DE60023906T2

DE60023906T2 - Superaktive, wachstumshormone freisetzende hormonanaloge vom schwein

Info

Publication number: DE60023906T2
Application number: DE60023906T
Authority: DE
Inventors: J. Robert SCHWARTZ; Ruxandra Draghia-Akli
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1999-07-26
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-07-25
Also published as: US7166461B2; EP1204321B1; JP2003517294A; BR0012748A; MXPA02000938A; US20030148948A1; WO2001006988A3; WO2001006988A2; KR20020047096A; EP1204321A2; CA2378943C; ATE309358T1; PL366132A1; EP1204321A4; AU6607800A; JP4644402B2; US6551996B1; CA2378943A1; CN1635898A; US20030129172A1

Description

Diese Anmeldung nimmt die Priorität der provisorischen US-Anmeldung der laufenden Nummer 60/145.624, eingereicht am 26. Juli 1999, in Anspruch.
FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Behandlung von Wachstumsdefekten; die Verbesserung der Wachstumsleistung; die Stimulierung der Produktion von Wachstumshormon in einem Tier in einer höheren Menge als der, die mit einem normalen Wachstum verbunden ist; und die Förderung des Wachstums durch die Verabreichung eines Analogons eines Wachstumshormon-freisetzenden Hormons. Außerdem betrifft sie die Applikation einer Nukleotidsequenz, die das Analogon des Wachstumshormon-freisetzenden Hormons codiert, welches durch einen muskelspezifischen Promotor reguliert ist, in Muskelgewebe, insbesondere unter Anwendung gentherapeutischer Techniken.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Wachstumshormon-(GH)-Bahn setzt sich aus einer Reihe voneinander abhängiger Gene zusammen, deren Produkte für ein normales Wachstum erforderlich sind. Zu den Genen der GH-Bahn zählen: (1) Liganden, wie etwa GH und insulinartiger Wachstumsfaktor-I (IGF-I); (2) Transkriptionsfaktoren, wie etwa Prophet von Pit-1 oder Prop 1 und Pit-1; (3) Agonisten und Antagonisten, wie etwa Wachstumshormon-freisetzendes Hormon (GHRH) bzw. Somatostatin; und (4) Rezeptoren, wie etwa GHRH-Rezeptor (GHRH-R) und der GH-Rezeptor (GH-R). Diese Gene werden in verschiedenen Organen und Geweben exprimiert, einschließlich des Hypothalamus, Hirnanhangsdrüse (Hypophyse), Leber und Knochen. Eine effektive und regulierte Expression der GH-Bahn ist für ein optimales Höhenwachstum, ebenso wie für die Homöostase des Kohlehydrat-, Protein- und Fettstoffwechsels wesentlich. Die GH-Synthese und Sekretion aus dem Hypophysenvorderlappen wird durch GHRH stimuliert und durch Somatostatin gehemmt, welches beide Hypothalamushormone sind. Die zentrale Rolle des GH in der Kontrolle des Körperwachstums bei Menschen und anderen Wirblern und die physiologisch relevanten Bahnen, die die GH-Sekretion aus der Hypophyse regulieren, sind wohlbekannt. GH erhöht die Produktion von IGF-I primär in der Leber und anderen Zielorganen. IGF-I und GH wiederum zeigen eine Rückkopplung mit dem Hypothalamus und der Hypophyse, wodurch die GHRH- und GH-Freisetzung gehemmt wird. GH zeigt sowohl direkte als auch indirekte Wirkungen auf periphere Gewebe, wobei die indirekten Wirkungen hauptsächlich durch IGF-I vermittelt sind.
Es gibt ein breites Spektrum von klinischen Zuständen sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen, bei denen das Längenwachstum (präpubertale Patienten) oder der Körperaufbau beeinträchtigt sind, und die auf eine GH- und GHRH-Therapie reagieren. In allen Fällen ist das GHRH-GH-IGF-I-System funktional, doch nicht unbedingt bei optimaler Empfindlichkeit oder Ansprechbarkeit aus einer Vielfalt von möglichen Gründen operativ.
Das Hauptmerkmal von GH-Mängeln bei Kindern ist eine niedrige Statur. Ähnliche Phänotypen werden durch genetische Defekte an verschiedenen Punkten in der GH-Achse erzeugt (Parks et al., 1995), ebenso wie eine Nicht-GH-defiziente kleinwüchsige Statur. Nicht-GH-Mängel weisen eine unterschiedliche Ethiologie auf: (1) genetische Krankheiten, Turner-Syndrom (Jacobs et al., 1990; Skuse et al., 1999), Hypochondroplasie (Tanaka et al., 1998; Key und Gross, 1996) und Crohn-Krankheit (Savage et al., 1999); und (2) intrauterine Wachstumsverzögerung (Albanese und Stanhope 1997; Azcona et al., 1998); und (3) chronische Niereninsuffizienz (Sohmiya et al., 1998; Benfield und Kohaut, 1997). Fälle, bei denen die GH-Achse unbeeinträchtigt ist (d.h. Patienten mit normalen Hormonen, Genen und Rezeptoren) machen mehr als 50% der Gesamtfälle einer Wachstumsverzögerung aus. In diesen Fällen wurde die Wirksamkeit der GHRH- oder GH-Therapie nachgewiesen (Gesundheit und Alexander, 1995).
Eine reduzierte GH-Sekretion aus dem Hypophysenvorderlappen führt während des Älterwerdens von 25 Jahren ab bis zum Alter zu einem Verlust der Skelettmuskelmasse. Das GHRH-GH-IGF-1-System vollzieht enorme Veränderungen während des Älterwerdens und bei älteren Menschen (D'Costa et al., 1993), wobei die verminderte GH-Produktionsrate und GH-Halbwertszeit, die verminderte IGF-1-Reaktion auf GH- und GHRH-Stimuli zu einem Verlust der Skelettmuskelmasse (Sarkopenie), Osteoporose und Zunahme an Fett und Abnahme an Magerkörpermasse führt (Bartke, 1998). Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass bei einer signifikanten Anzahl von gesunden älteren Personen die GH und IGF-Mengen im Serum signifikant um 70–80% gegenüber der Menge als Teenager reduziert sind (Corpas et al., 1993; Iranmanesh et al., 1991). Es ist nachgewiesen worden, dass die Entwicklung einer Sarkopenie durch GH-Therapie kompensiert werden kann. Diese ist jedoch nach wie vor eine umstrittene Therapie für ältere Personen aufgrund ihrer Kosten und häufigen Nebenwirkungen.
Die Produktion rekombinanter Proteine bietet ein nützliches Hilfsmittel für die Behandlung dieser Zustände. Obschon die GH-Ersatztherapie bei Patienten mit Wachstumsdefekten breit eingesetzt wird und ein zufriedenstellendes Wachstum erzielt, und außerdem positive psychologische Auswirkungen auf die zu behandelnden Kinder zeigen kann (Rosenbaum and Saigal, 1996: Erling, 1999), weist diese Therapie mehrere Nachteile auf, einschließlich der unpraktischen Erfordernis einer häufigen Verabreichung von GH (Monti et al., 1997; Heptulla et al., 1997) und unerwünschter Sekundärwirkungen (Blethen et al., 1996; Watkins, 1996; Shalet et al., 1997; Allen et al., 1997).
Es ist wohlbegründet, dass extrakranial sekretiertes GHRH, als reifes Peptid oder verkürzte Moleküle (wie bei Pankreas-Inselzelltumoren und verschiedentlich lokalisierten Karzinoiden erkennbar) oftmals biologisch aktiv sind und sogar Akromegalie erzeugen können (Esch et al., 1982; Thorner et al., 1984). Die Verabreichung von rekombinanten GHRH an GH-defiziente Kinder oder Erwachsene erhöht die IGF-1-Spiegel, steigert die GH-Sekretion proportional zur GHRH-Dosis, ruft sogar eine Reaktion auf Bolusdosen von GHRH hervor (Bercu und Walker, 1997). Daher stellt die GHRH-Verabreichung eine physiologischere Alternative zur Erhöhung subnormaler GH- und IGF-1-Spiegel dar (Corpas et al., 1993).
Obschon die GHRH-Proteintherapie eine normale zyklische GH-Sekretion nahezu ohne Nebenwirkungen mit sich bringt und stimuliert, erfordert die kurze Halbwertszeit von GHRH in vivo eine häufige (ein- bis dreimal tägliche) intravenöse, subkutane oder intranasale (was eine 300-fach höhere Dosis erfordert) Verabreichung. Daher ist die GHRH-Verabreichung als einer chronischen Behandlung nicht praktisch. Allerdings ist extrakranial sekretiertes GHRH, als eine prozessierte Proteinspezies (Tyr1–40 oder Tyr1-Leu44) oder selbst als kleinere verkürzte Moleküle, biologisch aktiv (Thorner et al., 1984). Bedeutsamerweise stimuliert eine geringe Menge an GHRH (100 pg/ml) in der Blutzufuhr die GH-Sekretion (Corpas et al., 1993) und macht GHRH zu einem ausgezeichneten Kandidaten für die gentherapeutische Expression. Ein direkter Plasmid-DNA-Gentransfer stellt derzeit die Basis vieler in Entwicklung befindlicher Gentherapie-Strategien dar und erfordert daher keine viralen Gene oder Lipidpartikel (Muramatsu et al., 1998; Aihara und Miyazaki, 1998). Skelettmuskel stellt ein bevorzugtes Zielgewebe dar, da Muskelfaser eine lange Lebensspanne aufweist und durch zirkuläre DNA-Plasmide transduziert werden kann, die über Monate oder Jahre in einem immunkompetenten Wirt exprimieren (Davis et al., 1993; Tripathy et al., 1996). Vorangegangene Berichte zeigten, dass humane GHRH cDNA durch einen injizierbaren myogenen Expressionsvektor in Mäuse übertragen werden konnte, wo sie vorübergehend die GH-Sekretion in einem mäßigen Umfang über einen Zeitraum von zwei Wochen stimulierte (Draghia-Akli et al., 1997).
Wildtyp-GHRH weist eine relativ kurze Halbwertszeit im Kreislaufsystem sowohl bei Menschen (Frohman et al., 1984) als auch bei landwirtschaftlichen Nutztieren auf. 60 Minuten nach Inkubation in Plasma sind 95% des GHRH(1–44)NH₂ abgebaut, wohingegen die Inkubation der kürzeren (1–40)OH-Form des Hormons unter ähnlichen Bedingungen einen Abbau des Peptids von lediglich 77% 60 Minuten nach Inkubation zeigt (Frohman et al., 1989). Der Einbau von cDNA, die für das kürzere GHRH der Spezies (1–40)OH codiert, in einen Gentherapie-Vektor könnte ein Molekül mit einer längeren Halbwertszeit in Serum, einer erhöhten Potenz und einer höheren GH-Freisetzung in Plasmid-injizierten Tieren erbringen. Außerdem könnte eine Mu tagenese über eine Aminosäure-Ersetzung von Protease-empfindlichen Aminosäuren die Serumhalbwertszeit des hGHRH-Moleküls verlängern. Weiterhin wird eine Erhöhung der biologischen Aktivität von GHRH unter Verwendung superaktiver Analoga erzielt, die seine Bindungsaffinität an spezifische Rezeptoren erhöhen können.
Es gibt herausgegebene Patente, die auf die Verabreichung neuartiger GHRH-Analogon-Proteine (US-Patente Nrn. 5.847.066; 5.846.936; 5.792.747; 5.776,901; 5.696.089; 5.486.505; 5.137.872; 5.084.442; 5.036.045; 5.023.322; 4.839.344; 4.410.512; RE33.699) oder synthetisch oder natürlich vorkommende Peptidfragmente von GHRH (US-Patente Nrn. 4.833.166; 4.228.158; 4.228.156; 4.226.857; 4.224.316; 4.223.021; 4.223.020; 4.223.019) für den Zweck einer erhöhten Freisetzung von Wachstumshormon, gerichtet sind. Ein GHRH-Analogon, das die folgenden Mutationen enthält, ist berichtet worden (US-Patent Nr. 5.846.936): Tyr an Position 1 zu His; Ala an Position 2 zu Val, Leu oder anderen; Asn an Position 8 zu Gln, Ser oder Thr; Gly an Position 15 zu Ala oder Leu; Met an Position 27 zu Nle oder Leu; und Ser an Position 28 zu Asn. Das Analogon der vorliegenden Erfindung enthält nicht alle der Aminosäure-Substitutionen, die im US-Patent Nr. 5.846.936 als für die Aktivität erforderlich berichtet sind.
Obschon spezifische Ausführungsformen des US-Patents Nr. 5.756.264 eine Gentherapie betreffen, bei der das therapeutische Gen in myogenes Gewebe übertragen wird, wobei ein in der Beschreibung genanntes Beispiel Wachstumshormon-freisetzendes Hormon ist, unterscheiden zwei wichtige Unterschiede dieses System von der vorliegenden Erfindung. Zunächst betrifft diese Erfindung ein Analogon des Wachstumshormon-freisetzenden Hormons, welches von der Wildtyp-Form mit signifikanten Modifikationen abweicht, die seine Funktion als ein GH-Sekretagog verbessern: verminderte Anfälligkeit gegenüber Proteasen und eine erhöhte Stabilität, was die Durchführbarkeit einer Therapie verlängern würde, und eine erhöhte biologische Aktivität, was die Erzielbarkeit einer Therapie erhöhen würde. Außerdem macht sie in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Gebrauch von einem einzigartigen synthetischen Promotoren, bezeichnet als SPc5–12 (Li et al., 1999), welcher ein proximales Serum Response Element (SRE) aus Seklett-α-Actin, multiplen MEF-2-Stellen, MEF-1-Stellen und TEF-1-Bindungsstellen enthält und die Transkriptionspo tenzen der natürlichen myogenen Promotoren in hohem Maße übertrifft. Die Einzigartigkeit solch eines synthetischen Promotors stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber beispielsweise den herausgegebenen Patenten dar, die einen myogenen Promotoren und seine Verwendung (z.B. US-Patent Nr. 5.374.544) oder Systeme für die myogene Expression einer Nukleinsäuresequenz (z.B. US-Patent Nr. 5.298.422) betreffen.
So lehrt die vorliegende Erfindung die Anwendung eines Analogons, das Mutationen enthält, welche die Hervorrufbarkeit der Freisetzung von Wachstumshormon verbessern. Wie in den Beispielen veranschaulicht, ist dieses Analogon darin erfolgreich, die Freisetzung von Wachstumshormon trotz der Abwesenheit der Substitution an Position 8 zu Gln, Ser oder Thr im Analogon nach dem Stand der Technik zu steigern. Außerdem stellt sie die Gentherapie-Techniken zur Einführung dieses Analogons, dessen Expression durch einen synthetischen myogenen Promotoren reguliert wird, in die bevorzugte Wahl des Skelettmuskelgewebes bereit, da Muskelfaser eine lange Lebensspanne aufweist und durch zirkuläre DNA-Plasmide transduziert werden kann. Dies stellt eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar, nach dem das Erfordernis einer häufigen Verabreichung des GHRH-Proteins es zur Verwendung als einer chronischen Behandlungsform ausschließt.
In WO 92/00095 sind Histidin-substituierte Analoga des Wachstumshormon-freisetzenden Faktors beschrieben. In WO 99/05300 sind ein GHRH-Expressionssystem und Methoden der Anwendung beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Wachstumshormon-freisetzende Hormon, bestehend aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1.
Eine weitere Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon bei Tieren, umfassend SEQ ID NR: 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nukleotidsequenz, die das Wachstumshormon- freisetzende Hormon codiert, bestehend aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1.
Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, umfassend einen Promotor; eine Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, und eine 3'-untranslatierte Region, die für eine funktionale Expression operativ verknüpft ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein synthetischer myogener Promotor. In einer anderen Ausführungsform ist die 3'-untranslatierte Region die hGH3'-untranslatierte Region. Bei spezifischen Ausführungsformen ist der Vektor ausgewählt aus einem Plasmid, einem viralen Vektor, einem Liposom oder einem kationischen Lipid.
Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Vektors, wie hierin beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments bereit, umfassend den Vektor zur Steigerung des Wachstumshormons in einem Tier, zur Behandlung eines Wachstumshormon-bezogenen Mangels in Verbindung mit der Wachstumshormon-Bahn; oder zur Behandlung eines Gewichtsverlusts, Verlusts der Muskelkraft oder Deregulation des Stoffwechsels. Die Erfindung stellt außerdem ein nicht-therapeutisches Verfahren zur Verbesserung der Wachstumsleistung in einem nicht-humanen Tier bereit, umfassend das Einführen eines wie hierin beschriebenen Vektors in das Tier, und ein nicht-therapeutisches Verfahren zur Steigerung des Wachstums in einem nicht-humanen Tier, umfassend das Einführen eines Vektors, wie hierin beschrieben, in das Tier.
Das Tier kann ausgewählt sein aus einem Haustier, einem Nahrungstier und einem Arbeitstier. Der Vektor kann in myogene Zellen des Tiers eingeführt werden. Der Vektor kann in Muskelgewebe des Tiers eingeführt werden. Der Vektor kann in das Tier in einer einzelnen Verabreichung eingeführt werden. Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Vektors gemäß der Erfindung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verbesserung der Wachstumsleistung in einem Tier und die Verwendung eines Vektors gemäß der Erfindung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Steigerung des Wachstums in einem Tier bereit.
Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden durch Lektüre der folgenden Beschreibung und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen, die einen Teil davon bilden, oder jeglicher Beispiele der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zum Zwecke der Beschreibung aufgeführt sind, erkennbar und schließlich leichter verstehbar sein.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A bis 1C zeigen, dass superaktive GHRH-Analoga die GH-sekretagoge Aktivität und Stabilität erhöhen. 1A zeigt einen Vergleich der Schweine-Wildtyp-(1–40)OH-Aminosäuresequenz mit dem Analogon HV-GHRH. 1B zeigt die Wirkung der verschiedenen GHRH-Spezies auf die Schweine-GH-Freisetzung in einer Schweinehypophysen-Primärkultur. 1C zeigt die Veränderungen in der Stabilität, die mit HV-GHRH und Wildtyp-Schweine-GHRH während einer 4- bis 6-stündigen Inkubation auftreten.
2A bis 2E zeigen eine Zunahme der GHRH-, GH- und IGF-1-Serumspiegel über zwei Monate nach Einzelinjektionen des myogenen Expressionsvektors mit dem superaktiven GHRH- Analogon. 2A stellt die Konstrukte dar, die den synthetischen SPc5-12-Promotor und die 3'-UTR von GH enthalten. Als ein Modell des mutierten Proteins wurde HV-GHRH-Konstrukt verwendet und mit dem Schweine-Wildtyp als einer positiven Kontrolle und mit β-Galactosidase-Konstrukt als einer negativen Kontrolle verglichen. 2B veranschaulicht die relativen Mengen an Serum-GHRH in pSP-GHRH-injizierten Schweinen gg. Placebo-injizierten Kontrollschweinen. 2C zeigt die Absolutmengen an Serum-GHRH in pSP-GHRH-injizierten Schweinen gg. Kontrollschweinen, korrigiert für die Zunahme an Gewicht/-Blutvolumen. 2D zeigt eine Variation der GH-Mengen in pSP-HV-GHRH-injizierten Schweinen. 2E zeigt Plasma-IGF-1-Spiegel nach einer direkten intramuskulären Injektion von pSP-GHRH-Konstrukten.
3A bis 3C zeigen die Wirkung von myogenen GHRH-Expressionsvektoren auf das Wachstum von Schweinen. 3A zeigt die Veränderung im mittleren Gewicht bei injizierten Schweinen über zwei Monate mit pSP-GHRH oder pSP- GHRH-HV. 3B zeigt den Status der Nahrungseffizienz bei den pSH-GHRH-injizierten Schweinen gg. Kontrollen. 3C zeigt einen Vergleich eines pSP-HV-GHRH-injizierten Schweins und eines Placebo-injizierten Kontrollschweins 45 Tage nach Injektion.
4 zeigt die Wirkung einer Injektion verschiedener Mengen an pSP-GHRH-HV auf 10 Tage alte Ferkel.
5 zeigt die Wirkung einer Injektion verschiedener Mengen an pSP-GHRH-HV auf die IGF-1-Spiegel bei 10 Tage alten Ferkeln.
6 zeigt den Zeitverlauf einer pSP-GHRH-HV-Plasmidinjektion in Ferkel.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff "Tier", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliche Spezies aus dem Tierreich. Bei bevorzugten Ausführungsformen bezieht er sich spezifischer auf Menschen, als Haustiere verwendete Tiere (Hunde; Katzen, Pferde), als Arbeitstiere verwendete Tiere (Pferde, Kühe) und auf Nahrungstiere, zu denen Tiere zählen, die Nahrung produzieren (Hühner, Kühe, Fische) oder die als selbst Nahrung dienen (Frösche, Hühner, Fische, Krabben, Hummer, Shrimps, Muscheln, Kammmuscheln, Ziegen, Wildscheine, Kühe, Lämmer, Schweine, Straußen, Emus, Aale) und andere im Fachgebiet wohlbekannte Tiere.
Der Begriff "Auszehrungskrankheiten", wie hierin verwendet, ist als Erkrankungen definiert, bei denen ein Gewichtsverlust (meistens Muskelmasse), Verlust der Muskelkraft, Demineralisierung der Knochen (unfreiwillig, ohne bekannten Mechanismus), möglicherweise eine Kombination aus viraler/bakterieller Infektion oder möglicherweise eine Deregulation einiger grundlegender Stoffwechselvorgänge erfolgt. Einige Beispiele dieser Krankheiten sind AIDS, Tuberkulose oder Krebs.
Der Begriff "wirksame Menge", wie hierin verwendet, ist als die Menge der Zusammensetzung definiert, die zum Produzieren einer Wirkung in einem Wirt erforderlich ist und die unter Anlegung mehrerer, den Fachleuten des Gebiets bekannter Endpunkte überwacht werden kann.
Der Begriff "Effizienz", wie hierin verwendet, ist als die Menge an Nahrung definiert, die ein Tier pro Tag aufnimmt, gegenüber der Menge an vom Tier zugenommenen Gewicht.
Der Begriff "Wachstumsdefekte", wie hierin verwendet, ist als jeglicher Gesundheitsstatus, medizinischer Zustand oder Krankheit definiert, in der das Wachstum weniger als normal ist. Der Mangel könnte das Ergebnis einer Abweichung sein, die eine Wachstumshormon-Bahn direkt beeinflusst (wie etwa die GHRH-GH-IGF-1-Achse), eine Wachstumshormon-Bahn indirekt beeinflusst oder eine Wachstumshormon-Bahn überhaupt nicht beeinflusst.
Der Begriff "Wachstumshormon", wie hierin verwendet, ist als ein Hormon definiert, welches sich auf das Wachstum bezieht und als ein chemischer Messenger zur Ausübung seiner Wirkung an einer Zielzelle dient.
Der Begriff "Wachstumshormon-freisetzendes Hormon", wie hierin verwendet, ist als ein Hormon definiert, welches die Freisetzung von Wachstumshormon erleichtert oder stimuliert.
Der Begriff "Wachstumshormon-freisetzendes Hormon-Analogon", wie hierin verwendet, ist als ein Protein definiert, das Aminosäure-Mutationen in der natürlich vorkommenden Form der Aminosäuresequenz (ohne synthetische Dextro- oder cyclische Aminosäuren) enthält, doch in GHRH-Molekül nicht natürlicherweise vorkommt, aber dennoch seine Funktion zur Erhöhung der Synthese und Sekretion des Wachstumshormons beibehält.
Der Begriff "myogen", wie hierin verwendet, bezieht sich spezifisch auf Muskelgewebe.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, wobei die Verabreichung dieser Verbindung durch einen Empfänger-Säuger toleriert werden kann.
Der Begriff "Sekretagog", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein natürliches oder synthetisches Molekül, das die Synthese und Sekretion eines stromabwärtsregulierten Moleküls erhöht (z.B. ist GHRH ein Sekretagog für GH).
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Menge einer verabreichten Verbindung, wobei diese Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn sein Vorhandensein zu einer technischen Veränderung in der Physiologie eines Empfängertiers führt. Zum Beispiel wäre bei der Behandlung von Wachstumsdefekten eine Zusammensetzung, die das Wachstum erhöht, therapeutisch wirksam; bei Auszehrungskrankheiten wäre eine Zusammensetzung, die die Verlustrate senken oder das Wachstum erhöhen würde, therapeutisch wirksam. Einem erfahrenen Fachmann ist klar, dass eine ausreichende Vektormenge verwendet wird, um die Expression einer Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, in therapeutisch wirksamen Mengen zu gewährleisten.
Der Begriff "Behandlungen", wie hierin verwendet, ist als der Akt des günstigen Beeinflussens mindestens eines Symptoms einer Wachstumsdefekt-Erkrankung oder des günstigen Beeinflussens des Wachstums eines Tiers definiert. Einem erfahrenen Fachmann ist klar, dass der Begriff "Behandlungen" nicht notwendigerweise die Heilung bedeutet, obschon eine Heilung des Symptoms oder der Symptome innerhalb des Umfangs des Begriffs Behandlung liegt.
Der Begriff "Vektor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches Vehikel, das eine Nukleinsäure in eine Zelle oder einen Organismus transferiert. Zu Beispielen zählen Plasmide, Virusvektoren, Liposome oder kationische Lipide.
Der Begriff "Auszehrungssymptome", wie hierin verwendet, ist als ein Zustand in Verbindung mit Auszehrungskrankheiten definiert.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Analogon von Wachstumshormon-freisetzendem Hormon, bestehend aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1, und alle Nukleotidsequenzen, die dieselbe codieren.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung die Behandlung von Wachstumshormon-bezogenen Defekten in Verbindung mit der Wachstumshormon-Bahn in einem Tier. Einem Fachmann des Gebiets ist klar, dass solche Defekte in der Wachstumshormon-Bahn sie indirekt oder direkt beeinträchtigen können, wobei der beeinträchtigende Punkt stromaufwärts oder stromabwärts der GHRH-Aktion oder Funktion liegen kann. Ist ein stromabwärts gelegener Punkt der GHRH-Aktion oder Funktion beeinträchtigt, so überwinden erhöhte Mengen des GHRH-Analogons der vorliegenden Erfindung, das ursprünglich in gentherapeutischer Form verabreicht wird, diesen betreffenden Punkt.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform stehen die Wachstumshormon-bezogenen Defekte mit einer genetischen Krankheit im Tier in Verbindung. Der Defekt kann direkt oder indirekt durch die genetische Krankheit verursacht sein, und weitere Phänotypen können ebenfalls vorliegen. Zu Beispielen der genetischen Krankheit zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, das Cohen-Syndrom, das Aminopterin/Methotrexat-Syndrom, das Kabuki-Syndrom, das Wolf-Hirschhorn-Syndrom, das Russell-Silver-Syndrom, die Miller-Dieker-Syndrome, die Langerhanszell-Histiozytose, das Roberts-Syndrom und das 18q-Syndrom.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine verbesserte Wachstumsleistung in einem Tier. Der Begriff "Wachstumsleistung", wie hierin verwendet, ist als das Stadium oder der Status des Wachstums eines Tiers definiert. Die Wachstumsleistung kann die Folge einer genetischen Krankheit, eines wachstumsbezogenen Defekts oder der Exposition einem Wachstums-beeinflussenden Agens entweder des Tiers oder eines Elter des Tiers sein. Das Verfahren zur Verbesserung der Wachstumsleistung in einem Tier umfasst in einer spezifischen Ausführungsform das Verfahren zur Steigerung des Wachstums des Tiers.
Es ist daher möglich, die Produktion von Wachstumshormon in einem Tier in einer größeren Menge zu stimulieren als mit einem normalen Wachstum verbunden. Eine größere Menge als die mit dem normalen Wachstum verbundene beinhaltet das basale, inhärente Wachstum eines Tiers mit einem wachstumsbezogenen Defekt oder eines Tiers mit Wachstumsgraden entsprechend denen von ähnlichen Tieren in der Population, einschließlich solcher ohne wachstumsbezogenen Defekt.
Die Erfindung betrifft auch die Steigerung des Wachstums in einem Tier. Das Tier, dessen Wachstum gesteigert ist, kann einen Wachstumsdefekt aufweisen oder aber nicht.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt ein Vektor vor, der sich aus einem Promotor; einer Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert; und einer 3'-untranslatierten Region, die für eine funktionale Expression operativ verknüpft ist, zusammensetzt. Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen zur Codierung der SEQ ID NR: 1 verwendet werden kann. Die spezifisch zu verwendende Sequenz wird zum Teil auf spezifischen, zu modifizierenden Sequenzen bestimmt, und die experimentellen Bedingungen werden durch den Fachmann des Gebiets für die spezifische Verwendung bestimmt. Wie hierin gezeigt, kann der Fachmann des Gebiets eine GHRH cDNA-Sequenz für eine ortsgerichtete Mutagene zur Schaffung von Veränderungen in der Sequenz verwenden, damit sie sowohl die native oder Spezies-spezifische Sequenz als auch die gewünschten Aminosäure-Substitutionen für Proteaseresistenz etc. enthält. Die hierin bereitgestellten Beispiele richten sich darauf, wie die Nukleotidsequenz mittels Methoden wie der ortsgerichteten Mutagenese verändert werden, um die gewünschte Sequenz zu erhalten. Einem Fachmann des Gebiets ist daher klar, wie eine Nukleotisequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, erhalten wird, indem beispielsweise SEQ ID NR: 8 oder eine ähnliche Sequenz aus GenBank (siehe unten) als einer Matrize zur Erzeugung von Alterationen daran durch ortsgerichtete Mutagenese oder andere bekannte Methoden zum Erhalt der Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, verwendet wird. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1, die aufgrund der Wobble-(dritten)-Position jedes Codons durch multiple Nukleotidsequenzen codiert ist, könnte durch einen Fachmann des Gebiets bei gegebenem Zugang zu GenBank für die Sequenz, den hierin bereitgestellten Methoden für die ortsgerichtete Mutagenese und einer Codontabelle für den genetischen Code, wie z.B. zu finden in jeglichem Standardlehrbuch der Biochemie oder Molekularbiologie (z.B. Biochemistry, 3. Aufl., L. Stryer, W. H. Freeman und Co., N. Y. (1988)) geschaffen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein synthetischer myogener Promotor und ist die 3'-untranslatierte -Region eine hGH-3'-untranslatierte Region. In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein synthetischer Promotor verwendet, bezeichnet als SPc5–12 (Li et al., 1999) (SEQ ID NR: 6), der ein proximales Serum Response Element (SRE) aus skelettalem α-Actin, multiple MEF-2-Stellen, MEF-1-Stellen und TEF-1-Bindungsstellen enthält und welcher die Transkriptionspotenzen der natürlichen myogenen Promotoren in starkem Maße übersteigt. Weitere Elemente, einschließlich trans-agierender Faktor-Bindungsstellen und Enhancer können gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform wird ein natürlicher myogener Promotor verwendet, wobei einem Fachmann des Gebiets klar sein wird, wie diese Promotorsequenzen aus Datenbanken einschließlich der National Center for Biotechnology Information (NCBI)-GenBank-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html) oder der NCBI Pub-Med-Seite (http://ncbi.nlm.nih.gov/Pub/Med/) erhalten werden können. Einem Fachmann des Gebiets wird klar sein, dass diese World Wide Web-Seiten zum Erhalt von Sequenzen oder der relevanten Literatur bezüglich der vorliegenden Erfindung genützt werden können.
Die hGH-3'-untranslatierte Region (SEQ ID NR: 7) kann in einem Nukleinsäure-Vektor, wie etwa einem Plasmid, verwendet werden.
Wie in den Beispielen beschrieben, wird humane GHRH cDNA (SEQ ID NR: 8) als eine Matrize für die ortsgerichtete Mutagenese zur Schaffung von Veränderungen in der Sequenz verwendet, damit diese sowohl die native Schweine-Sequenz als auch die erwünschten Aminosäure-Substitutionen für Proteaseresistenz etc. enthält. So bieten die hierin angegebenen Beispiele Anleitungen dazu, wie die Nukleotidsequenz mit Methoden wie der ortsgerichteten Mutagenese zum Erhalt der gewünschten Se quenz verändert werden. Einem Fachmann des Gebiets ist damit klar, wie eine Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, unter Verwendung beispielsweise der SEQ ID NR: 8 oder einer ähnlichen Sequenz aus GenBank (siehe supra) als einer Matrize zur Erzeugung von Alterationen daran durch ortsgerichtete Mutagenese oder andere bekannte Methoden zum Erhalt der Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, erhalten wird. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1, die durch vielfache Nukleotidsequenzen aufgrund der Wobble-(dritten)-Position jedes Codons codiert ist, könnte ohne weiteres durch einen Fachmann des Gebiets bei gegebenem Zugriff auf GenBank für die Sequenz, der hierin bereitgestellten Methoden für die ortsgerichtete Mutagenese und einer Codontabelle für den genetischen Code, wie zu finden in jedem Standardlehrbuch der Biochemie oder Molekularbiologie (z.B. Biochemistry, 3. Aufl., L. Stryer, W. H. Freeman und Co., N. Y. (1988)), geschaffen werden.
In spezifischen Ausführungsformen ist dieser Vektor ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Plasmid, einem viralen Vektor, einem Liposom oder einem kationischen Lipid. In weiteren spezifischen Ausführungsformen wird dieser Vektor in myogene Zellen oder Muskelgewebe eingeführt. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist das Tier ein Mensch, ein Haustier, ein Arbeitstier oder ein Nahrungstier.
Eine zusätzliche Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon in Tieren, umfassend SEQ ID NR: 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nukleotidsequenz, die das Wachstumhormon-freisetzende Hormon codiert, bestehend aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 1.
Über die spezifische Ausführungsform zur Einführung dieses Konstrukts in das Tier über einen Plasmidvektor können Transfersysteme für die Transfektion von Nukleinsäuren in das Tier oder seine Zellen, die im Fachgebiet bekannt sind, ebenfalls angewendet werden. Zum Beispiel können weitere nicht-virale oder virale Methoden genutzt werden. Ein geübter Fachmann erkennt, dass ein angezieltes System für nicht-virale Formen von DNA oder RNA vier Komponenten erfordert: 1) die DNA oder RNA von Interesse; 2) eine Komponente, die einen Zelloberflächen-Rezeptor oder Antigen erkennt und daran bindet, 3) eine DNA-Bindungskomponente; und 4) eine lytische Komponente, die den Transport des Komplexes von der Zelloberfläche zum Zytoplasma ermöglicht. Weiterhin können Liposome und kationische Lipide für den Transfer der therapeutischen Genkombinationen zur Erzielung desselben Effekts verwendet werden. Zu potenziellen viralen Vektoren zählen Expressionsvektoren, die von Viren wie Adenovirus, Vaccinia-Virus, Herpes-Virus und bovines Papillomvirus, abgeleitet sind. Außerdem können episomale Vektoren verwendet werden. Weitere DNA-Vektoren und Transportersysteme sind im Fachgebiet bekannt.
Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass Expressionsvektoren, die von verschiedenen bakteriellen Plasmiden, Retroviren, Adenoviren, Herpes oder von Vaccinia-Viren abgeleitet sind, zum Transfer der Nukleotidsequenzen zu einem Zielorgan, -gewebe oder -zellpopulation verwendet werden können. Methoden, die den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt sind, können zum Konstruieren rekombinanter Vektoren verwendet werden, die das Gen exprimieren werden, das das Analogon von Wachstumshormon-freisetzendem Hormon codiert. Eine vorübergehende Expression kann einen Monat oder mehr mit einem nicht-replizierenden Vektor und sogar noch länger dauern, wenn geeignete Replikationselemente einen Teil des Vektorsystems darstellen.
Nukleinsäuren
1. Vektoren
Der Begriff "Vektor" wird zur Bezeichnung eines Carriernukleinsäure-Moleküls verwendet, in welches eine Nukleinsäuresequenz für die Einführung in eine Zelle inseriert werden kann, wo sie repliziert werden kann. Eine Nukleinsäuresequenz kann "exogen" sein, was bedeutet, dass sie für die Zelle fremd ist, in die der Vektor einzuführen ist, oder dass die Sequenz homolog zu einer Sequenz in der Zelle ist, doch in einer Position innerhalb der Wirtszell-Nukleinsäure, in der die Sequenz üblicherweise nicht gefunden wird. Zu Vektoren zählen Plasmide, Cosmide, Viren (Bakteriophage, Tierviren und Pflanzenviren) und künstliche Chromosomen (z.B. YACs). Ein Fachmann des Gebiets wäre für die Konstruktion eines Vektors durch standardmäßige raekombinatorische Techniken gut gerüstet, die beschrieben sind bei Maniatis et al., 1988 und Ausubel et al., 1994.
Der Begriff "Expressionsvektor" bezieht sich auf einen Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für zumindest einen Teil eines Genprodukts codiert, das transkribierbar ist. In einer spezifischen Ausführungsform codiert die Nukleinsäuresequenz einen Teil oder die gesamte GHRH. In einigen Fällen werden dann RNA-Moleküle in ein Protein, Polypeptid oder Peptid translatiert. In anderen Fällen werden diese Sequenzen nicht translatiert, zum Beispiel in der Produktion von Antisense-Molekülen oder Ribozymen. Expressionsvektoren können eine Vielzahl von "Kontrollsequenzen" enthalten, was sich auf Nukleinsäuresequenzen bezieht, die für die Transkription und möglicherweise Translation einer operativ verknüpften Codierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Über Kontrollsequenzen hinaus, die die Transkription und Translation regeln, können Vektoren und Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die außerdem weiteren Funktionen dienen und unten beschrieben sind.
a. Promotoren und Enhancer
Ein "Promotor" ist eine Kontrollsequenz, die eine Region einer Nukleinsäuresequenz ist, bei der die Initiation und Rate der Transkription kontrolliert wird. Er kann genetische Elemente enthalten, an denen regulatorische Proteine und Moleküle, wie etwa RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren, binden können. Die Ausdrücke "operativ positioniert" "operativ verknüpft", "unter Kontrolle" und "unter Transkriptionskontrolle" bedeuten, dass ein Promotor in einer korrekten funktionalen Lokalisation und/oder Orientierung bezüglich einer Nukleinsäuresequenz zur Kontrolle der Transkriptionsinitiation und/oder Expression jener Sequenz ist. Ein Promotor kann in Verbindung mit einem "Enhancer" verwendet werden oder auch nicht, welcher sich auf eine cis-agierende regulatorische Sequenz bezieht, die an der Transkriptionsaktivierung einer Nukleinsäuresequenz beteiligt ist.
Ein Promotor kann ein natürlich mit einem Gen oder einer Sequenz assoziierter Promotor sein, wie er durch Isolieren der 5'-nicht-codierenden Sequenzen erhalten werden kann, die stromaufwärts des codierenden Segments und/oder Exons lokalisiert sind. Solch ein Promotor lässt sich als "endogen" bezeichnen. Ähnlich kann ein Enhancer ein natürlicherweise mit einer Nukleinsäuresequenz assoziierter Enhancer sein, der entweder stromabwärts oder stromaufwärts jener Sequenz lokalisiert ist. Alternativ werden bestimmte Vorteile erzielt, indem das codierende Nukleinsäuresegment unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors positioniert wird, was sich auf einen Promotor bezieht, der normalerweise nicht mit einer Nukleinsäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert ist. Ein rekombinanter oder heterologer Enhancer bezieht sich auch auf einen Enhancer, der normalerweise nicht mit einer Nukleinsäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert ist. Zu solchen Promotoren oder Enhancern können Promotoren oder Enhancer weiterer Gene zählen, und Promotoren oder Enhancer, die aus irgendeiner anderen prokaryontischen, viralen oder eukaryontischen Zelle isoliert sind, und Promotoren oder Enhancer, die nicht "natürlich vorkommen", d.h. die verschiedene Elemente von verschiedenen Transkriptions-regulatorischen Regionen enthalten und/oder Mutationen, die die Expression verändern. Über die synthetische Produktion von Nukleinsäuresequenzen der Promotoren und Enhancer hinaus können Sequenzen unter Anwendung einer rekombinanten Klonierungs- und/oder Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie, einschließlich der PCR^TM, in Verbindung mit den hierin beschriebenen Zusammensetzungen, produziert werden (siehe US-Patent Nr. 4.683.202, US-Patent Nr. 5.928.906). Weiterhin wird erwogen, dass die Kontrollsequenzen, die die Transkription und/oder Expression von Sequenzen innerhalb nicht-nuklearer Organellen wie Mitochondrien, Chloroplasten und ähnlichem steuern, ebenfalls verwendet werden können.
Natürlich wird die Verwendung eines Promotors und/oder Enhancers von Wichtigkeit sein, der die Expression des DNA-Segments in dem für die Expression gewählten Zelltyp, Organelle und Organismus wirksam steuert. Fachleuten des Gebiets der Molekularbiologie ist die Verwendung von Promotoren, Enhancern und Zelltyp-Kombinationen für die Proteinexpression allgemein bekannt; siehe zum Beispiel Sambrook et al. (1989). Die verwendeten Promotoren können konstitutiv, gewebe spezifisch, induzierbar und/oder unter den geeigneten Bedingungen zur Steuerung einer hochgradigen Expression des eingeführten DNA-Segments nützlich sein, wie etwa für die großmaßstäbliche Produktion rekombinanter Proteine und/oder Peptide von Vorteil. Der Promotor kann heterolog oder endogen sein. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Promotor ein synthetischer myogener Promotor, wie etwa beschrieben bei Li et al. (1999).
Die Identität der gewebespezifischen Promotoren oder Elemente, als auch Assays zur Charakterisierung ihrer Aktivität, ist den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt. Zu Beispielen solcher Regionen zählen das humane LIMK2-Gen (Nomoto et al., 1999), das Somatostatinrezeptor-2-Gen (Kraus et al., 1998), das murine epididymale Retinoesäure-bindende Gen (Lareyre et al., 1999), humanes CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), Maus-Alpha2-(XI)-Collagen (Tsumaki, et al., 1998), D1A-Dopamin-Rezeptorgen (Lee, et al., 1997), insulinartiger Wachstumsfaktor II (WU et al., 1997), humanes Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (Almendro et al., 1996).
b. Initiationssignale und interne Ribosomenbindungsstellen
Ein spezifisches Initiationssignal mag ebenfalls für die effiziente Translation von Codierungssequenzen erforderlich sein. Zu diesen Signalen zählen das ATG-Initiationscodon oder benachbarte Sequenzen. Exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, müssen möglicherweise bereitgestellt werden. Ein Fachmann des Gebiets wird bei üblicher Sachkenntnis ohne weiteres zur Bestimmung dessen und Bereitstellung der erforderlichen Signale in der Lage sein. Es ist wohlbekannt, dass das Initiationscodon "in-frame" mit dem Leserahmen der gewünschten Codierungssequenz sein muss, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Die exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können entweder natürlich oder synthetisch sein. Die Effizienz der Expression kann durch Aufnahme geeigneter Transkriptionsenhancer-Elemente erhöht werden.
Bei bestimmen Ausführungsformen der Erfindung werden interne Ribosomen-Eintrittsstellen-(IRES)-Elemente zur Schaffung von Multigen-, oder polycistronischen Messages verwendet. IRES-Elemente sind zur Umgehung des Ribosomen-Scanning-Modells der 5'-methylierten Cap-abhängigen Translation und Einleitung der Translation an internen Stellen fähig (Pelletier und Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picorna-Virus-Familie (Polio und Encephalomyocarditis) sind beschrieben worden (Pelletier und Sonenberg, 1988), ebenso wie ein IRES von einer Säuger-Message (Macejak und Sarnow, 1991). IRES-Elemente können an heterologe offene Leserahmen geknüpft werden. Multiple offene Leserahmen können gemeinsam transkribiert werden, wenn jeweils durch ein IRES getrennt, was polycistronische Messages schafft. Dank des IRES-Elements ist jeder offene Leserahmen für Ribosomen für eine effiziente Translation zugänglich. Multiple Gene können unter Verwendung eines einzelnen Promotors/Enhancers zur Transkribierung einer einzelnen Message wirksam exprimiert werden (siehe US-Patent Nrn: 5.925.565 und 5.935.819).
c. Multiple Klonierungsstellen
Vektoren können eine multiple Klonierungsstelle (MCS) enthalten, welches eine Nukleinsäure-Region ist, die multiple Restriktionsenzymstellen enthält, von denen jede in Verbindung mit einer standardmäßigen rekombinanten Technologie zum Verdau des Vektors verwendet werden kann. (Siehe Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, und Cocea 1997). "Restriktionsenzym-Verdau" bezieht sich auf die katalytische Spaltung eines Nukleinsäure-Moleküls mit einem Enzym, das lediglich an spezifischen Lokalisationen in einem Nukleinsäure-Molekül funktioniert. Viele dieser Restriktionsenzyme sind kommerziell verfügbar. Die Verwendung solcher Enzyme ist bei Fachleuten des Gebiets breit verstanden. Häufig wird ein Vektor linearisiert oder unter Verwendung eines Restriktionsenzyms fragmentiert, das innerhalb der MCS schneidet, um exogenen Sequenzen die Ligation an den Vektor zu ermöglichen. "Ligation" bezieht sich auf den Vorgang der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei Nukleinsäure-Fragmenten, die aneinander angrenzen können oder auch nicht. Techniken unter Einbeziehung von Restriktionsenzymen und Ligationsreaktionen sind den Fachleuten des Gebiets der rekombinanten Technologie wohlbekannt.
d. Splicing-Stellen
Die am meisten transkribierten eukaryontischen RNA-Moleküle werden einem RNA-Splicing zur Entfernung von Introns von den primären Transkripten unterzogen. Ge nomische eukaryontische Sequenzen enthaltende Vektoren erfordern möglicherweise Donor- und/oder Akzeptor-Splicing-Stellen, um eine korrekte Prozessierung des Transkripts für die Proteinexpression zu gewährleisten. (Siehe Chandler et al., 1997).
e. Polyadenylierungssignale
Bei der Expression wird typischerweise ein Polyadenylierungssignal aufgenommen, um die korrekte Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Die Beschaffenheit des Polyadenylierungssignals wird für die erfolgreiche Ausführung der Erfindung für nicht entscheidend gehalten und/oder es kann eine beliebige derartige Sequenz verwendet werden. Zu bevorzugten Ausführungsformen zählen das SV40-Polyadenylierungssignal und/oder das Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal, das bequem geeignet und/oder in verschiedenen Zielzellen als gut funktionierend bekannt ist. Ebenfalls als ein Element der Expressionskassette erwogen wird eine Transkriptionsterminationsstelle. Diese Elemente können zur Erhöhung der Message-Grade und/oder zur Minimierung des Durchlesens von der Kassette in andere Sequenzen dienen.
f. Replikationsursprünge
Um einen Vektor in einer Wirtszelle zu vermehren, kann er ein oder mehrere Ursprünge von Replikationsstellen (oftmals bezeichnet als "ori") enthalten, was eine spezifische Nukleinsäuresequenz ist, an der die Replikation eingeleitet wird. Alternativ kann eine autonom replizierende Sequenz (ARS) verwendet werden, wenn die Wirtszelle eine Hefe ist.
g. Selektierbare und screenbare Marker
Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Zellen das Nukleinsäure-Konstrukt der vorliegenden Erfindung, da eine Zelle in vitro oder in vivo durch Aufnahme eines Markers in den Expressionsvektor identifiziert werden kann. Solche Marker würden der Zelle eine identifizierbare Veränderung verleihen, was eine leichte Identifizierung der den Expressionsvektor enthaltenden Zellen ermöglicht. Generell ist ein selektierbarer Marker ein solcher, der eine Eigenschaft verleiht, die die Selektion ermöglicht. Ein positiver selektierbarer Marker ist ein solcher, dessen Vorhandensein seine Selektion ermöglicht, wohingegen ein negativer selektierbarer Marker ein solcher ist, dessen Vorhandensein seine Selektion verhindert. Ein Beispiel eines positiven selektierbaren Markers ist ein Wirkstoffresistenz-Marker.
Gewöhnlich ist die Aufnahme eines Wirkstoff-Selektionsmarkers bei der Klonierung und Identifizierung von Transformanten hilfreich; so sind zum Beispiel Gene, die eine Resistenz gegenüber Neomycin, Puromycin, Hygromycin, DHFR, GPT, Zeocin und Histidinol verleihen, nützliche selektierbare Marker. Über Marker hinaus, die einen Phänotyp verleihen, der die Unterscheidung von Transformanten auf der Grundlage der Implementierung von Bedingungen ermöglicht, werden auch weitere Typen von Markern, einschließlich screenbarer Marker wie GFP, deren Grundlage die kolorimetrische Analyse ist, erwogen. Alternativ können screenbare Enzyme wie Herpessimplex-Virus-Thymidinkinase (tk) oder Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) verwendet werden. Ein Fachmann des Gebiets wüsste auch, wie immunologische Marker, möglicherweise in Verbindung mit der FACS-Analyse, anzuwenden wären. Der speziell verwendete Marker wird nicht für bedeutsam gehalten, solange er gleichzeitig mit der Nukleinsäure, die ein Genprodukt codiert, exprimierbar ist. Weitere Beispiele der selektierbaren und screenbaren Marker sind einem Fachmann des Gebiets wohlbekannt.
2. Wirtszelle
Wie hierin verwendet, können die Begriffe "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" austauschbar verwendet werden. Alle diese Begriffe umfassen auch ihre Nachkommenschaft, was jegliche und alle nachfolgenden Generationen meint. Es ist selbstverständlich, dass möglicherweise nicht die gesamte Nachkommenschaft aufgrund bewusster oder unabsichtlicher Mutationen identisch ist. Im Zusammenhang mit der Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz bezieht sich "Wirtszelle" auf eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle, und umfasst jegliche transformierbare Organismen, die zur Replizierung eines Vektors und/oder Exprimierung eines heterologen Gens, das durch einen Vektor codiert ist, fähig sind. Eine Wirtszelle kann, und wurde, als ein Rezipient für Vektoren verwendet werden. Eine Wirtszelle kann "transfiziert" oder "transformiert" sein, was sich auf einen Prozess bezieht, durch den exogene Nukleinsäure in die Wirtszelle transferiert oder eingeführt wird. Eine transformierte Zelle beinhaltet die primäre Spenderzelle und ihre Nachkommenschaft.
Wirtszellen können von Prokaryonten oder Eukaryonten abgeleitet sein, was davon abhängt, ob das gewünschte Ergebnis eine Replikation des Vektors oder Expression eines Teils oder der gesamten Vektor-codierten Nukleinsäuresequenzen ist. Zahlreiche Zelllinien und Kulturen stehen zur Verwendung als einer Wirtszelle zur Verfügung und können bezogen werden von der American Type Culture Collection (ATCC), welches eine Organisation ist, die als ein Archiv für lebende Kulturen und genetische Materialien dient (www.atcc.orq). Ein geeigneter Wirt kann von einem Fachmann des Gebiets ausgehend von dem Vektor-Rückgrat und dem gewünschten Ergebnis bestimmt werden. Ein Plasmid oder Cosmid kann zum Beispiel in eine prokaryontische Wirtszelle für die Replikation vieler Vektoren eingeführt werden. Zu Bakterienzellen, die als Wirtszellen für die Vektor-Replikation und/oder -Expression verwendet werden, zählen DH5a, JM109 und KC8, als auch eine Anzahl kommerziell verfügbarer Bakterienwirte, wie etwa SURE^® Competent Cells und SOLOPACKä Gold Cells (STRATAGENE^®, La Jolla). Alternativ könnten Bakterienzellen wie E. coli LE392 als Wirtszellen für Phagenviren verwendet werden.
Zu Beispielen für eukaryontische Wirtszellen für die Replikation und/oder Expression eines Vektors zählen HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos und PC12. Viele Wirtszellen von verschiedenen Zelltypen und Organismen sind verfügbar und sind einem Fachmann des Gebiets bekannt. Entsprechend kann ein Virusvektor in Verbindung entweder mit einer eukaryontischen oder einer prokaryontischen Wirtszelle verwendet werden, insbesondere einer, die für die Replikation oder Expression des Vektors permissiv ist.
Einige Vektoren können Kontrollsequenzen verwenden, die ihnen erlauben, sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen repliziert und/oder exprimiert zu werden. Ein Fachmann des Gebiets würde weiterhin die Bedingungen verstehen, unter denen alle der oben beschriebenen Wirtszellen inkubiert werden, um sie aufzubewahren oder um die Replikation eines Vektors zu ermöglichen. Ebenfalls verstanden und bekannt sind die Techniken und Bedingungen, die eine großmaßstäbliche Produktion von Vektoren erlauben würden, ebenso wie die Produktion von Nu kleinsäuren, die durch Vektoren codiert sind, und deren kognaten Polypeptiden, Proteinen oder Peptiden.
3. Expressionssysteme
Es existieren zahlreiche Expressionssysteme, die zumindest einen Teil oder alle der oben erörterten Zusammensetzungen umfassen. Auf Prokaryonten und/oder Eurkaryonten basierende Systeme können zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um Nukleinsäuresequenzen oder deren kognate Polypeptide, Proteine oder Peptide zu erzeugen. Viele dieser Systeme sind kommerziell und breit verfügbar.
Das Insektenzell/Baculovirus-System kann einen hohen Grad an Proteinexpression eines heterologen Nukleinsäuresegments produzieren, wie etwa beschrieben in US-Patenten Nrn. 5.871.986, 4.879.236, die beide hierin als Verweise aufgenommen sind, und die zum Beispiel unter dem Namen MAXBAC^® 2.0 von INVITROGEN^® und BACKPACK^TM BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM FROM CLONTECH^® erworben werden können.
Zu weiteren Beispielen der Expressionssysteme zählen STRATAGENE^® COMPLETE CONTROL Inducible Mammalian Expression System, welches einen synthetischen Ecdyson-induzierbaren Rezeptor, oder sein pET-Expressionssystem, ein E. coli-Expressionssystem, einbeziehen. Ein weiteres Beispiel eines induzierbaren Expressionssystems ist beziehbar von INVITROGEN^®, welches das T-REXTM (Tetracyclin-reguliertes Expressions)-System trägt, ein induzierbares Säugerexpressionssystem, welches den Volllängen-CMV-Promotor verwendet. INVITROGEN^® liefert auch ein Hefe-Expressionssystem, bezeichnet als das Pichia methanolica-Expressionssystem, welches für eine hochgradige Produktion von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia methanolica designed ist. Ein Fachmann des Gebiets wüsste, wie ein Vektor, z.B. ein Expressionskonstrukt, zu exprimieren wäre, um eine Nukleinsäuresequenz oder ihr kognates Polypeptid, Protein oder Peptid zu produzieren.
Mutagenese
Wo angewandt, wird die Mutagenese mittels einer Vielzahl standardmäßiger mutagener Verfahrensweisen erreicht. Die Mutation stellt einen Vorgang dar, bei dem Veränderungen in der Quantität oder Struktur eines Organismus erfolgen. Eine Mutation kann die Modifikation der Nukleotidsequenz eines einzelnen Gens, von Blöcken der Gene oder des gesamten Chromosoms einbeziehen. Veränderungen in einzelnen Genen können die Folge von Punktmutationen sein, diel die Entfernung, Addition oder Substitution einer einzelnen Nukleotidbase innerhalb einer DNA-Sequenz einbeziehen, oder können die Folge von Veränderungen unter Einbeziehung der Insertion oder Deletion großer Anzahlen von Nukleotiden sein.
Mutationen können spontan als Folge von Ereignissen entstehen, wie zum Beispiel Fehlern in der Übereinstimmung der DNA-Replikation oder der Bewegung transposabler genetischer Elemente (Transposons) innerhalb des Genoms. Sie werden auch durch Einwirkung chemischer oder physikalischer Mutagene induziert. Zu solchen Mutations-induzierenden Mitteln zählen ionisierende Bestrahlungen, Ultraviolettlicht und eine vielfältige Reihe von Chemikalien wie Alkylierungsmittel und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, die allesamt entweder zum direkten oder indirekten Wechselwirken (generell als Folge einiger metabolischer Biotransformationen) mit Nukleinsäuren fähig sind. Die durch solche Umweltagenzien induzierten DNA-Läsionen können zu Modifikationen der Basensequenz führen, wenn die betroffene DNA repliziert oder repariert wird, und somit zu einer Mutation. Eine Mutation kann auch unter Anwendung spezieller zielgerichteter Methoden ortsspezifisch sein.
Ortsgerichtete Mutagenese
Eine strukturgelenkte ortsspezifische Mutagenese stellt ein wirksames Mittel für die Dissektion und gentechnische Konstruktion von Protein-Ligand-Wechselwirkungen dar (Wells, 1996, Braisted et al., 1996). Die Technik liefert die Herstellung und Testung von Sequenzvarianten durch Einführen einer oder mehrerer Veränderungen an der Nukleotidsequenz in einer ausgewählten DNA.
Die ortsspezifische Mutagenese verwendet spezifische Oligonukleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation codieren, als auch eine ausreichende Anzahl benachbarter, unmodifizierter Nukleotide. Auf diese Weise wird eine Primersequenz von ausreichender Größe und Komplexität zur Bildung eines stabilen Duplex auf beiden Seiten der zu überquerenden Deletions-Junktion bereitgestellt. Ein Primer von etwa 17 bis 25 Nukleotiden Länge ist bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Junktion der Sequenz verändert sind.
Die Technik wendet typischerweise einen Bakteriophagen-Vektor an, der sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form existiert. Zu den bei der ortsgerichteten Mutagenese nützlichen Vektoren zählen Vektoren wie der M13-Phage. Diese Phagen-Vektoren sind kommerziell verfügbar und ihre Anwendung den Fachleuten des Gebiets allgemein wohlbekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenfalls routinemäßig bei der ortsgerichteten Mutagenese verwendet, was den Schritt der Transferierung des Gens von Interesse von einem Phagen zu einem Plasmid umgeht.
Im Allgemeinen wird zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten, oder werden zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors verschmolzen, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die das gewünschte Protein oder genetische Element codiert. Ein synthetisch hergestellter Oligonukleotid-Primer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird dann mit dem einzelsträngigen DNA-Präparat vereinigt, wobei dem Grad der Fehlpaarung Rechnung getragen wird, wenn die Hybridisationsbedingungen ausgewählt werden. Das hybridisierte Produkt wird DNA-polymerisierenden Enzymen unterzogen, wie etwa E. coli-Polymerase I (Klenow-Fragment), um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs zu vervollständigen. Auf diese Weise wird ein Heteroduplex gebildet, worin ein Strang die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz codiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann zum Transformieren geeigneter Wirtszellen, wie etwa E. coli-Zellen, verwendet, und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenz-Anordnung tragen.
Eine umfassende Information zur funktionalen Signifikanz und dem Informationsgehalt eines gegebenen Proteinrests lässt sich am besten durch Sättigungsmutagenese erhalten, bei der alle 19 Aminosäure-Substitutionen untersucht werden. Die Unzulänglichkeit dieses Ansatz besteht darin, dass die Logistik der Sättigungsmutagesene von vielen Resten abschreckend ist (Warren et al., 1996, Brown et al., 1996; Zeng et al., 1996; Burton und Barbas, 1994; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996). Hunderte, und möglicherweise sogar Tausende, ortsspezifischer Mutanten müssen untersucht werden. Allerdings machen verbesserte Techniken die Produktion und das schnelle Screening von Mutanten wesentlich unkomplizierter. Siehe auch US-Patente Nrn. 5.798.208 und 5.830.650 für eine Beschreibung einer "Walk-Through"-Mutagenese.
Weitere Methoden der ortsgerichteten Mutagenese sind beschrieben in US-Patenten Nrn. 5.220.007; 5.284.760; 5.354.670; 5.366.878; 5.389.514; 5.635.377 und 5.789.166.
In vitro-Scanning-Mutagenese
Eine Random Mutagenese kann unter Anwendung einer fehlerhaften (error-prone) PCR eingeführt werden (Cadwell und Joyce, 1992). Die Rate der Mutagenese kann unter Durchführung der PCR in verschiedenen Röhrchen mit Verdünnungen der Matrizen erhöht werden.
Eine besonders nützliche Mutagenese-Technik ist die Alanin-Scanning-Mutagenese, bei der eine Anzahl von Resten individuell mit der Aminosäure Alanin substituiert sind, so dass die Effekte des Verlusts der Seitenketten-Wechselwirkungen bestimmt werden können und zugleich das Risiko von umfangreichen Störungen in der Proteinkonformation (Cunningham et al., 1989) minimiert ist.
In den letzten Jahren wurden Techniken zur Auswertung der Gleichgewichtskonstante für die Ligandenbindung unter Verwendung winziger Mengen an Protein entwickelt (Blackburn et al., 1991; US-Patente Nrn. 5.221.605 und 5.238.808). Die Möglichkeit der Durchführung funktioneller Assays mit geringen Mengen an Material kann zur Entwicklung hocheffizienter in vitro-Methodologien für die Sättigungsmutagenese von Antikörpern genützt werden. Die Erfinder umgingen die Klonierungsschritte durch Kombinieren der PCR-Mutagenese mit einer gekoppelten in vitro-Transkription/Translation für die Hochdurchsatz-Generierung von Proteinmutanten. Hierbei werden die PCR-Produkte direkt als der Matrize für die in vitro-Transkription/Translation der mutierten Einzelketten-Antikörper verwendet. Aufgrund der hohen Effizienz, mit der alle 19 Aminosäure-Substitutionen generiert und in dieser Weise analysiert werden können, ist nun die Durchführung einer Sättigungsmutagenese an zahlreichen Resten von Interesse möglich, ein Prozess, der als in vitro-Scanning-Sättigungsmutagenese beschrieben werden kann (Burks et al., 1997).
Die in vitro-Scanning-Sättigungsmutagenese liefert ein schnelles Verfahren zum Erhalt einer großen Menge an Struktur-Funktion-Information, einschließlich: (i) der Identifizierung der Reste, die die Ligand-Bindungsspezifität modulieren; (ii) eines besseren Verständnisses der Ligandenbindung auf der Grundlage der Identifizierung jener Aminosäuren, die eine Aktivität beibehalten, und jener, die die Aktivität an einer gegebenen Lokalisation aufheben, (iii) einer Abschätzung der Gesamtplastizität einer aktiven Stelle oder Protein-Subdomäne, (iv) der Identifizierung von Aminosäure-Substitutionen, die zu einer erhöhten Bindung führen.
Dosierung und Formulierung
Die Zusammensetzung (aktive Inhaltsstoffe; zum Beispiel SEQ ID NR: 1 oder die Nukleotidsequenz, die sie codiert, oder ein Vektor mit der Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert) dieser Erfindung kann zur Bewirkung einer Vielzahl von wachstumsdefizienten Zuständen mittels jeglicher Methode formuliert und verabreicht werden, die den Kontakt des aktiven Inhaltsstoffs mit der Wirkstelle des Agens im Körper eines Tiers erzeugt. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist als ein Vektor definiert, der eine Nukleotidsequenz enthält, die die Verbindung der Erfindung codiert, welcher ein hierin beschriebenes Aminosäuresequenz-Analogon ist. Die Zusammensetzung wird in ausreichender Menge verabreicht, um eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu erzeugen. Einem geübten Fachmann ist klar, dass eine ausreichende Vektormenge zur Bereitstellung der Expression einer Nukleotidsequenz, die SEQ ID NR: 1 codiert, in therapeutisch wirksamen Graden verwendet wird. Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass die Begriffe "verabreicht" und "eingeführt" austauschbar verwendet werden können.
Die Zusammensetzung kann mittels jeglicher herkömmlichen Methode verabreicht werden, die zur Anwendung in Verbindung mit Pharmazeutika entweder als individuelle therapeutische Wirkstoffe oder in einer Kombination von therapeutischen Wirkstoffen zur Verfügung steht. Diese können alleine verabreicht werden, werden aber generell mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der auf der Grundlage des gewählten Verabreichungswegs und der standardmäßigen pharmazeutischen Praxis ausgewählt wird. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für therapeutische oder diagnostische Zwecke in der klinischen Medizin, sowohl der Human- als auch Veterinärmedizin, eingesetzt werden. Zum Beispiel sind sie in der Behandlung von wachstumsbezogenen Störungen, wie etwa dem hypophysären Minderwuchs und Diabetes als Folge von Abnormalitäten in der Wachstumshormon-Produktion nützlich. Weiterhin können Sie auch zur Stimulierung des Wachstums oder Erhöhung der Nahrungseffizienz von Tieren, die für die Fleischproduktion gezüchtet werden, zur Steigerung der Milchproduktion und Stimulierung der Eierproduktion, verwendet werden.
Die verabreichte Dosis wird eine therapeutisch wirksame Menge an aktivem Inhaltsstoff sein und wird natürlich in Abhängigkeit von bekannten Faktoren, wie etwa den pharmakodynamischen Charakteristika des speziellen aktiven Inhaltsstoffs und seiner Verabreichungsform und -weg; der Art von Tier; dem Alter des Empfängers; dem Geschlecht des Empfängers; der Gesundheit des Empfängers; dem Gewicht des Empfängers; der Art und dem Umfang der Symptome; der Art von Begleitbehandlung; der Häufigkeit der Behandlung; und der gewünschten Wirkung abhängen. Geeignete Dosierungen der zu verabreichenden Vektoren der Erfindung werden in Abhängigkeit von dem einzelnen Lebewesen und der zu behandelnden Bedingung etwas variieren. Ein geübter Fachmann wird zur Bestimmung der geeigneten Dosierungen ausgehend von den bekannten zirkulierenden Mengen an Wachstumshormon in Verbindung mit einem normalen Wachstum und der Wachstumshormon-freisetzenden Aktivität des Vektors in der Lage sein. Wie im Fachgebiet wohlbekannt, wird die Behandlung von wachstumsbezogenen Störungen von Individuum zu Individuum variierende Dosen in Abhängigkeit vom Grad der Insuffizienz der Wachstumshormon-Produktion erfordern. Die zur Stimulierung der Wachstumsaktivität bei Nutztieren verwendete Dosis wird signifikant höher sein (pro kg des Gewichts des Lebewesens) als die zur Wiederherstellung eines normalen Wachstums in Fällen von Wachstumshormon-Mängeln wie dem pituitären Zwergenwuchs bei Menschen verwendete Dosis.
Daher wird gemäß dieser Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von wachstumsbezogenen Störungen bereitgestellt, die durch eine unzureichende Produktion von Wachstumshormon gekennzeichnet sind, welches das Verabreichen einer ausreichenden Menge des Analogons dieser Erfindung zur Stimulierung der Produktion von Wachstumshormon auf mit einem normalen Wachstum verbundene Mengen umfasst. Normale Mengen an Wachstumshormon variieren innerhalb der Lebewesen beträchtlich, und bei jedem einzelnen Lebewesen variieren die Mengen an zirkulierendem Wachstumshormon im Laufe des Tages beträchtlich.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Tieren durch Verabreichen einer ausreichenden Menge des GHRH-Analogons der Erfindung zur Stimulierung der Produktion von Wachstumshormon auf eine höhere Menge als der mit einem normalen Wachstum verbundenen Menge.
Verabreichung der Gentherapie: Wo geeignet, können die Gentherapie-Vektoren zu Präparaten in fester, halbfester, flüssiger oder gasförmiger Form in den im Fachgebiet für ihren jeweiligen Verabreichungsweg bekannten Weisen formuliert werden. Es können im Fachgebiet bekannte Methoden zur Vermeidung der Freisetzung und Absorption der Zusammensetzung angewendet werden, bis diese das Zielorgan erreicht hat oder um eine zeitverzögerte Freisetzung der Zusammensetzung zu gewährleisten. Eine pharmazeutisch akzeptable Form sollte eingesetzt werden, welche die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nicht unwirksam macht. In pharmazeutischen Dosierungsformen können die Zusammensetzung alleine oder in geeigneter Verbindung als auch in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen verwendet werden.
Demgemäß kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung über verschiedene Wege und an verschiedene Stellen im Körper eines Tiers zur Erzielung einer bestimmten Wirkung verabreicht werden (siehe z.B. Rosenfeld et al., (1991); Rosenfeld et al., (1991a); Jaffe et al., (1992)). Ein Fachmann des Gebiets wird erkennen, dass, obschon mehr als ein Weg für die Verabreichung gewählt werden kann, ein bestimmter Weg eine sofortigere und wirksamere Reaktion als ein anderer Weg erzielen kann. Eine lokale oder systemische Verabreichung kann durch eine Verabreichung, bestehend aus Applikation oder Instillation der Formulierung in Körperhöhlen, Inhalation oder Insufflation eines Aerosols, oder durch parenterale Einführung, umfassend die intramuskuläre, intravenöse, peritoneale, subkutane, intradermale als auch topische Verabreichung, erzielt werden.
Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass verschiedene Übertragungsmethoden zur Verabreichung eines Vektors in eine Zelle angewendet werden können. Zu Beispielen zählen: (1) Methoden unter Ausnützung physikalischer Mittel, wie etwa die Elektroporation (Elektrizität), einer Genpistole (physikalische Kraft) oder die Anwendung großer Volumina einer Flüssigkeit (Druck); und (2) Methoden, bei denen der Vektor zu einer anderen Entität komplexiert wird, wie etwa einem Liposom oder Transportermolekül.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transferieren eines therapeutischen Gens in einen Wirt bereit, welches das Verabreichen des Vektors der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise als Teil einer Zusammensetzung, unter Anwendung jeglicher der zuvor genannten Verabreichungswege oder den Fachleuten des Gebiets bekannten Alternativen und für eine spezielle Anwendung geeigneten Wegen umfasst. Ein effektiver Gentransfer eines Vektors in eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung kann bezüglich der therapeutischen Wirkung (z.B. Milderung eines mit der speziell zu behandelnden Erkrankung verbundenen Symptoms), oder weiter durch Nachweis des transferierten Gens oder der Expression des Gens innerhalb des Wirts (z.B. unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion in Verbindung mit der Sequenzierung, Northern- oder Southern-Hybridisationen oder Transkriptions-Assays zum Nachweis der Nukleinsäure in Wirtszellen, oder unter Anwendung der Immunoblot-Analyse, der Antikörper-vermittelten Detektion, mRNA oder Protein-Halbwertszeit-Studien, oder partikularisierter Assays zum Nachweis von Protein oder Polypeptid, das durch die transferierte Nukleinsäure codiert ist, oder in seiner Menge oder Funktion aufgrund des Transfers beeinträchtigt ist) überwacht werden.
Diese hierin beschriebenen Methoden sind in keinster Weise allumfassend, und weitere Methoden, die der spezifischen Anwendung genüge tun, werden für einen Fachmann bei üblicher Sachkenntnis erkennbar sein. Darüber hinaus kann die wirksame Menge der Zusammensetzungen durch Analogie zu Verbindungen weiter angenähert werden, die für die Erzielung der gewünschten Wirkung bekannt sind.
Außerdem kann die tatsächliche Dosis und das Schema in Abhängigkeit davon variieren, ob die Zusammensetzungen in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, oder in Abhängigkeit von interindividuellen Unterschieden bei Pharmakokinetiken, Wirkstoffdisposition und Metabolismus. In ähnlicher Weise können die Mengen bei in vitro-Anwendungen in Abhängigkeit von der speziell verwendeten Zelllinie variieren (z.B. basierend auf der Anzahl von auf der Zelloberfläche vorhandenen Vektorrezeptoren oder der Fähigkeit des speziell für den Gentransfer verwendeten Vektors zum Replizieren in jener Zelllinie) variieren. Weiterhin wird die Menge an pro Zelle zugesetztem Vektor wahrscheinlich mit der Länge und Stabilität des in Vektor inserierten therapeutischen Gens, ebenso wie der Natur der Sequenz, variieren und ist insbesondere ein Parameter, der empirisch bestimmt werden muss, und kann aufgrund von Faktoren verändert werden, die den Methoden der vorliegenden Erfindung nicht inhärent sind (zum Beispiel die mit der Synthese verbundenen Kosten). Ein Fachmann des Gebiets kann ohne weiteres jede der erforderlichen Anpassungen entsprechend den Dringlichkeiten der speziellen Situation vornehmen.
Die folgenden Beispiele sollen der Veranschaulichung dienen, sollen aber den Rahmen der Erfindung in keinster Weise einschränken.
BEISPIEL 1
Superaktive GHRH-Analoga erhöhen die GH-sekretagoge Aktivität und Stabilität GHRH weist eine relativ kurze Halbwertszeit von etwa 12 Minuten im Kreislaufsystem sowohl des Menschen (Frohman et al., 1984) als auch des Schweins auf. Durch Verwendung von GHRH-Analoga, die seine biologische Halbwertszeit verlängern und/oder die GH-sekretagoge Aktivität erhöhen, wird eine vermehrte GH-Sekretion erreicht. GHRH-Mutanten wurden durch ortsgerichtete Mutagenese generiert. Gly15 wurde für Ala15 substituiert, um die α-helikale Konformation und die amphiphile Struktur zur Herabsetzung der Spaltung durch Trypsin-artige Enzyme zu verbessern (Su et al., 1991). GHRH-Analoga mit Ala15-Substitutionen zeigen eine 4–5-fach größere Affinität für den GHRH-Rezeptor (Campbell et al., 1991). Um den Verlust der biologischen Aktivität aufgrund einer Oxidation des Met mit etwas stabileren Formen unter Verwendung von Molekülen mit einem freien COOH-Terminus zu reduzieren (Kubiak et al., 1989), wurde die Substitution von Met27 und Ser28 für Leu27 und Asn28 vorgenommen. Auf diese Weise wurde eine dreifach Aminosäure-substituierte Mutante, bezeichnet als GHRH-15/27/28, erzeugt. Dipeptidylpeptidase IV ist das entscheidende Serum-GHRH-degradative Enzym (Walter et al., 1980; Martin et al., 1993). Schwächere Dipeptidase-Substrate wurden unter Verwendung von GHRH15/27/28 und dann durch Ersetzen von Ala2 durch Ile2 (GHRH-TI) oder durch Val2 (GHRH-TV) oder durch Umwandeln von Tyr1 und Ala2 zu His1 und Val2 (GHRH-HV (1A); H1V2A15L27N28) geschaffen.
BEISPIEL 2
DNA-Konstrukte
Um die biologische Potenz der mutierten Schweine-GHRH cDNA-Sequenzen zu testen, wurden Plasmidvektoren gentechisch hergestellt, die zum Steuern des höchsten Grades einer Skelettmuskel-spezifischen Genexpression durch einen neu beschriebenen synthetischen Muskelpromotoren, SPc5–12, fähig sind, der ein proximales Serum Response Element von skelettalem α-Actin, multiple MEF-2-Stellen, multiple MEF-1-Stellen und TEF-1-Bindungsstellen enthält (Li et al., 1999). Ein 228-bp-Fragment von pGHRH, welches das 31 Aminosäure-Signalpeptid codiert, und das gesamte reife Schweine-GHRH- Peptid (Tyr1-Gly40) und/oder die GHRH-Mutanten, gefolgt von der 3'-untranslatierten Region von hGH cDNA, wurden in myogene GHRH-Expressionsvektoren mittels im Fachgebiet wohlbekannter Methoden eingebaut. Das Plasmid pSPc5–12 enthält ein 360 bp SacI/BamHI-Fragment des synthetischen SPc5–12-Promotors (Li et al., 1999) in den SacI/BamHI-Stellen des pSK-GHRH-Rückgrats (Draghia-Akli et al., 1997).
Die Wildtyp- und mutierten Schweine-GHRH cDNAs wurden durch ortsgerichtete Mutagenese von humaner GHRH cDNA (SEQ ID NR: 8) unter Verwendung des Kits Altered Sites II in vitro Mutagenesis System (Promega; Madison, WI) erhalten. Die humane GHRH cDNA wurde als ein BamHI-HindIII-Fragment in die entsprechenden Stellen des pALTER-Promega-Vektors subkloniert und die Mutagenese wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers vorgenommen. Die Wildtyp-Schweine-cDNA wurde aus der humanen cDNA durch Austausch der humanen Aminosäuren 34 und 38 unter Verwendung des Primers der SEQ ID NR: 2 erhalten:
5'-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGCAG-3'.
Die Schweine-HV-Mutationen wurden mit dem Primer der SEQ ID NR: 3 vorgenommen:
5'-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3'.
Die Schweine-15Ala-Mutation wurde mit dem Primer der SEQ ID NR: 4 vorgenommen:
5'-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3'.
Die Schweine-27Leu28Asn-Mutation wurde mit dem Primer der SEQ ID NR: 5 vorgenommen:
5'-CTGCTCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3'.
Auf die Mutagenese hin wurden die resultierenden Klone sequenziert, um ihre Richtigkeit zu bestätigen, und anschließend in die BamHI/HindIII-Stellen von pSK-GHRH wie in diesem Beispiel beschrieben mittels den Fachleuten des Gebiets wohlbekannten Methoden subkloniert.
Einem geübten Fachmann ist klar, dass anstelle der SEQ ID NR: 8 andere GHRH-Sequenzen verwendet werden können, einschließlich jener von Mus-Musculus (SEQ ID NR: 9; GenBank Zugriffsnummer NM_010285); Bos-Taurus (SEQ ID NR: 10; GenBank Zugriffsnummer AF168686 oder SEQ ID NR: 11; GenBank Zugriffsnummer BTU29611); Equus caballus (SEQ ID NR: 12; GenBank Zugriffsnummer AF097587); Rattus norvegicus (SEQ ID NR: 13; GenBank Zugriffsnummer RNU10156).
BEISPIEL 3
Zellkultur und Transfektion
Experimente wurden sowohl in Schweine-Hypophysenvorderlappen-Kultur als auch Hühnermyoblasten-Primärkulturen mit gleichem Erfolg durchgeführt. Alle Figuren zeigen jedoch Daten, die mit Schweine-Hypophysenvorderlappen-Kulturen generiert wurden. Die Hühnermyoblasten-Primärkulturen wurden wie folgt erhalten. Embryonales Hühnergewebe wurde geerntet, von Haut und Knorpel freigeschnitten und mechanisch zerteilt. Die Zellsuspension wurde durch Käseleinen und Linsenpapier passiert und bei einer Dichte von 1 × 10⁸ bis 2 × 10⁸/100 mm Kunststoff-Kulturschale ausplattiert. Die Zellpopulationen, die in Suspension verblieben, wurden bei einer Dichte von 2 × 10⁶ bis 3 × 10⁶ Zellen/Collagen-beschichtete 100 mm-Kunststoffschale ausplattiert und bei 37°C in einer 5% CO₂-Umgebung inkubiert. Die Zellen wurden dann 24 Stunden vor der Transfektion bei einer Dichte von 1,5 × 10⁶/100 mm-Platte in Minimal Essential Medium (MEM), ergänzt mit 10% Heat Inactivated Horse Serum (HIHS), 5% Hühnerembryo-Extrakt (CEE) (Gibco BRL; Grand Island, NY) und Gentamycin inkubiert. Für weitere Einzelheiten siehe Draghia-Akli et al., 1997 und Bergsma et al., 1986. Die Schweine-Hypophysenvorderlappen-Kultur wurde im Wesentlichen wie beschrieben erhalten (Tanner, et al., 1990). Kurz gesagt wurde Hypophysengewebe unter enzymatischen Bedingungen zerteilt, auf Kunststoffschalen ausreichend lange zur Ermöglichung der Bindung ausplattiert. Die Zellen wurden dann gespült und einem Inkubationsmedium vor den Experimenten ausgesetzt. Für Einzelheiten siehe Thanner et al. (1990).
Die Zellen wurden mit 4 mg Plasmid pro 100 mm-Platte unter Verwendung von Lipofectamin gemäß den Anleitungen des Herstellers transfiziert. Nach der Transfektion wurde das Medium gegen MEM ausgetauscht, das 2% HIHS und 2% CEE enthielt, um den Zellen das Differenzieren zu ermöglichen. Medium und Zellen wurden 72 Stunden nach Differenzierung geerntet. Die Effizienz der Transfektion wurde durch β-Galactosidase-Histochemie der Kontrollplatten mit 10% ausgewertet. Einen Tag vor der Ernte wurden die Zellen zweimal in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen und das Medium gegen MEM, 0,1% Rinderserumalbumin, ausgetauscht. Das konditionierte Medium wurde durch Zusetzen von 0,25 Volumen an 1% Trifluoressigsäure und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid behandelt, bei –80°C eingefroren, lyophilisiert, auf C-18 Sep-Säulen (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) gereinigt, relyophilisiert und in Radioimmunoassays verwendet oder in Medium resuspendiert, das für die Schweine-Hypophysenvorderlappen-Primärkultur konditioniert war.
BEISPIEL 4
Superaktive GHRH-Analoga erhöhen die GH-sekretagoge Aktivität und Stabilität
Skelettmyoblasten wurden wie in Beispiel 3 mit jedem Konstrukt transfiziert, und die aus konditionierten Kulturmedium-Zellen ausgereinigten GHRH-Komponenten wurden auf die Wachstumshormon-Sekretion in Schweine-Hypophysenvorderlappen-Zellkulturen untersucht. Wie in 1B gezeigt, ergaben die nach 24 Stunden entnommenen und durch Schweine-spezifische GH-Radioimmunoassays quantifizierten Medien, dass die mäßigen Zuwächse in der GH-Sekretion sich auf etwa 20% bis 50% für die modifizierten GHRH-Spezies (GH15/27/28; GHRH-TI; GHRH-TV) gegenüber dem Wildtyp-pGHRH beliefen. Lediglich eine der vier Mutanten, GHRH-HV, zeigte eine wesentliche Zunahme der GH-sekretagogen Aktivität, wobei die pGH-Mengen von den Grundlinien-Werten von 200 ng/nl auf bis zu 1600 ng/ml anstiegen (1B).
BEISPIEL 5
Plasma-Inkubation von HV-GHRH-Molekül
Gepooltes Schweineplasma wurde von Kontrollschweinen gesammelt und bei –80°C gelagert. Chemisch synthetisiertes HV-GHRH wurde durch Peptidsynthese präpariert. Das Schweineplasma wurde aufgetaut und zentrifugiert, bei 37°C platziert und durfte sich äquilibrieren. Die GHRH-Mutante wurde in einer Plasmaprobe zu ei ner Endkonzentration von 100 μg/ml gelöst. Sofort nach der Zugabe der GHRH-Mutante, und 15, 30, 60, 120 und 240 Minuten später, wurde 1 ml Plasma entnommen und mit 1 ml an 1 M TFA angesäuert. Das angesäuerte Plasma wurde auf C18-Affinitäts-SEP-Pak-Säulen gereinigt, lyophilisiert und mittels HPLC unter Verwendung eines Walters 600-Multisolvent-Zuführsystems, eines Walters Intelligent Sample Prozessors, Typ 717 und eines Walters Spektromonitors 490 (Walters Associates, Millipore Corp., Milford, MA) analysiert. Die Detektion wurde bei 214 nm vorgenommen. Der prozentuale Anteil an zu diesen Zeitpunkten abgebautem Peptid wurde durch integrierte Peak-Messungen gemessen.
Die Stabilität des Wildtyp-GHRH und des Analogon GHRH-HV wurde dann in Schweineplasma durch Inkubation der GHRH-Peptide, gefolgt von einer Festphasen-Extraktion und einer HPLC-Analyse getestet. Wie in 1C gezeigt, waren 95% der Wildtyp-GHRH-(1–44)NH₂ innerhalb von 60 Minuten nach Inkubation im Plasma abgebaut. Im Gegensatz dazu zeigte die Inkubation von GHRH-HV in Schweineplasma, dass mindestens 75% der Polypeptide gegen eine enzymatische Spaltung während 4 bis 6 Stunden nach Inkubation geschützt waren. Folglich blieb unter identischen Bedingungen ein Hauptanteil des GHRH-HV intakt, während die Wildtyp-GHRH vollständig abgebaut wird, was eine beträchtliche Zunahme der Stabilität für GHRH-HV gegenüber Serumproteasen anzeigt (1C).
BEISPIEL 6
Tierstudien
Drei Gruppen von fünf 3–4 Wochen alten hybridgekreuzten kastrierten männlichen Schweinen (Yorkshire, Landrace, Hampshire und Duroc) wurden in den GHRH-Studien verwendet. Die Tiere wurden einzeln bei ad lib-Zugang zu Wasser und einer Diät von 6% ihres Körpergewichts (24%-Schweineproteinmahlzeit, Producers Cooperative Association, Bryan, TX) behaust. Die Tiere wurden jeden zweiten Tag um 8.30 Uhr gewogen, und das Futter wurde anschließend gegeben. Die Tiere wurden gemäß der NIH Guide-, USDA- und Animal Welfare Act-Richtlinien gehalten.
BEISPIEL 7
Intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA in Schweine:
Endotoxin-freie Plasmid-(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)-Präparate von pSPc5–12-HV-GHRH, pSPc5-12-wt-GHRH und pSPc5–12bgaI wurden in PBS (pH 7,4) auf 1 mg/ml verdünnt. Die Tiere wurden gleichmäßig einer der Behandlungen zugeordnet. Die Schweine wurden mit Isofluran anästhesiert (Konzentration 2–6% für die Induktion und 1–3% für die Aufrechterhaltung). Jugularkatheter wurden mittels eines operativen Verfahrens zur Entnahme von Blut aus den Tieren am Tag 3, 7, 14, 21, 28, 45 und 65 nach Injektion implantiert. Unter Anästhesie wurden 10 mg Plasmid direkt in den Semitendinosusmuskel der Schweine injiziert. Zwei Minuten nach der Injektion wurde der injizierte Muskel zwischen einen Satz einer Mikrometerschraube platziert und unter Anwendung optimierter Bedingungen von 200 V/cm mit 4 Pulsen von 60 Millisekunden elektroporiert (Aihara et al., 1998). 65 Tage nach Injektion wurden die Tiere getötet und die inneren Organe und der injizierte Muskel entnommen, gewogen, in Flüssigstickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert. Die Kadaver wurden gewogen und mittels Neutronenaktivierung analysiert. Das Rückenfett wurde gemessen.
BEISPIEL 8
Muskelinjektion mit pSP-HV-GΗRH erhöht die Schweine-GΗRH; -GH und -IGF-1-Serumspiegel über zwei Monate
Die Fähigkeit des optimierten Protease-resistenten pSP-HV-GΗRH-Vektors, die langfristige Expression von GΗRH zu erleichtern und GH- und IGF-1-Sekretionsmengen zu stimulieren, wurde bestimmt. Schemakarten von pSP-HV-GΗRH, als auch des Wildtyp-Konstrukts pSP-wt-GΗRH als einer Wildtyp-Kontrolle, und ein synthetischer myogener Promotor E. coli-β-Galactosidase-Expressionsvektor pSP-bgaI als der Placebo-Kontrolle sind in 2A gezeigt. Drei Wochen alte kastrierte männliche Schweine wurden anästhesiert und ein Jugularvenenkatheter wurde eingeführt, um die Entnahme von Blutproben ohne Unbehagen für die Tiere zu ermöglichen. Plasmid-Expressionsvektor-DNA (10 mg DNA von pGHRH-HV; pSP-GHRH; oder pSP-bgaI) wurde direkt in den Semifendinosusmuskel injiziert, der daraufhin elektrophoriert wurde (siehe Beispiel 7).
BEISPIEL 9
Schweine-GHRH-, GH- und IGF-1-Messungen
Schweine-GHRH wurde mittels eines heterologen Humanassay-Systems gemessen (Peninsula Laboratories, Belmont, CA). Die Empfindlichkeit des Assays beträgt 1 pg/Röhrchen. Schweine-GH im Plasma wurde mit einem spezifischen Doppelantikörper-Verfahren-RIA (The Pennsylvania State University) gemessen. Die Empfindlichkeit des Assays beträgt 4 ng/Röhrchen. Schweine-IGF-1 wurde mittels eines heterologen Humanassays (Diagnostic System Lab., Webster, TX) gemessen. Die Daten wurden unter Verwendung des Microsoft Excel-statistische Analyse-Package analysiert. Die in den Figuren gezeigten Werte stellen den Mittelwert ±SEM dar. Spezifische p-Werte wurden durch Vergleich unter Verwendung von Student-t-Test erhalten. Ein p < 0,05 wird als die Höhe der statistischen Signifikanz festgesetzt. Bei Schweinen, die in den Semitendinosusmuskel mit pSP-GHRH-HV injiziert waren, waren die GHRH-Mengen 7 Tage nach Injektion erhöht (2B) und lagen um 150% über den Kontrollmengen nach 14 Tagen (652,4 ± 77 pg/ml gg. 419,6 ± 13 pg/ml). Die pSP-GHRH-HV-Expressionsaktivität erreichte nach 60 Tagen ein Plateau, das bei einem etwa 2- bis 3-fach höheren Niveau lag als die Placebo-injizierten Kontrollwerte. Die Absolutmenge des Serum-GHRH, die für das erhöhte Körpergewicht zwischen Tag 0 und Tag 60 (Blutvolumen macht 8% des Gesamtkörpergewichts aus) korrigiert war, wie von den pSP-GHRH-HV-injizierten Schweinen sekretiert, war 3-mal größer als die Placebo-injizierten Kontrollwerte (1426,49 ± 10,47 ng gg. 266,84 ± 25,45 ng) (2C). Die Wildtyp-pSP-GHRH-injizierten Tiere, die in den Semitendinosusmuskel injiziert worden waren, zeigten eine nur mäßige Zunahme bei ihren GHRH-Mengen, beginnend 45 Tage nach Injektion, doch eine 2-fache Zunahme bis 60 Tage nach Injektion (779,36 ng), was ausreichende Mengen waren, um eine biologische Wirkung hervorzurufen.
Junge Tiere weisen sehr hohe Mengen an GH auf, die mit dem Alter nach und nach abnehmen. Blutproben, die alle 15 Minuten über einen Zeitraum von 24 Stunden 7 und 14 Tagen nach den Ausgangsinjektionen entnommen wurden, wurden auf die pGH-Mengen untersucht, die für die Gesamtveränderung im pGH-Gehalt extrapoliert wurden. Die pGHRH-HV-injizierten Schweine (2D) zeigten eine Zunahme bei ihrem GH-Gehalt, was 7 Tage nach Injektion evident war (Delta-Variation HV = +1,52, wt = –0,73 gg. Kontrolle = –3,2 ng/ml) und 14 Tage nach Injektion (Delta-Variation HV = +1,09, wt = –4,42 gg. Kontrolle = –6,88 ng/ml).
Ein weiterer Hinweis auf erhöhte systemische Mengen an GH wären erhöhte Mengen an IGF-1. Die Serum-Schweine-IGF-1-Spiegel begannen bei pSP-GHRH-HV-injizierten Schweinen etwa 3 Tage nach Injektion zu steigen (2E). Nach 21 Tagen zeigten diese Tiere im Mittel eine etwa 3-fache Zunahme der Serum-IGF-1-Spiegel, die über 60 Tage beibehalten blieben (p < 0,03). Im Vergleich zeigten Schweine, die mit dem Wildtyp-pSP-GHRH-Expressionsvektor injiziert waren, eine lediglich 40%ige Zunahme bei ihren zirkulierenden IGF-1-Mengen (p = 0,39), wie in 2E gezeigt.
BEISPIEL 10
Myogene GHRH-Expressionsvektoren steigern das Schweinewachstum
Schweine-GH, das in den systemischen Kreislauf nach intramuskulärer Injektion von myogenen pSP-GHRH-Expressionsvektoren sekretiert wurde, steigert das Wachstum über 65 Tage bei kastrierten jungen männlichen Schweinen. Messungen der Körperzusammensetzungen wurden in vivo am Tag 30 und 65 Tage nach Injektion (Densitometrie, K40) oder post mortem (Organ, Kadaver, Körperfett, direkte Dissektion, gefolgt von Neutronenaktivierungskammer) vorgenommen. Mit Wildtyp-pSP-GHRH-injizierte Tiere waren im Mittel 21,5% schwerer als die Placebo-Kontrollen (37,125 kg gg. 29,375 kg), wohingegen die pSP-GHRH-HV-injizierten Schweine um 37,8 schwerer waren (41,775 kg; p = 0,014), wie in 3A gezeigt. Die Nahrungseffizienz war ebenfalls um 20% bei Schweinen verbessert, die mit GHRH-Konstruktion injiziert waren, im Vergleich zu den Kontrollen (0,267 kg Nahrung/Tag für jedes kg Gewichtszunahme in pSP-HV-GHRH, und 0,274 kg in pSP-wt-GHRH gg. 0,334 kg in pSP-bgaI-injizierten Schweinen (3B). Die Untersuchungen der Körperzusammensetzung mittels Densitometrie, K40-Kaliumkammer und Neutronenak tivierungskammer ergaben eine proportionale Zunahme aller Körperkomponenten bei GHRH-injizierten Tieren, ohne Anzeichen von Organomegalie, relativer Proportion an Körperfett und damit verbundener Pathologie. Eine Fotographie eines Placebo-injizierten Kontrollschweins und eines pSP-GHRH-HV-injizierten Schweins nach 45 Tagen ist in 3C gezeigt.
Das in Tabelle 1 gezeigte metabolische Profil von pSP-HV-GHRH-injizierten Schweinen bezeichnet eine signifikante Abnahme der Serum-Harnstoffmenge, pSP-GHRH bzw. pSP-GHRH-HV (9 ± 0,9 mg/dl bei den Kontrollen, 8,3 ± 1 mg/dl und 6,875 ± 0,5 mg/dl bei injizierten Schweinen) (p = 0,006), was auf einen verminderten Aminosäure-Katabolismus hinweist. Der Serumglucosespiegel war bei den Kontrollen und den Plasmid-GHRH-injizierten Schweinen vergleichbar (99,2 ± 4,8 mg/dl in Kontrollschweinen, 104,8 ± 6,9 mg/dl in pSP-GHRH-HV-injizierten Schweinen und 97,5 ± 8 mg/dl in Wildtyp-pSP-GHRH-injizierten Tieren (p = 0,263). Keine weiteren metabolischen Veränderungen wurden festgestellt.
Tabelle 1: Das metabolische Profil von GHRH-injizierten Schweinen und Kontrollen (Werte in mg/ml).
BEISPIEL 11
Experimente mit verschiedenen Mengen an pSP-HV-GHRH
Um weiter die Wirkungen von pSP-HV-GHRH auf das Wachstum von Ferkeln zu untersuchen, wurden Gruppen von zwei Ferkeln 10 Tage nach der Geburt mit pSP-HV-GHRH injiziert (3 mg, 1 mg, 100 μg). Wie in 4 gezeigt, zeigte die mit 100 Mikrogramm des Plasmids injizierte Gruppe die beste Wachstumskurve, bei signifikant statistischen Unterschieden zu den Kontrollen bei einem Alter von 50 Tagen. Ein Tier in der mit 3 mg injizierten Gruppe entwickelte Antikörper und zeigte ein signifikant herabgesetztes Wachstumsmuster.
Außerdem wurden Gruppen von 2 Ferkeln mit den angegebenen Dosen von pSP-HV-GHRH 10 Tage nach der Geburt injiziert. Die IGF-1-Werte begannen 10 Tage nach Injektion zu steigen, und 35 Tage nach Injektion zeigten die mit 100 Mikrogramm Plasmid injizierten Schweine im Mittel ein 10,62-fach höheres IGF-1 als die Kontrollen. Die mit 1 mg injizierten Schweinen zeigten im Mittel eine 7,94-fache Zunahme gegenüber den Kontrollen, und die mit 3 mg injizierten Schweine zeigten im Mittel eine 1,16-fache Zunahme gegenüber den Kontrollwerten.
Daher werden bei einer spezifischen Ausführungsform niedrigere Dosen von pSP-HV-GHRH injiziert. In einer spezifischen Ausführungsform werden etwa 100 Mikrogramm (0,1 Milligramm) des Plasmids angewendet. In einer anderen spezifischen Ausführungsform werden 200–300 Mikrogramm injiziert.
BEISPIEL 12
Altersvergleiche mit pSP-HV-GHRH
Um das Alter der Ferkel für die pSP-HV-GHRH-Injektion zu optimieren, wurden Gruppen von 2 Ferkeln beginnend bei ihrer Geburt mit 2 mg pSP-HV-GHRH injiziert. Wie in 6 gezeigt, zeigte die 14 Tage nach Geburt injizierte Gruppe die beste Wachstumskurve, bei signifikant statistischen Unterschieden im Vergleich zur Kontrolle zu jedem Zeitpunkt. Ein Tier in der nach 21 Tagen injizierten Gruppe entwickelte Antikörper und zeigte ein signifikant herabgesetztes Wachstumsmuster. Es ist möglich, dass eine Insulinresistenz auftritt, wenn zu früh behandelt wird (d.h. < etwa 10–14 Tage Alter). In einer spezifischen Ausführungsform ist die Therapie am wirksamsten, wenn die natürlichen GH- und IGF-1-Mengen die niedrigsten sind (etwa 10–14 Lebenstage), und können kontraproduktiv sein, wenn die GHRH-Mengen normal hoch sind.
BEISPIEL 13
Zusammenfassung
Zusammenfassend beträgt der optimale Zeitpunkt für die Injektion 14 Tage nach Geburt (im Mittel 8 US-Pounds schwerer als die Kontrollen (p < 0,04) 40 Tage nach Injektion). Eine bevorzugte Injektionsdosis beträgt 100 Mikrogramm Plasmid in 2 – 5 ml Volumen (im Mittel 6 Pounds schwerer als die Kontrollen (p < 0,02) 40 Tage nach Injektion). Die hormonalen und biochemischen Konstanten sind normal (IGF-1, IGF-BP3, Insulin, Harnstoff, Glucose, Gesamtproteine, Kreatinin) im Nachkommen der Sau 1 (Zeitverlauf) und der Sau 3 (Dosiskurve) und in Korrelation mit der Gewichtszunahme, ohne abträgliche Nebenwirkungen. Die Studien der Körperzusammensetzung aus dem vorangegangenen Experiment zeigten, dass HV-GHRH eine gleichmäßige Zunahme aller Körperkompartimente (Körperzusammensetzung ähnlich den Kontrollen, doch größer) festlegte, wohingegen wt-GHRH eine Zunahme der Magerkörpermasse und eine Abnahme an Fett festlegte.
Alle in der Beschreibung genannten Patentschriften und Veröffentlichungen geben den Wissenstand für Fachleute des Gebiets, zu dem die Erfindung gehört, wieder.
ZITIERTE REFERENZEN
US-PATENTDOKUMENTE

US-Patent Nr. 5.847.066, ausgegeben am 8. Dezember 1998, worin Coy et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 5.846.936, ausgegeben am 8. Dezember 1998, worin Felix et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 5.792.747, ausgegeben am 11. August 1998, worin Schally et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 5.776.901, ausgegeben am 7. Juli 1998, worin Bowers et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 5.756.264, ausgegeben am 26. Mai 1998, worin Schwartz et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 5.696.089, ausgegeben am 9. Dezember 1997, worin Felix et al. als Erfinder aufgelistet sind.
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US-Patent Nr. 5.137.872, ausgegeben am 11. August 1992, worin Seely et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 5.084.442, ausgegeben am 28. Januar 1992, worin Felix et al. als Erfinder aufgelistet sind.
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US-Patent Nr. 5.023.322, ausgegeben am 11. Juni 1991, worin Kovacs et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 4,839.344, ausgegeben am 13. Juni 1989, worin Bowers et al. als Erfinder aufgelistet sind.
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US-Patent Nr. RE33.699, ausgegeben am 24. September 1991, worin Drengler et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 4.833.166, ausgegeben am 23. Mai 1989, worin Grosvenor et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 4.228.158, ausgegeben am 14. Oktober 1980, worin Momany et al. als Erfinder aufgelistet sind.
US-Patent Nr. 4.228.156, ausgegeben am 14. Oktober 1980, worin Momany et al. als Erfinder aufgelistet sind.
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ANHANG 1 SEQUENZLISTE

Claims

Wachstumshormon-freisetzendes Hormon, bestehend aus der Aminosäuresequenz HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA (SEQ ID Nr. 1).
Pharmazeutische Zusammensetzung für die Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon bei Tieren, umfassend das Wachstumshormon-freisetzende Hormon nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Nukleotidsequenz, welche das Wachstumshormon-freisetzende Hormon codiert, bestehend aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1.
Vektor, umfassend einen Promotor; eine Nukleotidsequenz, die SEQ ID Nr. 1 codiert; und eine 3'-untranslatierte Region, die für eine funktionale Expression operativ verknüpft ist.
Vektor nach Anspruch 4, worin der Promotor ein synthetische myogener Promotor ist.
Vektor nach Anspruch 4 oder 5, worin die 3'-untranslatierte Region die hGH-3'-untranslatierte Region ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der Vektor ausgewählt ist aus einen Plasmid, einem viralen Vektor, einem Liposom und einem kationischen Lipid.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments, umfassend den Vektor zur Steigerung des Wachstumshormons in einem Tier.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments, umfassend den Vektor zur Behandlung in einem Tier eines Wachstumshormon-bezogenen Mangels in Verbindung mit der Wachstumshormon-Bahn.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Mangel die Folge einer Veränderung im genetischen Material des Tiers ist.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments, umfassend den Vektor zur Behandlung von Gewichtsverlust, Verlust der Muskelkraft oder Deregulation des Stoffwechsels in einem Tier ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin das Tier ausgewählt ist aus einem Menschen, einem Haustier, einem Nahrungstier und einem Arbeitstier.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, worin das Medikament zur Einführung in die myogenen Zellen des Tiers bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, worin das Medikament zur Einführung in das Muskelgewebe des Tiers bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 14, worin das Medikament zur Einführung in das Tier in einer einzelnen Verabreichung bestimmt ist.
Nicht-therapeutisches Verfahren zur Verbesserung der Wachstumsleistung in einem nicht-humanen Tier, umfassend das Einführen eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 in das Tier.
Nicht-therapeutisches Verfahren zur Steigerung des Wachstums in einem nicht-humanen Tier, umfassend das Einführen eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 in das Tier.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Tier ausgewählt ist aus einem Menschen, einem Haustier, einem Nahrungstier und einem Arbeitstier.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, worin der Vektor in myogene Zellen des Tiers eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, worin der Vektor in Muskelgewebe des Tiers eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, worin der Vektor in das Tier in einer einzelnen Verabreichung eingeführt wird.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verbesserung der Wachstumsleistung in einem Tier.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Steigerung des Wachstums in einem Tier.