JP4828438B2

JP4828438B2 - ソマトスタチン受容体アンタゴニスト

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Publication number: JP4828438B2
Application number: JP2007005725A
Authority: JP
Inventors: デグリ・ウベルティ，エットーレ・シロ; ザテーリ，マリア・チアラ; キュラー，マイケル・デウィット
Original assignee: Ipsen Pharma SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 2001-03-06
Filing date: 2007-01-15
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2022-03-06
Also published as: EP1390406B1; RU2275934C2; RU2003129515A; US20070259811A1; DE60232203D1; CA2440214C; JP2005506289A; DE60220157T2; JP4294959B2; CA2743731A1; RU2005132456A; NO20033881L; US9220760B2; RU2007111864A; ATE430162T1; RU2317824C2; US20050124549A1; ES2345280T3; EP1813625A1; DE60236225D1

Description

発明の背景
ソマトスタチン（ＳＳ）は、Ｂｒａｚｅａｕらにより発見されたテトラデカペプチドであり、組織内、例えば下垂体、膵臓及び胃腸管（gastrointestinal tract）内の様々な分泌のプロセスに有力な阻害作用を有することが示された。ＳＳは、中枢神経系において神経変調剤としても作用する。天然においては全て阻害性であるＳＳのこれらの生物学上の作用は、一連のＧ蛋白質共役受容体を通して顕在化され、そのうち５つのサブタイプが同定された（ＳＳＴＲ１−ＳＳＴＲ５）（ＲｅｕｂｉＪＣ，ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ４７：５５１−５５８，ＲｅｉｓｉｎｅＴ，ｅｔａｌ．，ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗ１６：４２７−４４２，ＬａｍｂｅｒｔｓＳＷ，ｅｔａｌ．，ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ１２：４５０−４８２，４ＰａｔｅｌＹＣ，１９９９ＦｒｏｎｔＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ２０：１５７−１９８）。これらの５つのサブタイプは、内生のＳＳリガンドに対しては類似の親和性を有するが、様々な組織において異なる分散性を有する。ソマトスタチンは５つの異なる受容体（ＳＳＴＲ）サブタイプに結合し、各々のサブタイプに関して相対的に高くて等しい親和性を有する。

ＳＳＴＲ１、２、４及び５のサブタイプにより細胞の増殖を阻止することにより（ＢｕｓｃａｉｌＬ，ｅｔａｌ．，１９９５ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：１５８０−１５８４；ＢｕｓｃａｉｌＬ，ｅｔａｌ．，１９９４ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１：２３１５−２３１９；Ｆｌｏｒｉｏ
Ｔ，ｅｔａｌ．，１９９９ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１３：２４−３７；ＳｈａｒｍａＫ，ｅｔａｌ．１９９９ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１３：８２−９０））、又はＳＳＴＲ３サブタイプによりアポトーシスを誘導することにより（ＳｈａｒｍａＫ，ｅｔａｌ．，１９９６ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１０：１６８８−１６９６）、ＳＳが細胞の増殖を阻害するという証拠が存在する。ＳＳ及び様々なアナログは、インビトロ及びインビボにおいて（ＬａｍｂｅｒｔｓＳＷ，ｅｔａｌ．，ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ１２：４５０−４８２）特定のＳＳ受容体（ＳＳＴＲ’ｓ）により（ＰａｔｅｌＹＣ，１９９９ＦｒｏｎｔＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ２０：１５７−１９８）及びあるいは異なるポスト受容体作用により（ＷｅｃｋｂｅｃｋｅｒＧ，ｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ６０：２４５−２６４；ＢｅｌｌＧＩ，ＲｅｉｓｉｎｅＴ１９９３ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ１６：３４−３８；ＰａｔｅｌＹＣ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９８：６０５−６１２；ＬａｗＳＦ，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌ７：１−８）、正常細胞及び腫瘍（neoplastic）細胞の増殖を阻害することが示された。さらに、別々のＳＳＴＲサブタイプが正常及び腫瘍細胞組織内で発現されるとの証拠が存在し（ＶｉｒｇｏｌｉｎｉＩ，ｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２７：６４５−６４７）、様々なＳＳアナログに関する異なる組織親和性及びそれらの治療上の効果に対する変更可能な臨床上の応答を授与する。

異なるタイプのソマトスタチンの受容体のサブタイプへの結合が、様々な症状及び／又は疾患の処置に付随した。例えば、成長ホルモンの阻害はソマトスタチンタイプ−２受容体（「ＳＳＴＲ２」）に帰し（Ｒａｙｎｏｒ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．４３：８３８（１９９３）；Ｌｌｏｙｄ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｇ１０２（１９９５））、インスリンの阻害はソマトスタチンタイプ−５受容体（「ＳＳＴＲ５」）に帰する（Ｃｏｙ，ｅｔａｌ．１９７：３６６−３７１（１９９３））。タイプ２及び５の活性化は、成長ホルモン抑圧及び特定すればＧＨ分泌アデノーマ（先端巨大症）及びＴＳＨ分泌アデノーマに付随した。プロラクチン分泌アデノー
マを処置することには、タイプ２の活性化が付随したが、タイプ５の活性化は付随しなかった。ソマトスタチン受容体サブタイプの活性化に付随した他の適応症は、真性糖尿病、脈管障害、増殖性網膜症、ダウン現象及びネフロパシーを処置するためのインスリン及び／又はグルカゴンの阻害；胃酸分泌、より特定すればペプチン性の潰瘍、腸の皮膚及び膵臓の皮膚の瘻（fistula）、過敏性結腸症候群、ダンピング症候群、水性下痢症候群、Ａ
ＩＤＳ関連の下痢、化学治療誘導性の下痢、急性又は慢性の膵臓炎及び胃腸ホルモン分泌性腫瘍の阻害；癌、例えば肝臓癌の治療；血管新生の阻害；炎症性障害、例えば関節炎の治療；網膜症；慢性同種移植片拒絶；血管形成；移植血管及び胃腸の出血の阻害を含む。所望の生物学上の応答に必須の一つ又は複数の特定のソマトスタチン受容体サブタイプに関して選択性のアナログを有し、即ち、不所望の副作用を導き得る他の受容体サブタイプとの相互作用を減じることが好ましい。

ソマトスタチン（ＳＳ）とその受容体（ＳＳＴＲ１からＳＳＴＲ５）は正常なヒトのパラフォリキュラーＣ細胞及び髄様甲状腺癌（ＭＴＣ）細胞において発現される。ＭＴＣは、カルシトニン（ＣＴ）、ソマトスタチン、並びに幾つかの他のペプチドを生成する甲状腺パラフォリキュラーＣ細胞を起源とする腫瘍である（ＭｏｒｅａｕＪＰ，ｅｔａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ４５（８補遺１）：２４−２６）。最近、Ｍａｔｏらは、ＳＳとＳＳＴＲ’ｓがヒトＭＴＣにおいて発現されることを示した（ＭａｔｏＥ，ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ８３：２４１７−２４２０）。ＳＳとそのアナログが血漿ＣＴレベルの低下とＭＴＣ患者における兆候の改善を誘導することを記録した。しかしながら、今まで、ＳＳアナログの腫瘍細胞に対する抗増殖活性は明確に証明されていなかった（ＭａｈｌｅｒＣ，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ３３：２６１−９；ＬｕｐｏｌｉＧ，ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ７８：１１１４−８；ＳｍｉｄＷＭ，ｅｔａｌ．，ＮｅｔｈＪＭｅｄ４０：２４０−２４３）。即ち、ＭＴＣ細胞の成長に対して選択性のＳＳＴＲサブタイプアナログの開発及び評価は、臨床上の応用のための有用な手段を提供する。今まで、ＭＴＣ細胞成長の制御への特定のＳＳＴＲサブタイプの関与に関するデータは報告されていない。

本発明は、ＭＴＣ細胞の特性を示し（ＺａｂｅｌＭ，ｅｔａｌ．，１９９２Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１０２：３２３−３２７，２ＧａｇｅｌＲＦ，ｅｔａｌ．，１９８６Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１８：１６４３−１６５１，ＬｊｕＪＬ，ｅｔａｌ．，１９９５Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３６：２３８９−２３９６）且つ全てのＳＳＴＲサブタイプを安定に発現する、ヒトＭＴＣ細胞系ＴＴが、［³
Ｈ］ｔｈｙの取り込み及び細胞数に関して２つの異なるパターンをもってサブタイプ選択的アゴニストによりＳＳＴＲ２及びＳＳＴＲ５に応答するという発見に関する。ＳＳＴＲ２選択的アゴニストは［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みを顕著に抑圧し、即ち、ＤＮＡ合成を阻害
し、そして細胞数を低下させる。ＳＳＴＲ５選択的アゴニストはＴＴ細胞において［³Ｈ
］ｔｈｙ取り込みを顕著に増加させ、即ち、ＤＮＡ合成を増加させるが、単独では細胞増殖には影響し得ない。さらに、ＳＳＴＲ２アンタゴニストはＴＴ細胞に対するＳＳＴＲ２選択的アゴニストの作用を打ち消す。またさらに、ＳＳＴＲ５選択的アゴニストの濃度の増加は、用量依存的に、ＳＳＴＲ２選択的アゴニストにより生じたＴＴ細胞の［³Ｈ］ｔ
ｈｙ取り込みと増殖の抑圧を妨害して、逆に、そのようなアゴニスト間にアンタゴニズムを示す。

アヘン剤（opiate）（ＪｏｒｄａｎＢＡ，ｅｔａｌ．，１９９９Ｎａｔｕｒｅ３９９：６９７−７００）及びＳＳ（ＲｏｃｈｅｖｉｌｌｅＭ，ｅｔａｌ．，２０００Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７８６２−７８６９）受容体ファミリーのサブタイプ間のヘテロ−及びホモダイマーの相互作用が、最近証明された。培養された下垂体アデノーマ細胞の研究は、ＳＳＴＲサブタイプ２と５が成長ホルモン及びプロラクチン分泌の抑圧において相乗的に作用することを証明した（ＳｈｉｍｏｎＩ，ｅｔａｌ．，１
９９７Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔ．１００：２３８６−２３９２，ＪａｑｕｅｔＰ，ｅｔａｌ．，２０００ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ．８５：７８１−７９２）。ＳＳＴＲ５の活性化がＳＳＴＲ２により媒介される抗増殖活性を低下させるという発見は、他の組織における結果とは異なる（ＰａｔｅｌＹＣ，１９９９ＦｒｏｎｔＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ２０：１５７−１９８，ＢｕｓｃａｌｉＬ，ｅｔａｌ．，１９９５ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ９２：１５８０−１５８４，ＢｕｓｃａｌｉＬ，ｅｔａｌ．，１９９４ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１：２３１５−２３１９，ＳｈａｒｍａＫ，ｅｔａｌ．，１９９６ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１０：１６８８−１６９６）。これは、ＳＳＴＲサブタイプ２及び５が細胞成長を制御することにおいて相乗的に作用し得るという最初の証明である。

即ち、ＳＳＴＲ２及びＳＳＴＲ５選択的アゴニストは、それらのＳＳＴＲ選択性に従い、インビトロにおいてヒト髄様甲状腺ＴＴ細胞系の増殖に対して異なる作用を及ぼす。ＴＴ細胞系の増殖は、ＳＳＴＲ２選択的アゴニストにより減少するがＳＳＴＲ５アゴニストによっては減少できず、ＳＳＴＲ５はＳＳＴＲ２媒介性抗増殖作用を阻害することができる。ＭＴＣ細胞増殖に対するＳＳＴＲ２の鍵となる阻害性の役割は、ＳＳＴＲ５に対しての増強されたＳＳＴＲ２親和性及び選択性がＭＴＣ処理において抗増殖剤として有用なはずであることを証明する。

発明の概要
本発明は、ＳＳＴＲ−２に関して選択的なソマトスタチンアゴニストが髄様甲状腺癌細胞の増殖速度を低下させるのに有効であること、及びＳＳＴＲ５に関して選択性のソマトスタチンアゴニストがこのＳＳＴＲ−２アゴニスト誘導性の増殖速度の低下を減衰させるのに有効であるという発見に基づく。

一つの側面において、本発明は、ＭＴＣ細胞を一つ又は複数のＳＳＴＲ２アゴニスト及び一つ又は複数のＳＳＴＲ５アゴニストに接触させることを含む、ＭＴＣ細胞の増殖速度の変調方法に向けられるが、但し、ＳＳＴＲ２アゴニストはＭＴＣ細胞濃度の増殖速度を低下させるように機能して、ＳＳＴＲ５アゴニストはＳＳＴＲ−２アゴニスト誘導性の増殖速度の低下を減衰させるように機能する。

一つの態様において、本発明は、ＳＳＴＲ−５アゴニストがＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂又はその薬学上受容可能な塩
である、直前に記載の方法に向けられる。

別の態様において、本発明は、髄様甲状腺癌細胞を一つ又は複数のＳＳＴＲ２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩に接触させることを含む、髄様甲状腺癌の増殖速度を低下させる方法に向けられる。

直前に記載の態様の好ましい例において、ＳＳＴＲ−２アゴニストはＳＳＴＲ−２選択的アゴニストである。より好ましい例において、ＳＳＴＲ−２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩は、それがＳＳＴＲ−２に関して有するよりも少なくとも２倍高いＳＳＴＲ−５に関するＫｉ値を有し、より好ましくはそれがＳＳＴＲ−２に関して有するよりも少なくとも５倍高く、そしてさらにより好ましくはそれがＳＳＴＲ−２に関して有するよりも少なくとも１０倍高い。

直前の態様の別の好ましい例において、ＳＳＴＲ−２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩は５ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満のＫｉ値を有する。
直前の態様の別の好ましい例において、ＳＳＴＲ−２選択的アゴニストは、Ｄ−Ｎａｌ
−シクロ［Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ₂，
シクロ［Ｔｉｃ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｐｈｅ］，４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニルアセチル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂，及び４−（２−ヒドロキシエチル）
−１−ピペラジン−２−エタンスルフォニル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂からなるリストから選択される化
合物；又はそれらの薬学上受容可能な塩であるが、式中、「４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジニルアセチル」は、構造：

を示し、そして「４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−２−エタンスルフォニル」は、構造：

を示す。
第３の態様において、本発明は、有効量のＳＳＴＲ−２アゴニストを必要のある患者に投与することを含む、髄様甲状腺癌の治療方法に向けられる。

第３の態様の好ましい例において、ＳＳＴＲ−２アゴニストはＳＳＴＲ−２選択的アゴニストである。より好ましい態様において、ＳＳＴＲ−２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩は、それがＳＳＴＲ−２に関して有するよりも少なくとも２倍高いＳＳＴＲ−５に関するＫｉ値を有し、より好ましくはそれがＳＳＴＲ−２に関して有するよりも少なくとも５倍高く、そしてさらにより好ましくはそれがＳＳＴＲ−２に関して有するよりも少なくとも１０倍高い。

第３の態様の別の好ましい例において、ＳＳＴＲ−２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩は５ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満のＫｉ値を有する。
第３の態様のまた別の好ましい例において、ＳＳＴＲ−２選択的アゴニストは、Ｄ−Ｎａｌ−シクロ［Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ₂，シクロ［Ｔｉｃ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｐｈｅ］，４−（２−ヒド
ロキシエチル）−１−ピペラジニルアセチル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂，及び４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジン−２−エタンスルフォニル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂からなるリストから選択され
る化合物；又はそれらの薬学上受容可能な塩であり、式中の、「４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジニルアセチル」及び「４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−２−エタンスルフォニル」は前に定義されたとおりである。

重要なことは、当業者にはよく知られるとおり、標準の放射性ヨウ素治療、例えば放射性ヨード塩の患者への投与は髄様甲状腺癌の治療に利用できないが、パラフォリキュラーＣ細胞がヨウ素を取り込まないからである。即ち、別の側面において、本発明は、有効量のＳＳＴＲ−２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩を、必要とする患者に投与することを含む、髄様甲状腺癌患者の治療方法を提供し、但し、ＳＳＴＲ−２アゴニスト又はその薬学上受容可能な塩はＴｙｒ（Ｉ）残基を含み、当該Ｔｙｒ（Ｉ）残基のヨウ素原子は放射性ヨウ素同位体を含む。好ましくは、ヨウ素同位体は¹²⁵Ｉ，¹²⁷Ｉ又は¹³¹Ｉである
。

上記の一つの態様において、髄様甲状腺癌細胞は甲状腺外において転移を形成する。さらなる態様において、上記転移はリンパ、肺、肝臓、脳又は骨の中に存在する。
発明の詳細な説明
当業者は、本明細書の記載に基づいて、そのもっとも十分な範囲に本発明を利用することができると信じる。以下の特定の実施例は、よって、単に例示として解釈され、いずれにしても何ら開示の残りの限定として解釈されるべきではない。

他に定義しない限り、本明細書にて使用される全ての技術用語及び科学用語は、発明の属する技術の当業者の一人により共通に理解されるのと同じ意味を有する。また、本明細書にて言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献はその全体を引用により本明細書に編入する。

様々なソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ’ｓ）、例えば、ＳＳＴＲ−１，ＳＳＴＲ−２，ＳＳＴＲ−３，ＳＳＴＲ−４及びＳＳＴＲ−５が単離されてきた。即ち、ソマトスタチンアゴニストは、一つ又は複数の、ＳＳＴＲ−１アゴニスト，ＳＳＴＲ−２アゴニスト，ＳＳＴＲ−３アゴニスト，ＳＳＴＲ−４アゴニスト又はＳＳＴＲ−５アゴニストであってよい。ソマトスタチンタイプ−２受容体アゴニスト（即ち、ＳＳＴＲ−２アゴニスト）が意味することは、（１）ＳＳＴＲ−２に関して高い結合親和性（例えば、１００ｎＭ未満、又は好ましくは１０ｎＭ未満又は１ｎＭ未満）を有し（例えば、以下に記載される受容体結合アッセイにより定義されるとおり）そして（２）髄様甲状腺癌細胞の増殖速度を低下させる（例えば、以下に記載される生物学上のアッセイにより定義されるとおり）化合物である。ソマトスタチンタイプ−２受容体選択的アゴニストが意味することは、ＳＳＴＲ−５に関してよりもＳＳＴＲ−２に関して高い結合親和性（即ち、低いＫｉ）を有するソマトスタチンタイプ−２受容体アゴニストである。ソマトスタチンタイプ−５受容体アゴニストが意味することは、（１）ＳＳＴＲ−５に関して高い結合親和性（例えば、１００ｎＭ未満、又は好ましくは１０ｎＭ未満又は１ｎＭ未満）を有し（例えば、以下に記載される受容体結合アッセイにより定義されるとおり）そして（２）髄様甲状腺癌細胞の増殖速度のＳＳＴＲ−２アゴニスト誘導性の低下を減衰させる（例えば、以下に記載される生物学上のアッセイにより定義されるとおり）化合物である。ソマトスタチンタイプ−５受容体選択的アゴニストが意味することは、ＳＳＴＲ−２に関してよりもＳＳＴＲ−５に関して高い結合親和性（即ち、低いＫｉ）を有するソマトスタチンタイプ−５受容体アゴニストである。

一つの態様において、ＳＳＴＲ−２アゴニストはＳＳＴＲ−２選択的アゴニストでもある。別の態様において、ＳＳＴＲ選択的アゴニストは、ＳＳＴＲ−２受容体に関してそれが有するよりも（例えば、以下に記載される受容体結合アゴニストにより定義されるとおり）少なくとも２倍（例えば少なくとも５倍又は少なくとも１０倍）高いＳＳＴＲ−５に関するＫｉ値を有する。

本発明を実施するために使用してよいＳＳＴＲ−２アゴニストの例は、限定ではないが、
Ｄ−Ｎａｌ−シクロ［Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ₂，（化合物１），
シクロ［Ｔｉｃ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｐｈｅ］，（化合物２），
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニルアセチル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂，（化合物３）
，そして
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−２−エタンスルフォニル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂
，（化合物４）
を含む。

本発明を実施するために使用してよいＳＳＴＲ−５アゴニストの例は、限定ではないが、
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂
，（化合物５）
を含む。

ソマトスタチンアゴニストの別の例は、以下に記載する刊行物に列挙された式によりカバーされるもの又は特別に列挙されたものであり、刊行物の全ては引用により本明細書に編入される。

ＥＰ出願番号Ｐ５１６４ＥＵ（発明者：Ｇ．Ｋｅｒｉ）；
ＶａｎＢｉｎｓｔ，Ｇ．らＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ５：８（１９９２）；
Ｈｏｒｖａｔｈ，Ａ．らＡｂｓｔｒａｃｔ，”Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆ
ＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎＡｎａｌｏｇｓＨａｖｉｎｇＡｎｔｉｔｕｍｏｒＡｃｔｉｖｉｔｙ”，２２ｎｄＥｕｒｏｐｅａｎｐｅｐｔｉｄｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，１９９２年９月１３−１９日、Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；
ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／０９０５６（１９９１）；
ＥＰ出願番号０３６３５８９Ａ２（１９９０）；
米国特許第４，９０４，６４２号（１９９０）；
米国特許第４，８７１，７１７号（１９８９）；
米国特許第４，８５３，３７１号（１９８９）；
米国特許第４，７２５，５７７号（１９８８）；
米国特許第４，６８４，６２０号（１９８７）；
米国特許第４，６５０，７８７号（１９８７）；
米国特許第４，６０３，１２０号（１９８６）；
米国特許第４，５８５，７５５号（１９８６）；
ＥＰ出願番号０２０３０３１Ａ２（１９８６）；
米国特許第４，５２２，８１３号（１９８５）；
米国特許第４，４８６，４１５号（１９８４）；
米国特許第４，４８５，１０１号（１９８４）；
米国特許第４，４３５，３８５号（１９８４）；
米国特許第４，３９５，４０３号（１９８３）；
米国特許第４，３６９，１７９号（１９８３）；
米国特許第４，３６０，５１６号（１９８２）；
米国特許第４，３５８，４３９号（１９８２）；
米国特許第４，３２８，２１４号（１９８２）；
米国特許第４，３１６，８９０号（１９８２）；
米国特許第４，３１０，５１８号（１９８２）；
米国特許第４，２９１，０２２号（１９８１）；
米国特許第４，２３８，４８１号（１９８０）；
米国特許第４，２３５，８８６号（１９８０）；
米国特許第４，２２４，１９９号（１９８０）；
米国特許第４，２１１，６９３号（１９８０）；
米国特許第４，１９０，６４８号（１９８０）；
米国特許第４，１４６，６１２号（１９７９）；
米国特許第４，１３３，７８２号（１９７９）；
米国特許第５，５０６，３３９号（１９９６）；
米国特許第４，２６１，８８５号（１９８１）；
米国特許第４，７２８，６３８号（１９８８）；
米国特許第４，２８２，１４３号（１９８１）；
米国特許第４，２１５，０３９号（１９８０）；
米国特許第４，２０９，４２６号（１９８０）；
米国特許第４，１９０，５７５号（１９８０）；
ＥＰ特許番号０３８９１８０（１９９０）；
ＥＰ出願番号０５０５６８０（１９８２）；
ＥＰ出願番号００８３３０５（１９８２）；
ＥＰ出願番号００３０９２０（１９８０）；
ＰＣＴ出願番号ＷＯ８８／０５０５２（１９８８）；
ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１２８１１（１９９０）；
ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／０１５７９（１９９７）；
ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１８０１６（１９９１）；
英国出願番号ＧＢ２，０９５，２６１（１９８１）；及び
フランス出願番号ＦＲ２，５２２，６５５（１９８３）。

本明細書に記載された全てのソマトスタチンアゴニストに関して、各アミノ酸残基は−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯ−の構造を表し、式中、Ｒは側鎖である（例えば、Ａｌａに関してはＣＨ₃）ことに注意されたい。アミノ酸の間の線は、アミノ酸を連結するペプチド結
合を表す。また、アミノ酸残基が光学活性であれば、それはＤ−型を標記しない限り、Ｌ−型の配置を意図する。明確にするため、Ｃｙｓ残基の２つの遊離チオールの間に存在するジスルフィド結合（例えば、ジスルフィドブリッジ）は示さない。一般的なアミノ酸の略語はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの推奨に従う。
ソマトスタチンアゴニストの合成
ソマトスタチンアゴニストを合成する方法は論文に十分に記載されており、当業者の能力の範囲内である。

短いアミノ酸配列の合成はペプチドの分野において十分に確立されている。例えば、上で記載されたＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂の合成は、欧州特許出願番号０３９５４１７Ａ１の実施例１に記載
されたプロトコルに従い達成することができる。置換されたＮ−末端を有するソマトスタチンアゴニストの合成は、例えば、ＷＯ８８／０２７５６，欧州特許出願番号０３２９２９５、及びＰＣＴ公表番号ＷＯ９４／０４７５２に記載されたプロトコルに従い達成することができる。

本発明の化合物の幾つかは、少なくとも一つの非対称中心を有することができる。追加の非対称中心が分子上の様々な置換基の性質に依存して分子上に存在してよい。そのような非対称中心の各々は２つの光学異性体を生じることになり、そのような光学異性体は別々に精製されるか又は部分精製された光学異性体、それらのラセミ混合物又は偏左右異性体混合物は本発明の範囲に含まれることを意図する。

本発明の化合物はそれらの薬学上受容可能な酸付加塩、例えば無機及び有機酸に由来する塩の形態にて単離することができる。そのような酸の例は、塩化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、琥珀酸、Ｄ−酒石酸、Ｌ−酒石酸、マロン酸、メタンスルフォン酸等である。さらに、例えばカルボキシのような酸官能基を含む特定の化合物はそれらの無機塩の形態で単離することができ、カウンターイオンをナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム等、並びに有機塩基から選択することができる。

薬学上受容可能な塩は、ＳＳＴＲ−２アゴニスト、例えば化合物１の約１当量を取り、そしてそれを約１当量又はそれ以上の所望の塩の適切な相当する酸と接触させることにより、形成させることができる。その結果の塩の精密検査（work-up）と単離は当業者によ
く知られている。

この発明の化合物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹膜内、静脈内又は皮下注射又は移植）、鼻内、膣内、直腸内、舌下又は局所経路の投与により投与することができ、そして各投与経路に適した投薬量形態を提供するために薬学上受容可能な賦形剤と共に製剤化することができる。従って、本発明は、活性成分として、少なくとも一つのＳＳＴＲ２アゴニストを薬学上受容可能な賦形剤と共に含む薬学組成物をその範囲内で含む。

経口投与のための固形投薬量形態は、カプセル、タブレット、ピル、粉末及び顆粒を含む。そのような固形投薬量形態において、活性化合物は、少なくとも一つの不活性な薬学上受容可能な賦形剤、例えば、蔗糖、乳糖又は澱粉と混合される。そのような投薬量形態は、通常の実施におけるように、追加の物質、例えば不活性希釈剤、例えば潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含むこともできる。カプセル、タブレット及びピルの場合、投薬量形態は緩衝剤を含んでもよい。タブレットとピルはさらに腸溶性コーティングと共に製造することができる。

経口投与のための液体投薬量形態は、薬学上受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、当業界で普通に使用される不活性希釈剤、例えば水を含むエリキシルを含む。そのような不活性希釈剤のほかにも、組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤及び甘味料、香味料及び芳香剤を含むこともできる。

非経口投与のためのこの発明による調製物は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを含む。非水性溶剤又は媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油又はコーン油、ゼラチン及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。そのような投薬量形態は、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含んでもよい。それらは、例えば、細菌固定フィルターを通す濾過によるか、滅菌剤を組成物に取り込むか、組成物を照射するか、又は組成物を加熱することにより、滅菌してよい。それらは、使用直前に滅菌水又は幾つかの他の滅菌注射可能媒体中に溶解し得る滅菌固形組成物の形態にて製造することもできる。

直腸内又は膣内投与のための組成物は座剤であることが好ましく、活性物質に加えて、賦形剤、例えばコカバター又は座剤ワックスを含んでよい。
鼻内又は舌下投与のための組成物も、当業界公知の標準の賦形剤と共に製造される。

通常、この発明の組成物中の活性成分の有効投薬量は変更してよい；しかしながら、有効成分の量は適切な投薬形態が得られるようにすることが必要である。選択された投薬量は、所望の治療効果、投与経路、及び治療期間に依存するが、それら全ては当業者の知識の領域内である。通常、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重の１日の投薬量レベル
を、ヒト又は他の動物、例えば哺乳類に投与される。

好ましい投薬量の範囲は、１日あたり０．０１から１０．０ｍｇ／ｋｇ体重であり、１回の投与として又は複数回の投与として投与することができる。
材料と方法
ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用することにより、５つ全てのＳＳＴＲサブタイプのｍＲＮＡがヒトＭＴＣ細胞系、ＴＴ内で発現されることを証明した。ＳＳＴＲ２と５に関して異なる親和性と特異性を有するＳＳアナログがＴＴ細胞の増殖活性に影響する能力を、［³Ｈ］
ｔｈｙ取り込みを考慮することにより評価し、ＤＮＡ合成活性の間接の測定及び生存細胞の数を考究してよい。

ＳＳＴＲ２選択的アゴニスト全てが、１０^-9Ｍから１０^-6Ｍの範囲の濃度においてＴＴ細胞の数を顕著に抑圧することができた。化合物３及び化合物４は、細胞数に対するそれらの最大の阻害効果が明らかであった場合に、１０^-9Ｍにおいて顕著に（ｐ＜０．０５）［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みを低下させたが、１０^-8Ｍ及び１０^-7Ｍにおいては低下させなか
った。試験された各ＳＳＴＲ２化合物は、濃度の増加と共に効果が低下する傾向を示したが、しかしながら、ベル形態の応答曲線はＳＳに関して共通である。［³Ｈ］ｔｈｙ取り
込みとＴＴ細胞数の１０^-7Ｍの化合物１及び化合物２による阻害は、トリパンブルー染色により証明されたところ、如何なる細胞障害性作用とも関連しなかった。さらに、この作用は、ＴＴ細胞の化合物６、選択的ＳＳＴＲ２アンタゴニスト、による処理により打ち消された。考え合わせると、これらの結果は、ＳＳＴＲ２に関して優先的な選択性を有するＳＳアナログが、ＳＳＴＲ２に特異的に相互作用することにより、ＴＴ細胞の増殖を阻害することを示す。

ＴＴ細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た。ＴＴ細胞系は、ＲＥＴプロトオンコジーン内のエクソン１１のコドン６３４におけるＴＧＣからＴＧＧへの変異の存在により特徴付けされる、異数性の形質転換されたＣＴ−生産性パラフォリキュラー細胞からなり（ＣｏｏｌｅｙＬＤ，ｅｔａｌ．，１９９５ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅｔＣｙｔｏｇｅｎｅｔ８０：１３８−１４９）、我々が研究対象とした細胞系において我々が確認した特徴であった。さらに、ＴＴ細胞は、主要抑圧性遺伝子Ｐ５３の低下した発現を示す（ＶｅｌａｓｃｏＪＡ，ｅｔａｌ．，１９９７ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ７３：４４９−４５５）。免疫組織化学の研究は、ＴＴ細胞が、ＣＴ及びＣＴ受容体（ＦｒｅｎｄｏＪＬ，ｅｔａｌ．，１９９４ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３４２：２１４−２１６）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＳＳ，ニューロテンシン、ガストリン−放出ペプチド（ＧＲＰ）、Ｌｅｕ−及びＭｅｔ−エンケファリン、パラチロイドホルモン放出ペプチド（ＰＴＨｒｐ）、クロモグラニンＡ、ＳＰ−Ｉ，シナプトフィシン、ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃受容体、チロシンヒドロキシラーゼ、α−チューブリン、及
びサイトケラチン（ＺａｂｅｌＭ，ｅｔａｌ．，１９９５ＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＪ．２７：８５９−８６８）を発現することを証明した。ＴＴ細胞は、顕著な量のＣＴを分泌して、イオン化されたカルシウムレベルの変化に応答する（ＺａｂｅｌＭ，ｅｔａｌ．，１９９２Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１０２：３２３−３２７）。即ち、ＴＴ細胞系は、パラフォリキュラー機能の研究に適しており、エンドクリン及び薬理刺激に応答する。

細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア），１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍＬアンフォテリシン（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅＬｔｄ，Ｔｏｒｑｕａｙ，英国）を添加した、グルタミンを含むＨａｍの栄養混合物Ｆ１２内で、３７℃において、５％ＣＯ₂及び９５％空気の湿潤雰囲気中で維持した（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅＬｔｄ
，Ｔｏｒｑｕａｙ，英国）。
ＲＮＡの単離
全ＲＮＡを半芝生状なＴＴ細胞からＴＲＩＺＯＬ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）を用いて、抽出した。ＴＲＩＺＯＬのプロトコルは、グアニジニウム／フェノール抽出の変形である。簡単に言えば、培養した細胞培地を吸引して、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄する。ＴＲＩＺＯＬ試薬を添加して、細胞を室温において１０分間で溶解する。クロロホルムをＴＲＩＺＯＬ／細胞溶解物混合物に添加して、２−３分放置し、次に、１２０００ｘｇにて１５分間遠心分離する。水層を遠心分離混合物から取り出す。イソプロパノールを添加してＲＮＡを沈殿させ、沈殿物を回収し、７５％エタノールにより洗浄して空気乾燥する。全ＲＮＡをジエチルピロカーボネート−処理した（ＤＥＰＣ）水に懸濁して、ＵＶ分光光度計により２６０ｎＭにて定量した。ＤＮＡの混入を避けるため、ＲＮＡをリボヌクレアーゼフリーのデオキシリボヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）で処理した。
ＲＴ−ＰＣＲ
第１標準相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）を用いて、１μｇの全ＲＮＡを製造者のプロトコルに従って逆転写した。ＰＣＲチューブ中のＲＴミックスを５０μｌのライトホワイトミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）で覆った；Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で以下のパラメーターを伴うプログラムを用いてＲＴを実施した：７０℃にて１０分、４℃にて１分。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩを追加後、４２℃にて５０分間、７０℃にて１５分間で反応を完了した。サンプルをＲＮＡｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）により３７℃にて２０分間消化して、最初のＰＣＲまで−２０℃に保存した。

ｃＤＮＡ（ＲＴ反応の１μｌアリコート）を次にＰＣＲにより１ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）を用いて、供給者により推奨される条件にて、５０μｌ反応混合物中で増幅した。９５℃５分間の最初の変性後に、ＰＣＲ反応を、予測される断片のサイズを記載する、表１に掲載したオリゴヌクレオチドプライマー及び条件を用いて実施した。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分析して、エチジウムブロミド（ＥＴＢ）染色により可視化した。ＲＴ−ＰＣＲ法の進行の間に汚染が起こらなかったことを確認するため、２種類の陰性対照を用意した。第１の陰性対照はＲＴにおいて全ＲＮＡを削除することにより作成した。第２は、ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡを水に置き換えることにより用意した。２％アガロースゲル上で陰性対照にバンドが観察されなかったら、ＰＣＲは有用と考えた。各ＰＣＲ産物を制限酵素消化に供して、２％アガロースゲル上で分析することにより、増幅産物の正確な同定をさらに確認した。
ＳＳＴＲ選択的アゴニスト及びアンタゴニスト
この研究に用いたＳＳアナログ及び異なるＳＳＴＲ’ｓに対するそれら各々の親和性を表２に掲載する。ＢｉｏｍｅａｓｕｒｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）により提供された各化合物を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．０１Ｎ酢酸中に懸濁することにより、均一な溶解性を提供し、そして様々な調製物の表面への非特異的結合を予防した。アナログの特異性及び選択性は、ＳＳＴＲサブタイプの各々により安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞上で放射性リガンド結合アッセイ（Radioligand Binding Assay）により決定したが、以下のとおりであった。

ＳＳＴＲ１、２、３及び４のゲノミック断片の完全なコーディング配列及びＳＳＴＲ５のｃＤＮＡクローンを哺乳類発現ベクターｐＣＭＶ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）にサブクローン化した。リン酸カルシウム共沈殿法（Ｄａ
ｖｉｓＬ，ｅｔａｌ．，１９９４Ｉｎ：ＢａｓｉｃｍｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ：６１１−６４６）を用いたＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ，ＵＳＡ）へのトランスフェクションにより、安定にＳＳＴＲ’ｓ１−５を発現するクローン細胞系を得た。プラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ）を選択可能マーカーとして含んだ。クローン細胞系を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）中で選択して、環状クローン化し（ring cloned）、そして培養液中で増殖させた。

インビトロ受容体結合アッセイのための膜は、ＳＳＴＲ’ｓサブタイプを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を氷冷５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中でホモジェナイズして３９０００ｇ（１０分間）にて２回遠心分離することにより得て、中間物の懸濁液を新鮮なバッファーに入れた。最終沈殿物をアッセイのために１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌに懸濁した。ＳＳＴＲ１、３、４及び５のアッセイに関しては、膜調製物のアリコートを９０分間２５℃にて、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ，５ｍＭのＭｇＣｌ₂，２００ＫＩＵ／ｍｌのＴｒａｓｙｌｏ
ｌ，０．０２ｍｇ／ｍｌのバシトラシン、及び０．０２ｍｇ／ｍｌのフェニルメチルスルフォニルフロリドを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の０．０５ｎＭの［¹²⁵
Ｉ−Ｔｙｒ１１］ＳＳ−１４とインキュベートした。最終アッセイ容量は０．３ｍｌであった。ＳＳＴＲ２アッセイに関しては、０．０５ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＭＫ−６７８を放射性
リガンドとして用いて、インキュベーション時間は２５℃において９０分間であった。インキュベーションは、Ｂｒａｎｄｅｌ濾過マニフォルドを用いてＧＦ／Ｃフィルター（０．３％ポリエチレンニミンに予め浸潤した）を通して素早く濾過することにより停止した。各チューブ及びフィルターを次に３回氷冷バッファーの５ｍｌアリコートにより洗浄した。特異的結合は、全結合放射性リガンド引く、ＳＳＴＲ１、３、４、及び５に関して１００ｎＭのＳＳ−１４又はＳＳＴＲ２に関しては１００ｎＭのＭＫ−６７８の存在下で結合した放射性リガンドとして定義した。
生物学上の活性の評価
ＳＳＴＲ選択的アゴニスト及びアンタゴニストの生物学上の活性を、ヒトＳＳＴＲ２又はＳＳＴＲ５を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞内でのカルシウム流動アッセイにより評価した。細胞を、０．３％のＥＤＴＡ／リン酸緩衝塩溶液中でインキュベートし（２５℃）、そして遠心分離により２回洗浄した。洗浄した細胞を、蛍光Ｃａ²⁺インディケーターＦｕｒａ−２ＡＭの負荷のために、Ｈａｎｋ’ｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。細胞懸濁液（約１０⁶細胞／ｍｌ）を２ｍＭＦｕｒａ−２ＡＭと共に３０分間２５℃においてイ
ンキュベートした。負荷していないＦｕｒａ−２ＡＭをＨＢＢＳ中で２回遠心分離することにより取り出し、そして最終懸濁液を、磁気撹拌機構及び温度制御キュベットホルダーを備えた分光光度計（ＨｉｔａｃｈｉＦ−２０００）に移した。３７℃にて平衡化した後に、ＳＳアナログを細胞内Ｃａ²⁺流動の測定のために添加した。励起及び放射の波長は、それぞれ３４０ｎｍ及び５１０ｎｍであった。ＳＳＴＲ２発現細胞において（図１）、化合物２と化合物１は細胞内Ｃａ²⁺の流動を顕著に刺激したが（刺激された値と規定値の間の比として示す）、化合物６は試験された濃度において刺激しなかった。さらに、化合物４と化合物３もＣａ²⁺流動を刺激することについて高い能力であった。ＳＳＴＲ５発現細胞においては（図２）、化合物５と化合物１が細胞内Ｃａ²⁺流動を顕著に刺激したが、化合物６は３００から１０００ｎＭの範囲においてわずかなアゴニスト活性しか示さなかった。ＳＳＴＲ２発現細胞においては（図３）、活性６が用量依存性様式にてＳＳＴＲ２発現細胞においてＳＳ−誘導性細胞内Ｃａ²⁺流動を阻害し、ＳＳ作用の完全な抑圧は約１０^-7Ｍにおいてであった。よって、細胞内Ｃａ²⁺流動の評価は、様々なアナログの各々の生物学上の活性がその受容体結合プロフィールと共に持続したことを証明した。
ＤＮＡ合成
ＴＴ細胞のＤＮＡ合成に対するＳＳＴＲ選択的アゴニスト及びアンタゴニストの効果を、以前に記載したとおりに、［³Ｈ］チミジン（［³Ｈ］ｔｈｙ）取り込みの速度を測定す
ることにより評価した（ＤａｖｉｓＬ，ｅｔａｌ．，１９９４Ｉｎ：ＢａｓｉｃｍｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ：６１１−６４６，ｄｅｇｌｉＵｂｅｒｔｉＥＣ，ｅｔａｌ．，１９９１ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ７２：１３６４−１３７１）。ＴＴ細胞を２４−マルチプレートに入れ（１０⁵細胞／ウエル）、１０％ＦＢＳを追加した培地中で、［３Ｈ］ｔｈｙ（１．５μＣｉ／
ｍＬ；８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）存在下で、１０^-6から１０^-9Ｍの範囲の濃度の各ＳＳアナログの共存又は不在にて、４８時間インキュベートした。処理は、培地を除去することなしに、インキュベーションの最初の２４時間後に新鮮なアナログをウエルに添加することにより、入れ替えた（renewed）。

インキュベーションの後に、細胞を３回氷冷ＰＢＳにて洗浄し、１０％氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により２回洗浄した。ＴＣＡ沈殿させた物質を、５００μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム及び０．１％ＳＤＳに溶解した。細胞に付随する放射性を次にシンチレーション分光光度計により計数した。結果（カウンター／分／ウエル）は、４通りの実験中の少なくとも６つの実験の平均値を測定することにより得た。対照及び処理培養物中のＴＴ細胞の生存性は、２４時間及び４８時間後の両方においてトリパンブルー染色により評価したところ、生存細胞の数はいつも８５−９５％であった。
細胞増殖
ＳＳＴＲ選択的アゴニスト及びアンタゴニストのＴＴ細胞増殖に対する効果を、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ９６ＡｑｕｅｏｕｓＮｏｎ−ＲａｄｉｏａｔｉｖｅＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍｉｌａｎｏ，イタリア）、増殖アッセイにおいて生存細胞数を測定するための比色法により評価した。当該アッセイは、テトラゾリウム化合物（Ｏｗｅｎ’ｓ試薬、ＭＴＳ）及び電子共役試薬（フェナジンメトスルフェート；ＰＭＳ）の溶液を含む。ＭＴＳは、組織培養培地中で可溶性のフォルマザンへ細胞により生物還元される（bioreduced）。４９０ｎｍにおけるフォルマザン（formazan）の吸光を直接９６ウエルアッセイプレートから読むことができる（ＺａｔｅｌｌｉＭＣ，ｅｔａｌ．，２０００ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ
８５：８４７−８５２；ＣｏｒｙＡＨ，ｅｔａｌ．，１９９１ＣａｎｃｅｒＣｏｍｍｕｎ３：２０７−２１２）。ＭＴＳの水溶性フォルマザンへの変換は、代謝上活性な細胞に見いだされるデヒドロゲナーゼ酵素により達成される。フォルマザン生成物の量は、４９０ｎｍ吸光の量により測定され、培養中の生存細胞の数に正比例する。簡単に言えば、ＴＴ細胞を９６−マルチウエルプレートに入れ（２ｘ１０⁴細胞／ウエル）、そ
して各ＳＳアナログを１０^-6から１０^-9Ｍの範囲の濃度の存在又は不在下で１０％ＦＢＳを追加した培地中で４８時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、２０μｌの混合したＭＴＳ／ＰＭＳ溶液を各ウエルに連発ピペット（repeating pipette）
により添加し、そしてプレートをさらに４時間３７℃において湿潤５％ＣＯ₂雰囲気下
でインキュベートした。４９０ｎｍにおける吸光を次にＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＡＳＩＡＲｅａｄｅｒ，Ｍｅｄｇｅｎｉｘ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いて記録した。ｌｅｌｌａ（４９０ｎｍにおける吸光）は、８つの複製の少なくとも６つの実験の平均値を測定することにより得た。

結果
ヒトＭＴＣ細胞系ＴＴ内のＳＳＴＲ発現
パラフォリキュラーＣ細胞増殖を制御することにおけるＳＳＴＲ２及びＳＳＴＲ５サブタイプの個々の役割を理解するため、我々は、個々のＳＳＴＲサブタイプのための選択的化合物に対して有力な応答を媒介することができるＳＳＴＲ’ｓをＴＴ細胞が発現できるか否かを評価した。この疑問に取り組むため、我々は、培養されたＴＴ細胞から全ＲＮＡを単離して、材料と方法に記載された条件においてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨシグナルの存在により、ｃＤＮＡの完全性を確認した。ｃＤＮＡサンプル中のゲノミック
ＤＮＡの汚染の不在を、逆転写されないサンプルを用いたＰＣＲ反応における何らかの増幅の欠如により評価した。ＳＳＴＲ１、２、３、４及び５の陽性の増幅が試験した細胞系において見いだされたことから（図４）、これらの受容体がヒト細胞系において発現されることを証明した。ＴＴ細胞系が安定にＳＳＴＲサブタイプを発現することの証明は、この細胞モデルシステムを、受容体選択的なＳＳアナログの作用を評価するのに適したものとした。
選択的ＳＳアナログのＴＴ細胞の［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みに対する効果
１０^-9から１０^-6Ｍの濃度の、ＳＳＴＲ２選択的アゴニスト（化合物１、化合物２、化合物３及び化合物４）、ＳＳＴＲ５選択的アゴニスト（化合物５）及びＳＳＴＲ２選択的アンタゴニスト（化合物６）により得られた［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みを図５に示す。示さ
れるとおり、化合物２は、１０^-9から１０^-7Ｍの範囲の濃度において、５８−２３％、［³Ｈ］ｔｈｙの取り込みを顕著に抑圧した。化合物１は、１０^-9から１０^-6Ｍの範囲の濃
度において、４１−２１％、［³Ｈ］ｔｈｙの取り込みを顕著に抑圧した。［³Ｈ］ｔｈｙの取り込みは、化合物４（−１３％，ｐ＜０．０５）及び化合物３（−１７％，ｐ＜０．０５）によっても１０^-9Ｍにて顕著に減少した。対するに、化合物５はＴＴ細胞中の［³
Ｈ］ｔｈｙの取り込みを、８０−１７５％、顕著に増加させた。ＳＳＴＲ２選択的アンタゴニストである化合物６は未処理の対照細胞に比較してＴ細胞の［³Ｈ］ｔｈｙの取り込
みを変化させなかった。
ＳＳアナログのＴＴ細胞の増殖に対する効果
ＴＴ細胞の成長に対するＳＳアナログの活性をもっと詳細に試験するため、生存細胞の数に対するそれらの効果も分析した。ＳＳＴＲ２選択的アゴニスト、ＳＳＴＲ５選択的アゴニスト及びＳＳＴＲ２選択的アンタゴニストの１０^-9から１０^-6Ｍの範囲の濃度における生存ＴＴ細胞数に対する効果を図６に示す。示されるとおり、全てのＳＳＴＲ２選択的化合物は、試験した各濃度において未処理の対照細胞に比較した場合に、細胞増殖を顕著に阻害した。選択的ＳＳＴＲ５アゴニストである化合物５はＴＴ細胞の増殖のわずかな増加を生じたが（１０^-8Ｍにおいて１１％まで）、しかしながら、これは未処理の対照細胞との統計上の差異を表さなかった。選択的ＳＳＴＲ２のアンタゴニストである化合物６は、試験した濃度においてＴＴ細胞の成長に影響しなかったらしい。
選択的ＳＳＴＲ２アンタゴニストはＳＳＴＲ２選択的アゴニストの効果を打ち消す
ＳＳＴＲ２がＳＳＴＲ２選択的アゴニストの抗増殖活性を媒介することに特異的に関与するか否かをさらに明確にするため、［³Ｈ］ｔｈｙの取り込み及び細胞の成長を、化合
物１及び化合物２に対して各々単独か（１０^-7Ｍにおいて）又は化合物６と共に、選択的ＳＳＴＲ２アンタゴニストを等モル濃度（１０^-7Ｍ）にて４８時間暴露したＴＴ細胞内で評価した。化合物１及び化合物２両方により誘導された［³Ｈ］ｔｈｙの取り込みの阻害
が、化合物６によるＴＴ細胞の処理により抑圧された（図７、上部パネル）。化合物１により誘導されたＴＴ細胞の増殖阻害は、化合物６の同時処理により４６％から１０％へ顕著に低下した。さらに、化合物６は化合物２の抗増殖活性を完全に遮断したと思われる（図７、下部パネル）。即ち、ＳＳＴＲ２アゴニストのＴＴ細胞増殖に対する阻害効果を媒介することにおけるＳＳＴＲ２の特異的な関与が明確に証明された。
［³Ｈ］ｔｈｙの取り込み及び細胞増殖に対する選択的ＳＳＴＲ２アゴニストと選択的Ｓ
ＳＴＲ５アゴニストの組み合わせの効果
ＳＳＴＲ２とＳＳＴＲ５アゴニストの組み合わせによる効果を分析するため、ＴＴ細胞の［³Ｈ］ｔｈｙの取り込みと増殖を、各々１０^-7Ｍの化合物２と化合物５の組み合わせ
て、他方の化合物に対する用量を増加させて（１０^-9Ｍから１０^-6Ｍ）試験して調査した。結果を図８に要約する。ＳＳＴＲ５アゴニストの濃度の増加（１０^-9Ｍから１０^-6Ｍ）は、ＳＳＴＲ２アゴニスト（１０^-7Ｍ）により生じたＴＴ細胞の［³Ｈ］ｔｈｙの取り込
み（図８、上部パネル）と増殖（図８、下部パネル）の抑圧を用量依存性に妨害した。これらのデータは、ＳＳＴＲ５媒介性の増殖に対する効果とＳＳＴＲ２媒介性の増殖に対する効果の間のアンタゴニズムを証明する。

発明を詳細な説明に関連して記載してきたが、上記の記載は特許請求の範囲により規定された発明の範囲を例示するためであって限定することを意図しないことが、理解されるべきである。他の側面、利点及び修飾は特許請求の範囲の範囲である。

インビトロＳＳＴＲ２媒介性細胞内カルシウム流動ヒトＳＳＴＲ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を材料と方法に記載されるとおりに回収して、次に、ＳＳアナログ（１０^-7−１０^-6Ｍ）を細胞内Ｃａ²⁺流動の測定のために添加して、ＳＳアナログ添加後に測定された細胞内カルシウム濃度と基底レベルにおいて観察された値の間の比として表現した。励起の波長と放射の波長はそれぞれ３４０ｎｍと５１０ｎｍであった。データは平均±ＳＥＭで表す。インビトロＳＳＴＲ５媒介性細胞内カルシウム流動ヒトＳＳＴＲ５を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を材料と方法に記載されるとおりに回収して、次に、ＳＳアナログ（１０^-7−１０^-6Ｍ）を細胞内Ｃａ²⁺流動の測定のために添加して、ＳＳアナログ（化合物１、化合物５及び化合物６）添加後に測定された細胞内カルシウム濃度と基底レベルにおいて観察された値の間の比として表現した。励起の波長と放射の波長はそれぞれ３４０ｎｍと５１０ｎｍであった。データは平均±ＳＥＭで表す。図２に現れる化合物の構造は以下のとおり：化合物１：Ｄ−Ｎａｌ−シクロ［Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ₂；化合物２：シクロ［Ｔｉｃ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｐｈｅ］；化合物３：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニルアセチル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂；化合物４：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−２−エタンスルフォニル−Ｄ−Ｐｈｅ−シクロ（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ）−Ｔｈｒ−ＮＨ₂；化合物５：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂；そして化合物６：Ｃｐａ−シクロ（Ｄ−Ｃｙｓ−４−Ｐａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ）−Ｎａｌ−ＮＨ₂である。ＳＳＴＲ２アンタゴニストによるＳＳ−刺激性細胞内カルシウム流動のインビトロ阻害ヒトＳＳＴＲ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を材料と方法に記載されるとおりに回収して、次に、化合物６（１０^-9−１０^-6Ｍ）とＳＳ（１０ｎＭ）をＳＳ（１０^-8Ｍ）−刺激性細胞内細胞内カルシウム流動に対する化合物６の作用の測定のために添加して、パーセンテージ対ＳＳ単独として表現した。励起の波長と放射の波長はそれぞれ３４０ｎｍと５１０ｎｍであった。データは平均±ＳＥＭで表す。ＴＴ細胞中のソマトスタチン受容体ｍＲＮＡ発現抽出されたＲＮＡ（１μｇ／反応）をデオキシリボヌクレアーゼにより処理して、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用いて逆転写に供した。生成されたｃＤＮＡ及び陰性対照からのアリコートを、表１に示すプライマーを用いるＳＳＴＲ’ｓの続くＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにより解析した。ＳＳＴＲ１−５の発現されたＰＣＲ産物をＡに描写する（レーンＭ，ＰＣＲマーカー；Ｇ，ＧＡＰＤＨ増幅のＰＣＲ産物）。ＴＴ細胞中の［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みに対するＳＳアナログの作用様々な濃度の（１０^-9，１０^-8，１０^-7及び１０^-6Ｍ）ＳＳアナログを付加した培養培地中で細胞を、４８時間、２４ウエルプレート中でインキュベートした。対照は媒体溶液で処理して、［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みをＴＣＡ沈殿物質中の放射活性として測定した。４通りにて個別に評価した６つの個々の実験からのデータを、平均±ＳＥＭパーセント［³Ｈ］ｔｈｙ取り込み阻害対未処理対照細胞＊Ｐ＜０．０４及び＊＊Ｐ＜０．０１対対照として表す。ＴＴ細胞増殖に対するＳＳアナログの作用様々な濃度の（１０^-9，１０^-8，１０^-7及び１０^-6Ｍ）ＳＳアナログを付加した培養培地中で細胞を、４８時間、９６ウエルプレート中でインキュベートした。対照は媒体溶液で処理した。ＴＴ細胞の増殖は各ウエルの４９０ｎＭにおける吸光として測定した。６つの個々の実験からのデータを、平均±ＳＥＭパーセント細胞増殖阻害対未処理対照細胞＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対対照として表された、８通りにより個別に評価した。ＳＳＴＲ２アゴニストによる処理の間のＴＴ細胞［³Ｈ］取り込み及び細胞増殖に対するＳＳＴＲ２選択的アンタゴニストの作用上部パネル：１００ｎＭの化合物１又は化合物２を付加した培養培地中で、化合物６（１０^-7Ｍ）を伴うか又は伴わずに、細胞を２４ウエルのプレート中で４８時間インキュベートした。対照は媒体溶液で処理した。［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みをＴＣＡ沈殿物質中の放射活性として測定した。６つの個々の実験からのデータを４通りにて個別に評価し、平均±ＳＥＭパーセント［³Ｈ］ｔｈｙ取り込み阻害対未処理対照細胞＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対対照として表す。下部パネル：１０^-7Ｍの化合物１又は化合物２を付加した培養培地中で、化合物６（１０^-7Ｍ）を伴うか又は伴わずに、細胞を９６ウエルのプレート中で４８時間インキュベートした。対照は媒体溶液で処理した。ＴＴ細胞の増殖は各ウエルの４９０ｎＭにおける吸光として測定した。６つの個々の実験からのデータを、平均±ＳＥＭパーセント細胞増殖阻害対未処理対照細胞＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対対照として表された、８通りにより個別に評価した。ＳＳＴＲ２アゴニストによる処理の間のＴＴ細胞［³Ｈ］取り込み及び細胞増殖に対するＳＳＴＲ５選択的アンタゴニストの作用上部パネル：化合物２（１０^-7Ｍ）を付加して化合物５を濃度を増加させて（１０^-9，１０^-8，１０^-7及び１０^-6Ｍ）伴うか又は伴わない培養培地中、又は化合物５（１０^-7Ｍ）を付加して化合物２を濃度を増加させて（１０^-9，１０^-8，１０^-7及び１０^-6Ｍ）伴うか又は伴わない培養培地中で、細胞を２４ウエルのプレート中で４８時間インキュベートした。対照は媒体溶液で処理した。［³Ｈ］ｔｈｙ取り込みをＴＣＡ沈殿物質中の放射活性として測定した。６つの個々の実験からのデータを４通りにて個別に評価し、平均±ＳＥＭパーセント［³Ｈ］ｔｈｙ取り込み阻害対未処理対照細胞＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対対照として表す。下部パネル：化合物２（１０^-7Ｍ）を付加して化合物５を濃度を増加させて（１０^-9，１０^-8，１０^-7及び１０^-6Ｍ）伴うか又は伴わない培養培地中、又は化合物５（１０^-7Ｍ）を付加して化合物２を濃度を増加させて（１０^-9，１０^-8，１０^-7及び１０^-6Ｍ）伴うか又は伴わない培養培地中で、細胞を２４ウエルのプレート中で４８時間インキュベートした。対照は媒体溶液で処理し、そしてＴＴ細胞の増殖は各ウエルの４９０ｎＭにおける吸光として測定した。６つの個々の実験からのデータを、平均±ＳＥＭパーセント細胞増殖阻害対未処理対照細胞＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対対照として表された、８通りにより個別に評価した。

Claims

Ｃｐａ−シクロ（Ｄ−Ｃｙｓ−４−Ｐａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ）−Ｎａｌ−ＮＨ₂又はその薬学上受容可能な塩。
請求項１に記載の化合物のソマトスタチン受容体アンタゴニストとしての使用。
請求項１に記載の化合物を含むソマトスタチン受容体アンタゴニスト作用を有する医薬組成物。