KR100808921B1 - 고나도트로핀 방출 호르몬-２의 작용제와 길항제, 및이들의 용도 - Google Patents

고나도트로핀 방출 호르몬-２의 작용제와 길항제, 및이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고나도트로핀 방출 호르몬-2(gonadotropin-releasing hormone-2,GnRH-2) 수용체에 특이적으로 결합함으로써 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2의 작용제와 길항제, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GnRH-2 작용제와 길항제는 GnRH-2 수용체에 특이적으로 결합하므로 이를 포함하는 약학 조성물은 생식생리 질환, 및 스테로이드 관련 암세포 치료에 유용하며, 또한, 비포유동물인 조류 및 어류의 양식 사업에도 유용하게 이용 가능하다.

Description

고나도트로핀 방출 호르몬-２의 작용제와 길항제, 및 이들의 용도{AGONISTS AND ANTAGONISTS OF GONADOTROPIN-RELEASING HORMONE-2, AND USE THEREOF}
본 발명은 GnRH-2 (gonadotropin-releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2의 작용제와 길항제, 및 이를 포함하는 GnRH-2의 방출 조절용 약학 조성물에 관한 것이다.
고나도트로핀 방출 호르몬 (gonadotropin-releasing hormone: GnRH)은 척추동물의 생식생리에서 중요한 역할을 하는 신경 펩타이드로서, 내분비 및 신경내분비 질환의 치료제로 광범위하게 사용된다 (참고문헌: Sealfon SC, et al., Endocr. Rev. vol.18 pp.180-205, 1997). GnRH는 현재까지 70여 가지 서로 다른 종에서 발견되는 약 14 가지 유형이 있고, 대부분의 척추동물 혹은 무척추동물에서 2종 혹은 그 이상의 GnRH들이 한 개체에서 발견되었다 (참고문헌: Fernald RD, et al., Front Neuroendocrinol, vol.20, pp.224-240, 1999).
첫 번째 유형의 GnRH (GnRH-1)는 시상하부형 GnRH이다. GnRH-1의 신경세포는 주로 시상하부에 분포하며, 그 신경말단이 정중융기 (median eminence)에 존재한다. GnRH-1은 정중융기에서 분비되어 시상하부와 뇌하수체를 잇는 문맥계를 타고 뇌하수체에 도달하여 뇌하수체의 기능을 조절한다. GnRH-1은 뇌하수체에서 황체형 성호르몬 (LH)과 여포자극호르몬 (FSH)의 분비를 조절하고, 이들 LH와 FSH는 생식소에서 스테로이드 합성 및 생식소 발달을 조절한다. 따라서 GnRH-1은 척추동물의 생식내분비 조절에 깊이 관여되어 있다 (참고문헌: Seeburg PH, et al., Recent Prog Horm Res vol.43 pp.69-98, 1986).
대표적인 GnRH-1은 포유류에서 처음 발견된 포유류형 GnRH (mammalian GnRH; mGnRH)이다 (참고문헌: Matsuo H, et al., Biochem Biophys Res Commun vol.43 pp.1334-1339, 1971; Burgus R, et al., Proc Natl Acad Sci USA vol.69 pp.278-282, 1972). mGnRH는 포유류뿐만 아니라 조류, 파충류, 양서류 등 대부분의 척추동물에서 발견된다. 하지만 진화적으로 초기에 나타나는 어류 및 몇몇 조류와 양서류에서 그 변이형이 발견된다 (참고문헌: Miyamoto K, et al., Life Sci vol. 32, pp.1341-1347, 1983; Powell JF et al., Proc Natl Acad Sci USA vol. 91 pp.12081-12085, 1994; Yoo MS,et al., Mol Cell Endocrinol vol.164 pp.197-204, 2000).
두 번째 유형의 GnRH (GnRH-2)는 조류에서 최초로 발견된 닭의 GnRH-II (His5Trp7Tyr8GnRH, cGnRH-II)가 그 예이다 (참고문헌: Miyamoto K et al, Proc Natl Acad Sci USA vol.81 pp.3874-3878). cGnRH-II의 신경세포는 주로 중뇌 (midbrain)에서 발견되며 신경말단은 시상하부 후위나 척수에 존재한다. cGnRH-II의 정확한 기능은 잘 알려져 있지 않지만 주로 신경조절자로의 기능과 성적행위 조절에 중요한 역할을 할 것으로 추측된다 (참고문헌: Troskie B, et al., Neuroendocrinology vol.65 pp.396-402, 1997). 또한 일부 신경말단이 시상하부로 뻗어 있는 것으로 보아 생식생리 조절에도 관여할 것이다. cGnRH-II는 인간을 포함한 포유류뿐만 아니라 어류, 양서류 및 파충류 등 거의 모든 척추동물에서 발견되고 그 변이형이 발견되고 있지 않다 (참고문헌: White RB, et al., Proc Natl Acad Sci USA vol.95 pp.305-309, 1998).
따라서 어류 이상 척추동물에서, 한 개체에 존재하는 GnRH는 cGnRH-II (GnRH-2)와 mGnRH (또는 다양한 변이형의 GnRH-1)이다. 또한 GnRH-1과 GnRH-2는 중추신경계 뿐만 아니라 신체의 말단조직에서도 발현되는 것으로 알려져 있다. 특히 면역계와 생식계를 조절하는 조직에서 GnRH-1과 GnRH-2의 발현이 보고되고 있다 (참고문헌: Kang SK, et al., Endocrinology vol.142 pp.182-192, 2001; Wilson TM, et al., Mol Endocrinol vol.9 pp.44-53, 1995; Dong KW, et al., Mol Cell Endocrinol vol.117 pp.121-130, 1996). 따라서 GnRH는 신경내분비 조절작용 이외에도 면역계와 생식계에서 국부적 조절자로서의 역할이 있을 것으로 여겨진다.
GnRH에 관한 연구는 생식기능의 이해는 물론 임상적 치료제 개발에 결정적인 정보를 제공하기 때문에 활발히 진행되어왔다. GnRH는 맥동적으로 분비되며 이러한 분비양상은 생식소에서의 스테로이드 호르몬 합성 및 분비를 조절하게 되고 정상적인 생식기능을 유지하는데 중요한 역할을 한다. GnRH의 유전자 변형 혹은 GnRH 신경세포의 기능저하에 의해 생긴 내분비 혹은 신경내분비 질환은 GnRH를 외부에서 맥동적으로 처리함으로써 치료할 수 있다. 반면 GnRH를 높은 농도로 지속적으로 처리하면 GnRH 수용체의 기능이 저하되어 궁극적으로 생식소의 기능저하가 유도된다. 이와 같은 GnRH의 기능을 이용하여 GnRH는 생식내분비계 질환, 조기사춘기증 치료, 및 체외수정을 위한 생리주기조절 등에 사용된다 (참고문헌: Huirne JA, et al., Lancet vol.358 pp.1793-1803, 2001). 또한 GnRH는 스테로이드 호르몬에 민감한 종양 즉, 전립선암, 유방암, 난소암 치료에 사용된다 (참고문헌: Schally AV, Peptides vol.20 pp.1247-1262, 1999; Grundker C, et al., Eur J Endocrinol vol.146 pp.1-14, 2002).
최근의 연구결과들은 일부 암세포 치료에 있어서는 GnRH-1 보다 GnRH-2가 더욱 효과적이라는 것이 밝혀졌고, GnRH-2를 경유한 신호전달이 GnRH-1과는 다르다는 사실이 밝혀지고 있다 [참고문헌: Kang et al., 상기문헌; Grundker et al., 상기문헌]. 또한 GnRH-2에 민감한 수용체가 원숭이에서 밝혀짐으로써 [참고문헌: Neill JD, et al., Biochem Biophys Res Commun vol. 282 pp.1012-1018, 2001; Millar R, et al., Proc Natl Acad Sci USA vol. 98 pp.9636-9641, 2001], GnRH-2와 이들 수용체를 통한 생리적 기능에 대한 연구가 필요하게 되었다. GnRH의 임상적 중요성으로 인해 현재까지 약 3000여종의 GnRH 작용제 및 길항제가 개발되었다. 대부분의 GnRH 작용제 및 길항제는 GnRH-1의 아미노산 구조를 일부 변경함으로써 GnRH 수용체에 대한 결합력을 높이고 생체내에서 분해속도를 늦추어 그 효과를 극대화시키기 위해 개발되었다 [참고문헌: Sealfon et al., 상기문헌].
최근에 본 발명자는 황소개구리에서 GnRH-2에 매우 민감한 수용체 3종류를 클로닝하였다 (참고문헌: Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA vol. 98 pp.361-366, 2001). 황소개구리의 GnRH 수용체 (bfGnRHR)들은 모두 GnRH-1보다 GnRH-2에 민감하게 반응한다. 또한 bfGnRHR는 구조적으로 포유동물에서 발견된 GnRH 수용체와는 매우 차이가 나지만, 비포유동물, 즉, 어류, 양서류 및 조류에서 발견된 GnRH 수용체와는 구조적으로 매우 유사하다. 또한, 최근에 원숭이에서 발견된 GnRH-2에 민감한 수용체와 (monkey GnRHR-2) 구조적으로 유사하다 [참고문헌: Neill et al., 상기문헌; Millar et al., 상기문헌]. 따라서 bfGnRHR은 그 구조와 기능에 있어서 포유류의 두 번째 GnRH 수용체와 매우 유사하다.
GnRH-1은 그 생식 및 생리적 중요성과 더불어 생식기능장애 및 종양치료에서의 임상적 효과 때문에 수천 가지 아날로그가 개발되어왔다. 하지만 GnRH-2에 대한 아날로그 개발 및 연구는 몇 가지 이유로 잘 진행되지 않았다. GnRH-2는 상대적으로 GnRH-1보다 뒤늦게 밝혀졌고 GnRH-2가 사람을 포함한 모든 척추동물에 존재한다는 것이 불과 4년 전에 밝혀졌으며, GnRH-2의 생체내 기능에 대해서 잘 알려지고 있지 않았으며, 또한 GnRH-2의 아날로그 개발에서 가장 중요한 요소인 GnRH-2에 대한 수용체의 발견이 늦어졌기 때문이다. GnRH-2에 대한 수용체는 비포유동물에서는 1997년 메기에서, 1998년 금붕어에서 발견되었고 [참고문헌: Tensen et al., 1997; Illing et al., 1999], 최근에 본 연구진에 의해 황소개구리에서 3종류의 GnRH 수용체를 발견함으로써 본격화되기 시작했다 [참고문헌: Wang et al., 상기문헌]. 포유동물에서는 원숭이에서 GnRH-2에 민감한 두 번째 수용체가 있음이 극히 최근에야 발견되었다 [참고문헌: Millar et al.,상기문헌; Neill et al., 상기 문헌]. 이와 같은 문제점으로 GnRH-2의 아날로그 개발에 대한 연구는 상당히 뒤쳐져 있었다.
GnRH-2의 6번째 아미노산을 치환하는 방법을 통해 몇몇 GnRH-2의 작용제들이 개발되었다 ([D-Arg6]GnRH-2, [D-Leu6]GnRH-2, [D-Trp6]GnRH-2, [D-t-bu-Ser 6]GnRH-2, 참고문헌: Siler-Khodr 및 Khodr등의 상기문헌; PCT 공개공보 WO 01-74377호). 하지만 이들 작용제의 연구는 GnRH-1에 민감한 수용체를 가지고 있는 세포주에서 실험되었고 GnRH-2에 민감한 수용체를 대상으로는 연구되지 않았다.
따라서, GnRH-1에 대한 길항제의 개발 및 GnRH-2의 수용체에 대한 연구가 진행되고 있지만, GnRH-2에 대한 작용제 및 길항제의 개발은 이루어지지 않고 있는 실정이다. 따라서, 임상적 용도 및 GnRH-2를 경유한 생리기능 연구를 위하여 GnRH-2의 작용제 및 길항제 개발이 요구되고 있다.
발명의 요약
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GnRH-2 (gonadotropin releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2 작용제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 GnRH-2 (gonadotropin-releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 억제하는 GnRH-2 길항제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 GnRH-2 길항제 또는 작용제를 유효성분으로 포함하는 고나도트로핀 방출 조절용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GnRH-2 (gonadotropin- releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2 작용제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와, 상기 GnRH-2 작용제를 유효성분으로 포함하는 고나도트로핀 방출 조절용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 GnRH-2 (gonadotropin-releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2 길항제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와, 상기 GnRH-2 길항제를 유효성분으로 포함하는 고나도트로핀 방출 조절용 약학 조성물에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 GnRH-1, GnRH-2, 및 이들의 아날로그 서열을 나타내는 도면이다.
도 2a 내지 도 2d는 황소개구리의 GnRH-2 수용체인 bfGnRHR-1, bfGnRHR-2, bfGnRHR-3, 및 래트 (rat)의 GnRH 수용체를 발현하는 각 세포주에 GnRH-1, GnRH-2 및 GnRH-2의 작용제를 처리한 이후 이노시톨 포스페이트 (IP) 생성을 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3b는 영장류에서 발견되는 GnRH-2 수용체를 발현하는 세포에 GnRH-2 및 GnRH-2 작용제를 처리한 후 루시퍼라제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 10 ㎍의 GnRH-2 작용제 ([D-Ala6]GnRH-2)를 처리한 후 시간의 경과에 따른 LH (황체형성 호르몬) 및 테스토스테론의 혈중 농도를 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 GnRH-2에 선택적으로 결합하는 수용체가 사람 전립선 암 세포인 TSU-Pri 세포에 존재함을 보여주는 그래프이다.
도 6a 내지 도 6c는 GnRH-2 수용체, 즉, bfGnRHR-2 및 bfGnRHR-3, 및 래트 GnRH 수용체를 발현하는 각각의 GH3 세포주에 10 nM GnRH-2의 존재하에 트립토렐릭스-1 또는 세트로렐릭스를 처리한 후 이노시톨 포스페이트 생성을 보여주는 그래프이다.
도 7은 영장류에서 발견되는 GnRH-2 수용체를 발현하는 세포에 GnRH-2 길항제인 트립토렐릭스-1, 트립토렐릭스-2 및 트립토렐릭스-3, 및 GnRH-1 길항제인 세트로렐릭스를 처리함에 의해 GnRH-2-유도된 루시퍼라제 활성의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 황소개구리 GnRH-2 수용체 및 래트 GnRH 수용체를 발현하는 각 세포주에서 GnRH-1, 세트로렐릭스, GnRH-2, 트립토렐릭스-1 및 GnRH-2 작용제와 수용체 간의 결합력을 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 이미 황소개구리에서 GnRH-2에 매우 민감한 3종류의 GnRH 수용체 (bfGnRHR)를 최초로 동정하였으며 [참고문헌: Wang et al., 상기문헌], 영장류 세포의 게놈에서 GnRH-2에 민감한 수용체를 최근에 클로닝하였다. 이 수용체의 아미노산 서열은 이전에 밝혀진 영장류 GnRH-2 수용체의 서열 [참고문헌: Neill et al., 상기문헌]과 2개의 아미노산이 상이하였다. 이를 이용하여 본 발명에서는 GnRH-1에 매우 민감하게 반응하는 래트 GnRH 수용체와 GnRH-2에 민감하게 반응하는 bfGnRHR를 발현하는 세포주를 레트로바이러스-매개 감염방법 (retrovirus-mediated infection method)으로 제조하고, 여기에 GnRH-2 작용제 또는 길항제를 처리하여 그 수용체의 활성을 조사하였다. 또한, 영장류에서 발견된 GnRH-2 수용체를 발현하는 세포를 GnRH-2 및 이의 작용제로 처리하여 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 그 결과, 상기 작용제 또는 길항제의 농도에 의존하여 이노시톨 포스페이트 (Inositol phosphate)의 생성을 증가시킴이 밝혀졌다. [D-Ala6]GnRH-2는 야생형 리간드 보다 높은 특이적 민감성을 가지며; 본 발명자들은 GnRH-2의 길항제인 트립토렐릭스-1 및 트립토렐릭스-2가 GnRH-1 길항제로 이미 널리 공지된 세트로렐릭스와 비교하여 매우 높은 민감성을 나타내고, GnRH-2 수용체의 활성을 억제함을 발견하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하에서, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 GnRH-2 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2의 작용제를 제공한다. 사람을 포함한 포유류의 GnRH-1 및 GnRH-2의 아미노산 서열을 도 1 및 다음에 나타낸다. GnRH-1과 GnRH-2의 아미노산 서열은 5번째, 7번째, 및 8번째 아미노산에서 차이를 나타낸다.
GnRH-1: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2
GnRH-2(서열번호 1): pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-GlyNH2
바람직하게는, 본 발명에 따른 GnRH-2 작용제는 상기 GnRH-2의 6번째 아미노산이 D-Ala, 또는 D-Lys인 펩타이드이며, 더욱 바람직하게는 하기 펩타이드 서열 ( 서열번호 2)을 갖는다. 서열번호 4에 나타난 [D-Lys6]GnRH-2는 6번째 아미노산을 D-Ala에서 D-Lys으로 변경한 것이고, 나머지 서열번호 3, 및 서열번호 5 내지 8에 나타난 서열은 모두 6번째 아미노산이 D-Ala로 치환된 것이다.
pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Pro-GlyNH2
상기 펩타이드 서열에서,
Xaa5는 Tyr, His, 또는 Leu이고,
Xaa6는 D-Ala, 또는 D-Lys이고,
Xaa7는 Leu, Tyr, 또는 Trp이고,
Xaa8는 Leu, Tyr, 또는 Trp이다.
가장 바람직하게는, 상기 GnRH-2 작용제가 서열번호 3 내지 서열번호 8에 나타난 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것이며, 이들 서열을 하기에 표시하였다. 하기 GnRH-2 작용제의 아미노산 서열중 GnRH-2의 아미노산 서열과 다른 아미노산들은 진한 이탤릭체로 표시하였다.
[D-Ala6]GnRH-2 (서열번호 3):
p-Glu-His-Trp-Ser-His- D-Ala- Trp-Tyr-Pro-GlyNH2
[D-Lys6]GnRH-2 (서열번호 4):
p-Glu-His-Trp-Ser-His -D-Lys- Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2
[D-Ala6, Leu7]GnRH-2 (서열번호 5):
pGlu-His-Trp-Ser-His -D-Ala - Leu -Tyr - Pro-Gly-NH2
[Leu5, D-Ala6]GnRH-2 (서열번호 6):
pGlu-His-Trp-Ser -Leu-D-Ala -Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2
[Tyr5, D-Ala6, Leu8]GnRH-2 (서열번호 7):
pGlu-His-Trp-Ser- Tyr - D-Ala -Trp- Leu- Pro-Gly-NH2
[D-Ala6, Tyr7, Trp8]GnRH-2 (서열번호 8):
pGlu-His-Trp-Ser-His -D-Ala - Tyr - Trp -Pro-Gly-NH2.
[Tyr5, D-Ala6, Leu8]GnRH-2는 GnRH-3인 연어 GnRH에서 6번째 아미노산을 D-Ala로 변경한 것이며, 7번째 Trp은 GnRH-2의 것으로 하고 5번째 아미노산은 GnRH-1에서 발견되는 Tyr으로 한 것이고, 8번째 아미노산은 GnRH-3의 Leu을 택한 것이다. [D-Ala6, Tyr7, Trp8]GnRH-2는 GnRH-2의 7번째 및 8번째 아미노산의 위치를 서로 치환시킨 아날로그이다. [Leu5, D-Ala6]GnRH-2는 5번째 아미노산을 Leu으로 치환한 GnRH-2 아날로그이다.
GnRH-2의 6번 째 아미노산인 Gly은 GnRH가 그 수용체에 결합했을 때 베타-II-턴 (beta-II-turn)을 형성하는 위치이다. Gly의 D-Ala으로의 치환은 GnRH의 베 타-II-턴 형태 (conformation)를 안정하게 한다. 상기 Gly을 D-Trp으로 치환한 [D-Trp6]GnRH-2의 경우 GnRH-2와 유사한 결합력과 민감성을 보인 반면 [D-Ala6]GnRH-2는 GnRH-2보다 훨씬 높은 결합력과 민감성을 보여준 결과로 미루어 볼 때, D-Ala 치환이 수용체와의 상호작용을 증가시킨 것으로 여겨진다.
또한, 본 발명은 GnRH-2 (gonadotropin-releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 억제하는 GnRH-2 길항제에 관한 것으로서, 상기 GnRH-2 길항제는 하기 펩타이드 서열 (서열번호 9)을 포함하는 것이 바람직하다.
Ac-D-2Nal-(A)-D-Phe-D-3Pal-Ser-Xaa5-D-Cit-Trp-Xaa8-Pro-D-AlaNH2
상기 펩타이드 서열에서,
A는 4Cl, 4F, 또는 4Br이며 바람직하게는 4Cl이고,
Xaa5는 Tyr, 또는 His이고,
Xaa8은 Tyr, 또는 Leu이다.
여기서, 상기 변형된 아미노산은 본 기술분야에서 널리 사용되는 화합물명이며, 구체적으로 Ac-D-Nal은 베타-탄소위치에 나프틸기가 치환된 D-알라닌에 아세틸기가 치환된 것 (β-(2-나프틸-D-Ala))이고, (4Cl)-D-Phe은 피리딘 링의 3번 위치에 연결된 베타-탄소위치에 피리딜기가 치환된 D-알라닌이고, D-Cit는 시트룰린의 D-이성질체이다.
가장 바람직하게는, 상기 GnRH-2 길항제는 서열번호 10 내지 서열번호 12에 나타난 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 GnRH-2 길항제이다. 상기 서열번호 10 내지 12에 나타난 GnRH-2 길항제는 트립토렐렉스(Trptorelix)로 명명한다. 하기에 이들 아미노산 서열을 표시하였으며, 트립토렐릭스-2 및 트립토렐릭스-3의 아미노산 서열중 트립토렐릭스-1의 아미노산서열과 다른 아미노산을 진한 이탤릭체로 표시하였다.
트립토렐릭스-1 (서열번호 10):
Ac-D2Nal-(4Cl)D-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-DAlaNH2
트립토렐릭스-2 (서열번호 11):
Ac-D2Nal-(4Cl)D-Phe-D-3Pal-Ser- His -DCit-Trp-Tyr-Pro-DAla-NH2
트립토렐릭스-3 (서열번호 12):
Ac-D2Nal-(4Cl)D-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-DCit-Trp- Leu- Pro-DAla-NH2.
상기 GnRH-2에 대한 길항제인 트립토렐릭스의 특징은 7번째 아미노산을 Trp로 하고 있으며, 이는 GnRH-3로 알려진 연어 (salmon) GnRH (어류에서만 발견됨, pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-Gly-NH2)도 역시 GnRH-2와 함께 2번째 GnRH 수용체에 민감하게 반응하는데, 이들의 GnRH-2와 GnRH-3의 펩타이드는 모두 7번째 아미노산이 Trp이라는 공통점이 있기 때문이다.
트립토렐릭스는 GnRH-1의 길항제로 잘 알려진 세트로렐릭스 (Cetrorelix, 도 1)를 변형하여 제조한 것으로서, 세트로렐릭스는 GnRH-1의 1, 2, 3, 6 번 아미노산을 아미노산 유도체로 치환한 길항제로 GnRH-1 수용체와 높은 결합력을 보이나 수 용체를 활성화시키지 않는다. 트립토렐릭스-1은 세트로렐릭스의 7번째, 8번째 아미노산을 치환하여 합성하였다. 세트로렐릭스의 7번째, 및 8번째 아미노산은 GnRH-1 수용체와 결합에 매우 중요한 아미노산으로서 이 부분을 GnRH-2의 아미노산으로 바꾸어 줌으로써 GnRH-2 수용체와의 결합력을 증가시키고자 하였다 (도 1).
GnRH-1에 매우 민감하게 반응하는 래트 GnRH 수용체와 GnRH-2에 잘 반응하는 bfGnRHR가 발현되는 세포주를 레트로바이러스 매개 감염 방법으로 제조하고, 이에 GnRH-2의 작용제인 [D-Ala6]GnRH-2, [D-Trp6]GnRH-2와 GnRH-2의 길항제인 트립토렐릭스-1을 처리하여 그 수용체의 활성을 조사하였다. 그 결과, [D-Ala6]GnRH-2는 bfGnRHR가 발현되는 세포에서 농도 의존적으로 이노시톨 포스페이트(IP)의 양을 증가시켰으며, 천연 리간드인 GnRH-2보다 2.5~10배, GnRH-1 보다 40~20,000배 높은 민감성을 보였다 (도 2a 및 도 2c). 한편, 래트(rat) GnRH 수용체가 발현되는 세포에서 [D-Ala6]GnRH-2는 GnRH-2 보다 5배 높은 민감성을 보였으나 GnRH-1보다 3.5배 낮은 민감성을 보였다 (도 2d). 이러한 결과는 [D-Ala6]GnRH-2가 GnRH-2에 특이적인 강력한 작용제임을 보여준다.
또한, 영장류 GnRH-2 수용체를 발현하는 세포에서 [D-Ala6]GnRH-2는 GnRH-2에 비해 약 3배 더 우수한 효과를 나타내었다. 한편, [D-Lys6]GnRH-2는 GnRH-2 보다 약 1.5배 낮은 효과를 가지며, [D-Trp6]GnRH-2는 GnRH-2 보다 약 1.2배 낮은 효 과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 결과는 영장류 및 비포유동물에서 발견된 GnRH-2 수용체에 있어서, [D-Ala6]GnRH-2가 가장 효과적인 작용제임을 시사한다. 또한, [D-Ala6]GnRH-2의 5번째, 7번째 및 8번째 아미노산이 치환된 아날로그들을 사용하는 경우, 이들의 효과는 [D-Ala6]GnRH-2 보다 약한 것으로 관찰되었으며, 이는 GnRH-2의 5번째, 7번째 및 8번째 위치에서 발견되는 His, Trp 및 Tyr을 유지하는 것이 중요함을 보여준다 (도 3b).
[D-Ala6]GnRH-2는 생체내에서 효과를 나타내었다. [D-Ala6]GnRH-2 10 ㎍을 수컷 래트에 주사하는 경우, 항체형성호르몬 (LH)의 증가가 단 1시간 관찰되었다. 그러나, 이러한 효과는 주사한 지 2시간 후에 급격히 감소하였다. 한편, 수컷 호르몬인 테스토스테론은 주사한 지 2시간 후부터 급격히 증가하여, 4시간 째에는 피크 포인트 (peak point)에 도달하였으며, 8시간 이후에도 주사하기 전에 비해 상당히 높은 수치를 나타내었다 (도 4).
본 발명자들은 GnRH-2에 대한 수용체가 전립선 암세포에 존재함을 밝혔다. 배양된 전립선 암세포인 TSU-Pri 세포를 I152로 방사능 표지한 GnRH-1으로 처리한 경우, 세포와의 결합이 관찰되지 않았으나, I152로 방사능 표지한 GnRH-2로 처리한 경우에는 세포와의 결합이 관찰되었다 (도 5a 및 도 5b). 후자의 경우, 방사능 표지하지 않은 [D-Ala6]GnRH-2를 처리하는 경우, I152로 방사능 표지된 GnRH-2의 결합 은 농도-의존적으로 감소하였다 (도 5c). 이러한 결과는 GnRH-2에 대한 수용체가 전립선 암세포에 존재함을 보여주며, [D-Ala6]GnRH-2가 전립선 암의 치료를 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
GnRH-2에 대한 길항제인 트립토렐릭스-1은 GnRH-2에 의해 유도된 IP의 증가를 농도 의존적으로 억제하며, bfGnRH 수용체에서는 GnRH-1의 길항제인 세트로렐릭스 (Cetrorelix)보다 약 100-2800배 높은 억제효과를 보였다 (도 6a 및 도 6b). 반면, 트립토렐릭스-1은 래트 GnRH 수용체에 대해서는 세트로렐릭스보다 약 60배 낮은 효과를 나타냈다 (도 6c). 또한 영장류 GnRH-2 수용체가 발현되는 세포주를 트립토렐릭스-1 및 트립토렐릭스-2로 처리하는 경우, GnRH-2에 의해 유도된 루시퍼라제 활성은 농도-의존적으로 감소하였지만, 트립토렐릭스-3 및 세트로렐릭스로 처리한 경우에는 어떠한 효과도 없었다 (도 7). 이는 세트로렐릭스의 7번째와 8번째 아미노산인 Leu와 Arg을 Trp과 Tyr로 치환하는 경우, 트립토렐릭스가 GnRH-2 수용체에 대해 높은 결합력을 나타내는 반면, GnRH-1 수용체에 대해선 낮은 결합력을 나타냄을 입증한다. 이러한 결과는 트립토렐릭스가 GnRH-2 수용체에 효과적으로 결합하여 이의 신호전달을 억제할 수 있음을 보여준다. 요약하면, 트립토렐릭스가 GnRH-2에 매우 특이적인 길항제임을 보여준다.
상기 작용제와 길항제의 수용체에 대한 결합력을 측정한 결과, bfGnRH 수용체에 대해서 트립토렐릭스-1>[D-Ala6]GnRH-2>GnRH-2>>[D-Trp6]GnRH-2>GnRH-1>세트로렐릭스 순으로 나타났으며, 래트 GnRH 수용체에 대해서는 세트로렐릭스>트립토렐릭 스-1>GnRH-1>[D-Ala6]GnRH-2>[D-Trp6]GnRH-2>GnRH-2 순으로 나타났다. 이러한 결과 역시 [D-Ala6]GnRH-2와 트립토렐릭스-1이 GnRH-2에 특이적인 작용제와 길항제임을 보여준다.
또한, PCT 공개공보 WO 01-74377호에 기재된 [D-Arg6]GnRH-2, [D-leu6]GnRH-2, [D-Trp6]GnRH-2, 및 [D-t-bu-Ser6]GnRH-2 등 은 GnRH-1에 민감한 수용체를 갖는 세포주에서 실험되었고, GnRH-2에 민감한 수용체를 대상으로는 연구되지 않았다. 따라서 이들 아날로그가 GnRH-2 수용체에 미치는 영향은 입증되지 않았다. 특히 본 발명에서도 [D-Trp6]GnRH-2를 사용하여 실험한 결과, [D-Trp6]GnRH-2는 천연 리간드인 GnRH-2 보다 효과가 더 뛰어나지 않았던 반면, 본 연구에서 개발된 [D-Ala6]GnRH-2는 그 효능이 GnRH-2의 수용체에 대해 천연 리간드 보다 효능이 뛰어남이 밝혀졌다.
본 발명은 또한 약리적으로 허용되는 담체와, 상기 GnRH-2 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 작용제 또는 길항제를 유효성분으로 포함하는 고나도트로핀 방출 조절용 약학 조성물에 관한 것이다.
GnRH-2에 대한 작용제와 길항제는 인간의 생식생리 질환 및 스테로이드 관련 암세포 치료에 상용될 수 있을 것이며, 비포유동물 즉 조류와 어류의 양식사업에도 사용될 수 있을 것이다. 따라서, 상기 GnRH-2 작용제 또는 길항제는 GnRH-2의 활 성을 조절함으로써 GnRH-2의 활성과 관련된 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
GnRH-2 작용제 또는 길항제를 포함하는 약학 조성물은 사용용도, 사용하는 GnRH-2 아날로그의 종류, 투여대상의 건강상태, 투여방법, 및 투여형태에 따라 적절히 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 상기 약학 조성물중 유효성분의 함량을 0.1 nM -100 nM 농도 수준으로 제조하여 투여할 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여방법은 경구투여, 또는 비경구 투여 등 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 투여방법을 적절히 선택하여 투여할 수 있다. 본 발명의 일례에서, 상기 약학 조성물중 유효성분의 함량을 0.1 nM -100 nM 농도 수준으로 제조하여 인체에 투여할 때에는 주사에 의해 0.1-100 ㎍/kg 체중 정도이다. 실제로, 본 발명에서 체중이 100g인 래트를 10㎍의 [D-Ala6]GnRH-2로 처리하였을 때, 생체내에서 황체형성호르몬 및 테스토스테론의 혈중 농도가 증가하는 것으로 관찰되었다 (도 4). 본 발명의 일례에서, GnRH-2 길항제 또는 작용제를 먼저 합성하고 이를 냉각농축하여 물기를 완전히 제거한 상태에서 유리병에 진공상태로 보관하게 된다. 작용제의 경우 증류수에 쉽게 용해되고 생리식염수에 희석함으로써 약학 조성물을 제조할 수 있고, 길항제의 경우 DMSO (dimethyl sufoxide)에 용해하거나 생리식염수로 희석하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 GnRH-2 아날로그는 스테로이드 관련 질환 (예, 전립선암, 유방암, 및 난소암 등), 생식내분비 기능저하와 관련된 질환 (예, 생리불순, 무월경, 조기사춘 기증, 및 성선기능저하증), 체외수정시 배란주기 조절 (예, GnRH 효능제, 혹은 길항제를 투여함으로써 배란주기를 임의적으로 조절할 수 있다), 피임 (예, 성교후 GnRH 길항제 투여를 통해 배아의 성장 및 착상율을 저하시킴), 어류 및 가축의 증산에 사용될 수 있다.
GnRH-2 수용체의 분자생물학적 연구 및 GnRH-2의 생리적 기능 분석과 관련하여, 현재까지 비포유동물의 GnRH 수용체 및 원숭이에서 발견된 GnRH-2 수용체는 모두 GnRH-1보다 GnRH-2에 민감하다 [참고문헌: Wang et al., 상기문헌; Neill et al., 상기문헌]. 따라서 이러한 수용체의 분자생물학적 연구 즉 리간드-수용체 결합력 및 세포내 신호전달기전의 분자적 연구에 GnRH-2 작용제와 길항제가 활용될 수 있다. 또한 인체 및 다른 포유동물에서 GnRH-2가 발견됨에도 불구하고 그 기능을 알지 못하였다 [참고문헌: White et al., 상기문헌]. GnRH-2 작용제와 길항제는 GnRH-2의 생리적 기능을 연구하는데 사용될 수 있을 것이다.
스테로이드에 의해 발생하는 유방암, 전립선암, 난소암 세포의 치료에 GnRH-1이 사용되었다 [참고문헌: Schally, 상기문헌,1999; Grundker et al., 상기문헌]. GnRH-1의 작용제나 길항제는 생식소에서 스테로이드 분비를 조절하는 기능이 있어 이와 같은 효과를 이용하여 전립선, 유방, 또는 난소에 형성된 종양이나 암세포 치료에 사용되었다. 즉 GnRH-2의 강력한 작용제나 길항제는 모두 정소에서 스테로이드 분비를 억제하고, 이로 인하여 인체에서 스테로이드 농도가 저하되며, 이는 궁극적으로 암세포의 증식을 억제하게 된다.
최근의 연구결과는 또한 이들 암세포에서 GnRH 수용체가 발현되는 것이 밝혀 지면서 GnRH의 직접적인 효과에 대하여 연구되고 있다. 이때 이들 암세포에는 GnRH-1 보다 GnRH-2가 보다 효과적인 것으로 나타났다. 즉, GnRH-2가 GnRH-1보다 낮은 농도에서 암세포의 증식을 억제하였다 [참고문헌: Grundker et al., 상기문헌]. 또한, 본 발명자들은 전립선 암세포인 TSU-Pri 세포에 GnRH-2가 더욱 효과적으로 결합함을 증명하였다 (도 5). 따라서 GnRH-2의 아날로그를 사용할 때 천연 GnRH-2 보다도 더 낮은 농도에서 처리할 수 있기 때문에 훨씬 경제적으로 암세포 증식을 억제할 것이다. 따라서 GnRH-2의 작용제 및 길항제는 스테로이드 관련 암세포치료에 매우 효과적일 것으로 추측된다.
GnRH-2의 작용제 및 길항제는 생식내분비계 질환 치료에 사용할 수 있다. 최근의 연구에 의하면, GnRH-2는 GnRH-1과 마찬가지로 뇌하수체의 생식선세포에서 LH 및 FSH의 분비를 촉진하는 것으로 밝혀지고 있다 [참고문헌: Millar et al., 상기문헌; Padmanabhan and McNeily, 2001]. 여기서, GnRH-1이 LH 분비에 효과적이라면 GnRH-2는 FSH의 분비에 더욱 효과적이다. FSH와 LH는 정소에서 서로 다른 기능을 가지고 있다. 예를 들어 FSH는 난소에 여포의 성장을 촉진한다. 반면, LH는 성장한 여포에서 난자가 방출되도록 도와주는 기능을 수행한다. GnRH-1의 LH 분비촉진능에 비해 GnRH-2는 FSH의 분비촉진능이 더욱 크다고 밝혀지고 있다. 이러한 연구결과는 GnRH-2 작용제 및 길항제를 FSH와 LH 분비조절에 사용할 수 있음을 시사한다. GnRH-1은 그 동안 성선기능저하증, 조기사춘기증, 불규칙적인 월경 등에 사용되었다 [참고문헌: Huirne and Lambalk, 2001]. 하지만 GnRH-1와 GnRH-2는 모두 LH와 FSH의 분비를 촉진시키지만, GnRH-1은 LH를 GnRH-2는 FSH를 보다 많이 분 비시키는 서로 다른 특성을 지니고 있기 때문에, GnRH-1과 GnRH-2의 아날로그를 복합적으로 사용함으로써 보다 좋은 효능을 발휘할 수 있을 것이다. 따라서 GnRH-2의 작용제 및 길항제 역시 이와 같은 생식내분비계 질환 치료에 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.
GnRH-2의 작용제 및 길항제는 체외수정에 사용될 수 있다. 불임환자에 있어서 체외수정은 가임을 위한 매우 중요한 방법이다. 이때 배란주기조절을 위해 GnRH의 작용제 및 길항제가 사용되는 데, GnRH-2의 작용제 및 길항제 역시 배란주기 조절에 사용될 수 있을 것이다.
또한, GnRH-2의 작용제 및 길항제는 피임제로 사용될 수 있다. GnRH 및 GnRH 수용체는 초기 배아 발생시기에도 발현되는 것으로 나타났으며, 특히 초기 배아 발생기에 GnRH를 처리하면 배아의 발생과 착상이 증진되나, GnRH 길항제를 사용하면 배아의 발생 및 착상이 억제됨이 나타났다 [참고문헌: Raga F, et al., Endocrinology vol.140 pp. 3705-3712, 1999]. 따라서 이러한 현상에도 GnRH-2의 작용제와 길항제를 사용한다면 피임약으로 사용할 수 있을 것이다.
GnRH-2의 작용제 및 길항제는 어류 및 가축의 증산에 사용할 수 있다. 현재까지 어류 및 조류에서 밝혀진 GnRH 수용체는 GnRH-1보다 GnRH-2에 더욱 민감하다. 그동안 어류의 과배란을 위해서는 GnRH-1 아날로그들이 사용되어왔으나 그 효과가 작다. 따라서 GnRH-2에 민감한 수용체에 작용하는 [D-Ala6]GnRH-2와 트립토렐릭스는 어류 및 조류의 증식에도 사용될 수 있다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 제공되는 것이며 본 발명의 보호범위를 하기 실시예로 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: GnRH-2 아날로그의 제조
GnRH-2 의 작용제를 개발하기 위하여 GnRH-2의 6번째 아미노산인 Gly를 D-Ala으로 치환한 [D-Ala6]GnRH-2를 제조하고 이의 서열을 도 1, 및 서열번호 3에 나타냈다. 또한, 상기 GnRH-2의 6번째 Gly를 D-Trp으로 치환한 [D-Trp6]GnRH-2를 디자인하였다. GnRH-2은 Sigma사(미국)에서 구입하였으며 이의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타냈다.
GnRH-1의 길항제인 세트로렐릭스 (Ac-D-2Nal-(4Cl)-D-Phe-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2)는 Serono사 (스위스) 사에서 구입하였다. GnRH-2의 길항제는 세트로렐릭스에서 5번째, 7번째 및 8번째 아미노산인 Tyr, Leu 및 Arg을 His, Trp 및 Tyr으로 치환하는 방법으로 제작하였으며, 트립토렐릭스-1, 트립토렐릭스-2 및 트립토렐릭스-3라고 명명하였으며 서열번호 10 내지 서열번호 12에 나타냈다.
[D-Ala6]GnRH-2, [D-Trp6]GnRH-2 및 트립토렐릭스는 Anygen사 (대한민국 광주광역시, 광주과학기술원 소재)에 의뢰하여 화학적 합성법으로 제조하였다.
실시예 2: GnRH-2 작용제-유도된 GnRH-2 수용체 활성
GnRH 수용체는 G 단백질과 연결되어 있는 막 단백질로, 리간드에 의해 활성화되었을 때 G 단백질을 활성화시키고, 이는 다시 포스포리파제 C를 활성화시켜, 세포내 이차 전달자인 이노시톨 포스페이트(IP)의 합성이 증가하게 된다. 이와 같은 원리를 이용하여 세포내 IP의 양을 측정함으로써 수용체의 활성을 조사할 수 있다.
2-1 이노시톨 포스페이트 분석
GH3 세포주는 대한민국 서울에 소재하는 서울대학교 의과대학 암염구소 내 세포주은행에서 입수하였다. GH3 세포주에 황소개구리 GnRH 수용체인 bfGnRHR-1, bfGnRHR-2, bfGnRHR-3와 래트 GnRHR를 코딩하는 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 감염시켜 이들 수용체를 발현하는 각각의 세포주를 얻었다. bfGnRHR-1, bfGnRHR-2, bfGnRHR-3, 래트 GnRHR를 발현하는 GH3 세포를 12-웰 플레이트에서 배양하였다. 24 시간 후 세포를 이노시톨이 없는 배양액에 H3-미오신이노시톨을 넣어주고 24시간 동안 세포를 배양하였다. 완충액 A (140 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 8 mM D-글루코스, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA)로 상기 세포를 세척한 후, 10 mM LiCl가 포함된 완충액 A에 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 적정농도의 GnRH를 처리하고 37℃에서 30분간 배양하고 배양액을 제거하였다. 세포에 빙냉 (ice-cold) 10 mM 포름산을 처리하여 반응을 중지시키고, 세포 추출물을 Dowex 음이온 교환수지를 혼합하였다. 상기 수지 (resin)를 증류수로 세척한 다음, 1M 암모니움 포르메이트/0.1M 포름산으로 IP를 추출하여 cpm (count per minute)을 측정하였다.
2-2: GnRH-2 작용제에 의해 유도된 IP 생성
GH3 세포주에 황소개구리 GnRH 수용체인 bfGnRHR-1, bfGnRHR-2, bfGnRHR-3와 래트 GnRHR를 코딩하는 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 감염시켜 이들 수용체를 발현하는 각각의 세포주를 얻었다. 이들 세포주에 GnRH-1, GnRH-2 및 그 작용제를 처리하고 30분 후에 2차 신호전달자인 IP의 형성을 조사하였다. 모든 세포주에서 GnRH 및 그 작용제를 처리하였을 때 농도 의존적으로 IP가 형성됨을 관찰하였다. 모든 bfGnRHR에 대하여 GnRH-2가 GnRH-1보다 더 민감하게 반응하였으며, 래트 GnRH 수용체에 대해서는 GnRH-1이 GnRH-2보다 더 민감하게 반응하는 것을 관찰하였다 (도 2a 내지 도 2d, 및 표 1).
이러한 결과는 기존에 밝혀진 결과와 일치하는 것으로 비포유동물의 GnRH 수용체는 GnRH-2에 민감하게 반응하고 포유동물 GnRH 수용체는 GnRH-1에 민감하게 반응하는 것을 보여준다 [참고문헌: Neill et al., 상기문헌; Millar et al., 상기문헌; Wang et al., 상기문헌]. 도 2a 내지 2d에서 알 수 있는 바와 같이, bfGnRHR-1을 발현하는 GH3세포에 GnRH-2의 작용제인 [D-Ala6]GnRH-2, [D-Trp6]GnRH-2를 처리하였을 때, [D-Ala6]GnRH-2는 GnRH-2보다 약 8배 정도 낮은 농도에서 bfGnRHR-1을 활성화시켰으며, [D-Trp6]GnRH-2는 GnRH-2와 유사한 농도에서 bfGnRHR-1을 활성화시 켰다. bfGnRHR-2를 발현하는 GH3 세포에 GnRH-1, GnRH-2, [D-Ala6]GnRH-2, 및 [D-Trp6]GnRH-2를 처리했을 때, 역시 [D-Ala6]GnRH-2가 가장 민감하게 수용체에 작용하여 IP 생성을 유도하였다. GnRH-1은 GnRH-2보다 약 1000배정도 높은 농도에서 bfGnRHR-2를 활성화시킬 수 있었다. 또한 bfGnRHR-3을 발현하는 세포주에서도 [D-Ala6]GnRH-2가 가장 민감하게 반응하는 것을 관찰하였다. 한편 래트의 GnRH 수용체 (래트 GnRHR)를 발현하는 세포에서는 GnRH-1이 가장 민감하게 IP 생성을 유도하였으며, [D-Ala6]GnRH-2와 GnRH-2는 10배 이상 낮은 민감도를 보였다.
표 1
Figure 112004048751047-pct00001
상기 표 1에 의하면, GnRH가 각각의 수용체활성의 반을 활성화시킬 수 농도 EC50 값을 보여준다. 이상과 같은 결과는 [D-Ala6]GnRH-2가 GnRH-2에 민감한 수용체인 bfGnRHR-1, bfGnRHR-2, bfGnRHR-3에 매우 민감하게 작용하는 반면, GnRH-1에 민감한 래트 GnRHR에는 GnRH-1보다 그 민감성이 떨어지는 것을 보여주는 것으로, [D-Ala6]GnRH-2가 GnRH-2에 특이적인 작용제임을 증명하였다.
2-3: 루시퍼라제 활성 분석
영장류 GnRH-2 수용체에 대한 상보적 DNA (cDNA)를 CV-1 세포 게놈으로부터 수득하였다. 누클레오티드 서열 분석을 통해 이것이 이미 공지되어 있는 영장류 GnRH-2 수용체와 3개의 누클레오티드에서 차이가 있음이 밝혀졌고 (참고문헌: Neill et al., 상기 문헌), 2개의 아미노산에서 차이가 발견되었다. 상기 수용체의 활성을 분석하기 위해, 루시퍼라제 유전자를 c-fos 프로모터와 융합시킨 c-fos-luc를 프로브 유전자로서 동시 감염시켰다. 감염시킨 지 48시간 후에, 세포를 GnRH-2 작용제로 처리하고 루시퍼라제의 활성을 분석하였다 (참고문헌: Seong et al., Endocrinology vol 144 2003, 454-466).
2-4: GnRH-2 작용제-유도된 루시퍼라제 활성
영장류 GnRH-2 수용체를 발현시키는 세포 내로 몇몇 GnRH-2 작용제를 주입함으로써 이들 모두가 농도-의존적으로 루시퍼라제의 활성을 증가시킴이 밝혀졌다. GnRH-2 수용체 중에 [D-Ala6]GnRH-2는 천연 GnRH-2 보다 약 3배의 탁월한 효과를 나타내었다. 그러나 [D-Lys6]GnRH-2 및 [D-Trp6]GnRH-2의 경우에는 GnRH-2와 비교하였을 때 이들의 효과는 각각 약 1.5배 및 1.2배 감소된 것으로 밝혀졌다 (도 3a 및 표 2). 한편, GnRH-1의 작용제인 [D-Ala6]GnRH-1은 GnRH-2에 비해 매우 낮은 민감도를 나타내었다. 따라서, 이러한 결과는 [D-Ala6]GnRH-2가 영장류 및 비포유동물에서 발견되는 GnRH-2 수용체에 대한 가장 효과적인 작용제임을 시사한다. [D-Ala6]GnRH-2의 5번째, 7번째 및 8번째 아미노산이 치환된 아날로그를 사용하는 경우, 이들의 효과는 [D-Ala6]GnRH-2 보다 약해지는 것으로 관찰되었으며, 따라서 GnRH-2의 5번째, 7번째 및 8번째에서 발견되는 His, Trp 및 Tyr을 유지하는 것이 중요하다고 할 수 있다 (도 3b).
표 2. 영장류 GnRH-2 수용체가 발현되는 세포에서 GnRH-2 작용제에 의한 루시퍼라제 활성
GnRH 아날로그 Log EC50 비 (Ratioa) Emax (유도 배수 (fold-induction))
GnRH-1 -5.74±0.15 446.68 12.87±1.12
GnRH-2 -8.39±0.10 1 11.74±0.31
[D-Ala6]GnRH-1 -6.38±0.10 102.33 8.91±0.39
[D-Ala6]GnRH-2 -8.81±0.12 0.38 11.84±0.47
[D-Lys6]GnRH-2 -8.57±0.11 0.66 11.74±0.43
[D-Trp6]GnRH-2 -8.31±0.09 1.20 11.20±0.32
[D-Ala6, Leu7]GnRH-2 -7.95±0.10 2.51 9.04±0.27
[Leu5, D-Ala6]GnRH-2 -7.35±0.12 10.96 6.22±0.25
[D-Ala6, Tyr7, Trp8]GnRH-2 -7.57±0.13 6.61 12.83±0.56
[Tyr5, D-Ala6, Leu8]GnRH-2 -7.90±0.24 3.01 7.35±0.51
GnRH-2 작용제의 Log EC50 값 및 Emax 값은 독립적으로 3회 수행된 실험의 평균값이다. 비 (Ratioa)는 GnRH-2의 EC50 값에 기초하여 다른 GnRH 아날로그의 EC 50 값의 비를 나타낸다.
실시예 3: GnRH-2 작용제-유도된 형청 LH 및 테스토스테론 레벨
[D-Ala6]GnRH-2를 100 ㎍/ml의 농도로 식염수에 용해시킨 다음, 10 ㎍의 [D-Ala6]GnRH-2를 수컷 래트 (체중이 약 100g인 Sprague Dawley 래트)의 경부 (cervix)에 주사하였다. 주사한 지 1시간, 2시간, 4시간 및 8시간 후에 래트로부터 혈청을 수득하였다. 이 혈청에 존재하는 황체형성 호르몬 및 테스토스테론의 농도를 방사면역검정법에 의해 측정하였다. [D-Ala6]GnRH-2를 수컷 래트에 주사한 경우, 단지 1시간 내에만 황체형성 호르몬 (LH)의 증가가 관찰되었다. 그러나, 이효과는 주사한 지 2시간에 급격히 감소하였다. 한편, 수컷 호르몬인 테스토스테론은 주사 한 지 2시간 후부터 급격히 증가하기 시작하였고, 4시간 째에 피크 포인트에 도달하였으며, 주사하기 이전과 비교하여 8시간 후에도 상당히 높은 값을 나타내었다 (도 4).
실시예 4: 전립선 암세포에 GnRH-2 수용체의 존재
전립선 암세포에 GnRH-2 수용체의 존재를 조사하기 위해, GnRH-1 및 GnRH-2를 I125로 방사능표지하였다. 전립선 암세포주 중 하나인 TSU-Pri를 방사능표지된 I125GnRH-1 및 I125GnRH-2와 함께 배양하였다. 대조구로서, GnRH-1에 쉽게 결합하는 래트 GnRH 수용체를 발현하는 세포 및 GnRH-2에 쉽게 결합하는 bfGnRHR-3 수용체를 발현하는 세포를 사용하였다. 방사능표지된 GnRH 및 세포를 실온에서 6시간 동안 배양한 다음, PBS (인산 완충 염수)로 수 회 세척함으로써 결합되지 않은 GnRH를 제거하였다. 그런 다음, 상기 세포를 분리하고 Y-카운터를 사용하여 세포로부터 방사능을 측정하였다. I125GnRH-1은 래트 GnRH 수용체를 발현하는 세포에 매우 잘 결합하였고, 이러한 결합은 방사능표지되지 않은 GnRH-1 또는 GnRH-2를 경쟁자로서 첨가하는 경우 감소하였다. 한편, 전립선 암세포인 TSU-Pri 세포를 I125-방사능표지된 GnRH-1으로 처리하는 경우, 세포와의 어떠한 결합도 관찰되지 않았다 (도 5a). TSU-Pri를 I125GnRH-2로 처리하는 경우, 세포와의 결합이 관찰되었다. 후자의 경우, 방사능표지되지 않은 GnRH-2를 경쟁자로서 사용하였을 때, 결합이 감소하였지만, 방사능표지되지 않은 GnRH-1을 경쟁자로서 사용하였을 때는 결합이 감소하지 않았다 (도 5b). 또한, 방사능표지하지 않은 GnRH-2 또는 GnRH-2 작용제를 몇 가지 농도에서 경쟁자로서 사용하는 경우, 농도-의존적으로 결합이 감소하는 것으로 관찰되었다 (도 5c). 이러한 결과는 GnRH-2에 대한 수용체가 전립선 암세포에 존재함을 보여주는 것이며, [D-Ala6]GnRH-2가 전립선암의 치료를 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 5: GnRH-2 길항제의 효과
5-1: 비포유동물의 GnRH-2 수용체에 대한 GnRH-2 길항제의 효과
상기 2-2에서 제조한 bfGnRHR-2와 bfGnRHR-3을 발현하는 각각의 GH3세포에 GnRH-2 길항제인 트립토렐릭스-1을 처리했을 때, IP 생성은 관찰되지 않았다. 하지만 트립토렐릭스-1은 1 nM GnRH-2에 의해 유도된 IP 생성을 농도 의존적으로 저하시킬 수 있었다 (도 6a 내지 도 6c). 이러한 효과는 GnRH-1의 길항제인 세트로렐릭스를 처리했을 때 보다 bfGnRHR-2에 대해 100배, bfGnRHR-3에 대해 1000배 민감한 것으로 밝혀졌다 (표 3).
표 3
Figure 112004048751047-pct00002
반면 트립토렐릭스-1은 GnRH-1에 의해 유도된 래트 GnRHR의 활성을 억제하였지만 GnRH-1의 길항제인 세트로렐릭스 보다 그 민감성이 매우 낮음을 보여주었다 (도 6). 이러한 결과는 트립토렐릭스가 GnRH-2에 민감한 bfGnRHR-3에 특이적으로 작용하는 반면 GnRH-1에 민감한 래트 GnRHR에 대해서는 GnRH-1 길항제보다 효과가 적음을 시사한다. 표 3은 GnRH 수용체의 활성을 절반 억제할 수 있는 길항제의 농도 (IC50) 값을 보여준다.
5-2: 영장류 GnRH-2 수용체에 대한 GnRH-2 길항제의 효과
상기 2-3에서와 동일한 방법으로, 영장류 GnRH-2 수용체를 c-fos-luc 리포터 유전자와 함께 동시-감염시키고, 48시간 후에, GnRH-2 및 GnRH-2 길항제를 처리한 다음 GnRH-2 길항제의 효과를 관찰하였다. 영장류 GnRH-2 수용체를 발현하는 세포주를 트립토렐릭스-1 및 트립토렐릭스-2로 처리하였을 때, GnRH-2에 의해 유도된 루시퍼라제의 활성은 농도-의존적으로 감소하였으나, 트립토렐릭스-3 및 세트로렐릭스는 아무런 효과도 나타나지 않았다 (도 7 및 표 4). 이는 세트로렐릭스의 7번째 및 8번째 아미노산인 Leu 및 Arg를 Trp 및 Tyr로 치환함으로써 트립토렐릭스가 GnRH-2에 대해 높은 결합력을 나타낸 반면 GnRH-1 수용체에 대해 낮은 결합력을 보여주었다. 이러한 결과는 트립토렐릭스가 GnRH-2 수용체에 효과적으로 결합할 수 있어서 이들의 신호 전달을 억제시킴을 보여준다.
표 4. GnRH 길항제 각각의 수용체에 대한 log IC50 값
리포터 길항제 Log IC50
c-fos-luc Trp-1 -5.74±0.10
Trp-2 -6.19±0.12
Trp-3 NDa
세트로렐릭스 NDa
길항제에 의한 log IC50 값은 독립적으로 수행된 3회 실험의 평균값이다. ND는 '검출되지 않음'을 나타낸 것이고, 이는 억제 기능이 없음을 의미한다.
실시예 6: 리간드-수용체 결합 분석
6-1
GnRH와 GnRH 수용체의 결합력을 측정하기 위해 GnRH-2를 I125로 표지하였다. 상기 실시예 2-3에서 제조된 bfGnRHR-1, bfGnRHR-2, bfGnRHR-3, 래트 GnRHR를 발현하는 GH3 세포를 100-mm 디시 (dish)에서 배양하였다. 48 시간 뒤에 세포를 균질화하여 세포막을 얻고 결합 완충액 (40 mM Tris, pH 7.4, 2 mM MgCl2)에 녹였다. 20 ug의 막 단백질을 I125-GnRH-2와 4℃에서 16시간 반응시켰다. 여기에 표지되지 않은 GnRH-1, GnRH-2, [D-Ala6]GnRH-2, [D-Trp6]GnRH-2, 및 트립토렐릭스-1을 가하고, I125-GnRH-2와 함께 반응시켜 이들의 수용체에 관한 결합력을 조사하였다. 비 특이적 결합은 100 μM의 GnRH-2와 경쟁적으로 반응시키면서 얻었다. 반응이 끝난 후 Brandel harvester를 이용하여 수용체와 결합한 I125-GnRH-2를 여과지에 여과하고 Y-계수기로 cpm (count per minute)을 측정하였다.
6-2: GnRH-2 작용제 및 길항제의 수용체 결합력 조사
상기 실시예 6-1에서 얻어진 bfGnRHR-3을 발현하는 GH3세포에 I125GnRH-2와 GnRH-2의 작용제 및 길항제를 다양한 농도로 처리하여 GnRH-2 작용제 및 길항제의 수용체 결합력을 조사하였다. 결합력은 bfGnRHR에 대해서 트립토렐릭스-1>[D-Ala6]GnRH-2>GnRH-2>[D-Trp6]GnRH-2>GnRH-1>세트로렐릭스의 순으로 나타났으며, 래트 GnRHR에 대해서는 세트로렐릭스>트립토렐릭스-1>GnRH-1>[D-Ala6]GnRH-2>[D-Trp6]GnRH-2> GnRH-2의 순으로 나타났다 (도 4a 내지 4b, 및 표 5). 이러한 결과는 리간드-수용체 결합에 있어서 [D-Ala6]GnRH-2와 트립토렐릭스가 GnRH-2 보다 bfGnRHR-3에 보다 효과적으로 결합함을 시사한다.
표 5
Figure 112004048751047-pct00003
본 발명은 GnRH-2 (gonadotropin-releasing hormone-2) 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 조절하는 GnRH-2의 작용제와 길항제, 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, GnRH-2 수용체에 특이적으로 결합하여 효과적으로 GnRH-2를 조절함으로써 생식생리 질환, 및 스테로이드 관련 암세포 치료에 유용하고, 비포유동물인 조류 및 어류의 양식 사업에도 사용 가능하다는 장점이 있다.
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  6. GnRH-2 수용체에 특이적으로 결합하여 GnRH-2의 활성을 억제하는 GnRH-2 길항제로서, 서열번호: 9로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 GnRH-2 길항제.
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  8. 제 6항에 있어서, 펩타이드 서열이 서열번호: 10 내지 서열번호: 12로 표시되는 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 GnRH-2 길항제.
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  10. 약학적으로 허용되는 담체 및, 제 6항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 따른 GnRH-2 길항제를 유효성분으로 포함하는 고나도트로핀 방출 조절용 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물이 (1) 전립선암, 유방암 및 난소암과 같은 스테로이드 관련 질환, (2) 생리불순, 무월경, 조기사춘기증 및 성선기능저하증과 같은 생식내분비 기능저하와 관련된 질환, (3) 체외수정시 배란주기 조절, (4) 피임 및 (5) 어류 및 가축의 증산 용도로 사용됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
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