ES2328077T3 - Procedimiento de modulacion de la proliferacion de celulas de carcinoma tiroideo medular. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de la fórmula: Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH2 o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable.
Description
Procedimiento de modulación de la proliferación
de células de carcinoma tiroideo medular.
Se ha demostrado que la somatostatina (SS), un
tetradecapéptido descubierto por Brazeau y col., tiene potentes
efectos inhibidores en diversos procesos secretores en tejidos tales
como pituitaria, páncreas y tracto gastrointestinal. La SS actúa
también como un neuromodulador en el sistema nervioso central. Estos
efectos biológicos de SS, todos de naturaleza inhibidora, están
estimulados a través de una serie de receptores acoplados a la
proteína G, de los cuales se han caracterizado cinco subtipos
diferentes (SSTR1-SSTR5) (Reubi JC, y col., Cancer
Res 47: 551-558, Reisine T, y col., Endocrine Review
16: 427-442, Lamberts SW, y col., Endocr Rev 12:
450-482, 4 Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology
20: 157-198). Estos cinco subtipos tienen afinidades
similares para los ligandos SS endógenos pero tienen una
distribución que difiere en diversos tejidos. La somatostatina se
une a los cinco subtipos diferentes del receptor (SSTR) con afinidad
relativamente alta e igual para cada subtipo.
Existe evidencia de que la SS regula la
proliferación celular deteniendo el crecimiento celular mediante los
subtipos SSTR1, 2, 4, y 5 (Buscail L, y col., 1995 Proc Natl Acad
Sci EE.UU. 92: 1580-1584; Buscail L, y col., 1994
Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91: 2315-2319; Florio T, y
col., 1999 Mol Endocrinol 13: 24-37; Sharma K, y
col., 1999 Mol Endocrinol 13: 82-90), o induciendo
la apoptosis mediante el subtipo SSTR3 (Sharma K, y col., 1996 Mol
Endocrinol 10: 1688-1696). Se ha demostrado que la
SS y diversos análogos inhiben la proliferación normal y neoplásica
in vitro e in vivo (Lamberts SW, y col., Endocr Rev
12: 450-482) mediante receptores SS específicos
(SSTR) (Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology 20:
157-198) y acciones postreceptoras posiblemente
diferentes (Weckbecker G, y col., Pharmacol Ther 60:
245-264; Bell GI, Reisine T 1993 Trends Neurosci 16:
34-38; Patel YC, y col., Biochem Biophys Res Commun
198: 605-612; Law SF, y col., Cell Signal 7:
1-8). Además, existe evidencia de que distintos
subtipos de SSTR se expresan en tejidos humanos normales y
neoplásicos (Virgolini I, y col., Eur J Clin Invest 27:
645-647), confiriendo diferentes afinidades
tisulares respecto de diversos análogos de SS y respuesta clínica
variable para sus efectos terapéuticos.
Se ha asociado la unión a los diferentes tipos
de subtipos del receptor de la somatostatina con el tratamiento de
dolencias y/o enfermedades. Por ejemplo, se ha atribuido la
inhibición de la hormona del crecimiento al receptor de tipo 2 de
la somatostatina ("SSTR2") (Raynor, y col., Molecular
Pharmacol. 43: 838 (1993); Lloyd, y col., Am. J. Physiol. 268: G102
(1995)) mientras que se ha atribuido la inhibición de la insulina al
receptor de tipo 5 de la somatostatina ("SSTR5") (Coy, y col.
197: 366-371 (1993)). Se ha asociado la activación
de los tipos 2 y 5 con la supresión de la hormona del crecimiento y
más concretamente con los adenomas que segregan GH (acromegalia) y
los adenomas que segregan TSH. Se ha asociado la activación del tipo
2 pero no la del tipo 5 con el tratamiento de los adenomas que
segregan prolactina. Otras conjeturas asociadas con la activación
de los subtipos del receptor de la somatostatina incluyen la
inhibición de la insulina y/o glucagón para tratar diabetes
mellitus, angiopatía, retinopatía proliferativa, el fenómeno de alba
y la nefropatía; la inhibición de la secreción de ácido gástrico y
más concretamente las úlceras pépticas, fístula enterocutánea y
pancreaticocutánea, síndrome del intestino irritable, síndrome de
evacuación gástrica rápida, síndrome de la diarrea líquida, diarrea
relacionada con SIDA, diarrea inducida por quimioterapia,
pancreatitis aguda o crónica y tumores gastrointestinales que
segregan hormonas; tratamiento del cáncer tal como hepatoma;
inhibición de la angiogénesis, tratamiento de trastornos
inflamatorios tales como artritis; retinopatía, rechazo crónico al
aloinjerto; angioplastia; evitando el sangrado del injerto de vaso
y gastrointestinal. Se prefiere tener un análogo que sea selectivo
para el subtipo o subtipos específicos del receptor de la
somatostatina responsable(s) de la respuesta biológica
deseada, reduciendo de esta manera la interacción con otros subtipos
del receptor que podría provocar efectos secundarios
indeseables.
La somatostatina (SS) y sus receptores (SSTR1 a
SSTR5) se expresan en células C parafoliculares humanas y células
de carcinoma tiroideo medular (MTC). MTC es un tumor que se origina
a partir de células C parafoliculares tiroideas que producen
calcitonina (CT), somatostatina, así como otros péptidos diversos
(Moreau JP, y col., Metabolism 45 (8 Supl. 1):
24-26). Recientemente, Mato y col. demostraron que
la SS y los SSTR se expresaban en MTC humano (Mato E, y col., J
Clin Endocrinol Metab 83: 2417-2420). Se ha
documentado que la SS y sus análogos inducen una disminución de los
niveles de CT en plasma y una mejora sintomática en pacientes con
MTC. Sin embargo, hasta ahora no se había demostrado claramente la
actividad antiproliferativa de los análogos de la SS sobre las
células tumorales (Mahler C, y col., Clin Endocrinol 33: 261- 9;
Lupoli G, y col., Cancer 78: 1114-8; Smid WM, y
col., Neth J Med 40: 240-243). De esta manera, el
desarrollo y la evaluación de los análogos del subtipo SSTR
selectivos respecto del crecimiento de las células de MTC
proporciona una herramienta útil para aplicación clínica. Hasta
ahora no se ha informado de datos que conciernan a la implicación
específica del subtipo SSTR en la regulación del crecimiento de
células de MTC.
La presente memoria descriptiva se refiere al
descubrimiento de que la línea de células TT de MTC humano, que
muestra características de las células de MTC (Zabel M, y col., 1992
Histochemistry 102: 323-327, 2 Gagel RF, y col.,
1986 Endocrinology 118: 1643-1651, Liu JL, y col.,
1995 Endocrinology 136: 2389-2396)y que
expresa de manera estable todos los subtipos SSTR, responde a la
activación de SSTR2 y SSTR5 mediante agonistas selectivos del
subtipo con dos modelos diferentes en términos de incorporación de
[^{3}H]thy y número de células. Los SSTR2 suprimen
significativamente la incorporación de [^{3}H]thy en las
células TT, es decir, por ejemplo, inhiben la síntesis de ADN y
reducen la proliferación celular. Los agonistas selectivos para
SSTR5 aumentan significativamente la incorporación de
[^{3}H]thy en las células TT, es decir, aumentan la
síntesis de ADN, pero en solitario fracasan en influenciar la
proliferación celular. Además, los antagonistas de SSTR2
contrarrestan la acción de los agonistas con preferencia por SSTR2
en las células TT. Aún más, concentraciones crecientes de un
agonista selectivo de SSTR5 evita de manera dependiente de la dosis
la supresión de la incorporación de [^{3}H]thy en las
células TT y la proliferación producida por un agonista con
preferencia por SSTR2, y viceversa, mostrando un antagonismo entre
dichos agonistas.
Se han demostrado recientemente interacciones
hetero y homodiméricas entre subtipos de familias de receptores
opiáceos (Jordan BA, y col., 1999 Nature 399:
697-700.) y SS (Rocheville M, y col., 2000 J. Biol.
Chem. 275: 7862-7869). Los estudios en células
cultivadas de adenoma de la pituitaria han demostrado que el subtipo
2 y el 5 de SSTR actúan sinérgicamente en la supresión de la
hormona del crecimiento y la secreción de prolactina (Shimon I, y
col., 1997 J. Clinical Invest. 100: 2386-2392,
Jaquet P, y col., 2000 J Clin Endocrinol Metab. 85:
781-792). El hallazgo de que la activación de SSTR5
reduce la actividad antiproliferativa mediada por SSTR2 difiere de
los resultados en otros tejidos (Patel YC, 1999 Front
Neuroendocrinology 20: 157-198, Buscail L, y col.,
1995 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 92: 1580-1584,
Buscail L, y col., 1994 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91:
2315-2319, Sharma K, y col., 1996 Mol Endocrinol 10:
1688-1696). Esta es la primera demostración de que
los subtipos 2 y 5 de SSTR pueden actuar de forma antagonista en la
regulación del crecimiento celular.
De esta manera, los agonistas con preferencia
por SSTR2 y SSTR5 ejercen efectos diferenciales sobre la
proliferación de la línea de células TT tiroideas medulares in
vitro, según su selectividad específica de SSTR. Se puede
reducir la proliferación de la línea de células TT mediante los
agonistas selectivos de SSTR2, pero no mediante los agonistas de
SSTR5, y un agonista de SSTR5 puede evitar los efectos
antiproliferativos mediados por SSTR2. El papel inhibidor clave de
SSTR2 sobre la proliferación de células de MTC demuestra que los
análogos que mejoran la afinidad y selectividad de SSTR2 frente a
SSTR5 serían útiles como agentes antiproliferativos en el
tratamiento del MTC.
En un aspecto, la presente invención se dirige a
un compuesto de fórmula:
Cpa-ciclo(D-Cys-4-PaL-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH_{2},
o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptable.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un compuesto de fórmula
Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH_{2},
o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable
para uso como antagonista del receptor de la somatostatina.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al uso de un compuesto de fórmula
Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaL-NH_{2},
o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable
como antagonista del receptor de la somatostatina.
En una realización, dicho antagonista del
receptor de la somatostatina es un antagonista selectivo de
SSTR2.
Se cosecharon células CHO-K1,
que expresan el SSTR2 humano según se describe en la sección de
Materiales y Procedimientos y a continuación se añadieron los
análogos de SS (10^{-7}-10^{-6} M) para la
medida de la movilización del Ca^{2+} intracelular, expresada en
forma de relación entre la concentración de calcio intracelular
medida tras la adición de los análogos de SS y el valor basal
observado. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de
340 y 510 nm, respectivamente. Los datos se representan como
promedio \pm DEM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cosecharon células CHO-K1,
que expresan el SSTR5 humano según se describe en la sección de
Materiales y Procedimientos y a continuación se añadieron los
análogos de SS (10^{-7}-10^{-6} M) para la
medida de la movilización del Ca^{2+} intracelular, expresada en
forma de relación entre la concentración del calcio intracelular
medida tras la adición de los análogos de SS (Compuesto 1, Compuesto
5 y Compuesto 6) y el valor basal observado. Las longitudes de onda
de excitación y emisión fueron de 340 y 510 nm, respectivamente. Los
datos se representan como promedio \pm DEM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las estructuras de los compuestos que aparecen
en la Figura 2 son como sigue:
Compuesto 1:
D-NaI-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
Compuesto 2:
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
Compuesto 3:
4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
Compuesto 4:
4-(2-Hidroxiethil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-
{}\hskip0.4cm NH_{2};
{}\hskip0.4cm NH_{2};
Compuesto 5:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2};
y
Compuesto 6:
Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Se cosecharon células CHO-K1,
que expresan el SSTR2 según se describe en la sección de Materiales
y Procedimientos, y a continuación se añadieron el compuesto 6
(10^{-9}-10^{-6} M) y SS (10 nM) para la medida
del efecto de la movilización del calcio intracelular estimulada
por el Compuesto 6 sobre SS (10^{-8} M), y se expresó en forma de
porcentaje frente a SS sólo. Las longitudes de onda de excitación y
emisión fueron de 340 y 510 nm, respectivamente. Los datos se
representan como promedio \pm DEM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató el ARN extraído (1 \mug/reacción) con
desoxirribonucleasa y se sometió a transcripción inversa usando
Oligonucleótido(dT) como cebador. Las muestras incubadas sin
enzima RT sirvieron como control. Se sometieron las alícuotas del
ADNc generado y los controles negativos a la amplificación mediante
la PCR subsiguiente de los SSTR, usando los cebadores indicados en
la Tabla 1. Se resolvieron los productos de la PCR en un gel de
agarosa al 2%. Se representan gráficamente en A los productos de la
PCR esperados de SSTR1-5 (banda M, marcador de la
PCR; G, producto de la PCR de la amplificación de GAPDH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron las células en placas de 24
pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo suplementado con
análogos de SS a diversas concentraciones (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7}, y 10^{-6} M). Los pocillos control se trataron con
disolución vehículo y se midió la incorporación de
[^{3}H]thy como radioactividad en el material precipitado
con TCA. Se evaluaron independientemente los datos de seis
experimentos individuales por cuadruplicado y se expresaron como
promedio \pm DEM de porcentaje de inhibición de la incorporación
de [^{3}H]thy frente a las células control no tratadas *P
< 0,05 y **P < 0,01 frente a control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron las células en placas de 96
pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo suplementado con
análogos de SS a diversas concentraciones (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7}, y 10^{-6} M). Los pocillos control se trataron con
disolución vehículo. Se midió la proliferación de células TT como
absorbancia a 490 nm de cada pocillo. Se evaluaron los datos de
seis experimentos individuales independientes con ocho réplicas
expresados como el promedio \pm DEM del porcentaje de inhibición
de la proliferación celular frente a las células control no
tratadas *P < 0,05 y **P < 0,01 frente al control.
\vskip1.000000\baselineskip
Panel superior: Se incubaron las células en
placas de 24 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con 100 nM de Compuesto 1 o Compuesto 2, con o sin el
Compuesto 6 (10^{-7} M), Los pocillos control se trataron con
disolución vehículo. Se midió la incorporación de
[^{3}H]thy como radioactividad en el material precipitado
con TCA. Se evaluaron los datos de seis experimentos individuales
independientemente con cuatro réplicas expresados como el promedio
\pm DEM del porcentaje de inhibición de la incorporación de
[^{3}H]thy frente a las células control no tratadas *P <
0,05 y **P < 0,01 frente al control.
Panel inferior: se incubaron las células en
placas de 96 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con 10^{-7} M de Compuesto 1 o compuesto 2 con o sin
Compuesto 6 (10^{-7} M). Las células control se trataron con
disolución vehículo. Se midió la proliferación de células TT como
absorbancia a 490 nm de cada pocillo. Se evaluaron los datos de
seis experimentos individuales con 0cho réplicas expresados como el
promedio \pm DEM del porcentaje de inhibición de la proliferación
celular frente a las células control no tratadas *P < 0,05 y **P
< 0,01 frente al control,
\vskip1.000000\baselineskip
Panel superior: Se incubaron las células en
placas de 24 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con el Compuesto 2 (10^{-7} M) con o sin
concentraciones crecientes de Compuesto 5 (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7}, y 10^{-6} M), o con el Compuesto 5 (10^{-7} M) con o
sin concentraciones decrecientes de Compuesto 2 (10^{-6},
10^{-7}, 10^{-8}, y 10^{-9} M). Los pocillos control se
trataron con disolución vehículo. Se midió la incorporación de
[^{3}H]thy como radioactividad en material precipitado con
TCA. Se evaluaron los datos de seis experimentos individuales
independientemente con cuatro réplicas expresados como el promedio
\pm DEM del porcentaje de inhibición de la incorporación de
[^{3}H]thy frente a las célula control no tratadas *P <
0,05 y **P < 0,01 frente al control.
Panel inferior: Se incubaron las células en
placas de 96 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementados con el Compuesto 2 (10^{-7} M) sin o con
concentraciones crecientes de Compuesto 5 10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7}, y 10^{-6} M), o con el Compuesto 5 (10^{-7} M) con o
sin concentraciones decrecientes de Compuesto 2 (10^{-6},
10^{-7}, 10^{-8}, y 10^{-9} M). Las células control se
trataron con disolución vehículo y se midió la proliferación de
células TT como absorbancia a 490 nm de cada pocillo. Se evaluaron
los datos de seis experimentos individuales con ocho réplicas
expresados como el promedio \pm DEM del porcentaje de inhibición
de la proliferación celular frente a las células control no tratadas
*P < 0,05 y **P < 0,01 frente al control.
A no ser que se definan de otra manera, todos
los términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona
normalmente experta en la técnica a la cual esta invención
pertenece.
Se han aislado diversos receptores de
somatostatina (los SSTR), por ejemplo, SSTR-1,
SSTR-2, SSTR-3,
SSTR-4, y SSTR-5. De esta manera,
un agonista de la somatostatina puede ser uno o más de un agonista
de SSTR-1, agonista de SSTR-2,
agonista de SSTR-3, agonista de
SSTR-4 o un agonista de SSTR-5. Lo
que se entiende por un agonista del receptor de tipo 2 de la
somatostatina (es decir, agonista de SSTR-2) es un
compuesto que (1) tiene una alta afinidad de unión (por ejemplo, Ki
de menos de 100 nM o preferiblemente de menos de 10 nM o menos de 1
nM) para SSTR-2 (por ejemplo, según se define
mediante el ensayo de unión con el receptor descrito a continuación)
y (2) disminuye la velocidad de proliferación de las células del
carcinoma tiroideo medular (por ejemplo, según se muestra mediante
el ensayo biológico descrito a continuación). Lo que se entiende por
un agonista selectivo del receptor de tipo 2 de la somatostatina es
un agonista del receptor de tipo 2 de la somatostatina que tiene
una afinidad de unión mayor (es decir, Ki menor) para
SSTR-2 que para SSTR-5. Lo que se
entiende por un agonista del receptor de tipo 5 de la somatostatina
es un agonista de la somatostatina que (1) tiene una alta afinidad
de unión (por ejemplo, Ki de menos de 100 nM o preferiblemente menos
de 10 nM o menos de 1 nM) para SSTR-5 (por ejemplo,
según se define mediante el ensayo de unión con el receptor descrito
a continuación y (2) atenúa la disminución inducida por el agonista
de SSTR-2 sobre la velocidad de proliferación de las
células del carcinoma tiroideo medular (por ejemplo, según se
muestra mediante el ensayo biológico descrito a continuación). Lo
que se entiende por un agonista selectivo del receptor de tipo 5 de
la somatostatina es un agonista de tipo 5 de la somatostatina que
tiene una afinidad de unión mayor (es decir, menor Ki) para
SSTR-5 que para SSTR-2.
En una realización, el agonista de
SSTR-2 es también un agonista selectivo de
SSTR-2. En otra realización, el agonista selectivo
de SSTR-2 tiene un valor de Ki para
SSTR-5 que es al menos 2 veces (por ejemplo, al
menos 5 veces o al menos 10 veces) mayor que el que tiene para el
receptor SSTR-2 (por ejemplo, según se define
mediante el ensayo de unión con el receptor descrito a
continuación).
Los ejemplos de agonistas de
SSTR-2 que se pueden usar para llevar a cabo la
presente invención incluyen, pero no se limitan a:
D-NaI-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2},
(Compuesto 1),
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe],
(Compuesto 2),
4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo
(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
(Compuesto 3), y
4-(2-Hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
(Compuesto 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de agonista de SSTR-5
que se puede usar para llevar a cabo la presente invención incluye,
pero no se limita a:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2}.
(Compuesto 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos adicionales de agonistas de la
somatostatina son aquellos cubiertos por las fórmulas o aquellos
enumerados específicamente en las publicaciones que se muestran a
continuación.
Solicitud Europea Nº P5 164 EU (Inventor: G.
Keri);
Van Binst, G. y col. Peptide
Research 5: 8 (1992);
Horvath, A. y col. Resumen,
"Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor
Activity", 22º European Peptide Symposium, 13-19
de septiembre, 1992, Interlaken, Suiza;
Solicitud PCT Nº WO 91/09056 (1991);
Solicitud Europea Nº 0 363 589 A2 (1990);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.904.642
(1990);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.871.717
(1989);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.853.371
(1989);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.725.577
(1988);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.684.620
(1987);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.650.787
(1987);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.603.120
(1986);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.585.755
(1986);
Solicitud Europea Nº 0 203 031 A2 (1986);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.522.813
(1985);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.486.415
(1984);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.485.101
(1984);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.435.385
(1984);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.395.403
(1983);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.369.179
(1983);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.360.516
(1982);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.358.439
(1982);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.328.214
(1982);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.316.890
(1982);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.310.518
(1982);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.291.022
(1981);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.238.481
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.235.886
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.224.199
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.211.693
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.190.648
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.146.612
(1979);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.133.782
(1979);
Patente de los Estados Unidos Nº 5.506.339
(1996);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.261.885
(1981);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.728.638
(1988);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.282.143
(1981);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.215.039
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.209.426
(1980);
Patente de los Estados Unidos Nº 4.190.575
(1980);
Patente Europea Nº 0 389 180 (1990);
Solicitud Europea Nº 0505 680 (1982);
Solicitud Europea Nº 0 083 305 (1982);
Solicitud Europea Nº 0 030 920 (1980);
Solicitud PCT Nº WO 88/05052 (1988);
Solicitud PCT Nº WO 90/12811 (1990);
Solicitud PCT Nº WO 97/01579 (1997);
Solicitud PCT Nº WO 91/18016 (1991);
Solicitud Británica Nº GB 2.095.261 (1981);
y
Solicitud Francesa Nº FR 2.522.655 (1983).
\vskip1.000000\baselineskip
Señalar que para todos los agonistas de la
somatostatina descritos en el presente documento, cada resto de
aminoácido representa la estructura de
-NH-C(R)H-CO-, en la
que R es la cadena secundaria (por ejemplo, CH_{3} para Ala). Las
líneas entre los restos de aminoácidos representan enlaces
peptídicos que unen los aminoácidos. También, cuando el resto de
aminoácido es ópticamente activo, se pretende que sea la
configuración de la forma L a no ser que se designe expresamente la
forma D. Por claridad, no se muestran los enlaces disulfuro (por
ejemplo, el puente disulfuro) que existen entre dos tioles libres de
restos Cys. Las abreviaturas de los aminoácidos comunes son según
las recomendaciones de la IUPAC-IUB.
Los procedimientos para sintetizar agonistas de
la somatostatina están bien documentados y están comprendidos
dentro de la capacidad de una persona normalmente experta en la
técnica.
La síntesis de secuencias cortas de aminoácidos
está bien establecida en la técnica de péptidos. Por ejemplo, la
síntesis de
HD-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
descrita anteriormente se puede conseguir siguiendo el protocolo
que se muestra en el Ejemplo I de la Solicitud de Patente Europea 0
395 417 A1. La síntesis de agonistas de la somatostatina con un
término N sustituido se puede conseguir, por ejemplo, siguiendo el
protocolo que se define en el documento WO 88/02756, la Solicitud
de Patente Europea Nº 0 329 295 y la Publicación PCT Nº WO
94/04752.
Alguno de los compuestos de la presente
invención puede tener al menos un centro asimétrico. Pueden estar
presentes centros asimétricos adicionales en la molécula dependiendo
de la naturaleza de los diversos sustituyentes de la molécula. Cada
uno de dichos centros asimétricos producirá dos isómeros ópticos y
se pretende que todos los mencionados isómeros ópticos, ya sean
isómeros ópticos separados, puros o parcialmente purificados,
mezclas racémicas o mezclas diasterómeras de los mismos, estén
incluidos dentro del alcance de la presente invención.
Se pueden aislar generalmente los compuestos de
la presente invención en forma de sus sales de adición de ácido
farmacéuticamente aceptables, tales como las sales derivadas de usar
ácidos inorgánicos y orgánicos. Los ejemplos de dichos ácidos son
clorhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, fórmico, acético,
trifluoroacético, propiónico, maleico, succínico,
D-tartárico, L-tartárico, malónico,
metanosulfónico y similares. Además, algunos compuestos que
contienen una función ácida tales como carboxilo se pueden aislar en
forma de su sal inorgánica en la que el contraión se puede
seleccionar a partir de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio y
similares, así como de bases orgánicas.
Se pueden formar sales farmacéuticamente
aceptables tomando aproximadamente 1 equivalente de un agonista de
SSTR-2, por ejemplo, el compuesto 1, y poniendo éste
en contacto con aproximadamente 1 equivalente o más del ácido
correspondiente apropiado de la sal que se desea. La preparación y
el aislamiento de la sal resultante son bien conocidas por la
persona normalmente experta en la técnica.
Los compuestos de esta invención se pueden
administrar mediante rutas de administración oral, parenteral (por
ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o
subcutánea, o implante), nasal, vaginal, rectal, sublingual o
tópica y se pueden formular con vehículos farmacéuticamente
aceptables para proporcionar formas de dosificación apropiadas para
cada ruta de administración. Según esto, la presente invención
incluye dentro de su alcance composiciones farmacéuticas que
comprenden, como ingrediente activo, al menos un agonista de
SSTR-2 en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Las formas de dosificación sólidas para la
administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos
y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, el compuesto
activo se premezcla con al menos un vehículo inerte
farmacéuticamente aceptable tal como sacarosa, lactosa, o almidón.
Dichas formas de dosificación pueden comprender también, como es
habitual en la práctica, otras sustancias adicionales diferentes
tales como diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes
tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas,
comprimidos y píldoras, las formas de dosificación pueden
comprender también agentes tamponantes. Se pueden preparar
adicionalmente los comprimidos y las píldoras con recubrimientos
entéricos.
Las formas de dosificación líquidas para la
administración oral incluyen emulsiones, disoluciones, suspensiones,
jarabes farmacéuticamente aceptables, conteniendo los elíxires
diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como
agua. Además de dichos diluyentes inertes, las composiciones pueden
incluir también adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes
emulsionantes y de suspensión, y agentes endulzantes, aromatizantes
y perfumantes.
Las preparaciones según esta invención para la
administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones, o
emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de
disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y
aceite de maíz, gelatina, y ésteres orgánicos inyectables tales
como oleato de etilo. Dichas formas de dosificación pueden contener
también adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes,
emulsionantes, y dispersantes. Se pueden esterilizar mediante, por
ejemplo, filtración a través de un filtro que retiene bacterias,
incorporando agentes esterilizantes en las composiciones,
irradiando las composiciones, o calentando las composiciones. Se
pueden preparar también en forma de composiciones sólidas estériles
que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro medio
inyectable estéril inmediatamente antes del uso.
Las composiciones para la administración rectal
o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener,
además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de
cacao o una cera de supositorio.
Las composiciones para la administración nasal o
sublingual se preparan también con excipientes estándar bien
conocidos de la técnica.
En general, se puede variar una dosificación
efectiva del ingrediente activo en las composiciones de esta
invención; sin embargo, es necesario que la cantidad del ingrediente
activo sea tal que se obtenga una forma de dosificación adecuada.
La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado,
de la ruta de administración, y de la duración del tratamiento,
todo lo cual está dentro de la esfera del conocimiento de una
persona normalmente experta en la técnica. En general, se
administran niveles de dosificación de entre 0,0001 a 100 mg/kg de
peso corporal diario a seres humanos y otros animales, por ejemplo,
mamíferos.
Un intervalo de dosificación preferido es 0,01 a
10,0 mg/kg de peso corporal diariamente, que se puede administrar
como una dosis única o dividida en múltiples dosis.
Se usó el análisis de la RT-PCR
para demostrar que los ARN de los cinco subtipos de SSTR se
expresaban en la línea de células de MTC humano, TT. Se puede
evaluar la capacidad de los análogos de SS con diferentes
afinidades y especificidades respecto de los subtipos de SSTR 2 y 5
para influenciar la actividad proliferativa de las células TT
teniendo en cuenta la incorporación de [^{3}H]thy,
considerada una medida indirecta de la actividad sintética del ADN,
y del número de células viables.
Todos los agonistas preferentes de SSTR2 fueron
capaces de suprimir significativamente el número de células TT a
concentraciones que oscilaban entre 10^{-9} M y 10^{-6} M. El
Compuesto 3 y el Compuesto 4 redujeron significativamente (p <
0,05) la incorporación de [^{3}H]thy a 10^{-9} M pero no
a 10^{-8} M y 10^{-7} M, cuando fue evidente su máximo efecto
inhibidor sobre el número de células. Cada compuesto SSTR2 ensayado
mostró una tendencia a disminuir la eficacia con el aumento de la
concentración, sin embargo, las curvas de respuesta en forma de
campana son comunes para SS. La inhibición de la incorporación de
[^{3}H]thy y del número de células TT por el Compuesto 1 y
el Compuesto 2 a 10^{-7} M no se asoció con ninguna acción
citotóxica, según se demostró por la tinción del Azul Trypan.
Además, este efecto estuvo completamente contrarrestado por el
tratamiento simultáneo de las células TT con el Compuesto 6, un
antagonista selectivo de SSTR2. Tomados en su conjunto, estos
resultados indican que los análogos de SS con selectividad
preferente por SSTR2 inhibieron la proliferación de células TT que
interactuaban específicamente con SSTR2. Cultivo de la línea de
células TT.
Se obtuvo la línea de células TT de la American
Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). La línea de
células TT está constituida por células parafoliculares que producen
CT transformado aneuploide que se caracterizan por la presencia de
una mutación TGC a TGG (Cys a Trp) en el exón 11 del codón 634 en el
protooncogén RET (Cooley LD, y col., 1995 Cancer Genet Cytogenet
80: 138-149), una característica que los inventores
confirmaron en la línea celular con la que trabajaron. Además, las
células TT muestran una expresión desequilibrada del gen p53
supresor del tumor (Velasco JA, y col., 1997 Int J Cancer 73:
449-455). Los estudios de inmunohistoquímica
demostraron que las células TT expresan CT y el receptor de CT
(Frendo JL, y col., 1994 FEBS Lett. 342: 214-216),
el antígeno carcino-embriónico (CEA), SS, la
neurotensina, el péptido que libera la gastrina (GRP), Leu y
Met-encefalina, el péptido que libera la hormona
paratiroidea (PTHrp), la cromogranina A, SP-I, la
sinaptofisina, la enolasa específica de neuronas (NSE), el receptor
de la 1,25-dihidroxivitamina D_{3}, la tiroxina
hidroxilasa, la \alpha-tubulina, y la
citoqueratina (Zabel M, y col., 1995 Histochemical J. 27:
859-868). Las células TT segregan una cantidad
significativa de CT y responden a los cambios en los niveles de
calcio ionizado (Zabel M, y col., 1992 Histochemistry 102:
323-327). De esta manera, la línea de células TT es
adecuada para los estudios sobre la función parafolicular y las
respuestas a los estímulos endocrinos y farmacológicos.
Se mantuvieron las células en Mezcla Nutriente
de Ham F12 con Glutamina (EuroClone Ltd, Torquay, Reino Unido),
suplementada con suero bovino fetal al 10% (FBS, Life Technologies,
Milán, Italia), 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de
estreptomicina, y 100 \mug/ml de anfotericina (EuroClone Ltd,
Torquay, Reino Unido) a 37ºC en una atmósfera humidificada de
CO_{2} al 5% y aire al 95%. Aislamiento del ARN.
Se extrajo el ARN total de las células TT
subconfluentes usando TRIZOL (Life Technologies, Milán, Italia).El
protocolo del TRIZOL es una modificación de la extracción con
guanidinio/fenol. Brevemente, los medios celulares cultivados se
aspiraron y las células se lavaron con PBS 1 X. Se añadió reactivo
TRIZOL y se lisaron las células a temperatura ambiente durante 10
min. Se añadió cloroformo a la mezcla de TRIZOL/lisado celular, y se
dejó reposar durante 2-3 min, y a continuación se
centrifugó a 12000 x g durante 15 min. Se retiró la capa acuosa de
la mezcla centrifugada. Se añadió isopropanol para precipitar el
ARN, se recogió el residuo, se lavó con etanol al 75% y se secó al
aire. Se volvió a suspender el ARN total en agua tratada con
dietilpirocarbonato (DEPC) y se cuantificó usando espectrometría UV
a 260 nm. Para evitar la contaminación del ADN, se trató el ARN con
desoxirribonucleasa libre de ribonucleasa (Promega, Milán,
Italia).
Usando un kit de síntesis del ADN complementario
(ADNc) de primera cadena (Sistema de Preamplificación SuperScript
para la síntesis del ADNc de Primera Cadena, Life Technologies,
Milán, Italia), 1 \mug de ARN total se transcribió de manera
inversa según el protocolo del fabricante. La mezcla RT en tubos de
PCR se cubrió con 50 \mul de aceite mineral ligero blanco
(Sigma-Aldrich Corp. Milán, Italia); Se llevó a cabo
la RT en el Minycicler (MJ Research Inc., Watertown, MA, EE.UU.)
usando un programa con los parámetros siguientes: 10 min a 70ºC, 1
min a 4ºC, 5 min a 4ºC. Tras suplementar con SuperScript II, se
completó la reacción a 42ºC durante 50 min y a continuación a 70º
durante 15 min. Las se digirieron muestras con RNasa H (Promega,
Milán, Italia) a 37ºC durante 20 min, y a continuación se
almacenaron a -20ºC hasta la primera PCR.
A continuación se amplificó el ADNc (1 \mul de
la reacción de la transcriptasa inversa) mediante la PCR con 1 U de
Taq ADN polimerasa (Life Technologies, Milán, Italia), en las
condiciones recomendadas por los suministradores en una mezcla de
reacción de 50 \mul. Tras la desnaturalización inicial a 95ºC
durante 5 min, se llevaron a cabo las reacciones de la PCR usando
los cebadores de oligonucleótidos y las condiciones relacionadas en
la Tabla 1, describiendo el tamaño de los fragmentos esperados. Se
analizaron los productos de la PCR en un gel de agarosa al 2% y se
visualizaron mediante la tinción de bromuro de etidio (ETB). Para
asegurar que no se producía contaminación durante el curso del
procedimiento de la RT-PCR, se prepararon dos tipos
de controles negativos. Se preparó el primer control negativo
omitiendo el ARN total en la RT. Se preparó el segundo sustituyendo
la mezcla de ADNc con agua en la reacción de la PCR. Se consideró
útil la PCR sólo si no se observaban bandas en las bandas de
control negativo en un gel de agarosa al 2%. Cada producto de la
PCR se sometió a la digestión mediante enzima de restricción y se
analizó sobre un gel de agarosa al 2% para confirmar adicionalmente
la identificación correcta de los amplicones.
Se relacionan en la Tabla 2 los análogos de SS
usados en este estudio y sus afinidades respectivas respecto de los
diferentes SSTR. Cada compuesto, proporcionado por Biomeasure
Incorporated (Milford, MA, EE.UU.), se volvió a suspender en ácido
acético 0,01 N que contenía albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA)
con el fin de proporcionar una solubilidad uniforme y evitar la
unión no específica a las diversas superficies de la preparación.
Se determinaron la especificidad y la selectividad de los análogos
mediante el Ensayo de Unión al Radioligando y se transfectaron de
manera estable las células CHO-K1 con cada uno de
los subtipos de SSTR, como sigue.
Las secuencias completas de codificación de los
fragmentos genómicos de los genes de SSTR 1, 2, 3, y 4 y el clon de
un ADNc de SSTR5 se subclonaron en el vector de expresión en
mamíferos pCMV (Life Technologies, Milán, Italia). Se obtuvieron
líneas de células clonales que expresaban de manera estable los SSTR
1-5 mediante transfección en células
CHO-K1 (ATCC, Manassas, Va, EE.UU.) usando el
procedimiento de precipitación simultánea con fosfato de calcio
(Davis L, y col., 1994 en: Basic Methods in Molecular Biology, 2ª
edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT, EE.UU.:
611-646). Se incluyó el plásmido
pRSV-neo (ATCC) como marcador seleccionable. Se
seleccionaron las líneas celulares clonales en los medios RPMI 1640
que contenían 0,5 mg/ml de G418 (Life Technologies, Milán, Italia),
se clonó el anillo, y expandió en el cultivo.
Se obtuvieron las membranas para los ensayos de
unión del receptor in vitro homogeneizando las células
CHO-K1 que expresaban los subtipos de SSTR en
Tris-HCl 50 mM enfriado en hielo y centrifugando dos
veces a 39000 g (10 min), con una resuspensión intermedia en tampón
fresco. Los residuos finales se volvieron a suspender en
Tris-HCl 10 mM para el ensayo. Para los ensayos de
los SSTR 1, 3, 4, y 5, se incubaron alícuotas de las preparaciones
de membrana durante 90 min a 25ºC con
[^{125}I-Tyr11]SS-14 0,05
nM en HEPES 50 mM (pH 7,4) que contenía 10 mg/ml de BSA, MgCl_{2}
5 mM, 200 KIU/ml de Trasylol, 0,02 mg/ml de bacitracina, y 0,02
mg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo. El volumen final del
ensayo fue de 0,3 ml. Para el ensayo de SSTR 2, se empleó
[^{125}I]MK-678 0,05 nM como radioligando y
el tiempo de incubación fue de 90 min a 25ºC. las incubaciones se
terminaron mediante filtración rápida a través de filtros de GF/C
(prehumedecidos en polietileneimina al 0,3%) usando un manguito de
filtración Brandel. A continuación se lavaron cada tubo y filtro
tres veces con alícuotas de 5 ml de tampón enfriado en hielo. Se
definió la unión específica como la unión total de radioligando
menos la unión en presencia de 1000 nM de SS-14 para
SSTR 1, 3, 4, y 5, o de 1000 nM de MK-678 para
SSTR2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la actividad biológica de los
agonistas y antagonistas selectivos de SSTR mediante el ensayo de
movilización del calcio en células CHO-K 1 que
expresaban el SSTR2 o el SSTR5 humano. Se cosecharon las células
incubando en una disolución salina tamponada con EDTA/fosfato al
0,3% (25ºC) y se lavaron dos veces mediante centrifugación. Las
células lavadas se volvieron a suspender en disolución salina
tamponada con Hank (HBSS) para introducir el indicador de Ca^{2+}
fluorescente Fura-2AM. Las suspensiones celulares
(aproximadamente 10^{6} células/ml) se incubaron con
Fura-2AM 2 mM durante 30 min a 25ºC. Se retiró el
fura-2AM no introducido mediante centrifugación dos
veces en HBBS, y las suspensiones finales se transfirieron a un
espectrofluorómetro (Hitachi F-2000) equipado con
un mecanismo de agitación magnética y un recipiente de tipo cubeta
con temperatura regulada. Tras el equilibrio a 37ºC, se añadieron
los análogos de SS para la medida de la movilización del Ca^{2+}
intracelular. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron
de 340 y 510 nm, respectivamente. En las células que expresaban
SSTR2 (Figura 1), el Compuesto 2 y el Compuesto 1 estimularon
significativamente la movilización del Ca^{2+} intracelular
(indicado como la relación entre el valor estimulado y el basal)
mientras que el Compuesto 6 no lo hizo, a las concentraciones
ensayadas. Además, el Compuesto 4 y el Compuesto 3 fueron
igualmente muy potentes en la estimulación de la movilización del
Ca^{2+}. En las células que expresaban SSTR5 (Figura 2), el
Compuesto 5 y el Compuesto 1 estimularon significativamente la
movilización del Ca^{2+} intracelular, mientras que el Compuesto
6 mostró una ligera actividad agonista en el intervalo de 300 a 1000
nM. En las células que expresaban SSTR2 (Figura 3), el Compuesto 6
inhibió la movilización del Ca^{2+} intracelular inducida por SS
en las células en las células que expresaban SSTR2 en una manera
dependiente de la dosis con la supresión completa de la acción de
SS a aproximadamente 10^{-7} M. Por tanto, la evaluación de la
movilización del Ca^{2+} intracelular demostró que la actividad
biológica de cada uno de los diversos análogos era acorde con su
perfil de unión al receptor. Síntesis de ADN.
Se evaluaron los efectos de los agonistas y
antagonistas selectivos de SSTR sobre la síntesis de ADN de las
células TT determinando la velocidad de incorporación de
[^{3}H]timidina ([^{3}H]thy), según se ha descrito
anteriormente (Davis L, y col., 1994 En: Basic Methods in Molecular
Biology, 2ª edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT, EE.UU.:
611-646, degli Uberti EC, y col., 1991 J Clin
Endocrinol Metab 72: 1364-1371). Se plaquearon las
células TT en placas de 24 multipocillos (10^{5} células/pocillo)
y se incubaron durante 48 horas en un medio suplementado con FBS al
10% en presencia de [^{3}H]thy (1,5 \muCi/ml; 87 Ci/mmol)
con o sin cada análogo de SS a concentraciones que oscilaban entre
10^{-6} a 10^{-9} M. Los tratamientos se renovaron añadiendo
análogos frescos a los pocillos después de las primeras 24 h de
incubación, sin retirar el medio.
Tras la incubación, se lavaron las células tres
veces con PBS enfriado en hielo y dos veces con ácido
tricloroacético (TCA) al 10% enfriado en hielo. El material
precipitado con TCA se solubilizó en 500 \mul de hidróxido de
sodio 0,2 mol (l y SDS al 0,1%. A continuación se contó la
radioactividad asociada a las células en un espectrómetro por
centelleo. Se obtuvieron los resultados (cuentas por min por
pocillo) determinando el valor promedio de al menos seis
experimentos por cuadruplicado. Se evaluó la viabilidad de las
células TT en los cultivos control y tratados mediante la tinción
del azul Trypan tras 24 y 48 horas, y el número de células viables
fue de casi el 85-95%.
Se evaluaron los efectos de los agonistas y
antagonistas selectivos de SSTR sobre la proliferación de células
TT mediante el Ensayo de Proliferación Celular No Radioactivo Acuoso
CELL-TITER 96 (Promega, Milán, Italia), un
procedimiento colorimétrico para determinar el número de células
viables en los ensayos de proliferación. El ensayo contiene
disoluciones de un compuesto de tetrazolio (reactivo de Owen, MTS) y
un reactivo de acoplamiento electrónico (metosulfato de fenazina;
PMS). El MTS fue biorreducido por las células a formazán, que es
soluble en medio de cultivo de tejido. Se puede medir la
absorbancia del formazán a 490 nm directamente en las placas de
ensayo de 96 pocillos (Zatelli MC, y col., 2000 J Clin Endocrinol
Metab 85: 847-852; Cory AH, y col., 1991 Cancer
Commun 3: 207-212). La conversión de MTS en formazán
soluble acuoso se lleva a cabo mediante las enzimas deshidrogenasas
que se encuentran en células metabólicamente activas. La cantidad de
producto de formazán según se determinó por la cantidad de
absorbancia a 490 nm es directamente proporcional al número de
células vivas en el cultivo. Brevemente, se plaquearon las células
TT en placas de 96 multipocillos (2 x 10^{4} células/pocillo) y
se incubaron durante 48 horas en un medio suplementado con FBS al
10% en presencia o ausencia de cada análogo de SS a concentraciones
que oscilaban entre 10^{-6} y 10^{-9} M. Se renovaron los
tratamientos añadiendo análogos frescos a los pocillos tras las
primeras 24 h de incubación. Al final del período de incubación, se
añadieron 20 \mul de una disolución combinada de MTS/PMS a cada
pocillo con una pipeta automática, y se incubaron las placas
durante 4 horas más a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%
humidificada. A continuación se registró la absorbancia a 490 nm
usando un lector de placas ELISA (EASIA Reader, Medgenix,
Camarillo, CA). Se obtuvieron los resultados (absorbancia a 490 nm)
determinando el valor promedio de al menos seis experimentos en
ocho réplicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para entender el papel individual de los
subtipos SSTR2 y SSTR5 en el control de la proliferación de células
C parafoliculares, los inventores evaluaron si las células TT
expresaban los SSTR que podrían mediar una respuesta potencial a
los compuestos selectivos para los subtipos SSTR individuales. Para
responder a esta pregunta, los inventores aislaron el ARN total de
las células TT cultivadas y llevaron a cabo las reacciones de la
RT-PCR en las condiciones descritas en Materiales y
Procedimientos. Se aseguró la integridad del ADNc mediante la
presencia de la señal GAPDH. Se evaluó la ausencia de contaminación
en el ADN genómico en las muestras de ADNc mediante la ausencia de
cualquier amplificación en la reacción de la PCR usando muestras
transcritas de manera no inversa. Se encontró que la amplificación
positiva de SSTR1, 2, 3, 4, y 5 en la línea celular examinada (Fig.
4) demostraba que estos receptores se expresaban en la línea de
células TT de MTC humano. La demostración de que la línea de
células TT expresa de manera estable los subtipos SSTR hace de este
sistema un modelo celular adecuado para evaluar la acción de los
análogos de SS selectivos para el receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Se presentan en la Figura 5 los valores de la
incorporación de [^{3}H]thy con concentraciones de
10^{-9} a 10^{-6} M de agonistas preferentes de SSTR2
(Compuesto 1, Compuesto 2, Compuesto 3, y Compuesto 4), el agonista
preferente de SSTR5 (Compuesto 5) y el antagonista preferente de
SSTR2 (Compuesto 6). Según se indica, el Compuesto 2 suprimió
significativamente la incorporación de [^{3}H]thy en un
58-23% a concentraciones que oscilaban entre
10^{-9} y 10^{-7} M. El Compuesto 1 suprimió significativamente
la incorporación de [^{3}H]thy en un
41-21% a concentraciones que oscilaban entre
10^{-9} y 10^{-6} M. La incorporación de [^{3}H]thy se
redujo también significativamente mediante el Compuesto 4 (-13%, p
< 0,05) y el Compuesto 3 (-17%, p < 0,05) a 10^{-9} M. Por
el contrario, el Compuesto 5 aumentó significativamente la
incorporación de [^{3}H]thy en las células TT en un
80-175%. El antagonista selectivo de SSTR2, el
compuesto 6, no altera la incorporación de [^{3}H]thy en
las células TT en comparación con las células control no
tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar con más detalle la actividad de
los análogos de SS sobre el crecimiento de las células TT, se
analizó también su efecto sobre el número de células viables. Se
representan en la Figura 6 los efectos de los agonistas preferentes
de SSTR2, un agonista preferente de SSTR5 y un antagonista
preferente de SSTR2 sobre el número de células TT viables a
concentraciones que oscilan entre 10^{-9} y 10^{-6} M. Según se
indica, todos los compuestos preferentes de SSTR2 inhibieron
significativamente la proliferación celular, cuando se los comparó
con las células control no tratadas a cada concentración ensayada.
El agonista selectivo de SSTR5, el Compuesto 5, produjo un ligero
aumento de la proliferación de células TT (hasta un 11% a 10^{-8}
M), sin embargo, esto no representa una diferencia estadística
respecto de las células control no tratadas. El antagonista
selectivo de SSTR2, el Compuesto 6, no parece afectar el crecimiento
de las células TT a las concentraciones ensayadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aclarar adicionalmente si SSTR2 está
específicamente implicado en la mediación de la actividad
antiproliferativa de los agonistas preferentes de SSTR2, se
evaluaron la incorporación de [^{3}H]thy y el crecimiento
celular en células TT expuestas durante 48 horas al Compuesto 1 y
el Compuesto 2, cada uno solo (a 10^{-7} M) o en combinación con
el Compuesto 6, un antagonista selectivo de SSTR2 a concentración
equimolar (10^{-7} M). Se suprimió la inhibición de la
incorporación de [^{3}H]thy inducida por el Compuesto 1 y
el Compuesto 2 mediante el tratamiento simultáneo de células TT con
el Compuesto 6 (Figura 7, panel superior). La inhibición de la
proliferación de células TT inducida por el Compuesto 1 se redujo
significativamente desde el 46% al 10% mediante el tratamiento
simultáneo con el Compuesto 6. Además, el Compuesto 6 pareció
bloquear completamente la actividad antiproliferativa del Compuesto
2 (Figura 7, panel inferior). De esta manera, se demostró claramente
la implicación específica de SSTR2 en la mediación del efecto
inhibidor de un agonista de SSTR2 sobre la proliferación de las
células TT.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de analizar los efectos de un
agonista de SSTR2 y de SSTR5 en combinación, se examinaron la
incorporación de [^{3}H]thy y la proliferación ensayando
cada uno del Compuesto 2 y el Compuesto 5 a 10^{-7} M en
combinación con dosis crecientes (desde 10^{-9} M a 10^{-6} M)
del otro compuesto. En la Figura 8 se resumen los resultados. El
aumento de las concentraciones del agonista de SSTR5 (10^{-9} M a
10^{-6} M) evitó de manera dependiente de la dosis la supresión
de la incorporación de [^{3}H]thy a las células TT (Figura
8, panel superior) y la proliferación (Figura 8, panel inferior)
producida por el agonista de SSTR2 (10^{-7} M). Estos datos
demuestran un antagonismo entre los efectos mediados por SSTR5 y
SSTR2 sobre la proliferación.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se determinó la afinidad por subtipo mediante
ensayos de unión del receptor de la membrana a radioligando en
células de ovario de hámster chino expresando el ADNc de los genes
SSR2 o SSR5.
Claims (4)
1. Un compuesto de la fórmula:
Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH_{2}
o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptable.
2. Un compuesto de la fórmula
Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH_{2}
o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable
para uso como antagonista del receptor de la somatostatina.
3. El uso de un compuesto de la fórmula
Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-NaI-NH_{2}
o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable
como antagonista del receptor de la somatostatina.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho antagonista del receptor de la somatostatina es un antagonista
selectivo para SSTR2.
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