DE69632064T2

DE69632064T2 - Neue tyrosinkinase-rezeptoren und liganden

Info

Publication number: DE69632064T2
Application number: DE69632064T
Authority: DE
Inventors: M. David VALENZUELA; J. David GLASS; C. David BOWEN; D. George YANCOPOULOS
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2016-12-14
Also published as: DE69632064D1; ATE263238T1

Description

EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung liefert neue Moleküle, die einen Tyrosinkinase-Rezeptor aktivieren können, und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fähigkeit von Polypeptidliganden, an Zellen zu binden und dabei eine phänotypische Antwort wie Zellwachstum, -überleben oder -differenzierung in solchen Zellen hervorzurufen, wird oft von Rezeptor-Tyrosinkinasen vermittelt. Der extrazelluläre Teil jeder Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) ist im allgemeinen der am meisten kennzeichnende Teil des Moleküls, da er das Protein mit seiner Liganden erkennenden Eigenschaft versieht. Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne resultiert in Signaltransduktion über eine intrazelluläre katalytische Tyrosinkinasedomäne, die ein biologisches Signal an intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die spezielle Aneinanderreihung von Sequenzmotiven dieser cytoplasmatischen, katalytischen Domäne bestimmt ihren Zugang zu möglichen Kinasesubstraten (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 11: 5068–5078; Fantl, et al., 1992, Cell 69: 413).
Die Gewebeverteilung eines einzelnen Tyrosinkinase-Rezeptors in höheren Organismen liefert hinsichtlich der biologischen Funktion des Rezeptors wichtige Daten. Zum Beispiel lieferte die Lokalisation eines Rezeptors der Trk-Familie, TrkB, in Gewebe einen gewissen Einblick in die mögliche biologische Rolle dieses Rezeptors sowie der Liganden, die diesen Rezeptor binden (hier als Zugehörige bzw. zugehörig bezeichnet). Folglich wurde zum Beispiel in erwachsenen Mäusen trkB bevorzugt in Hirngewebe exprimiert gefunden, obwohl bedeutende Mengen von trkB-mRNA auch in Lunge, Muskel und Eierstöcken gefunden wurden. Darüber hinaus wurden trkB-Transkripte in Embryonen mittlerer und später Schwangerschaft nachgewiesen. In situ-Hybridisierungsanalyse von 14 und 18 Tage alten Mausembryonen zeigte, dass trkB-Transkripte im zentralen und peripheren Nervensystem, einschließlich Gehirn, Rückenmark, Spinal- und Cranialganglien, dem paravertebralen Ast des sympathischen Nervensystems und verschiedener Innervierungswege, lokalisiert waren, was nahelegt, dass das trkB-Genprodukt ein Rezeptor sein kann, der an der Neurogenese und frühen Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist, sowie eine Rolle im erwachsenen Nervensystem spielt.
Die zelluläre Umgebung, in der eine RTK exprimiert wird, kann die biologische Antwort beeinflussen, die auf die Bindung eines Liganden an den Rezeptor erfolgt. So erfolgen zum Beispiel, wenn eine neuronale Zelle, die einen Trk-Rezeptor exprimiert, mit einem Neurotrophin in Kontakt kommt, das diesen Rezeptor bindet, neuronales Überleben und Differenzierung. Wenn der gleiche Rezeptor von einer Fibroblastenzelle exprimiert wird, resultiert der Kontakt mit dem Neurotrophin in der Proliferation des Fibroblasten (Glass, et al., 1991, Cell 66: 405–413). Folglich scheint es, dass die extrazelluläre Domäne den bestimmenden Faktor liefert, was die Ligandenspezifität angeht, und wenn die Signaltransduktion ausgelöst wurde, wird die zelluläre Umgebung das phänotypische Ergebnis dieser Signaltransduktion bestimmen.
Eine Reihe von RTK-Familien wurden identifiziert, basierend auf Sequenzhomologien ihrer intrazellulären Domänen. Zum Beispiel besitzen zwei Mitglieder der TIE- (Tyrosinkinase mit Immunglobulin- und EGF-Homologiedomänen) Familie, bekannt als TIE-1 und TIE-2, 79% Sequenzhomologie in ihrem intrazellulären Bereich (Maisonpierre, et al., 1993, Oncogene 8: 1631–1637). Obwohl diese Rezeptoren ähnliche Motive in ihrer extrazellulären Domäne teilen, sind nur 32% der Sequenzen identisch.
Ein Rezeptor mit einer Kinase-Domäne, der zu der Trk-Familie verwandt ist, wurde in dem elektrischen Rochen Torpedo californica gefunden, und kann eine Rolle in von Motoneuronen induzierten Synapsen für Muskelfasern spielen (Jennings, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2895–2899). Diese Kinase wurde aus dem elektrischen Organ isoliert, einem Gewebe, das eine spezialisierte Form eines Skelettmuskels ist. Die Tyrosinkinasedomäne dieses Proteins ist mit der Trk-Familie verwandt, während die extrazelluläre Domäne sich ein wenig von den Trks unterscheidet. Das Protein wurde in Skelettmuskel von Torpedo in hohen Mengen und in viel geringeren Mengen in Gehirn., Rückenmark, Herz, Leber und Hoden von erwachsenem Torpedo exprimiert gefunden.
Oft werden solche neuen RTKs bei der Suche nach zusätzlichen Mitgliedern bekannter Familien von Tyrosinkinase-Rezeptoren mittels zum Beispiel PCR basierten Absuchens, betreffend bekannte Bereiche von Homologien zwischen den Trk-Familienmitgliedern, gefunden und isoliert. (Vgl. zum Beispiel Maisonpierre, et al., 1993, Oncogene 8: 1631–1637). Die Isolierung von solchen sogenannten „Waisen"-Tyrosinkinase-Rezeptoren, für die kein Ligand bekannt ist, und die anschließende Bestimmung von Geweben, in denen solche Rezeptoren exprimiert werden, liefert Einblick in die Regulation des Wachstums, der Proliferation und Regeneration von Zellen in Zielgeweben. Die Identifizierung und Isolierung neuer RTKs kann als Mittel zur Identifizierung neuer Liganden oder aktivierender Moleküle verwendet werden, die dann verwendet werden können, um das Überleben, das Wachstum, die Differenzierung und/oder Regeneration von Zellen, die den Rezeptor exprimieren, zu regulieren. Da RTKs eine Reihe wichtiger Funktionen während der Entwicklung zu vermitteln scheinen, verstärken die Identifizierung und Isolierung solcher Rezeptoren, Liganden und aktivierender Moleküle unser Verständnis von Entwicklungsvorgängen und können unsere Fähigkeit verbessern, abnormale Zustände zu diagnostizieren oder zu behandeln.
Zum Beispiel können die vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden, um ein Ereignis, das in der Entwicklung der neuromuskulären Verbindung (NMJ) – die Lokalisation von Acetylcholin-Rezeptoren an der Synapse – vorkommt, zu untersuchen. Es war lange bekannt, dass wichtige Signale über die NMJ ausgetauscht werden (Nitkin, et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 2471–2478; Hall, Z. W. und Sanes, J. R., 1993, Cell/Neuron (Erg.) 72/10: 99–121; Bowe, M. A. und Fallon, J. R., 1995, Ann. Rev. Neurosci. 18: 443–462; Sanes, J. R., 1995, Devel. Biol. 6: 163–173; Burden, S. J., et al., 1995, Devel. Biol. 6: 59–65). Diese Signale schließen den chemischen Transmitter, Acetylcholin, ein, der aus Vesikeln in der Nervenendigung ausgeschüttet, von Acetylcholinrezeptoren (AChRs) auf dem Muskel erkannt wird und schließlich in elektrischer Aktivierung und Kontraktion des Muskels resultiert.
Der Muskel stellt auch neurotrophe Faktoren bereit, die das Überleben von Motoneuronen unterstützen (DeChiara, T., et al., 1995, Cell 83: 313–322), und der Nerv kann seinerseits myotrophe Faktoren bereitstellen, die die Muskelmasse aufrechterhalten (Helgren, M. E., et al., 1994, Cell 76: 493–504). Gegenseitige Signalinteraktionen sind auch sowohl für die Bildung als auch Aufrechterhaltung der neuromuskulären Verbindung selbstentscheidend. Solche Signale regulieren die Erkennung des Nerv-an-Muskel-Kontakts, stoppen das Wachstum der einwachsenden Nervenendigung und induzieren die Bildung einer hochspezialisierten Nervenendigung, die durch eine polarisierte Anordnung von synaptischen Vesikeln und aktiven Zonen gekennzeichnet ist. Gleichzeitig bildet sich genau neben der Nervenendigung ein komplexer molekularer Apparat auf der Muskelmembran. Diese spezialisierte postsynaptische Struktur mit der Bezeichnung motorische Endplatte umfasst einen winzigen Fleck auf der Muskelmembran, der durch eine dichte Gruppierung spezieller Proteine gekennzeichnet ist; einige von diesen können vom Nerven stammende Signale erhalten, wie AChRs bekannterweise tun, während andere an der Schaffung des molekularen Gerüsts für diese postsynaptische Spezialisierung beteiligt sein können.
Vom Nerven hergestellte Signale induzieren postsynaptische Cluster durch mindestens zwei Mechanismen. Erstens können diese Signale die Umverteilung schon vorhandener Moleküle, die anfänglich in der ganzen Myofaser exprimiert sind, induzieren, und zweitens können sie die lokalisierte Transkription spezifischer Gene nur durch die subsynaptischen Nuclei, die unter der NMJ liegen, induzieren. Zwischen der Nervenendigung und der motorischen Endplatte ist ein schmaler synaptischer Spalt, der eine komplexe Basallamina enthält. Diese Basallamina unterscheidet sich von der benachbarten extrazellulären Matrix durch die Ansammlung einer Reihe von Proteinen wie Acetylcholinesterase und s-Laminin. Die synaptische Basallamina dient auch als ein Reservoir für Signalmoleküle, die zwischen dem Nerv und dem Muskel ausgetauscht werden.
Obwohl die gegenseitigen Interaktionen zwischen Nerv und Muskel intensiv für Jahrzehnte untersucht wurden, bleiben noch viele Fragen, die die genaue Beschaffenheit der Signale, die an der Bildung der NMJ beteiligt sind, betreffen. Die Realisierung, dass leere Hüllen der synaptischen Basallamina die Bildung von sowohl Nervenendigungsspezialisierungen als auch motorischen Endplatten induzieren konnten, legte nahe, dass Schlüsselsignalmoleküle in der extrazellulären Matrix eingebettet sein könnten (Sanes, J. R., et al., 1978, J. Cell. Biol. 78: 176–198; Burden, S. J., et al., 1979, J. Cell. Biol. 82: 412–425; McMahan, U. J. und Slater, C. R., 1984, J. Cell. Biol. 98: 1453–1473; Kuffler, D. P., 1986, J. Comp. Neurol. 250: 228–235). Tatsächlich deuten jüngste Befunde an, dass ein Protein, dass aufgrund seiner AChR-induzierenden Aktivität entdeckt und folglich ARIA genannt wurde (Jessell, T. M., et al., 1979, PNAS (USA) 76: 5397–5401; Falls, D. L., et al., 1990, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55: 397–406; Falls D. L., et al., 1993, Cell 72: 801–815), das die Expression mehrerer AChR-Untereinheitengene erhöhen kann (Harns, D. A., et al., 1989, Nature 337: 173–176; Martinou, J.-C., et al., 1991, PNAS (USA) 88: 7669–7673; Jo, S. A., et al., 1995, Nature 373: 158–161; Chu, G. C., et al., 1995, Neuron 14: 329–339), an der synaptischen Basallamina lokalisiert ist (Jo, S. A., et al., 1995, Nature 373: 158–161; Goodearl, A. D., et al., 1995, J. Cell. Biol. 130: 1423–1434). Molekulare Clonierung zeigte, dass ARIA einem Faktor entspricht, der alternativ als Neuregulin, NDF, Heregulin oder Gliawachstumsfaktor bezeichnet wird, und an die erbB-Familie von RTKs bindet (Carraway, K. L. und Burden, S. J., 1995, Curr. Opin. Neurobiol. 5: 606–612). Interessanterweise wurde die Neuregulin-Herstellung in Motoneuronen gezeigt, und die Neuregulin-Rezeptoren erbB3 und erbB4 wurden jüngst an der motorischen Endplatte lokalisiert, was die Idee unterstützt, dass vom Nerven stammendes Neuregulin ein wichtiges Signal an den Muskel liefert, das die Transkription von subsynaptischen Nuclei reguliert (Altiok, N., et al., 1995, EMBO J. 14: 4258–4266; Moscoso, L. M., et al., 1995, Dev. Biol. 172: 158–169; Zhu, X., et al., 1995, EMBO J. 14: 5842–5848).
Ein anderes Protein, bekannt als Agrin, wurde aus der synaptischen Basallamina isoliert, basierend auf seiner Fähigkeit, die Neuverteilung schon vorhandener AChRs in Cluster auf der Oberfläche von kultivierten Myotuben zu verursachen (Godfrey, E. W., et al., 1984, J. Cell. Biol. 99: 615–627; Rupp, F., et al., 1991, Neuron 6: 811–823; Tsim, K. W., et al., 1992, Neuron 8: 677–689). Im Gegensatz zu Neuregulin scheint Agrin die AChR-Expression nicht zu regulieren. Agrin verursacht jedoch die Gruppierung einer Reihe von synaptischen Bestandteilen, zusammen mit AChRs, in kultivierten Myotuben (Wallace, B. G., 1989, J. Neurosci. 9: 1294–1302).
Eine Vielfalt von Daten stimmt mit der Vorstellung überein, dass Agrin auch in vivo agiert, um die postsynaptische Membranspezialisierung zu induzieren und zu unterstützen. Am wichtigsten darunter sind die Befunde, dass die aktivsten Formen von Agrin ausschließlich von Neuronen gemacht und in der synaptischen Basallamina lokalisiert werden (Ruegg, M. A., et al., 1992, Neuron 8: 691–699; Ferns, M., et al., 1993, Neuron 11: 491–502; Hoch, W., et al., 1993, Neuron 11: 479–490) und dass Antikörper gegen Agrin die Nerven induzierte Gruppierung von AChRs auf kultivierten Myotuben blockieren (Reist, N. E., et al., 1992, Neuron 8: 865–868).
Der genaue Mechanismus der Wirkung von Agrin bleibt ein Geheimnis (Sealock, R. und Froehner, S. C., 1994, Cell 77: 617–619). Es ist bekannt, dass Agrin die Tyrosinphosphorylierung von AChRs induziert, und Inhibitoren der Tyrosinphosphorylierung blockieren die Agrinvermittelte Gruppierung (Wallace, B. G., et al., 1991, Neuron 6: 869–878; Wallace, B. G., 1994, J. Cell. Biol. 125: 661–668; Qu, Z. und Huganir, R. L., 1994, J. Neurosci. 14: 6834–6841; Wallace, B. G., 1995, J. Cell. Biol. 128: 1121–1129).
Interessante jüngste Befunde zeigten, dass Agrin direkt an α-Dystroglycan binden kann, ein extrinsisches peripheres Membranprotein, das an die Zelloberfläche über kovalente Bindung an β-Dystroglycan gebunden ist, das seinerseits an das intrazelluläre Cytoskelettgerüst über einen assoziierten Proteinkomplex koppelt (Bowe, M. A., et al., 1994, Neuron 12: 1173–1180; Campanelli, J. T., et al., 1994, Cell 77: 673–674; Gee, S. H., et al., 1994, Cell 77: 675–686; Sugiyama, J., et al., 1994, Neuron 13: 103–115; Sealock, R. und Froehner, S. C., 1994, Cell 77: 617–619).
Extrasynaptisch bindet der Dystroglycan-Komplex Laminin auf seiner extrazellulären Seite und koppelt an das Actingerüst über ein Spectrin-ähnliches Molekül, bekannt als Dystrophin. An der Synapse jedoch kann Agrin (über seine eigenen Laminin-ähnlichen Domänen) eventuell Laminin ersetzen, wohingegen Utrophin (ein Dystrophin-ähnliches Protein) Dystrophin als die Verbindung zu Actin ersetzt (im Überblick dargestellt in Bowe, M. A. und Fallon, J. R., 1995, Ann. Rev. Neurosci. 18: 443–462). Der Dystroglycan-Komplex gruppiert sich zusammen mit AChRs als Antwort auf Agrin in vitro, und Bestandteile dieses Komplexes werden an der Endplatte in vivo konzentriert (im Überblick dargestellt in Bowe, M. A. und Fallon, J. R., 1995, Ann. Rev. Neurosci. 18: 443–462).
Jüngste Hinweise legen nahe, dass ein cytoplasmatisches Protein von 43 kD, bekannt als Rapsyn, AChRs an einen subsynaptischen Cytoskelett-Komplex verankert, wahrscheinlich über Interaktionen mit dem Dystroglycan-Komplex (Cartaud, J. und Changeux, J. P., 1993, Eur. J. Neurosci. 5: 191–202; Apel, E. D., et al., 1995, Neuron 15: 115–126). Gendisruptionsstudien decken auf, dass Rapsyn absolut notwendig zur Gruppierung von AChRs sowie des Dystroglycan-Komplexes ist. Jedoch werden andere Gesichtspunkte der NMJ-Bildung, die präsynaptische Differenzierung und Synapsen-spezifische Transkription einschließen, in Mäusen, denen Rapsyn fehlt, gesehen (Gautam, M., et al., 1995, Nature 377: 232–236).
Trotz der Befunde, dass Agrin direkt an α-Dystroglycan binden kann, und dass AChRs und der Dystroglycan-Komplex verbunden sind und als Antwort auf Agrin zusammen gruppieren, bleibt die Rolle von Dystroglycan als ein Agrin-Rezeptor unklar (Sealock, R. und Froehner, S. C., 1994, Cell 77: 617–619; Ferns, M., et al., 1996, J. Cell. Biol. 132: 937–944). Es wurde jüngst berichtet, dass ein 21 kD-Fragment von Agrin von Küken ausreichend ist, um die AChR-Aggregation zu induzieren (Gesemann, M., et al., 1995, J. Cell. Biol. 128: 625–636). Dystroglycan könnte direkt an der Aktivierung von Signalwegen, die zur Gruppierung erforderlich zu sein scheinen, wie solche, die Tyrosinphosphorylierung beinhalten, durch einen unbekannten Mechanismus (zum Beispiel durch Assoziation mit einer cytoplasmatischen Tyrosinkinase) beteiligt sein.
Andererseits könnte Dystroglycan an Kopplungen von Agrin nicht nur an AChRs, sondern an einen neuen Signalrezeptor beteiligt sein. Es bleibt auch möglich, dass Dystroglycan keine aktive oder erforderliche Rolle in der Initiierung der Gruppierung spielt und sich nur in einer Auswahl von postsynaptischen Molekülen, die sich gruppieren, befindet. Jüngste Hinweise deuten an, dass das Agrinfragment, das in der Induktion der AChR-Aggregation aktiv ist, nicht an α-Dystroglycan bindet, und es wurde vielmehr eine strukturelle Rolle in der Aggregation als eine Signaltransduktionsrolle für die Bindung von Agrin an α-Dystroglycan vorgeschlagen (Gesernann, M., et al., 1996, Neuron 16: 755–767).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Tyrosinkinase mit der Bezeichnung „MuSK" für „Muskel-spezifische Kinase" wird in normalem und denerviertem Muskel exprimiert, sowie in anderen Geweben, einschließlich Herz, Milz, Eierstöcken oder Retina (vgl. Valenzuela, D., et al., 1995, Neuron 15: 573–584). Die Tyrosinkinase wurde alternativ als „Dmk" für „Denervierte Muskelkinase" bezeichnet (vgl. Internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/LTS94/08039, veröffentlicht am 1. Februar 1996 als WO 96/02643 unter dem Titel Denervated Muscle Kinase (DMK), A Receptor Of the Tyrosine Kinase Superfamily). Folglich können die Begriffe MuSK und Dmk austauschbar verwendet werden. Das Protein scheint mit der Trk-Familie der Tyrosinkinasen verwandt zu sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden neue Polypeptide identifiziert, die den MuSK-Rezeptor aktivieren.
Der Begriff „MuSK aktivierendes Molekül", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors in einer differenzierten Muskelzelle induzieren kann. Ein solches aktivierendes Molekül ist Agrin, wie in den hier aufgeführten Beispielen beschrieben.
Die Erfindung liefert ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das den Teil des menschlichen Agrins codiert, der den MuSK-Rezeptor aktiviert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) der Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 60 bis 492 oder ein Fragment davon codiert, das mindestens die Aminosäuren 300 bis 492 codiert;
(b) einer Nucleotidsequenz, die sich von der Nucleotidsequenz von (a) unterscheidet durch die Abwesenheit eines Inserts, das dem Insert an Position Y in 15 entspricht, und/oder durch die Abwesenheit eines Inserts, das dem Insert an Position Z in 15 entspricht, und/oder durch die Anwesenheit einer Nucleinsäure, die ein weiteres Insert codiert, das die Aminosäuresequenz VLSASHPLTVSGASTPR hat, die unmittelbar auf das Insert an Position Y in 15 folgt;
(c) einer Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz von (a) oder (b) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das den MuSK-Rezeptor aktiviert und das zu nicht mehr als dem in (a) oder (b) definierten Agrinfragment äquivalent ist; und
(d) einer Nucleotidsequenz, die sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen (a), (b) oder (c) unterscheidet und die ein Polypeptid codiert, das den MuSK-Rezeptor aktiviert.

Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können ein Nucleotidsequenzinsert enthalten oder nicht, so dass das codierte Polypeptid die acht Aminosäuren ELANEIPV an der Position, die der Aminosäureposition 1780 entspricht, wie in 14 gezeigt, enthält oder nicht (Insert Z in 15). Die Nucleinsäure kann in einer anderen Ausführungsform ein Nucleinsäureinsert enthalten oder nicht, so dass das codierte Polypeptid die vier Aminosäuren KSRK an der Position, die der Aminosäureposition 1643 entspricht, wie in 14 gezeigt, enthält oder nicht (Insert Y in 15). Ein weiteres Insert von 17 Aminosäuren VLSASHPLTVSGASTPR kann dem Insert Y direkt folgen.
Stringente Bedingungen, wie hier angewendet, sind solche, die (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur zum Waschen verwenden, zum Beispiel 0.15 M NaCl/0.015 M Natriumcitrat/0.1% NaDodSO₄ bei 50°C; oder die (2) ein denaturierendes Agens während der Hybridisierung, wie Formamid, zum Beispiel 50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0.1% Rinderserumalbumin/0.1% Ficoll/0.1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphat-puffer bei pH 6.5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, verwenden.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Förderung des Wachstums, Überlebens oder der Differenzierung einer den MuSK-Rezeptor exprimierenden Zelle in vitro, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge Agrin oder eines Teils davon, die die Aktivierung des MuSK-Rezeptors bewirkt, an die den MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist Agrin menschliches Agrin. In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist die MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle eine Zelle, die normalerweise im Herzen, in der Milz, den Eierstöcken, der Retina oder dem Skelettmuskel vorkommt. In einer anderen Ausführungsform ist die MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle eine Zelle, die genetisch verändert wurde, um den MuSK-Rezeptor zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung liefert weiter Polypeptide, die von den Nucleinsäuren der Erfindung codiert werden. Solche Polypeptide können wahlweise durch kovalentes Anhängen eines Polyethylenglykolmoleküls verändert werden.
Die Erfindung liefert weiter Vektoren, einschließlich Expressionsvektoren, die ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung umfassen, Wirtvektorsysteme, umfassend solche Vektoren in einer geeigneten Wirtszelle, und Verfahren, Polypeptide der Erfindung herzustellen, die das Züchten von Wirtszellen eines solchen Systems unter Bedingungen, die die Herstellung des Polypeptids und die Gewinnung des so hergestellten Polypeptids erlauben, umfassen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Polypeptids oder einer Nucleinsäure der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung bzw. Störung, die Muskeln befällt.
Die Erfindung betrifft weiter noch Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid oder eine Nucleinsäure der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen oder polyclonalen anti-Agrin-Antikörpers oder eines Fragments davon ein, wobei ein Polypeptid der Erfindung oder ein Fragment oder Derivat davon als ein Immunogen verwendet wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 – Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure- (Einzelbuchstabencode) Sequenzen von MuSK der Ratte. Die Nucleotidsequenz, die reife MuSK codiert, beginnt um Nucleotid 192 herum.
2 – Northern Blot, der die Verteilung von MuSK in der Ratte während der frühen Entwicklung zeigt. Spur 1: Gesamtembryo E9; Spur 2: Gesamtembryo E11; Spur 3: Placenta E11; Spur 4: Embryokopf E12; Spur 5: Embryokörper E12; Spur 6: Embryorückenmark E12; Spur 7: Placenta E12; Spur 8: Embryokopf E13; Spur 9: Embryokörper E13; Spur 10: Embryogehirn E17; Spur 11: Embryogehirn P1; Spur12: Embryogehirn P10; Spur13: Embryogehirn P19; Spur14: Erwachsenes Gehirn; Spur15: Erwachsener Muskel; Spur16: Erwachsener denervierter Muskel; wobei der Tag des positiven Spermienergebnisses als Tag E1 bezeichnet wird und der Tag der Geburt als Tag P1.
3 – Northern Blot, der die Verteilung von MuSK in Geweben der erwachsenen Ratte zeigt. Spur 1: Gehirn; Spur 2: Riechkolben; Spur 3: Cortex; Spur 4: Hippocampus; Spur 5: Thalamus/Hypothalamus; Spur 6: Mittelhirn; Spur 7: Hinterhirn; Spur 8: Cerebellum; Spur 9: Rückenmark; Spur 10: Thymus; Spur 11: Milz; Spur 12: Leber; Spur 13: Niere; Spur 14: Lunge; Spur 15: Ischiasnerv; Spur 16: Retina; Spur 17: Herz; Spur 18: Eierstock; Spur 19: Muskel; Spur 20: Denervierter Muskel.
4 – Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure- (Einbuchstabencode) Sequenzen von menschlichem MuSK-Rezeptor.
5 – Schematische Darstellung der genomischen DNA, umfassend die drei Exons der Kinasedomäne des MuSK-Gens der Maus, des hergestellten Steuerungs-Vektors und des mutierten Locus nach erfolgreicher Ansteuerung. Die drei Exons der MuSK-Kinasedomäne sind als schwarze Boxen angezeigt, enthaltend die angezeigten Kinasesubdomänen (SD). Die PGK-neo- und MC1-tk-Kassetten sind als offene Boxen angezeigt. Die neuen EcoRI(R)- und NcoI(N)-Fragmente, die nach erfolgreicher Ansteuerung entstehen, sind markiert. Die EcoRI/HpaI-5'-Sonde, die verwendet wird, um die endogenen und mutierten EcoRI-Fragmente nachzuweisen, wurde aus genomischer DNA abgeleitet, die nicht im Ansteuerungs-Konstrukt enthalten ist. B, BamHI; Hp, HpaI; S, SpeI (Spaltstellen in Klammern werden während des Clonierungsprozesses zerstört).
6 – MuSK-Knockout-Mouse – Southern-Blot von Schwanz-DNA von Wildtyp, heterozygoten und homozygoten F2-Nachkommen, der endogene und mutierte EcoRI-Fragmente, nachgewiesen mittels der RI/HpaI-5'-Sonde, sowie die endogenen NcoI-Fragmente, nachgewiesen mittels der Kinasebereichsonde, die in der homozygoten Mutanten nicht vorhanden sind, zeigt.
7A–7D – Histologische Post-mortem-Analyse der Lunge, die zeigt, dass die Luftsäcke der Alveoli in den MuSK-/--Neugeborenen nicht expandiert sind (7A) wie in der Lunge von Kontrolltieren desselben Wurfes (7B), was andeutet, dass mutierte Neugeborene keinen einzigen Atemzug machen. Histologische Post-mortem-Analyse der Muskulatur des Hinterbeins deckt auf, dass MuSK-/--Mäuse (7C) im wesentlichen eine normale Muskelarchitektur ähnlich zu der der Kontrollmäuse besitzen (7D).
8A–8C – Agrin induziert AChR-Gruppierung in Myotuben von Kontroll-, aber nicht MuSK-/--Mäusen. Myotuben von Kontroll- und MuSK-/-Mäusen wurden über Nacht mit wechselnden Konzentrationen von Agrin_4,8 behandelt, mit Rhodamin konjugiertem α-Bungarotoxin (α-BGT) gefärbt, um Oberflächen-AChRs zu färben, dann entweder bei 64facher Vergrößerung unter Rhodamin-Optik fotografiert (8A, Stimulierung mit 100 nM Agrin gezeigt) oder der AChR-Clusterquantifizierung unterzogen (8B, jeder Punkt zeigt die mittlere ± SEM von 40 Mytotuben-Segmenten). Die Gesamtmenge an AChRs auf den Myotuben vor der Agrin-Behandlung wurde bestimmt durch Bindung mit ¹²⁵I-α-BGT (8C, jeder Balken stellt die mittlere ± SEM von gebundenen CPM pro μg Gesamtzellprotein dar; Kontrolle: N = 6; MuSK-/-: N = 5).
9A–9D – c-Agrin_4,8 und c-Agrin_0,8 induzieren spezifisch schnelle Tyrosinphosphorylierung der MuSK-Rezeptoren. C2C12 und primäre Rattenmyoblasten wurden in Myotuben differenziert und stimuliert mit konditionierten Medien von COS-Zellen, transfiziert mit einer Plasmidkontrolle (Schein) oder Plasmiden, die die verschiedenen Formen von löslichem Agrin codieren, mit konditionierten Medien, die Neuregulin enthalten, oder mit gereinigtem bFGF oder Insulin, wie angezeigt. Stimuliert wurde für 10 Minuten mit 10 nM-Konzentrationen der verschiedenen Faktoren, außer wie in den 9C und 9D angezeigt. Nach den Faktorstimulationen wurden die Zellen lysiert und Immunpräzipitationen (I. P.) für entweder MuSK- oder ErbB3-Rezeptoren, wie angezeigt, unterzogen, dann einem Immunblot-Verfahren für Phosphotyrosinmengentestung unterworfen. Nur Agrine, die das Insert an Position Z mit acht Aminosäuren enthielten, aber nicht andere Faktoren, konnten die MuSK-Phosphorylierung induzieren (9A). Agrin konnte die Phosphorylierung eines anderen Muskelrezeptors, ErbB3, nicht induzieren (9B). Die MuSK-Phosphorylierung erfolgte bei niedrigen Agrin-Konzentrationen (9C) und sehr schnell nach der Agrinzugabe (9D).
FIGUREN 10A&10B – Agrin kann nicht nachweisbar an die isolierte Ektodomäne von MuSK binden. Agrin wurde auf seine Bindung an immobilisiertes MuSK-Fc oder an immobilisierten Agrin-spezifischen monoclonalen Antikörper (mAb) getestet, jeweils gekoppelt an eine BIAcore-Sensorchip-Oberfläche (10A); Bindungen an die MuSK-Fc-Oberfläche wurden auch in Gegenwart von 2 mM Ca⁺⁺ oder Heparin (0.01 mg/ml), wie angezeigt, durchgeführt, während Bindungen an die Antikörperoberfläche auch mit überschüssigem löslichem monoclonalen Antikörper oder MuSK-Fc (jeweils bei 25 μg/ml), wie angezeigt, kompetiert wurden. Umgekehrt wurde die Bindung von löslichem MuSK-Fc oder monoclonalem Antikörper an immobilisiertes Agrin durch Bindung zuerst von konditionierten Medien, transfiziert mit einer Plasmidkontrolle (Schein) oder einem Plasmid, das c-Agrin_4,8 (cAg_4,8) codiert, an Nitrocellulose, gefolgt von dem Nachweis mittels entweder löslichem MuSK-Fc oder dem Agrin-spezifischen monoclonalen Antikörper, wie angezeigt, getestet (10B); TrkB-Fc-Nachweis von Nitrocellulose immobilisiertem BDNF diente als zusätzliche Kontrolle.
11 – Agrin kann die MuSK-Phosphorylierung nur in einer differenzierten Myotube induzieren: Hinweis auf eine Myotube spezifische zusätzliche Komponente. Agrin induzierbare Phosphorylierung eines eingeführten MuSK-Rezeptors aus Küken wurde in einem Clon von C2C12-Myoblasten, stabil transfiziert mit einem Küken-MuSK-Expressionsvektor, gemessen. Die eingeführte MuSK aus Küken wird unabhängig davon exprimiert, ob dieser C2C12-Clon undifferenziert („Undif") oder in Myotuben („Dif") differenziert (mittleres Feld) ist, im Gegensatz zur endogenen MuSK der Maus, die nur in differenzierten Zellen exprimiert wird (unteres Feld). Die MuSK des Huhns kann als Antwort auf Agrin nur induzierbar phosphoryliert werden, wenn in differenzierten Myotuben gemessen wird (oberes Feld). Die MuSK aus Küken zeigt die gleiche Spezifität für die Aktivierung durch verschiedene Agrin-Isoformen (jeweils bei 10 nM für 10 Minuten) wie die endogene MuSK der Maus (vergleiche transfizierte MuSK des Huhns und endogene MuSK der Maus im oberen Feld).
12A–12C – Relevante Modelle für den Agrin/MuSK-Rezeptorkomplex.
12A – Schematische Darstellung, die die schrittweise Zusammenstellung des Multikomponenten-Rezeptorkomplexes für den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) darstellt; b1, gp130; b2, LIFRb.
12B – Schematische Darstellung der Verwendung von löslichen b-Rezeptorkomponenten (mit Fc-Marker), um einen CNTF-Rezeptorkomplex aufzubauen, der an die Zelloberfläche über nur einen seiner Bestandteile, die nicht-signalleitende a-Komponente, angeheftet ist; die Oberflächenbindung der löslichen b-Komponenten kann mittels Antikörper, die den Fc-Marker erkennen, nachgewiesen werden.
12C – Schematische Darstellung eines mehrerer möglicher Modelle des MuSK-Rezeptorkomplexes für Agrin, die das Erfordernis einer Myotube assoziierten Spezifitätskomponente (M.A.S.C.) und mögliche Interaktionen mit zusätzlichen Komponenten darstellt, die zur Signaltransduktion oder Kopplung an verschiedene Effektoren oder Substrate erforderlich sein können; diese Kopplungen können extracellulär (zum Beispiel über Agrinbindung an den Dystroglycan-Komplex) oder intracellulär (zum Beispiel über Interaktionen von SH2-Domänen enthaltenden Proteinen mit phosphorylierten Tyrosinen in MuSK) vermittelt sein.
13A–13C – Hinweis auf einen Agrin/MuSK Rezeptorkomplex, der eine Myotube-spezifische zusätzliche Komponente verwendet.
13A – Bildung von Agrin/MuSK-Komplexen auf der Oberfläche von Myotuben: undifferenzierte (undiff.) oder in Myotuben differenzierte (diff.) C2C12-Zellen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, entweder MuSK-Fc oder eine Kontroll-Rezeptor-Fc-Fusion (TrkB-Fc) zu binden, in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Agrin-Isoformen (bereitgestellt in konditionierten Medien von transienten COS-Transfektionen); spezifische Bindung von MuSK-Fc an die Myotubenoberfläche, die durch exogen zugegebenes Agrin verstärkt wird, schließt vermutlich zu denen in 12B analoge Komplexe ein.
13B – Direkte Bindung von Agrin an MuSK wird durch Quervernetzungs-Analyse gezeigt. Radiomarkiertes Agrin (ein rekombinantes C-terminales Fragment (oder ein Teil) von menschlichem Agrin mit der Bezeichnung hAgrin_4.8) bei 1 nM wurde chemisch an die Oberfläche von Myotuben quervernetzt. Nach dem Quervernetzung wurden die Lysate mit einem MuSK-spezifischen Antikörper immunpräzipitiert (Spur 1). Das Quervernetzung wurde auch in Gegenwart eines Überschusses (150 nM) an unmarkiertem Agrin (Spur 2) durchgeführt, während die Immunpräzipitation auch in Gegenwart eines Überschusses an Peptid (entsprechend dem, das zur Herstellung des Antikörpers verwendet wurde) durchgeführt wurde, um die MuSK-Präzipitation zu blockieren; die Positionen des Agrin/MuSK-Komplexes sowie der verschiedenen Formen von ungebundenem monomerem und dimerem Agrin (vgl. Text) sind angegeben.
13C – Hemmung des Agrin induzierten AChR-Clusterings durch MuSK-Fc: Agrin induziertes AChR-Clustering (mit 10 nM c-Agrin_4.8) wurde mit C2C12-Myotuben-Kulturen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an löslichem MuSK-Fc oder einer Kontroll-Rezeptor-Fc-Fusion (Ret-Fc) durchgeführt; das lösliche MuSK-Fc hemmt spezifisch, vermutlich durch Bildung inaktiver Komplexe mit Agrin und der Myotuben-spezifischen zusätzlichen Komponente auf der Zelloberfläche.
14 – Aminosäure- (Einbuchstabencode) Sequenz von Agrin der Ratte, die die Y- und Z-Stellen der Aminosäureinserts, die in Spleißvarianten gefunden werden, anzeigt.
15 – Nucleotid- und Aminosäure-(Einbuchstabencode) Sequenzen von menschlichem Agrinexpressionskonstrukt, das das Signalpeptid und einen flg-Marker (FLAG-Marker) einschließt. Der Start des codierenden Bereichs für das aktive C-terminale Fragment (Teil) von menschlichem Agrin 4–8 ist angegeben. Auch angegeben sind die Position Y- und Position Z-Insertstellen, an denen die Inserts von 4 und 8 Aminosäuren liegen. Überall in dieser Anmeldung geben Bezugnahmen auf menschliches Agrin 4,8; c-Agrin 4,8; oder menschliches c-Agrin 4,8 das aktive C-terminale Fragment (Teil) von menschlichem Agrin 4–8, wie in der Figur dargelegt, an.
16 – Ergebnisse des Phosphorylierungstests, die zeigen, dass der aktive C-terminale 50 kD-Teil von menschlichem Agrin 4,8 und der verkürzte Delta 9-Teil von menschlichem Agrin jeweils die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors induzieren können.
17 – Ergebnisse der pharmakokinetischen Untersuchung, die die Halbwertszeiten im Serum des aktiven C-terminalen 50 kD-Teils von menschlichem Agrin 4,8 (c-Agrin 4,8) mit dem aktiven C-terminalem 50 kD-Teil von menschlichem Agrin 4,8, das durch kovalente Bindung von Polyethylenglykol verändert wurde, vergleicht.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das MuSK-Tyrosinkinasemolekül ist mit der trk-Familie von Tyrosinkinasen verwandt. Die Sequenz des Proteins ist in 1 als SEQ ID Nr.: 1 dargestellt. Es wird angenommen, dass der codierende Bereich des reifen Proteins bei oder um das Serin-Glycin-Threonin an oder um Position 20 herum des codierenden Bereichs beginnt.
Es wurde gefunden, dass diese Tyrosinkinase in denerviertem Skelettmuskel induziert wird. Entsprechend wurde sie MuSK (Muskel-spezifische Kinase) genannt. Sie wurde früher auch als Dmk (denervierte Muskelkinase) bezeichnet. Zusätzlich dazu, dass sie in Skelettmuskel, sowohl normalem als auch denerviertem, gefunden wird, wurde MuSK auch, aber nicht darauf beschränkt, in Milz, Eierstock und Retina gefunden. Sie scheint während der frühen Entwicklung vorhanden zu sein, aber wird auch in erwachsenem Gewebe gefunden.
MuSK ist möglicherweise mit der Torpedo-RTK, nachgewiesen von Jennings, et al., vorstehend, verwandt. MuSK unterscheidet sich jedoch darin, dass sie in denerviertem Muskel induziert zu sein scheint, während keine solche Induktion in Bezug auf die Torpedo-RTK berichtet wurde. Weiter besitzt die Torpedo-RTK eine extrazelluläre Kringle-Domäne, während die MuSK diese nicht besitzt. Diese Kinasen können jedoch Mitglieder der gleichen oder verwandter Familien sein.
Das Gen, das MuSK der Ratte codiert, wurde cloniert und die DNA-Sequenz bestimmt ( 1; SEQ ID Nr.: 2). Es wird angenommen, dass die extrazelluläre Domäne des reifen Proteins von der Nucleotidsequenz, die bei oder um Position 192 herum beginnt und an oder um Position 1610 herum endet, codiert wird. Es wird angenommen, dass der Transmembranteil des Proteins von der Nucleotidsequenz, die an oder um Position 1611 herum beginnt und an oder um Position 1697 herum endet, codiert wird. Es wird angenommen, dass die intrazelluläre Domäne von der Nucleotidsequenz, die an oder um Position 1698 herum beginnt und an oder um Position 2738 herum endet, codiert wird. Ein cDNA-Clon, der Dmk (MuSK) codiert, wurde bei der American Type Culture Collection am 13. Juli 1993 hinterlegt, und ihm wurde die Eingangsnummer ATCC Nr. 75498 erteilt.
Es wird angenommen, dass die extrazelluläre Domäne des Proteins von den Aminosäuren an oder um die Positionen 20 bis 492 herum des codierenden Bereichs, wie in SEQ ID Nr.: 1 dargelegt, umfasst wird.
Die Ähnlichkeit zwischen MuSK und der Torpedo-RTK legt die Verwendung von Bereichen von Sequenzhomologien innerhalb dieser Gene nahe, um Primer zu entwickeln, die zur Suche nach zusätzlichen, verwandten RTKs nützlich sind.
Die Aminosäuresequenz des MuSK-Proteins ist in 1 dargelegt (SEQ ID Nr.: 1). Funktionell äquivalente Moleküle schließen Derivate ein, in denen Aminosäurereste durch Reste in der Sequenz ersetzt sind, die zu einem stillen Austausch führen. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die als ein funktionelles Äquivalent fungiert, ersetzt werden, was zu einer stillen Veränderung führt. Ersatz für eine Aminosäure in der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
MuSK-Proteine schließen auch Proteine oder Fragmente (Teile) oder Derivate davon ein, die während oder nach der Translation verschieden verändert werden, z. B. durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden, etc..
Im Wesentlichen ähnliche Proteine sind solche von verschiedenen Arten oder sind Mitglieder einer Familie in einer Art, und sie sind an mindestens 40% der Positionen gleich. Wesentliche Ähnlichkeit auf Proteinebene schließt die Fähigkeit eines interessierenden Proteins ein, mit MuSK um die Bindung an monoclonale Antikörper, die gegen MuSK-Epitope entwickelt wurden, zu konkurrieren.
Das MuSK-Protein ist nützlich in 1) Absuchstrategien, 2) Aufreinigungsstrategien und 3) diagnostischen Anwendungen. In Bezug auf Absuchstrategien liefern Expressionsclonierungsstrategien, basierend auf Zellüberlebens- und Proliferationstests, ein Verfahren zur Suche nach verwandten Liganden (Class, et al., 1991, Cell 66: 405–413). Da Liganden, die MuSK binden, membrangebunden sein können, können andere Strategien zur Suche nach solchen Rezeptoren besser geeignet sein (Armitage, et al., 1992, Nature 357: 80–82; Smith, et al., 1993, Cell 73: 1349–1360). In bevorzugten Ausführurigsformen ist die extrazelluläre Domäne von MuSK mit einem Marker fusioniert, um ein chimäres Protein zu schaffen, das die Identifikation und Reinigung der extrazellulären Domäne, wenn sie an einen verwandten Liganden gebunden ist, ermöglicht.
Weiterer Einblick in die physiologische Rolle von MuSK wird aus der weiteren Definition des aktivierenden Moleküls der vorliegenden Erfindung kommen. Die Kinasedomäne des MuSK-Rezeptors scheint mit anderen Rezeptortyrosinkinasen verwandt zu sein, daher ist es wahrscheinlich, dass der MuSK-Rezeptor an der Signaltransduktion in Zellen, in denen er exprimiert wird, beteiligt ist. Entsprechend kann das MuSK aktivierende Molekül der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Signaltransduktion nicht nur in natürlich vorkommenden MuSK exprimierenden Zellen zu induzieren, die in Muskelgewebe, Herz, Milz, Eierstock und Retina vorkommende Zellen einschließen, sondern auch in Zellen, die verändert wurden, um den MuSK-Rezeptor zu exprimieren. Das MuSK aktivierende Molekül der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um das Wachstum oder das Überleben solcher Zellen zu fördern.
Der Begriff „MuSK aktivierendes Molekül", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors in einer differenzierten Muskelzelle induzieren kann. Ein solches aktivierendes Molekül ist Agrin, wie in den hier dargelegten Beispielen beschrieben.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff „MuSK aktivierendes Molekül" hier beschriebene, den isolierten und gereinigten MuSK-Rezeptor aktivierende Polypeptide ein sowie funktionell äquivalente Moleküle, in denen Aminosäurereste durch Reste in der Sequenz ersetzt werden, die zu einem stillen Austausch führen. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine anderen Aminosäure einer ähnlichen Polarität ausgetauscht werden, die als ein funktionelles Äquivalent agiert, was zu einer stillen Veränderung führt. Ersatz für eine Aminosäure in der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Auch im Rahmen der Erfindung eingeschlossen sind Proteine oder Fragmente (Teile) oder Derivate davon, die die gleiche oder ähnliche biologische Aktivität zeigen, und Derivate, die während oder nach der Translation verschieden verändert wurden, z. B. durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden, etc..
Die Erfindung liefert weiter ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das den Teil des menschlichen Agrins codiert, der den MuSK-Rezeptor aktiviert, wobei die Nucleotidsequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) der Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 60 bis 492 codiert;
(b) einer Nucleotidsequenz, die sich von der Nucleotidsequenz von (a) unterscheidet durch die Abwesenheit eines Inserts, das dem Insert an Position Y in 15 entspricht, und/oder durch die Abwesenheit eines Inserts, das dem Insert an Position Z in 15 entspricht, und/oder durch die Anwesenheit einer Nucleinsäure, die ein weiteres Insert codiert, das die Aminosäuresequenz VLSASHPLTVSGASTPR hat, die unmittelbar auf das Insert an Position Y in 15 folgt;
(c) einer Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz von (a) oder (b) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das im Wesentlichen die gleiche Anzahl von Aminosäuren besitzt und das den MuSK-Rezeptor aktiviert; und
(d) einer Nucleotidsequenz, die sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen (a), (b) oder (c) unterscheidet und die ein Polypeptid codiert, das den MuSK-Rezeptor aktiviert.

Die Erfindung liefert weiter ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die den aktiven Teil des menschlichen Agrins codiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 60 bis 492 codiert;
(b) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 76 bis 492 codiert;
(c) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 126 bis 492 codiert;
(d) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 178 bis 492 codiert;
(e) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 222 bis 492 codiert;
(f) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 260 bis 492 codiert; und
(g) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 300 bis 492 codiert.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das Agrin 0-8 codiert, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den aktiven Teil von menschlichem Agrin codiert, wobei die Nucleotidsequenz ein Teil der in 15 dargestellten Sequenz ist, mit der Ausnahme, dass es kein Insert an Position Y gibt. Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das Agrin 4-0 codiert, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den aktiven Teil des menschlichen Agrins codiert, wobei die Nucleotidsequenz ein Teil der in 15 dargestellten Sequenz ist, mit der Ausnahme, dass es kein Insert an Position Z gibt.
Die vorliegende Erfindung liefert ein isoliertes Polypeptid, das von irgendeinem der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung, wie hier dargelegt, codiert wird. Weiter liefert die vorliegende Erfindung die durch kovalentes Anhängen eines Polyethylenglykolmoleküls veränderten Polypeptide.
Folglich liefert die vorliegende Erfindung verkürzte Formen des menschlichen Agrinpolypeptids, die den MuSK-Rezeptor aktivieren. Wie hier dargelegt, liefert die Erfindung auch Nucleinsäuresequenzen, die solche verkürzten Formen codieren. Diese verkürzten Formen behalten die Fähigkeit, die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors zu induzieren.
In Bezug auf 15, beginnend am N-terminalen Ende (Aminosäuren 24-KSPC), besitzen diese verkürzten Formen von menschlichem Agrin bevorzugt Deletionen von bis zu 40, 50, 100, 150, 200 oder 250 Aminosäuren. Besonders bevorzugte verkürzte Formen werden hier als Delta 3 bis Delta 9 beschrieben.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Förderung des Wachstums oder Überlebens einer den MuSK-Rezeptor exprimierenden Zelle in Kultur, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge an Agrin oder eines Derivats von Agrin an die MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist Agrin menschliches Agrin. In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist die den MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle eine Zelle, die normalerweise in Herz, Milz, Eierstock oder Retina gefunden wird. In einer anderen Ausführungsform ist die den MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle eine Zelle, die genetisch verändert wurde, um den MuSK-Rezeptor zu exprimieren.
Muskelkrankheiten oder neuromuskuläre Störungen können durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines aktiven Teils von Agrin oder eines Derivats davon an den Patienten behandelt werden. Der aktive Teil des menschlichen Agrinmoleküls kann irgendeines der verkürzten Fragmente (Teile) des menschlichen Agrins sein, wie hier beschrieben, der die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors induzieren kann.
Insbesondere können Muskelkrankheiten oder neuromuskuläre Störungen durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines aktiven Teils von Agrin oder eines Derivats davon zusammen mit dem Ziliaren Neurotrophen Faktor (CNTF) oder dem veränderten Ziliaren Neurotrophen Faktor an den Patienten behandelt werden, wie in dem Patent Nr. 5,349,056 der Vereinigten Staaten beschrieben ist, erteilt am 20. September 1994 an Panayotatos.
Monoclonale oder polyclonale Antikörper, die den aktiven Teil von menschlichem Agrin spezifisch binden können, können verwendet werden, um die Anwesenheit von menschlichem Agrin in einer Probe nachzuweisen durch:

(a) Reaktion der Probe mit einem Antikörper, der menschliches Agrin unter Bedingungen spezifisch binden kann, in denen der Antikörper in der Probe vorhandenes menschliches Agrin bindet; und
(b) Nachweis des gebundenen Antikörpers, dadurch Nachweis der Anwesenheit von menschlichem Agrin in der Probe.

Der verwendete Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Die Probe kann biologisches Gewebe oder Körperflüssigkeit sein. Das biologische Gewebe kann Gehirn, Muskel oder Rückenmark sein. Die Körperflüssigkeit kann Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, Speichel, Blut oder eine Blutfraktion wie Serum oder Plasma sein.
Der hier beschriebene cDNA-Clon, der den aktiven Teil von menschlichem Agrin codiert, wird das Absuchen von cDNA und genomischen Banken erleichtern, um die Vollängen-Sequenz, die das ganze menschliche Agrinmolekül codiert, zu clonieren. Die Zellen können genetisch verändert sein, um den aktiven Teil oder das Vollängen-Agrinmolekül herzustellen, z. B. durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation, Mikroinjektion, über ein transgenes Tier einer Nucleotidsequenz, die den aktiven Teil oder das Vollängen-Agrinmolekül in einem geeigneten Expressionsvektor codiert. Die Erfindung liefert auch einen Vektor, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst, das einen aktiven Teil oder das menschliche Vollängen-Agrinmolekül codiert.
Die Erfindung liefert weiter ein Wirts-Vektor-System zur Herstellung eines Polypeptids, das die biologische Aktivität von menschlichem Agrin besitzt, in einer geeigneten Wirtszelle. Die geeignete Wirtszelle kann eine bakterielle Zelle wie E. coli, eine Hefezelle wie Pichia pastoris, eine Insektenzelle wie Spodoptera frugiperda oder eine Säugerzelle wie eine COS- oder CHO-Zelle sein. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die biologische Aktivität von menschlichem Agrin besitzt, umfassend das Züchten von Zellen des Wirts-Vektor-Systems unter Bedingungen, die die Herstellung des Polypeptids und die Gewinnung des so hergestellten Polypeptids erlauben.
Die Erfindung liefert weiter einen Expressionsvektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das menschliches Agrin oder einen Teil davon codiert, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist. Die Erfindung liefert auch ein Wirts-Vektor-System zur Herstellung eines Polypeptids, das die biologische Aktivität von menschlichem Agrin besitzt, umfassend den Expressionsvektor der Erfindung in einer geeigneten Wirtszelle. Die geeignete Wirtszelle kann eine bakterielle Zelle wie E. coli, eine Hefezelle wie Pichia pastoris, eine Insektenzelle wie Spodoptera frugiperda, oder eine Säugerzelle wie eine COS- oder CHO-Zelle sein. Die Erfindung liefert weiter ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die biologische Aktivität von menschlichem Agrin besitzt, umfassend das Züchten von Zellen des Wirtsvektorsystems der Erfindung unter Bedingungen, die die Herstellung des Polypeptids erlauben, und die Gewinnung des so hergestellten Polypeptids.
Jedes der dem Fachmann bekannten Verfahren zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu entwerfen. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA und synthetische Techniken und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression der Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, kann durch eine zweite Nucleotidsequenz reguliert sein, so dass das Polypeptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expression des Polypeptids durch jeden im Fachgebiet bekannten Promotor/Enhancer kontrolliert sein. Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression zu kontrollieren, schließen die folgenden Promotoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt: die lange terminale Wiederholung, wie in Squinto et al. (1991, Cell 65: 1–20) beschrieben, den frühen SV40-Promotorbereich (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den CMV-Promotor, die 5'-terminale M-MuLV-Wiederholung, den in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus enthaltenen Promotor (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster, et al., 1982, Nature 296: 39–42), prokaryotische Expressionsvektoren wie der β-Lactamasepromotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25); Vgl. auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie der Gal4-Promotor, ADH- (Alkoholdehydrogenase) Promotor, PGK- (Phosphoglycerinkinase) Promotor, Alkalische Phosphatase-Promotor und die folgenden tierischen transkriptionalen Kontrollbereiche, die Gewebsspezifität besitzen und in transgenen Tieren verwendet wurden: Elastase I-Genkontrollbereich, der in Pankreas-Acinarzellen aktiv ist (Swift, et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz, et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515), Insulin-Genkontrollbereich, der in Pankreas-Betazellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), Immunglobulin-Genkontrollbereich, der in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl, et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames, et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander, et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), Brusttumorvirus-Kontrollbereich der Maus, der in Testis-, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder, et al., 1986, Cell 45: 485–495), Albumin-Genkontrollbereich, der in Leber aktiv ist (Pinkert, et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), Alpha-Fetoprotein-Genkontrollbereich, der in Leber aktiv ist (Krumlauf, et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer, et al., 1987, Science 235: 53–58), Alpha-l-Antitrypsin-Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist (Kelsey, et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), Beta-Globin-Genkontrollbereich, der in Myeloidzellen aktiv ist (Mogram, et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias, et al., 1986, Cell 46: 89–94), Basisches Myelinprotein-Genkontrollbereich, der in Oligodendrocytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead, et al., 1987, Cell 48: 703–712), Genkontrollbereich der leichten Kette-2 des Myosins, der in Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314: 283–286) und gonadotropin-Freisetzungshormon-Genkontrollbereich, der im Hypothalamus aktiv ist (Mason, et al., 1986, Science 234: 1372–1378).
Expressionsvektoren, die Geninserts enthalten, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen, und (c) Expression inserierter Sequenzen. Im ersten Ansatz kann die Anwesenheit eines fremden Gens, das in einen Expressionsvektor eingefügt wurde, durch DNA-DNA-Hybridisierung mittels Sonden, die Sequenzen umfassen, die zu einem inserierten Gen homolog sind, nachgewiesen werden. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem identifiziert und selektiert werden, auf der Grundlage der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Antibiotikaresistenzen, Transformationsphänotyp, Einschluss-körperbildung in Baculovirus, etc.), die durch die Insertion fremder Gene in den Vektor verursacht werden. Zum Beispiel können, wenn das fremde Gen in die Markergensequenz des Vektors einfügt wurde, Rekombinante, die das Geninsert enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Im dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Test auf das fremde Genprodukt, das durch den rekombinanten Vektor exprimiert wird, identifiziert werden. Solche Tests können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionalen Eigenschaften des Rezeptor codierenden Genprodukts basiert werden, zum Beispiel durch Bindung des Rezeptors an neurotrophen Faktor oder einen Antikörper, der den Rezeptor direkt erkennt. Zellen der vorliegenden Erfindung können transient oder bevorzugt konstitutiv und permanent das Polypeptid der Erfindung exprimieren.
Wie vorstehend beschrieben, scheint der MuSK-Tyrosinkinaserezeptor in denerviertem Muskel exprimiert zu sein. Sonden, die diese Rezeptoren erkennen können, können verwendet werden, um Krankheiten oder Störungen durch Messen veränderter Mengen des Rezeptors in Zellen und Geweben zu identifizieren. Solche Krankheiten oder Störungen können ihrerseits durch Verwendung des hier offenbarten aktivierenden Moleküls behandelt werden. Solche Störungen schließen folgende ein, sind aber nicht auf solche beschränkt, in denen atrophe oder dystrophe Veränderungen von Muskel der grundlegende pathologische Befund sind. Zum Beispiel kann Muskelatrophie aus Denervation (Verlust des Kontakts des Muskels mit seinem Nerv) aufgrund von Nervenverletzung, degenerativer, metabolischer oder inflammatorischer Neuropathie (z. B. Guillian-Barre-Syndrom), peripherer Neuropathie oder Nervenverletzung, die durch Umweltgifte oder Arzneistoffe verursacht wird, resultieren. In einer anderen Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie aus Denervation aufgrund einer Motoneuronopathie. Solche Motoneuronopathien schließen folgende ein, sind aber nicht auf sie beschränkt: erwachsene Motoneuronkrankheit, einschließlich Amyotrophe Lateralsklerose (ALS oder Lou Gehrig's Krankheit); Kinder- oder Jugend-Spinalmuskularatrophien und Autoimmunmotoneuropathien mit multifokalem Leitungsblock. In einer anderen Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie aus chronischem Nichtgebrauch. Solche Nichtgebrauchsatrophie kann aus Bedingungen resultieren, die folgende einschließen, aber nicht auf sie beschränkt sind: Paralyse aufgrund von Herzinfarkt, Rückenmarksverletzung, Skelettimmobilisierung aufgrund einer Verletzung (wie Bruch, Verstauchung oder Verrenkung) oder längere Bettruhe. In noch einer anderen Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie aus metabolischem Stress oder Unternährung, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Auszehrung durch Krebs und andere chronische Krankheiten, Fasten oder Rhabdomyolyse, endokrine Erkrankungen wie Erkrankungen der Schilddrüse und Diabetes, aber nicht darauf beschränkt. Die Muskelatrophie kann auch aus einem Muskelatrophiesyndrom resultieren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, des Duchenne-Syndroms, Becker-Syndroms, Myotonie, Fascioscapulohumeral-Syndrom, Emery-Dreifuss, oculopharyngeale Krankheit, scapulohumerale Krankheit, Gürtelrose und angeborene Syndrome und die Dystrophie, die als Erbliche Distale Myopathie bekannt ist. In einer weiteren Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie aus einer angeborenen Myopathie, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Gutartige Angeborene Hypotonie, Zentrale Kern-Krankheit, Nemalin-Myopathie und Myotubuläre (centronucleäre) Myopathie. Zusätzlich kann MuSK und sein assoziierter Ligand zur Behandlung von erworbenen (toxischen oder inflammatorischen) Myopathien verwendet werden. Myopathien, die aus einer inflammatorischen Krankheit des Muskels resultieren, schließen Polymyositis und Dermatomyositis ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Toxische Myopathien können aufgrund von Agenzien resultieren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Adiodaron, Chloroquin, Clofibrat, Colchicin, Doxorubicin, Ethanol, Hydroxychloroquin, Organophosphate, Perihexilin und Vincristin.
Obwohl die Anmelder nicht an eine Theorie gebunden sein wollen, zeigte eine vorläufige Kartierung des musk in der Maus, dass dieses Gen auf dem Chromosom 4 der Maus in einem Bereich, der mit dem menschlichen Chromosom 9q homolog ist, lokalisiert ist. Mutationen in Mäusen, die mit diesem Bereich von Chromosom 4 assoziiert sind, schließen die "wi"-Mutation (whirler) ein, die in Symptomen des Shaker-Syndroms resultiert, einschließlich Taubheit, Kopfschütteln, Kreisen und Hyperaktivität (Lane, P. W., 1963, J. Hered. 54: 263–266). Eine andere Mutation in Mäusen, die mit diesem Bereich von Chromosom 4 assoziiert ist, ist die "vc"-Mutation (vacillans), die mit den Symptomen des heftigen Zitterns beim Laufen und Schwankens der Hinterbeine assoziiert ist (Sirlin, J. L., 1956, J. Genet. 54: 42–48).
Im Menschen ist die Krankheit, die als idiopathische Torsionsdystonie (ITD) bekannt ist, mit einem Gen assoziiert, das mittels Nachbarschaftsanalyse auf dem menschlichen Chromosom 9q, Bande 34 kartiert wurde. Diese Krankheit ist durch ständige unfreiwillige Muskelkontraktionen gekennzeichnet, die häufig Verzerrungen und wiederholte Bewegungen oder abnormale Haltungen verursachen.
Die vorliegende Erfindung kann, wo angezeigt, in der Gentherapie zum Ersatz des menschlichen Agrin-Gens in situ verwendet werden.
Jedes der dem Fachmann bekannten Verfahren zum Transfer von Genen in Skelettmuskelgewebe kann in Agrin-Gentherapieprotokollen verwendet werden. Als nichteinschränkendes Beispiel kann der Fachmann direkte Injektion nackter DNA in Muskelgewebe, Adenovirus assoziierten Gentransfer, primäre Myoblastentransplantation oder kationischen Liposomen:DNA-Komplex-Gentransfer verwenden.
Zum Beispiel kann direkte Injektion von DNA in Muskel verwendet werden, um die Vektorkonstruktion zu optimieren, wie von Manthorpe et al. (1993, Hum. Gene Ther. 4: 419–431) beschrieben, wobei kovalent geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA, die das Leuchtkäfer-Luciferase-Reportergen codiert, in Skelettmuskel von erwachsenen Mäusen injiziert wurde, um die Wirksamkeit verschiedener regulatorischer Elemente, die im DNA-Expressionsvektor enthalten sind, zu beurteilen. In einer biologischen Studie wurden die systemischen immunologischen Wirkungen von Cytokingenen mittels direkter Injektion von DNA, die die Gene für IL-2, IL-4 oder TGF-β-1 codiert (Raz, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4523–7), in Muskel beurteilt. Eine andere Studie testete die Fähigkeit des menschlichen Kallikrein-Genprodukts, den Blutdruck in Ratten mit spontan hohem Blutdruck nach direkter DNA-Injektion von menschlichem Kallikrein-Gen in Skelettmuskel der Maus zu verringern (Mong, et al., 1995).
Plasmid-DNA, komplexiert mit kationischen Lipiden, wurde ebenfalls auf ihre Fähigkeit, Gene in Muskelgewebe zu transportieren, getestet. Trivedi, et al. (1995, J. Neurochem. 64: 2230–38) führten in vitro-Studien durch, die polykationische Liposomen verwendeten, um das Reportergen LacZ erfolgreich in die kultivierte Myoblastenzellinie C2C12 der Maus und in primäre Myoblasten der Maus, die von normalen und mdx-Mäusen stammten, zu transportieren, wobei diese Studien die Grundlage zur Anpassung an die Gentherapie in vivo bilden.
Gemäß der Erfindung können der aktive Teil von Agrin oder Fragmente davon als ein Immunogen verwendet werden, um anti-Agrin-Antikörper herzustellen. Durch Ermöglichen der Herstellung relativ reichlicher Mengen an Protein mittels rekombinanter Techniken zur Proteinsynthese (basierend auf den Nucleotidsequenzen der Erfindung) wurde das Problem begrenzter Mengen an Protein beseitigt.
Um weiter die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung einer anti-Agrin-Immunantwort zu verbessern, kann die Aminosäuresequenz des aktiven Teils von Agrin analysiert werden, um testeten Adenovirus vermittelten Transfer von Vollängen- und verkürzten Formen des Dystrophingens in Muskel von normalen und mdx-Mäusen.
Transplantation von retroviral transformierten primären Myoblasten, die rekombinante Gene exprimieren, in Skelettmuskelgewebe wurde auch intensiv als ein möglicher Ansatz zur Gentherapie für Muskel- als auch Nicht-Muskel-Krankheiten untersucht. Es ist bekannt, dass der Erfolg der Myoblastentransplantation zur Korrektur intrinsischer Muskeldefekte von der Fähigkeit der transplantierten Myoblasten, mit den Wirtsmyofasern zu fusionieren, abhängt. Um diesen Punkt zu adressieren, entwickelten Rando & Blau (1994, J. Cell. Biol. 125: 1275–87) ein neues Kultursystem zur Isolierung angereicherter und clonaler Populationen primärer Myoblasten. Es wurde gezeigt, dass durch dieses Verfahren isolierte Myoblasten wirksam mit Wirtsmyofasern fusionieren, um Hybridmyofasern zu bilden, die bis zu sechs Monaten bestehen, gezeigt durch die β-Galactosidase-Reportergenexpression. Da Immunabstossung transplantierter Myoblasten ein mögliches Problem in diesem Gentherapieansatz ist, wurde dieses Problem in Studien angesprochen, die autologe versus heterologe Myoblasten zur Transplantation (Huard, et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5: 949–58) und mit Cyclosporin A induzierte Immunsuppression in erwachsenen Mäusen, die Myoblasten-Transplantate nach Muskelverletzung erhalten (Irintchev, et al., 1995, J. Neurocytol. 24: 319–331), vergleichen. Repräsentative Krankheitsziele zur Gentherapie, die Myoblasten-Transplantation verwenden, schließen Hämophilie B, bei der zirkulierender Faktor IX des Menschen oder des Hundes im Plasma von Mäusen nach Transplantation rekombinanter Myoblasten in Skelettmuskeln von normalen und SCID-Mäusen gemessen wurde (Roman, et al., 1992, Somat. Cell. Mol. Genet. 18: 247–58; Dai, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892–5; Yao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3357–61; Yao, et al., 1994, Gene Ther. 1: 99–107) und primäre Myopathien wie Duchenne Muskuläre Dystrophie ein, bei der Myoblasten, die das Dystrophin-Gen exprimieren, in normale und mdx-Mäuse transplantiert wurden (Partridge, et al., Nature 337: 176–9; Sopper, et al., 1994, Gene Ther. 1: 108–113).
Plasmid-DNA, komplexiert mit kationischen Lipiden, wurde ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Gene in Muskelgewebe zu transportieren. Trivedi, et al. (1995, J. Neurochem. 64: 2230–38) führten in vitro-Studien durch, die polykationische Liposomen verwendeten, um das Reportergen LacZ erfolgreich in die kultivierte Myoblastenzellinie C2C12 der Maus und in primäre Myoblasten der Maus, die von normalen und mdx-Mäusen stammten, zu transportieren, wobei diese Studien die Grundlage zur Anpassung an die Gentherapie in vivo bilden.
Gemäß der Erfindung können der aktive Teil von Agrin oder Fragmente oder Derivate davon als Immunogen verwendet werden, um anti-Agrin-Antikörper herzustellen. Durch Herstellung relativ reichlicher Mengen an Protein mittels rekombinanter Techniken zur Proteinsynthese (basierend auf den Nucleotidsequenzen der Erfindung) wurde das Problem begrenzter Mengen an Protein beseitigt.
Um weiter die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung einer anti-Agrin-Immunantwort zu verbessern, kann die Aminosäuresequenz des aktiven Teils von Agrin analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die mit erhöhter Immunogenität assoziiert sind. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz der Computeranalyse unterzogen werden, um Oberflächenepitope zu identifizieren, die Computer erzeugte Darstellungen der Hydrophilie, Oberflächen-wahrscheinlichkeit, Flexibilität, des antigenen Index, der amphiphilen Helix, des amphiphilen Blatts und der Sekundärstruktur darstellen. In einer anderen Ausführungsform könnten abgeleitete Aminosäuresequenzen verschiedener Arten verglichen werden und relativ nicht-homologe Bereiche identifiziert werden; diese nicht-homologen Bereiche wären wahrscheinlicher in verschiedenen Arten immunogen.
Zur Herstellung monoclonaler Antikörper gegen den aktiven Teil von Agrin kann jede Technik verwendet werden, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch fortlaufende Zellinien in Kultur ermöglicht. Zum Beispiel liegen die Hybridom-Technik, ursprünglich entwickelt von Köhler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497) sowie die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor, et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridom-Technik, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole, et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. S. 77–96), und dergleichen im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Monoclonale Antikörper, hergestellt gemäß der Erfindung zur therapeutischen Verwendung, können menschliche monoclonale Antikörper oder monoclonale chimäre Mensch-Maus- (oder andere Arten) Antikörper sein. Menschliche monoclonale Antikörper können mittels jeder von zahlreichen, im Fachgebiet bekannten Techniken hergestellt werden (z. B. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 7308–7312; Kozbor, et al., 1983, Immunology Today 4: 72–79; Olsson, et al, 1982, Meth. Enzymol. 92: 3–16). Chimäre Antikörpermoleküle, enthaltend eine Antigen-bindende Domäne der Maus mit konstanten Bereichen des Menschen, können hergestellt werden (Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851; Takeda, et al., 1985, Nature 314: 452).
Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung polyclonaler Antikörper verwendet werden. Zur Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit Protein oder einem Fragment oder Derivat davon, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Kaninchen, Mäuse, Ratten, etc., immunisiert werden. Verschiedene Adjuvantien können verwendet werden, um die Immunantwort zu erhöhen, abhängig von der Wirtsart, und einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Freundsches Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH („keyhole limpet hemocyanin"), Dinitrophenol und möglicherweise brauchbare menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacille-Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Ein molekularer Clon eines Antikörpers gegen ein Agrin-Epitop kann mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Rekombinante DNA-Methoden (vgl. z. B. Maniatis, et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) können verwendet werden, um Nucleotidsequenzen zu entwerfen, die ein monoclonales Antikörpermolekül oder den Antigen-bindenden Bereich davon codieren.
Antikörpermoleküle können mittels bekannter Techniken gereinigt werden, z. B. Immunabsorptions- oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Methoden wie HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatogaphie) oder eine Kombination davon, etc..
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um Fragmente von Antikörpermolekülen herzustellen. Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente folgende ein, sind aber nicht auf diese beschränkt: das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsin-Spaltung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem reduzierenden Agens hergestellt werden können.
BEISPIEL 1 – HOMOLOGE REKOMBINATION, UM DAS MuSK-GEN ZU UNTERBRECHEN
Die Tyrosinkinasedomäne von MuSK umfasst 11 Subdomänen, die sich auf drei codierende Exons aufteilen. Subdomäne I, die die ATP bindende Domäne codiert, befindet sich auf dem ersten Kinase-Exon, während die Subdomänen 5–11, die den katalytischen Bereich codieren, sich auf dem dritten Kinase-Exon befinden (5). Um die MuSK-Tyrosinkinaseaktivität zu unterbrechen, wurde ein Steuerungs-Vektor entworfen, der den größten Teil des dritten Kinase-Exons nach homologer Rekombination mit dem endogenen MuSK-Locus der Maus entfernen würde (5); dieser Steuerungs-Vektor enthielt eine Gesamtheit von 3.8 kb homologer Region mit dem MuSK-Gen der Maus.
Der MuSK-Ansteuerungs-Vektor wurde aus genomischen DNA-Fragmenten der Maus entworfen, die aus einer Lambda FIX II Phagen-Genbank, hergestellt mit genomischer DNA der Maus vom Stamm 129 (Stratagene), isoliert wurden. Das 1.7 kb-SpeI-Fragment, dargestellt in 5, wurde in die kompatiblen Enden einer einmal vorkommenden XbaI-Stelle stromaufwärts der PGK-Neo-Kassette ligiert (wobei die SpeI- und die XbaI-Stellen zerstört wurden), während das 2.1 kb-BamHI-DNA-Fragment, dargestellt in 5, mit glatten Enden in die einmal vorkommende HindIII-Stelle zwischen die PGK-Neo-Kassette und MCl-tk-Expressionskassetten ligiert wurde (wobei die BamHI- und die HindIII-Stellen zerstört wurden). Der Targeting-Vektor wurde durch Spaltung mit NotI linearisiert und dann in embryonale E14.1-Stammzellen durch Elektroporation übertragen, die einem zweifachen Selektionsprotokoll unterzogen (Gancyclovir-Zugabe resultierte in einer 5–10fachen Anreicherung, verglichen mit einer Selektion in G418 allein) und dann verwendet wurden, um chimäre Mäuse herzustellen, wie zuvor beschrieben (Conover, et al., 1995; DeChiara, et al., 1995).
Es wurde vorhergesagt, dass erfolgreiche Gensteuerung mit diesem Konstrukt in der Erzeugung eines neuen 3.8 kb-EcoRI-Fragmentes des angesteuerten Allels, wie mit einer 5'-Sonde nachgewiesen, sowie dem Verlust von zwei NcoI-Fragmenten resultiert, die mit der Kinase-Sonde hybridisieren (5). Das testen auf diese Fragmente mittels des Southern-Blot-Verfahrens enthüllte, dass eine erfolgreiche Ansteuerung des MuSK-Gens der Maus in vier von etwa 400 embryonalen Stamm(ES)zellclonen erreicht wurde, die mittels eines doppelten Selektionsschemas erhalten wurden, das zur Verstärkung der Selektion angesteuerter Clone führen sollte; die ES-Zellen waren aus dem 129-Stamm der Maus. Männliche Chimären, die von allen vier dieser angesteuerten Clone stammten, wurden mit C57BL/6-Weibchen verpaart. Chimäre von zwei der angesteuerten Clone gaben das mutierte Allel an die F1-Generation weiter. Die resultierenden F1-Nachkommen, heterozygot für die MuSK-Mutation, waren lebensfähig und erschienen normal und fruchtbar.
BEISPIEL 2 – MuSK-GENUNTERBRECHUNG RESULTIERT IN PERINATALER LETALITÄT
Die heterozygoten F1-Nachkommen wurden miteinander verpaart, um Mäuse zu erzeugen, die homozygot für die MuSK-Genunterbrechung waren (bezeichnet als MuSK-/--Mäuse). Unter den F2-Würfen, die von den Kreuzungen stammten, waren neugeborene Mäuse, die perinatal starben. Genotypanalyse der Schwanz-DNA der Mäuse zeigte, dass die toten Jungen homozygot für das mutierte MuSK-Allel waren (6); bezeichnenderweise überlebte keine einzige Maus den perinatalen Zeitraum, die homozygot für die Mutation war (37 Homozygote wurden festgestellt unter den ersten 138 jungen, die genotypisiert wurden, entsprechend einer 26.8%igen Häufigkeit von Homozygoten).
Um den Phänotyp der MuSK-/--Neugeborenen sofort bei Geburt zu bestimmen, waren die Anmelder vorsichtig, indem sie die Geburten von mehreren Würfen, die von heterozygoten Kreuzungen stammten, beobachteten. Obwohl sie normal in ihrer groben Anatomie und ihrem Körpergewicht waren, unterschieden sich die MuSK-/--Jungen in mehreren auffälligen Weisen von ihren Wurfkontrollen. Erstens zeigten sie keine spontane Bewegung und antworteten nicht auf einen sanften Kniff in Schwanz oder Fuss. Nur ein starker Kniff in den Schwanz konnte eine schwache unkoordinierte Bewegung hervorrufen. Dagegen zeigten Wurfkontrollen intensive Bewegung und antworteten kräftig auf einen milden Kniff in den Schwanz. Zweitens waren die MuSK-/--Jungen zyanotisch bei Geburt und schienen nicht zu atmen, obwohl ihre Herzen für eine kurze Zeit nach der Geburt weiter schlugen. Um zu bestimmen, ob die MuSK-/--Jungen jemals einen Atemzug gemacht hatten, untersuchten die Anmelder die Lungen histologisch. Die Lungenalveoli sind in utero kollabiert und expandieren mit dem ersten Atemzug des Lebens; wenn die Atmung dann beendet ist, bleiben die Alveoli ausgedehnt.
Die histologische Untersuchung (7A) zeigte, dass die Alveoli von MuSK-/--Jungen nicht expandiert waren, was andeutete, dass die Jungen nie einen Atemzug getan hatten. Dagegen zeigten die Lungen der Wurfkontrollen expandierte Alveoli (7B).
BEISPIEL 3 – NORMALER SKELETTMUSKEL IN MuSK-/--MAUS
Da MuSK sich an synaptischen Stellen im Skelettmuskel befindet (Valenzuela, D., et al., 1995, Neuron 15: 573–584) und da mutierte MuSK-/--Mäuse bei Geburt nicht beweglich sind und kurz danach sterben, überlegten die Anmelder, dass die neuromuskuläre Synapsenbildung in MuSK-/--Mutanten unnormal sein könnte. Die Anmelder untersuchten zuerst den Diaphragma-Muskel, da seine einfache Organisation und seine dünne Struktur es erlauben, synaptische Stellen in ihrer Gesamtheit präparierten Präparationen sichtbar zu machen. Der Diaphragma-Muskel wird durch den phrenischen Nerv innerviert, der normalerweise nahe des Zentrums des Diaphragma-Muskels eintritt. Der hauptsächliche intramuskuläre Nerv ist senkrecht zur Längsachse der Muskelfasern orientiert und erstreckt sich durch den zentralen Bereich des Muskels.
Für die in ihrer Gesamtheit präparierten Diaphragma-Präparationen wurden neugeborene Mäuse in 1% Paraformaldehyd in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4°C für mehrere Stunden fixiert und darin kurz in PBS gewaschen. Die Diaphragma-Muskeln wurden herauspräpariert, zweimal für 10 Minuten in PBS gewaschen, in 0.1 M Glycin in PBS für 15 Minuten inkubiert, für 5 Minuten in PBS gespült und mit 0.5% Triton X-100 in PBS (PBT) für 5 Minuten permeabilisiert. Die Muskeln wurden dann mit Kaninchen-Antikörpern gegen Synaptophysin (freundlicherweise von Dr. R. Jahn, Yale University Medical School, zur Verfügung gestellt), die 1/1000 in PBT mit 2% BSA verdünnt wurden, über Nacht bei 4°C inkubiert, anschließend für 5 Minuten in PBT gespült, dreimal für eine Stunde in PBT gewaschen und dann gleichzeitig mit Fluorescein konjugiertem Schaf-anti-Kaninchen IgG (Boehringer Mannheim) und Tetramethylrhodamin konjugiertem α-Bungarotoxin (α-BGT) (Molecular Probes, Oregon) über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Gewebe wurden dann dreimal für 1 Stunde mit PBT gewaschen, einmal mit PBS für 5 Minuten gespült, in 100% Methanol bei –20°C fixiert und in 90% Glycerol, 0.1 M Tris, pH 7.5 mit 1 mg/ml p-Phenylendiamin aufgezogen. Die in ihrer Gesamtheit präparierten Präparationen wurden mit Epifluoreszenz und Filtern angeschaut, die für Rhodamin oder Fluorescein selektiv waren, und Bilder wurden entweder auf Film oder mit einer CCD-Kamera (Princeton Instruments) aufgenommen.
Die Anordnung und grobe Struktur der Muskelfasern (vergleiche 7C und 7D) sowie des hauptsächlichen intramuskulären Nervs schienen in mutierten MuSK-/--Mäusen unverändert zu sein. Folglich, obwohl das Anschalten der MuSK-Expression etwa am embryonalen Tag 11 in sich entwickelnden Somiten der Maus (im mutmaßlichen Myotom) erfolgt, scheint MuSK nicht notwendig für die Schaffung, Proliferation und Fusion von Myoblasten oder für das Wachstum der Motoaxone vom Rückenmark zum Muskel zu sein.
BEISPIEL 4 – AGRIN KANN DIE AChR-GRUPPIERUNG IN MYOTUBEN, DIE KEINE MuSK BESITZEN, NICHT INDUZIEREN
Die Lokalisation von MuSK an der NMJ regte uns an, zu fragen, ob MuSK für die Ansprechbarkeit auf Agrin notwendig ist. Um das zu testen, isolierten die Anmelder zuerst Myoblasten aus neugeborenen MuSK-/-Mäusen oder von Kontrolljungen, versuchten, sie in Myotuben in Kultur zu differenzieren, und testeten dann ihre Ansprechbarkeit auf Agrin.
Primäre Myoblasten-Kulturen wurden aus der Muskulatur des Hinterbeins von neugeborenen MusK-/-- oder Wurfkontroll-Jungen angelegt. Das Gewebe wurde aufeinanderfolgend mit Kollagenase und Trypsin behandelt, dann auf Plastik-Gewebekulturschalen plattiert. Nach 1 Stunde wurden nicht-anhaftende Zellen (vor allem Myoblasten) entfernt und auf Kammer-Objektträger, beschichtet mit Poly-D-Lysin und Fibronectin, plattiert. Myoblasten-Kulturen wurden in Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 25% fötales Kälberserum, 10% Pferdeserum und 50 μg/ml Gentamycin, gehalten. Um die Myotuben-Bildung zu induzieren, wurden die Kulturen in ein Medium überführt, das aus DMEM, enthaltend 5% Pferdeserum, L-Glutamin und Gentamycin, besteht, zu dem 20 μM Cytosinarabinosid nach 24 h zugegeben wurden. Nach zusätzlichen 2–3 Tagen hatten sich kontraktile Myotuben reichlich in den Kulturen von sowohl MuSK-/-- als auch den Kontroll-Jungen gebildet. C2C12-Zellen wurden in einem Serum-armen Medium gehalten und zur Differenzierung veranlasst, wie zuvor beschrieben (Ferns, M., et al., 1993, Neuron 11: 491–502).
Für Agrin vermittelte AChR-Gruppierungstests auf primären Myotuben wurden die Kulturen auf Kammer-Objektträgern über Nacht mit c-Agrin4,8 bei 0.01–100 nM behandelt; zur Beurteilung von MuSK-Fc als einen Inhibitor der Gruppierung wurden differenzierte C2C12-Zellen auf Kammer-Objektträgern, beschichtet mit Fibronectin und Poly-D-Lysin, mit MuSK-Fc oder einem Kontroll-Rezeptorkörper für 1 h bei 37°C vorbehandelt vor der Zugabe von etwa 10 nM Agrin4,8 zur Übernachtinkubation. Nach Übernachtbehandlungen mit Agrin wurden die Zellen als nächstes in Rhodamin konjugiertem α-Bungarotoxin inkubiert, um AChRs zu markieren, dann fixiert und für Fluoreszenzmikroskopie präpariert. Um das Ausmaß an AChR-Gruppierung zu quantifizieren, wurden zufällig ausgewählte Myotuben unter Fluorescein-Optik angesehen, dann zu Rhodamin-Optik gewechselt, und die Anzahl an AChR-Clustern innerhalb eines Fadenkreuzgitters, angeordnet entlang der Längsachse der Myotube, wurden gezählt. AChRs auf der Oberfläche der kultivierten primären Myotuben wurden durch Inkubation von lebenden Kulturen mit 25 mM Ci ¹²⁵I-α-BGT für 1 h bei Raumtemperatur, Waschen und anschließende Lyse der Zellen in 0.1 N NaOH quantifiziert. Die Proteinkonzentration in Aliquoten jedes Extrakts wurde mittels eines BCA-Proteintest-Kits (Pierce) bestimmt, während der Rest des Extrakts in einem Gamma-Zähler gezählt wurde.
Myoblasten von sowohl den Kontroll- als auch MuSK-/--Mäuse konnten fusionieren und lange, kontraktierende Myotuben in Kultur bilden. Zusammen mit der Beobachtung, dass der Skelettmuskel ziemlich normal in MuSK-/--Mäusen zu sein scheint, zeigen diese Befunde, dass MuSK nicht kritisch für die frühe Muskelentwicklung und Myoblastenfusion ist. Andererseits scheint MuSK absolut notwendig für die AChR-Gruppierung als Antwort auf Agrin zu sein. Nach Stimulation mit der aktivsten Form von c-Agrin, enthaltend sowohl die vier als auch acht Aminosäurehangen Insertionen (c-Agrin_4,8), waren AChR-Cluster nur in den Myotuben aus Kontrollmäusen erkennbar (8A). Während Cluster in normalen Myotuben mit nur 1 nM c-Agrin_4,8 induziert wurden, konnte keine Gruppierung in MuSK-/--Myotuben sogar nach Erhöhung der Konzentration an c-Agrin_4,8 auf 100 nM beobachtet werden (8B). Das Fehlen einer nachweisbarer Gruppierung erfolgte nicht aufgrund der Abwesenheit der AChRs, da Myotuben von MuSK-/--Mäusen eine ähnliche Anzahl an AChRs auf ihrer Oberfläche wie die Myotuben von Kontrollmäusen exprimierten (8C). Folglich erschien MuSK absolut notwendig für die AChR-Gruppierung als Antwort auf Agrin zu sein.
BEISPIEL 5 – AGRIN INDUZIERT DEUTLICHE UND SCHNELLE TYROSINPHOSPHORYLIERUNG VON MuSK
Das Unvermögen von Agrin, AChR-Gruppierung in Myotuben von MuSK-/--Mäusen zu induzieren, zeigt, dass MuSK für die Reaktion auf Agrin notwendig ist, und stimmt mit der Möglichkeit überein, dass MuSK als der funktionelle Agrin-Rezeptor dient. Da die Gruppierung jedoch über einen Zeitraum von Stunden stattfindet, stimmen diese Ergebnisse auch mit der Möglichkeit überein, dass MuSK viel weiter stromabwärts im Agrin-Signalweg wirkt. Um zu beginnen, zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, zogen die Anmelder den Vorteil aus der Tatsache, dass RTKs schnell am Tyrosin nach Stimulation mit ihrem zugehörigen Liganden autophosphoryliert werden. Die Anmelder entschieden, vier der bekannten Formen von löslichem Agrin, die unterschiedliche AChR-Gruppierungsaktivitäten zeigen (Ruegg, M. A., et al., 1992, Neuron 8: 691–699; Ferns, M., et al., 1992, Neuron 8: 1079–1086; Ferns, M., et al., 1993, Neuron 11: 491–502; Hoch, W., et al., 1994, EMBO J. 13: 2814–2821), auf ihre Fähigkeit zu testen, die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors zu induzieren.
Die Fähigkeit verschiedener Agrine und Wachstumsfaktoren, MuSK- oder ErbB3-Tyrosinphosphorylierung für die angegebenen Zeiten und die angegebenen Konzentrationen zu induzieren, wurde in primären Myoblasten der Ratte und in entweder untransfizierten C2C12-Myoblasten oder in C2C12-Myoblasten, die stabil mit einem Küken-MuSK exprimierenden Plasmid transfiziert waren, beurteilt. Die Zellen wurden in konfluentem Zustand in einem undifferenzierten Zustand oder etwa 4–5 Tage nach Induktion zur Differenzierung in Myotuben in Serum-armem Medium stimuliert. Nach Stimulation wurden die Zellen lysiert, die Extrakte der Immunpräzipitation mit Rezeptor-spezifischen Antikörpern unterzogen und dann wurde mit entweder Rezeptor-spezifischen oder Phosphotyrosin-spezifischen Antikörpern ein Immunblot erstellt, wobei zuvor beschriebene Verfahren verwendet wurden (Stitt, T., et al., 1995, Cell 80: 661–670). Polyclonale Antikörper gegen MuSK wurden wie folgt erzeugt: für MuSK der Ratte wurden Kaninchen mit einem Peptid, das den carboxyterminalen 20 Aminosäuren des MuSK-Proteins der Ratte entspricht, immunisiert (Valenzuela, D., et al., 1995, Neuron 15: 573–584; die Nomenklatur für diesen Antikörper ist: 41101K); für MuSK des Kükens wurden Kaninchen mit einem Peptid, das den ersten 19 Aminosäuren der cytoplasmatischen Domäne von MuSK des Kükens entspricht, immunisiert (Peptid: TLPSELLLDRLHPNPMYQ; die Nomenklatur für diesen Antikörper ist 52307K). Die Spezifität der Antikörper wurde auf COS-Zellen exprimierten MuSK-Proteinen bestimmt, sowohl durch Immunpräzipitation als auch durch das Western-Verfahren, wobei untransfizierte COS-Zelllysate mit Lysaten von mit MuSK der Ratte und des Kükens transfizierten COS-Zellen verglichen wurden. 41101K immunpräzipitiert und detektiert MuSK von Nagetieren auf dem Western-Blot, aber erkennt MuSK des Kükens nicht. 52307 immunpräzipitiert und detektiert MuSK des Kükens auf dem Western Blot. Antikörper gegen ErbB3 wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc. erhalten.
Kulturen von konfluenten C2C12-Zellen, entweder undifferenziert oder in Serum-armem Medium für vier bis fünf Tage, wie vorstehend beschrieben, differenziert, wurden in eine Temperatur von 4°C übertragen und für 90 Minuten mit entweder MuSK-Fc oder TrkB-Fc (bei 5 mg/ml) inkubiert, jeweils in Anwesenheit der angegebenen Schein- oder Agrin enthaltenden konditionierten Medien (mit 100 nM Agrin). Agrinmengen wurden durch Western-Analyse der konditionierten Medien mit einem Ratten-Agrin-Antikörper (131, von StressGen, Inc.) bestimmt, unter Verwendung einer gereinigten Agrin-Kontrolle bekannter Konzentration. Nach diesen Inkubationen wurden die Zellen viermal mit PBS, enthaltend Calcium und Magnesium, gewaschen und dann eine zusätzliche Stunde mit radioiodiertem Ziege-anti-Mensch IgG (NEN/Dupont; 1 mCi/ml in PBS) inkubiert, um oberflächengebundenes Rezeptor-Fc nachzuweisen. Nach viermal weiterem Waschen wurden die Zellen in 0.1 N NaOH solubilisiert, und die gebundene Radioaktivität wurde bestimmt. Der Test ist dem ähnlich, der an einer anderen Stelle beschrieben wurde (Davis, S., et al., 1994, Science 266: 816–819).
Transiente Transfektionen, die entweder zuvor beschriebene Agrin-Konstrukte verwendeten (Ferns, M., et al., 1993, Neuron 11: 491–502) oder leere Vektorkontrollen, oder stabile Transfektionen eines Küken-MuSK-Expressionskonstrukts wurden, wie beschrieben, durchgeführt (Glass, D., et al., 1991, Cell 66: 405–413; Ip, N.Y., et al., 1992, PNAS (USA) 89: 3060–3064). Agrinkonzentrationen in konditionierten Medien, die von transienten Transfektionen stammten, wurden durch Immunblot-Vergleiche mit gereinigtem Agrin bekannter Konzentration bestimmt.
Phosphorylierung wurde am endogenen MuSK-Rezeptor bestimmt, der in Myotuben-Kulturen stark exprimiert wird, die durch Differenzierung von entweder der C2C12-Myoblastenzellinie der Maus (Valenzuela, D., et al., 1995, Neuron 15: 573–584) oder primären Myoblasten der Ratte erhalten wurden. Eindrucksvollerweise waren lösliche Agrine, die das Insert von acht Aminosäuren an Position Z (c-Agrin_4,8 und c-Agrin_0,8) enthielten, die die Formen sind, die die AChR-Gruppierung induzieren können, auch die Formen, die deutliche Tyrosinphosphorylierung von MuSK induzierten (9A). Das Agrin, das am aktivsten bei der Gruppierung ist (c-Agrin_4,8), war auch das aktivste in der Induktion der MuSK-Phosphorylierung (9A). Dagegen konnten die löslichen Agrine, denen das Insert von acht Aminosäuren fehlte (c-Agrin_4,0 und c-Agrin_0,0) und die die AChR-Gruppierung nicht induzieren können, auch die MuSK-Phosphorylierung nicht induzieren (9A).
Die Spezifität der Wirkung von Agrin wurde weiter untersucht durch Vergleich seiner Aktivität mit der von Wachstumsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie Rezeptoren auf Muskeln besitzen. Von mehreren solchen getesteten Faktoren, einschließlich Insulin, Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und ARIA/Neuregulin, konnte nur Agrin die Phosphorylierung von MuSK induzieren (9A); da FGF auch die AChR-Gruppierung auf Myotuben induzierte (Peng, H. B., et al., 1991, Neuron 6: 237–246), zeigen diese Ergebnisse auch, dass die MuSK-Phosphorylierung spezifisch für Antworten auf Agrin ist und nicht nur auf Agenzien, die die Gruppierung induzieren können. Darüber hinaus konnte Agrin, während gezeigt werden konnte, dass solche Faktoren die Phosphorylierung ihrer eigenen RTKs auf Myotuben induzieren (z. B. Neuregulin induziert die Phosphorylierung seiner zugehörigen RTK, erbB3), nur MuSK aktivieren und nicht andere RTKs (9B).
Die Aktivierung einer RTK durch ihren zugehörigen Liganden erfolgt typischerweise schnell, und die Anmelder konnten zeigen, da s Agrin die Tyrosinphosphorylierung von MuSK mit Kinetiken, die denen ähnlich sind, die bei gut charakterisierten RTK/Ligandensystemen beobachtet werden, induziert (z. B. Kaplan, D. R., et al., 1991, Nature 350: 158–160); die Induktion war innerhalb einer Minute nachweisbar, erreichte ihre Spitze innerhalb der ersten fünf Minuten und blieb über eine Stunde erhöht (9D). Die Tyrosinphosphorylierung von MuSK erfolgte auch bei Verwendung von Agrin in Konzentrationen, die denen ähnlich waren, die für andere Liganden, die auf RTKs wirken, beobachtet wurden (Ip, N.Y., et al., 1993, Neuron 10: 137–149), wobei die Phosphorylierung mit 1 nM Agrin nachweisbar war (9C).
Das erforderliche Vorhandensein von MuSK für die Antwort auf Agrin, die Fähigkeit von Agrin, schnelle und deutliche MuSK-Phosphorylierung zu induzieren, die Spezifität von Agrin für MuSK, verglichen mit anderen getesteten Faktoren, und die genaue Korrelation von Agrinformen in AChR-Gruppierungstests und in MuSK-Phosphorylierungstests, all das zusammen unterstützt weiter die Vorstellung, dass MuSK als der funktionale Agrin-Rezeptor dient.
BEISPIEL 6 – AGRIN BINDET NICHT DIREKT AN EINE ISOLIERTE MuSK-EKTODOMÄNE
Wenn MuSK tatsächlich der funktionelle Agrin-Rezeptor ist, würden die Anmelder erwarten, die Bindung von Agrin an MuSK zeigen zu können. In einem Versuch, diese Bindung zu zeigen, entwarfen die Anmelder zuerst ein Expressionskonstrukt, das ein Fusionsprotein zwischen der Ektodomäne von MuSK der Ratte und dem Fc-Teil des menschlichen Immunglobulins G1 (bezeichnet als MuSK-Fc) codiert, und stellten dann das Fusionsprotein her und reinigten es. Ähnliche Rezeptor-Fc-Fusionen wurden zuvor verwendet, um die Bindung zwischen RTKs und ihren Liganden zu charakterisieren (Davis, S., et al., 1994, Science 266: 816–819; Stitt, T., et al., 1995, Cell 80: 661–670).
Baculovirus-Expressionsvektoren, die MuSK-Fc, TrkB-Fc und Ret-Fc codieren, stellten Fusionsproteine her, in denen die Ektodomänen von TrkB der Ratte, Ret der Ratte beziehungsweise MuSK der Ratte mit einem Spacer mit der Sequenz Gly-Pro-Gly verbunden waren, gefolgt von der Gelenkregion und den CH2- und CH3-Bereichen von menschlichem IgG1, beginnend mit den Resten Glu-Pro-Lys, wie beschrieben (Davis, S., et al., 1994, Science 266: 816–819). Baculovirus-Infektionen in Spodoptera frugiperda-SF-21AE-Insektenzellen wurden mittels Standardverfahren durchgeführt (Stitt, T., et al., 1995, Cell 80: 661–670). Die löslichen Fc enthaltenden Proteine wurden mittels Protein A-Sepharose (Pharmacia)-Chromatographie gereinigt.
Die Bindung von Agrin an immobilisiertes MuSK-Fc, verglichen mit einem monoclonalen, für Agrin spezifischen Antikörper, wurde mittels BIAcore-Biosensor-Technologie (Pharmacia Biosensor) gemessen, unter Verwendung von zuvor beschriebenen Ansätzen (Stitt, T., et al., 1995, Cell 80: 661–670). Heparin und CaCl₂ wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) geliefert und ohne weitere Reinigung verwendet. Der Agrin-spezifische monoclonale Antikörper (Clon AGR131, hergestellt gegen Agrin der Ratte) wurde von StressGen Biotechnologies Corp. (Victoria, BC, Canada) gekauft.
In einem ersten Ansatz verwendeten die Anmelder MuSK-Fc zusammen mit der BIAcore-Biosensor-Technologie. Die BIAcore-Technologie erlaubt die direkte und quantitative Messung der Bindung von löslichen Liganden an Rezeptoren, die an einen Sensor-Chip gekoppelt sind. Rekombinantes MuSK-Fc wurde kovalent an eine Oberfläche auf dem BIAcore-Sensor-Chip gekoppelt, und als eine Kontrolle wurde auch ein monoclonaler, für Agrin der Ratte spezifischer Antikörper an eine getrennte Oberfläche auf dem Sensor-Chip gekoppelt; Medien, die c-Agrin_4,8 enthielten, wurden dann über die zwei Oberflächen geschickt. Während starke Bindung des Agrins an die Antikörperoberfläche leicht nachgewiesen werden konnte, konnte keine Bindung des Agrins an die MuSK-Oberfläche gesehen werden (10A). Darüber hinaus war die Bindung nicht durch überschüssiges lösliches MuSK-Fc kompetierbar, während die Bindung an die Antikörperoberfläche spezifisch durch überschüssigen löslichen Antikörper, der dem Agrin-enthaltenden Medium zugegeben wurde, kompetierbar war (10A). Da Agrin-Aktivität Calcium erfordert (Bowe und Fallon, 1995, Ann. Rev. Neurosci. 18: 443–462) und da einige Heparin bindende Faktoren Heparin brauchen, um an ihre Rezeptoren zu binden (Goldfarb, M., 1990, Cell Growth & Differentiation 1: 439–445), versuchten die Anmelder auch die Bindung in Gegenwart von Calcium oder Heparin; in keinem Fall wurde eine Bindung an die MuSK-Oberfläche beobachtet (10A).
Als nächstes versuchten die Anmelder die Bindung von MuSK und Agrin zu zeigen, indem sie versuchten, MuSK-Fc zu verwenden, um auf Nitrocellulose immobilisiertes Agrin nachzuweisen. Im Gegensatz zu unseren Kontrollexperimenten, in denen immobilisierter vom Gehirn stammender neurotropher Faktor (BDNF) leicht durch eine Fc-Fusion seines zugehörigen Rezeptors (TrkB-Fc) nachgewiesen werden konnte und in denen immobilisiertes Agrin leicht durch den Agrin-spezifischen monoclonalen Antikörper nachgewiesen werden konnte, konnte immobilisiertes Agrin nicht durch MuSK-Fc nachgewiesen werden ( 10B).
Die vorstehend beschriebenen, negativen Bindungsergebnisse zeigen, dass der isolierte MuSK-Rezeptor nicht ausreicht, um Agrin zu binden. Folglich dient MuSK vielleicht nicht direkt als ein Rezeptor für Agrin, trotz der Vielfalt an funktionellen Daten, die andeuten, dass Agrin über MuSK wirkt. Alternativ dazu braucht MuSK vielleicht zusätzliche Komponenten oder Veränderungen, die zur Bindung und Antwort auf Agrin erforderlich sind.
BEISPIEL 7 – AGRIN AKTIVIERT MuSK AUF EINE ZELLKONTEXT-ABHÄNGIGE WEISE: ERFORDERNIS FÜR EINE MYOTUBEN-SPEZIFISCHE ZUSÄTZLICHE KOMPONENTE
Basierend auf den vorstehend beschriebenen Ergebnissen zogen die Anmelder die Möglichkeit in Betracht, dass die Agrin-MuSK-Interaktion zusätzliche Komponenten erfordert. Um diese Möglichkeit weiter zu erforschen, bestimmten die Anmelder die Zellkontext-Abhängigkeit für die Agrinaktivierung von MuSK, wobei sie überlegten, dass, wenn eine zusätzliche Komponente erforderlich war, sie spezifisch nur auf Zellen exprimiert sein könnte, die normalerweise auf Agrin antworten. Folglich exprimierten die Anmelder Vollängen-cDNAs, die MuSK der Ratte, des Menschen und des Kükens codierten, ektopisch in Fibroblasten und testeten darauf, ob diese MuSK-Rezeptoren induzierbar durch Agrin phosphoryliert werden konnten. Wenn sie in Fibroblasten exprimiert wurden, konnte keine der drei Arten von MuSK als Antwort auf Agrin phosphoryliert werden. Während das die Möglichkeit unterstützte, dass MuSK eine zusätzliche Myotuben-spezifische Komponente braucht, um auf Agrin zu antworten, war es auch möglich, dass unsere cDNAs MuSK-Varianten codierten, die nicht auf Agrin antworten konnten. Das war eine möglicherweise beunruhigende Möglichkeit, da es vielfache, verschieden gespleißte Versionen des MuSK- Transkripts gibt (Valenzuela, D., et al., 1995, Neuron 15: 573–584); die Anmelder wussten nicht, welche der Formen normalerweise auf Agrin antworteten, und unsere cDNAs machten nur einen Teil der verschiedenen Formen aus. Folglich entschieden die Anmelder, unsere cDNAs in Myoblasten zu exprimieren, um zu überprüfen, dass sie Antworten auf Agrin vermitteln konnten, wenn sie im richtigen Kontext exprimiert wurden. Zu diesem Zweck entschieden die Anmelder, MuSK des Huhns in der C2C12-Myoblasten-Zellinie der Maus zu exprimieren, da MuSK des Kükens leicht von der endogenen MuSK der Maus auf der Grundlage der Größe und durch Verwendung spezieller Antikörper unterschieden werden konnte. Bei Expression in undifferenzierten Myoblasten wurde MuSK des Kükens in Antwort auf jede Isoform von Agrin nicht phosphoryliert (11, vgl. Spuren mit der Bezeichung "Undif", oberes Feld), genauso wie sie nicht in Fibroblasten phosphoryliert wurde; undifferenzierte C2C12-Zellen exprimieren keine signifikanten Mengen an endogener MuSK (11, Spuren mit der Bezeichnung "Undif", unteres Feld und auch (Valenzuela, D., et al., 1995, Neuron 15: 573–584); daher konnten die Anmelder die Aktivierung der endogenen MuSK der Maus in Myoblasten nicht vergleichen. Nach Differenzierung in Myotuben wurde die eingeführte MuSK des Kükens genauso wirksam durch Agrin aktiviert, wie die endogene MuSK der Maus (11, Spuren mit der Bezeichnung "Diff", oberes Feld); sowohl eingeführte als auch endogene MuSK besaßen identische Profile der Antwort auf die verschiedenen Formen von Agrinen, mit Aktivierungen, die nur von Formen mit dem Insert von 8 Aminosäuren an der Z-Position vermittelt wurden. Folglich codieren unsere cDNAs MuSK-Proteine, die vollkommen zur Agrin induzierten Phosphorylierung fähig sind, aber sie können nur von Agrin im Kontext einer differenzierten Myotube aktiviert werden, was in Übereinstimmung mit der Vorstellung ist, dass die Agrin-Aktivierung von MuSK eine Myotuben-spezifische zusätzliche Komponente erfordert, die nicht in Fibroblasten oder undifferenzierten Myoblasten exprimiert wird.
BEISPIEL 8 – EIN REZEPTOR-KOMPLEX KANN ZWISCHEN AGRIN, MuSK UND EINER MYOTUBEN-SPEZIFISCHEN ZUSÄTZLICHEN KOMPONENTE GEZEIGT WERDEN
Insgesamt zeigen die vorstehenden Daten, dass Agrin MuSK braucht, um eine Gruppierung zu vermitteln, und dass Agrin MuSK sehr schnell aktiviert, aber dass Agrin nicht direkt an eine gereinigte MuSK-Ektodomäne bindet und MuSK nur im Kontext einer Myotube aktivieren kann. Diese Befunde sind in Übereinstimmung mit der Möglichkeit, dass MuSK ein erforderlicher Teil eines Agrin-Rezeptor-Komplexes ist, aber dass es, obwohl MuSK eine Schlüsselsignalfunktion für diesen Komplex bereitstellt, eine oder mehrere andere Komponenten erfordert, um an Agrin zu binden. Ähnliche Typen von Rezeptorkomplexen wurden für andere Liganden beschrieben. Vielleicht schließen einige der am besten charakterisierten Beispiele die Rezeptorkomplexe für den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) und seine Cytokin-Verwandten ein (Davis, S., et al., 1993, Science 260: 1805–1808; Stahl und Yancopoulos, 1993, Cell 74: 587–590). Um mit seinen zwei Signal transduzierenden "b"-Rezeptorkomponenten, gp130 und LIFRb, zu interagieren, muss CNTF zuerst an seine "a"-Rezeptorkomponente binden, bekannt als CNTFRa. CNTFRa besitzt keine Signalfunktion und ist tatsächlich an die Oberfläche über eine Glycosylphosphatidylinositolverbindung gebunden und besitzt folglich keine cytoplasmatische Domäne. Der Rezeptorkomplex für CNTF wird auf schrittweise Art gebildet: CNTF bindet zuerst an CNTFRa; dieser anfängliche Komplex kann dann an eine einzelne "b"-Komponente binden und sie aufnehmen; zuletzt bildet sich ein vollständiger Komplex, der eine "b"-Komponentendimerisierung einschließt, die zur Signalinitiation erforderlich ist (12A). Im endgültigen Komplex scheint CNTF Kontakte mit allen drei Rezeptorkomponenten zu bilden. Interessanterweise können Rezeptorkomplexe für CNTF in Lösung nur mit den löslichen Ektodomänen der verschiedenen Komponenten gebildet werden. Darüber hinaus, kann, wenn nur eine der Rezeptorkomponenten an die Oberfläche gebunden ist, darum ein Rezeptorkomplex mit löslichen Versionen der anderen Komponenten gebildet werden, aber nur auf eine CNTF-abhängige Art (12B).
Wenn Agrin an MuSK in einem Rezeptorkomplex bindet, überlegten die Anmelder, dass sie diesen Komplex manipulieren könnten, auf im Grossen und Ganzen die gleiche Art, auf die der CNTF-Rezeptorkomplex manipuliert werden kann. Um die Möglichkeit zu erforschen, dass Myotuben spezifisch eine oder mehrere zusätzliche Komponenten exprimieren, die erforderlich sind, damit Agrin an MuSK binden kann (12C), entschieden die Anmelder, zu testen, ob die Anmelder spezifisch einen Rezeptorkomplex auf der Oberfläche von Myotuben, aber nicht auf anderen Zellen bilden könnten, wobei Agrin zusammen mit einer löslichen Version des MuSK-Rezeptors verwendet wurden, um mit mögliche(n) zusätzliche(n) Komponente(n) auf der Oberfläche von Myotuben einen Komplex zu bilden. Diese Möglichkeit bestätigend, fanden die Anmelder, dass die Bindung von löslichem MuSK- Fc an die Oberfläche von Zellen mit Agrin erhöht werden kann, aber nur auf der Oberfläche von differenzierten Myotuben und nicht auf der Oberfläche von Fibroblasten oder Myoblasten (13A). Diese Daten zeigen, dass sich Komplexe zwischen Agrin und MuSK bilden können, aber nur in Gegenwart einer oder mehrerer Myotuben-spezifischenr Komponenten (wie in 12C vorgeschlagen). Interessanterweise können, obwohl Formen von c-Agrin, die das Insert von acht Aminosäuren an der Z-Position enthalten, die Agrin-abhängige MuSK-Komplexbildung am besten unterstützen können, Formen von c-Agrin ohne dieses Insert auch diese Komplexe bilden. Die Fähigkeit all dieser löslichen Formen, die Komplexbildung zu unterstützen, einschließlich solcher, denen das Insert von acht Aminosäuren für die Aktivität fehlt, kann mit vorherigen Befunden in Einklang stehen, dass Matrix gebundene Formen von Agrin, denen das Z-Insert fehlt, die Gruppierung aktivieren können (Ferns, M., et al., 1992, Neuron 8: 1079–1086). Folglich, obwohl lösliche Agrine, denen Inserts an der Z-Position fehlen, scheinbar keine Signalfunktion ausüben können, können sie fähig sein Teilkomplexe zu bilden, während Matrix assoziierte Formen dieser gleichen Agrine weiter vollständige Komplexe mit Signalfunktion bilden können. Interessanterweise bilden Liganden für die EPH-Familie von RTKs ein Beispiel von Liganden, die an ihre Rezeptoren binden, sie aber nicht aktivieren, wenn sie in löslichen Formen präsentiert werden, aber die als wirksame Aktivatoren agieren können, wenn sie an die Zelloberfläche gebunden sind (Davis, S., et al., 1994, Science 266: 816–819); absichtliche Gruppierung der löslichen Liganden kann ebenfalls _T eine Aktivierung ermöglichen, was nahelegt, dass die Rolle der Oberflächenanheftung die ist, die Liganden-Gruppierung ermöglichen (Davis, S., et al., 1994, Science 266: 816–819).
In Abwesenheit zugegebenen Agrins zeigte MuSK-Fc eine viel größere Bindung an Myotuben-Oberflächen als mehrere Kontroll-Rezeptor-Fc-Fusionsproteine (13A, Daten gezeigt für TrkB-Fc); MuSK-Fc jedoch zeigte eine ähnliche Agrin unabhängige Bindung an sowohl Myoblasten als auch Fibroblasten wie Kontroll-Rezeptor-Fc-Proteine (13A). Spezifische Bindung von MuSK-Fc an Myotuben-Oberflächen, in Abwesenheit von exogen zur Verfügung gestelltem Agrin, kann anzeigen, dass MuSK eine Affinität für seine Myotuben-spezifische zusätzliche Komponente in Abwesenheit von Liganden besitzt. Alternativ, da Myotuben Muskel-spezifische Formen von Agrin bilden (denen das Insert von acht Aminosäuren an der Z-Position fehlt), könnte die spezifische Bindung von MuSK-Fc an Myotuben in Abwesenheit von zugegebenem Agrin durch die Bildung eines Komplexes zwischen dem zugegebenen MuSK-Fc und endogen exprimiertem Muskel-Agrin zusammen mit der zusätzlichen Komponente erklärt werden; Zugabe von zusätzlichem exogenem löslichem Agrin könnte einfach ermöglichen, dass noch mehr MuSK von Komplexen mit der Myotuben-spezifischen zusätzlichen Komponente aufgenommen wird. Obwohl sowohl Myoblasten als auch Myotuben endogenes Agrin produzieren, können Myoblasten scheinbar keine Komplexe mit zugegebenem MuSK-Fc bilden, da sie die erforderliche zusätzliche Komponente nicht exprimieren.
Um zu bestätigen, dass MuSK direkt mit Agrin als Teil seines Rezeptorkomplexes interagiert, zeigten die Anmelder als nächstes, dass radiomarkiertes Agrin an MuSK-Rezeptoren auf der Oberfläche von Myotuben quervernetzt werden konnte.
Menschliches Agrin-Protein mit Flg-Marker, das den COOH-terminalen 50 kD von menschlichem Agrin 4,8 entspricht, wurde in COS-Zellen exprimiert und durch Affinitäts- und Größenausschlußchromatographie auf > 95% Reinheit gereinigt. 20 μg wurden durch ein verändertes Lactoperoxidase-Verfahren, wie zuvor beschrieben, iodiert (DiStefano, P., et al., 1992, Neuron 8: 983–993). Der Einbau von ¹²⁵I war größer als 80%; ¹²⁵I-h-Agrin 4,8-flg wurde von freiem ¹²⁵I auf einer 1 × 3 cm-Sephadex G-25-Säule vor der Verwendung in den Querverknüpfimgs-Tests getrennt. Die spezifische Aktivität betrug 4000 CpM/fMol (~2400 Ci/mMol). Die biologische Aktivität von ¹²⁵I-h-Agrin 4,8-flg wurde durch Tyrosinphosphorylierung von MuSK in C2C12-Myotuben verfolgt und war von ihrem unmarkierten Gegenstück nicht zu unterscheiden. Für Querverknüpfungs-Studien wurden 10 cm-Platten differenzierter C2C12 Myotuben in 1 nM [¹²⁵I]-Agrin_4,8 in 1.5 ml PBS, enthaltend 1% BSA und 1 mg/ml Glucose, in Anwesenheit oder Abwesenheit eines 150fachen Überschusses unmarkierten Agrins_4,8 für 75 min bei 4°C inkubiert. Das Querverknüpfungs-Agens DSS (Disuccinimidylsuberat) wurde in einer Endkonzentration von 0.2 mM zugegeben, und die Platten wurden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert, dreimal mit 50 mM Tris/150 mM NaCl, pH 7.5, gewaschen, lysiert und der Immunpräzipitation mit MuSK-spezifischen Antikörpern unterzogen. Für die Peptidkompetition wurde Peptidantigen in der Immunpräzipitation in einer Endkonzentration von 20 μg/ml eingeschlossen. Die Proben wurden dann der Elektrophorese unterzogen, und die fixierten und getrockneten Gele wurden der Autoradiographie ausgesetzt.
Immunpräzipitationen von Lysaten von Myotuben, die chemisch mit radiomarkiertem, rekombinantem menschlichem Agrin quervernetzt waren, mit einem MuSK-spezifischen Antikörper, enthielten Komplexe, die in der Größe Agrin/MuSK-Komplexen entsprachen (13B). Diese Agrin/MuSK-Komplexe konnten in Gegenwart eines Überschusses unmarkierten Agrins oder wenn ein Peptid verwendet wurde, um die MuSK-Präzipitation zu blockieren, nicht gesehen werden (13B). Zusätzliche radiomarkierte Arten, die mit dem MuSK-Antikörper immunpräzipitierten, entsprechen Formen von Agrin, die mit MuSK assoziiert, aber nicht quervernetzt sind, vermutlich aufgrund der geringen Effizienz der Quervernetzung (13B); geringe Mengen zusätzlicher Agrinkomplexe, die vielleicht MASC einschließen, konnten auch in diesen Immunpräzipitationen nachgewiesen werden.
Zuletzt, wenn unsere Befunde, dass lösliche MuSK Komplexe mit ihrer erforderlichen Myotuben-spezifischen zusätzlichen Komponente bilden kann, richtig sind, dann sollte dieser lösliche Rezeptor auch als ein Inhibitor Agrin-vermittelter Antworten wirken, wobei die zusätzliche Komponente maskiert und daran gehindert wird, mit der endogen exprimierten, zur Signalübertragung fähigen MuSK zu interagieren. Tatsächlich hemmte die Zugabe steigender Mengen an MuSK-Fc die Agrin-vermittelte Gruppierung von AChRs (13C) sowie die Agrin induzierte MuSK-Phosphorylierung in einer Dosis-abhängigen Weise, während Kontroll-Rezeptor-Fc-Proteine keine hemmende Wirkung besaßen.
BEISPIEL 9 – CLONIERUNG MENSCHLICHER AGRIN-cDNA
Sonden, die menschlichem Agrin entsprechen, wurden mittels PCR hergestellt, auf der Grundlage von partiellen Sequenzen von menschlichem Agrin, die aus der Genbank-Datenbank verfügbar waren.
Zwei Paare von PCR-Primern wurden synthetisiert, auf der Grundlage von menschlichen Agrin-cDNA-Sequenzen, erhalten aus der Genbank-Datenbank. Die Sequenzen der Oligonucleotid-Primer waren wie folgt:
Primer-Paar 18:

h-Agrin 18-5': 5'-GACGACCTCTTCCGGAATTC-3'
h-Agrin 18-3': 5'-GTGCACATCCACAATGGC-3'

Primer-Paar 35:

h-Agrin 35-5': 5'-GAGCAGAGGGAAGGTTCCCTG-3'
h-Agrin 35-3': 5'-TCATTGTCCCAGCTGCGTGG-3'.

Die Oligonucleotidprimer wurden für die PCR-Amplifikation von zwei Abschnitten von DNA von etwa 100 Nucleotiden (Primer-Paar 18) und 85 Nucleotiden (Primer-Paar 35) mit 300 ng menschlicher genomischer DNA als eine Matrize verwendet. Die PCR-Amplifikation wurde, wie vom Hersteller (Perkin-Elmer) empfohlen, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 35 Zyklen bei 94°C für 60 sec, 55°C für 50 sec und 72°C für 30 sec. Die erhaltenen PCR-Fragmente wurden aus einem Agarosegel gereinigt und wieder für 30 Zyklen unter den gleichen, vorstehend beschriebenen PCR-Bedingungen amplifiziert.
Nach der Amplifikation wurden die PCR-Reaktionen in Agarosegelen der Elektrophorese unterzogen, die Agarose, die die DNA-Banden von 100 beziehungsweise 85 Nucleotiden enthielt, wurde ausgeschnitten, mit QiaEx II (Qiagen) gereinigt und dann in das Plasmid pCR-script mittels Stratagenes-pCR-Script-Clonierungskit cloniert, gefolgt von bakterieller Transformation und Plattierung auf Agar-Ampicillin-Platten, wie vom Hersteller empfohlen. Bakterienkolonien, die die 100 und 85 Nucleotide langen Inserts enthielten, wurden mittels PCR mit den vorstehend beschriebenen Primern identifiziert. Die erhaltenen PCR-Fragmente wurden zur Verwendung als Sonden mittels einer Standard-PCR-Reaktion (Perkin-Elmer) mit 20 ng DNA-Matrize radiomarkiert, mit der Ausnahme dass jewails 5 nMol an dATP, dGTP und dTTP und 0.2 mM Curie alpha-³²P-dCTP (DuPont 3000 Ci/mMol) zu dem Reaktionsgemisch zugegeben wurden, und dann 7 PCR-Zyklen unterzogen. Nicht-eingebaute Markierung wurde von den Sonden auf einer G50-NICK-Säule (Pharmacia) abgetrennt. Diese Sonden wurden verwendet, um eine menschliche fötale Gehirn-cDNA-Genbank (Stratagene Cat# 936206) mittels Standard-Genbank-Absuchverfahren (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press) abzusuchen. Eineinhalb Millionen Phagen-Plaques wurden in XL-1 Blue-Bakterien plattiert, wie von Stratagene empfohlen, und auf Nitrocellulosefilter im Duplikat, wie zuvor beschrieben (id.), transferiert. Die Filter wurden weiter bearbeitet, und jedes Filterreplikat wurde zur Hybridisierung mit einer der vorstehenden Sonden, wie zuvor beschrieben (id.), verwendet. Plaques, die mit beiden Sonden hybridisierten, wurden isoliert und gereinigt, und ein das cDNA-Insert enthaltendes Plasmid wurde aus dem Lambda-Clon gemäß des von Stratagene empfohlenen Verfahrens (EXASSIST/SOLR-System) ausgeschnitten. Das pBluescript-Plasmid, das menschliches Agrin-Insert enthielt, wurde gereinigt, und das Insert wurde dann mittels eines automatisierten Sequenzierungskits (Applied Biosystems) sequenziert.
Als ein Ergebnis dieser Suche wurde ein Clon (pBL-hAgrin1) erhalten, der eine Nucleotidsequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz von menschlichem Agrin codiert. Die erste Aminosäure, die von der clonierten Nucleotidsequenz codiert wird, entspricht etwa der Aminosäure 424 des Agrins der Ratte (vgl. 14). Die Nucleotidsequenz des Clons endet stromabwärts des Stoppcodons. Clon pBL-hAgrin1 enthält ein Insert von vier Aminosäuren, das an der Position beginnt, die der Position 1643 von 14 entspricht, ein Punkt, der zuvor für die Ratte als Position "Y" beschrieben wurde (Stone, D. M. und Nikolics, K., J. Neurosci. 15: 6767–6778 (1995)). Die Sequenz des Inserts von vier Aminosäuren sowohl im Clon pBL-hAgrin1 als auch in der Ratte ist KSRK.
Ein zweiter Clon wurde aus dieser Suche erhalten. Dieser zweite Clon (pBL-hAgrin 23) enthält auch eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz von menschlichem Agrin codiert. Die erste Aminosäure, die von der clonierten Nucleotidsequenz codiert wird, entspricht etwa der Aminosäure 1552 des Agrins der Ratte (vgl. 14). Die Nucleotidsequenz des Clons endet stromabwärts des Stoppcodons. Clon pBL-hAgrin23 enthält ein Insert von acht Aminosäuren, das an einer Position beginnt, die der Position 1780 von 14 entspricht, ein Punkt, der zuvor für die Ratte als Position "Z" beschrieben wurde (Stone, D. M. und Nikolics, K., J. Neurosci. 15: 6767–6778 (1995)). Die Sequenz des Inserts von acht Aminosäuren sowohl im Clon pBL-hAgrin23 als auch in der Ratte ist ELANEIPV. Wie zuvor diskutiert, wurde berichtet, dass das Insert von acht Aminosäuren eine wichtige Rolle in der Regulation der AChR-Gruppierungsaktivität verschiedener Agrinformen spielt. Daher kann durch Einfügen einer Nucleotidsequenz, die die Sequenz von acht Aminosäuren ELANEIPV codiert, in den Clon pBL-hAgrin1 an der Position, die der Position Z des Agrins der Ratte entspricht, ein menschlicher 4-8-Agrinclon erhalten werden. Das Hinzufügen des Inserts von acht Aminosäuren an Position Z sollte hohe biologische Aktivität auf den menschlichen 4-8-Clon übertragen.
Clon pBL-hAgrin23 enthält auch das "Y"-Insert von vier Aminosäuren, wie vorstehend für Clon pBL-hAgrin1 beschrieben. Clon pBL-hAgrin23 enthält jedoch 17 zusätzliche Aminosäuren an der gleichen "Y"-Position, so dass die Sequenz des "Y"-Inserts in Clon pBL-hAgrin23 KSRKVLSASHPLTVSGASTPR ist. Daher werden zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen menschlichen (4-0)- und (4-8)-Agrin-Spleißvarianten menschliche Clone, die den Spleißvarianten entsprechen, die (Y-Z)-Inserts von (17-0), (17-8), (21-0) und (21-8) enthalten, durch dieses Ergebnisse angedeutet und liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 10 – EXPRESSION VON MENSCHLICHEM AGRIN
Konstruktion eines Expresssionsvektors für menschliches Agrin
Ein SfiI – AatII-Fragment für menschliches Agrin, enthaltend das Insert von vier Aminosäuren an der Position, die der für Agrin der Ratte beschriebenen Y-Stelle entspricht (vgl. 14), wurde aus dem Clon pBL-hAgrin1 ausgeschnitten. Ein AatII – NotI-Fragment für menschliches Agrin, enthaltend das Insert von acht Aminosäuren an der Position, die der für Agrin der Ratte beschriebenen Z-Stelle entspricht (vgl. 14), wurde aus dem Clon pBL-hAgrin 23 ausgeschnitten. Ein XhoI – SfiI-Fragment wurde dann mittels PCR geschaffen, das ein Präprotrypsin-Signalpeptid, das flg-Peptid von acht Aminosäuren (aus dem flag-Markierungssystem, IBI/Kodak, Rochester, NY) und die menschliche Agrinsequenz enthielt, die der Sequenz von Aminosäuren von Position 1480 bis zu der SfiI-Stelle bei den Aminosäuren 1563–1566 von Agrin der Ratte entspricht (vgl. 14). Die drei Fragmente wurden dann in einen mit XhoI – NotI gespaltenen pMT21 Expressionsvektor ligiert, um den Expressionsvektor pMT21-Agrin 4-8 für menschliches Agrin 4-8 zu bilden. Die Sequenz von menschlichem Agrin 4-8, die im Expressionsvektor codiert wurde, ist in 15 gezeigt. Expressionsvektoren für die menschlichen Clone, die den Spleißvarianten entsprechen, die (Y-Z)-Inserts von (0-8) und (4-0) enthielten, wurden auch konstruiert.
Expression von menschlichem Agrin (4-8) in E. coli
Das Gen für menschliches Agrin 4-8 wurde aus pMT21-Agrin 4-8 mit dem Primer-Paar AGS' (5'-GAGAGAGGTTTAAACATGAGCCCCTGCCAGCCCAACCCCTG-3') und AG3' (5'-CTCTGCGGCCGCTTATCATGGGGTGGGGCAGGGCCGCAG-3') PCR-amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen PmeI und NotI gespalten und in die PmeI- und NotI-Stellen des Vektors pRG501 cloniert, ein pMB1-Replicon, das Kanamycin-Resistenz überträgt und entworfen ist, um clonierte Gerte vom Phagen-T7-Promotor aus zu exprimieren. Ein Isolat wurde charakterisiert und pRG531 genannt. Das 1315 Basenpaare lange NcoI – NaeI-Fragment innerhalb von Agrin in pRG531 wurde dann mit dem entsprechenden Fragment von pMT21-Agrin 4-8 ersetzt. Das resultierende Plasmid, pRG451, wurde in den Expressionsstamm RFJ209 [IN(rrnD-rrn/E)1 lacI^Q lacZpL8 fhuAD322-405 rpoS_(MC4100) ara::(lacUV5-T7 Gen 1)8] transformiert. Kulturen von RFJ209/pRG541, induziert mit IPTG, exprimieren menschliches Agrin zu etwa 5% des gesamten zellulären Proteins und Fraktionen mit löslichem Protein nach Zellaufbruch. Es wurde gefunden, dass die rohe lösliche Proteinfraktion, die menschliches Agrin 4-8 enthält, sowie menschliches Agrin 4-8, gereinigt durch Q-Sepharose-Chromatographie, aktiv in der Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors sind.
Expression von menschlichem Agrin (4-8) in Pichia pastoris
Das aktive 50 kD-Fragment (Teil) von menschlichem Agrin 4-8 wurde mittels PCR cloniert unter Verwendung von einem Primer, der einen Teil des Prä-Pro-Sekretionssignals des α-Paarungsfaktors von S. cerevisiae und das 5'-Ende des Bereichs, der das 50 kD Agrin-Fragment codiert, enthält
(GTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGCCCCTGCCAGCCCAACC), und einem Primer, der Sequenzen aus dem Bereich 3' des codierenden Bereichs von Agrin und eine NotI-Stelle enthält
(AATAGTGCGGCCGCCAACACTCAGGCAAGAAAATCATATC).
Nach der PCR wurde das Fragment mit XhoI, das Sequenzen im 5'-Primer erkennt, und NotI gespalten und wurde in pPIC9 (Invitrogen), gespalten mit XhoI und NotI, cloniert. Der resultierende Clon wurde mit NotI gespalten und partiell mit NcoI gespalten, um den Hauptteil der PCR amplifizierten Agrin-Sequenzen zu entfernen. Dieser Bereich wurde durch ein NotI – NcoI-Fragment von Agrin aus pRG541 ersetzt. Die PCR amplifizierten Bereiche wurden sequenziert und als Wildtyp identifiziert. Dieser Clon, pRG543, wurde mit SalI gespalten und in Pichia pastoris durch Elektroporation transformiert. Transformanten wurden auf einen His+Mut+-Phänotyp selektiert. Induktion des AOX1-Promotors, der die Expression von hAgrin steuert, wurde durch Züchten der Zellen in gepuffertem Glycerin-Komplex-Medium, enthaltend 0.5% Glycerin, pH = 6.0, für 24 h durchgeführt, bis das Glycerin verbraucht war, dann wurde Methanol in einer Endkonzentration von 0.5% zugegeben. Die Kultur wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde gegen PBS dialysiert. Die Konzentration an hAgrin war etwa 10 μg/ml und wurde bestimmt, in der Phosphorylierung von MuSK-Rezeptor aktiv zu sein.
Herstellung von menschlichem Agrin 4,8 aus Baculovirus infizierten Insektenzellen
Virusherstellung
Das flg-markierte Gen für menschliches Agrin 4-8 wurde in ein Baculovirus-Expressionsplasmid cloniert und mit viraler DNA rekombiniert, um rekombinanten Baculovirus zu erzeugen, amplifiziert und geerntet mittels zuvor beschriebener Verfahren (O'Reilly, D. R., L. K. Miller, und V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors – A Laboratory Manual 1992, New York: W. H. Freeman). SF21-Insektenzellen (Spodoptera frugiperda), erhalten von Invitrogen, wurden angepasst und bei 27°C in serumfreiem Gibco SF900 II-Medium expandiert. Man ließ nichtinfizierte Zellen bis zu einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml wachsen. Die Zelldichte wurde durch Zählen lebender Zellen mittels eines Hämacytometers bestimmt. Die Virusstammlösung für FLAG-Agrin wurde zu dem Bioreaktor in einer niedrigen Multiplizität von 0.01–0.1 PBE/Zelle zugegeben, um die Infektion zu beginnen. Der Infektionsprozess wurde für 3–4 Tage laufen gelassen, wobei die maximale Virusreplikation ohne einhergende wesentliche Zelllyse ermöglicht wurde. Die Zellsuspension wurde aseptisch in sterile Zentrifugenflaschen aliquotiert, und die Zellen wurden durch Zentrifugation (1600 UpM, 30 min) entfernt. Der zellfreie Überstand wurde in sterilen Flaschen gesammelt und bei 4°C in Abwesenheit von Licht bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Der Virustiter wurde durch Plaquetest bestimmt, wie von O'Reilly, Miller und Luckow beschrieben. Das Verfahren wurde in 60 mm-Gewebekulturschalen durchgeführt, in denen 1.5 × 10⁶ Zellen ausgesät wurden. Reihenverdünnungen der Virusstammlösung wurden zu den angehefteten Zellen zugegeben, und das Gemisch wurde unter Schütteln inkubiert, damit das Virus an einzelne Zellen adsorbieren konnte. Eine Agarschicht wird darüber gegeben, und die Platten werden für 5 Tage bei 27°C inkubiert. Lebende Zellen werden mit Neutralrot gefärbt, was zirkuläre Plaques zeigte, die gezählt wurden, um den Virustiter als Plaque-bildende Einheit per Milliliter (PBE/ml) zu ergeben.
Infektion von Zellen zur Proteinherstellung
Nichtinfizierte SF21-Zellen wurden in einem 60 l-ABEC-Bioreaktor, enthaltend 40 l Gibco SF900 II-Medium mit Gentamicinsulfat (25 mg/l) und Amphotericin B (1 mg/l), wachsen gelassen. Die Temperatur wurde auf 27°C kontrolliert, und die gelöste Sauerstoffmenge wurde bei 50% Sättigung durch Kontrolle der Flussrate an Sauerstoff im Einlassgasstrom gehalten. Wenn eine Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml erreicht wurde, wurden die Zellen im Bioreaktor auf 20 l mittels einer mit Dampf sterilisierbaren Pumpe mit geringer Scherung und einer Tangentialströmungs-Filtrationsvorrichtung mit Millipore-Prostak-0.45 Micron-Membranen konzentriert. Nach der Konzentration wurde frisches, steriles Wachstumsmedium langsam zu dem Bioreaktor zugegeben, während das Filtrationssystem fortfuhr, das verbrauchte Wachstumsmedium durch Diafiltration zu entfernen. Nach zwei Volumenaustauschen wurden 20 l zusätzliches frisches Medium zum Bioreaktor zugegeben, um die Zellen zum ursprünglichen Volumen von 401 zu resuspendieren.
Die Menge an erforderlicher Virusstammlösung wurde auf der Grundlage der Zelldichte, des Virustiters und der gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) berechnet. Die Multiplizitätsanteile zwischen 1 und 10 PBE/Zelle wurden wirksam genutzt. Die Virusstammlösung wurde aseptisch zum Bioreaktor zugegeben, und die Infektion wurde für drei bis vier Tage laufen gelassen.
Gewinnung und chromatographische Reinigung
Nach Abschluss der Infektionsphase des Bioreaktorprozesses wurden die Zellen im Bioreaktor mittels einer 30 ft²-Millipore-Prastak-Filter (0.45 micron-Porengröße) konzentriert. Das zellfreie Permeat, das durch den Filter läuft, wurde in einem sauberen Verarbeitungssgefäß gesammelt. Das Protein wurde in einen Puffer mit niedriger Leitfähigkeit (20 mM Citrat, pH 5.5) mittels Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationsmembrankassetten mit insgesamt 20 ft² mit einem nominellem Ausschluss von 10 Kilodalton diafiltriert. Das zurückgehaltene Protein wurde auf eine Kationenaustauschsäule (Pharmacia SP Sepharose FF) geladen, die mit 20 mM Citratpuffer, pH 5.5, äquilibriert wurde. Nach Laden wurde das Protein zuerst mit 20 mM Citrat, 200 mM Natriumchlorid, pH 5.5, gewaschen, dann mit 20 mM Bicin, pH 8.0, um verunreinigende Proteine zu entfernen. Das Protein wurde mit einem 0–750 mM linearen Natriumchloridgradienten über 7.5 Säulenvolumina eluiert. Es erfolgte ein Pufferaustausch des eluierten Agrins in 20 mM Tris, pH 8.5, um Salze für die anschließende Bindung an eine Anionenaustauschsäule zu entfernen.
Das Agrin wurde dann an eine Pharmacia-Q Sepharose FF-Säule gebunden, die mit 20 mM Tris, pH 8.5, äquilibriert war. Nach Laden wurde die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, um verunreinigende Proteine zu entfernen, und das Protein mit einem 0–250 mM Natriumchloridgradienten eluiert. Die Fraktionen, die Agrin enthielten, wurden gesammelt und konzentriert und gegen PBS dialysiert, enthaltend Calcium und Magnesium.
Expression von menschlichem Agrin (4-8) in COS-7-Zellen
Lipofectamin-Reagens (GIBCO-BRL, Inc.) und empfohlene Protokolle wurden verwendet, um COS-7-Zellen mit dem menschlichen Agrin-cDNA-Clon pMT21-Agrin 4-8, das eine Nucleotidsequenz enthält, die die Sequenz der acht Aminosäuren ELANEIPV an der der Position Z des Agrins der Ratte entsprechenden Position enthält, zu transfizieren. COS-Medien, die den sezernierten Liganden enthielten, wurden nach drei Tagen geerntet und 20fach durch Diafiltration konzentriert (DIAFLO Ultrafiltrationsmembranen, Amicon, Inc.). Die Menge an aktivem menschlichem Agrin, die in den Medien vorhanden ist, wurde bestimmt und als die Menge (in Resonanzeinheiten, R. U.) von MuSK-Rezeptor-spezifischer Bindungsaktivität exprimiert, die mittels eines BIAcore-Bindungstests gemessen wurde.
BEISPIEL 11 – HERSTELLUNG VERKÜRZTER MOLEKÜLE, ENTHALTEND DEN MuSK AKTIVIERENDEN TEIL VON MENSCHLICHEM AGRIN
Es wurde kürzlich berichtet, dass ein 21 kD-Fragment von Agrin des Kükens ausreichend ist, um die AChR-Aggregation zu induzieren (Gesemann, M., et al., 1995, J. Cell. Biol. 128: 625–636). Die Anmelder entschieden daher, die Eigenschaften der verschiedenen Teile von menschlichem Agrin zu untersuchen und die Fähigkeit von jedem zu testen, die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors zu induzieren.
Wie in 15 dargelegt, ist die Aminosäuresequenz des aktiven 50 kD-Teils von menschlichem Agrin 4,8 492 Aminosäuren lang. Eine Präprotrypsin-Signalsequenz (Stevenson, et al., 1986, Nucleic Acids Res. 21: 8307–83330) geht einer FLAG-Marker-Sequenz voraus (Hopp, et al., 1988, Bio/Technology 6: 1204–1210); zusammen machen sie die ersten 23 Aminosäuren aus. Folglich beginnt die Agrin 4,8-Sequenz mit Aminosäure 24. Verkürzte Moleküle wurden entworfen, von denen jedes die Signalsequenz und den FLAG-Marker (23 Aminosäuren) enthielt, gefolgt von der Agrin 4,8-Sequenz, die N-terminalen Deletionen unterzogen wurde, um Teile von Agrin zu schaffen (mit der Bezeichnung Delta 3 bis 9), wie folgt:
Delta 3: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #60: QTAS...
Delta 4: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #76: NGFS...
Delta 5: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #126: VSLA...
Delta 6: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #178: GPRV...
Delta 7: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #222: GFDG...
Delta 8: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #260: ASGH...
Delta 9: Agrinsequenz beginnt mit Aminosäure #300: AGDV...
Alle Sequenzen erstrecken sich bis zu den terminalen Aminosäuren PCPTP, wie bei dem 50 kD-Agrin.
Die verkürzten Moleküle wurden wie folgt gemacht: PCR-Primer wurden entworfen, in Übereinstimmung mit den Nucleotidsequenzen, die die ersten und letzten 10 Aminosäuren jedes Konstrukts codieren. In den 5'-Primer eingeschlossen waren Sequenzdaten, um die Präprotrypsin-Signalsequenz und den "FLAG-Marker" an den Aminoterminus jedes Agrinfragments anzuhängen. Folglich enthält das kürzeste verkürzte Molekül (Delta 9) die Signalsequenz und den FLAG-Marker und die menschliche Agrinsequenz von Aminosäure 300 bis 492 von menschlichem c-Agrin 4,8. DNA, codierend die "Delta"-Formen von verkürztem c-Agrin 4,8, wurde dann in einen eukaryontischen Expressionsvektor cloniert, und transiente Transfektionen wurden, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Glass, D., et al., 1991, Cell 66: 405–413; Ip, N.Y., et al., 1992, PNAS (USA) 89: 3060–3064).
Die Agrinmengen in den COS transfizierten Überständen wurden durch Western-Analyse der konditionierten Medien mit einem Agrin-spezifischen Antikörper (Stressgen 131) bestimmt, mittels einer gereinigten Agrinkontrolle bekannter Konzentration. Jedes der verkürzten Moleküle wurde exprimiert und es wurde gezeigt, dass es die Tyrosinphosphorylierung des MuSK-Rezeptors induzieren kann.
16 zeigt, dass das verkürzte Delta 9-Molekül die Phosphorylierung des MuSK-Rezeptors induzieren kann, wenn auch mit geringerer Effizienz als das 50 kD-Agrin 4,8-Molekül. Folglich zeigte jedes der hergestellten verkürzten Moleküle die biologische Aktivität von menschlichem Agrin 4,8 in Bezug auf den MuSK-Rezeptor.
BEISPIEL 12 – PEGYLIERUNG VON AGRIN 4,8 UND PHARMAKOKINETISCHE STUDIE
Nach intravenöser Verabreichung wurde das 50 kD-Agrin 4,8 schnell aus der systemischen Zirkulation mit einer Halbwertszeit von < 10 Minuten entfernt (vgl. 17). Es war bekannt, dass die Eigenschaften bestimmter Proteine durch Anhängen von Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren verändert werden können, was das hydrodynamische Volumen des Proteins erhöht und daher seine Entfernung durch Nierenfiltration verlangsamt. (Vgl. z. B. Clark, R., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 21969–21977). Daher, als Versuch, seine zirkulierende Halbwertszeit zu erhöhen, wurde Agrin 4,8 durch kovalentes Anhängen eines Polyethylenglykolmoleküls verändert, und die Wirkung auf die Halbwertszeit des Proteins im Serum wurde untersucht.
Eine Lösung von 500 mg menschlichem Agrin 4,8 zu 3.0 mg/ml wurde zu dem Reaktionsgefäß zugegeben, und die PEGylierungs-Reaktion wurde durch Zugabe von Monomethoxypolyethylenglykolsuccinimidylpropionat (PEG) gestartet (ungefähres Molekulargewicht = 20,000 Dalton). Ein Verhältnis von 1.75 Mol PEG-Reagens zu Agrin wurde für die Reaktion verwendet, die bei einem pH-Wert von 7.3 bis 8.5 in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 2 Stunden durchgeführt wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 mM Trishydrochlorid gestoppt.
Das PEGylierte Agrin wurde mit einem Puffer bei einem pH-Wert von 8.2 verdünnt, um sowohl die Leitfähigkeit als auch die Konzentration an Tris zu verringern, bevor es auf eine Kationenaustauschsäule (Pharmacia-SP High Performance) geladen wurde. Die Säule wurde mittels eines Gradienten von 0 bis 600 mM Natriumchlorid in Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 8.2 eluiert. Zahlreiche verschiedenen Formen von PEGyliertem Agrin eluierten entlang des Gradienten, und unverändertes Agrin eluierte bei hohen Salzgehalt am Ende des Gradienten. Monopegylierte Formen wurden selektiv für das anschließende Testen in vivo vereint.
Erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (männlich oder weiblich) mit einem Gewicht von 300–500 g wurden mit Ketamin/Xylazin (50/10 mg/kg) anästhetisiert, und die Muskeln des rechten Hinterbeins wurden durch Zertrennen des Ischiasnervs auf mittlerer höhe des Oberschenkels denerviert. Nach 10–14 Tagen (wenn die MuSK-Expression im denervierten Muskel deutlich erhöht war) wurden die Ratten wieder anästhetisiert, und die rechte Jugularvene wurde durch Schnitt-Chirurgie bloßgelegt. Den Ratten wurden Dosen von Agrin 4,8 oder PEG-Agrin 4,8, die von 1–10 mg/kg reichten, in die Jugularvene mit einer 27 Gauge-Nadel verabreicht. Nach Injektion wurde die Wunde genäht, und Blutproben des Schwanzes wurden bei 0 (vor der Injektion), 5, 10, 15, 30 Minuten und 1, 2, 4, 6, 8, 16, 24 und 48 Stunden nach der Injektion entnommen. Serumproben wurden aus dem zentrifugierten Blut geerntet und mittels eines ELISAs getestet. Serummengen wurden in μg/ml Serum ausgedrückt.
Wie in 17 gezeigt, wurde Agrin 4,8 in einer Menge von 10 mg/kg, i. v., schnell aus dem Blut mit einer Halbwertszeit von ~10 Minuten entfernt. Dagegen war die Halbwertszeit von PEG-Agrin 4,8 (auch bei 10 mg/kg, i. v.) dramatisch ~10fach erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Veränderung von Agrin 4,8 mit PEG seine apparente Halbwertszeit im Blut sehr erhöht. Folglich kann PEGyliertes Agrin eine verlängerte Aktivität auf MuSK in denerviertem Skelettmuskel besitzen und kann so eine wirksamere Behandlung für muskuläre Erkrankungen und Zustände wie Muskelatrophie ergeben. Es wird erwartet, dass die PEGylierung der vorstehend beschriebenen verkürzten Agrinmoleküle ihre apparenten Halbwertszeiten im Blut ähnlich erhöhen würden.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Ein Clon mit der Bezeichnung pBluescript SK enthaltend-containing dmk wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 am 13. Juli 1993 unter der ATCC-Eingangsnr. 75498 hinterlegt. Rekombinantes Autographa california-Baculovirus, codierend Dmk-RB der Ratte (z. B. MuSK-IgG1-Rezeptorkörper der Ratte), wurde als "vDmk-Rezeptorkörper" bezeichnet und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 am 16. Mai 1995 unter der ATCC-Eingangsnr. VR-2507 hinterlegt. Der cDNA-Clon pBL-hAgrin1 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 am 12. Dezember 1995 unter der ATCC-Eingangsnr. 97378 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung ist nicht im Rahmen durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen eingeschränkt. Tatsächlich werden verschiedene Veränderungen der Erfindung zusätzlich zu denen, die hier beschrieben wurden, dem Fachmann von der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren offensichtlich werden. Solche Veränderungen sind beabsichtigt, in den Rahmen der angehängten Patentansprüche zu fallen.

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das den Teil des menschlichen Agrins codiert, der den MuSK-Rezeptor aktiviert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) der Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 60 bis 492 oder ein Fragment davon codiert, das mindestens Aminosäuren 300 bis 492 codiert; (b) einer Nucleotidsequenz, die sich von der Nucleotidsequenz von (a) unterscheidet durch die Abwesenheit eines Inserts, das dem Insert an Position Y in 15 entspricht, und/oder durch die Abwesenheit eines Inserts, das dem Insert an Position Z in 15 entspricht, und/oder durch die Anwesenheit einer Nucleinsäure, die ein weiteres Insert codiert, das die Aminosäuresequenz VLSASHPLTVSGASTPR hat, die unmittelbar auf das Insert an Position Y in 15 folgt; (c) einer Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz von (a) oder (b) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das den MuSK-Rezeptor aktiviert und das zu nicht mehr als dem in (a) oder (b) definierten Agrinfragment äquivalent ist; (d) einer Nucleotidsequenz, die sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen (a), (b) oder (c) unterscheidet und die ein Polypeptid codiert, das den MuSK-Rezeptor aktiviert.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, ausgewählt aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 60 bis 492 codiert; (b) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 76 bis 492 codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 126 bis 492 codiert; (d) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 178 bis 492 codiert; (e) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 222 bis 492 codiert; (f) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 260 bis 492 codiert; und (g) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 300 bis 492 codiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 2, ausgewählt aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 60 bis 492 codiert; (b) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 76 bis 492 codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 126 bis 492 codiert; (d) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 178 bis 492 codiert; (e) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 222 bis 492 codiert; (f) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 260 bis 492 codiert; und (g) einer Nucleotidsequenz, die die in 15 dargestellten Aminosäuren 300 bis 492 codiert.
Isoliertes Polypeptid, das von einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, 2 oder 3 codiert wird.
Polypeptid nach Anspruch 4, das durch die kovalente Bindung eines Polyethylenglykolmoleküls modifiziert ist.
Vektor, der das isolierte Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfasst.
Expressionsvektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfasst, wobei das Nucleinsäuremolekül mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verknüpft ist.
Wirtsvektorsystem für die Herstellung eines Polypeptids, das den MuSK-Rezeptor aktiviert, umfassend den Vektor nach Anspruch 7 in einer geeigneten Wirtszelle.
Wirtsvektorsystem nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle ist.
Wirtsvektorsystem nach Anspruch 9, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, die E. coli ist, eine Hefezelle, die Pichia pastoris ist, eine Insektenzelle, die Spodoptera frugiperda ist, oder eine Säugerzelle, die eine COS-Zelle oder eine CHO-Zelle ist, darstellt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das den MuSK-Rezeptor aktiviert, umfassend das Züchten von Zellen des Wirtsvektorsystems nach Anspruch 8, 9 oder 10 unter Bedingungen, die die Herstellung des Polypeptids und die Gewinnung des so hergestellten Polypeptids erlauben.
Verfahren zur Förderung des Wachstums, der Differenzierung oder des Überlebens einer den MuSK-Rezeptor exprimierenden Zelle in vitro, das das Verabreichen einer effektiven Menge Agrin oder eines Teils davon, die die Aktivierung des MuSK-Rezeptors bewirkt, an die Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die einen MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle eine Zelle ist, die normalerweise im Muskel, im Herz, in der Milz, im Eileiter oder in der Retina zu finden ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die einen MuSK-Rezeptor exprimierende Zelle eine Zelle ist, die gentechnisch verändert worden ist, um den MuSK-Rezeptor zu exprimieren.
Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen oder polyclonalen Anti-Agrin-Antikörpers oder eines Fragments davon, wobei ein Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5 oder ein Fragment davon als Immunogen eingesetzt wird.
Polypeptid, wie in Anspruch 4 oder 5 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers in der Therapie oder in einem Diagnoseverfahren.
Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bei einer Krankheit oder Erkrankung, die Muskeln befällt.
Verwendung eines wie in Anspruch 4 oder 5 definierten Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung, die Muskeln befällt.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Krankheit oder die Erkrankung Muskelatrophie ist, die aus Denervierung aufgrund von Nerventrauma, degenerativer, metabolischer oder entzündlicher Neuropathie, peripherer Neuropathie oder durch Umweltgifte oder Arzneistoffe verursachten Nervenschäden hervorgeht.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Krankheit oder die Erkrankung Muskelatrophie aufgrund einer motorischen Neuropathie, chronischer Inaktivität, metabolischen Stresses oder Ernährungsinsuffizienz, Muskeldystrophiesyndroms oder kongenitaler Myopathie ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Krankheit oder die Erkrankung eine erworbene (toxische oder entzündliche) Myopathie ist.
Arzneimittel, umfassend ein wie in Anspruch 4 oder 5 definiertes Polypeptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Nucleinsäuremolekül, wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers in der Therapie oder in einem Diagnoseverfahren.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 23 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bei einer Krankheit oder Erkrankung, die Muskeln befällt.
Verwendung eines wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definierten Nucleinsäuremoleküls zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung, die Muskeln befällt.
Arzneimittel, umfassend ein wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiertes Nucleinsäuremolekül und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.