufweist. SS wirkt darüber hinaus als Neuromodulator im zentralen Nervensystem. Diese biologischen Wirkungen von SS, die alle inhibitorischer Art sind, werden durch mehrere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ausgelöst, von denen fünf unterschiedliche Subtypen charakterisiert wurden (SSTR1–SSTR5) (Reubi JC, et al., Cancer Res. 47: 551–558, Reisine T. et al., Endocrine Review 16: 427–442, Lamberts SW, et al., Endocr Rev 12: 450–482, 4 Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology 20: 157–198). Diese fünf Subtypen haben ähnliche Affinitäten für die endogenen SS-Liganden, weisen jedoch eine unterschiedliche Verteilung in den verschiedenen Geweben auf. Somatostatin bindet die fünf verschiedenen Rezeptor-(SSTR)-Subtypen mit relativ hoher und gleicher Affinität für jeden Subtypen.
  • Es gibt Hinweise, dass SS die Zellproliferation durch Anhalten des Zellwachstums über die Subtypen SSTR1, 2, 4 und 5 (Buscail L, et al., 1995 Proc Natl Acad Sci, USA 92: 1580–1584; Buscail L, et al., 1994 Proc Natl Acad Sci, USA 91: 2315–2319; Florin T, et al., 1999 Mol Endocrinol 13: 24–37; Sharma K, et al., 1999 Mol Endocrinol 13: 82–90) oder durch Einleitung der Apoptose über den Subtyp SSTR3 (Sharma K. et al., 1996 Mol Endocrinol 10: 1688–1696) reguliert. Es wurde gezeigt, dass SS und verschiedene Analoga die normale und neoplastische Zellproliferation in vitro und in vivo inhibieren (Lamberts SW, et al., Endocr Rev 12: 450–482), und zwar über spezifische SS-Rezeptoren (SSTR's) (Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology 20: 157–198) sowie möglicherweise über verschiedene, dem Rezeptor nachgelagerte Prozesse (Weckbecker G. et al., Pharmacol Ther 60: 245–264; Bell GI, Reisine T 1993 Trends Neurosci 16: 34–38; Patel YC, et al., Biochem Biophys Res Commun 198: 605–612; Law SF, et al., Cell Signal 7: 1–8). Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass in normalen und neoplastischen humanen Gewebe verschiedene SSTR-Subtypen exprimiert werden (Virgolini L, et al., Eur J Clin Invest 27: 645–647), was zu verschiedenen Gewebeaffinitäten für zahlreiche SS-Analoga und zu wechselhaften klinischen Antworten auf ihre therapeutischen Wirkungen führt.
  • Die Bindung an die verschiedenen Arten von Somatostatin-Rezeptor-Subtypen ist mit der Behandlung von verschiedenen Zuständen und/oder Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Beispielsweise ist die Inhibierung von Wachstumshormone mit dem Somatostatin-Rezeptor vom Typ 2 ("SSTR2") in Verbindung gebracht wurden (Raynor, et al., Molecular Pharmacol. 43: 838 (1993); Lloyd, et al., Am. J. Physiol. 268: G102 (1995)), während die Inhibierung von Insulin mit dem Somatostatin-Rezeptor vom Typ 5 ("SSTR5") in Verbindung gebracht worden ist (Coy, et al. 197: 366–371 (1993)). Die Aktivierung der Typen 2 und 5 ist mit der Suppression von Wachstumshormone und insbesondere von GH-ausscheidenden Adenomen (Akromegalie) und TSH-ausscheidenden Adenomen in Verbindung gebracht worden. Die Aktivierung des Typs 2, jedoch nicht des Typs 5 ist mit der Behandlung von Prolaktin-ausscheidenden Adenomen in Verbindung gebracht worden. Andere Indikationen, die mit der Aktivierung von Somatostatin-Rezeptor-Subtypen in Verbindung gebracht worden sind, umfassen die Inhibierung von Insulin und/oder Glucagon zur Behandlung von Diabetes mellitus, Angiopathie, proliferative Retinopathie, Dawn-Phänomen und Nephropathie; die Inhibierung der Ausschüttung von Magensäure und insbesondere Magengeschwüre, enterokutane und pankreatikokutane Fisteln, Reizdarm- Syndrom, Dumping-Syndrom, Wasserdurchfall-Syndrom, AIDS-bedingter Durchfall, Chemotherapie-bedingter Durchfall, akute oder chronische Pankreatitis und Gastrointestinalhormon ausscheidende Tumore; die Behandlung von Krebs wie z.B. Hepatomen; die Inhibierung der Angiogenese; die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise Arthritis; Retinopathie; chronische Allotransplantat-Abstoßung; Angioplastie, die Vermeidung von Transplantatgefäßblutung und gastrointestinaler Blutung. Es ist bevorzugt, ein Analog zu haben, das selektiv für den spezifischen Somatostatin-Rezeptor-Subtypen oder die Subtypen ist, welche für die erwünschte biologische Antwort verantwortlich sind, wodurch eine Wechselwirkung mit anderen Rezeptor-Subtypen, die zu unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten, verhindert wird.
  • Somatostatin (SS) und seine Rezeptoren (SSTR1 bis SSTR5) werden in normalen humanen parafollikulären C-Zellen und in Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms (medullary thyroid carcinoma, MTC) exprimiert. MTC ist ein Tumor, der aus den parafollikulären C-Zellen der Schilddrüse entsteht, welche Calcitonin (CT), Somatostatin und einige andere Peptide produzieren (Moreau JP, et al., Metabolism 45 (8 Suppl 1): 24–26). Kürzlich haben Mato et al. gezeigt, dass SS und SSTR's in humanem MTC exprimiert werden (Mato E, et al., J Clin Endocrinol Metab 83: 2417–2420). Es ist gezeigt worden, dass SS und seine Analoga eine Verringerung der Plasma-CT-Spiegel sowie eine symptomatische Verbesserung bei MTC-Patienten bewirken. Bisher jedoch war die antiproliferative Aktivität von SS-Analoga auf Tumorzellen nicht eindeutig belegt worden (Mahler C, et al., Clin Endocrinol 33: 261–9; Lupoli G, et al., Cancer 78: 1114–8; Smid WM, et al., Neth J Med 40: 240–243). Demgemäß stellt die Entwicklung und die Beurteilung von SST-Subtyp-Analoga, die selektiv in Bezug auf das MTC-Zellwachstum sind, ein nützliches Hilfsmittel für die klinische Anwendung bereit. Bislang sind keinerlei Daten bezüglich der Beteiligung von spezifischen SSTR-Subtypen an der Regulation des MTC-Zellwachstums beschrieben worden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass die humane MTC-Zelllinie TT, die MTC-Zelleigenschaften aufweist (Zabel M, et al., 1992 Histochemistry 102: 323–327, 2 Gagel RF, et al., 1986 Endocrinology 118: 1643–1651, Liu JL, et al., 1995 Endocrinology 136: 2389–2396), und die stabil alle SSRT-Subtypen exprimiert, auf eine Aktivierung von SSTR2 und SSTR5 durch Subtypen-selektive Agonisten mit zwei unterschiedlichen Mustern in Bezug auf den Einbau von [3H]thy und die Zellzahl reagiert. Von SSTR2 bevorzugte Agonisten supprimieren im signifikanten Ausmaß den Einbau von [3H]thy, d.h. sie inhibieren die DNA-Synthese und verringern die Zellproliferation. SSTR5-selektive Agonisten erhöhen im signifikanten Ausmaß den Einbau von [3H]thy in TI-Zellen, d.h. sie verstärken die DNA-Synthese, führen jedoch allein nicht zu einer Beeinflussung der Zellproliferation. Darüber hinaus wirken SSTR2-Antagonisten der Wirkung von Agonisten, die von SSTR2 bevorzugt werden, auf TI-Zellen entgegen. Ferner verhindern ansteigende Konzentrationen eines SSTR5-selektiven Agonisten in Dosis-abhängiger Weise die Supprimierung des Einbaus von [3H]thy in TI-Zellen sowie die Proliferation von TI-Zellen, die durch einen von SSTR2 bevorzugten Agonisten erzeugt werden, und umgekehrt, was auf einen Antagonismus zwischen diesen Agonisten verweist.
  • Kürzlich wurden heterodimere und homodimere Wechselwirkungen zwischen Subtypen der Opiat-Rezeptorfamilie (Jordan BA, et al., 1999 Nature 399: 697–700) und der SS-Rezeptorfamilie (Rocheville M, et al., 2000 J. Biol. Chem. 275: 7862–7869) gezeigt. Studien in kultivierten Adenomzellen der Hypophyse haben gezeigt, dass die SSTR-Subtypen 2 und 5 synergistisch bei der Supprimierung der Ausscheidung von Wachstumshormon und Prolactin wirken (Shimon I, et al., 1997 J. Clinical Invest. 100: 2386–2392, Jaquet P. et al., 2000 J Clin Endocrinol Metab. 85: 781–792). Die Erkenntnis, dass die SSTR5-Aktivierung die durch SSTR2 vermittelte antiproliferative Aktivität verringert, weicht von den Ergebnissen in anderen Geweben ab (Pa tel YC, 1999 Front Neuroendocrinology 20: 157–198, Buscail L, et al., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92: 1580–1584, Buscail L, et al., 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91: 2315–2319, Sharma K, et al., 1996 Mol Endocrinol 10: 1688–1696). Dies ist der erste Beweis, dass die SSTR-Subtypen 2 und 5 antagonistisch bei der Regulation des Zellwachstums wirken können.
  • Somit weisen von SSTR2 und SSTR5 bevorzugte Agonisten in vitro unterschiedliche Auswirkungen auf die Proliferation der humanen medullären Schilddrüsen-TT-Zelllinie auf, gemäß ihrer spezifischen SSTR-Selektivität. Die Proliferation der TT-Zelllinie kann durch SSTR2-selektive Agonisten verringert werden, hingegen nicht durch SSTR5-Agonisten, und ein SSTR5-Agonist kann die von SSTR2 vermittelten antiproliferativen Wirkungen verhindern. Die inhibitorische Schlüsselrolle von SSTR2 bei der MTC-Zellproliferation zeigt, dass Analoga mit verstärkter Affinität und Selektivität für SSTR2 im Vergleich zu SSTR5 nützlich als antiproliferative Mittel bei der MTC-Behandlung sein würden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Somatostatin-Agonisten, die selektiv für SSTR-2 sind, wirksam bei der Verringerung der Proliferationsrate von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms sind, und, dass Somatostatin-Agonisten, die selektiv für SSRT5 sind, wirksam bei der Abschwächung dieser durch den SSTR2-Agonisten induzierten Verringerung der Proliferationsrate sind.
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modulierung der Proliferationsrate von MTC-Zellen in vitro, welches das Inkontaktbringen der MTC-Zellen mit einem oder mit mehreren SSTR2-Agonisten und mit einem oder mit meh reren SSTR5-Agonisten umfasst, wobei der SSTR2-Agonist dazu dient, die Proliferationsrate der MTC-Zellen zu verringern, und wobei der SSTR5-Agonist dazu dient, die durch den SSTR2-Agonisten induzierte Verringerung der Proliferationsrate abzuschwächen.
  • Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung das unmittelbar zuvor erwähnte Verfahren, wobei der SSTR5-Agonist D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Proliferationsrate von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms, welches das Inkontaktbringen von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms in vitro mit einem oder mit mehreren SSTR2-Agonisten oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon umfasst.
  • In einem bevorzugten Beispiel für die unmittelbar zuvor erwähnte Ausführungsform ist der SSTR2-Agonist ein für SSTR2 selektiver Agonist. In einem stärker bevorzugten Beispiel weist der SSTR2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR5 auf, der mindestens 2-fach höher ist als derjenige für SSTR2, stärker bevorzugt mindestens 5-fach höher als derjenige für SSTR2, und noch stärker bevorzugt mindestens 10-fach höher als derjenige für SSTR2.
  • In einem weiteren Beispiel für die zuvor genannte Ausführungsform weist der SSTR2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert von weniger als 5 nM auf, vorzugsweise von weniger als 1 nM.
  • In einem weiteren bevorzugten Beispiel für die zuvor genannte Ausführungsform ist der SSTR2-selektive Agonist eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus D-Nal- cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, cyclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe], 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2 und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei "4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl" auf die folgende Struktur verweist:
    Figure 00070001
    und "4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-" auf die folgende Struktur verweist:
    Figure 00070002
  • In einer dritten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines SSTR2-Agonisten oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung des medullären Schilddrüsenkarzinoms.
  • In einem bevorzugten Beispiel für die dritte Ausführungsform ist der SSTR2-Agonist ein SSTR2-selektiver Agonist. In einem stärker bevorzugten Beispiel weist der SSTR2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR5 auf, der mindestens 2-fach höher ist als derjenige für SSTR2, stärker bevorzugt mindestens 5-fach höher als derjenige für SSTR2, und noch stärker bevorzugt mindestens 10-fach höher als derjenige für SSTR2.
  • In einem weiteren bevorzugten Beispiel für die dritte Ausführungsform weist der SSTR2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert von weniger als 5 nM, vorzugsweise von weniger als 1 nM auf.
  • In einem weiteren bevorzugten Beispiel für die dritte Ausführungsform ist der SSTR2-selektive Agonist eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus D-Nal-Cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, cyclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe], 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2 und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei "4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl" und "4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-" wie zuvor erwähnt definiert sind.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass es im Stand der Technik hinreichend bekannt ist, dass die Standard-Therapie mit radioaktivem Iod, z.B. die Verabreichung eines radioaktiven Iodsalzes an ein Patienten, bei der Behandlung des medullären Schilddrüsenkarzinoms nicht anwendbar ist, da parafollikuläre Zellen kein Iod aufnehmen. Somit betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung einer wirksamen Menge eines SSTR2-Agonisten oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, wobei der SSTR2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Tyr(I)-Rest umfasst, wobei das Iodatom dieses Tyr(I)-Rests eine radioaktives Iod-Isotop umfasst, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung des medullären Schilddrüsenkarzinoms. Vorzugsweise umfasst das Iod-Isotop 125I, 127I oder 131I.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung haben die Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms Metastasen außerhalb der Schilddrüse gebildet. In einer weiterer Ausführungsform sind diese Metastasen in der Lymphe, der Lunge, der Leber, dem Gehirn oder im Knochen vorhanden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1: Von SSTR2 in vitro vermittelte, intrazelluläre Calciummobilisierung
  • CHO-K1-Zellen, die das humane SSTR2 exprimierten, wurden wie im Material- und Methodenteil beschrieben geerntet, und anschließend wurden die SS-Analoga (10–7 bis 10–6 M) für die Messung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung zugegeben, welche durch das Verhältnis zwischen der intrazellulären Calciumkonzentration, die nach der Zugabe der SS-Analoga gemessen wurde, und dem Wert, der bei dem Grundspiegel beobachtet wurde, zum Ausdruck gebracht wird. Die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge betrugen 340 bzw. 510 nm. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt.
  • 2: Von SSTR5 in vitro vermittelte, intrazelluläre Calciummobilisierung
  • CHO-K1-Zellen, die das humane SSTR2 exprimierten, wurden wie im Material- und Methodenteil beschrieben geerntet, und anschließend wurden die SS-Analoga (10–7 bis 10–6 M) für die Messung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung zugegeben, welche durch das Verhältnis zwischen der intrazellulären Calciumkonzentration, die nach der Zugabe der SS-Analoga (Verbindung 1, Verbindung 5 und Verbindung 6) gemessen wurde, und dem Wert der bei dem Grundspiegel beobachtet wurde, zum Ausdruck gebracht wird. Die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge betrugen 340 bzw. 510 nm. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt.
  • Die Strukturen der in 2 aufgeführten Verbindungen sind die folgenden:
    Verbindung 1: D-Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 2);
    Verbindung 2: cyclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe] (SEQ ID NO: 3);
    Verbindung 3: 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 4);
    Verbindung 4: 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 5);
    Verbindung 5: D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 1); und
    Verbindung 6: Cpa-Cyclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Nal-NH2 (SEQ ID NO: 6).
  • 3: In vitro-Inhibierung der durch SS stimulierten intrazellulären Calciummobilisierung durch einen SSTR2-Antagonisten
  • CHO-K1-Zellen, die das humane SSTR2 exprimierten, wurden wie im Material- und Methodenteil beschrieben geerntet, und anschließend wurden Verbindung 6 (10–9 bis 10–6 M) und SS (10 nm) für die Messung der Wirkung von Verbindung 6 auf die durch SS (10–8 M) stimulierte intrazelluläre Calciummobilisierung zugegeben, und diese wurde als prozentualer Wert gegenüber SS allein ausgedrückt. Die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge betrugen 340 bzw. 510 nm. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt.
  • 4: Expression von mRNA für Somatostatin-Rezeptoren in TI-Zellen
  • Extrahierte RNA (1 μg/Reaktion) wurde mit Desoxyribonuklease behandelt und einer reversen Transkription unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer verwendet. Proben, die ohne RT-Enzym inkubiert wurden, dienten als Kontrolle. Aliquots der erzeug ten cDNA und die Negativkontrollen wurden einer anschließenden PCR-Amplifikation der SSTRs unterworfen, wobei die in Tabelle 1 gezeigten Primer verwendet wurden. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. Die erwarteten PCR-Produkte von SSTR 1–5 sind in A gezeigt (Bahn M, PCR-Marker; G, PCR-Produkt der GAPDH-Amplifikation).
  • 5: Wirkung von SS-Analoga auf den Einbau von [3H]thy in TI-Zellen
  • Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen für 48 Stunden in einem Kulturmedium inkubiert, das mit SS-Analoga in verschiedenen Konzentrationen supplementiert war (10–9, 10–8, 10–7 und 10–6 M). Die Kontrollvertiefungen wurden mit Vehikellösung behandelt, und der Einbau von [3H]thy wurde als Radioaktivität in TCA-präzipitiertem Material gemessen. Daten von sechs einzelnen Experimenten, die unabhängig voneinander in Vierfachansätzen bewertet wurden, sind als Mittelwerte ± SEM Prozent Inhibierung des Einbaus von [3H]thy versus unbehandelte Kontrollzellen *P<0,05 und **P<0,01 versus Kontrolle ausgedrückt.
  • 6: Wirkung von SS-Analoga auf die Proliferation von TI-Zellen.
  • Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen für 48 Stunden in einem Kulturmedium inkubiert, das mit SS-Analoga in verschiedenen Konzentrationen supplementiert war (10–9, 10–8, 10–7 und 10–6 M). Die Kontrollvertiefungen wurden mit Vehikellösung behandelt. Die Proliferation der TI-Zellen wurde als Absorption bei 490 nM in jeder Vertiefung gemessen. Daten von sechs einzelnen Experimenten wurden unabhängig voneinander bewertet, wobei acht Doppelansätze als Mittelwert ± SEM Prozent Inhibierung der Zellproliferation versus unbehandelte Kon trollzellen *P<0,05 und **P<0,01 versus Kontrolle ausgedrückt sind.
  • 7: Wirkung eines SSTR2-selektiven Antagonisten auf den Einbau von [3H]thy in TI-Zellen und auf die Proliferation von TI-Zellen während der Behandlung mit dem SSTR2-Agonisten
  • Oberes Bild: Die Zellen wurden für 48 Stunden in Platten mit 24 Vertiefungen in einem Kulturmedium inkubiert, das mit 100 nM Verbindung 1 oder Verbindung 2 supplementiert war, mit oder ohne Verbindung 6 (10–7 M). Die Kontrollvertiefungen wurden mit Vehikellösung behandelt. Der Einbau von [3H]thy wurde als Radioaktivität in TCA-präzipitiertem Material gemessen. Daten von sechs einzelnen Experimenten wurden unabhängig voneinander bewertet, wobei vier Doppelansätze als Mittelwert ± SEM Prozent Inhibierung des Einbaus von [3H]thy versus unbehandelte Kontrollzellen *P<0,05 und **P<0,01 versus Kontrolle ausgedrückt sind.
  • Unteres Bild: Die Zellen wurden für 48 Stunden in Platten mit 96 Vertiefungen in einem Kulturmedium inkubiert, das mit 10–7 M Verbindung 1 oder Verbindung 2 supplementiert war, mit oder ohne Verbindung 6 (10 Die Kontrollvertiefungen wurden mit Vehikellösung behandelt. Die Proliferation der TI-Zellen wurde als Absorption bei 490 nM in jeder Vertiefung gemessen. Die Daten von sechs einzelnen Experimenten wurden unabhängig voneinander bewertet, wobei acht Doppelansätze als Mittelwert ± SEM Prozent Inhibierung der Zellproliferation versus unbehandelte Kontrollzellen *P<0,05 und **P<0,01 versus Kontrolle ausgedrückt sind.
  • 8: Wirkung eines SSTR5-selektiven Agonisten auf den Einbau von [3H]thy in TI-Zellen und die Proliferation von TT-Zellen während der Behandlung mit einem SSTR2-selektiven Agonisten
  • Oberes Bild: Die Zellen wurden für 48 Stunden in Platten mit 24 Vertiefungen in einem Kulturmedium inkubiert, das mit Verbindung 2 (10–7 M) ohne oder mit ansteigenden Konzentrationen von Verbindung 5 (10–9, 10–8, 10–7 und 10–6 M), oder mit Verbindung 5 (10–7 M) mit oder ohne abnehmende Konzentrationen von Verbindung 2 (10–6, 10–7, 10–8 und 10–9 M) supplementiert war. Die Kontrollvertiefungen wurden mit Vehikellösung behandelt. Der Einbau von [3H]thy wurde als Radioaktivität in TCA-präzipitiertem Material gemessen. Daten von sechs einzelnen Experimenten wurden unabhängig voneinander bewertet, wobei vier Ansätze als Mittelwert ± SEM Prozent Inhibierung des Einbaus von [3H]thy gegenüber unbehandelten Kontrollzellen *P<0,05 und **P<0,01 versus Kontrolle ausgedrückt sind.
  • Unteres Bild: Die Zellen wurden für 48 Stunden in Platten mit 96 Vertiefungen in einem Kulturmedium inkubiert, das mit Verbindung 2 (10–7 M) ohne oder mit ansteigenden Konzentrationen von Verbindung 5 (10–9 M, 10–8, 10–7 und 10–6 M), oder mit Verbindung 5 (10–7 M) mit oder ohne abnehmende Konzentrationen von Verbindung 2 (10–6 M, 10–7, 10–8 und 10–9 M) supplementiert war. Die Kontrollzellen wurden mit Vehikellösung behandelt, und die Proliferation der TI-Zellen wurde als Absorption bei 490 nM in jeder Vertiefung gemessen. Daten von sechs einzelnen Experimenten wurden unabhängig voneinander bewertet, wobei acht Ansätze als Mittelwert ± SEM Prozent Inhibierung der Zellproliferation gegenüber unbehandelten Kontrollzellen *P<0,05 und **P<0,01 versus Kontrolle ausgedrückt sind.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es wird angenommen, dass ein Fachmann basierende auf der vorliegenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollem Umfang anwenden kann. Die nachfolgenden spezifischen Ausführungsformen sind somit lediglich als Veranschaulichung zu ver stehen, und sie sind für den Rest der Offenbarung nicht einschränkend, wobei dieser lediglich durch den Umfang der anhängenden Ansprüche beschränkt ist.
  • Soweit nicht anderweitig definiert haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die vorliegend verwendet werden, dieselbe Bedeutung, die ihnen von einem Fachmann, an den sich die Erfindung richtet, zugemessen werden.
  • Verschiedene Somatostatin-Rezeptoren (SSTRs) sind isoliert worden, z.B. SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 und SSTR-5. Somit kann ein Somatostatin-Agonist eines oder mehrere von einem SSTR-1-Agonisten, einem SSTR-2-Agonisten, einem SSTR-3-Agonisten, einem SSTR-4-Agonisten oder einem SSTR-5-Agonisten sein. Mit einem Agonisten für den Somatostatin-Rezeptor vom Typ 2 (d.h. einem SSTR-2-Agonisten) ist eine Verbindung gemeint, die (1) eine hohe Bindungsaffinität für SSTR-2 aufweist (z.B. einen Ki von weniger als 100 nM oder vorzugsweise weniger als 10 oder weniger als 1 nM) (wie z.B. durch den nachfolgend beschriebenen Rezeptor-Bindungsassay definiert), und (2) die Proliferationsrate von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms verringert (wie z.B. durch den nachfolgend beschriebenen biologischen Assay gezeigt). Mit einem für den Somatostatin-Rezeptor vom Typ 2 selektiven Agonisten ist ein Agonist des Somatostatin-Rezeptors vom Typ 2 gemeint, der eine höhere Bindungsaffinität (d.h. einen geringeren Ki) für SSTR-2 aufweist als für SSTR-5. Mit einem Agonisten für den Somatostatin-Rezeptor vom Typ 5 ist ein Somatostatin-Agonist gemeint, der (1) eine hohe Bindungsaffinität für SSTR-5 aufweist (d.h. einen Ki von weniger als 100 nM oder vorzugsweise weniger als 10 nm oder weniger als 1 nM) (wie z.B. durch den nachfolgend beschriebenen Rezeptor-Bindungsassay definiert), und (2) welche die durch den SSTR-2-Agonisten induzierte Verringerung der Proliferationsrate von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms verringert (wie z.B. durch den nachfolgend beschriebe nen Assay gezeigt). Mit einem für den Somatostatin-Rezeptor vom Typ 5 selektiven Agonisten ist ein Agonist für den Somatostatin-Rezeptor vom Typ 5 gemeint, der eine höhere Bindungsaffinität (d.h. einen geringeren Ki) für SSTR-5 als für SSTR-2 aufweist.
  • In einer Ausführungsform ist der SSTR-2-Agonist auch ein SSTR-2-selektiver Agonist. In einer weiteren Ausführungsform weist der SSTR-2-selektive Agonist einen Ki-Wert für SSTR-5 auf, der mindestens 2-fach (z.B. mindestens 5-fach oder mindestens 10-fach) höher ist als derjenige für den SSTR-2-Rezeptor (wie z.B. durch den nachfolgend beschriebenen Rezeptor-Bindungsassay definiert).
  • Beispiele für SSTR-2-Agonisten, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind:
    D-Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, (Verbindung 1),
    cyclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe], (Verbindung 2),
    4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2, (Verbindung 3), und
    4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-D-Phecyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2, (Verbindung 4).
  • Ein Beispiel für einen SSTR-5-Agonisten, der bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist:
    D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2, (Verbindung 5).
  • Weitere Beispiele für Somatostatin-Agonisten sind diejenigen, die durch Formeln abgedeckt sind oder die spezifisch in den nachfolgend genannten Veröffentlichungen aufgeführt sind.
  • Es ist anzumerken, dass für alle vorliegend beschriebenen Somatostatin-Agonisten jeder Aminosäurerest die Struktur -NH-C(R)H-CO- aufweist, in der R die Seitenkette (z.B. CH3 für Ala) ist. Linien zwischen Aminosäureresten stellen Peptidbindungen dar, welche die Aminosäuren verbinden. Sofern der Aminosäurerest optisch aktiv ist, ist die L-Form-Konfiguration gemeint, sofern nicht die D-Form ausdrücklich genannt wird. Aus Gründen der Klarheit sind Disulfid-Bindungen (z.B. Disulfid-Brücken), die zwischen zwei frei Thiolen von Cys-Resten vorkommen, nicht gezeigt. Abkürzungen der üblichen Aminosäuren erfolgen in Einklang mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB.
  • Synthese von Somatostatin-Agonisten
  • Die Verfahren zur Synthese von Somatostatin-Agonisten sind hinreichend dokumentiert und liegen im Bereich des durchschnittlichen Könnens des Fachmanns.
  • Die Synthese von kurzen Aminosäuresequenzen ist hinreichend im Bereich der Peptidchemie etabliert. Beispielsweise kann die Synthese des oben beschriebenen H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 erreicht werden, indem man dem Protokoll aus Beispiel I der Europäischen Patentanmeldung 0 395 417 A1 folgt. Die Synthese von Somatostatin-Agonisten mit einem substituierten N-Terminus kann beispielsweise erreicht werden, indem man dem Protokoll aus der WO 88/02756 , der Europäischen Patent-Anmeldungs-Nr. 0 329 295 und PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 94/04752 folgt.
  • Einige der erfindungsgemäßen Verbindungen können mindestens ein asymmetrisches Zentrum aufweisen. Zusätzliche asymmetrische Zentren können auf dem Molekül vorhanden sein, abhängig von der Art der verschiedenen Substituenten auf dem Molekül. Jedes asymmetrische Zentrum wird zwei optische Isomere erzeugen, und es ist beabsichtigt, dass alle diese optischen Isomere, als gereinigte, reine oder partiell aufgereinigte optische Isomere, racemische Gemische oder diastereomere Mischungen derselben vom Umfang der Erfindung umfasst sind.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können im Allgemeinen in Form ihrer pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze isoliert werden, wie beispielsweise die Salze, die sich von der Verwendung anorganischer und organischer Säuren ableiten. Beispiele für solche Säuren sind Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, D-Weinsäure, L-Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure und Ähnliche. Darüber hinaus können bestimmte Verbindungen, die eine Säurefunktion umfassen, wie beispielsweise eine Carboxygruppe, in Form ihres anorganischen Salzes isoliert werden, in dem das Gegen-Ion ausgewählt sein kann aus Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium und Ähnlichen, sowie auch aus organischen Basen.
  • Das pharmazeutisch akzeptable Salz kann gebildet werden, indem man 1 Äquivalent eines SSTR-2-Agonisten, z.B. Verbindung 1, nimmt und dieses mit etwa 1 äquivalent oder mehr einer geeigneten korrespondierenden Säure des erwünschten Salzes in Kontakt bringt. Die Bearbeitung und Isolierung des resultierenden Salzes ist dem Fachmann hinreichend bekannt.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch orale, parenterale (z.B. intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder subkutane Injektion oder durch ein Implantat), nasale, vaginale, rektale, sublinguale oder topische Verabreichungsart verabreicht werden, und sie können mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern formuliert sein, um Dosierungsformen bereitzustellen, die für jede Verabreichungsart geeignet sind. Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff mindestens einen SSTR-2-Agonisten in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
  • Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Puder und Granulat. In solchen festen Dosierungsformen ist der Wirkstoff mit mindestens einem inerten pharmazeutisch akzeptablen Träger, wie beispielsweise Sucrose, Laktose oder Stärke vermischt. Solche Dosierungsformen können gemäß üblicher Praxis zusätzliche Substanzen umfassen, bei denen es sich nicht um solche inerten Verdünnungsmittel handelt, z.B. Gleitmittel, wie beispielsweise Magnesiumstearat. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit Magensaft-resistenten Beschichtungen (enteric coatings) hergestellt werden.
  • Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung umfassen pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, welche im Stand der Technik üblich sind, wie beispielsweise Wasser. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen ferner Hilfsstoffe, wie beispielsweise Befeuchtungsmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel sowie Süßstoffe, Aromastoffe und Duftstoffe umfassen.
  • Erfindungsgemäße Zubereitungen für die parenterale Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel oder Vehikel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie beispielsweise Olivenöl oder Maisöl, Gelatine und injizierbare organische Ester, wie beispielsweise Ethyloleat. Solche Dosierungsformen können ferner Hilfsstoffe, wie beispielsweise Konservierungsstoffe, Befeuchtungsmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel umfassen. Sie können sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration mittels eines Filters, der Bakterien zurückhält, durch Einbringen von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzungen, durch Bestrahlung der Zusammensetzungen oder durch Erhitzen der Zusammensetzungen. Sie können darüber hinaus in Form von sterilen festen Zusammensetzungen hergestellt werden, die unmittelbar vor ihrer Verwendung in sterilem Wasser oder in einem anderen sterilen injizierbaren Medium gelöst werden können.
  • Zusammensetzungen für die rektale oder vaginale Verabreichungen sind vorzugsweise Zäpfchen, die neben dem Wirkstoff Hilfsstoffe, wie beispielsweise Kakaobutter oder ein Zäpfchenwachs umfassen können.
  • Zusammensetzungen für die nasale oder sublinguale Verabreichungen werden ebenfalls mit Standardhilfsmitteln, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt.
  • Im Allgemeinen kann eine wirksame Dosis eines aktiven Bestandteils der erfindungsgemäßen Zusammensetzung variiert werden; es ist jedoch notwendig, dass die Menge des aktiven Bestandteils so gewählt wird, dass eine geeignete Dosierungsform erhalten wird. Die ausgewählte Dosierung hängt von dem gewünschten therapeutischen Effekt, dem Weg der Verabreichung und der Dauer der Behandlung ab, wobei diese Faktoren dem Fachmann bekannt sind. Üblicherweise werden Dosierungsbereiche von zwischen 0,0001 bis 100 mg/kg Körpergewicht täglich an Menschen und andere Tiere, z.B. Säugetiere, verabreicht.
  • Ein bevorzugter Dosierungsbereich ist 0,01 bis 10,0 mg/kg Körpergewicht/Tag, wobei dieser als Einzeldosis oder geteilt in mehrere Dosen verabreicht werden kann.
  • MATERIAL UND METHODEN
  • Es wurde eine RT-PCR-Analyse verwendet, um zu zeigen, dass mRNA von allen fünf SSTR-Subtypen in einer humane MTC-Zelllinie (TT) exprimiert werden. Die Fähigkeit von SSTR-Analoga mit unterschiedlicher Affinität und Spezifität für die Subtypen SSTR2 und 5, die Proliferationsaktivität von TT-Zellen zu beeinflussen, kann festgestellt werden, indem man den Einbau von [3H]thy, der als indirektes Maß für die Aktivität der DNA-Synthese angesehen wird, und die Anzahl der lebensfähigen Zellen betrachtet.
  • Alle von SSTR2 bevorzugten Agonisten waren in der Lage, die Anzahl an TI-Zellen bei Konzentrationen im Bereich von 10–9 M bis 10–6 M zu supprimieren. Verbindung 3 und Verbindung 4 verringerten signifikant (p < 0,05) den Einbau von [3H]thy bei 10–9 M, jedoch nicht bei 10–8 M und 10–7 M, als ihre maximale inhibitorische Wirkung auf die Zellzahl sichtbar war. Jede untersuchte SSTR2-Verbindung zeigte bei ansteigenden Konzentra tionen einen Trend zu einer verringerten Wirksamkeit, wobei jedoch glockenförmige Response-Kurven für SS üblich sind. Die Inhibierung des Einbaus von [3H]thy und der TT-Zellzahl durch Verbindung 1 und Verbindung 2 bei 10–7 M war nicht mit einer zytotoxischen Wirkung assoziiert, wie durch Trypanblau-Färbung gezeigt wurde. Darüber hinaus wurde dieser Wirkung vollständig entgegengewirkt, indem man die TI-Zellen gleichzeitig mit Verbindung 6 behandelte, einem selektiven SSTR2-Antagonisten. In der Gesamtschau zeigen diese Ergebnisse das SS-Analoga mit bevorzugter Selektivität für SSTR-2 die Proliferation von TI-Zellen durch spezifische Interaktion mit SSTR2 inhibieren.
  • Kultivierung der TT-Zelllinie
  • Die TT-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erhalten. Die TT-Zelllinie besteht aus aneuploid transformierten, CT-produzuierenden parafollikulären Zellen, die durch das Vorhandensein einer Mutation von TGC zu TGG (Cys zu Trp) in Exon 11, Codon 634 im RET-Protoonkogen gekennzeichnet sind (Cooley LD, et al., 1995 Cancer Genet Cytogenet 80: 138–149), eine Eigenschaft, die wir in der Zelllinie, mit der wir gearbeitet haben, bestätigt haben. Ferner zeigen TI-Zellen eine beeinträchtigte Expression des Tumorsuppressor-Gens p53 (Velasco JA, et al., 1997 Int J Cancer 73: 449–455). Immunhistochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die TI-Zellen CT und den CT-Rezeptor (Frendo JL, et al., 1994 FERS Lett. 342: 214–216), karzinoembryonisches Antigen (CER), SS, Neurotensin, Gastrin-freisetzendes Peptid (GRP), Leu-Enkephalin und Met-Enkephalin, Parathyroidhormon-freisetzendes Peptid (PTHrp), Chromogranin A, SP-I, Synaptophysin, Neuron-spezifische Enolase (NSE), 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Rezeptor, Thyrosinhydroxylase, α-Tubulin und Cytocheratin (Zabel M, et al., 1995 Histochemical J. 27: 859–868) exprimieren. TI-Zellen scheiden eine signifikante Menge von CT aus und reagieren auf Veränderungen der Mengen an ionisiertem Calcium (Zabel M, et al., 1992 Histochemistry 102: 323–327).
  • Somit ist die TT-Zelllinie für Untersuchungen in Bezug auf die parafollikuläre Funktion und in Bezug auf Antworten auf endokrine und pharmakologische Stimuli geeignet.
  • Die Zellen wurden in Nährstoffmischung F12 nach Ham mit Glutamin (EuroClone Ltd, Torquay, UK) gehalten, die mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS, Life Technologies, Mailand, Italien), 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Amphotericin (EuroClone Ltd, Torquay, UK) supplementiert war, bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luft.
  • Isolation von RNA
  • Die Gesamt-RNA wurde aus subkonfluenten TI-Zellen unter Verwendung von TRIZOL (Life Technologies, Mailand, Italien) extrahiert. The TRIZOL-Protokoll ist eine Modifikation der Guanidinium/Phenolextraktion. Das kultivierte Zellmedium wurde abgesaugt, und die Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen. Das TRIZOL-Reagenz wurde zugegeben, und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten lysiert. Der Mischung aus TRIZOL/Zelllysat wurde Chloroform zugesetzt, und sie wurde für 2–3 Minuten stehen gelassen, und anschließend für 15 Minuten bei 12000 × g zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde aus der zentrifugierten Mischung entfernt. Es wurde Isopropanol zugesetzt, um die RNA zu präzipitieren, das Pellet wurde gesammelt, mit 75 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Gesamt-RNA wurde in Wasser resuspendiert, das mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt worden war, und unter Verwendung von UV-Spektrophotometrie bei 260 nM quantifiziert. Um DNA-Kontamination zu verhindern, wurde die RNA mit ribonukleasefreier Desoxyribonuklease (Promega, Mailand, Italien) behandelt.
  • RT-PCR
  • Unter Verwendung eines Kits zur Synthese von komplementärer Erststrang-DNA (cDNA) (Superscript Preamplification System für die Synthese von Erststrang-cDNA, Life Technologies, Mailand, Italien) wurde 1 μg Gesamt-RNA nach dem Protokoll des Herstellers revers transkribiert. Die RT-Mischung in den PCR-Gefäßen wurde mit 50 μl leichtem, weißem Mineralöl überschichtet (Sigma-Aldrich Corp., Mailand, Italien); die RT wurde im Minicycler (MJ Research Inc., Watertown, MA, USA) durchgeführt, wobei ein Programm mit den folgenden Parametern verwendet wurde: 10 min bei 70°C, 1 min bei 4°C, 5 min bei 4°C. Nach Supplementierung mit SuperScript II wurde die Reaktion bei 42°C für 50 min und anschließend bei 70°C für 15 min vervollständigt. Die Proben wurden bei 37°C für 20 min mit RNAse H verdaut (Promega, Mailand, Italien), und anschließend bei –20°C bis zur ersten PCR gelagert.
  • Die cDNA (1 μl der RT-Reaktion) wurde anschließend durch PCR mit 1 U Taq-DNA-Polymerase (Life Technologies, Mailand, Italien) in einer 50 ml-Reaktionsmischung amplifiziert, wobei die vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen verwendet wurden. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95°C für 5 min wurde die PCR-Reaktionen unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Oligonukleotidprimer und Bedingungen durchgeführt, wobei die Größe der erwarteten Fragmente dort beschrieben ist. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel analysiert und durch Ethidiumbromid (ETB)-Färbung sichtbar gemacht. Um sicherzustellen, dass keine Kontamination während des Verlaufs des RT-PCR-Vorgangs aufgetreten ist, wurden zwei Arten von Negativkontrollen hergestellt. Die erste Negativkontrolle wurde hergestellt, indem keine Gesamt-RNA in die RT eingesetzt wurde. Die zweite Negativkontrolle wurde hergestellt, indem die cDNA-Mischung in der PCR-Reaktion durch Wasser ersetzt wurde. Die PCR wurde als nützlich angesehen, wenn auf einem 2%igen Agarosegel keine Bande in den Bahnen für die Negativkontrolle beobachtet wurde. Jedes PCR-Produkt wurde einem Restriktionsenzymverdau unterworfen und auf einem 2%igen Agarosegel ana lysiert, um die korrekte Identifizierung der Amplicons zu bestätigen.
  • SSTR-selektive Agonisten und Antagonisten
  • SS-Analoga, die im Rahmen der vorliegenden Untersuchung verwendet wurden, sowie ihre jeweiligen Affinitäten für die verschiedenen SSTRs sind in Tabelle 2 aufgeführt. Jede Verbindung (bereitgestellt von Biomeasure Incorporated, Milford, MA, USA) wurde in 0,01 N Essigsäure resuspendiert, die 0,1 bovines Serumalbumin (BSA) enthielt, um eine einheitliche Löslichkeit sicherzustellen und, um eine nicht-spezifische Bindung an die verschiedenen Oberflächen der Zubereitungen zu verhindern. Die Spezifität und Selektivität der Analoga wurde durch Radioliganden-Bindungsassay mit CHO-K1-Zellen durchgeführt, die stabil mit jedem der SSTR-Subtypen wie nachfolgend dargestellt transfiziert wurde.
  • Die vollständigen kodierenden Sequenzen von genomischen Fragmenten der Gene für SSTR 1, 2, 3 und 4 sowie ein cDNA-Klon für SSTR 5 wurden in den Säugetier-Expressionsvektor pCMV (Life Technologies, Mailand, Italien) subkloniert. Klonale Zelllinien, die stabil die SSTRs 1 bis 5 exprimierten, wurden durch Transfektion in CHO-K1-Zellen (ATCC, Manassas, Va, USA) unter Verwendung der Calciumphosphat-Co-Präzipitationsmethode erhalten (Davis L, et al., 1994 in: Basic methods in Molecular Biology, 2. Auflage, Appleton & Lange, Norwalk, CT, USA: 611–646). Das Plasmid pRSV-neo (ATCC) wurde als Selektionsmarker eingeschlossen. Klonale Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medien, die 0,5 mg/ml G418 (Life Technologies, Mailand, Italien) enthielten, selektiert, ringkloniert und in Kultur expandiert.
  • Membranen für in vitro-Assays in Bezug auf die Rezeptorbindung wurden durch Homogenisieren der CHO-K1-Zellen, welche die SSTR-Subtypen exprimierten, in eiskaltem 50 mM Tris-HCl und zweimaligem Zentrifugieren bei 39000 g (10 min) mit einer zwi schenzeitlichen Resuspension in frischem Puffer erhalten. Die endgültigen Pellets wurden für den Assay in 10 mM Tris-HCl resuspendiert. Für die Assays mit SSTR 1, 3, 4 und 5 wurden Aliquots der Membranenpräparationen 90 min bei 25°C mit 0,05 nM [125I-Tyr11]SS-14 in 50 mM HEPES (pH 7,4), enthaltend 10 mg/ml BSA, 5 mM MgCl2, 200 KIU/ml Trasylol, 0,02 mg/ml Bacitracin und 0,02 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, inkubiert. Das endgültige Assay-Volumen betrug 0,3 ml. Für den SSTR-2-Assay wurden 0,05 nM [125I]MK-678 als Radioligand verwendet, und die Inkubationszeit betrug 90 min bei 25°C. Die Inkubationen wurden durch schnelle Filtration durch GF/C-Filter (zuvor in 0,3 Polyethylenimin getränkt) unter Verwendung eines Brandel-Filtrationssammlers abgestoppt. Jedes Reaktionsgefäß und jeder Filter wurden anschließend 3-mal mit 5 ml-Aliquots eiskaltem Puffer gewaschen. Die spezifische Bindung wurde definiert als gesamt gebundener Radioligand minus demjenigen, dar in Gegenwart von 1000 nM SS-14 für SSTR 1, 3, 4 und 5 oder 1000 nM MK-678 für SSTR2 gebunden hat.
  • Bewertung der biologischen Aktivität
  • Die biologische Aktivität von SSTR-selektiven Agonisten und Antagonisten wurde durch den Calciummobilisierungs-Assay in CHO-K1-Zellen, welche humanes SSTR2 oder SSTR5 exprimierten, beurteilt. Die Zellen wurden durch Inkubieren in 0,3 EDTA/Phosphat-gepufferte Salzlösung (25°C) geerntet und zweimal durch Zentrifugieren gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden für die Beladung des fluoreszenten Ca2+-Indikators Fura-2AM in Hank's-gepufferter Salzlösung (HBSS) resuspendiert. Die Zellsuspensionen (ungefähr 106-Zellen/ml) wurden mit 2 mM Fura-2AM für 30 min bei 25°C inkubiert. Unbeladenes Fura-2AM wurde durch zweifaches Zentrifugieren in HBBS entfernt, und die endgültigen Suspensionen wurden in ein Spektrofluorometer (Hitachi F-2000) überführt, das mit einem magnetischen Rührermechanismus und einem temperaturregulierten Küvettenhalter ausgestattet war. Nach Äquilibrieren auf 37°C wurden die SS- Analoga für die Messung der intrazellulärem Ca2+-Mobilisierung zugefügt. Die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge betrugen 340 nm bzw. 510 nm. In den SSTR2-exprimierenden Zellen (1) stimulierten die Verbindung 2 und die Verbindung 1 signifikant die intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung (wie durch das Verhältnis zwischen stimuliertem und basalem Wert gezeigt wird), wobei die Verbindung 6 diese Wirkung bei den untersuchten Konzentrationen nicht zeigte. Darüber hinaus waren die Verbindung 4 und die Verbindung 3 ferner im hohen Maße bei der Stimulierung der Ca2+-Mobilisierung wirksam. In den SSTR5-exprimierenden Zellen (2) stimulierten die Verbindung 5 und die Verbindung 1 eine signifikante intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung, wohingegen die Verbindung 6 eine leichte Agonistenaktivität im Bereich von 300 bis 1000 nM zeigte. In den SSTR2-exprimierenden Zellen (3) inhibierte die Verbindung 6 die von SS induzierte intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung in SSTR2-exprimierenden Zellen in Dosis-abhängiger Weise, wobei eine vollständige Suppression der SS-Wirkung bei etwa 10–7 M auftrat. Somit zeigte die Beurteilung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung, dass die biologische Aktivität von jedem der verschiedenen Analoga in Übereinstimmung mit seinem Rezeptor-Bindungsprofil war.
  • DNA-Synthese
  • Die Wirkungen der SSTR-selektiven Agonisten und Antagonisten auf die DNA-Synthese in TI-Zellen wurde wie zuvor beschrieben durch Bestimmung der Einbaurate von [3H]Thymidin ([3H]thy) durchgeführt (Davis L, et al., 1994 in: Basic methods in Molecular Biology, 2. Auflage, Appleton & Lange, Norwalk, CT, USA: 611–646, degli Uberti EC, et al., 1991 J Clin Endocrinol Metab 72: 1364–1371). Die TI-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert (105 Zellen/Vertiefung) und für 48 Stunden in einem Medium inkubiert, das mit 10 FBS in Gegenwart von [3H]thy (1,5 μCi/ml; 87 Ci/mmol) supplementiert war, mit oder ohne jedem der SS-Analoge bei Konzentrationen, die von 10–6 bis 10–9 M reichten. Die Behandlungen wurden durch Zugabe von frischen Analoga in den Vertiefungen nach 24 Stunden Inkubation erneuert, wobei das Medium nicht entfernt wurde.
  • Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und zweimal mit 10 % eiskalter Trichloressigsäure (TCA). TCA-präzipitiertes Material wurde in 500 μl 0,2 mol/l Natriumhydroxid und 0,1 % SDS solubilisiert. Die mit den Zellen assoziierte Radioaktivität wurde anschließend in einem Szintillationsspektrometer gezählt. Die Ergebnisse (Zählereignisse pro Minute pro Vertiefung) wurden erhalten, indem der Mittelwert aus mindestens 6 Versuchen in Vierfachansätzen bestimmt wurde. Die Lebensfähigkeit der TI-Zellen in der Kontrolle und in den behandelten Kulturen wurde durch Trypanblau-Färbung sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden beurteilt, und die Anzahl der lebensfähigen Zellen betrug immer 85–95 %.
  • Zellproliferation
  • Die Wirkungen der SSTR-selektiven Agonisten und Antagonisten auf die Proliferation von TI-Zellen wurde durch den nicht-radioaktiven Flüssig-Zellproliferationsassay CELLTITER 96 (Promega, Mailand, Italien) bestimmt, einem colorimetrischen Verfahren für die Bestimmung der Anzahl von lebensfähigen Zellen in Proliferationsassays. Der Assay enthält Lösungen einer Tetrazoliumverbindung (Owen-Reagenz; MTS) und ein Elektronenkopplungsreagenz (Phenazinmethosulfat; PMS). MTS wird durch die Zellen in Formazan bioreduziert, welches in Gewebekulturmedium löslich ist. Die Absorption von Formazan bei 490 nm kann direkt aus Assayplatten mit 96 Vertiefungen gemessen werden (Zatelli MC, et al., 2000 J Clin Endocrinol Metab 85: 847–852; Cory AH, et al., 1991 Cancer Commun 3: 207–212). Die Umwandlung von MTS in das wasserlösliche Formazan wird durch Dehydrogenase-Enzyme erreicht, die in metabolisch aktiven Zellen vorhanden sind. Das Menge an Formazan-Produkt, wie es durch das Ausmaß der Absorption bei 490 nm bestimmt wird, ist direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen in der Kultur. Die TI-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert (2 × 104 Zellen/Vertiefung) und für 48 Stunden in einem mit 10 % SDS supplementierten Medium inkubiert, in Gegenwart oder in Abwesenheit eines jeden SS-Analogs, bei Konzentrationen, die von 10–6 bis 10–9 M reichten. Die Behandlungen wurden nach 24 Stunden Inkubation durch Zugabe von frischem Analoga in die Vertiefungen erneuert. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden 20 μl einer kombinierten MTS/PMS-Lösung mit einer Mehrwegpipette in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden für weitere 4 Stunden bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5 % CO2 inkubiert. Die Absorption bei 490 nm wurde anschließend unter Verwendung einer Vorrichtung zum Auslesen von ELISA-Platten (EASIA-Lesegerät, Medgenix, Camarillo, CA) aufgezeichnet. Die Ergebnisse (Absorption bei 490 nm) wurden erhalten, indem der Mittelwert aus mindestens 6 Versuchen in Achtfachansätzen bestimmt wurde.
  • ERGEBNISSE
  • SSTR-Expression in der humanen MTC-Zelllinie TT Um die jeweilige Rolle der Subtypen SSTR2 und SSTR5 bei der Kontrolle der Proliferation von parafollikulären C-Zellen zu verstehen, haben wir untersucht, ob TI-Zellen SSTRs exprimieren, die eine potentielle Antwort auf selektive Verbindungen für individuelle SSTR-Subtypen vermitteln könnten. Um dieser Frage nachzugehen, haben wir Gesamt-RNA aus kultivierten TI-Zellen isoliert und RT-PCR-Reaktionen unter den im Material- und Methodenteil beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die Integrität der cDNA wurde durch das Vorhandensein des GAPDH-Signals sichergestellt. Die Abwesenheit von Kontaminationen aus genomischer DNA in der cDNA-Probe wurde durch Fehlen jeglicher Amplifikation in einer PCR-Reaktion unter Ver wendung von nicht revers transkribierten Proben beurteilt. Eine positive Amplifikation von SSTR1, 2, 3, 4 und 5 wurde in der untersuchten Zelllinie gefunden (4), was zeigt, dass diese Rezeptoren in der humanen MTC-Zelllinie TT exprimiert werden. Der Nachweis, dass die TT-Zelllinie SSTR-Subtypen stabil exprimiert, macht dieses zelluläre Modellsystem für die Beurteilung der Wirkung von Rezeptor-selektiven SS-Analoga geeignet.
  • Wirkung von selektiven SS-Analoga auf den Einbau von [3H]thy in TI-Zellen
  • Die Werte für den Einbau von [3H]thy, die mit den von SSTR2 bevorzugten Agonisten (Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 und Verbindung 4), mit dem von SSTR5 bevorzugten Agonisten (Verbindung 5) und mit dem von SSTR2 bevorzugten Antagonisten (Verbindung 6) in Konzentrationen von 10–9 bis 10–6 M erreicht wurden, sind in 5 gezeigt. Wie dargestellt unterdrückt Verbindung 2 signifikant den Einbau von [3H]thy um 58-23 % bei Konzentrationen im Bereich von 10–9 bis 10–7 M. Verbindung 1 unterdrückt signifikant den Einbau von [3H]thy um 41-21 % bei Konzentrationen im Bereich von 10–9 bis 10–6 M. Der Einbau von [3H]thy wurde auch signifikant durch Verbindung 4 (–13 %, p<0,05) und Verbindung 3 (–17 p<0,05) bei 10–9 M verringert. Im Gegensatz dazu erhöhte Verbindung 5 signifikant den Einbau von [3H]thy in TT Zellen um 80–175 %. Der für SSTR2-selektive Antagonist, Verbindung 6, veränderte den Einbau von [3H]thy in TI-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen nicht.
  • Wirkung von selektiven SS-Analoga auf die Proliferation von TI-Zellen
  • Um die Aktivität von SS-Analoga auf das Wachstum von TI-Zellen näher zu untersuchen, wurde auch ihre Wirkung auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen untersucht. Die Wirkungen von Agonisten, die von SSTR2 bevorzugt werden, einem von SSTR5 bevorzugten Agonisten und einem von SSTR2 bevorzugten Antagonisten auf die Anzahl von lebensfähigen TI-Zellen bei Konzentrationen im Bereich von 10–9 bis 10–6 M sind in 6 dargestellt. Wie gezeigt inhibierten alle Verbindungen, die von SSTR2 bevorzugt werden, bei jeder der untersuchten Konzentrationen die Zellproliferation signifikant im Vergleich mit unbehandelten Kontrollzellen. Der für SSTR5 selektive Agonist, Verbindung 5, erzeugte eine leichte Erhöhung der Proliferation der TI-Zellen (bis zu 11 % bei 10–8 M), wobei dies jedoch keinen statistischen Unterschied zu den unbehandelten Kontrollzellen darstellte. Der für SSTR2 selektive Antagonist, Verbindung 6, schien das Wachstum von TI-Zellen bei den getesteten Konzentrationen nicht zu beeinflussen.
  • Ein selektiver SSTR2-Antagonist wirkt den Wirkungen eines von SSTR2 bevorzugten Agonisten entgegen
  • Um weiter aufzuklären, ob SSTR2 spezifisch bei der Vermittlung der antiproliferativen Aktivität der von SSTR2 bevorzugten Agonisten beteiligt ist, wurden der Einbau von [3H]thy und das Zellwachstum in TI-Zellen beurteilt, die für 48 Stunden Verbindung 1 und Verbindung 2 ausgesetzt waren, jede entweder allein (bei 10–7 M) oder in Kombination mit Verbindung 6, einem selektiven SSTR2-Antagonisten in äquimolarer Konzentration (10–7 M). Die Inhibierung des Einbaus von [3H]thy, die sowohl von Verbindung 1 als auch von Verbindung 2 induziert wird, wurde durch gleichzeitige Behandlung der TI-Zellen mit Verbindung 6 supprimiert (7, oberes Bild). Die Inhibierung der Proliferation der TI-Zellen, die durch Verbindung 1 induziert wird, wurde durch gleichzeitige Behandlung mit Verbindung 6 signifikant von 46 % auf 10 % verringert. Darüber hinaus schien Verbindung 6 die antiproliferative Aktivität von Verbindung 2 vollständig zu blockieren (7, unteres Bild). Folglich ist die spezifische Beteiligung von SSTR2 bei der Vermittlung der inhibitorischen Wirkung eines SSTR2-Agonisten auf die Proliferation von TI-Zellen eindeutig nachgewiesen.
  • Wirkung der Kombination eines von SSTR2 bevorzugten Agonisten und eines von SSTR5 bevorzugten Agonisten auf den Einbau von [3H]thy und die Zellproliferation
  • Um die Wirkungen eines SSTR2-Agonisten und eines SSTR5-Agonisten in Kombination zu analysieren, wurde der Einbau von [3H]thy und die Proliferation von TI-Zellen untersucht, wobei jede der Verbindungen 2 und 5 bei 10–7 M in Kombination mit ansteigenden Dosen (von 10–9 M bis 10–6 M) der anderen Verbindungen untersucht wurde. Die Ergebnisse sind in 8 zusammengefasst. Ansteigende Konzentrationen des SSTR5-Agonisten (10–9 M bis 10–6 M) verhinderten in Dosis-abhängiger Weise die Unterdrückung des Einbaus von [3H]thy in TI-Zellen (8, oberes Bild) sowie die Proliferation (8, unteres Bild), welche durch den SSTR2-Agonisten erzeugt werden (10–7 M). Diese Daten zeigen einen Antagonismus zwischen den von SSTR5 und SSTR2 vermittelten Wirkungen auf die Proliferation.
    Figure 00330001
    Tabelle 2: Spezifität der humanen Somatostatin-Rezeptor-Subtypen (IC50, nM)
    Rezeptorsubtyp
    Verbindung 1 2 3 4 5
    1 2129 0,75 98 1826 12,7
    2 1000 0,34 412 1000 213,5
    3 5210 0,35 215 7537 11,2
    4 6016 0,19 26,8 3897 9,8
    5 1152 166 1000 1618 2,4
    6 (Antagonist) 2757 6,4 44 423 86,5
  • Die Subtypen-Affinität wurde durch Radioliganden-Membranrezeptor-Bindungsassays in CHO-Zellen bestimmt, die das humane SSR2-Gen oder SSR5-cDNA exprimieren.

Claims (23)

  1. Verfahren zur Modulierung der Proliferationsrate von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms, bei dem man MTC-Zellen in vitro mit einem oder mit mehreren SSTR2-Agonisten und mit einem oder mit mehreren SSTR-5-Agonisten in Kontakt bringt, wobei der SSTR-2-Agonist die Proliferationsrate der MTC-Zellen verringert und der SSTR-5-Agonist die vom SSTR-2-Agonisten induzierte Verringerung der zellulären Proliferationsrate abschwächt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der SSTR-5-Agonist D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon ist.
  3. Verfahren zur Verringerung der Proliferationsrate von Zellen eines medullären Schilddrüsenkarzinoms, bei dem man die Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms in vitro mit einem oder mit mehreren SSTR-2-Agonisten oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon in Kontakt bringt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der SSTR-2-Agonist ein für SSTR-2 selektiver Agonist oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR-5 aufweist, der mindestens 2-fach höher als derjenige für SSTR-2.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR-5 aufweist, der mindestens 5-fach höher ist als derjenige für SSTR-2.
  7. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR-5 aufweist, der mindestens 10-fach höher ist als derjenige für SSTR-2.
  8. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert von weniger als 5 aufweist.
  9. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert von weniger als 1 aufweist.
  10. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der für SSTR-2 selektive Agonist eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus: D-Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; cyclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe]; 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2; und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
  11. Verwendung eines SSTR-2-Agonisten oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salz davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines medullären Schilddrüsenkarzinoms.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist einen für SSTR-2 selektiven Agonisten oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon umfasst.
  13. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR-5 aufweist, der mindestens 2-fach höher ist als derjenige für SSTR-2.
  14. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR-5 aufweist, der mindestens 5-fach höher ist als derjenige für SSTR-2.
  15. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert für SSTR-5 aufweist, der mindestens 10-fach höher ist als derjenige für SSTR-2.
  16. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert von weniger als 5 nM aufweist.
  17. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Ki-Wert von weniger als 1 nM aufweist.
  18. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon eine Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus: D-Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; cyclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe]; 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylacetyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2; und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-2-ethansulfonyl-D-Phe-cyclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
  19. Verwendung nach Anspruch 11, bei der der SSTR-2-Agonist oder das pharmazeutisch akzeptable Salz davon einen Tyr(I)-Rest umfasst, wobei das Iod-Atom des Tyr(I)-Rests ein radioaktives Iod-Isotop umfasst.
  20. Verwendung nach Anspruch 11 oder Anspruch 19, bei der die Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms Metastasen außerhalb der Schilddrüse gebildet haben.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, bei der die Metastasen in der Lymphe, der Lunge, der Leber, dem Gehirn oder im Knochen vorhanden sind.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, bei dem das Iod 125I, 127I oder 131I ist.
  23. Verwendung eines SSTR-2-Agonisten und eines SSTR-5-Agonisten in Kombination bei der Herstellung eines Medikamentes zur Modulierung der Proliferationsrate von Zellen des medullären Schilddrüsenkarzinoms, wobei der SSTR-2-Agonist die Proliferationsrate der MTC-Zellen verringert und der SSTR-5-Agonist die vom SSTR-2-Agonisten induzierte Verringerung der zellulären Proliferationsrate abschwächt.
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