DE69734096T2

DE69734096T2 - Rezeptor des ob-proteins und verwandte zusammensetzungen und verfahren

Info

Publication number: DE69734096T2
Application number: DE69734096T
Authority: DE
Inventors: Ming-Shi Chang; Avery Andrew WELCHER; Addison Frederick FLETCHER
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-01-04
Filing date: 1997-01-02
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2017-01-03
Also published as: WO1997025424A1; EP0877803B1; IL125081A; DK0877803T3; ATE303437T1; PT877803E; AU1526297A; DE69734096D1; EP0877803A1; IL125081A0; NZ534416A; ES2244990T3; JP2000502569A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft OB-Protein-Rezeptoren, damit zusammenhängende Zusammensetzungen sowie Verfahren zum Herstellen und Verwenden von derartigen Rezeptoren und von mit diesen zusammenhängenden Zusammensetzungen.
Hintergrund
Obwohl die molekulare Grundlage für die Fettleibigkeit (Adipositas) weitgehend unbekannt ist, hat die Identifizierung des „OB-Gens" und des kodierten Proteins („OB-Protein") die Mechanismen, die der Körper verwendet, um die Einlagerung von Körperfett zu regulieren, etwas erhellt. Zhang et al., Nature 372: 425–432 (1994); siehe auch die Korrektur in Nature 374: 479 (1995). Das OB-Protein ist in vivo sowohl in ob/ob-Mäusemutanten (Mäuse, die aufgrund eines Defekts in der Produktion des OB-Genprodukts fettleibig sind) als auch in normalen Wildtyp-Mäusen aktiv. Die biologische Aktivität äußert sich unter anderem in Gewichtsverlust. Siehe allgemein Barinaga, „Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475–476 (1995). Siehe die Offenlegungsschrift der internationalen PCT-Anmeldung Nr. WO 96/05309, „Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof", hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Die anderen biologischen Wirkungen des OB-Proteins sind nicht gut charakterisiert. Es ist beispielsweise bekannt, daß bei ob/ob-Mäusemutanten eine Verabreichung von OB-Protein zu einer Abnahme der Insulin-Serumspiegel und Glukose-Serumspiegel führt. Es ist auch bekannt, daß eine Verabreichung von OB-Protein zu einer Abnahme des Körperfetts führt. Dies wurde sowohl bei ob/ob-Mäusemutanten beobachtet, als auch bei nicht fettleibigen, normalen Mäusen. Pelleymounter et al., Science 269: 540–543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543–546 (1995). Siehe auch Campfield et al., Science 269: 546–549 (1995) (Peripheral and central administration of microgram doses of OB protein reduced food intake and body weight of ob/ob and diet-induced obese mice but not in db/db obese mice). Nach keinem dieser Berichte sind Toxizitäten beobachtet worden, selbst bei den höchsten Dosen nicht.
Trotz der Aussicht auf eine klinische Verabreichung des OB-Proteins ist die Wirkungsweise des OB-Proteins in vivo nicht vollständig aufgeklärt, was teilweise auf das Fehlen von Informationen über den OB-Rezeptor zurückzuführen ist. Eine hochaffine Bindung des OB-Proteins ist im Ratten-Hypothalamus nachgewiesen worden, was dem Bericht zufolge auf die Lokalisierung des OB-Rezeptors hinweist. Stephens et al., Nature 377: 530–532 (1995). Die db/db-Maus weist einen Phänotyp auf, der mit dem der ob/ob-Maus identisch ist, d. h. extreme Fettleibigkeit und Typ II-Diabetes, wobei angenommen wird, daß dieser Phänotyp auf einen fehlerhaften OB-Rezeptor zurückzuführen ist, insbesondere deshalb, weil db/db-Mäuse auf die Verabreichung von OB-Protein nicht ansprechen. Siehe Stephens et al., oben.
Eine Identifizierung des OB-Rezeptors ist ein Schlüssel zum Aufklären des Signaltransduktionswegs. Darüber hinaus würde eine Identifizierung des OB-Protein-Rezeptors eine wirksame Anwendung zu diagnostischen Verwendungen verfügbar machen, beispielsweise um Individuen zu bestimmen, die von einer OB-Protein-Therapie profitieren würden. Weiterhin könnte der OB-Rezeptor ein Schlüsselbestandteil in einem Test zum Bestimmen zusätzlicher Moleküle sein, die an den Rezeptor binden und zu der gewünschten biologischen Aktivität führen. Weiterhin könnte ein solcher löslicher Rezeptor die Wirksamkeit des OB-Proteins (oder eines Analogons oder Derivats davon) steigern oder verändern.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse von Protein-Rezeptoren, hier als „OB-Protein-Rezeptoren" oder „OB-Rezeptoren" bezeichnet, von denen angenommen wird, daß sie das OB-Protein selektiv binden. Als solche wird die neue OB-Rezeptor-Familie verfügbar gemacht, ebenso wie neue Mitglieder einer derartigen Familie. Ebenfalls verfügbar gemacht werden Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen, die derartige Nukleinsäuren enthalten, damit zusammenhängende antisense-Nukleinsäuren, Moleküle, die selektiv an den OB-Protein-Rezeptor binden, und damit zusammenhängende Zusammensetzungen von Bedeutung, wie etwa OB-Rezeptor-Protein/OB-Protein-Komplexe. Unter anderen Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Verwenden der oben genannten Zusammensetzungen, wie etwa therapeutische und/oder diagnostische Verfahren, und Verfahren zum Herstellen von OB-Rezeptor-Liganden.
Genaue Beschreibung
Es wird eine neue Familie von OB-Rezeptoren verfügbar gemacht. Diese neue Familie ist das Ergebnis einer Identifizierung eines PCR-Fragments, das aus einer menschlichen Leberzell-cDNA-Bibliothek isoliert wurde. Das ursprüngliche PCR-Fragment, aus dem Primer isoliert wurden, enthielt ein „WSXWS"-Motiv, das Zytokin-Rezeptoren gemeinsam ist. Wie durch die Arbeitsbeispiele unten veranschaulicht, sind unter Verwendung dieses Fragments vier Mitglieder dieser OB-Protein-Rezeptor-Familie identifiziert worden. Diese Mitglieder, hier als „A", „B" und „C" sowie „D" bezeichnet, sind in den Aminosäure-Positionen 1–891 (wobei die Numerierung nach Seq. ID Nr. 1 verwendet wird) identisch, unterscheiden sich jedoch in Position 892 bis zum C-Terminus. Sie variieren in bezug auf ihre Länge am C-Terminus hinter der Aminosäure 891, und die verschiedenen Formen scheinen verschiedene Gewebeverteilungen aufzuweisen.
Die Verwendung der Hydrophobizitätsanalyse ergab, daß die Leader-Sequenz wahrscheinlich die Aminosäuren (Seq. ID Nr. 1) 1–21, 1–22 oder 1–28 enthält. Die erste Aminosäure des reifen Proteins ist wahrscheinlich 22 (F), 23 (N) oder 29 (T). Auf der Grundlage einer eukaryotischen Zellexpression (CHO-Zellexpression, siehe Beispiel 8, unten) ist es am wahrscheinlichsten, daß die erste Aminosäure des reifen Proteins 22 (F) ist. Der Anfang der transmembranären Domäne scheint in Position 840 (A) oder 842 (L) lokalisiert zu sein. Das Ende der transmembranären Domäne scheint in Position 862 (I), 863 (S) oder 864 (H) lokalisiert zu sein. Auf der Grundlage von Vorhersagen aus der Hydrophobizitätsanalyse ist für eine OB-Protein-Bindung mindestens die extrazelluläre Domäne des reifen Proteins, die Aminosäuren 22, 23 oder 29 bis zu den Aminosäuren 839 (D) oder 841 (G), notwendig. Deshalb besteht die vorliegende Klasse von OB-Rezeptor-Proteinen aus solchen, die folgende Aminosäuren aufweisen (gemäß Seq. ID Nr. 1):

(a) 1–896;
(b) 22–896;
(c) 23–896;
(d) 29–896
(e) 22–891;
(f) 23–891;
(g) 29–891;
(h) die Sequenzen (e) bis (g), welche die C-terminalen Aminosäuren aufweisen, die ausgewählt sind aus:
(i) OB-Rezeptor B (Seq. ID Nr. 3), Positionen 892–904;
(ii) OB-Rezeptor C (Seq. ID Nr. 5), Positionen 892–958;
(i) Aminosäuren der Teilsequenzen b, c, d, e, f g, und h, denen eine Leader-Sequenz fehlt, die einen N-terminalen Methioninrest aufweisen; und
(j) ein chemisch modifiziertes Derivat aus einer der Teilsequenzen (a) bis (h).

Die funktionellen Domänen des OB-Rezeptors können unter Verwendung der Information, die in Bazan et al., PNAS-USA 87: 6934–6938 (1990) (hier durch Bezugnahme aufgenommen), enthalten ist, vorhergesagt werden. Für den vorliegenden OB-Rezeptor gibt es zwei Hämatopoetin-Domänen, eine Random coil-Region, die transmembranäre Domäne und die intrazelluläre Domäne. Die Gesamtgeographie kann wie folgt veranschaulicht werden:
Unter Verwendung der durch Bazan oben verfügbar gemachten Information können die Domänen mit im wesentlichen einem Fehler von ungefähr plus oder minus drei Basenpaaren (angewendet auf die Lage aller Aminosäuren, die zum Zweck der Identifizierung der mittels Bazan vorhergesagten Domänen angegeben wurden) vorhergesagt werden. Die präzisen Lagen können empirisch durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden, wie etwa durch Herstellen und Exprimieren von modifizierten rekombinanten DNAs. Es wird angenommen, daß die strukturellen Eigenschaften zum Erhalten der strukturellen Integrität des Moleküls wichtig sind und deshalb, soweit eine derartige Struktur zur Funktion wichtig ist, ebenso für funktionelle Eigenschaften wichtig sind.
Von den Hämatopoetin-Domänen (H1 und H2) wird angenommen, daß sie jeweils zwei Fibronektin-Typ 3-Repeats, jeweils einen Satz von gepaarten Cysteinresten (von denen angenommen wird, daß sie eine Disulfidbrücke bilden) und eine „WSXWS-Box" (was sich auf den Aminosäure-Einzelbuchstaben-Code bezieht, wobei „X" jede Aminosäure sein kann) aufweisen. Die Fibronektin Typ 3-Domänen können durch die Lage eines doppelten Prolins („PP") identifiziert werden, welches den Anfang des zweiten Fibronektin Typ 3-Repeats markiert, wobei der tatsächliche Anfang eines solchen zweiten Fibronektin Typ 3-Repeats wahrscheinlich ungefähr 3 Aminosäuren stromaufwärts von diesem doppelten Prolin beginnt.
Die erste Hämatopoetin-Domäne beginnt wahrscheinlich mit der Aminosäure 123 (wobei die Numerierung von beispielsweise Seq. ID Nr. 1 verwendet wird), wobei es sich um einen Isoleucinrest (I) handelt. Die letzte Aminosäure der Hämatopoetin-Domäne ist wahrscheinlich die Aminosäure 339, wobei es sich um einen Lysinrest (K) handelt. Die beiden Fibronektin Typ 3-Repeats sind wahrscheinlich ungefähr bei den Aminosäuren 123 bis 235 und 236 bis 339 lokalisiert. Es gibt ein Einzelpaar von Cysteinresten, die wahrscheinlich eine Disulfidbrücke bilden, die in Position 131 und Position 142 lokalisiert ist. Die „WSXWS-Box" ist in Position 319 bis 323 lokalisiert.
Die zweite Hämatopoetin-Domäne beginnt wahrscheinlich in Position 428, wobei es sich um ein Isoleucin (I) handelt, und endet in Position 642 mit einem Glycin (G). Die gepaarten Fibronectin Typ 3-Repeats sind ungefähr in Position 428 bis Position 535 und ungefähr in Position 536 bis ungefähr Position 642 lokalisiert. Ein Paar von Cysteinen ist in Position 436 und Position 447 lokalisiert, und das zweite Paar ist in Position 473 und 488 lokalisiert. Die „WSXWS-Box" ist in Position 622 bis 626 lokalisiert.
Zwischen der ersten und der zweiten Hämatopoetin-Domäne (ungefähr Aminosäuren 339 bis 428) gibt es eine Region von unbekannter funktioneller Bedeutung.
Die Random coil-Domäne („RC" zwischen der H2-Domäne und der transmembranären Domäne „TM") beginnt wahrscheinlich mit der Aminosäure, die auf das Ende der zweiten Hämatopoetin-Domäne folgt, und endet wahrscheinlich mit Beginn der transmembranären Domäne. Diese erstreckt sich wahrscheinlich von ungefähr Aminosäure 642 bis Aminosäure 839 oder 841 (wobei die transmembranäre Domäne in den Positionen 840 (A) oder 842 (L) beginnt). Die intrazelluläre Domäne („IC") beginnt wahrscheinlich in Position 861 (L), 862 (I), 863 (S) oder 864 (H).
Die intrazelluläre Domäne („IC") enthält drei Regionen oder „Boxen", von denen angenommen wird, daß sie an der Signaltransduktion beteiligt sind (zwei „JAK"-Boxen und eine ein zelne „STAT"-Box, „Box 1", „Box 2" und „Box 3"). Im Hinblick auf die Numerierung der Position der Aminosäuren der „D"-Form des OB-Rezeptors (Seq. ID Nr. 7, unten) ist Box 1 bei den Aminosäuren 871 (F) bis 878 (P) lokalisiert. Box 2 ist ungefähr bei den Aminosäuren Nr. 921 (I) bis 931 (K) lokalisiert. Box 3 der „D"-Form ist ungefähr in den Positionen 1141 bis 1144 (Aminosäuren YMPO, da die „STAT"-Box normalerweise eine konservierte Region von „YXXQ" ist, wobei „X" jede Aminosäure bezeichnet) lokalisiert. Es wird angenommen, daß die intrazelluläre Domäne für die Signaltransduktion verantwortlich ist. Eine mögliche Wirkungsweise besteht in einer Phosphorylierung verschiedener Reste. Siehe Ihle et al., Cell 84: 331–334 (1996) (Übersichtsartikel, hier durch Bezugnahme aufgenommen).
Eine mögliche Wirkungsweise ist, daß nach Ligandenbindung (hier nach Bindung des OB-Proteins) der OB-Rezeptor mit einem anderen Rezeptor dimerisiert. Eine Kinase („JAK") bindet an Box 1 und wird phosphoryliert. (Die JAK-Kinase kann bereits vor der Dimerisierung gebunden sein.) Auch „STATs" binden an die Box 3 und werden an einem bestimmten Tyrosin phosphoryliert. Es wird angenommen, daß diese Phosphorylierung wahrscheinlich indirekt zu einer Produktion von DNA-bindendem Protein führt, was zu einer veränderten DNA-Transkription und damit zu einer veränderten Expression führt. Wie dem Beispiel 6 unten entnommen werden kann, stellt eine Messung der Fähigkeit eines OB-Rezeptors, ein Signal zu transduzieren, die Messung des Grads der Phosphorylierung von JAK/STAT-Molekülen dar.
Die C-terminale Region (des zellgebundenen OB-Rezeptors) befindet sich intrazellulär. Die Unterschiede im C-Terminus zwischen den Mitgliedern der vorliegenden OB-Rezeptor-Familie können zu Unterschieden in der Signaltransduktion zwischen den Spezies führen. Folglich schließt der vorliegende OB-Rezeptor mindestens die extrazelluläre Domäne ein, die zur Bindung des Protein-Liganden wichtig ist. Nukleinsäuren, welche die vorliegenden OB-Rezeptoren kodieren, Vektoren und Wirtszellen werden hier ebenfalls verfügbar gemacht.
Die extrazelluläre Domäne kann modifiziert sein und die Funktion zur Ligandenbindung noch beibehalten, insbesondere durch eine oder mehrere der folgenden Modifikationen: (a) die Random coil-Domäne (die, wie oben angegeben, stromabwärts von der zweiten Hämatopoetin-Domäne bis zum Anfang der transmembranären Domäne auftritt) kann deletiert sein (dies kann ungefähr die Positionen 642 bis 839 oder 841 betreffen); (b) die „WSXWS"-Box kann modifiziert sein durch (i) Substitution des ersten Serins durch eine andere Aminosäure, insbe sondere eine solche, die in bezug auf Hydrophobizität und/oder Lage konserviert ist, wie etwa Glycin; (ii) das letzte Serin kann durch eine andere Aminosäure, wie etwa Threonin substituiert sein; (iii) das erste Tryptophan kann durch eine andere Aminosäure, beispielsweise ein Tyrosin, substituiert sein.
Die menschliche genomische DNA, welche das OB-Rezeptor-Protein kodiert, wird hier ebenfalls verfügbar gemacht. Die genomische DNA ist auf dem menschlichen Chromosom 1P31 lokalisiert, von dem angenommen wird, daß es mit dem Mäusechromosom 4, auf dem der Mäuse-db-Locus lokalisiert ist, korrespondiert.
Die Analyse der Gewebeverteilung zeigt, daß das Vorhandensein von OB-Rezeptor-Nukleinsäuren nahezu ubiquitär ist, aber insbesondere in der Leber festzustellen ist. Sie werden auch im Ovar und im Herzen und, in einem geringeren Ausmaß, im Dünndarm, der Lunge, der Skelettmuskulatur, der Niere und, in einem noch geringeren Ausmaß, der Milz, dem Thymus, der Prostata, den Testes, der Plazenta und dem Pankreas beobachtet (Beispiel 2, unten). Von dem im Serum vorhandenen OB-Rezeptor kann es auch eine oder mehrere Formen geben, wie etwa dem löslichen OB-Rezeptor, der mit einer oder mehreren Formen des OB-Proteins komplexiert sein kann.
Aminosäuresequenzen und Zusammensetzungen
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue OB-Protein-Rezeptoren und DNA-Sequenzen, die alle derartigen OB-Rezeptoren oder einen Teil davon kodieren, verfügbar gemacht. Die vorliegende Erfindung macht gereinigte und isolierte Polypeptid-Produkte verfügbar, die einen Teil oder die Gesamtheit der primären strukturellen Konformation (d. h. eine kontinuierliche Sequenz von Aminosäureresten) und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften (z. B. immunologische Eigenschaften und biologische Aktivität in vitro) und physikalische Eigenschaften (z. B. Molekulargewicht) des natürlicherweise vorkommenden Säugetier-OB-Rezeptors, einschließlich Allel-Varianten davon, aufweisen. Der Begriff „gereinigt und isoliert" bedeutet hier im wesentlichen frei von unerwünschten Substanzen, damit die vorliegenden Polypeptide für den beabsichtigten Zweck nützlich sind. Beispielsweise kann man einen rekombinanten menschlichen OB-Rezeptor zur Verfügung haben, der im wesentlichen frei ist von menschlichen Proteinen oder pathologischen Agenzien. Diese Polypeptide sind auch dadurch charakterisiert, daß sie ein Produkt von Säugetierzellen sind oder das Produkt eines chemischen Syntheseverfahrens oder einer Expression von exogenen DNA-Sequenzen, die durch Klonieren von genomischer DNA oder cDNA oder durch Gensynthese erhalten worden sind, in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt (z. B. Bakterien oder Zellen von Hefe, einer höheren Pflanze, einem Insekt oder Säugetier in Kultur). Die Produkte einer Expression in Wirtszellen, normalerweise Hefe (z. B. Saccharomyces cerevisiae), einem Insekt oder Prokaryonten (z. B. E. coli), sind frei davon, mit Säugetierproteinen in Verbindung zu stehen. Die Produkte einer Expression in Wirbeltierzellen (z. B. von einem nicht menschlichen Säugetier, z. B. COS oder CHO, oder einem Vogel) sind frei davon, mit menschlichen Proteinen in Verbindung zu stehen. In Abhängigkeit von dem eingesetzten Wirt und anderen Faktoren können die Polypeptide der Erfindung mit Kohlenwasserstoffen vom Säugetier oder anderen Eukaryoten glykosyliert oder nicht glykosiliert sein. Man kann die Nukleinsäure modifizieren, damit Glykosylierungsstellen in dem resultierenden Polypeptid eingeschlossen sind. Wahlweise kann man ein glykosyliertes Polypeptid teilweise oder vollständig deglykosylieren. Polypeptide der Erfindung können auch einen Aminosäurerest einschließen, bei dem es sich um ein Start-Methionin (in Position –1, bezogen auf den ersten Aminosäurerest des reifen Polypeptids) handelt.
Zusätzlich zu den natürlicherweise vorkommenden Formen von Allelen des OB-Rezeptors beschreibt die vorliegende Erfindung auch andere OB-Rezeptor-Produkte, wie etwa Polypeptid-Analoga des OB-Rezeptors und Fragmente des OB-Rezeptors. Wenn man die Verfahren der oben erwähnten offengelegten Anmeldung von Alton et al. (WO 83/04053) nacharbeitet, kann man Gene, die für eine mikrobielle Expression von Polypeptiden mit primären Konformationen kodieren, die sich von den hier angegebenen in bezug auf die Identität oder Lage von einem oder mehreren Resten (z. B. Substitutionen, terminalen und zwischen den Termini liegenden Additionen und Deletionen) unterscheiden, leicht entwerfen und herstellen. Alternativ können Modifikationen von cDNA und genomischen Genen leicht durch die gut bekannten Techniken der ortsgerichteten Mutagenese (Site-directed mutagenesis) erzielt und eingesetzt werden, um Analoga und Derivate des OB-Rezeptors zu erzeugen. Derartige Produkte würden mindestens eine der biologischen Eigenschaften des Säugetier-OB-Rezeptors teilen, können sich jedoch in anderen unterscheiden. Als Beispiele schließen geplante Produkte solche ein, die durch z. B. Deletionen verkürzt sind, oder solche, die gegenüber einer Hydrolyse stabiler sind (und deshalb stärker ausgeprägte oder länger anhaltende Wirkungen als natürlicherweise vorkommende Proteine aufweisen), oder solche, die verändert worden sind, indem eine oder mehrere potentielle Stellen für eine Glykosylierung deletiert sind (was zu höheren Aktivitäten bei durch Hefe produzierten Produkten führen kann) oder solche, bei denen ein oder mehrere Cysteinreste deletiert oder durch z. B. Alanin- oder Serinreste ersetzt sind und die potentiell in der aktiven Form aus mikrobiellen Systemen einfacher isoliert werden, oder solche, bei denen ein oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt sind, oder solche, die eine veränderte Lysin-Zusammensetzung aufweisen (wie etwa solche, die zu Zwecken einer Derivatisierung hergestellt wurden). Es werden solche Polypeptide mit Aminosäure-Substitutionen beschrieben, die in bezug auf Azidität, Ladung, Hydrophobizität, Polarität, Größe oder andere Eigenschaften, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, bekannt sind, „konservativ" sind. Siehe allgemein Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company, N. Y., (1984) 498 Seiten plus Index, passim. Man kann Änderungen in den ausgewählten Aminosäuren vornehmen, solange derartige Änderungen die Gesamtfaltung oder Gesamtaktivität des Proteins erhalten (siehe Tabelle 1, unten). Kleine aminoterminale Erweiterungen, wie etwa ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid mit bis zu ungefähr 20 bis 25 Resten oder eine kleine Erweiterung, welche die Reinigung erleichtert, wie etwa ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder eine bindende Domäne, können ebenfalls vorhanden sein. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991.
Tabelle 1: Konservative Aminosäure-Substitutionen
Ebenfalls beschrieben werden Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz oder von sekundären Konformationen innerhalb des OB-Rezeptors duplizieren, wobei die Fragmente eine Aktivität (z. B. eine immunologische Aktivität) des Säugetier-OB-Rezeptors (insbesondere des menschlichen Rezeptors) und keine anderen Aktivitäten (z. B. OB-Protein bindende Aktivität) aufweist.
Anwendbar auf OB-Rezeptor-Fragmente und OB-Rezeptor-Polypeptid-Analoga sind Berichte über die immunologische Aktivität synthetischer Peptide, die im wesentlichen die Aminosäuresequenz, die in natürlicherweise vorkommenden Proteinen, Glycoproteinen und Nucleoproteinen noch vorhanden sind, dupliziert. Genauer gesagt, es ist gezeigt worden, daß Polypeptide mit einem relativ kleinen Molekulargewicht an Immunreaktionen teilnehmen, die in bezug auf Dauer und Ausmaß den Immunreaktionen von physiologisch bedeutsamen Proteine ähnlich sind, wie etwa virale Antigene, Polypeptidhormone und derartiges. Von den Immunreaktionen derartiger Polypeptide ist das Auslösen der Bildung spezifischer Antikörper in immunologisch aktiven Tieren umfasst. Siehe z. B. Lerner et al., Cell 23: 309–310 (1891); Ross et al., Nature 294: 654–656 (1891); Walter et al., PNAS-USA 77: 5197–5200 (1980); Lerner et al., PNAS-USA, 78: 3403–3407 (1891); Walter et al., PNAS-USA 78: 4882–4886 (1891); Wong et al., PNAS-USA 79: 5322–5326 (1982); Baron et al., Cell 28: 395–404 (1982); Dressmann et al., Nature 295: 185–160 (1982); und Lerner, Scientific American 248: 66–74 (1983). Siehe auch die Publikation von Kaiser et al., Science 223: 249–255 (1984), die sich auf biologische und immunologische Aktivitäten synthetischer Peptide bezieht, die sekundäre Strukturen von Peptidhormonen annähernd teilen, nicht jedoch die primäre strukturelle Konformation. Die vorliegende Erfindung beschreibt Klassen von Polypeptiden, die durch Bereiche der DNA kodiert werden, die zu dem das Protein kodierenden Strang der menschlichen cDNA oder genomischen DNA-Sequenzen des OB-Rezeptors komplementär sind, d. h. „invers komplementäre Proteine", wie durch Tramontano et al., Nucleic Acid 12: 5049–5059 (1984) beschrieben. Polypeptide oder Analoga davon können auch eine oder mehrere Aminosäure-Analoga, wie etwa Peptidomimetika, enthalten.
Folglich ist die vorliegende Klasse von OB-Rezeptor-Proteinen eine solche, deren Mitglieder die folgende Aminosäuren (gemäß Seq. ID Nr. 1) aufweisen:

(a) 1–896;
(b) 22–896;
(c) 23–896;
(d) 29–896
(e) 22–891;
(f) 23–891;
(g) 29–891;
(h) die Sequenzen (e) bis (g), welche die C-terminalen Aminosäuresequenzen aufweisen, die in Position 892 des OB-Rezeptors B (Seq. ID Nr. 3) oder C (Seq. ID Nr. 5) beginnen;
(i) Aminosäuren der Teilsequenzen b, c, d, e, f, g, und h, denen eine Leader-Sequenz fehlt, die einen N-terminalen Methioninrest aufweisen; und
(j) ein chemisch modifiziertes Derivat von jeder der Teilsequenzen (a) bis (h).

Wie oben ausgeführt, kann man einen löslichen Rezeptor durch Eliminierung der transmembranären und intrazellulären Regionen herstellen. Beispiele für lösliche Rezeptoren schließen solche ein, die in Seq. ID Nr. 10 und 13 dargestellt werden. Eine Form eines löslichen menschlichen OB-Rezeptors, von der angenommen wird, daß sie eine native, sezernierte Form darstellt, wird hier ebenfalls beschrieben. Diese Form eines OB-Rezeptor-Proteins weist eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus folgenden (gemäß Seq. ID Nr. 13):

(a) Aminosäuren der Teilsequenzen 1–804;
(b) Aminosäuren 22–804;
(c) Aminosäuren 23–804;
(d) Aminosäuren 29–804; und
(e) Aminosäuren der Teilsequenzen (b), (c) oder (d) mit einem N-terminalen Methioninrest.

Da zusätzlich die C-terminale Region der oben aufgeführten Polypeptide in Position 892 abweicht (bezogen auf die Seq. ID Nr. 1, 3, 5, 7 und 13), kann man wünschen, nur Polypeptide herzustellen, die sich folgendermaßen unterscheiden:

(a) Solche, die nur die Aminosäuren 892–896 nach Seq. ID Nr. 1 aufweisen;
(b) Solche, die nur die Aminosäuren 892–904 nach Seq. ID Nr. 3 aufweisen;
(c) Solche, die nur die Aminosäuren 892–958 nach Seq. ID Nr. 5 aufweisen;
(d) Solche, die nur die Aminosäuren 892–1165 nach Seq. ID Nr. 7 aufweisen; und
(e) Solche, die nur die Aminosäuren 799–804 nach Seq. ID Nr. 13 aufweisen;

Die oben aufgeführten Polypeptide, die eine extrazelluläre Domäne aufweisen, können modifiziert sein, wie oben angegeben, und die Funktion zur Ligandenbindung noch beibehalten. Eine derartige Modifikation kann eine oder mehrere der folgenden einschließen:

(a) Die Random coil-Domäne (die, wie oben angegeben, stromabwärts von der zweiten Hämatopoetin-Domäne bis zum Anfang der transmembranären Domäne auftritt) kann deletiert sein (dies kann ungefähr die Positionen 642 bis 839 oder 841 betreffen);
(b) Die „WSXWS"-Box kann modifiziert sein durch (i) Substitution des ersten Serins mit einer anderen Aminosäure, insbesondere einer, die im Hinblick auf Hydrophobizität und/oder Ladung konserviert ist, wie etwa Glycin; (ii) das letzte Serin kann durch eine andere Aminosäure, wie etwa Threonin substituiert sein; (iii) das erste Tryptophan kann durch eine andere Aminosäure, beispielsweise ein Tyrosin, substituiert sein.

Folglich schließen die vorliegenden Polypeptide folgende ein (gemäß der Numerierung nach Seq. ID Nr. 7):

(a) 1–896;
(b) 22–896;
(c) 23–896;
(d) 29–896;
(e) 22–891;
(f) 23–891;
(g) 29–891;
(h) Sequenzen (e) bis (g), welche die C-terminalen Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus den C-terminalen Aminosäuren 892 bis 904 des OB-Rezeptors B (Seq. ID Nr. 3) oder den Aminosäuren 892 bis 958 des OB-Rezeptors C (Seq. ID Nr. 5), aufweisen;
(i) Aminosäuren der Teilsequenzen b, c, d, e, f g und h, denen eine Leader-Sequenz fehlt und die einen N-terminalen Methioninrest aufweisen; und
(j) Aminosäuren der Teilsequenzen (a) bis (i) oben, die mindestens eine der folgenden Modifikationen aufweisen:
(i) Deletion der gesamten Sequenz der Random coil-Domäne oder eines Teils davon, ausgewählt aus folgenden Teilsequenzen:
(a) 640 bis 839 (wobei die Numerierung nach Seq. ID Nr. 1 verwendet wird);
(b) 641 bis 839;
(c) 642 bis 839;
(d) 640 bis 841;
(e) 641 bis 841;
(f) 642 bis 841; und
(ii) Modifikation einer „WSXWS"-Sequenz, die in folgendem besteht:
(a) Einer Substitution des ersten Serins durch eine andere Aminosäure, insbesondere eine, die konserviert ist in bezug auf die Hydrophobizität und/oder Ladung, wie etwa einem Glycin;
(b) Einer Substitution des letzten Serins durch eine andere Aminosäure, wie etwa einem Threonin;
(c) Einer Substitution des ersten Tryptophans durch eine andere Aminosäure, beispielsweise einem Tyrosin.

Man kann den OB-Rezeptor modifizieren, um ein Fusionsmolekül mit einer anderen Peptidsequenz zu erschaffen. Wenn man beispielsweise wünscht, den OB-Rezeptor mit einem immunogenen Peptid zu „taggen", d. h. ein entsprechendes Peptid anzuhängen, kann man eine DNA konstruieren, die zu einem solchen Fusionsprotein führen würde. Das „Etikett" („tag") kann sich am N-Terminus befinden. Da offensichtlich ist, daß der C-Terminus für die Ligandenbindungsaktivität nicht notwendig ist, kann man auch den C-Terminus von beispielsweise einem löslichen OB-Rezeptor chemisch modifizieren. Man kann beispielsweise eine Herstellung wünschen, bei der eines oder mehrere Polymermoleküle, wie etwa Polyethylenglykol-Moleküle angefügt sind. Folglich ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein chemisch modifiziertes OB-Rezeptor-Protein (ebenfalls unten näher beschrieben).
Ein Beispiel eines solchen Etiketts wird hier unter Verwendung des C-Terminus eines rekombinanten löslichen OB-Rezeptors verfügbar gemacht. Die Seq. ID Nr. 12 macht eine „FLAG-tag"-Version eines derartigen löslichen OB-Rezeptors verfügbar (es wird die Nukleinsäuresequenz verfügbar gemacht, die transkribiert werden kann, um das Polypeptid herzustellen). Ein derartiger „FLAG-tag" kann auch an den N-Terminus oder eine andere Region eines OB-Rezeptor-Proteins angefügt sein. Diese Art von „Tagging" ist nützlich, um das Protein unter Verwendung von Reagenzien, wie etwa Antikörpern, die für einen solches Etikett selektiv sind, zu binden. Eine derartige Bindung kann zum Nachweis der Lokalisierung oder Menge von Protein vorgesehen sein oder zu Verfahren eines „Einfangens" („Capturing") von Proteinen, bei denen beispielsweise eine Affinitätssäule verwendet wird, um das Etikett und damit das gewünschte Protein zu binden. Andere Arten von nachweisbaren Markierungen, wie etwa Radioisotope, einem Licht emittierenden (z. B. fluoreszierende oder phosphoreszierende Verbindungen), enzymatisch spaltbaren, nachweisbaren Antikörper (oder einer Modifikation davon) oder anderen Substanzen können für eine solche Markierung der vorliegenden Proteine verwendet werden. Das Nachweisen von Protein durch Verwendung der Markierungen kann zum Identifizieren der Anwesenheit oder Menge von OB-Rezeptor-Protein oder einer Verbindung, die ein solches Protein enthält (z. B. OB-Protein, das mit dem OB-Rezeptor komplexiert ist) nützlich sein. Darüber hinaus kann ein derartig markiertes Protein nützlich sein, um ein exogenes OB-Rezeptor-Protein von der endogenen Form zu unterscheiden.
Nukleinsäuren
Neue Nukleinsäuresequenzen der Erfindung schließen Sequenzen ein, die zum Feststellen einer Expression von Polypeptidprodukten, die mindestens einen Teil der primären strukturellen Konformation und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften eines rekombinanten menschlichen OB-Rezeptors aufweisen, in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen nützlich sind. Die Nukleinsäuren können gereinigt und isoliert werden, damit die gewünschte kodierende Region nützlich ist, um die vorliegenden Polypeptide beispielsweise zu diagnostischen Zwecken, wie unten ausführlicher beschrieben, herzustellen. Die DNA-Sequenzen der Erfindung umfassen speziell: (a) jede DNA-Sequenz, die in Seq. ID Nr 2, 4 und 6 (und komplementären Strängen) dargestellt ist; (b) eine DNA-Sequenz, die (unter Hybridisierungsbedingungen, die im Abschnitt über das Durchmustern einer cDNA-Bibliothek unten offenbart werden, wobei das 300 bp große PCR-Fragment verwendet wird, wie beschrieben, um selek tiv mit einer cDNA zu hybridisieren, die ein OB-Rezeptor-Protein in einer menschlichen Leber-cDNA-Bibliothek kodiert, oder unter äquivalenten Bedingungen oder stringenteren Bedingungen) mit der DNA-Sequenz der Teilsequenz (a) oder Fragmenten davon hybridisiert; und (c) eine DNA-Sequenz, die, abgesehen von der Degeneration des genetischen Codes, mit der DNA-Sequenz der Teilsequenz (a) hybridisieren würde. In den Teilsequenzen (b) und (c) speziell enthalten sind genomische DNA-Sequenzen, die variante Formen von Allelen des menschlichen OB-Rezeptors kodieren und/oder eine OB-Rezeptor-Form anderer Säugetierspezies kodieren, sowie hergestellte DNA-Sequenzen, die den OB-Rezeptor, Fragmente des OB-Rezeptors und Analoga des OB-Rezeptors kodieren, wobei die DNA-Sequenzen Kodons umfassen können, welche die Transkription und Translation von messenger-RNA in mikrobiellen Wirten erleichtert. Derartige hergestellte Sequenzen können leicht nach den Verfahren von Alton et al., offengelegte PCT-Anmeldung WO93/04053, konstruiert werden.
Genomische DNA, wie etwa die von Seq. ID Nr. 9, welche die vorliegenden OB-Rezeptoren kodiert, kann zusätzlich nicht kodierende Basen oder Introns enthalten, und derartige genomische DNAs sind durch Hybridisieren der gesamten cDNA, veranschaulicht in Seq. ID Nr. 2, 4, 6, 8, 11 und 14 oder eines Teils davon, mit einer genomischen DNA-Quelle, wie etwa einer menschlichen genomischen DNA-Bibiliothek, erhältlich. Derartige genomische DNA wird ein funktionelles OB-Rezeptor-Polypeptid kodieren, allerdings kann eine Verwendung der cDNAs insofern besser durchführbar sein, als eine rekombinante Manipulation erleichtert wird, da nur die kodierende Region beteiligt ist. Die Intron/Exon-Lage von genomischer DNA wird in Seq. ID Nr. 9 unten dargelegt.
Nukleinsäuresequenzen schließen die Aufnahme von Kodons ein, welche eine Expression durch ausgewählte Nicht-Säugetierwirte steigern, die Bereitstellung von Stellen zur Spaltung durch Restriktionsendonuklease-Enzyme und die Bereitstellung von zusätzlichen anfänglichen, terminalen oder dazwischen liegenden DNA-Sequenzen, welche die Konstruktion von Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren erleichtern.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch DNA-Sequenzen, welche Polypeptidanaloga oder Derivate des OB-Rezeptors kodieren, welche sich von den natürlicherweise vorkommenden Formen im Hinblick auf die oben beschriebenen Eigenschaften unterscheiden. Die Leader-Sequenz-DNA kann zur Erleichterung der Expression oder zu anderen Zwecken durch eine andere Leader-Sequenz substituiert sein.
Auch kann man antisense-Nukleinsäuren gegen die vorliegenden DNAs herstellen. Derartige antisense-Nukleinsäuren können zum Modulieren der Wirkungen des OB-Rezeptor-Proteins in vivo nützlich sein. Beispielsweise kann man eine antisense-Nukleinsäure herstellen, die wirksam die Fähigkeit einer Zelle, einen OB-Rezeptor zu produzieren, inaktiviert, indem sie an die Nukleinsäure, welche einen solchen OB-Rezeptor kodiert, bindet.
Die DNA-Sequenzen der Erfindung sind auch geeignete Materialien zur Verwendung als markierte Sonden beim Isolieren menschlicher genomischer DNA, welche den OB-Rezeptor kodiert, wie oben erwähnt, und damit in Beziehung stehender Proteine ebenso wie von cDNA und genomischen DNA-Sequenzen anderer Säugetierspezies. Die DNA-Sequenzen können auch nützlich sein bei verschiedenen alternativen Verfahren der Proteinsynthese (z. B. in Insektenzellen) oder, wie unten beschrieben, bei der Gentherapie an Menschen und anderen Säugetieren. Es wird angenommen, daß die DNA-Sequenzen der Erfindung nützlich sind beim Entwickeln transgener Säugetierspezies, die als eukaryotische „Wirte" zur quantitativen Herstellung eines OB-Rezeptors oder eines OB-Rezeptor-Produkts dienen. Siehe allgemein Palmiter et al., Science 222: 809–814 (1983).
Vektoren und Wirtszellen
Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung sind die hier beschriebenen DNA-Sequenzen, welche OB-Rezeptor-Polypeptide kodieren, wertvoll für die Information, die sie in bezug auf die Aminosäuresequenz des Säugetierproteins verfügbar machen, die vordem nicht verfügbar gewesen ist. Anders ausgedrückt, DNA-Sequenzen, die durch die Erfindung verfügbar gemacht werden, sind nützlich zum Herstellen neuer und nützlicher viraler und ringförmiger Plasmid-DNA-Vektoren, neuer und nützlicher transformierter und transfizierter prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen (einschließlich in Kultur gewachsener Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen) und neuer und nützlicher Verfahren zum Wachstum derartiger Wirtszellen in Kultur, die zur Expression des OB-Rezeptors und seiner verwandten Produkte in der Lage sind.
Die hier verfügbar gemachte DNA (oder entsprechende RNAs) können auch zur Gentherapie verwendet werden, beispielsweise zur Behandlung von Zuständen, die durch die Überexpression des OB-Proteins charakterisiert sind, wie etwa Anorexie oder Kachexie. Alternativ kann die Gentherapie in Fällen verwendet werden, in denen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem OB-Protein gewünscht ist, wie etwa in Fällen, in denen ein Individuum einen Zustand aufweist, der durch solche OB-Protein-Rezeptoren charakterisiert ist, deren Fähigkeit, das OB-Protein zu binden oder die Bindung aufrecht zu erhalten, gestört ist. Gegenwärtig können Vektoren, die zur Gentherapie geeignet sind (wie etwa retrovirale oder adenovirale Vektoren, die zu gentherapeutischen Zwecken modifiziert sind und die außerdem rein und pharmazeutisch zulässig sind) zur Abgabe an beispielsweise die Lunge verabreicht werden. Derartige Vektoren können eine Nukleinsäure einschließen, welche die vorliegenden Peptide zur Expression an einem gewünschten Ort kodiert. Eine Gentherapie kann mehr als ein Gen eines gewünschten Proteins oder verschiedener gewünschter Proteine beinhalten.
Alternativ kann man keinen Vektor verwenden, um ein relativ stabiles Vorhandensein im Wirt zu erleichtern. Beispielsweise kann eine homologe Rekombination einer DNA, wie sie hier verfügbar gemacht wird, oder einer geeigneten Transkriptions- oder Translationskontrollregion eine Integration in oder eine Expression von einem Wirtsgenom erleichtern. (Dies kann ebenfalls zu Herstellungszwecken durchgeführt werden, z. B. US-Patent Nr. 5,272,071 und WO91/09955). Die Nukleinsäure kann in einem pharmazeutisch zulässigen Träger untergebracht sein, um die Aufnahme durch die Zelle zu erleichtern, wie etwa einem Träger aus einer Lipidlösung (z. B. ein geladenes Lipid), einem Liposom oder einem Polypeptid-Träger (z. B. Polylysin). Ein Übersichtsartikel zur Gentherapie ist Verma, Scientific American, November 1990, S. 68–84, der im Wege der Bezugnahme hier aufgenommen ist.
Folglich macht die vorliegende Erfindung eine Population von Zellen verfügbar, die einen OB-Rezeptor der vorliegenden OB-Rezeptor-Familie exprimieren. Derartige Zellen sind zur Transplantation oder Implantation in ein Individuum zu therapeutischen Zwecken geeignet. Beispielsweise kann man eine Population von Zellen herstellen, welche den OB-Rezeptor (wie etwa einen, der in den Seq. IDs identifiziert oder auf andere Weise hier erwähnt wird) überexprimieren oder eine gewünschte Form eines OB-Rezeptors exprimieren, wie etwa eine, die besonders empfindlich ist gegenüber dem OB-Protein (d. h. eine Form, die eine gewünschte Fähigkeit zur Signaltransduktion aufweist). Man kann dann derartige Zellen dann in ein Individuum implantieren, um die Empfindlichkeit des Individuums gegenüber dem OB-Protein zu steigern. Derartige Zellen können beispielsweise Leberzellen, Knochenmarkszellen oder Zellen, die aus der Nabelschnur stammen, sein. Alternativ kann man wünschen, eine Überexpression von Zellen, die in der Zirkulation auftreten, zu verwenden; wie etwa Blutvor läuferzellen, T-Zellen oder andere Blutzellen. Beim Menschen können menschliche Zellen verwendet werden. Die Zellen können in Form von Gewebe vorliegen. Derartige Zellen können vor der Transplantation oder Implantation kultiviert werden. Eine derartige OB-Rezeptor-Überexpression oder eine Expression von besonders empfindlichen Formen des OB-Rezeptors kann durch beispielsweise Verändern des regulatorischen Mechanismus zur Expression des OB-Rezeptors erreicht werden, wie etwa unter Verwendung homologer Rekombinationstechniken, wie oben beschrieben. Folglich wird eine Population von Wirtszellen verfügbar gemacht, die modifiziert sind, damit die Expression von endogener OB-Rezeptor-DNA gesteigert ist.
Die Zellen, die auf den Empfänger übertragen werden sollen, können unter Verwendung eines oder mehrerer Faktoren, welche das Wachstum oder die Proliferation solcher Zellen beeinflussen, falls notwendig, kultiviert werden. Es können Hämatopoese-Faktoren beim Kultivieren von hämatopoetischen Zellen verwendet werden. Derartige Faktoren schließen G-CSF, EPO, MGDF, SCF, Flt-3-Ligand, Interleukine (z. B. IL1–IL13), GM-CSF, LIF und Analoga und Derivate davon ein, wie sie für diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, verfügbar sind.
Nervenzellen, wie etwa Neurone oder Gliazellen, können ebenfalls verwendet werden, und diese können mit neurotrophen Faktoren, wie etwa BDNF CNTF, GDNF, NT3 und anderen kultiviert werden.
Es kann eine Gen-Kombinationstherapie stattfinden, an der die Transplantation von Zellen beteiligt ist, welche mehr als ein gewünschtes Protein exprimieren. Beispielsweise können Zellen, die ein OB-Rezeptor-Protein exprimieren, gleichzeitig oder nacheinander in Verbindung mit Zellen verwendet werden, die ein OB-Protein exprimieren.
In bezug auf die Dosierungen in der Gentherapie wird man im allgemeinen zwischen einer Kopie und mehreren tausend Kopien der vorliegenden Nukleinsäure pro Zelle verwenden, was von dem Vektor, dem Expressionssystem, dem Alter, Gewicht und Zustand des Empfängers und anderen Faktoren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, offensichtlich sind, abhängt. Die zelluläre Abgabe eines solchen Proteins kann derart gestaltet sein, daß sie über eine ausgewählte Zeitdauer anhält, wie etwa einer Dauer von Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren. Am Ende der wirksamen Zeitdauer kann der Empfänger derartiger transformierter Zellen eine andere „Dosis" (z. B. Transplantation von Zellen) erhalten. Die Zellen können nach ihrer Lebenszeit, ihrer Zeitdauer der Expression des gewünschten Proteins oder ihrer Fähigkeit, aus einem Individuum re-isoliert zu werden (d. h. bei Blutzellen kann eine Leukaphorese verwendet werden, um transformierte Zellen unter Verwendung von Markern, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind, zu gewinnen) ausgewählt werden. Vektoren können auf ähnliche Weise entworfen werden, wobei beispielsweise Viren, die eine bekannte Expressionsdauer von cDNAs, die in ihnen enthalten sind, aufweisen, verwendet werden.
Die gewünschten Zellen oder Vektoren können unter Verwendung von Techniken, wie etwa Einfrieren, die für diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, verfügbar sind, gelagert werden.
Folglich beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Verabreichen eines OB-Rezeptor-Proteins an ein Individuum, wobei die Quelle des OB-Rezeptor-Proteins ausgewählt ist aus (i) einer Population von Zellen, welche ein OB-Rezeptor-Protein exprimieren, und (ii) einer Population von Vektoren, welche ein OB-Rezeptor-Protein exprimieren. Das genannte OB-Rezeptor-Protein kann ausgewählt sein aus den hier beschriebenen. Die genannten Vektoren können virale Vektoren sein, die in der Lage sind, menschliche Zellen zu infizieren. Die genannten Zellen können ausgewählt sein aus Gewebe oder individuellen Zellen. Die genannten individuellen Zellen können ausgewählt sein aus Adipozyten, Fibroblasten, Knochenmarkszellen, peripheren Blutvorläuferzellen, roten Blutzellen und weißen Blutzellen, einschließlich T-Zellen, und Nervenzellen. Die genannte Population von Zellen oder Vektoren kann gemeinsam mit einer Population von Zellen oder Vektoren, welche ein OB-Protein oder ein anderes gewünschtes Protein exprimieren, verabreicht werden. Die genannten Zellen oder Vektoren können zur Verwendung in einem Individuum gelagert werden. Die Lagerung kann durch Einfrieren erfolgen.
Komplexe
Zusätzlich zu dem OB-Rezeptor-Protein, wie es hier beschrieben wird, kann man Komplexe aus einem OB-Rezeptor-Protein und einem OB-Protein, Analogon oder Derivat herstellen.
Das OB-Protein kann ausgewählt sein aus solchen, die in der PCT-Publikation WO96/05309 beschrieben wurden. 3 dieser Publikation (Seq. ID Nr. 4, wie hier angeführt) stellt die volle deduzierte Aminosäuresequenz dar, die für das menschliche OB-Gen abgeleitet wurde. Die Aminosäuresequenzen sind von 1 bis 167 numeriert. Eine Signalsequenz-Spaltstelle ist nach der Aminosäure 21 (Ala) lokalisiert, so daß sich das reife Protein von der Aminosäure 22 (Val) zu der Aminosäure 167 (Cys) erstreckt. Für die vorliegende Offenbarung wird hier eine andere Numerierung verwendet, wobei die Aminosäure-Position 1 der Valinrest ist, der sich am Anfang des reifen Proteins befindet.
Allgemein wird das zur Verwendung vorgesehene OB-Protein in der Lage sein, mit dem ausgewählten OB-Protein-Rezeptor zu komplexieren. Folglich wird man die Fähigkeit zur Bindung (an die gesamte extrazelluläre Domäne des OB-Rezeptors oder eines Teils davon, wie oben angegeben) empirisch testen, um zu bestimmen, welche Form von OB-Protein verwendet werden können. Allgemein können Modifikationen, die allgemein anwendbar sind, wie oben angegeben, auf das OB-Rezeptor-Protein hier ebenfalls angewendet werden. Wie in WO 96/05309 ausgeführt, behalten das OB-Protein in seiner nativen Form oder Fragmente (wie etwa Enzym-Spaltungsprodukte) oder andere trunkierte Formen, Analoga und Derivate alle die biologische Aktivität bei. Derartige Formen können verwendet werden, solange die Form an mindestens einen Teil der extrazellulären Domäne der vorliegenden OB-Rezeptor-Proteine bindet.
Eine wirksame Menge eines OB-Proteins, Analogons oder Derivats davon kann ausgewählt sein aus der Aminosäuresequenz, wie sie in der PCT-Publikation WO 96/05309, 3, dargestellt wird, die derart numeriert ist, daß die erste Aminosäure des reifen Proteins mit der Nummer 1 versehen ist:

(a) Die Aminosäuresequenz 1–146, der wahlweise ein Glutaminrest in Position 28 fehlt, und die wahlweise weiterhin einen Methionrest am N-Terminus aufweist;
(b) Eine Aminosäuresequenz mit der Teilsequenz (a), die eine andere Aminosäure aufweist, die in einer oder mehreren der folgenden Positionen substituiert ist: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145;
(c) Ein trunkiertes OB-Protein-Analogon, ausgewählt aus Analoga mit den folgenden Teilsequenzen (wobei die Numerierung der Teilsequenz (a) oben verwendet wird):
(i) Aminosäuren 98–146;
(ii) Aminosäuren 1–32;
(iii) Aminosäuren 1–35;
(iv) Aminosäuren 40–116;
(v) Aminosäuren 1–99 und 112–146;
(vi) Aminosäuren 1–99 und 112–146, die eine oder mehrere der Aminosäuren 100–111 aufweisen, die nacheinander zwischen den Aminosäuren 99 und 112 untergebracht sind; und
(vii) Das trunkierte OB-Analogon der Teilsequenz (i), bei dem eine oder mehrere der Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145 durch eine andere Aminosäure substituiert sind;
(viii) Das trunkierte Analogon der Teilsequenz (ii), bei dem eine oder mehrere der Aminosäuren 4, 8 und 32 durch eine andere Aminosäure substituiert sind;
(ix) Das trunkierte Analogon der Teilsequenz (iv), bei dem eine oder mehrere der Aminosäuren 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 und 112 durch eine andere Aminosäure ersetzt sind;
(x) Das trunkierte Analogon der Teilsequenz (v), bei dem eine oder mehrere der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 und 145 durch eine andere Aminosäure ersetzt sind;
(xi) Das trunkierte Analogon der Teilsequenz (vi), bei dem eine oder mehrere der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145 durch eine andere Aminosäure ersetzt sind;
(xii) Das trunkierte Analogon von einer der Teilsequenzen (i) bis (xi), die einen N-terminalen Methionrest aufweisen; und
(d) Das OB-Protein oder analoge Derivat von jeder der Teilsequenzen (a) bis (c), die einen chemischen Rest umfassen, der mit dem Proteinrest verbunden ist;
(e) Ein Derivat einer Teilsequenz (d), wobei der genannte chemische Rest ein Rest eines wasserlöslichen Polymers ist;
(f) Ein Derivat einer Teilsequenz (e), wobei der genannte Rest eines wasserlöslichen Polymers Polyethylenglykol ist;
(g) Ein Derivat einer Teilsequenz (f), wobei der genannte Rest eines wasserlöslichen Polymers ein Polyaminosäurerest ist;
(h) Ein Derivat der Teilsequenz (g), wobei der Rest des wasserlöslichen Polymers nur an den N-Terminus des genannten Proteinrests angefügt ist;
(i) Ein OB-Protein, Analogon oder Derivat einer der Teilsequenzen (a) bis (h) in einem pharmazeutisch zulässigen Träger.

Von OB-Proteinen, Analoga und verwandten Molekülen wird auch in den folgenden Publikationen berichtet, allerdings gibt es keine Darstellung im Hinblick auf die Aktivität irgendeiner berichteten Zusammensetzung:

US-Patent Nr. 5,521,283; 5,532,336; 5,552,522; 5,552,523; 5,552,524; 5,554,727; 5,559,208; 5,563,243; 5,563,244; 5,563,245; 5,567,678; 5,567,803; 5,569,744; 5,569,743 (alle übertragen auf Eli Lilly and Company);
PCT-Anmeldungen WO96/23517; WO96/23515; WO96/23514; WO96/24670; WO96/23513; WO96/23516; WO96/23518; WO96/23519; WO96/23520; WO96/23815; WO96/24670; WO96/27385 (alle übertragen auf Eli Lilly and Company);
PCT-Anmeldung WO96/22308 (übertragen auf Zymogenetics);
PCT-Anmeldung WO96/29405 (übertragen auf Ligand Pharmaceuticals, Inc.);
PCT-Anmeldung WO96/31526 (übertragen auf Amyin Pharmaceuticals, Inc.);
PCT-Anmeldung WO96/34885 (übertragen auf Smithkline Beecham PLC);
PCT-Anmeldung WO96/35787 (übertragen auf Chiron);
EP 0 725 079 (übertragen auf Eli Lilly and Company);
EP 0 725 078 (übertragen auf Eli Lilly and Company);
EP 0 736 599 (übertragen auf Takeda);
EP 0 741 187 (übertragen auf F. Hoffman LaRoche).

Soweit diese Referenzen nützliche OB-Proteine oder Analoga oder Derivate davon oder damit verbundene Zusammensetzungen oder Verfahren verfügbar machen, können derartige Zusammensetzungen und/oder Verfahren zusammen mit den vorliegenden OB-Rezeptor-Proteinen verwendet werden, wie etwa zur gemeinsamen Verabreichung (zusammen oder einzeln in einem ausgewählten Dosierungsplan) oder durch Komplexieren von Zusammensetzungen mit den vorliegenden OB-Protein-Rezeptoren.
Derivate und Formulierungen
Der vorliegende OB-Protein-Rezeptor und/oder das OB-Protein (der Begriff „Protein", wie hier verwendet, schließt, wenn nicht anders angegeben, ein „Peptid" und OB-Protein-Analogon oder OB-Protein-Rezeptor-Analoga ein, wie etwa jene, die unten aufgelistet sind) können auch durch das Anfügen von einer oder mehreren chemischen Resten an den Proteinrest derivatisiert sein. Falls die vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen als den aktiven Inhaltsstoff einen Komplex aus OB-Protein-Rezeptor und OB-Protein enthalten, kann eines dieser Proteine oder es können beide derivatisiert sein. Die chemisch modifizierten Derivate können weiter formuliert sein zur intraarteriellen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intravenösen, oralen, nasalen, pulmonaren oder topischen Verabreichung oder zu anderen Arten der Verabreichung. Es ist festgestellt worden, daß eine chemische Modifikation von biologisch aktiven Proteinen unter bestimmten Umständen zusätzliche Vorteile verfügbar macht, wie etwa ein Verbessern der Stabilität und ein Verlängern der Verweilzeit in der Zirkulation des therapeutischen Proteins und ein Abnehmen der Immunogenität. Siehe US-Patent Nr. 4,179,337, Davis et al., erteilt am 18. Dezember 1979. Zur Übersicht siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg und J. Roberts, Hrsg. S. 367–383 (1991)). Ein Übersichtsartikel, der eine Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt, ist Francis, Focus on Growth Factors 3: 4–10 (Mai 1992) (herausgegeben von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).
Vorzugsweise wird zur therapeutischen Verwendung der Zubereitung des Endprodukts der chemische Rest zur Derivatisierung pharmazeutisch zulässig sein. Es kann ein Polymer verwendet werden. Jemand, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer auf der Grundlage von Überlegungen auszuwählen, wie etwa, ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden wird, und wird, falls dies der Fall ist, die gewünschte Dosierung, die Verweildauer in der Zirkulation, die Resistenz gegenüber Proteolyse und andere Überlegungen einbeziehen. In bezug auf die vorliegenden Proteine und Peptide kann die Wirksamkeit der Derivatisierung durch Verabreichung des Derivats in der gewünschten Form (d. h. beispielsweise durch eine osmotische Pumpe oder durch Injektion oder Infusion oder in einer weiteren Formulierung zur oralen, pulmonaren oder nasalen Abgabe) und Beobachten der biologischen Wirkungen, wie sie hier beschrieben werden, festgestellt werden.
Die chemischen Reste, die zur Derivatisierung geeignet sind, können ausgewählt sein aus verschiedenen wasserlöslichen Polymeren. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, damit das Protein, an welches es angefügt wird, in einer wäßrigen Umgebung, wie etwa einer physiologischen Umgebung, mischbar ist. Das wasserlösliche Polymer kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus beispielsweise Polyethylenglykol, Copolymeren von Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidon, Poly-l,3-dioxalan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere oder nicht zufällige Copolymere) (siehe oben in bezug auf Fusionsmolekülen) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykol-Homopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole, Polystyrolmaleat und Polyvinylalkohol. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann beim Herstellen aufgrund seiner Stabilität in Wasser vorteilhaft sein.
Fusionsproteine können durch Anfügen von Polyaminosäuren an den OB-Protein-Rezeptor oder den OB-Protein-Rest (oder ein Analogon oder einen Komplex) hergestellt werden. Beispielsweise kann die Polyaminosäure ein Trägerprotein sein, das dazu dient, die Halbwertszeit des Proteins in der Zirkulation zu erhöhen. Zu den vorliegenden therapeutischen oder kosmetischen Zwecken sollte eine derartige Polyaminosäure eine solche sein, die keine neutralisierende antigene Antwort oder eine andere nachteilige Antwort hervorruft. Eine derartige Polyaminosäure kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus Serumalbumin (wie etwa humanem Serumalbumin), einem Antikörper oder einem Teil davon (wie etwa einer konstanten Region eines Antikörpers, manchmal als „F_c" bezeichnet) oder anderen Polyaminosäuren. Wie unten angegeben, kann sich die Lage der Anfügung der Polyaminosäure am N-Terminus des OB-Protein-Rests oder an einem anderen Ort befinden, und sie kann auch durch einen chemischen „Linker"-Rest mit dem OB-Protein verbunden sein.
Das Polymer kann jedes Molekulargewicht aufweisen, und es kann verzweigt oder unverzweigt sein. Bei Polyethylenglykol liegt das bevorzugte Molekulargewicht zugunsten der Einfachheit in der Handhabung und Herstellung zwischen ungefähr 2 kDa und ungefähr 100 kDa (der Begriff „ungefähr" gibt an, daß in Zubereitungen von Polyethylenglykol einige Moleküle ein größeres und einige ein geringeres Molekulargewicht als das angegebene aufweisen). Andere Größen können verwendet werden, was von dem gewünschten therapeutischen Profil (z. B. der Dauer der gewünschten verzögerten Freisetzung, den Wirkungen, falls es eine Wirkung auf die biologische Aktivität gibt, der Einfachheit in der Handhabung, dem Grad oder Fehlen einer antigenen Wirkung und anderen bekannten Wirkungen des Polyethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder Analogon) abhängt.
Die Anzahl an Polymermolekülen, die auf diese Weise angefügt werden, kann variieren, und jemand, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, wird in der Lage sein, die Wirkung auf die Funktion sicherzustellen. Man kann eine einfache („mono") Derivatisierung vornehmen, oder man kann eine di-, tri-, tetra- oder eine sonstige Kombination von Derivatisierungen mit denselben oder verschiedenen chemischen Resten (z. B. Polymeren, wie etwa Polyethylenglykolen mit verschiedenen Gewichten) verfügbar machen. Das Verhältnis von Polymermolekülen zu Protein- (oder Peptid-)Molekülen wird variieren, so wie ihre Konzentrationen in der Reaktionsmischung variieren wird. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (in bezug auf die Wirksamkeit der Reaktion, dadurch bestimmt, daß es keinen Überschuß an nicht umgesetztem Protein oder Polymer gibt) durch verschiedene Faktoren bestimmt werden, wie etwa dem gewünschten Grad der Derivatisierung (z. B. mono-, di-, tri- etc.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, der Tatsache, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist, und den Reaktionsbedingungen.
Die chemischen Reste sollten an das Protein unter Berücksichtigung der Wirkungen auf funktionelle oder antigene Domänen des Proteins angefügt sein. Es gibt eine Anzahl von Verfahren zum Anfügen, die für jemanden, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, verfügbar sind. Beispielsweise EP 0 401 384 (betrifft die Kopplung von PEG an G-CSF), siehe auch Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028–1035 (1992) (worin über die Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid berichtet wird). Beispielsweise kann Polyethylenglykol kovalent durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe, wie etwa eine freie Amino- oder Carboxygruppe, gebunden sein. Reaktive Gruppen sind solche, an die ein aktiviertes Polyethylenglykol-Molekül (oder ein anderer chemischer Rest) gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest einschließen. Diejenigen, die eine freie Carboxygruppe aufweisen, können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenfalls als eine reaktive Gruppe zum Anfügen des/der Polyethylenglykol-Moleküls/e (oder eines anderen chemischen Rests) verwendet werden. Zur Herstellung zu therapeutischen Zwecken bevorzugt ist das Anfügen an eine Aminogruppe, wie etwa ein Anfügen an den N-Terminus oder die Lysingruppe. Ein Anfügen von Resten, die für die Rezeptorbindung wichtig sind, sollte vermieden, falls eine Rezeptorbindung gewünscht ist.
Man kann ein speziell am N-Terminus chemisch modifiziertes Protein wünschen. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als einem Beispiel für die vorliegenden Zusammensetzungen kann man auswählen aus einer Vielfalt von Polyethylenglykol-Molekülen (in bezug auf Molekulargewicht, Verzweigung etc.), dem Verhältnis von Polyethylenglykol-Molekülen zu Proteinmolekülen in der Reaktionsmischung, der Art der Pegylierungsreaktion, die durchgeführt werden soll, und dem Verfahren zum Erhalten des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins. Das Verfahren zum Erhalten der N-terminal pegylierten Zubereitung (d. h. das Trennen dieses Rests von anderen monopegylierten Resten, falls erforderlich) kann durch Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen erfolgen. Eine selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch reduktive Alkylierung erreicht werden, welche die unterschiedliche Reaktivität von verschiedenen Arten von primären Aminogruppen (Lysin vs. die N-terminale Aminogruppe), die zur Derivatisierung in einem bestimmten Protein verfügbar sind, ausnutzen. Siehe PCT-Anmeldung WO 96/11953. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einer Carbonylgruppe, die ein Polymer enthält, erzielt. Beispielsweise kann man das Protein selektiv am N-Terminus pegylieren, indem die Reaktion bei einem pH-Wert durchgeführt wird, der es einem ermöglicht, die pK_a-Unterschiede zwischen der ε-Aminogruppe der Lysinreste und der α-Aminogruppe des N-terminalen Rests des Proteins auszunutzen. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird das Anfügen eines Polymers an ein Protein gesteuert: die Konjugation mit dem Polymer findet vorrangig am N-Terminus des Proteins statt, und es findet keine bedeutende Modifikation anderer reaktiver Gruppen, wie etwa den Aminogruppen der Lysinseitenkette, statt. Unter Verwendung einer reduktiven Alkylierung kann das Polymer von der oben beschriebenen Art sein, und es sollte ein einzelnes reaktives Aldehyd zur Kopplung an das Protein aufweisen. Polyethylenglykolpropionaldehyd, das ein einzelnes reaktives Aldehyd enthält, kann verwendet werden.
Ein am N-Terminus chemisch modifiziertes Derivat wird aus Gründen der Einfachheit bei der Produktion eines Therapeutikums (gegenüber anderen Arten einer chemischen Modifikation) bevorzugt. Eine N-terminale chemische Modifikation gewährleistet ein homogenes Produkt, da eine Charakterisierung des Produkts im Verhältnis zu di-, tri- oder anderen multiderivatisierten Produkten vereinfacht ist. Die Verwendung des oben beschriebenen Verfah rend der reduktiven Alkylierung zur Herstellung eines N-terminal chemisch modifizierten Produkts wird aus Gründen der Einfachheit bei der kommerziellen Herstellung bevorzugt.
Unter noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der Proteine und Derivate verfügbar gemacht. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können zur Verabreichung durch Injektion oder zur oralen, pulmonaren, nasalen oder transdermalen Verabreichung oder zu anderen Formen der Verabreichung vorgesehen sein. Im allgemeinen werden von der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen umfaßt, die wirksame Mengen an Protein- oder Derivatprodukten der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägern umfassen. Derartige Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und unterschiedlicher Ionenstärke, Additiven, wie etwa Detergentien und Lösungsvermittlern (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimerson, Benzylalkohol) und Volumensubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol) ein. Eingeschossen ist auch das Aufnehmen des Materials in partikuläre Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure etc., oder in Liposomen. Siehe z. B. PCT-Anmeldung WO 96/29989, Collins et al., "Stable protein: phospholipid compositions and methods", offengelegt am 3. Oktober 1996. Hyaluronsäure kann ebenfalls verwendet werden, und dies kann die Wirkung haben, einen verlängerten Verbleib in der Zirkulation zu fördern. Derartige Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Freisetzungsrate in vivo und die Clearance-Rate in vivo der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) S. 1435–1712. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden, oder sie können als trockenes Pulver, wie etwa in lyophilisierter Form, vorliegen. Implantierbare Formulierungen zur verzögerten Freisetzung werden ebenso wie transdermale Formulierungen in Betracht gezogen.
Besonders in Betracht gezogen werden orale Dosierformen der oben beschriebenen derivatisierten Proteine. Ein Protein kann chemisch modifiziert sein, damit die orale Abgabe des Derivats wirksam ist. Allgemein ist die in Betracht gezogene chemische Modifikation das Anfügen von mindestens einem Rest an das Protein- (oder Peptid-) Molekül selbst, wobei der Rest (a) eine Hemmung der Proteolyse, und (b) eine Aufnahme in den Blutstrom aus dem Magen oder dem Darm erlaubt. Ebenfalls gewünscht ist eine Verbesserung der Gesamtstabilität des Proteins und eine Verlängerung der Verweildauer in der Zirkulation des Körpers. Siehe PCT-Anmeldung WO 95/21629, Habberfield, „Oral Delivery of Chemically Modified Proteins" (offengelegt am 17. August 1995) und US-Patent Nr. 5,574,018, Habberfield et al., „Conjugates of Vitamin B12 and Proteins", erteilt am 12. November 1996.
Hier ebenfalls in Betracht gezogen wird eine pulmonare Abgabe des vorliegenden Proteins oder eines Derivats davon. Das Protein (Derivat) wird an die Lungen eines Säugetiers während des Inhalierens abgegeben und überschreitet die epitheliale Auskleidung der Lungen, um in dem Blutstrom zu gelangen. Siehe PCT-Anmeldung WO 94/20069, Niven et al., "Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor", offengelegt am 15. September 1994.
Eine nasale Abgabe des Proteins (oder eines Analogons oder Derivats) wird ebenfalls in Betracht gezogen. Eine nasale Abgabe erlaubt die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichen des therapeutischen Produkts an die Nase ohne die Notwendigkeit, das Produkt in der Lunge abzusetzen. Formulierungen zur nasalen Abgabe schließen solche mit die Absorption steigernden Mitteln, wie etwa Dextran oder Cyclodextran, ein. Eine Abgabe durch Transport über andere Mucosamembranen wird ebenfalls in Betracht gezogen.
Dosierungen
Diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, werden in der Lage sein, wirksame Dosierungen durch Verabreichen und Beobachten der gewünschten therapeutischen Wirkung festzustellen. Vorzugsweise wird die Formulierung des Moleküls oder Komplexes in einer pharmazeutischen Zusammensetzung derart sein, daß eine Dosierung zwischen ungefähr 0,10 μg/kg/Tag und 10 mg/kg/Tag die gewünschte therapeutische Wirkung liefern wird. Die wirksamen Dosierungen können unter Verwendung diagnostischer Werkzeuge über die Zeit bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Diagnose zum Messen der Menge von OB-Protein oder OB-Rezeptor-Protein im Blut (oder Plasma oder Serum) zunächst verwendet werden, um endogene Spiegel an OB-Protein (oder Rezeptor) zu bestimmen. Ein derartiges diagnostisches Werkzeug kann in Form eines Antikörpertests vorliegen, wie etwa einem Antikörper-Sandwich-Test. Die Menge an endogenem OB-Rezeptor-Protein (wie etwa einem löslichen Rezeptor) wird anfänglich quantifiziert, und es wird eine Grundlinie bestimmt. Die therapeu tischen Dosierungen werden ermittelt, indem die Quantifizierung von endogenem und exogenem OB-Rezeptor-Protein (d. h. Protein, ein Analogon oder Derivat, das im Körper gefunden wird, das entweder selbst produziert oder verabreicht wird) im Verlauf der Therapie fortgeführt wird. Die Dosierungen können deshalb im Verlauf der Therapie variieren, wobei eine relativ hohe Dosierung anfänglich verwendet wird, bis ein therapeutischer Erfolg beobachtet wird, und es werden niedrigere Dosierungen verwendet werden, um die therapeutischen Erfolge aufrechtzuerhalten.
Während des anfänglichen Verlaufs der Therapie einer fettleibigen Person können Dosierungen verabreicht werden, durch die ein Gewichtsverlust und eine damit einhergehende Abnahme des Gewebefetts erzielt wird. Wenn einmal ein ausreichender Gewichtsverlust erzielt worden ist, kann eine Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um ein Zurückgewinnen des Gewichts zu verhüten, die aber noch ausreicht, um das gewünschte Gewicht oder den gewünschten Fettanteil zu erhalten. Diese Dosierungen können empirisch bestimmt werden, da die Wirkungen des OB-Proteins reversibel sind. Beispielsweise B. Campfield et al., Science 269; 546–549 (1995), S. 547. Wenn folglich beobachtet wird, daß eine Dosierung zu einem Gewichtsverlust führt und ein Gewichtsverlust nicht erwünscht ist, würde man eine niedrigere Dosis verabreichen, um das gewünschte Gewicht noch aufrechtzuerhalten.
Therapeutische Zusammensetzungen und Verfahren
Die vorliegenden OB-Rezeptor-Proteine, allein oder in Kombination mit einem OB-Protein, und Nukleinsäuren können für Verfahren zur Behandlung oder für Verfahren zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung verwendet werden. Eine derartige Behandlung schließt Zustände ein, die durch eine übermäßige Produktion von OB-Proteinen gekennzeichnet sind, wobei die vorliegenden OB-Rezeptoren, insbesondere in löslicher Form, verwendet werden können, um derart übermäßiges OB-Protein zu komplexieren und dadurch zu inaktivieren. Alternativ kann ein derartiges OB-Rezeptor-Protein, insbesondere in löslicher Form, wirken, indem die Aktivität des OB-Proteins geschützt wird. Während nicht gewünscht wird, durch eine Theorie festgelegt zu werden, kann man postulieren, daß die Aktivität eines OB-Protein-Rezeptoragonisten durch eine protektive Wirkung erreicht werden kann, die erzielt wird, wenn ein OB-Protein-Rezeptor (insbesondere ein löslicher Rezeptor) mit dem OB-Protein komplexiert wird. Eine derartige Wirkung kann die Halbwertszeit des OB-Proteins im Serum in vivo verlängern. Derartige Behandlungen können erreicht werden, indem ein löslicher Re zeptor hergestellt (z. B. unter Verwendung einer extrazellulären Domäne, wie oben beschrieben) und eine derartige Zusammensetzung an ein Individuum, das einer solchen Zusammensetzung bedarf, verabreicht wird, oder durch Herstellung einer Population von Zellen, welche einen derartigen OB-Rezeptor enthalten oder exprimieren, und durch Transplantieren derartiger Zellen in das Individuum, das dieser Behandlung bedarf.
Die vorliegenden OB-Rezeptoren können auch zur Behandlung solcher Individuen verwendet werden, die fehlerhafte OB-Rezeptoren aufweisen. Beispielsweise kann man ein Individuum, das fehlerhafte OB-Rezeptoren aufweist, behandeln, indem eine Population von Zellen hergestellt wird, die einen derartigen, nicht fehlerhaften OB-Rezeptor enthalten, und durch Transplantieren derartiger Zellen in das Individuum. Alternativ kann ein Individuum eine unzureichende Anzahl an OB-Rezeptoren aufweisen, und es können Zellen, die derartige Rezeptoren enthalten, transplantiert werden, um die Anzahl an OB-Rezeptoren, die dem Individuum zur Verfügung stehen, zu steigern.
Die vorliegenden OB-Rezeptor-Proteine und damit zusammenhängende Zusammensetzungen, wie etwa ein OB-Rezeptor-Protein/OB-Protein-Komplex, machen einen Gewichtsverlust, Fettabbau, einen Anstieg der Magermasse, einen Anstieg der Insulinempfindlichkeit, eine Zunahme der Kraft insgesamt, einen Anstieg der roten Blutzellen (und der Oxygenierung im Blut), eine Abnahme der Knochenresorption oder Osteoporose, verminderte oder aufrechterhaltene Cholesterin-Serumspiegel (LDL oder VLDL), verminderte oder aufrechterhaltene Triglyceridspiegel, eine Verhütung oder Reduktion der Bildung arterieller Plaques, eine Behandlung von arteriellem Bluthochdruck und eine Verhütung oder Reduktion der Bildung von Gallensteinen verfügbar. Da die Zusammensetzung von Körperfett mit bestimmten Krebsarten korreliert werden kann, sind die vorliegenden Zusammensetzungen zur Verhütung oder Besserung bestimmter Krebsarten nützlich. Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in Verbindung mit den hier beschriebenen kosmetischen/therapeutischen Zuständen ein, wobei die Verfahren mindestens eine der vorliegenden Zusammensetzungen betreffen.
Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren können in Verbindung mit anderen Medikamenten verwendet werden, wie etwa solchen, die zur Behandlung von Diabetes (z. B. Insulin oder Analoga davon, Thiazolidindione oder andere antihyperglykämische Mittel und möglicherweise Amylin oder Antagonisten davon) nützlich sind, Medikamenten, die Choles terin und den Blutdruck senken (wie etwa solche, welche die Blutlipidspiegel senken und andere kardiovaskuläre Medikamente) und Medikamenten, welche die Aktivität steigern (z. B. Amphetamine). Appetitzügler können ebenfalls verwendet werden (wie etwa Serotonin-Modulatoren und Neuropeptid Y-Antagonisten). Eine solche Verabreichung kann gleichzeitig erfolgen oder nacheinander erfolgen.
Zusätzlich können die vorliegenden Verfahren in Verbindung mit chirurgischen Verfahren verwendet werden, wie etwa kosmetischen Eingriffen, die dazu vorgesehen sind, die gesamte Erscheinung des Körpers zu verändern (z. B. Liposuktion oder Laseroperationen, die dazu vorgesehen sind, die Körpermasse zu reduzieren, oder Implantationsoperationen, die dazu vorgesehen sind, die Erscheinung von Körpermasse zu steigern). Die gesundheitlichen Vorteile von Herzoperationen, wie Bypass-Operationen und andere Operationen, die dazu vorgesehen sind, einen schädlichen Zustand, der durch Verengung von Blutgefäßen durch Fettablagerungen, wie etwa einer arteriellen Plaque, verursacht wird, zu verbessern, können durch gleichzeitige Anwendung der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren gesteigert werden. Verfahren zum Entfernen von Gallensteinen, wie etwa Ultraschall- oder Laserverfahren, können ebenfalls verwendet werden, entweder vor, während oder nach einem Verlauf der vorliegenden therapeutischen Verfahren. Weiterhin können die vorliegenden Verfahren als Zusatz zu Operationen oder Therapien bei Knochenbrüchen oder Muskelverletzungen angewendet werden oder zu anderen Therapien, die durch eine Zunahme der Magergewebemasse verbessert würden.
Unter einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit, Typ II-Diabetes und zu hohen Blutspiegeln an Lipid oder Cholesterin verfügbar, indem die Empfindlichkeit gegenüber Insulin und die Magermasse gesteigert wird, und von anderen Zuständen, wie oben ausgeführt. Ebenfalls verfügbar gemacht werden lediglich kosmetische Behandlungen von Individuen, die wünschen, ihre Erscheinung durch Gewichtsverlust, und genauer durch Verlust von Fettablagerungen zu verbessern, selbst ohne irgendeinen therapeutischen Vorteil.
Diagnostische Zusammensetzung und Verfahren
Wie oben angegeben, können Polypeptidprodukte der Erfindung durch Verbindung mit einer nachweisbaren Markersubstanz (z. B. radioaktiv markiert mit ¹²⁵I, Fluoreszenz, Chemilumi neszenz, Enzym) markiert werden, um Reagenzien verfügbar zu machen, die beim Nachweis und Quantifizieren des OB-Rezeptors (oder von Komplexen) in solidem Gewebe und flüssigen Proben, wie etwa Blut oder Urin, nützlich sind. Nukleinsäureprodukte der Erfindung können auch mit nachweisbaren Marken (wie etwa radioaktiven Markierungen und Markierungen, die keine Isotope darstellen, wie etwa Biotin) markiert und in Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, um die Position des menschlichen OB-Rezeptor-Gens und/oder die Position irgendeiner verwandten Genfamilie in einer Chromosomenkarte zu lokalisieren. Nukleinsäuresequenzen, die selektiv an das menschliche OB-Rezeptor-Gen binden, sind zu diesem Zweck nützlich. Sie können auch verwendet werden, um Störungen des menschlichen OB-Rezeptor-Gens auf DNA-Ebene zu identifizieren, und sie können als Genmarkierungen zum Identifizieren benachbarter Gene und von deren Störungen verwendet werden. Derartige Nukleinsäuresequenzen können zum Nachweis von OB-Rezeptor-mRNA oder zur Messung der OB-Rezeptor-mRNA-Konzentration in einer biologischen Probe verwendet werden. Hier in Betracht gezogen werden Kits, die derartige markierte Materialien enthalten.
Das hier verfügbar gemachte Protein und/oder die Nukleinsäuren können auch durch einen Teil eines Kits oder Herstellungsartikels verkörpert sein. In Betracht gezogen wird ein Herstellungsartikel, der ein Verpackungsmaterial und eine oder mehrere Zubereitungen der vorliegend zur Verfügung gestellten Zusammensetzungen umfaßt. Derartiges Verpackungsmaterial wird eine Markierung umfassen, die anzeigt, daß die Präparation aus Protein- oder Nukleinsäure zum Nachweisen und/oder Quantifizieren der Menge an OB-Rezeptor in einer biologischen Probe oder von OB-Rezeptor-Defekten in einer biologischen Probe nützlich ist. Als solches kann das Kit wahlweise Materialien einschließen, um einen derartigen Test durchzuführen, wie etwa Reagenzien, die zum Durchführen einer Analyse der DNA- oder RNA-Hybridisierung oder einer PCR-Analyse in Blut, Urin oder Gewebeproben nützlich ist.
Weiterhin werden selektiv bindende Moleküle, wie etwa monoklonale Antikörper, die einen OB-Rezeptor selektiv binden, beschrieben. Die ursprünglich durch Köhler und Milstein beschriebene Hybridomtechnik (Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976)) ist umfangreich angewendet worden, um Hybridzellinien herzustellen, die hohe Konzentrationen an monoklonalen Antikörpern gegen viele spezifische Antigene sezernieren. Rekombinante Antikörper (siehe Huse et al., Science 246: 1275 (1989)) können ebenfalls hergestellt werden. Derartige rekombinante Antikörper können weiter modifiziert werden, wie etwa durch Modifikation von die Komplementarität bestimmenden Regionen, um die Affinität zu steigern oder zu verändern, oder durch „Humanisieren" solcher Antikörper. Derartige Antikörper können beispielsweise in einem Kit zu diagnostischen Zwecken aufgenommen sein. Ein diagnostisches Kit kann eingesetzt werden, um die Lage und/oder Menge an OB-Rezeptor eines Individuums zu bestimmen. Diagnostische Kits können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Individuum Rezeptoren aufweist, die das OB-Protein binden, oder solche, die in unterschiedlichen Ausprägungen eine reduzierte Bindungskapazität oder Fähigkeit zur Bindung aufweisen. Wie unten festgestellt, können derartige Antikörper unter Verwendung von immunogenen Bereichen eines OB-Rezeptor-Proteins hergestellt werden. Derartige selektiv bindende Moleküle können selbst Alternativen zum OB-Protein sein, und sie können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert sein.
Derartige Proteine und/oder Nukleinsäuren können zu Tests verwendet werden, mit denen die Gewebeverteilung untersucht wird (wie beispielsweise in dem Arbeitsbeispiel unten verfügbar gemacht) oder zu anderen Tests, um den OB-Rezeptor zu lokalisieren.
Die Familie des vorliegenden OB-Rezeptor-Proteins kann bei Verfahren verwendet werden, um OB-Protein-Analoga, Mimetika oder kleine Moleküle („small molecules") zu erhalten. Man würde einfach ein gewünschtes OB-Rezeptor-Protein herstellen, insbesondere eines mit der Fähigkeit, an natives OB-Protein zu binden, und das Testmolekül, das mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz markiert sein kann, auf die Fähigkeit, an einen derartigen Rezeptor zu binden, testen. Andere Parameter, wie etwa Affinität und Lage der Bindung können auch durch Verfahren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, verfügbar sind, festgestellt werden. Beispielsweise kann man Bereiche des vorliegenden OB-Rezeptors verwenden, insbesondere Bereiche in der extrazellulären Domäne, die zur Ligandenbindung wichtig sind, um die Lage einer derartigen Bindung zu bestimmen. Man könnte OB-Rezeptoren herstellen, die verschiedene Trunkierungen oder Deletionen von Regionen der extrazellulären Domäne aufweisen, die verwendet werden könnten, um die Lage der Bindung des Testmoleküls zu bestimmen. Man könnte einen OB-Rezeptor verwenden, von dem bekannt ist, daß er bezüglich der Bindung des nativen OB-Proteins fehlerhaft ist, wie etwa potentiell einer aus einem Individuum, das derartige fehlerhafte Rezeptoren aufweist, und diesen als Grundlage zum Feststellen eines OB-Proteins, das wirksam zu der gewünschten biologischen Aktivität führen würde (d. h. Gewichtsverlust, Reduktion von Blutdyslipidämien oder Senkung von Cholesterinspiegeln, Reduktion des Auftretens oder der Schwere von Diabetes) verwenden. Andere Verwendungen schließen lediglich kosmetische Verwendungen zur Änderung der Körpererscheinung ein, insbesondere die Entfernung von Fett.
Das vorliegende OB-Rezeptor-Protein oder die OB-Rezeptor-Nukleinsäuren können auch nützlich sein, um Substanzen zu identifizieren, welche das OB-Protein oder den OB-Rezeptor aufregulieren. Beispielsweise kann eine zeitliche Expression des OB-Rezeptors in vivo nützlich sein, um zu bestimmen, ob eine verabreichte Substanz eine Zunahme oder Abnahme des OB-Rezeptors verursacht. Man kann schlußfolgern, daß eine Zunahme der OB-Rezeptor-Expression zu einer Modulierung des Gewichts oder des Lipidstoffwechsels führt.
Die Abweichung im C-Terminus kann OB-Rezeptoren mit verschiedenen Fähigkeiten im Hinblick auf die Signaltransduktion darstellen. Deshalb können die verschiedenen Mitglieder der Rezeptorfamilie für verschiedene Tests verwendet werden, abhängig von der beobachteten Art der Signaltransduktion. Es wird angenommen, daß mindestens ein Bereich der intrazellulären Domäne für die Signaltransduktion notwendig ist (siehe oben).
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, sollen jedoch nicht derart ausgelegt werden, daß sie deren Umfang begrenzen.
BEISPIEL 1: Identifizierung von menschlichem OB-Rezeptor-Protein
DNA des menschlichen OB-Rezeptor-Proteins wurde in einer menschlichen Leber-cDNA-Bibliothek in zwei Schritten identifiziert. Der erste Schritt verwendete zwei Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um eine ausgewählte 300 Basenpaar-Region aus der menschlichen Leber-cDNA-Bibliothek zu amplifizieren. Der zweite Schritt verwendete das PCR-Fragment als eine Sonde, um die menschliche Leber-cDNA-Bibliothek durchzumustern. Es wurden dreizehn Klone erhalten, die jedoch am 5'-Ende unvollständig waren. Es wurde ein Verfahren durchgeführt, um das 5'-Ende zu vervollständigen, um vollständige Klone herzustellen. Zwölf Klone wurden sequenziert. Diese zwölf Klone wurden identifiziert als entweder „A", „B" oder „C", wie durch den C-Terminus der vorhergesagten Aminosäuresequenz bezeichnet.
Polymerase-Kettenreation
Der ursprüngliche PCR-Primer beruhte auf dem 5'-Ende und dem 3'-Ende einer 416 Basenpaar-Sequenz mit der Zugangsnr. T73849 zu der Datenbank GenBank. Diese Sequenz wurde auf der Grundlage eines bekannten Motivs ausgewählt, das in Zytokin-Rezeptoren vorhanden ist, nämlich „WSXWS".
Der 5'-Primer wies die Sequenz 73–96 der 416 bp-Sequenz auf. Der 3'-Primer wies die Sequenz 337–360 der 416 bp-Sequenz auf.
Diese Primer wurden verwendet, um eine menschliche cDNA-Leber-Bibliothek (Stratagene) zu sondieren. Es wurden Standardverfahren verwendet.
Dies führte zu einem PCR-Fragment mit der Sequenz 73–360 des 416 bp-Fragments.
Hybridisierung
Das 300 bp große PCR-Fragment wurde verwendet, um eine menschliche Leber-cDNA-Bibliothek (Stratagene) unter Verwendung von Standardverfahren zu sondieren. Die zweite Hybridisierung führte zu dreizehn positiven Klonen. Bei diesen handelte es sich um partielle Klone, die am 5'-Ende unvollständig waren.
Vervollständigung des 5'-Endes
Es wurde ein Verfahren zur Amplifizierung („rapid amplification") des cDNA-Endes („RACE"-Kit, GIBCO/BRL) verwendet, um die Volllänge-Klone zu erhalten.
Ergebnisse der Sequenzierung
Die Sequenzierung ergab die drei Arten von OB-Rezeptor-DNAs. Von dreizehn Klonen waren 4 Klone vom „A"-Typ (Seq. ID Nr. 1 und 2), 1 Klon war vom „B"-Typ (Seq. ID Nr. 3 und 4) und 4 Klone waren vom „C"-Typ (Seq. ID Nr. 5 und 6).
Wie der Sequenzbeschreibung (unten) entnommen werden kann, weist der OB-Rezeptor „A" eine Länge von 896 Aminosäuren, „B" von 904 Aminosäuren und „C" von 958 Aminosäuren auf. Diese verschiedenen OB-Rezeptoren sind in den Aminosäure-Positionen 1–891 identisch, und sie unterscheiden sich fast vollständig ab Position 892. Aufgrund einer Hydrophobizitätsanalyse wird postuliert, daß die Leader-Sequenz die Aminosäuren 1–21(M-A), 1–22(M-F) oder 1–28(M-I) darstellt, wobei das reife Protein in den Positionen 22 (F), 23 (N) oder 29 (T) beginnt. Auf der Grundlage der Hydrophobizitätsanalyse befindet sich die Leader-Sequenz am wahrscheinlichsten in den Positionen 1–21 (M-A). Die zelluläre Produktion der sezernierten Form des OB-Rezeptor-Proteins durch Ovarialzellen vom chinesischen Hamster („Chinese hamster ovary", CHO) produzierte auch ein Protein, das die Aminosäure Nr. 22 als die erste Aminosäure des reifen Proteins aufwies. Es ist wahrscheinlich, daß die transmembranäre Region entweder in Position 840 (A) oder 842 (L) bis Position 862 (I), 863 (S) oder 864 (H) beginnt. Bei dem OB-Rezeptor von Typ „A" befindet sich die letzte Aminosäure in Position 896, und sie ist ein Lysin (L). Bei dem OB-Rezeptor vom Typ „B" befindet sich die letzte Aminosäure in Position 904, und sie ist ein Glutamin (Q). Bei dem OB-Rezeptor vom Typ „C" befindet sich die letzte Aminosäure in Position 958, und sie ist eine Glutaminsäure (E).
Bei dem OB-Rezeptor-Protein vom Typ „C" besitzt die C-terminale Region eine ausgeprägte Homologie zu einem bekannten menschlichen transponierbaren Element. Bei den Nukleotiden 2737 bis 2947 des vorliegenden menschlichen OB-Rezeptor-Proteins vom Typ „C" gibt es eine Homologie von 98,1% mit einem Abschnitt von 211 Basen eines menschlichen retrotransponierbaren Elements, beschrieben in Ono et al., Nucl. Acids Res. 15: 8725–8737 (1987) (Basen 520 bis 731, SINE-R11, GeneBank-Zugangsnr. x07417).
BEISPIEL 2: Gewebeverteilung
Die Gewebeverteilung wurde unter Verwendung von zwei Verfahren festgestellt. Das erste Verfahren umfaßte die Verwendung des vollständigen Typ „A"-OB-Rezeptors. Das zweite Verfahren umfaßte die Verwendung von Sonden, die für die C-terminale Region des Proteins spezifisch sind. Da sich diese C-terminalen Regionen unterscheiden, wies das zweite Verfahren die Gewebeverteilung der verschiedenen Mitglieder der OB-Rezeptor-Familie nach.
Das erste Verfahren verwendete einen Northern blot-Kit (Clontech), wobei die gesamte Typ „A"-OB-Rezeptor-DNA als eine Sonde verwendet wurde. Das zweite Verfahren verwendete die PCR mit Primern; welche für die Nukleinsäuren spezifisch waren, die den abweichenden C-Terminus der drei Typen kodierten. Es wurden Standardverfahren verwendet.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse aus dem Northern blot und den PCR-Verfahren. Das „+" bezeichnet die durch den Erfinder subjektiv vorgenommene Bestimmung der Signalstärke. In der Northern blot-Analyse gibt ein dreifaches „+++" an, daß ein Ergebnis (eine dunkle Bande auf dem Röntgenfilm) nach Exponierung des Films über Nacht beobachtet wurde. Ein doppeltes „++" gibt an, daß Banden nach einer Exponierung von zwei Wochen beobachtet wurden. Ein einzelnes „+" gibt an, daß die Banden nach einer Exposition von drei Wochen zu sehen waren. Zusätzlich wurden unter Verwendung dieses Verfahrens zwei Molekulargewichte beobachtet, eine Bande bei 4 kb und eine bei 6,2 kb. Obwohl die Verteilung ubiquitär war, wurden die stärksten Signale für das Ovar, das Herz und die Leber beobachtet. In der PCR-Analyse wurde der OB-Rezeptor „A" in allen getesteten Arten von Geweben (Prostata, Ovar, Dünndarm, Herz, Lunge, Leber und Skelettmuskel) beobachtet, Typ „B" wurde nur in der Lunge und der Leber beobachtet, und Typ „C" wurde im Ovar, in Herz, Lunge und Leber beobachtet.
Tabelle 2: Gewebeverteilung des neuen OB-Rezeptors
BEISPIEL 3: Identifizierung der genomischen DNA und der chromosomalen Lage des menschlichen OB-Rezeptors sowie Identifizierung des menschlichen OB-Rezeptors „D"
Die genomische Volllänge-DNA des menschlichen OB-Rezeptors wurde ebenfalls hergestellt. Die gesamte cDNA des OB-Rezeptors „A" wurde als eine Sonde gegen eine menschliche genomische DNA-Bibliothek verwendet, wobei Materialien und Verfahren aus einem kommerziell verfügbaren Kit verwendet wurden (Genome Systems, unter Verwendung einer menschlichen genomischen Bibliothek in einem P1-Vektor). Es wurde ein einzelner positiver Klon nachgewiesen. Es gibt Introns, die bei den folgenden Basenpaaren lokalisiert sind (im bezug auf die OB-Rezeptor „A"-DNA): 559, 1059, 1350, 1667, 1817, 1937, 2060, 2277, 2460, 2662 und 2738.
Das menschliche OB-Rezeptor-Gen wurde auf dem menschlichen Chromosom 1P31 durch FISH-Analyse (Genom Systems) lokalisiert. Es wird angenommen, daß das menschliche Chromosom 1 mit dem Mäusechromosom 4C7 korrespondiert, von dem vermutet wird, daß auf diesem der db-Lokus liegt.
Es wurde eine weitere chromosomale Sequenz isoliert. Diese chromosomale DNA-Sequenz wurde aus einer genomischen Bibliothek isoliert, wie oben beschrieben. Diese chromosomale Sequenz kodiert das, was hier als menschlicher OB-Rezeptor „D" bezeichnet wird, und die kodierte Aminosäuresequenz wird in Seq. ID Nr. 7 dargelegt. Eine cDNA, die diese Aminosäuresequenz kodiert, wird in Seq. ID Nr. 8 dargelegt. Die Karte der Intron/Exon-Übergänge auf der chromosomalen DNA- wird als Seq. ID Nr. 9 dargelegt.
Wie bei den Formen „A", „B" und „C" beginnt bei der vorliegenden Form „D" des OB-Rezeptor-Proteins die erste Aminosäure des reifen Proteins wahrscheinlich (aufgrund einer Hydrophobizitätsanalyse) in Position 22 (F), 23 (N) oder 29 (P). Die letzte Aminosäure des Proteins befindet sich in Position 1165 und ist ein Valinrest. Bei den anderen Formen erstreckt sich die extrazelluläre Domäne von Position 22 (F), 23 (N) oder 29 (P) zu Position 839 (D) oder 841 (G). Die transmembranäre Domäne scheint in Position 840 (A) oder 842 (L) zu beginnen. Das Ende der transmembranären Domäne scheint in Position 862 (I), 863 (S) oder 864 (H) lokalisiert zu sein. Die C-terminale Region hinter der transmembranären Region ist wahrscheinlich an der Signaltransduktion beteiligt, und sie ist in Position 863 (S), 864 (H) oder 865 (Q) bis Position 1165 (V) lokalisiert.
Die vorliegende OB-Rezeptor-Form „D" ist mit der von Tartaglia et al., Cell 83: 1263–1271 (29. Dezember 1995) publizierten identisch, abgesehen von einem einzelnen Aminosäureaustausch in der Aminosäure-Position 976 (das Nukleotid-Kodon beginnt in Position 3022). Die vorliegende Typ „D"-Aminosäure in Position 976 ist Asparaginsäure, und die publizierte Aminosäure, die derselben Position entspricht, ist Alanin. Hierbei handelt es sich um eine nicht konservative Substitution, siehe unten, und da sich die Lage der Substitution in einer Region befindet, von der angenommen wird, daß sie für die Signaltransduktion wichtig ist, könnte diese Änderung die Funktion des Moleküls beeinflussen.
BEISPIEL 4: Herstellung eines löslichen OB-Rezeptors
Es wurden drei Formen des löslichen menschlichen OB-Rezeptors hergestellt.
1. Leader-Sequenz + extrazelluläre Domäne (Seq. ID Nr. 10 und 11)
Es wurde eine rekombinante Form des löslichen menschlichen OB-Rezeptors hergestellt. Diese Form überspannt das unreife Protein, die Leader-Sequenz und die extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1–839). Bei dem reifen Protein wäre die Leader-Sequenz deletiert, und die erste Aminosäure des reifen rekombinanten löslichen menschlichen OB-Rezeptors wäre 22 (F), 23 (N) oder 29 (T). Dieses Protein wurde exprimiert, wie unten beschrieben.
2. Leader-Sequenz + extrazelluläre Domäne + C-terminales FLAG (Seq. ID Nr. 12)
Eine zweite Form des rekombinanten löslichen menschlichen OB-Rezeptors wurde ebenfalls hergestellt. Diese Form wies ein „FLAG"-Etikett auf, das an dem C-Terminus des Proteins lokalisiert war. Das „FLAG"-Peptid ist ein nützliches Forschungswerkzeug, da es einem erlaubt, das Protein unter Verwendung eines Antikörpers, der das „FLAG"-Peptid erkennt, zu verfolgen. Derartige Reagenzien sind kommerziell verfügbar (IBI, New Haven, CT). Dieses Protein wurde exprimiert, wie unten beschrieben.
3. Native Splice-Variante (Seq. ID Nr. 13 und 14)
Von dieser Form wird angenommen, daß es sich um die rekombinante Form eines natürlicherweise vorkommenden, sezernierten löslichen menschlichen OB-Rezeptors handelt. Diese Form weist die meisten der Aminosäuren auf, die in der extrazellulären Domäne gefunden werden (Aminosäuren 22–798), und eine einzigartige Sequenz von 6 Aminosäuren am Carboxyterminus. Beginnend in der Aminosäure-Position 799 gemäß Seq. ID Nr. 13 ist die Aminosäuresequenz dieser nativen Splice-Variante des menschlichen OB-Rezeptor-Proteins „G K F T I L".
BEISPIEL 5: Herstellung von Expressionsvektoren
Vektoren zur Expression des rekombinanten menschlichen OB-Rezeptors wurden zur Expression in Säugetierzellen hergestellt. Wie oben angegeben, kann eine Expression auch in Nicht-Säugetierzellen erfolgen, wie etwa in Bakterienzellen. Die Typ „A"-cDNA (Seq. ID Nr. 2) wurde in einem kommerziell verfügbaren Säugetiervektor (pCEP4, Invitrogen) zur Expression in Säugetierzellen, einschließlich Zellen der kommerziell verfügbaren menschlichen Embryonieren-Zellinie „293", untergebracht.
Rekombinante menschliche OB-Rezeptor-Expressionsvektoren sind zur Expression des rekombinanten löslichen OB-Rezeptors hergestellt worden, die aus der Leader-Sequenz und der extrazellulären Domäne (Seq. ID Nr. 10 und 11) bestehen, wobei dasselbe System wie oben (der kommerziell verfügbare Säugetiervektor pCEP4 und „293"-Zellen) verwendet wurde. Dieser rekombinante lösliche menschliche OB-Rezeptor wurde auch in CHO-Zellen auf ähnliche Weise exprimiert.
Die Form mit dem „FLAG"-Etikett (Seq. ID Nr. 12) des rekombinanten löslichen menschlichen OB-Rezeptors und die „D"-Form (Seq. ID Nr. 7) wurden ebenfalls in „293"-Zellen auf eine ähnliche Weise wie oben beschrieben exprimiert.
Ein Nachweis des gewünschten Proteins wurde unter Verwendung einer BIACORE-Analyse (Pharmacia) erreicht. Diese entspricht der in Bartley et al., Nature 368: 558–560 (1994) beschriebenen Analyse.
Im wesentlichen mißt die BIACORE-Maschine Affinitätsinteraktionen zwischen zwei Proteinen. In diesem Fall wurde das OB-Protein an der Maschine immobilisiert, und es wurden konditionierte Medien von Zellinien, die den OB-Rezeptor exprimieren, zu der Maschine gegeben. Jedes Rezeptorprotein, das in den konditionierten Medien vorhanden war, wurde an die OB-Protein-Oberfläche gebunden. Die BIACORE-Maschine lieferte eine Anzeige, die zeigte, daß das Rezeptorprotein exprimiert wurde. Bei der Expression des rekombinanten löslichen Rezeptors (Seq. ID Nr. 10) in „293"-Zellen betrug der Anzeigewert 191,0 im Verhältnis zum Anzeigewert Null der Grundlinie. Bei der Expression des rekombinanten löslichen Rezeptors (Seq. ID Nr. 10) in CHO-Zellen betrug der Anzeigewert 150,9 im Verhältnis zum Anzeigewert Null der Grundlinie. Bei dem rekombinanten löslichen Rezeptor mit einem C-terminalen FLAG-Etikett (Seq. ID Nr. 12) betrug der Anzeigewert 172,0 im Verhältnis zu einer Grundlinie von Null.
Zur Expression in Bakterienzellen würde man normalerweise den Teil eliminieren, der die Leader-Sequenz kodiert (z. B. potentiell die Aminosäuren 1–21, 1–22 oder 1–28). Zur bakteriellen Expression würde man ein zusätzliches Methionin am N-Terminus anfügen. Zusätzlich würde man die native Leader-Sequenz durch eine andere Leader-Sequenz oder eine andere Sequenz zur Spaltung zur Erleichterung der Expression substituieren.
BEISPIEL 6: Nachweis der Signaltransduktion
Dieses Beispiel zeigt, daß die „D"-Form aktiv ist, um ein Signal in einer Zelle zu erzeugen, wobei die „A"-Form dies in dem selbem Zelltyp nicht tut. Der Test zur Signaltransduktion wurde unter Verwendung von „293"-Zellen durchgeführt, die entweder die „A"- oder die „D"-Form transient exprimieren (siehe oben zur Herstellung der „293"-Expressionsklone). Eine Phosphorylierung von Molekülen, für die vorhergesagt wurde; daß sie an der Signaltransduktion in der Zelle beteiligt sind, wurde nach Bindung des OB-Proteins an das getestete OB-Rezeptor-Protein untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß nach Bindung des OB-Proteins an die extrazelluläre Domäne die „D"-Form des vorliegenden OB-Protein-Rezeptors ein Signal transduziert, das ausreicht, um eine Phosphorylierung von Signalmolekülen auszulösen.
Verfahren
1. OB-Rezeptor-Moleküle
Wie oben angegeben, wurden die „A"-Form (Seq. ID Nr. 1) und die „D"-Form (Seq. ID Nr. 7) untersucht.
2. Expressionssystem
Das pCEP4-System (wie oben beschrieben), das eine intertierte DNA aufwies, welche die „A"-Form (Seq. ID Nr. 2) oder die „D"-Form (Seq. ID Nr. 8) kodierte, wurde verwendet, um „293"-Zellen zu transfizieren. Diese Zellen erlaubten nicht, daß sich der pCEP4-Vektor in das Genom integrierte, so daß eine derartige Expression transient war. Nicht rekombinante (scheintransfizierte) Zellen wurden als Kontrollen ebenfalls hergestellt.
3. Nachweis einer Phosphorylierung
Scheintransfizierte Zellen und Zellen, welche die „A"-Form oder die „D"-Form exprimierten, wurden analysiert. Vor der Behandlung wurden die Zellen durch Inkubation in Medien mit 0,5% Serum 16 Stunden vor den Behandlungen durch Serumentzug hungern gelassen. Die Zellen wurden mit dem OB-Protein (10 mg/ml) 15 Minuten bei 37°C behandelt, wonach die Zellen in modifiziertem NP40-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid, 1% NP40, 10 mg/ml Aprotinin, 5 mM EDTA, 200 mM Natriumorthovanadat) lysiert wurden. Phosphotyrosin enthaltende Proteine wurden immunpräzipiert (anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10, UBI, Lake Placid, NY) und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Nach der Elektrophorese und einem Elektroblot auf Membranen wurden die Immunpräzipitate mit Antikörpern gegen verschiedene Signaltranduktionsmoleküle sondiert. Antikörper gegen STATs, JAKs und ERKs wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc. bezogen. Immunkomplexe wurden durch mit Meerrettichperoxidase konjugierte sekundäre Reagenzien unter Verwendung von Chemolumineszenz nachgewiesen, wie durch den Hersteller (ECL, Amersham) beschrieben. Als eine positive Kontrolle wurden 32D-Zellen mit IL-3 be handelt, von dem bekannt ist, daß es die Tyrosin-Phosphorylierung der meisten analysierten Moleküle aktiviert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 unten dargestellt. Wie zu sehen ist, war nur die „D"-Form in der Lage, auf OB-Protein entweder der Maus oder des Menschen zu antworten, wie durch die Phosphorylierung von JAK- und STAT-Molekülen nachgewiesen wurde. Eine Angabe von „+" gibt an, daß ein Signal nachgewiesen wurde, eine Angabe von „-" bedeutet, daß kein Signal beobachtet wurde. Tabelle 3:

‡ Ziel des Antikörpernachweises
* 293-Zellen, welche die Form „D" des Rezeptors exprimieren, behandelt mit rekombinantem menschlichen OB
** 293-Zellen, welche die „D"-Form des Rezeptors exprimieren, behandelt mit rekombinantem Mäuse-OB
# 293-Zellen, welche die Form „A" des Rezeptors exprimieren, behandelt mit rekombinantem menschlichen OB
## 293-Zellen, welche die „A"-Form des Rezeptors exprimieren, behandelt mit rekombinantem Mäuse-OB

Die „D"-Form ist in der Lage, eine Signaltransduktion über die JAK/STAT-Wege in 293-Zellen auszulösen, während die „A"-Form dies nicht kann.
BEISPIEL 7: Verwendung des löslichen OB-Rezeptors als Therapeutikum
Dieses Beispiel zeigt, daß das lösliche OB-Rezeptor-Protein die Wirkung hat, die Aktivität des OB-Proteins zu schützen. Im folgenden wurde ein löslicher OB-Rezeptor und/oder ein OB-Protein an ein Säugetier durch „Gentransplantation" abgegeben, d. h. über Knochenmarkszellen, die manipuliert wurden, damit sie die gewünschten DNAs exprimieren. Wenn der lösliche OB-Rezeptor in Kombination mit dem OB-Protein abgegeben wurde, verloren die Tiere mehr Gewicht als bei einer Abgabe von nur dem OB-Protein. Dies zeigt die protektive Aktivität des OB-Rezeptor-Proteins.
Während es nicht gewünscht ist, durch eine Theorie festgelegt zu sein, ist eine Erklärung der Wirkungsweise die, daß ein lösliches OB-Rezeptor-Protein wirkt, indem es das OB-Protein im Serum vor Mitteln oder Bedingungen schützt, welche seine Aktivität verringern könnten. Die protektive Wirkung scheint die Halbwertszeit des Proteins in der Zirkulation zu erhöhen. Als solches zeigt das vorliegende Beispiel, daß der OB-Rezeptor, entweder alleine oder als ein Komplex mit OB-Protein (oder einem Analogon oder Derivat davon) verabreicht, als ein therapeutisches Mittel wirken könnte.
Material und Methoden
1. Herstellung von Verpackungszellen für einen rekombinanten retroviralen ob-Vektor
Verwendung von Mäuse-ob-cDNA: Mäuse-Wildtyp-ob-Vollänge-cDNA wurde durch die PCR unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden, die anhand der von Zhang et al., Nature 372: 425–432 (1994) publizierten Sequenz entworfen wurden, amplifiziert. Es wurden Linker (ein EcoRI-Linker und ein BglII-Linker) verwendet, um das Subklonieren zu erleichtern.
Verwendung der cDNA von löslichem rekombinantem menschlichem OB-Rezeptor: Es wurden Verfahren verwendet, die den oben beschriebenen ähnlich sind: Ein Konstrukt, das den rekombinanten menschlichen löslichen Rezeptor nach Seq. ID Nr. 10 enthielt, wurde verwen det und mit Linkern modifiziert, um das Klonieren zu erleichtern (d. h. Einführen einer BglII-Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle).
Unterbringen der gewünschten cDNA in einem Vektor: Die PCR-Produkte wurden mit EcoRI und BglII verdaut und in einen ähnlich verdauten parentalen Vektor (pMSCV2.1) unter der transkriptionellen Kontrolle des viralen LTR-Promotors kloniert. Der parentale MSCV-Vektor (geliefert durch R. Hawley, University of Toronto, Canada) wurde vom MESV (Mäuseembryostammzellen-Virus) abgeleitet, und er enthielt ein Neomycin-Phosphotransferase-Resistenzgen (neo^®), das durch einen internen Mäuse-Phosphoglyceratkinase-(PGK)Promotor angetrieben wurde, wie in Hawley et al., J. Exp. Med. 176: 1149–1163 (1992) beschrieben. Das parentale Plasmid pMSCV2.1 und pMSCV-OB wurden unabhängig voneinander in die Verpackungszellinie GP+E-86 (geliefert von Dr. A. Bank, Columbia University, NY) elektroporiert (Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120–1124 (1988)). Transiente Überstände elektroporierter Populationen wurden geerntet und verwendet, um mit Tunicamycin behandelte parentale GP+E-86-Zellen zu infizieren. Eine Behandlung mit Tunicamycin setzt die Blockierung gegenüber der Superinfektion der parentalen Verpackungszellen frei. Klone, die gegen G418 (0,78 mg/ml, 67% Aktivität, GIBCO Laboratories, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) resistent waren, wurden aus jeder infizierten Population ausgewählt und durch Infektion von NIH3T3-Zellen titriert. Klone mit dem höchsten Titer bezüglich der G418-Resistenz wurden expandiert und in Aliquots eingefroren. Jedes Experiment einer Knochenmarksinfektion und Knochenmarkstransplantation verwendete Aliquots aus derselben Passage von gefrorenen viralen Verpackungszellen. Sowohl die parentalen als auch die ob-Verpackungszellinien wurden auf die Anwesenheit von replikationskompetentem Virus unter Verwendung eines empfindlichen Tests zum Nachweis eines Markers getestet (Moore, et al., (1993) in: Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, Hrsg. (Oxford University, Press, New York, NY), und sie erwiesen sich als frei davon.
2. Herstellung von retroviralen Überständen
Rekombinante virusproduzierende Verpackungszellinien wurden in 175 cm²-Gewebekulturkolben in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (GIBCO), 10% (Vol./Vol.) FBS, bei 37°C wachsen gelassen. Sub-konfluente (ungefähr 60%) Einzelzellschichten („Monolayer") von Zellen wurden mit frischem Medium 24 Stunden bevor Virus enthaltende Überstände geerntet wurden gefüttert. Virale Überstände wurden von den Verpackungszellinien durch Aspiration entfernt, steril filtriert (0,45 mM bzw. μm) und direkt zu Knochenmarkkulturen gegeben. Es wurden frische Aliquots von gefrorenen Verpackungszellinien zur Verwendung in jedem Experiment aufgetaut.
3. Infektion und Transplantation von Knochenmark
C57BL/6J (+/+) oder (ob/ob)-Mäuseweibchen wurden als Knochenmarkspender und Knochenmarkempfänger verwendet. Alle Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen und unter besonderen pathogenfreien Bedingungen in einem Vivarium in Übereinstimmung mit amtlichen Vorschriften und institutionellen Richtlinien gehalten.
Knochenmarkszellen wurden aus dem Femur und der Tibia der Spendermäuse 4 Tage nach einer Behandlung mit 5-Fluoruracil (5-FO, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; 150 mg/kg i. v.) geerntet. Die Knochenmarkszellen (6 × 10⁵/ml) wurden in 150 mm-Gewebekulturschalen (30 ml/Schale) inkubiert, die frischen viralen Überstand (wie oben beschrieben), 15% FBS, 6 mg/ml Polybren (Sigma), 0,1% Rinderserumalbumin (BSA, Fraction V, Sigma), 2,5 ng/ml rekombinantes Mäuse-IL-3 (rmIL-3), jeweils 100 ng/ml rekombinantes menschliches IL-6 (rhIL-6), rekombinantes menschliches IL-11 (rhIL-11) und rekombinantes Ratten-SCF (rrSCF) enthielten. Alle Wachstumsfaktoren wurden durch Amgen, Inc. (Thousand Oaks, CA) hergestellt. Die Kulturmedien wurden täglich für drei Tage durch frischen, das Virus enthaltenden Überstand und Wachstumsfaktoren ersetzt.
Am Ende des Infektionszeitraums wurde die Gesamtheit der nicht adhärenten und adhärenten Zellen gewaschen und in 1% BSA/Salzlösung resuspendiert und in γ-bestrahlte (12 Gy, Cs¹³⁷) Mäuse transplantiert. Jedes Tier wurde mit 2,5 × 10⁶ syngenen Zellen transplantiert. Es gab ungefähr 10 Tiere pro Kohorte.
4. Analyse der OB-Protein-Expression in transfizierten Zellen und transplantierten Tieren
Mit den transfizierten Knochenmarkszellen wurde eine Western blot-Analyse durchgeführt. Zellüberstand der Vektorverpackungszellen wurde durch SDS-PAGE (16% Acrylamid) aufgetrennt, dann auf Hybond-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL) übertragen. Die Filter wurden mit affinitätsgereinigtem polyklonalem Kaninchen-anti-Maus-OB-Protein-Antikörper (1 mg/ml) in T-TBS-Puffer (20 mM Tris-Chlorid, pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20) bei Raumtemperatur 45 Minuten inkubiert. Mit Meerrettichperoxidase („Horseradish peroxidase", HRP) konjugiertes Esel-anti-Kaninchen-IgG (Amersham) wurde in T-TBS (1:2500) verdünnt und mit dem Filter bei Raumtemperatur 45 Minuten inkubiert. Der Nachweis der verstärkten Chemilumineszenz (ECL, Amersham) wurde durchgeführt, wie vom Hersteller empfohlen.
Das Serum der transplantierten Tiere wurde analysiert. Den Tieren wurden unter Isofluoran-Anästhesie retroorbital Blut entnommen. Serum von transplantierten ob/ob-Tieren wurde durch SDS-PAGE (4–20% Acrylamid) unter nicht reduzierenden und reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, dann wurden die Proteine auf Trans-Blot-Membranen (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) übertragen. Die Membranen wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-OB-Protein-Antikörper (0,125 mg/ml) in T-TBS-Puffer, der 5% fotales Rinderserum und 1% Rinderserumalbumin enthielt, inkubiert. Gebundenes OB-Protein wurde durch ECL (Amersham) nachgewiesen, durchgeführt, wie durch den Hersteller empfohlen.
Zur Quantifizierung von Konzentrationen an löslichem OB-Protein wurde Serum von transplantierten Tieren einer ELISA-Analyse unterzogen. Kurz, 96-well-Platten wurden mit affinitätsgereinigtem polyklonalem Kaninchen-anti-OB-Protein-Antikörper beschichtet. Es wurden Standards (gereinigtes rekombinantes OB-Protein-Monomer; Pelleymounter et al., Science 269: 540–543 (1995)) und Proben aus dem Experiment zugegeben, und die Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden zweimal gewaschen, und es wurde affinitätsgereinigter Kaninchen-anti-OB-Protein-Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, zugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten viermal mit TNE-Tween 20 gewaschen. Es wurde TMB/Peroxid-Substrat zugesetzt, und die Farbreaktion wurde bei 450 nm in einem Molecular Devices-Plattenlesegerät abgelesen. Die OB-Protein-Konzentrationen in den Seren wurden durch Vergleich mit einer Standardkurve, die aus internen Standards hergestellt worden war, bestimmt. OB-Protein-Konzentrationen von > 160 pg/ml in den Proben wurden zuverlässig gemessen.
5. Körpergewicht und Nahrungsaufnahme
Den Mäusen wurde pelletiertes Nagerfutter (PMI Feeds, Inc., St. Louis, MO) ad libitum angeboten. Das Körpergewicht von individuellen Tieren wurde während der ersten zwei Monate der Untersuchung täglich und danach wöchentlich gemessen. Der Nahrungskonsum wurde täglich bei ausgewählten Gruppen von individuell gehaltenen Tieren gemessen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in den Tabellen 4 und 5 unten dargestellt. Die Verabreichung von OB-Protein-Rezeptor steigerte die Wirksamkeit des OB-Proteins. Dies könnte durch eine verlängerte Verweilzeit des OB-Proteins in der Zirkulation in Gegenwart des OB-Protein-Rezeptors erreicht worden sein.
Wie der Tabelle entnommen werden kann, zeigten Tiere, denen eine Kombination aus OB-Protein und OB-Protein-Rezeptor (durch Gentherapie) verabreicht wurde, einen größeren Gewichtsverlust nach 28 Tagen als solche, die eine Zusammensetzung von nur einem der beiden erhalten hatten. Die Tabelle stellt die Ergebnisse von zwei Experimenten („_/_") dar. Wie der Tabelle entnommen werden kann, führte eine Verwendung von nur dem OB-Protein dazu, daß Tiere am Tag 40 87,5% und 72,2% des Ausgangsgewichts aufwiesen. Die Verwendung des OB-Rezeptors in Kombination mit dem OB-Protein allerdings führte dazu, daß Tiere 68% und 53,6% des Ausgangsgewichts aufwiesen. Es schien, daß die Verwendung von nur dem Rezeptor wenig Wirkung ausübte, wenn überhaupt. Tabelle 4:

* 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-Protein-cDNA, wie oben beschrieben, und 50% Knochenmarkszellen ohne genetische Veränderung;
** 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-Rezeptor-Protein-cDNA, wie oben beschrieben, und 50% Knochenmarkszellen ohne genetische Veränderung;
*** 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-cDNA, wie oben beschrieben, und 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-Rezeptor-Protein-cDNA, wie oben beschrieben.

Tabelle 5 unten enthält die Ergebnisse für die OB-Konzentrationen, die im Serum von Tieren gefunden wurden, denen nur das OB-Protein verabreicht wurde oder denen das OB-Protein in Kombination mit dem OB-Protein-Rezeptor (durch das „Gentherapie"-Verfahren dieses Beispiels) verabreicht wurde. Die Daten geben Nanogramm OB-Protein pro Milliliter Serum plus oder minus den Standardfehler des Mittelwerts wieder. Tabelle 5:

* 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-Protein-cDNA, wie oben beschrieben, und 50% Knochenmarkszellen ohne genetische Veränderung;
** 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-Rezeptor-Protein-cDNA, wie oben beschrieben, und 50% Knochenmarkszellen ohne genetische Veränderung;
*** 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-cDNA, wie oben beschrieben, und 50% Knochenmarkszellen, transfiziert mit OB-Rezeptor-Protein-cDNA, wie oben beschrieben;
‡ Experiment Nr. 1 wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei die Serumspiegel von OB-Protein nach 38 Tagen gemessen wurden;
‡‡ Experiment Nr. 2 wurde ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt, wobei die Serumspiegel von OB-Protein nach 24 Tagen gemessen wurden.

Die Daten zeigen die protektiven Wirkungen des OB-Rezeptors. Wie der Tabelle entnommen werden kann, weist das OB-Protein in Gegenwart des OB-Rezeptors eine höhere Akkumulation im Serum auf. Es wird beobachtet, daß das Ausmaß der Akkumulation umgekehrt proportional zu den Serumspiegeln an OB-Protein ansteigt. Im Experiment Nr. 1 (mit einer OB-Protein-Ausgangskonzentration von ungefähr 2,93 ng/ml) stieg der OB-Protein-Serumspiegel ungefähr um 400% bei Zugabe des Rezeptors an, wobei in Experiment Nr. 2 (mit einer Ausgangskonzentration von ungefähr 9,74) der OB-Protein-Serumspiegel um ungefähr 25% anstieg.
Der OB-Rezeptor, verabreicht entweder alleine oder in Verbindung mit OB-Protein (oder Analoga oder Derivaten davon), kann dazu dienen, die Verweilzeit des OB-Proteins in der Zirkulation zu verlängern und dadurch die therapeutische Wirksamkeit von entweder exogenem oder endogenem OB-Protein zu steigern.
BEISPIEL 8: Herstellung von selektiv bindenden Molekülen
Es wurden Tiere zum Herstellen von polyklonalen Antikörpern unter Verwendung der folgenden Peptide immunisiert (wobei sich die Numerierung der Aminosäuren auf den OB-Rezeptor A, Seq. ID Nr. 1 bezieht): 54–64, 91–100, 310–325, 397–406, 482–496, 874–885 und unter Bezugnahme auf die Aminosäuren des OB-Rezeptors „C" (Seq. ID Nr. 5), 910–929. Einige der (in Kaninchen) erzeugten polyklonalen Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit getestet, an das rekombinante menschliche OB-Rezeptor-Protein zu binden. Es zeigte sich, daß der gegen die Aminosäuren 54–64 hergestellte polyklonale Antikörper die größte Affinität zum rekombinanten menschlichen OB-Rezeptor-Protein aufwies. Es wurde gefunden, daß auch der gegen die Aminosäuren 397–406 hergestellte polyklonale Antikörper an rekombinantes menschliches OB-Rezeptor-Protein bindet. Es zeigte sich, daß der gegen die Aminosäuren 91–100 hergestellte polyklonale Antikörper an rekombinantes menschliches OB-Rezeptor-Protein schwach bindet. Es zeigte sich, daß eine Bindung des gegen die Aminosäuren 874–885 hergestellten polyklonalen Antikörpers an rekombinantes menschliches OB-Rezeptor-Protein nicht stattfand.
Es wurde eine zusätzliche Untersuchung durchgeführt, welche die Expression und Reinigung der extrazellulären Domäne des OB-Rezeptor-Proteins in CHO-Zellen zeigt, und Antikörper, welche diese extrazelluläre Domäne des OB-Protein-Rezeptors erkennen.
Die extrazelluläre Domäne des menschlichen OB-Rezeptor-Proteins wurde als ein sezerniertes lösliches Protein in CHO-Zellen exprimiert, wie zuvor oben beschrieben. Es wurden individuelle Zellinien isoliert und in ansteigenden Mengen von Methotrexat wachsen gelassen (100, 200 oder 500 Mikrogramm Methotrexat pro ml Medium), um die Selektion/Expression des rekombinanten Rezeptorproteins zu steigern. Es wurden konditionierte Medien der CHO-Zellinien gesammelt, und die Proteine in den konditionierten Medien wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die extrazelluläre Domäne des OB-Rezeptors wanderte als eine breite Bande mit einer apparenten Größe im Bereich von ungefähr 140 kDa bis ungefähr 200 kDa.
Die extrazelluläre Domäne des OB-Rezeptor-Proteins wurde durch Western blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern, die gegen einen Bereich der extrazellulären Domäne des OB-Rezeptor-Proteins hergestellt worden waren, nachgewiesen. Das ungefaltete, bakteriell exprimierte Protein wurde als ein Antigen verwendet, um Antiseren in Kaninchen zu erzeugen. Die identifizierte extrazelluläre Domäne des OB-Rezeptors wurde durch Affinitätschromatographie gereinigt. Das gereinigte Protein wurde am Aminoterminus sequenziert, um zu bestätigen, daß es sich um den OB-Rezeptor handelte, und auch, um den Anfang des reifen Proteins (nach Abspaltung des Signalpeptids) zu bestimmen, wie es in CHO-Zellen exprimiert wurde. Es wurde festgestellt, daß die Aminosäure Nr. 22 (gemäß der Numerierung der Aminosäuresequenz nach Seq. ID Nr. 1, unten) die erste Aminosäure des reifen Proteins, wie es in CHO-Zellen exprimiert wurde, war.
Es können andere immunogene Peptide verwendet werden. Es können polyklonale, monospezifisch polyklonale, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und rekombinante Antikörper unter Verwendung von Verfahren, die für diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, verfügbar sind, hergestellt werden.
Man kann weiterhin rekombinante Techniken oder Peptidsyntheseverfahren verwenden, um die Eigenschaft von derartigen selektiv bindenden Molekülen zu verändern. Dies kann durch Herstellen von rekombinanten Antikörpern erreicht werden, bei denen die die Komplementarität bestimmenden Regionen verändert sind (im Stand der Technik manchmal als „CDRs" für „Complementarity determining regions" bezeichnet), um beispielsweise die Antikörper durch Verwendung von menschlichen F_c (konstante)-Regionen zu „humanisieren". Andere Arten von rekombinanten Antikörpern, beispielsweise solchen, bei denen die CDRs verändert sind, um die Affinität zu einem oder mehreren Mitgliedern der OB-Rezeptor-Familie oder die Selektivität dafür zu steigern, können unter Verwendung von Verfahren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, zur Verfügung stehen, hergestellt und verwendet werden. Siehe Winter et al., Nature 349: 293–299 (1991).
Das vorliegende OB-Rezeptor-Protein kann als ein Test verwendet werden, um nach den gewünschten selektiv bindenden Molekülen zu suchen. Ein derartiger Test kann auf der Fähigkeit zur Bindung oder auf einer biologischen Aktivität oder anderen Mitteln zum Nachweis einer Signaltransduktion beruhen. Wenn man beispielsweise man eine Reihe modifizierter Antikörper herstellt, kann man sie auf die Affinität (d. h. Bindungsstärke) zu dem Ziel-OB-Rezeptor testen.
Die selektiv bindenden Moleküle können zu diagnostischen Zwecken nützlich sein, wie etwa zur Analyse der Gewebeverteilung oder um die relative Affinität der OB-Rezeptoren eines Individuums zu derartigen selektiv bindenden Molekülen zu diagnostizieren, um die Funktionsfähigkeit des OB-Rezeptors eines Individuums während eines Therapieverlaufs zu bestimmen. Selektiv bindende Moleküle können zum OB-Protein alternative therapeutische oder kosmetische Produkte sein.
BEISPIEL 9: Gentherapie
Man kann das vorliegende OB-Rezeptor-Protein mittels Gentherapie verabreichen, wie oben beschrieben.
Man kann sich unter Verwendung von Materialien und Verfahren, die für diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, verfügbar sind, und die hier verfügbar gemacht werden, die Verwendung von T-Zellen, die DNA zur OB-Rezeptor-Expression tragen, als ein Mittel zur Gentherapie vorstellen. Ein Individuum würde T-Zellen aufweisen, selektioniert unter Verwendung einer CD34⁺-Selektion und einer Vorrichtung zur Selektion durch magnetische Mikropartikel. Derartige Zellen würden mit der gewünschten DNA transfiziert werden, oder es könnte die Regulation der gewünschten kodierenden Region unter Verwendung von homologer Rekombination oder anderen in situ-Techniken verändert werden. Die transduzierten Zellen könnten empirisch ausgewählt werden unter Verwendung von Mitteln zum Nachweis des gewünschten Proteins, oder es könnte ein Marker beteiligt sein, der einen indirekten Nachweis ermöglicht (d. h. ein selektierbarer Marker, wie er im Stand der Technik bekannt ist). Wahlweise könnten derartige Zellen expandiert werden, beispielsweise unter Verwendung von einem oder mehreren Wachstumsfaktoren, wie etwa SCF oder einem Interleukin, und derartige Zellen könnten zur zukünftigen Verwendung gelagert werden. Auf diese Weise würde das Verfahren nur einmal oder jedenfalls nicht häufig im Leben eines Individuums zum späteren Transfer in das Individuum angewendet werden. Die Zellen würden in das Individuum zurückimplantiert werden, und das Individuum würde auf die gewünschte therapeutische Wirkung, wie etwa Gewichtsverlust/Gewichtserhaltung, ein Wiederauftreten von Diabetes, die Entwicklung der Blutlipidspiegel und andere Zustände überwacht werden.
Erläuternde Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen
Die unten aufgeführten Aminosäure- und DNA-Sequenzen sind diejenigen, auf die Bezug genommen worden ist. Ein Stern („*") bezeichnet die Position eines Stop-Kodons.
Aminosäuresequenz des menschlichen OB-Rezeptors „A" (Seq. ID Nr. 1, Aminosäure, Einzelbuchstaben-Code):
DNA-Sequenz des menschlichen OB-Rezeptors „A" (Seq. ID Nr. 2, DNA):
Aminosäuresequenz des menschlichen OB-Rezeptors „B" (Seq. ID Nr. 3, Aminosäure):
DNA-Sequenz des menschlichen OB-Rezeptors „B" (Seq. ID Nr. 4, DNA):
Aminosäuresequenz des menschlichen OB-Rezeptors „C" (Seq. ID Nr. 5, Aminosäure):
DNA-Sequenz des menschlichen OB-Rezeptors „C" (Seq. ID Nr. 6, DNA):
Aminosäuresequenz des menschlichen OB-Rezeptors „D" (Seq ID Nr. 7):
DNA-Sequenz des menschlichen OB-Rezeptors „D" (Seq. ID Nr. 8):
Chromosomale DNA des menschlichen OB-Rezeptor-Proteins „D" (Seq. ID Nr. 9):
Menschliches OB-Rezeptor-Protein, Aminosäuresequenz des rekombinanten sezernierten Rezeptors (Seq. ID Nr. 10):
Menschliches OB-Rezeptor-Protein, DNA-Sequenz des rekombinanten sezernierten Rezeptors Seq. ID Nr. 11):
Menschliches OB-Rezeptor-Protein, DNA-Sequenz des rekombinanten sezernierten Rezeptors mit einem C-terminalen FLAG (Seq. ID Nr. 12):
Rekombinantes menschliches OB-Rezeptor-Protein, Aminosäuresequenz einer natürlichen Splice-Variante (Seq. ID Nr. 13):
Menschliches OB-Rezeptor-Protein, DNA einer natürlichen Splice-Variante (Seq ID Nr 14):
Während die vorliegende Erfindung in Bezug auf bevorzugte Ausführungen beschrieben worden ist, soll verstanden werden, daß denjenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, Variationen und Modifikationen in den Sinn kommen werden. Deshalb ist beabsichtigt, daß die angefügten Ansprüche alle derartigen äquivalenten Variationen abdecken, die innerhalb des beanspruchten Umfangs der Erfindung liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

OB-Rezeptorprotein-Zubereitung, die ein OB-Rezeptorprotein enthält, wahlweise in einer pharmazeutisch vertretbaren Formulierung, wobei das OB-Rezeptorprotein aus der Aminosäuresequenz besteht, die aus folgenden Aminosäuresequenzen ausgewählt ist (gemäß SEQ ID No. 1): (a) 1–896; (b) 22–896, wahlweise mit einem N-terminalen Methioninrest; (c) 23–896, wahlweise mit einem N-terminalen Methioninrest; (d) 29–896, wahlweise mit einem N-terminalen Methioninrest; (e) 22–891, wahlweise mit einem N-terminalen Methioninrest; (f) 23–891, wahlweise mit einem N-terminalen Methioninrest; (g) 29–891, wahlweise mit einem N-terminalen Methioninrest; (h) wobei die Sequenzen (e) bis (g) weiterhin die C-terminalen Aminosäuren, beginnend in Position 892, eines OB-Rezeptors B (SEQ ID No. 3) oder C (SEQ ID No. 5) aufweisen; und (i) ein chemisch modifiziertes Derivat von jeder der in (a) bis (h) aufgeführten Sequenzen.
OB-Rezeptorprotein-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei die C-terminalen Aminosäuren des OB-Rezeptorproteins, beginnend in Position 799 durch GKFTIL (SEQ ID No. 13) substituiert sind.
OB-Rezeptorprotein-Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die extrazelluläre Domäne, die sich von Position 22(F), 23(N) oder 29(T) bis Position 839(D) oder 841(G) erstreckt, des OB-Rezeptorproteins modifiziert ist, wobei die Modifikation aus folgenden ausgewählt ist: (a) Deletion der gesamten oder eines Teils der Zufallsknäuel-Domäne von ungefähr Aminosäure 642 bis Aminosäure 839 oder 841; (b) Modifikation von einer der oder beiden „WSXWS"-Boxen durch Substitution des ersten Serins durch eine andere Aminosäure; (c) Modifikation von einer der oder beiden „WSXWS"-Boxen durch Substitution des letzten Serins durch eine andere Aminosäure; und (d) Modifikation von einer der oder beiden „WSXWS"-Boxen durch Substitution des ersten Tryptophans durch eine andere Aminosäure.
DNA-Molekül, das ein OB-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Expressions- oder Klonierungsvektor, der eine DNA nach Anspruch 4 enthält.
Eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 5 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine isolierte menschliche Wirtszelle ist.
Verfahren zum Herstellen eines OB-Rezeptor-Proteins, die ein Kultivieren unter geeigneten Bedingungen, eine Wirtszelle nach Anspruch 6, ein Erhalten des hergestellten OB-Rezeptors und wahlweise ein Herstellen einer pharmazeutischen Zubereitung, die den OB-Rezeptor enthält, umfaßt.
Verwendung eines OB-Rezeptorproteins nach den Ansprüchen 1 bis 3 oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 8 zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit, Diabetes, hohen Blutfettspiegeln oder hohen Cholesterinspiegeln.
OB-Protein/OB-Rezeptorprotein-Komplex-Zubereitung, die einen OB-Protein-Rest und einen OB-Rezeptorprotein-Rest enthält, wahlweise in einer pharmazeutisch vertretbaren Formulierung, wobei: (a) das OB-Rezeptorprotein ausgewählt ist aus jenen, die in einem der Ansprüche 1 bis 3 dargelegt sind; und (b) der OB-Protein-Rest ausgewählt ist aus folgendem: (i) einem natürlich vorkommenden OB-Protein; und (ii) einem nicht natürlich vorkommenden OB-Protein, einem Analogon oder Derivat davon.
Verwendung einer OB-Protein/OB-Rezeptorprotein-Komplex-Zubereitung nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit, Diabetes, hohen Blutfettspiegeln oder hohen Cholesterinspiegeln.