ES2345280T3 - Procedimiento de modulacion de la proliferacion de celulas de carcinoma tiroideo medular. - Google Patents
Procedimiento de modulacion de la proliferacion de celulas de carcinoma tiroideo medular. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto de fórmula: ciclo[Tic-Tyr D-Trp-Lys-Abu-Phe]; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2; y 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH2, o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Description
Procedimiento de modulación de la proliferación
de células de carcinoma tiroideo medular.
La somatostatina (SS), un tetradecapéptido
descubierto por Brazeau y col., ha mostrado tener potentes efectos
inhibitorios en diversos procesos secretores en tejidos tales como
la pituitaria, el páncreas y el tracto gastrointestinal. La SS
también actúa como un neuromodulador en el sistema nervioso central.
Estos efectos biológicos de la SS, todos de naturaleza inhibitoria,
son producidos mediante una serie de receptores acoplados a
proteínas G, de los cuales se han caracterizado cinco subtipos
diferentes (SSTR1-SSTR5) (Reubi JC y col., Cancer
Res 47:551-558, Reisine T y col., Endocrine Review
16:427-442, Lamberts SW y col., Endocr Rev
12:450-482, 4 Patel YC, 1999 Front
Neuroendocrinology 20:157-198). Estos cinco subtipos
tienen afinidades similares por los ligandos de la SS endógenos,
pero tienen una distribución diferente en los diversos tejidos. La
somatostatina se une a los cinco subtipos diferentes de receptores
(SSTR) con una afinidad relativamente elevada e igual para cada
subtipo.
Hay pruebas de que la SS regula la proliferación
celular deteniendo el crecimiento celular mediante los subtipos
SSTR1, 2, 4 y 5 (Buscail L y col., 1995 Proc Natl Acad Sci EEUU
92:1580-1584; Buscail L y col., 1994 Proc Natl Acad
Sci EEUU 91:2315-2319; Florio T y col., 1999 Mol
Endocrinol 13:24-37; Sharma K y col., 1999 Mol
Endocrinol 13: 82-90) o induciendo la apoptosis
mediante el subtipo SSTR3 (Sharma K y col., 1996 Mol Endocrinol
10:1688-1696). La SS y sus diversos análogos han
mostrado una inhibición de la proliferación de células sanas y
neoplásicas in vitro e in vivo (Lamberts SW y col.,
Endocr Rev 12:450-482) mediante receptores
específicos de la SS (SSTR) (Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology
20:157-198) y, posiblemente, diferentes acciones de
los post-receptores (Weckbecker G y col., Pharmacol
Ther 60:245-264; Bell GI, Reisine T 1993 Trends
Neurosci 16:34-38; Patel YC y col., Biochem Biophys
Res Commun 198:605-612; Law SF y col., Cell Signal
7:1-8). Además, hay pruebas de que distintos
subtipos de SSTR se expresan en tejidos humanos sanos y neoplásicos
(Virgolini I y col., Eur J Clin Invest 27:645-647),
confiriendo diferentes afinidades a los tejidos para los diversos
análogos de la SS y una respuesta clínica variable a sus efectos
terapéuticos.
La unión a los diferentes tipos de subtipos de
receptores de somatostatina se ha asociado al tratamiento de
diversos trastornos y/o enfermedades. Por ejemplo, la inhibición de
la hormona del crecimiento se ha atribuido al receptor tipo 2 de la
somatostatina ("SSTR2") (Raynor y col., Molecular Pharmacol.
43:838 (1993); Lloyd y col., Am. J. Physiol. 268:G102 (1995)),
mientras que la inhibición de la insulina se ha atribuido al
receptor tipo 5 de la somatostatina ("SSTR5") (Coy y col. 197:
366-371 (1993)). La activación de los tipos 2 y 5 se
ha asociado a la supresión de la hormona del crecimiento y, más
concretamente, a los adenomas secretores de GH (acromegalia) y
adenomas secretores de TSH. La activación del tipo 2 pero no del
tipo 5 se ha asociado al tratamiento de los adenomas secretores de
prolactina. Otras indicaciones asociadas a la activación de los
subtipos de receptores de la somatostatina incluyen inhibición de
insulina y/o glucagón para el tratamiento de la diabetes mellitus,
angiopatías, retinopatías proliferativas, síndrome de dawn y
nefropatías; inhibición de la secreción de ácidos gástricos y, más
concretamente, de ulceras pépticas, fístulas enterocutáneas y
pancreático-cutáneas, síndrome del intestino
irritable, síndrome de evacuación gástrica rápida, síndrome de
diarrea líquida, diarrea asociada con el SIDA, diarrea inducida por
quimioterapia, pancreatitis grave o crónica y tumores secretores de
hormonas gastrointestinales; tratamiento del cáncer tal como
hepatomas; inhibición de la angio-génesis;
tratamiento de trastornos inflamatorios tales como la artritis;
retinopatías; rechazo crónico de aloinjertos; angioplastia;
prevención del sangrado de vasos de injertos y gastrointestinal. Es
preferible un análogo que sea selectivo para el subtipo o subtipos
específicos de receptores de somatostatina responsables de la
respuesta biológica deseada, reduciendo así la interacción con
otros subtipos de receptores, lo que podría producir efectos
secundarios no deseados.
La somatostatina (SS) y sus receptores (SSTR1 a
SSTR5) se expresan en las células C parafoliculares humanas sanas y
las células de carcinoma tiroideo medular (MTC). El MTC es un tumor
que se origina en las células C parafoliculares tiroideas que
produce calcitonina (CT), somatostatina y otros muchos péptidos
(Moreau JP y col., Metabolism 45 (8 Suppl
1):24-26). Recientemente, Mato y col. mostraron que
la SS y los SSTR se expresan en los MTC humanos (Mato E y col., J
Clin Endocrinol Metab 83:2417-2420). Se ha
documentado que la SS y sus análogos inducen una disminución en los
niveles plasmáticos de CT y una mejora sintomática en pacientes con
MTC. Sin embargo, hasta ahora la actividad antiproliferativa de los
análogos de la SS sobre las células tumorales no se ha demostrado
claramente (Mahler C y col., Clin Endocrinol
33:261-9; Lupoli G y col., Cancer
78:1114-8; Smid WM y col., Neth J Med
40:240-243). Por tanto, el desarrollo y evaluación
de análogos de subtipos de SSTR selectivos sobre el crecimiento
celular del MTC proporciona una herramienta útil para su aplicación
clínica. Hasta ahora, no se han proporcionado datos relativos a la
implicación de los subtipos específicos de SSTR en la regulación del
crecimiento celular en los MTC.
La presente memoria descriptiva se refiere al
descubrimiento de que la línea celular TT humana de los MTC, que
muestra las características de la célula del MTC (Zabel M y col.,
1992 Histochemistry 102:323-327, 2 Gagel RF y col.,
1986 Endocrinology 118:1643-1651, Liu JL y col.,
1995 Endocrinology 136:2389-2396) y que expresa de
forma estable todos los subtipos de SSTR, responde a la activación
de los SSTR2 y SSTR5 mediante agonistas selectivos del subtipo con
dos patrones diferentes en términos de incorporación de
[^{3}H]thy y número de células. Los agonistas preferentes
de los SSTR2 suprimen significativamente la incorporación de
[^{3}H]thy, es decir, inhiben la síntesis de ADN, y
disminuyen la proliferación celular. Los agonistas selectivos de
los SSTR2 aumentan significativamente la incorporación de
[^{3}H]thy en las células TT, es decir, aumentan la
síntesis de ADN, pero solos no logran influir en la proliferación
celular. Además, los antagonistas de los SSTR2 contrarrestan la
acción de los agonistas preferentes de los SSTR2 en las células TT.
Además, concentraciones crecientes de un agonista selectivo de los
SSTR5 evitan, en función de la dosis, la supresión de la
incorporación de [^{3}H]thy en células TT y la
proliferación producida por un agonista preferente de los SSTR2 y
viceversa, mostrando un antagonismo entre tales agonistas.
Recientemente se han demostrado interacciones
hetero- y homo-dímeras entre los subtipos de las
familias de receptores del opiato (Jordan BA y col., 1999 Nature
399:697-700) y la SS (Rocheville M y col., 2000 J.
Biol. Chem. 275:7862-7869). Los estudios en cultivos
celulares de adenomas de pituitaria han demostrado que los SSTR
subtipos 2 y 5 actúan de forma sinérgica en la supresión de la
secreción de la hormona del crecimiento y prolactina (Shimon I y
col., 1997 J. Clinical Invest. 100:2386-2392, Jaquet
P y col., 2000 J Clin Endocrinol Metab.
85:781-792). El descubrimiento de que la activación
de los SSTR5 disminuye la actividad antiproliferativa mediada por
los SSTR2 difiere de los resultados en otros tejidos (Patel YC, 1999
Front Neuroendocrinology 20:157-198, Buscail L y
col., 1995 Proc Natl Acad Sci EEUU 92:1580-1584,
Buscail L y col., 1994 Proc Natl Acad Sci EEUU
91:2315-2319, Shanna K y col., 1996 Mol Endocrinol
10:1688-1696). Esta es la primera demostración de
que los subtipos 2 y 5 de SSTR pueden actuar de forma antagonista en
la regulación del crecimiento celular.
Por tanto, los agonistas preferentes de los
SSTR2 y SSTR5 ejercen diferentes efectos sobre la proliferación de
la línea celular TT tiroidea medular humana in vitro, según
su selectividad específica por los SSTR específicos. La
proliferación de la línea celular TT se puede disminuir mediante los
agonistas selectivos de los SSTR2, pero no mediante los agonistas
de los SSTR5, y un agonista de los SSTR5 puede evitar los efectos
antiproliferativos mediados por los SSTR2. El papel inhibidor clave
de los SSTR2 sobre la proliferación de las células de los MTC
demuestra que análogos con afinidad y selectividad mejoradas a los
SSTR2 frente a los SSTR5 serían útiles como agentes
antiproliferativos en el tratamiento de los MTC.
\vskip1.000000\baselineskip
A
Según un aspecto la presente invención se
refiere a un compuesto de fórmula:
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
D-Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-
Abu-Cys)-Thr-NH_{2} o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Abu-Cys)-Thr-NH_{2} o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Según un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula:
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-
Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2} o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable de los mismos, para uso como agonista de los receptores de la somatostatina.
Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2} o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable de los mismos, para uso como agonista de los receptores de la somatostatina.
Según un aspecto adicional, la presente
invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula:
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo
(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable de los
mismos, como un agonista de los receptores de la somatostatina.
En una realización, dicho agonista de los
receptores de somatostatina es un agonista de los SSTR2.
Según un aspecto adicional la presente invención
se refiere a un compuesto de fórmula:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable del
mismo.
Según un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable del mismo,
para uso como agonista de los receptores de la somatostatina.
Según un aspecto adicional, la presente
invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula:
D-Phe-Phe-Trp-DTrp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable del mismo
como un agonista de los receptores de la somatostatina.
En una realización, dicho agonista de los
receptores de somatostatina es un agonista de los SSTR5.
\newpage
Tal como se usa en el presente documento,
"4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil"
indica la estructura:
La fig. 1 Movilización de calcio intracelular
mediada por SSTR2 in vitro .
Las células CHO-K 1, que
expresan los SSTR2 humanos, se cosecharon como se describe en el
apartado Materiales y Procedimientos y, a continuación, se añadieron
los análogos de la SS (10^{-7}-10^{-6} M) para
medición de la movilización de Ca^{2+} intracelular, expresada
como la relación entre la concentración de calcio intracelular
medida después de la adición de los análogos de la SS y el valor
observado a nivel basal. Las longitudes de onda de excitación y
emisión fueron de 340 y 510 nm, respectivamente. Los datos se
representan como la media \pm SEM;
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 2 Movilización de calcio intracelular
mediada por SSTR5 in vitro .
Las células CHO-K 1, que
expresan los SSTR5 humanos, se cosecharon como se describe en el
apartado Materiales y Procedimientos y, a continuación, se añadieron
los análogos de la SS (10^{-7}-10^{-6} M) para
medición de la movilización de Ca^{2+} intracelular, expresada
como la relación entre la concentración de calcio intracelular
medida después de la adición de los análogos de la SS (compuesto 1,
compuesto 5 y compuesto 6) y el valor observado a nivel basal. Las
longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 340 y 510 nm,
respectivamente. Los datos se representan como la media \pm
SEM.
Las estructuras de los compuestos que aparecen
en la figura 2 son las siguientes:
- Compuesto 1:
- D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
- Compuesto 2:
- ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
- Compuesto 3:
- 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
- Compuesto 4:
- 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
- Compuesto 5:
- D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2, y
- Compuesto 6:
- Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Nal-NH_{2};
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 3 Inhibición in vitro de la
movilización de calcio intracelular estimulada por SS con un
antagonista de los SSTR2.
Las células CHO-K1, que expresan
los SSTR2 humanos, se cosecharon como se describe en el apartado
Materiales y Procedimientos y, a continuación, se añadió el
compuesto 6 (10^{-9}-10^{-6} M) y SS (10 nM)
para medición del efecto del compuesto 6 sobre la movilización de
calcio intracelular estimulado por SS (10^{-8} M), y expresada
como el porcentaje frente a la SS sola. Las longitudes de onda de
excitación y emisión fueron de 340 y 510 nm, respectivamente. Los
datos se representan como la media \pm SEM;
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 4 Expresión de ARNm de receptores de
somatostatina en células TT.
El ARN extraído (1 \mug/reacción) se trato con
deoxiribonucleasa y se sometió a transcripción inversa usando
Oligo(dT) como cebador. Se incubaron muestras con enzima RT
como control. Alícuotas del ADNc generado y de los controles
negativos se sometieron a una posterior amplificación por PCR de los
SSTR usando los cebadores indicados en la tabla 1. Los productos de
la PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 2%. Los productos de
la PCR esperados de los SSTR 1-5 se representan en A
(columna M, marcador PCR; G, producto PCR de amplificación de
GAPDH);
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 5 Efecto de los análogos de la SS en
la incorporación de [^{3}H]thy en células TT.
Las células se incubaron en placas de 24
pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo suplementado con
análogos de la SS a diversas concentraciones (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7} y 10^{-6} M). Los pocillos de control se trataron una
disolución vehículo y la incorporación de [^{3}H]thy se
midió como radioactividad en el material precipitado con TCA. Los
datos de seis experimentos individuales evauluados
independientemente por cuadruplicado se expresan como el porcentaje
de la media \pm SEM de la inhibición de incorporación de
[^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar
*P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control;
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 6 Efecto de los análogos de la SS en
la proliferación de células TT.
Las células se incubaron en placas de 96
pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo suplementado con
análogos de la SS a diversas concentraciones (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7} y 10^{-6} M). Los pocillos de control se trataron con
una disolución vehículo. La proliferación de las células TT se midió
como absorbancia a 490 nM en cada pocillo. Los datos de seis
experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho
réplicas, expresados como el porcentaje de la media \pm SEM de la
inhibición de la proliferación celular frente a las células de
control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control;
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 7 Efecto de los antagonistas
selectivos de los SSTR2 sobre la incorporación de
[^{3}H]thy en células TT y proliferación celular durante el
tratamiento con agonistas de los SSTR2.
Panel superior: Las células se incubaron en
placas de 24 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con 100 nM del compuesto 1 o el compuesto 2, con o sin
compuesto 6 (10^{-7} M). Los pocillos de control se trataron con
una disolución vehículo. La incorporación de [^{3}H]thy se
midió como radioactividad en el material precipitado con TCA. Los
datos de seis experimentos individuales se evaluaron
independientemente con cuatro réplicas, expresados como el
porcentaje de la media \pm SEM de la inhibición de incorporación
de [^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar
*P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control.
Panel inferior: Las células se incubaron en
placas de 96 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con 10^{-7} M del compuesto 1 o el compuesto 2, con o
sin compuesto 6 (10^{-7} M). Los pocillos de control se trataron
con una disolución vehículo. La proliferación de las células TT se
midió como absorbancia a 490 nM en cada pocillo. Los datos de seis
experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho
réplicas, expresados como el porcentaje de la media \pm SEM de la
inhibición de la proliferación celular frente a las células de
control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control;
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 8 Efecto de los agonistas selectivos
de los SSTRS sobre la incorporación de [^{3}H]thy en
células TT y proliferación celular durante el tratamiento con un
agonista selectivo de los SSTR2.
Panel superior: Las células se incubaron en
placas de 24 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con el compuesto 2 (10^{-7} M) con o sin
concentraciones crecientes de compuesto 5 (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7} y 10^{-6} M ),
o con compuesto 5 (10^{-7} M) con o sin concentraciones decrecientes de compuesto 2 (10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} M ). Los pocillos de control se trataron con una disolución vehículo. La incorporación de [^{3}H]thy se midió como radioactividad en el material precipitado con TCA. Los datos de seis experimentos individuales se evaluaron independientemente con cuatro réplicas, expresados como el porcentaje de la media \pm SEM de la inhibición de incorporación de [^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control.
o con compuesto 5 (10^{-7} M) con o sin concentraciones decrecientes de compuesto 2 (10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} M ). Los pocillos de control se trataron con una disolución vehículo. La incorporación de [^{3}H]thy se midió como radioactividad en el material precipitado con TCA. Los datos de seis experimentos individuales se evaluaron independientemente con cuatro réplicas, expresados como el porcentaje de la media \pm SEM de la inhibición de incorporación de [^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control.
Panel inferior: Las células se incubaron en
placas de 96 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
suplementado con el compuesto 2 (10^{-7} M) con o sin
concentraciones crecientes de compuesto 5 (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7} y 10^{-6} M), o con compuesto 5 (10^{-7} M) con o sin
concentraciones decrecientes de compuesto 2 (10^{-6}, 10^{-7},
10^{-8} y 10^{-9} M ).
Los pocillos de control se trataron con una disolución vehículo y la proliferación de las células TT se midió como absorbancia a 490 nM en cada pocillo. Los datos de seis experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho réplicas, expresados como el porcentaje de la media \pm SEM de la inhibición de la proliferación celular frente a las células de control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control.
Los pocillos de control se trataron con una disolución vehículo y la proliferación de las células TT se midió como absorbancia a 490 nM en cada pocillo. Los datos de seis experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho réplicas, expresados como el porcentaje de la media \pm SEM de la inhibición de la proliferación celular frente a las células de control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente al control.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por un
experto en la materia a la cual pertenece esta invención.
Se han aislado diversos receptores (SSTR) de la
somatostatina, por ejemplo, SSTR-1,
SSTR-2, SSTR-3,
SSTR-4 y SSTR-5. Por tanto, un
agonista de somatostatina puede ser uno o más de un agonista de los
SSTR-1, agonista de los SSTR-2,
agonista de los SSTR-3, agonista de los
SSTR-4 o agonista de los SSTR-5. Un
agonista de los receptores tipo 2 de somatostatina (es decir,
agonista de los SSTR-2) significa un compuesto que
(1) tiene una elevada afinidad de unión (por ejemplo, Ki inferior a
100 nM o, preferiblemente, inferior a 10 nm o inferior a 1 nM) para
los SSTR-2 (por ejemplo, como se define en el ensayo
de unión a receptores descrito a continuación) y (2) disminuye la
velocidad de proliferación de las células de carcinoma tiroideo
medular (por ejemplo, como se muestra en el ensayo biológico
descrito a continuación). Un agonista selectivo de los receptores
tipo 2 de somatostatina significa un agonista de los receptores
tipo 2 de somatostatina que tiene una mayor afinidad de unión (es
decir, Ki menor) para los SSTR-2 que para los
SSTR-5. Un agonista selectivo de los receptores
tipo 5 de somatostatina significa un agonista de somatostatina que
(1) tiene una elevada afinidad de unión (por ejemplo, Ki inferior a
100 nM o, preferiblemente, inferior a 10 nm o inferior a 1 nM) para
los SSTR-5 (por ejemplo, como se define en el
ensayo de unión a receptores descrito a continuación) y (2) atenúa
la disminución inducida por el agonista de los
SSTR-2 de la velocidad de proliferación de las
células de carcinoma tiroideo medular (por ejemplo, como se muestra
en el ensayo biológico descrito a continuación). Un agonista
selectivo de los receptores tipo 5 de somatostatina significa un
agonista de los receptores tipo 5 de somatostatina que tiene una
mayor afinidad de unión (es decir, Ki menor) para los
SSTR-5 que para los SSTR-2.
En una realización, el agonista de los
SSTR-2 también es un agonista selectivo de los
SSTR-2. En otra realización, el agonista selectivo
de los SSTR2 tienen un valor de Ki para los SSTR-5
que es al menos 2 veces (por ejemplo, al menos 5 veces o al menos 10
veces) mayor que para el receptor SSTR-2 (por
ejemplo, como se define en el ensayo de unión a receptores descrito
a continuación).
Ejemplos de agonistas de los
SSTR-2 que se pueden usar para poner en práctica la
presente invención incluyen, pero no se limitan a:
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH _{2} ,
\+ \hskip1.2cm (compuesto 1),\cr \+\cr
ciclo [Tic - Tyr - D - Trp - Lys - Abu - Phe],
\+ \hskip1.2cm (compuesto 2),\cr \+\cr
4-(2 - hidroxietil) - 1 - piperazinilacetil - D - Phe - ciclo (Cys - Tyr - D - Trp - Lys - Abu - Cys) - Thr - NH _{2} ,
\+ \hskip1.2cm (compuesto 3),
y\cr}
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
(compuesto
4).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de agonista de los
SSTR-5 que se puede usar para poner en práctica la
presente invención incluye, pero no se limita a:
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH _{2} ,
\+ \hskip7cm (compuesto
5).\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos adicionales de agonistas de
somatostatina son los cubiertos por las fórmulas o los indicados
específicamente en las publicaciones expuestas a continuación.
Solicitud europea nº P5164EU (inventor: G.
Keri);
Van Binst, G. y col. Peptide Research 5:8
(1992);
Horvath, A. y col. Abstract, "Conformations of
Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity", 22nd European
peptide Symposium, Septiembre 13-19, 1992,
Interlaken, Suiza;
Solicitud PCT nº WO91/09056 (1991);
Solicitud europea nº 0363589A2 (1990);
Patente estadounidense nº 4.904.642 (1990);
Patente estadounidense nº 4.871.717 (1989);
Patente estadounidense nº 4.853.371 (1989);
Patente estadounidense nº 4.725.577 (1988);
Patente estadounidense nº 4.684.620 (1987);
Patente estadounidense nº 4.650.787 (1987);
Patente estadounidense nº 4.603.120 (1986);
Patente estadounidense nº 4.585.755 (1986);
Solicitud europea nº 0203031A2 (1986);
Patente estadounidense nº 4.522.813 (1985);
Patente estadounidense nº 4.486.415 (1984);
Patente estadounidense nº 4.485.101 (1984);
Patente estadounidense nº 4.435.385 (1984);
Patente estadounidense nº 4.395.403 (1983);
Patente estadounidense nº 4.369.179 (1983);
Patente estadounidense nº 4.360.516 (1982);
Patente estadounidense nº 4.358.439 (1982);
Patente estadounidense nº 4.328.214 (1982);
Patente estadounidense nº 4.316.890 (1982);
Patente estadounidense nº 4.310.518 (1982);
Patente estadounidense nº 4.291.022 (1981);
Patente estadounidense nº 4.238.481 (1980);
Patente estadounidense nº 4.235.886 (1980);
Patente estadounidense nº 4.224.199 (1980);
Patente estadounidense nº 4.211.693 (1980);
Patente estadounidense nº 4.190.648 (1980);
Patente estadounidense nº 4.146.612 (1979);
Patente estadounidense nº 4.133.782 (1979);
Patente estadounidense nº 5.506.339 (1996);
Patente estadounidense nº 4.261.885 (1981);
Patente estadounidense nº 4.728.638 (1988);
Patente estadounidense nº 4.282.143 (1981);
Patente estadounidense nº 4.215.039 (1980);
Patente estadounidense nº 4.209.426 (1980);
Patente estadounidense nº 4.190.575 (1980);
Patente europea nº 0389180 (1990);
Solicitud europea nº 0505680 (1982);
Solicitud europea nº 0083305 (1982);
Solicitud europea nº 0030920 (1980);
Solicitud PCT nº WO88/05052 (1988);
Solicitud PCT nº WO90/12811 (1990);
Solicitud PCT nº WO97/01579 (1997);
Solicitud PCT nº WO91/18016 (1991);
Solicitud del Reino Unido nº GB2.095.261 (1981);
y
Solicitud francesa nº FR2.522.655 (1983).
\vskip1.000000\baselineskip
Observe que para todos los agonistas de la
somatostatina descritos en el presente documento, cada residuo de
aminoácido representa la estructura
-NH-C(R)H-CO-, en la
que R es la cadena lateral (por ejemplo, CH_{3} para Ala). Las
líneas entre los residuos de aminoácidos representan enlaces
peptídicos que unen los aminoácidos. Además, el residuo
aminoacídico es ópticamente activo; es la configuración de la forma
L la que se pretende, a menos que se diseñe de forma expresa la
forma D. Para mayor claridad, los enlaces disulfuro (por ejemplo,
puente disulfuro) que existen entre dos tioles libres de los
residuos Cys no se muestran. Las abreviaturas de los aminoácidos
esenciales son según las recomendaciones de la
IUPAC-IUB.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos para sintetizar agonistas de
la somatostatina están bien documentados y están dentro de los
conocimientos de un experto en la materia.
La síntesis de secuencias cortas de aminoácidos
está bien establecida en la materia de los péptidos. Por ejemplo,
la síntesis de
HD-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
descrita anteriormente, se puede lograr siguiendo el protocolo
expuesto en el ejemplo I de la solicitud de patente europea
0395417A1. La síntesis de agonistas de la somatostatina con una
terminación N sustituida se puede lograr, por ejemplo, siguiendo el
protocolo expuesto en el documento WO88/02756, la solicitud de
patente europea nº 0329295 y la publicación PCT nº WO94/04752.
Algunos de los compuestos de la presente
invención pueden tener al menos un centro asimétrico. Puede haber
presentes centros asimétricos adicionales en la molécula dependiendo
de la naturaleza de los diversos sustituyentes de la molécula. Cada
centro asimétrico producirá dos isómeros ópticos y está previsto que
todos tales isómeros ópticos, como isómeros ópticos separados,
puros o parcialmente purificados, mezclas racémicas o mezclas de
diastereómeros, estén incluidos dentro del alcance de la presente
invención.
Los compuestos de la presente invención
generalmente se pueden aislar en forma de sus sales de adición ácida
farmacéuticamente aceptables, tales como las sales derivadas del
uso de ácidos inorgánicos u orgánicos. Ejemplos de tales ácidos son
clorhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, fórmico, acético,
trifluoroacético, propiónico, maléico, succínico,
D-tartárico, L-tartárico, malónico,
metanosulfónico y similares. Además, se pueden asilar determinados
compuestos que contienen funciones ácidas tales como un carboxi en
forma de su sal inorgánica, en la que el contraión se puede
seleccionar de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio y similares,
así como de bases orgánicas.
Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden
formar tomando aproximadamente 1 equivalente de un agonista de los
SSTR-2, por ejemplo, el compuesto 1, y poniéndolo en
contacto con aproximadamente 1 equivalente o más del ácido adecuado
correspondiente de la sal que se desea. La formación y el
aislamiento de la sal resultante son muy conocidos por los expertos
en la materia.
Los compuestos de esta invención se pueden
administrar por vías de administración oral, parenteral (por
ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o
subcutánea, o implante), nasal, vaginal, rectal, sublingual o
tópica, y se puede formular con vehículos farmacéuticamente
aceptables para proporcionar formas de presentación adecuadas para
cada vía de administración. Por consiguiente, la presente invención
incluye dentro de su alcance composiciones farmacéuticas que
comprenden, como un ingrediente activo, al menos un agonista de los
SSTR-2 en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Las formas de presentación sólidas para
administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas,
polvos y gránulos. En tales formas de presentación sólidas, el
compuesto activo está mezclado con al menos un vehículo inerte
farmacéuticamente aceptable tal como sacarosa, lactosa o almidón.
Tales formas de presentación pueden comprender también, como en la
práctica habitual, sustancias adicionales diferentes a los
diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como
estearato de magnesio. En caso de cápsulas, comprimidos y pastillas,
las formas de presentación pueden comprender también agentes
tampón. Los comprimidos y pastillas se pueden preparar
adicionalmente con recubrimientos entéricos.
Las formas de presentación líquidas para
administración oral incluyen emulsiones, disoluciones, suspensiones
y jarabes farmacéuticamente aceptables, conteniendo los elixires
diluyentes habitualmente usados en la técnica, tales como agua.
Además de tales diluyentes inertes, las composiciones también
incluyen adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes
emulsificantes y de suspensión, y agentes edulcorantes,
potenciadores del sabor y aromatizantes.
\newpage
Las preparaciones según esta invención para
administración parenteral incluyen disoluciones estériles acuosas o
no acuosas, suspensiones o emulsiones. Ejemplos de disolventes o
vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites
vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y
esteres orgánicos inyectables, tales como etiloleato. Tales formas
de presentación también pueden contener adyuvantes tales como
agentes conservantes, humectantes, emulsificantes y dispersantes. Se
pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un
filtro de retención de bacterias, mediante incorporación de agentes
esterilizantes en las composiciones, mediante irradiación de las
composiciones o calentando las composiciones. También se pueden
fabricar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden
disolver en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril
inmediatamente antes de su uso.
Composiciones para administración rectal o
vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener, además
de la sustancia activa, excipientes tales como mantequilla de coco
o una cera para supositorios.
Composiciones para administración nasal o
sublingual también se preparan con excipientes estándar muy
conocidos en la técnica.
En general, la dosis eficaz de ingrediente
activo en las composiciones de esta invención puede variar; sin
embargo, es necesario que la cantidad de ingrediente activo sea tal
que se obtenga una dosis adecuada. La dosis seleccionada depende
del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la
duración del tratamiento, todo lo cual está dentro de la esfera de
conocimientos de un experto en la materia. Generalmente, niveles de
dosis diarias entre 0,0001 y 100 mg/kg de peso corporal se
administran a los humanos y otros animales, por ejemplo,
mamíferos.
Un intervalo de dosis diaria preferible es de
0,01 a 10,0 mg/kg de peso corporal, que se puede administrar en una
única dosis o en múltiples dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis por RT-PCR se uso
para demostrar que todos los ARNm de los cinco subtipos de SSTR se
expresan en una línea celular TT humana de MTC. La capacidad los
análogos de la SS con diferente afinidad y especificidad por los
SSTR subtipos 2 y 5 para influir en la actividad proliferativa de
las células TT se puede evaluar considerando la incorporación de
[^{3}H]thy, considerada una medida indirecta de la
actividad sintética del ADN y del número de células viables.
Todos los agonistas preferentes de los SSTR2
fueron capaces de suprimir significativamente el número de células
TT a concentraciones que variaban entre 10^{-9} M y 10^{-6} M.
El compuesto 3 y el compuesto 4 disminuyeron significativamente
(p<0,05) la incorporación de [^{3}H]thy para 10^{-9} M
pero no para 10^{-8} M y 10^{-7} M, cuando su efecto máximo
inhibitorio en el número de células era evidente. Cada compuesto
para los SSTR2 ensayado mostró una tendencia de disminución de
eficacia a concentraciones crecientes; sin embargo, las curvas de
respuesta con forma de campana son habituales para la SS. La
inhibición de la incorporación de [^{3}H]thy y el número
de células TT por el compuesto 1 y el compuesto 2 para 10^{-7} M
no se asoció con ninguna acción citotóxica, como se demostró
mediante tinción con azul Trypan. Además, este efecto fue
completamente contrarrestado por el co-tratamiento
de las células TT con el compuesto 6, un antagonista selectivo de
los SSTR2. Considerándolos conjuntamente, estos resultados indican
que los análogos de la SS con selectividad preferente por los SSTR2
inhiben la proliferación de células TT mediante interacción
específica con los SSTR2.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular TT se obtuvo de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA, EEUU). La línea
celular TT está constituida por células parafoliculares
transformadas aneuploides que producen CT, que están caracterizadas
por la presencia de una mutación TGC por TGG (Cys por Trp) en el
exón 11 codon 634 del protooncogen RET (Cooley LD y col., 1995
Cancer Genet Cytogenet 80:138-149), Una
característica que confirmamos en la línea celular con la que
trabajamos. Además, la línea celular TT muestra una expresión
reducida del gen supresor de tumores p53 (Velasco JA y col., 1997
Int J Cancer 73:449-455). Los estudios
inmunohistoquímicos demostraron que las células TT expresan CT y el
receptor de CT (Frendo JL y col., 1994 FEBS Lett.
342:214-216), antigen
carcino-embriónico (CEA), SS, neurotensina, péptido
liberador de gastrina (GRP), Leu- y Met-encefalina,
péptido liberador de hormona paratiroidea (PTHrp), cromogranina A,
SP-I, sinaptofisina, enolasa específica para
neuronas (NSE), receptor de 1,25-dihidroxivitamina
D3, tirosinhidroxilasa, \alpha-tubulina y
citoqueratina (Zabel M y col., 1995 Histochemical J.
27:859-868). Las células TT secretan una cantidad
significativa de CT y responden a cambios en los niveles de calcio
ionizado (Zabel M y col., 1992 Histochemistry
102:323-327). Por tanto, la línea celular TT es
adecuada para estudios sobre la función parafolicular y respuestas a
estímulos endocrinos y farmacológicos.
Las células se mantuvieron en una mezcla de
medio nutritivo de Ham F12 con glutamina (EuroClone Ltd, Torquay,
RU), suplementado con el 10% de suero bovino fetal (FBS, Life
Technologies, Milano, Italia), 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de
estreptomicina y 100 \mug/mL de amfotericina (EuroClone Ltd,
Torquay, RU) a 37ºC en atmósfera humidificada con el 5% de CO_{2}
y el 95% de aire.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total se extrajo de las células TT
sub-confluyentes usando TRIZOL (Life Technologies,
Milano, Italia). El protocolo con TRIZOL es una modificación de la
extracción con guanidinio/fenol. Brevemente, el medio celular
cultivado se aspiró y las células se lavaron con I x PBS. Se añadió
el reactivo TRIZOL y las células se lisaron a temperatura ambiente
durante 10 min. Se añadió cloroformo a la mezcla de TRIZOL/lisado
celular y se dejó reposar durante 2-3 min y, a
continuación, se centrifugó a 12000 x g durante 15 min. Se retiró la
capa acuosa de la mezcla centrifugada. Se añadió isopropanol para
precipitar el ARN, se recogió el pellet, se lavó con etanol al 75%
y se secó al aire. El ARN total se resuspendió en agua tratada con
dietilpirocarbonato (DEPC) y se cuantificó usando
espectrofotometría UV a 260 nM. Para evitar la contaminación del
ADN, el ARN se trató con deoxiribonucleasa sin ribonucleasa
(Promega, Milano, Italia).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando un kit de síntesis de primera hebra de
ADN complementario (ADNc) (Sistema de
Pre-amplificación SuperScript para síntesis de
primera hebra de ADNc, Life Technologies, Milano, Italia), se
realizó la transcripción inversa de 1 \mug de ARN total según el
protocolo del fabricante. La mezcla para RT en tubos de PCR se
cubrió con 50 \mul de aceite mineral blanca ligera
(Sigma-Aldrich Corp. Milano, Italia); la RT se llevo
a cabo en el Miniciclador (MJ Research Inc., Watertown, MA, EEUU)
usando un programa con los parámetros siguientes: 10 min a 70ºC, 1
min a 4ºC, 5 min a 4ºC. Después de suplementarla con SuperScript II,
la reacción se completó a 42ºC durante 50 min y, a continuación, a
70ºC durante 15 min. Las muestras se sometieron a digestión con
ARNasa H (Promega, Milano, Italia) a 37ºC durante 20 min y, a
continuación, se almacenaron a -20ºC hasta la primera PCR.
El ADNc (1 \mul de reacción RT) se amplificó
entones por PCR con 1 U de Taq ADN polimerasa (Life Technologies,
Milano, Italia) en las condiciones recomendadas por los proveedores
en una mezcla de reacción de 50 \mul. Después de la
desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min, las reacciones de
PCR se llevaron a cabo usando los cebadores nucleotídicos y las
condiciones enumerados en la tabla 1, que describe el tamaño de los
fragmentos esperados. Los productos de la PCR se analizaron en un
gel de agarosa al 2% y se observaron mediante tinción con bromuro
de etidio (ETB). Para garantizar que no se producía contaminación
durante el procedimiento de RT-PCR, se prepararon
dos tipos de controles negativos. El primer control negativo se
preparó suprimiendo el ARN total en la RT. El segundo se preparó
sustituyendo la mezcla de ADNc por agua en la reacción PCR. La PCR
se consideró útil solo si no se observaba ninguna banda en las
columnas del control negativo en un gel de agarosa al 2%. Cada
producto de PCR se sometió a digestión con enzimas de restricción y
se analizó en un gel de agarosa al 2% para confirmar adicionalmente
la identificación de los amplicones.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de la SS usados en este estudio y
sus respectivas afinidades por los diferentes SSTR se enumeran en
la tabla 2. Cada compuesto, proporcionado por Biomeasure
Incorporated (Milford, MA, EEUU), se resuspendió en ácido acético
0,01 N que contenía un 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) para
proporcionar una solubilidad uniforme y evitar la unión no
específica a las diversas superficies de preparación. La
especificidad y selectividad de los análogos se determinó mediante
un ensayo de unión con radio-ligandos en células
CHO-K I trasfectadas de forma estable con cada uno
de los subtipos de SSTR, como se indica a continuación.
Las secuencias de codificación completas de los
fragmentos genómicos de los genes de los SSTR 1, 2, 3 y 4 y un clon
del ADNc para los SSTR 5 se subclonaron en el vector de expresión de
mamíferos pCMV (Life Technologies, Milano, Italia). Se obtuvieron
líneas celulares clonales que expresaban de forma estable los SSTR
1-5 mediante transfección en células
CHO-K1 I (ATCC, Manassas, Va, EEUU) usando el
procedimiento de co-precipitación con fosfato de
calcio (Davis L y col., 1994 In: Basic methods in Molecular Biology,
2ª edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT, EEUU:
611-646). Se incluyó el plásmido
pRSV-neo (ATCC) como un marcador seleccionable. Las
líneas celulares clonales se seleccionaron en un medio RPMI 1640
que contenía 0,5 mg/ml de G418 (Life Technologies, Milano, Italia),
se clonaron en anillo y se expandieron por cultivo.
Las membranas para los ensayos de unión a
receptores in vitro se obtuvieron homogeneizando las células
CHO-K1 que expresan los subtipos de SSTR en
Tris-HCl 50 mM helado y centrifugándolas dos veces a
39000 g (10 min) con una resuspensión intermedia en tampón nuevo.
Los pellets finales se resuspendieron en Tris-HCl 10
mM para su ensayo. Para los ensayos con los SSTR 1, 3, 4 y 5, se
incubaron alícuotas de las preparaciones de membranas 90 min. a
25ºC con
[^{125}I-Tyr11]SS-14 0,05
nM en HEPES 50 mM (pH 7,4) que contenía 10 mg/ml de BSA, MgCl_{2}
5 mM, 200 KIU/ml de Trasylol, 0,02 mg/ml de bacitracina y 0,02 mg/ml
de fluoruro de fenilmetilsufonilo. El volumen final de ensayo fue
de 0,3 ml. Para el ensayo de los SSTR 2, se usó
[^{125}I]MK-678 0,05 nM como el
radio-ligando y el tiempo de incubación fue de 90
min a 25ºC. Las incubaciones se terminaron mediante filtración
rápida a través de filtros GF/C (pre-empapados en
polietilenimina al 0,3%) usando un colector de filtración de
Brandel. Cada tubo y filtro se lavaron entonces tres veces con
alícuotas de 5 ml de tampón helado. La unión específica se definió
como las uniones totales a radio-ligandos menos esas
uniones en presencia de SS-14 1000 nM para los SSTR
1, 3, 4 y 5, o MK-678 1000 nM para los SSTR2.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad biológica de los agonistas y
antagonistas selectivos de los SSTR se evaluó mediante el ensayo de
movilización de calcio en células CHO-K1 que
expresan los SSTR2 o SSTR5 humanos. Las células se cosecharon
mediante incubación en una disolución salina tampón EDTA/fosfato al
0,3% (25ºC) y se lavaron dos veces mediante centrifugación. Las
células lavadas se resuspendieron en disolución salina tampón de
Hank (HBSS) para cargar el indicador fluorescente de Ca^{2+}
Fura-2AM. Las suspensiones celulares
(aproximadamente 10^{6} células/ml) se incubaron con
Fura-2AM 2 mM durante 30 min. a 25ºC. El
Fura-2AM no cargado se eliminó mediante
centrifugación dos veces en HBBS y las suspensiones finales se
transfirieron a un espectrofluorómetro (Hitachi
F-2000) equipado con un mecanismo de agitación
magnética y un porta-cubetas con control de
temperatura. Después de equilibrio a 37ºC, se añadieron los
análogos de la SS para medición de la movilización de Ca^{2+}
intracelular. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron
de 340 y 510 nm, respectivamente. En las células que expresaban los
SSTR2 (figura 1), el compuesto 2 y el compuesto 1 estimularon
significativamente la movilización de Ca^{2+} intracelular
(indicada como la relación entre el valor estimulado y el basal),
mientras que el compuesto 6 no lo hacía, a las concentraciones
ensayadas. Además, el compuesto 4 y el compuesto 3 también eran muy
potentes estimulando la movilización de Ca^{2+}. En las células
que expresaban los SSTR5 (figura 2), el compuesto 5 y el compuesto
1 estimularon significativamente la movilización de Ca^{2+}
intracelular, mientras que el compuesto 6 mostraba una ligera
actividad agonista en el intervalo de 300 a 1000 nM. En las células
que expresaban los SSTR2 (figura 3), el compuesto 6 inhibió la
movilización de Ca^{2+} intracelular inducida por SS en las
células que expresaban los SSTR2 de forma dependiente de la dosis
con supresión total de la acción de la SS a aproximadamente
10^{-7} M. Por tanto, la evaluación de la movilización de
Ca^{2+} intracelular demostró que la actividad biológica de cada
uno de los diversos análogos era función de su perfil de unión a los
receptores.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos de los agonistas y antagonistas
selectivos de los SSTR sobre la síntesis de ADN en células TT se
evaluaron determinando la velocidad de incorporación de
[^{3}H]timidina ([^{3}H]thy), como se describió
anteriormente (Davis L y col., 1994 En: Basic methods in Molecular
Biology, 2ª edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT,
EEUU:611-646, degli Uberti EC y col., 1991 J Clin
Endocrinol Metab 72:1364-1371). Las células se
colocaron en placas de 24 pocillos (10^{5} células/pocillo) y se
incubaron durante 48 horas en un medio suplementado con FBS al 10%
en presencia de [^{3}H]thy (1,5 \muCi/mL; 87 Ci/mmol) con
o sin cada análogo de la SS a concentraciones que variaban de
10^{-6} a 10^{-9} M. Los tratamientos se renovaron añadiendo
análogos nuevos a los pocillos después de las primeras 24 h de
incubación, sin retirar el medio.
Después de incubación, las células se lavaron
tres veces con PBS helado y dos veces con ácido tricloroacético
(TCA) al 10%. El material precipitado con TCA se solubilizó en 500
\mul de hidróxido de sodio 0,2 mol/L y SDS al 0,1%. La
radioactividad asociada a las células se midió entonces en un
espectrómetro de centelleo. Los resultados (cuentas por min. por
pocillo) se obtuvieron determinando el valor medio de al menos seis
experimentos por cuadruplicado. La viabilidad de las células TT en
los cultivos de control y los tratados se evaluó mediante tinción
con azul Trypan tanto después de 24 como de 48 horas, y el número de
células viables fue siempre del 85-95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos de los agonistas y antagonistas
selectivos de los SSTR sobre la proliferación de células TT se
evaluaron mediante el ensayo de proliferación celular no radioactivo
acuoso CELLTITER 96 (Promega, Milano, Italia), un procedimiento
colorimétrico para la determinación del número de células viable en
ensayos de proliferación. El ensayo contiene disoluciones de un
compuesto de tetrazolio (reactivo de Owen; MTS) y un reactivo de
acoplamiento electrónico (metosulfato de fenazina; PMS). El MTS es
bio-reducido por las células para dar formazán, que
es soluble en el medio de cultivo tisular. La absorbancia del
formazán a 490 nm se puede medir directamente en las placas de
ensayo de 96 pocillos (Zatelli MC y col., 2000 J Clin Endocrinol
Metab 85: 847-852; Cory AH y col., 1991 Cancer
Commun 3: 207-212). La conversión de MTS en formazán
soluble acuoso se logra con las enzimas deshidrogenasa encontradas
en las células metabólicamente activas. La cantidad de producto
formazán, medida como la cantidad de absorbancia a 490 nm, es
directamente proporcional al número de células vivas en cultivo.
Brevemente, las células TT se colocaron en placas de 96 pocillos (2
x 10^{4} células/pocillo) y se incubaron durante 48 horas en un
medio suplementado con FBS al 10% en presencia o ausencia de cada
análogo de la SS a concentraciones que variaban de 10^{-6} a
10^{-9} M. Los tratamientos se renovaron añadiendo análogos
nuevos a los pocillos después de las primeras 24 h de incubación. Al
final del periodo de incubación, se añadieron a cada pocillo 20
\mul de una disolución combinada de MTS/PMS con una pipeta
repetida y las placas se incubaron durante 4 horas adicionales a
37ºC en una atmósfera humidificada con el 5% de CO_{2}. La
absorbancia a 490 nm se registró entonces usando un lector de placas
ELISA (EASIA Reader, Medgenix, Camarillo, CA). Los resultados
(absorbancia a 490 nm) se obtuvieron determinando el valor medio de
al menos seis experimentos de 8 réplicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprender el papel individual de los
subtipos SSTR2 y SSTR5 en el control de la proliferación de las
células C parafoliculares, evaluamos si las células TT expresaban
los SSTR que podrían mediar una respuesta potencial a compuestos
selectivos para subtipos de SSTR individuales. Para resolver esta
cuestión, aislamos ARN total de las células TT cultivadas y
llevamos a cabo reacciones RTPCR en las condiciones descritas en el
apartado Materiales y Procedimientos. La integridad del ADNc se
garantizó por la presencia de la señal de GAPDH. La ausencia de
contaminación de ADN genómico en las muestras de ADNc se evaluó por
la falta de amplificación en una reacción PCR usando muestras sin
transcripción inversa. La amplificación positiva de los SSTR1, 2,
3, 4 y 5 se encontró en la línea celular examinada (fig. 4),
demostrando que estos receptores se expresan en la línea celular TT
humana de MTC. La demostración de que la línea celular TT expresa de
forma estable los subtipos de SSTR hizo que este sistema de modelo
celular fuera adecuado para evaluar la acción de análogos de la SS
selectivos al receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores de incorporación de
[^{3}H]Thy obtenidos con concentraciones de 10^{-9} a
10^{-6} M de agonistas preferentes de los SSTR2 (compuesto 1,
compuesto 2, compuesto 3 y compuesto 4), un agonista preferente de
los SSTR5 (compuesto 5) y un antagonista preferente de los SSTR2
(compuesto 6) se presentan en la figura 5. Como se indica, el
compuesto 2 suprimió significativamente la incorporación de
[3H]thy en un 58-23% para concentraciones
que variaban entre 10^{-9} M y 10^{-7} M. El compuesto I
suprimió significativamente la incorporación de [^{3}H]thy
en un 41-21% para concentraciones que variaban entre
10^{-9} M y 10^{-6} M. La incorporación de [^{3}H]thy
también disminuyó significativamente con el compuesto 4 (-13%, p<
0,05) y el compuesto 3 (-17%, p<0,05) para 10^{-9} M. En
contraposición, el compuesto 5 aumentó significativamente la
incorporación de [^{3}H]thy en células TT en un
80-175 %. El antagonista selectivo de los SSTR2, el
compuesto 6, no modificó la incorporación de [^{3}H]thy en
células TT en comparación con las células de control sin tratar.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar con más detalle la actividad de
los análogos de la SS en el crecimiento de células TT, se analizó
también su efecto en el número de células viables. Los efectos de
los agonistas preferentes de los SSTR2, un agonista preferente de
los SSTR5 y un antagonista preferente de los SSTR2 en el número de
células TT viables a concentraciones que variaban entre 10^{-9} M
y 10^{-6} M se representan en la figura 6. Como se indica, todos
los compuestos preferentes de los SSTR2 inhibían significativamente
la proliferación celular en comparación con las células de control
sin tratar a cada concentración ensayada. El agonista selectivo de
los SSTR5, el compuesto 5, produjo un ligero aumento de la
proliferación de células TT (hasta el 11% para 10^{-8} M); sin
embargo, esto no representa una diferencia estadística respecto a
las células de control sin tratar. El antagonista selectivo de los
SSTR2, el compuesto 6, pareció no afectar al crecimiento de las
células TT a las concentraciones ensayadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aclarar adicionalmente si los SSTR2 están
específicamente involucrados en la mediación de la actividad
antiproliferativa de los agonistas preferentes de los SSTR2, se
evaluaron la incorporación de [^{3}H]thy y el crecimiento
celular en células TT expuestas durante 48 horas al compuesto 1 y al
compuesto 2, cada uno bien solo (10^{-7} M) o bien en combinación
con el compuesto 6, un antagonista preferente de los SSTR2, a
concentración equimolar (10^{-7} M). La inhibición de la
incorporación de [^{3}H]thy inducida tanto por el
compuesto 1 como por el compuesto 2 fue suprimida por
co-tratamiento de las células TT con el compuesto 6
(figura 7, panel superior). La inhibición de la proliferación de
células TT inducida por el compuesto 1 se redujo significativamente
del 46% al 10% por co-tratamiento con el compuesto
6. Además, el compuesto 6 pareció bloquear completamente la
actividad antiproliferativa del compuesto 2 (figura 7, panel
inferior). Por tanto, la implicación específica de los SSTR2 en la
mediación del efecto inhibitorio de un agonista de los SSTR2 en la
proliferación de células TT queda claramente demostrada.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar los efectos de un agonista de los
SSTR2 y un agonista de los SSTR5 en combinación y la incorporación
de [^{3}H]thy en células TT y la proliferación se
examinaron ensayando el compuesto 2 y el compuesto 5 para 10^{-7}
M en combinación con dosis crecientes (de 10^{-9} M a 10^{-6} M)
del otro compuesto. Los resultados se resumen en la figura 8.
Concentraciones crecientes del agonista de los SSTR5 (10^{-9} M a
10^{-6} M) evitaban en función de la dosis la supresión de la
incorporación de [^{3}H]thy en células TT (figura 8, panel
superior) y la proliferación (figura 8, panel inferior) producidas
por el agonista de los SSTR2 (10^{-7} M). Estos datos demuestran
un antagonismo entre los efectos mediados por SSTR5 y SSTR2 sobre la
proliferación.
La afinidad de los subtipos se determinó
mediante ensayos de unión a receptores de membrana con radio
ligandos en células de ovarios de hámsteres chinos que expresaban el
gen SSR2 o ADNc de SSR5 humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es solo para utilidad del lector. No forma parte del
documento de patente europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la
recopilación de las referencias, no se puede excluir la posibilidad
de errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este
respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet EP P5164 A [0023]
- \bullet US 4211693 A [0024]
- \bullet WO 9109056 A [0024]
- \bullet US 4190648 A [0024]
- \bullet EP 0363589 A2 [0024]
- \bullet US 4146612 A [0024]
- \bullet US 4904642 A [0024]
- \bullet US 4133782 A [0024]
- \bullet US 4871717 A [0024]
- \bullet US 5506339 A [0024]
- \bullet US 4853371 A [0024]
- \bullet US 4261885 A [0024]
- \bullet US 4725577 A [0024]
- \bullet US 4728638 A [0024]
- \bullet US 4684620 A [0024]
- \bullet US 4282143 A [0024]
- \bullet US 4650787 A [0024]
- \bullet US 4215039 A [0024]
- \bullet US 4603120 A [0024]
- \bullet US 4209426 A [0024]
- \bullet US 4585755 A [0024]
- \bullet US 4190575 A [0024]
- \bullet EP 0203031 A2 [0024]
- \bullet EP 0389180 A [0024]
- \bullet US 4522813 A [0024]
- \bullet EP 0505680 A [0024]
- \bullet US 4486415 A [0024]
- \bullet EP 0083305 A [0024]
- \bullet US 4485101 A [0024]
- \bullet EP 0030920 A [0024]
- \bullet US 4435385 A [0024]
- \bullet WO 8805052 A [0024]
- \bullet US 4395403 A [0024]
- \bullet WO 9012811 A [0024]
- \bullet US 4369179 A [0024]
- \bullet WO 9701579 A [0024]
- \bullet US 4360516 A [0024]
- \bullet WO 9118016 A [0024]
- \bullet US 4358439 A [0024]
- \bullet GB 2095261 A [0024]
- \bullet US 4328214 A [0024]
- \bullet FR 2522655 [0024]
- \bullet US 4316890 A [0024]
- \bullet EP 0395417 A1 [0027]
- \bullet US 4310518 A [0024]
- \bullet WO 8802756 A [0027]
- \bullet US 4291022 A [0024]
- \bullet EP 0329295 A [0027]
- \bullet US 4238481 A [0024]
- \bullet WO 9404752 A [0027]
- \bullet US 4235886 A [0024]
- \bullet US 10469835 B [0059]
- \bullet US 4224199 A [0024]
- {}\hskip0.2cm [0060]
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletReubi JC y col. Cancer
Res, vol. 47, 551-558 [0001]
\bulletReisine T y col. Endocrine
Review, vol. 16, 427-442 [0001]
\bulletLamberts SW y col. Endocr
Rev, vol. 12, 450-482 [0001] [0002]
\bulletPatel YC. Front
Neuroendocrinology, 1999, vol. 20,
157-198 [0001] [0002] [0006]
\bulletBuscail L y col. Proc Natl
Acad Sci EEUU, 1995, vol. 92, 1580-1584
[0002] [0006]
\bulletBuscail L y col. Proc Natl
Acad Sci EEUU, 1994, vol. 91, 2315-2319
[0002] [0006]
\bulletFlorio T y col. Mol
Endocrinol, 1999, vol. 13, 24-37
[0002]
\bulletSharma K y col. Mol
Endocrinol, 1999, vol. 13, 82-90
[0002]
\bulletSharma K y col. Mol
Endocrinol, 1996, vol. 10, 1688-1696
[0002]
\bulletWeckbecker G y col.
Pharmacol Ther, vol. 60, 245-264 [0002]
\bulletBell GI; Reisine T.
Trends Neurosci, 1993, vol. 16, 34-38
[0002]
\bulletPatel YC y col. Biochem
Biophys Res Commun, vol. 198, 605-612 [0002]
\bulletLaw SF y col. Cell
Signal, vol. 7, 1-8 [0002]
\bulletVirgolini I y col. Eur J
Clin Invest, vol. 27, 645-647 [0002]
\bulletRaynor y col. Molecular
Pharmacol., 1993, vol. 43, 838 [0003]
\bulletLloyd y col. Am. J.
Physiol., 1995, vol. 268, G102 [0003]
\bulletCoy y col. AM. J.
PHYSIOL., 1993, vol. 197, 366-371
[0003]
\bulletMoreau JP y col.
Metabolism, vol. 45 (8), 24-26 [0004]
\bulletMato E y col. J Clin
Endocrinol Metab, vol. 83, 2417-2420 [0004]
\bulletMahler C y col. Clin
Endocrinol, vol. 33, 261-9 [0004]
\bulletLupoli G y col. Cancer,
vol. 78, 1114-8 [0004]
\bulletSmid WM y col. Neth J
Med, vol. 40, 240-243 [0004]
\bulletZabel M y col.
Histochemistry, 1992, vol. 102, 323-327
[0005] [0041]
\bulletGagel RF y col.
Endocrinology, 1986, vol. 118, 1643-1651
[0005]
\bulletLiu JL y col.
Endocrinology, 1995, vol. 136, 2389-2396
[0005]
\bulletJordan BA y col. Nature,
1999, vol. 399, 697-700 [0006]
\bulletRocheville M y col. J. Biol.
Chem., 2000, vol. 275, 7862-7869
[0006]
\bulletShimon I y col. J. Clinical
Invest., 1997, vol. 100, 2386-2392
[0006]
\bulletJaquet P y col. J Clin
Endocrinol Metab., 2000, vol. 85, 781-792
[0006]
\bulletShanna K y col. Mol
Endocrinol, 1996, vol. 10, 1688-1696
[0006]
\bullet Van Binst, G. y col. Peptide
Research, 1992, vol. 5, 8 [0023]
\bulletHorvath, A. y col.
Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity.
22nd European peptide Symposium, 13 September 1992 [0024]
\bulletCooley LD y col. Cancer
Genet Cytogenet, 1995, vol. 80, 138-149
[0041]
\bulletVelasco JA y col. Int J
Cancer, 1997, vol. 73, 449-455 [0041]
\bulletFrendo JL y col. FEBS
Lett., 1994, vol. 342, 214-216 [0041]
\bulletZabel M y col. Histochemical
J., 1995, vol. 27, 859-868 [0041]
\bulletDavis L y col. Basic methods
in Molecular Biology. Appleton & Lange, 1994,
611-646 [0047] [0050]
\bulletUberti EC y col. J Clin
Endocrinol Metab, 1991, vol. 72,
1364-1371 [0050]
\bulletZatelli MC y col. J Clin
Endocrinol Metab, 2000, vol. 85, 847-852
[0052]
\bulletCory AH y col. Cancer
Commun, 1991, vol. 3, 207-212 [0052]
<110> Degli uberti, Ettore C
\hskip1cmZatelli, Maria C
\hskip1cmCuller, Michael D
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de modulación de la
proliferación de células de carcinoma tiroideo medular
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BIO-101.1P US
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 10/469.835
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-09-05
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MIS_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Nal
(D-naftil alanina)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es un aminoácido no natural,
Tic (ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Abu (ácido
2-aminobutírico)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> modificación:
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MIST_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Abu (ácido
2-aminobutírico)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Phe
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MIS_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Abu (ácido
2-amino butírico)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es
p-c1-Phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Cys
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es
L-3-(pirid-4-il)alanilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Nal
(2-naftil alalina)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
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<400> 6
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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<400> 7
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\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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<400> 9
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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<400> 10
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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<210> 13
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacacgctgg tcatctacgt ggt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagacactggt gaactggttg ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgacccctt cattgacctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtggtcgt tgagggcaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Degli uberti, Ettore C
\hskip1cmzatelli, Maria C
\hskip1cmCuller, Michael D
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de modulación de la
proliferación de células de carcinoma tiroideo medular
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BIO-101.1P US
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 10/469.835
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-09-05
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Nal
(D-naftil alanina)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es un aminoácido no natural,
Tic (ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Abu (ácido
2-amino butírico)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> modificación:
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Abu (ácido
2-amino butírico)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Abu (ácido
2-amino butírico)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es
p-cl-phe
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFUR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido cíclico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Cys
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es
L-3-(pirid-4-il)alanilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuo es Nal
(2-naftil alalina)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccggttga ctattacgcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctcactt ctaccattgt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgaagtcc tctggaatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattgccag tagacagagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatctgcct ctgctacctg
\hfill20
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcccaaag aaggcaggct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcagtctt cgtggtctac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatcaaggt cggtcacgac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacacgctgg tcatctacgt ggt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagacactggt gaactggttg ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgacccctt cattgacctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtggtcgt tgagggcaat
\hfill20
Claims (10)
1. Un compuesto de fórmula:
ciclo[Tic-Tyr
D-Trp-Lys-Abu-Phe];
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto de fórmula:
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable de los mismos, para uso como agonista de los receptores de
somatostatina.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un compuesto según la reivindicación 2, en el
que dicho agonista de los receptores de somatostatina es un agonista
de los SSTR2.
4. El uso de un compuesto de fórmula:
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etanosulfonil-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable de los mismos para la fabricación de un medicamento para
uso como un agonista de los receptores de somatostatina.
\vskip1.000000\baselineskip
5. El uso según la reivindicación 4, en el que
dicho agonista de los receptores de somatostatina es un agonista de
los SSTR2.
6. Un compuesto de fórmula:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un compuesto de fórmula:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable del mismo, para uso como agonista de los receptores de la
somatostatina.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un compuesto para uso según la reivindicación
7, en el que dicho agonista de los receptores de somatostatina es un
agonista de los SSTR5.
9. El uso de un compuesto de fórmula:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
o una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para uso
como un agonista de los receptores de la somatostatina.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El uso según la reivindicación 9, en el que
dicho agonista de los receptores de somatostatina es un agonista de
los SSTR5.
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| ES07006462T Expired - Lifetime ES2345280T3 (es) | 2001-03-06 | 2002-03-06 | Procedimiento de modulacion de la proliferacion de celulas de carcinoma tiroideo medular. |
| ES07006463T Expired - Lifetime ES2328077T3 (es) | 2001-03-06 | 2002-03-06 | Procedimiento de modulacion de la proliferacion de celulas de carcinoma tiroideo medular. |
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|---|---|---|---|---|
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| CA2743731C (en) * | 2001-03-06 | 2014-05-06 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Method of modulating the proliferation of medullary thyroid carcinoma cells |
| EP1372688B1 (en) * | 2001-03-08 | 2008-05-07 | The Administrators of The Tulane Educational Fund | Somatostatin antagonists |
| EP1522311A1 (fr) * | 2003-10-10 | 2005-04-13 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Utilisation de la somatostine ou d'un de ses analogues pour préparer un médicament destiné à réguler la réserve folliculaire ovarienne chez la femme non ménopausée |
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Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4661472A (en) * | 1985-05-09 | 1987-04-28 | The Salk Institute For Biological Studies | GnRH antagonists IX |
| PT1288223E (pt) | 1993-08-09 | 2005-03-31 | Sod Conseils Rech Applic | Derivados de peptidos terapeuticos |
| US5597894A (en) * | 1995-06-05 | 1997-01-28 | The Louisiana State University Medical Center Foundation | Multi-tyrosinated somatostatin analogs |
| DE69812084T2 (de) | 1997-05-01 | 2003-12-24 | Cedars Sinai Medical Center | Verfahren zur behandlung von hyperprolaktinämia und prolaktinomen |
| US5972893A (en) * | 1997-05-06 | 1999-10-26 | Cedars-Sinai Medical Center | Method of treating hyperprolactinemia and prolactinomas |
| US6180082B1 (en) * | 1997-11-24 | 2001-01-30 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Method to enhance tissue accumulation of radiolabeled compounds |
| CN1250361A (zh) | 1997-11-24 | 2000-04-12 | 路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会 | 提高放射性标记化合物的组织积累的方法 |
| US5968903A (en) * | 1998-05-07 | 1999-10-19 | Biomeasure, Incorporated | Inhibition of H. pylori proliferation |
| PL346361A1 (en) | 1998-07-30 | 2002-02-11 | Sod Conseils Rech Applic | Methods of using a somatostatin analogue |
| HUP0201696A3 (en) * | 1999-06-25 | 2002-10-28 | Sod Conseils Rech Applic | Cyclic peptides, pharmaceutical compositions comprising thereof and their use |
| CA2743731C (en) * | 2001-03-06 | 2014-05-06 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Method of modulating the proliferation of medullary thyroid carcinoma cells |
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