DE69535221T2

DE69535221T2 - Cardiotrophin und verwendung davon

Info

Publication number: DE69535221T2
Application number: DE69535221T
Authority: DE
Inventors: Joffre El Granada BAKER; Kenneth La Jolla CHIEN; Kathleen Pacifica KING; Diane Burlingame Pennica; William San Mateo WOOD
Original assignee: Genentech Inc; University of California
Current assignee: Genentech Inc; University of California
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-06
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2015-04-07
Also published as: JPH09512427A; AU2635395A; EP0755446A1; JP3906314B2; CA2188017C; CA2188017A1; DE69535221D1; US5624806A; US5723585A; US5679545A; DK0755446T3; AU697165B2; WO1995029237A1; ES2276393T3; MX9604985A; US5627073A; ATE339503T1; EP0755446B1; US5571675A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Anmeldung betrifft einen Herzhypertrophiefaktor (auch als Cardiotrophin bekannt) zur Modulation der Herzfunktion bei der Behandlung von Herzinsuffizienz und zur Modulation der Nervenfunktion bei der Behandlung von neurologischen Störungen.
Hintergrund der Erfindung
Herzinsuffizienz betrifft ungefähr drei Millionen Amerikaner und entwickelt sich in etwa 400.000 pro Jahr. Sie ist gegenwärtig eine der führenden Einweisungsdiagnosen in den Vereinigten Staaten. Jüngste Fortschritte bei der Behandlung von akuten Herzerkrankungen, einschließlich akutem Herzinfarkt, resultieren in einer größer werdenden Patientenpopulation, die letztendlich eine chronische Herzinsuffizienz entwickeln werden.
Die gegenwärtige Therapie für Herzinsuffizienz richtet sich in erster Linie auf die Verwendung von Inhibitoren von Angiotensin umwandelndem Enzym (ACE) und Diuretika. Während sie das Überleben beim Eintritt von Herzinsuffizienz verlängern, scheinen ACE-Inhibitoren das Fortschreiten zur Herzinsuffizienz im Endstadium zu verlangsamen, und eine wesentliche Anzahl an Patienten, die ACE-Inhibitoren erhalten, weisen eine funktionelle Klasse-III-Herzinsuffizienz auf. Darüber hinaus scheinen ACE-Inhibitoren durchwegs unfähig zu sein, die Symptome bei mehr als 60 % von Herzinsuffizienzpatienten zu lindern. und vermindern die Mortalität der Herzinsuffizienz um nur ungefähr 15-20 %. Herztransplantation ist durch die Verfügbarkeit von Spenderherzen eingeschränkt. Weiters hat die chronische Verabreichung von positiven inotropen Mitteln mit Ausnahme von Digoxin nicht zu einem brauchbaren Medikament ohne nachteilige Nebenwirkungen, wie z.B. erhöhte Arrhythmogenese, plötzlichen Tod oder schädliche Nebenwirkungen, geführt, die mit dem Überleben zusammenhängen. Diese Mängel der gegenwärtigen Therapie legen die Notwendigkeit von zusätzlichen therapeutischen Ansätzen nahe.
Eine große Menge an Daten legt nahe, dass die pathologische Hypertrophie des Herzmuskels beim Szenario der Herzinsuffizienz schädlich sein kann und durch eine Erweiterung der Herzkammer, eine Erhöhung der Wandspannung/Belastung, eine Steigerung der Länge gegenüber Breite der Herzmuskelzellen und eine begleitende Verminderung der Leistungsfähigkeit und Funktion des Herzens gekennzeichnet ist. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aktivierung der physiologischen oder kompensatorischen Hypertrophie beim Szenario der Herzinsuffizienz vorteilhaft sein kann. In der Tat ist behauptet worden, dass die Wirkungen von ACE-Inhibitoren nicht nur das Herz entlasten, sondern auch die pathologische hypertrophe Reaktion hemmen, von der angenommen worden ist, dass sie mit dem lokalisierten Renin-Angiotensin-System im Myokard verbunden ist.
Auf der Ebene der Molekularbiologie funktioniert das Herz als Synzytium von Myozyten und umgebenden Stützzellen, die Nicht-Myozyten genannt werden. Obwohl Nicht-Myozyten in erster Linie Fibroblasten-/Mesenchymzellen sind, umfassen sie auch Endothel- und Glattmuskelzellen. In der Tat stellen Myozyten, obgleich sie den Großteil der Herzmuskelmasse ausmachen, nur etwa 30 % der im Herzen vorhandenen Gesamtzellzahl dar. Wegen ihrer engen Beziehung mit Herz-Myozyten in vivo sind Nicht-Myozyten fähig, das Wachstum und/oder die Entwicklung zu beeinflussen. Diese Wechselwirkung kann direkt durch Zell-Zell-Kontakt oder indirekt über die Produktion eines parakrinen Faktors vermittelt werden. Eine derartige Verbindung in vivo ist wichtig, da sowohl die Myozyten-Anzahl als auch die extrazelluläre Matrix, mit der sie wechselwirken, bei Herzhypertrophie und in Reaktion auf Verletzung und Infarkt erhöht sind. Diese Veränderungen sind mit abnormaler Herzfunktion verbunden.
Herz-Myozyten sind unfähig, sich kurz nach der Geburt zu teilen. Weiteres Wachstum tritt durch Hypertrophie der einzelnen Zellen auf. Zellkulturmodelle von Myozyten-Hypertrophie sind entwickelt worden, um die Mechanismen der Herz-Myozyten-Hypertrophie besser zu verstehen. Simpson et al., Circ. Res. 51, 787-801 (1982); Chien et al., FASEB J. 5, 3037-3046 (1991). Die meisten Untersuchungen von Herz-Myozyten in Kultur sind konstruiert, um die Kontamination durch Nicht-Myozyten zu minimieren. Siehe beispielsweise Simpson und Savion, Cir. Cres. 50, 101-116 (1982); Libby, J. Mol. Cell. Cardiol. 16, 803-811 (1984); Iwaki et al., J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
Shubaita et al, J. Biol. Chem. 265, 20555-20562 (1990), dokumentierten den Nutzen eines Kulturmodells, um Peptid-hergeleitete Wachstumsfaktoren, wie z.B. Endothelin-1, zu identifizieren, das eine hypertrophe Reaktion aktivieren kann. Long et al., Cell Regulation 2, 1081-1095 (1991), untersuchten die Wirkung der Herz-Nicht-Myozyten auf das Herz-Myozyten-Wachstum in Kultur. Hypertrophes Myozyten-Wachstum wurde in Hochzelldichtekulturen mit erhöhter Anzahl an Nicht-Myozyten und in Co-Kulturen mit erhöhter Anzahl an Nicht-Myozyten stimuliert. Diese Wirkung von Nicht-Myozyten auf die Myozyten-Größe konnte durch serumfreies Medium, das durch Nicht-Myozyten-Kulturen konditioniert war, nachvollzogen werden. Die hauptsächliche, das Myozyten-Wachstum fördernde Aktivität in den Kulturen war Heparin-Bindung. Die Eigenschaften dieses Wachstumsfaktors wurden mit verschiedenen Wachstumsfaktoren verglichen, die bekanntermaßen im Herzen vorhanden sind, einschließlich Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF), Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) und transformierender Wachstumsfaktor Beta-1 (TGF-β1). Der Wachstumsfaktor von Long et al. erwies sich als größer als diese anderen bekannten Wachstumsfaktoren und wies ein anderes Heparin-Sepharose-Elutionsprofil als alle diese Wachstumsfaktoren mit Ausnahme von PDGF auf. Außerdem wurde er durch einen PDGF-spezifischen Antikörper nicht neutralisiert. Die Autoren schlugen vor, dass er eine parakrine Beziehung definiert, die für das Wachstum und die Entwicklung von Herzmuskelzellen wichtig ist.
Es besteht nicht nur ein Bedarf an einer Verbesserung der Therapie von Herzinsuffizienz, wie z.B. kongestiver Herzinsuffizienz, sondern auch ein Bedarf daran, eine wirksame Behandlung für neurologische Störungen anzubieten. Neurotrophe Faktoren, wie z.B. Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Nervenwachstumsfaktor, hirnabstammender neurotropher Faktor, Neurotrophin-3, -4 und -5 und ziliarer neurotropher Faktor, sind als potenzielle Mittel zur Verbesserung des Überleben von Neuronen vorgeschlagen worden, beispielsweise als Behandlung für neurodegenerative Krankheiten, wie z.B. amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Schlaganfall, Epilepsie, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit und periphere Neuropathie. Es wäre wünschenswert, eine zusätzliche Therapie für diesen Zweck bereitzustellen.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Therapie zur Prävention und/oder Behandlung von Herzinsuffizienz, wie z.B. kongestiver Herzinsuffizienz, bereitzustellen, insbesondere die Förderung physiologischer Formen von Hypertrophie oder Hemmung von pathologischen Formen von Hypertrophie, und zur Prävention und/oder Behandlung von neurologischen Störungen, wie z.B. periphere Neuropathie.
Es ist ein weiteres Ziel, eine neue Gruppe von Herzhypertrophiefaktor-Polypeptiden und Antagonisten dagegen zur Verwendung bei derartigen Therapien zu identifizieren.
Es ist noch ein weiteres Ziel, Nucleinsäure bereitzustellen, die für derartige Polypeptide kodiert, und diese Nucleinsäure zu verwenden, um die Polypeptide in rekombinanter Zellkultur herzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel, Derivate und modifizierte Formen derartiger Polypeptide, einschließlich Aminosäuresequenzvarianten und kovalente Derivate davon, bereitzustellen.
Es ist ein zusätzlichen Ziel, Immunogene zur Herstellung von Antikörpern gegen derartige Polypeptide herzustellen sowie Antikörper zu erlangen, die diese binden können.
Es ist noch ein weiteres Ziel, einen neuen Hypertrophietest bereitzustellen, der beispielsweise bei der Expressionsklonierung und Reinigung derartiger Polypeptide, bei der Beurteilung von aus der Expressionsklonierung isolierten Klonen und bei der I dentifizierung von Antagonisten gegen derartige Polypeptide verwendet werden kann.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden dem durchschnittlichen Fachmann nach Betrachtung der Patentbeschreibung als Ganzes offensichtlich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein In-vitro-Neugeborenen-Ratten-Herzhypertrophietest ist entwickelt worden, der die Expressionsklonierung und Proteinreinigung des hierin offenbarten Herzhypertrophiefaktors (CHF) ermöglicht. Die Testkapazität von 1.000 Einzelproben pro Woche, gekoppelt mit der geringen notwendigen Probengröße von 100 μl und weniger hat die Expressionsklonierung und Proteinreinigung ermöglicht, die unter Anwendung der gegenwärtig veröffentlichten Verfahren unmöglich gewesen wäre. Daher stellt die Erfindung in einer ihrer Ausführungsformen ein Verfahren zum Testen einer Testprobe auf hypertrophe Aktivität bereit, das Folgendes umfasst:

(a) das Ausplattieren einer Suspension von Myozyten bei einer Zelldichte von etwa 7,5 × 10⁴ Zellen pro ml in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM)/F-12-Medium, das Insulin, Transferrin und Aprotinin umfasst, in 96-Well-Platten;
(b) das Kultivieren der Zellen;
(c) das Zusetzen der Testprobe (wie z.B. einer, von der vermutet wird, dass sie ein CHF enthält) zu den kultivierten Zellen; und
(e) das Messen, ob die Testprobe hypertrophe Aktivität aufweist.

Außer dem Test stellt die Erfindung ein isoliertes Herzhypertrophiefaktor-(CHF-)Polypeptid mit Ausnahme von jenem der Ratte bereit, das zumindest 75 % Sequenzidentität mit der in 1 gezeigten translatierten Sequenz gemeinsam hat und eine biologische Aktivität der hypertrophen, inotropen, anti-arrhythmischen oder neurotrophen Aktivität eines nativen CHF-Polypeptids zeigt.
Außerdem kann das CHF-Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus dem Polypeptid besteht, das aus einem Säugetier isoliert wird, dem Polypeptid, das durch rekombinante Mittel hergestellt wird, und dem Polypeptid, das durch synthetische Mittel hergestellt wird. Weiters kann dieses CHF-Polypeptid aus der Gruppe gewählt werden, das aus dem Polypeptid besteht, das menschlich ist, und dem Polypeptid, das in einem Menschen nicht immunogen ist.
In einem weiteren Aspekt ist das Polypeptid das reife menschliche CHF mit der in 5 gezeigten, translatierten CHF-Sequenz.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen isolierten Antikörper bereit, der zur Bindung von CHF fähig ist, sowie ein Verfahren zum Nachweis von CHF in vitro oder in vivo, das das Kontaktieren des Antikörpers mit einer Probe oder Zelle, von der vermutet wird, dass sie CHF enthält, und das Nachweisen umfasst, ob eine Bindung aufgetreten ist, wie z.B. mit einem ELISA. Der Antikörper kann monoklonale, chimäre, humanisierte, bispezifische Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon umfassen.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von CHF bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass ein Gemisch von CHF über eine Säule geschickt wird, an die Antikörper gebunden sind, sowie das Gewinnen der CHF enthaltenden Fraktion.
In weiteren Aspekten umfasst die Erfindung ein isoliertes, für CHF kodierendes Nucleinsäuremolekül, einen das Nucleinsäuremolekül umfassenden Vektor, vorzugsweise einen Expressionsvektor, der das Nucleinsäuremolekül umfasst, das operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden, eine das Nucleinsäuremolekül umfassende Wirtszelle, einschließlich Säugetier- und bakterielle Wirtszellen, und ein Verfahren der Verwendung eines für CHF kodierenden Nucleinsäuremoleküls, um die Produktion von CHF zu bewirken, umfassend das Kultivieren der das Nucleinsäuremolekül umfassenden Wirtszelle. Vorzugsweise wird die Wirtszelle transfiziert, um CHF-Nucleinsäure zu exprimieren, und das CHF wird aus der Wirtszellkultur gewonnen und, falls sekretiert, aus dem Kulturmedium gewonnen.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das die in 1 oder 5 gezeigte Nucleinsäuresequenz des offenen Leserasters umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren der Bestimmung der Gegenwart eines CHF-Nucleinsäuremoleküls in einer Testprobe bereitgestellt, umfassend das Kontaktieren des CHF-Nucleinsäuremoleküls mit der Testprobe und das Ermitteln, ob eine Hybridisierung aufgetreten ist, oder umfassend das Hybridisieren des CHF-Nucleinsäuremoleküls an eine Testproben-Nucleinsäure und Ermitteln der Gegenwart von CHF-Nucleinsäure.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren der Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe bereit, das das Primen einer Nucleinsäure-Polymerasekettenreaktion in der Testprobe mit dem CHF-Nucleinsäuremolekül umfasst.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1A und 1B stellen die Nucleotidsequenz (Sinn- und Antisense-Stränge) (Seq.-ID Nr. 1 und 2) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) eines Maus-CHF-DNA-Klons dar. Die unterstrichenen komplementären Nucleotide an Position 27 zeigen den Start eines weiteren Maus-CHF-Klons, der zur Erlangung des Klons voller Länge verwendet wurde.
2 gleicht die translatierte Aminosäuresequenz des Maus-CHF-Klons (chf.781) (Seq.-ID Nr. 3) an die Aminosäuresequenz von menschlichem ziliarem neurotrophem Faktor (humcntf) (Seq.-ID Nr. 4) an, um das Ausmaß an Sequenzidentität zu zeigen.
3 zeigt eine Grafik der Freisetzung von atrialem natriuretischem Peptid (ANP) für Phenylephrin (Standardkurve) und Transfektionen in 293-Zellen in einem neonatalen Herzhypertrophietest.
4 zeigt eine Grafik des Überlebens lebender ziliarer Ganglienneuronen (gemessen mittels Zellzahl) als Funktion von entweder des Standards des ziliaren neurotrophen Faktors (CTNF) (in ng/ml) oder des transfizierten 293-konditionierten Mediums (in Bruchteilen des Testvolumens) unter Verwendung von CNTF-Standard (Kreise), Medium aus einer CHF-DNA-Transfektion von 293-Zellen (Dreiecke) und Medium aus einer Kontroll-DNA-Transfektion von 293-Zellen (Quadrate).
5A und 5B stellen die Nucleotidsequenz (Sinn- und Antisense-Stränge) (Seq.-ID Nr. 6 und 7) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 8) eines menschlichen CHF-DNA-Klons dar.
6 gleicht die translatierte Aminosäuresequenz des menschlichen CHF-Klons (humct1) (Seq.-ID Nr. 8) an die translatierte Aminosäuresequenz des Maus-CHF-Klons (chf.781) (Seq.-ID Nr. 3) an, um das Ausmaß an Sequenzidentität darzustellen.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
I. Definitionen
Im Allgemeinen haben die folgenden Begriffe und Ausdrücke die angegebene Definition, wenn sie in Beschreibung, Beispielen und Ansprüchen verwendet werden:
„CHF" (oder „Herzhypertrophiefaktor") oder „Cardiotrophin" oder „Cardiotrophin-1" ist hierin als jegliche Polypeptidsequenz definiert, die zumindest eine biologische Eigenschaft (wie unten definiert) eines natürlich vorkommenden Polypeptids besitzt, das die Polypeptidsequenz aus 1 oder die in 5 gezeigte menschliche Entsprechung davon umfasst. Es umfasst nicht das Ratten-Homolog von CHF, d.h. CHF aus der Rattenspezies. Diese Definition umfasst nicht nur das aus einer natürlichen CHF-Quelle, wie z.B. den hierin beschriebenen murinen Embryoidkörpern, oder aus einer anderen Quelle, wie z.B. einer anderen Tierspezies mit Ausnahme der Ratte, einschließlich aus dem Menschen, isolierte Polypeptid, sondern auch das durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellte Polypeptid. Es umfasst außerdem Variantenformen, einschließlich funktionelle Derivate, Allele, Isoformen und Analoga davon.
Ein „CHF-Fragment" ist ein Abschnitt einer natürlich vorkommenden reifen CHF-Sequenz voller Länge, bei der eine oder mehrere Aminosäurereste oder Kohlenhydrateinheiten deletiert sind. Der/die deletierten Aminosäurerest(e) können irgendwo im Polypeptid vorkommen, einschließlich entweder am N-terminalen oder C-terminalen Ende oder intern. Das Fragment wird zumindest eine biologische Eigenschaft mit CHF gemeinsam haben. CHF-Fragmente werden typischerweise eine zusammenhängende Sequenz von zumindest 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminsäureresten aufweisen, die mit den Sequenzen der aus einem Säugtier, einschließlich dem aus murinen Embryoidkörpern, isolierten CHF oder dem menschlichen CHF identisch sind.
Die Definition von „CHF-Varianten" oder „CHF-Sequenzvarianten" meint hierin die unten definierten biologisch aktiven CHFs, die weniger als 100 % Sequenzidentität mit dem aus rekombinanter Zellkultur oder aus murinen Embryoidkörpern isolierten CHF mit der in 1 beschriebenen, abgeleiteten Sequenz oder mit der in 5 beschriebenen menschlichen Entsprechung aufweisen. Für gewöhnlich wird eine biologisch aktive CHF-Variante eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zumindest ungefähr 70 % Aminosäuresequenzidentität mit dem aus murinen Embryoidkörpern isolierten CHF oder mit dem reifen menschlichen CHF (siehe 1 und 5), vorzugsweise zumindest ungefähr 75 %, bevorzugter zumindest ungefähr 80 %, noch bevorzugter zumindest ungefähr 85 %, noch bevorzugter zumindest ungefähr 90 % und insbesondere zumindest ungefähr 95 %, aufweist.
Ein „chimäres CHF" ist ein Polypeptid, das CHF voller Länge oder ein oder mehrere Fragmente davon aufweist, das/die an ein zweites Protein oder ein oder mehrere Fragmente davon fusioniert ist/sind. Die Chimäre wird zumindest eine biologische Eigenschaft mit CHF gemeinsam haben. Das zweite Protein wird typischerweise ein Cytokin, Wachstumsfaktor oder Hormon, wie z.B. Wachstumshormon, IGF-I oder ein neurotropher Faktor, wie z.B. CNTF, Nervenwachstumsfaktor (NGF), hirnabstammender neurotropher Faktor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4), Neurotrophin-5 (NT-5) usw., sein.
„Isoliertes CHF", „hochgereinigtes CHF" und „im Wesentlichen homogenes CHF" werden wechselseitig verwendet und meinen ein CHF, das aus einer CHF-Quelle gereinigt worden ist oder durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt worden ist und im Wesentlichen frei von anderen Peptiden oder Proteinen ist, (1) um zumindest 15 und vorzugsweise 20 Aminosäurereste der N-terminalen oder einer internen Aminosäuresequenz zu erlangen, und zwar durch Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators oder des besten im Handel erhältlichen, vermarkteten Aminosäure-Sequenators oder wie aufgrund veröffentlichter Verfahren modifiziert zum Zeitpunkt des Einreichungsdatums dieser Anmeldung oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Homogenität bedeutet hier weniger als 5 % Verunreinigung mit anderen Proteinen der Quelle.
„Biologische Eigenschaft" bedeutet bei Verwendung in Verbindung mit entweder „CHF" oder „isoliertem CHF" das Aufweisen von myokardiotropher, inotroper, antiarrhythmischer oder neurotropher Aktivität oder das Aufweisen eines In-vivo-Effektors oder einer antigenen Funktion oder Aktivität, die direkt oder indirekt von einem CHF (ob in seiner nativen oder denaturierten Konformation) oder einem Fragment davon verursacht oder ausgeführt wird. Effektorfunktionen umfassen Rezeptorbindung und jegliche Trägerbindungsaktivität, Agonismus oder Antagonismus von CHF, insbesondere die Übertragung eines Proliferationssignals, einschließlich Replikation, DNA-Regulationsfunktion, Modulation der biologischen Aktivität anderer Wachstumsfaktoren, Rezeptoraktivierung, Reaktivierung, Up- oder Down-Regulation, Zellwachstum oder Differenzierung und dergleichen. Jedoch umfassen Effektorfunk tionen nicht den Besitz eines Epitops oder einer antigenen Stelle, das/die zur Kreuzreaktion mit gegen nativen CHF hergestellten Antikörpern fähig ist.
Eine „antigene Funktion" meint den Besitz eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit Antikörpern fähig ist, die gegen das native CHF, dessen Sequenz in 1 gezeigt ist, oder ein anderes natives Säugetier-CHF, einschließlich das menschliche Homolog, hergestellt wurden, dessen Sequenz in 5 gezeigt ist. Die antigene Hauptfunktion eines CHF-Polypeptids ist es, dass es mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁶ l/mol an einen Antikörper bindet, der gegen CHF hergestellt wurde, das aus Maus-Embryoidkörpern oder einem menschlichen Homolog davon isoliert wurde. Für gewöhnlich bindet das Polypeptid mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁷ l/mol. Insbesondere bevorzugt ist das antigen aktive CHF-Polypeptid ein Polypeptid, das an einen Antikörper bindet, der gegen CHF mit einer der oben beschriebenen Effektorfunktionen hergestellt wurde. Die zur Definition von „biologischer Aktivität" verwendeten Antikörper sind polyklonale Kaninchenantikörper, die hergestellt wurden durch Formulieren des aus rekombinanter Zellkultur oder Embryoidkörpern isolierten CHF in Freundschem kompletten Adjuvans, subkutanes Injizieren der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion der Formulierung, bis der Titer des Anti-CHF-Antikörpers sein Plateau erreicht hat.
„Biologisch aktiv" meint bei Verwendung in Verbindung mit entweder „CHF" oder „isoliertem CHF" ein Polypeptid, das hypertrophe, inotrope, anti-arrhythmische oder neurotrophe Aktivität zeigt oder eine Effektorfunktion mit CHF gemeinsam hat, das aus murinen Embryoidkörpern isoliert oder in hierin beschriebener rekombinanter Zellkultur hergestellt wurde und das zusätzlich eine antigene Funktion besitzt (aber nicht besitzen muss). Eine der hauptsächlichen Effektorfunktionen von CHF oder CHF-Polypeptid hierin ist die Beeinflussung von Herzwachstum oder Hypertrophieaktivität, wie sie z.B. durch Freisetzen von atrialem natriuretischem Peptid (ANP) oder durch den hierin beschriebenen Myozyten-Hypertrophietest unter Verwendung eines/r spezifischen Ausplattiermediums und Plattendichte und vorzugsweise unter Verwendung von Kristallviolett zur Ablesung gemessen wird. Die gewünschte Funktion eines CHF (oder CHF-Antagonisten) ist die Zunahme physiologischer (vorteilhafter) Formen von Hypertrophie und Abnahme pathologischer Hypertrophie. Zusätzlich wird vom CHF hierin erwartet, das es eine anti-arrhythmische Funktion zeigt, indem ein normalerer Phänotyp gefördert wird. Eine weitere hauptsächliche Effektorfunktion des CHF oder CHF-Polypeptids hierin ist die Stimulation der Proliferation von ziliarer Ganglienneuronen von Hühnern in einem Test für CNTF-Aktivität
Als Antigen aktives CHF ist als ein Polypeptid definiert, das eine antigene Funktion von CHF besitzt und zusätzlich eine Effektorfunktion besitzt (aber nicht besitzen muss).
In bevorzugten Ausführungsformen ist als Antigen aktives CHF ein Polypeptid, das mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁶ l/mol an einen zur Bindung von CHF fähigen Antikörper bindet. Für gewöhnlich bindet das Polypeptid mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁷ l/mol. Ein isolierter, zur Bindung von CHF fähiger Antikörper ist ein Antikörper, der identifiziert und von einer Komponente der natürlichen Umgebung abgetrennt ist, in der er zugegen sein kann. Insbesondere bevorzugt ist das als Antigen aktive CHF ein Polypeptid, das an einen Antikörper bindet, der zur Bindung von CHF in seiner nativen Konformation fähig ist. CHF in seiner nativen Konformation ist CHF, wie es sich in der Natur findet, das nicht durch chaotrope Mittel, Hitze oder eine andere Behandlung denaturiert worden ist, die die dreidimensionale Struktur von CHF modifiziert, wie sie beispielsweise durch Wanderung auf nicht-reduzierenden, nicht-denaturierenden, nach Größe trennenden Gelen ermittelt wird. Der bei dieser Ermittlung verwendete Antikörper ist polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der hergestellt wird, indem natives CHF aus einer Nicht-Kaninchen-Spezies in Freundschem kompletten Adjuvans formuliert, die Formulierung subkutan injiziert und die Immunantwort durch intraperitoneale Injektion der Formulierung geboostet wird, bis der Titer des Anti-CHF-Antikörpers sein Plateau erreicht hat.
„Prozentuelle Aminosäuresequenzidentität" bezüglich der CHF-Sequenz ist hierin als prozentueller Anteil von Aminosäureresten in der Kandidatsequenz identifiziert, der mit den Resten in der aus murinen Embryoidkörpern isolierten CHF-Sequenz iden tisch ist, die die in 1 beschriebene abgeleiteten Aminosäuresequenz oder die in 5 beschriebene abgeleitete menschliche CHF-Aminosäuresequenz aufweist, und zwar nach dem Angleichen der Sequenz und, erforderlichenfalls, Einführung von Lücken zur Erzielung der maximalen prozentuellen Sequenzidentität, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt bleiben. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die CHF-Sequenz soll dahingehend ausgelegt werden, dass sie die Sequenzidentität oder Homologie beeinträchtigt. Daher umfassen beispielhafte biologisch aktive CHF-Polypeptide, die als identische Sequenzen aufweisend gelten, Präpro-CHF, Pro-CHF und reifes CHF.
„CHF-Mikrosequenzierung" kann durch ein beliebiges geeignetes Standardverfahren unter der Voraussetzung erzielt werden, dass das Verfahren ausreichend empfindlich ist. In einem solchen Verfahren wird aus SDS-Gelen oder aus einem letzten HPLC-Schritt erlangtes hochreines Polypeptid direkt durch automatischen Edman(Phenylisothiocyanat-)Abbau unter Verwendung eines mit einem 120A-Phenythiohydantoin-(PTH-)Aminosäureanalysator ausgestatteten Gasphasen-Sequenzierers, Modell 470A von Applied Biosystems, sequenziert. Zusätzlich können CHF-Fragmente durch chemischen (z.B. CNBr-, Hydroxylamin- oder 2-Nitro-5-thiocyanobenzoat-) oder enzymatischen (z.B. Trypsin-, Clostripain- oder Staphylococcus-Protease-)Verdau, gefolgt von Fragmentreinigung (z.B. HPLC) auf ähnliche Weise sequenziert werden. PTH-Aminosäuren werden unter Verwendung des ChromPerfectTM-Datensystems (Justice Innovations, Palo Alto, CA) analysiert. Die Sequenzinterpretation wird an einem Computer (VAX 11/785 Digital Equipment Co.) wie von Henzel et al., J. Chromatography 404, 41-52 (1987), beschrieben durchgeführt. Gegebenenfalls können Aliquoten von HPLC-Fraktionen einer 5-20%igen SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, auf eine PVDF-Membran (ProBlott, AIB, Foster City, CA) übertragen und mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt werden. Matsurdiara, J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987). Ein durch die Färbung identifiziertes spezifisches Protein wird aus dem Blot herausgeschnitten, und es wird die N-terminale Sequenzierung mit dem oben beschriebenen Gasphasen-Sequenator durchgeführt. Für interne Proteinsequenzen werden HPLC-Fraktionen unter Vakuum (SpeedVac) ge trocknet, in geeigneten Puffern resuspendiert und mit Bromcyan, dem für Lys spezifischen Enzym Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) oder Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) verdaut. Nach dem Verdau werden die resultierenden Peptide als Gemisch oder nach HPLC-Trennung an einer mit einem Propanolgradienten in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) entwickelten C4-Säule vor der Gasphasensequenzierung sequenziert.
„Isolierte CHF-Nucleinsäure" ist RNA oder DNA, die mehr als 16 und vorzugsweise mehr als 20 oder mehr aufeinander folgende Nucleotidbasen enthält, die für ein biologisch aktives CHF oder ein Fragment davon kodieren, zur RNA oder DNA komplementär ist oder an die RNA oder DNA hybridisiert und unter mäßig stringenten Bedingungen stabil gebunden bleibt. Diese RNA oder DNA ist frei von zumindest einer verunreinigenden Nucleinsäure der Quelle, mit der sie normalerweise in der natürlichen Quelle assoziiert ist, und vorzugsweise im Wesentlichen frei von jeglicher anderen Säugetier-RNA oder -DNA. Der Ausdruck „frei von zumindest einer verunreinigenden Nucleinsäure der Quelle, mit der sie normalerweise assoziiert ist" umfasst den Fall, wo die Nucleinsäure in der Quelle oder natürlichen Zelle vorhanden ist, sich jedoch an einem anderen chromosomalen Ort befindet oder andernfalls von Nucleinsäuren flankiert ist, die sich normalerweise nicht in der Herkunftszelle finden. Ein Beispiel von isolierter CHF-Nucleinsäure ist RNA oder DNA, die für ein biologisch aktives CHF kodiert, das zumindest 75 %, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, noch bevorzugter zumindest 90 % und insbesondere bevorzugt zumindest 95 %, Sequenzidentität mit dem murinen CHF oder mit dem menschlichen CHF aufweist.
Unter „Kontrollsequenzen" werden in Bezug auf Expression DNA-Sequenzen verstanden, die zur Expression einer operabel gebundenen Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungsstelle und möglicherweise andere bislang wenig verstandene Sequenzen. Eukaryotische Zellen setzen bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
„Operabel gebunden" bedeutet in Bezug auf Nucleinsäuren, dass die Nucleinsäuren in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäure gesetzt werden. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls derartige Stellen nicht existieren, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Bei Bezugnahme auf ein Element wird unter „exogen" eine Nucleinsäuresequenz verstanden, die der Zelle fremd ist oder mit der Zelle homolog ist, jedoch in einer Position innerhalb der Nucleinsäure der Wirtszelle, in der sich das Element für gewöhnlich nicht findet.
„Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" werden hierin wechselseitig verwendet, und derartige Bezeichnungen umfassen alle Nachkommen einer Zelle oder Zelllinie. Folglich umfassen beispielsweise Ausdrücke wie „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon hergeleitete Kulturen ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Es versteht sich außerdem, dass nicht alle Nachkommen hinsichtlich DNA-Gehalt absolut identisch sein müssen, und zwar aufgrund gezielter oder zufälliger Mutationen. Mutierte Nachkommen, die dieselbe Funktion oder biologische Aktivität wie jene aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist, sind mit umfasst. Wo unterschiedliche Bezeichnungen beabsichtigt sind, werden sie aus dem Zusammenhang klar sein.
„Plasmide" sind autonom replizierende zirkuläre DNA-Moleküle, die unabhängige Replikationsstartpunkte besitzen, und werden hierin durch den Kleinbuchstaben „p" bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, in uneingeschränkter Weise öffentlich verfügbar oder können aus derartigen erhältlichen Plasmiden nach veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind gleichwertige Plasmide auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind dem durchschnittlichen Fachmann offensichtlich.
„Restriktionsenzymverdau" bedeutet bei Bezugnahme auf DNA katalytische Spaltung interner Phosphodiesterbindungen von DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Orten oder Stellen in der DNA-Sequenz agiert. Derartige Enzyme werden „Restriktionsendonucleasen" genannt. Jede Restriktionsendonuclease erkennt eine spezifische DNA-Sequenz, die „Restriktionsstelle" genannt wird, die eine zweifache Symmetrie zeigt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und es werden ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen verwendet, wie sie von den Enzymlieferanten festgelegt wurden. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen bezeichnet, die sich aus einem Großbuchstaben, gefolgt von anderen Buchstaben zusammensetzen, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erlangt wurde, gefolgt von einer Zahl, die das jeweilige Enzym bezeichnet. Im Allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1-2 Units Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller spezifiziert. Für gewöhnlich wird eine Inkubation von 1 Stunde bei 37 °C angewendet, kann jedoch gemäß den Anleitungen des Lieferanten variieren. Nach der Inkubation wird Protein oder Polypeptid durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die verdaute Nucleinsäure wird aus der wässrigen Fraktion durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dem Verdau mit einem Restriktionsenzym kann die Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit alkalischer Phosphatase folgen, um den „Ringschluss" der beiden restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments oder die Bildung einer geschlossenen Schleife zu verhindern, die die Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Wenn nicht anders angegeben, folgt dem Verdau von Plasmiden keine 5'-terminale Dephosphorylierung. Verfahren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind die herkömmlichen, die in den Abschnitten 1.56-1.61 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben sind.
„Gewinnung" oder „Isolation" eines gegebenen Fragments von DNA aus einem Restriktionsverdau meint die Trennung des Verdaus an Polyacrylamid- oder Agarosegelen durch Elektrophorese, Identifizierung des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber jener von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht und Abtrennung des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103-6114 (1981), und Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
„Southern-Analyse" oder „Southern-Blotting" ist ein Verfahren, durch das die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Restriktionsendonucleaseverdau von DNA oder einer DNA-enthaltenden Zusammensetzung mittels Hybridisierung an ein bekanntes, markieres Oligonucleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Southern-Analyse umfasst typischerweise die elektrophoretische Trennung von DNA-Verdauungen an Agarosegelen, Denaturierung der DNA nach elektrophoretischer Trennung und Transfer der DNA auf Nitrocellulose, Nylon oder einen anderen geeigneten Membranträger zur Analyse mit einer radioaktiv markierten, biotinylierten oder enzymmarkierten Sonde, wie in den Abschnitten 9.37-9.52 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben wird.
„Northern-Analyse" oder „Northern-Blotting" ist ein Verfahren, das zur Identifizierung von RNA-Sequenzen verwendet wird, die an eine bekannte Sonde wie z.B. ein Oligonucleotid, DNA-Fragment, cDNA oder Fragment davon oder RNA-Fragment hybridisieren. Die Sonde ist mit einem Radioisotop, wie z.B. ³²P, oder durch Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise elektrophoretisch an einem Agarose- oder Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrocellulose, Nylon oder eine andere geeignete Membran übertragen und mit der Sonde unter Anwendung von Techniken hybridisiert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z.B. jenen, die in Abschnitten 7.39-7.52 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben sind.
„Ligation" ist der Vorgang der Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nucleinsäurefragmenten. Für die Ligation der beiden Fragmente müssen die Enden der Fragmente miteinander kompatibel sein. In manchen Fällen werden die Enden nach Endonucleaseverdau direkt kompatibel sein. Jedoch kann es notwendig sein, zuerst die nach Endonucleaseverdau üblicherweise produzierten überstehenden Enden zu glatten Enden umzusetzen, um sie für eins Ligation kompatibel zu machen. Zum Glätten der Enden wird die DNA in einem geeigneten Puffer für zumindest 15 Minuten bei 15 °C mit etwa 10 Units des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxyribonucleotidtriphosphaten behandelt. Die DNA wird dann durch Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die DNA-Fragmente, die miteinander zu ligieren sind, werden in etwa äquimolaren Mengen gelöst. Die Lösung wird außerdem ATP, Ligasepuffer und eine Ligase wie z.B. T4-DNA-Ligase mit etwa 10 Units pro 0,5 μg DNA enthalten. Falls die DNA in einen Vektor zu ligieren ist, wird der Vektor zuerst durch Verdau mit der/den geeigneten Restriktionsendonuclease(n) linearisiert. Das linearisierte Fragment wird dann mit bakterieller alkalischer Phosphatase oder Kälberdarm-Phosphatase behandelt, um die Selbstligation während des Ligationsschritts zu verhindern.
„Herstellung" von DNA aus Zeilen meint das Isolieren der Plasmid-DNA aus einer Kultur der Wirtszellen. Herkömmlich verwendete Verfahren zur DNA-Herstellung sind die in Abschnitten 1.25-1.33 von Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen Plasmid-Herstellungen im großen und kleinen Maßstab. Nach der Herstellung der DNA kann sie mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Verfahren, wie z.B. jenen im Abschnitt 1.40 von Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen, gereinigt werden.
„Oligonucleotide" sind kurze einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die durch bekannte Verfahren synthetisiert werden, wie z.B. durch Phosphodiester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie, unter Verwendung von Festphasentechniken, wie z.B. beschrieben in der am 4. Mai 1988 veröffentlichten EP 266.032 , oder über Desoxynucleosid-H-Phosphonat-Zwischenverbindungen, wie von Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399-5407 (1986), beschrieben wird. Weitere Verfahren umfassen die unten definierte Polymerasekettenreaktion und andere Autoprimer-Verfahren und Oligonucleotidsynthesen auf festen Trägern. Alle diese Verfahren sind in Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716-734 (1989), beschrieben. Diese Verfahren werden verwendet, wenn die gesamte Nucleinsäuresequenz des Gens bekannt oder die Sequenz der zum kodierenden Strang komplementären Nucleinsäure verfügbar ist. Alternativ dazu kann man, falls die Zielaminosäuresequenz bekannt ist, mögliche Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung bekannter und bevorzugter kodierender Reste für jeden Aminosäurerest herleiten. Die Oligonucleotide werden dann an Polyacrylamidgelen gereinigt.
„Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" bezieht sich auf ein Verfahren oder eine Technik, bei dem/der winzige Mengen eines speziellen Stücks von Nucleinsäure, RNA und/oder DNA wie im am 28. Juli erteilten US-Patent Nr. 4.683.195 beschrieben amplifiziert werden. Im Allgemeinen muss Sequenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus bekannt sein, so dass Oligonucleotidprimer konstruiert werden können; diese Primer werden hinsichtlich ihrer Sequenz mit entgegengesetzten Strängen des zu amplifizierenden Templats identisch oder zu diesen ähnlich sein. Die 5'-terminalen Nucleotide der beiden Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials übereinstimmen. PCR kann verwendet werden, um spezifische RNA-Sequenzen, spezifische DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA und aus zellulärer Gesamt-RNA transkribierte cDNA, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen usw. zu amplifizieren. Siehe allgemein Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY (1989). Wie hierin verwendet wird PCR als eines der Beispiele, jedoch nicht als einziges Beispiel eines Nucleinsäurepolymeraseverfahrens zur Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe angesehen, das die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure als Primer und einer Nucleinsäurepolymerase zur Amplifikation oder zur Erzeugung eines spezifischen Stücks von Nucleinsäure umfasst.
„Stingente Bedingungen" sind jene, die (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur zum Waschen einsetzen, beispielsweise 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % NaDodSO₄ (SDS) bei 50 °C, oder (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie z.B. Formamid, einsetzen, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS.
„Mäßig stringente Bedingungen" werden in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und von Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS), die weniger stringent als oben beschrieben sind. Ein Beispiel mäßig stringenter Bedingungen ist eine Bedingung wie z.B. Inkubation über Nacht bei 37 °C in einer Lösung, die Folgendes umfasst: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Der geübte Fachmann wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. notwendigerweise einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen zu genügen.
„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine, die dieselben strukturellen Eigenschaften aufweisen. Während Antikörper Bindungsspezifität gegen ein spezifisches Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere Antikörper-ähnliche Moleküle, denen Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in niedrigen Ausmaßen vom Lymphsystem und in erhöhten Ausmaßen von Myelomen produziert.
„Native Antikörper und Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten zusammengesetzt sind. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, während die Anzahl von Disulfidbindungen zwischen den Schwerketten verschiedener Immunglobulin-Isotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist außerdem in regelmäßigen Abständen befindliche Zwischenketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem der Enden eine variable Domäne (V_H) gefolgt von einer Anzahl konstanter Domänen auf. Jede Leichtkette weist eine variable Domäne (V_L) an einem der Enden und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist an der ersten konstanten Domäne der Schwerkette ausgerichtet, und die variable Domäne der Leichtkette ist an der variablen Domäne der Schwerkette ausgerichtet. Von bestimmten Aminosäuren wird angenommen, dass sie eine Schnittstelle zwischen den variablen Domänen der Leicht- und Schwerkette ausbilden (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-663 (1985); Novotny und Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)).
Der Ausdruck „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass sich gewisse Abschnitte der variablen Domänen hinsichtlich Sequenz unter Antikörpern stark unterscheiden und bei der Bindung und Spezifität jedes einzelnen Antikörpers für sein jeweiliges Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die variablen Domänen der Antikörper verteilt. Sie ist in drei Segmenten konzentriert, die komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) oder hypervariable Regionen in den variablen Domänen der Leicht- sowie Schwerketten genannt werden. Die stärker konservierten Abschnitte der variablen Domänen werden Gerüst-(FR-)Regionen genannt. Die variablen Domänen von nativen Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die größtenteils eine β-Faltblattkonfiguration einnehmen und durch drei CDRs verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon ausbilden. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen nahe beieinander gehalten und tragen mit den CDRs der anderen Kette zur Ausbildung der Antigenbindungsstelle von Anti körpern bei (siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, fünfte Auflage, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung von Antikörper an Antigen beteiligt, zeigen jedoch verschiedene Effektorfunktionen, wie z.B. die Teilnahme des Antikörpers an antikörperabhängiger Zelltoxizität.
Der Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die „Fab"-Fragmente genannt werden, beide mit einer einzelnen Antigenbindungsstelle und einem restlichen „Fc"-Fragment, dessen Name seine Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung liefert ein F(ab')₂-Fragment, das zwei antigenkombinierende Stellen aufweist und nach wie vor in der Lage ist, Antigen zu vernetzen.
„Fv" ist das Minimal-Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Antigenbindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Verbindung. Es ist diese Konfiguration, in der die drei CDRs jeder variablen Domäne wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Spezifität. Jedoch hat sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines nur drei für ein Antigen spezifische CDRs umfassenden Fv) die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich bei einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Anfügung einiger weniger Reste am Carboxyterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörpergelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', bei dem der/die Cysteinreste der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeglicher Vertebratenspezies können einem von zwei klar unterschiedlichen Typen zugeordnet werden, die auf Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen Kappa (κ) und Lambda (λ) genannt werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere dieser können in Unterklassen (Isotypen) weiter unterteilt werden, z.B. IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 und IgA-2. Die konstanten Schwerkettendomänen, die den unterschiedlichen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden α, δ, ε, γ bzw. μ genannt. Die Untereinheitenstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen verschiedener Klassen von Immunglobulinen sind wohlbekannt.
Der Ausdruck „Antikörper" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und umfasst speziell einzelne monoklonale Antikörper (einschließlich Agonisten- und Antagonistenantikörper) und Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörper erlangt wurde, d.h. dass die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper mit Ausnahme von möglichen natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige antigene Stelle. Darüber hinaus richtet sich jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene, gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper dahingehend vorteilhaft, dass sie durch die Hybridomkultur ohne Verunreinigung durch andere Immunglobuline synthetisiert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen Hybrid- und rekombinante Antikörper, die hergestellt werden durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines Anti-CHF-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z.B. „humanisierte Antikörper") oder einer Leichtkette mit einer Schwerkette oder einer Kette aus einer Spezies mit einer Kette aus einer anderen Spezies oder Fusionen mit heterologen Proteinen unabhängig von der Ursprungsspezies oder Immunglobulinklassen- oder Unterklassen-Bezeichnung sowie Antikörperfragmenten (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen. (Siehe z.B. Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567; Mage und Lamoyi, in: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, S. 79-97 (1987).)
Daher kennzeichnet der Modifikator „monoklonal" den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt wird, und ist nicht dahingehend auszulegen, als dass die Produktion des Antikörpers irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mittels Hybridomverfahren hergestellt werden, das erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (Cabilly et al., siehe oben).
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen ausdrücklich „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Teil der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die aus einer bestimmten Spezies stammen oder einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die aus einer anderen Spezies stammen oder einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, sowie Fragmente derartiger Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (Cabilly et al., siehe oben; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)).
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher (z.B. Maus-)Antikörper sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine aus einem nicht-menschlichen Immunglobulin stammende Minimalsequenz aufweisen. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Fv-Gerüstregion-(FR-)Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CRD- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifikationen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, bei denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird gegebenenfalls auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins, umfassen. Für weitere Einzelheiten siehe: Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).
„Nicht immunogen in einem Menschen" bedeutet, dass nach Kontaktieren des Polypeptids in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem geeigneten Gewebe eines Menschen kein Zustand der Sensitivität oder Resistenz gegen das Polypeptid nach der zweiten Verabreichung des Polypeptids nach einer geeigneten Latenzzeit (z.B. 8 bis 14 Tage) nachweisbar ist.
„Neurologische Störung" bezieht sich auf eine Störung von Neuronen, einschließlich peripherer Neuronen und Neuronen aus dem Zentralnervensystem. Beispiele derartiger Störungen umfassen alle neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. periphere Neuropathien (motorisch und sensorisch), amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schlaganfall, Huntington-Krankheit, Epilepsie und ophthaimologische Krankheiten wie z.B. jene, die die Netzhaut umfassen, z.B. diabetische Retinopathie, Netzhautdystrophie und Netzhautdegeneration, verursacht durch infantile maligne Osteopetrose, Zeroidlipofuszinose oder Cholestase oder verursacht durch Photodegeneration, Trauma, Axotomie, neutoroxisch-erregende Degeneration oder ischämische neuronale Degeneration.
„Periphere Neuropathie" bezieht sich auf eine Störung, die das periphere Nervensystem beeinträchtigt, was sich am häufigsten als eine von oder eine Kombination von motorischer, sensorischer, sensorimotorischer oder autonomer neuronaler Dysfunktion manifestiert. Die breite Vielfalt von Morphologien, die durch periphere Neuropathien an den Tag gelegt werden, können alle eindeutig einer ebenso großen Anzahl an Ursachen zugeschrieben werden. Beispielsweise können periphere Neuropathien genetisch erworben sein, können aus einer systemischen Krankheit resultieren oder können durch ein toxisches Mittel ausgelöst werden. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf distale sensorimotorische Neuropathie oder autonome Neuropathien, wie z.B. verminderte Motilität des Magen-Darm-Trakts oder Atonie der Harnblase. Mit systemischer Erkrankung zusammenhängende Beispiele von Neuropathien umfassen Post-Polio-Syndrom; Beispiele von erblichen Neuropathien umfassen Charcot-Mariesche Krankheit, Refsum-Krankheit, A-Beta-Lipoproteinämie, Tangier-Krankheit, Krabbe-Krankheit, metachromatische Leukodystrophie, Fabrysche Krankheit, Déjerine-Sottas-Syndrom; und Beispiele von Neuropathien, die durch ein toxisches Mittel bewirkt werden, umfassen jene, die durch Behandlung mit einem chemotherapeutischen Mittel, wie z.B. Vincristin, verursacht werden.
„Herzinsuffizienz" bezieht sich auf eine Abnormalität der Herzfunktion, bei der das Herz das Blut nicht mit der für die Erfordernisse metabolisierender Gewebe nötigen Geschwindigkeit pumpt. Herzinsuffizienz umfasst eine breite Auswahl von Krank heitszuständen, wie z.B. kongestive Herzinsuffizienz, Herzinfarkt und Herzrhythmusstörung.
„Behandlung" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, welche die Störung bereits aufweisen, sowie jene, die für die Störung anfällig sind, oder jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo-, Sport- und Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
Wie hierin verwendet bezieht sich „ACE-Inhibitor" auf Wirkstoffe, die Angiotensin umwandelndes Enzym hemmen, indem sie die Umsetzung von Angiotensin I zu Angiotensin II verhindern. Die ACE-Inhibitoren können bei kongestiver Herzinsuffizienz vorteilhaft sein, indem sie den systemischen Gefäßwiderstand vermindern und Kreislaufstauung lindern. Die ACE-Inhibitoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, jene, die durch die folgenden Markennamen gekennzeichnet sind: Accupril^® (Quinapril), Altace^® (Ramipril), Capoten^® (Captopril), Lotensin^® (Benazepril), Monopril^® (Fosinopril), Prinivil^® (Lisinopril), Vasotec^® (Enalapril) und Zestril^® (Lisinopril). Eines der Beispiele eines ACE-Inhibitors ist jenes, das unter dem Markennamen Capoten^® vermarktet wird. Generisch als Captopril bezeichnet wird dieser ACE-Inhibitor chemisch als 1-[(2S)-3-Mercapto-2-methylpropionyl]-L-prolin bezeichnet.
II. Art und Weise der praktischen Durchführung der Erfindung
1. CHF-Polypeptide
Bevorzugte Polypeptide dieser Erfindung sind im Wesentlichen homogene(s) CHF-Polypeptid(e), die die biologische Eigenschaft aufweisen, dass sie Myozytenhypertrophisch sind und die Entwicklung von ziliaren Neuronen von Hühnern in ei nem CNTF-Test stimulieren. Bevorzugtere CHFs sind isolierte(s) Säugetierprotein(e) mit hypertropher, anti-arrhythmischer, inotroper und neurologischer Aktivität. Insbesondere bevorzugte Polypeptide dieser Erfindung sind Maus- und Mensch-CHFs einschließlich Fragmente davon mit hypertropher, anti-arrhythmischer, inotroper und neurologischer Aktivität. Gegebenenfalls fehlt diesen murinen und menschlichen CHFs die Glykosylierung.
Optionale bevorzugte Polypeptide dieser Erfindung sind biologisch aktive CHF-Variante(n) mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest 70 % Aminosäuresequenzidentität mit dem murinen CHF aus 1, vorzugsweise zumindest 75 %, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, noch bevorzugter zumindest 90 % und insbesondere bevorzugt zumindest 95 %, aufweist (d.h. 70-100 %, 75-100 %, 80-100 %, 90-100 % bzw. 95-100 % Sequenzidentität). Alternativ dazu weist/en die bevorzugte(n) biologisch aktive(n) CHF-Variante(n) eine Aminosäuresequenz auf, die zumindest 70 %, vorzugsweise zumindest 75 %, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, noch bevorzugter zumindest 90 % und insbesondere bevorzugt zumindest 95 %, Aminosäuresequenzidentität mit der menschlichen CHF-Sequenz aus 5 aufweist/en (d.h. 70-100 %, 75-100 %, 80-100 %, 85-100 %, 90-100 % bzw. 95-100 % Sequenzidentität).
Das aus murinen Embryoidkörpern klonierte CHF weist die folgenden Eigenschaften auf:

(1) es hat ein mittels reduzierender SDS-PAGE gemessenes Molekulargewicht von etwa 21-23 kD;
(2) es zeigt positive Aktivität im ziliaren Hühnerneuronentest und in den Myozyten-Hypertrophie- und ANP-Freisetzungs-Hypertrophietests.

Bevorzugtere CHF-Polypeptide sind jene, die von genomischer DNA oder cDNA kodiert werden und die Aminosäuresequenz des in 1 beschriebenen murinen CHF oder die Aminosäuresequenz des in 5 beschriebenen menschlichen CHF aufweisen.
Andere bevorzugte natürlich vorkommende biologisch aktive CHF-Polypeptide dieser Erfindung umfassen Präpro-CHF, Pro-CHF, Prä-CHF, reifes CHF und Glykosylierungsvarianten davon.
Andere bevorzugte Polypeptide dieser Erfindung umfassen CHF-Sequenzvarianten und chimäre CHFs. Für gewöhnlich sind bevorzugte CHF-Sequenzvarianten biologisch aktive CHF-Varianten, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zumindest 70 % Aminosäuresequenzidentität mit dem menschlichen oder murinen CHF, vorzugsweise zumindest 75 %, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, noch bevorzugter zumindest 90 % und insbesondere bevorzugt zumindest 95 %, aufweisen. Eine beispielhafte bevorzugte CHF-Variante ist eine CHF-Variante einer C-terminalen Domäne, bei der ein oder mehrere der basischen oder dibasischen Aminosäurereste (z.B. R oder K) durch (einen) nicht-basische(n) Aminosäurerest(e) ersetzt ist/sind (z.B. hydrophob, neutral, sauer, aromatisch, Gly, Pro und dergleichen).
Eine weitere beispielhafte bevorzugte CHF-Sequenzvariante ist eine „Domänenchimäre", bei der die N-terminalen Reste mit einem oder mehreren, jedoch nicht allen der wie in 2 gezeigt ungefähr ausgerichteten menschlichen CNTF-Reste substituiert sind. Bei dieser Ausführungsform würden die CHF-Chimären einzelne oder Blöcke von Resten aus der menschlichen CNTF-Sequenz aufweisen, die an Positionen an die CHF-Sequenz angefügt oder in diese substituiert sind, die der in 2 gezeigten Ausrichtung entsprechen. Beispielsweise könnten ein oder mehrere jener CNTF-Segmente, die nicht homolog sind, in die entsprechenden Segmente von CHF substituiert werden. Es ist vorgesehen, dass diese „CHF-CNTF-Domänenchimäre" gemischte hypertrophe/anti-arrhythmische/inotrope/neurotrophe biologische Aktivität aufweisen werden.
Andere bevorzugte Polypeptide dieser Erfindung umfassen CHF-Fragmente, die eine aufeinander folgende Sequenz von zumindest 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten, vorzugsweise etwa 10-150 Resten, aufweisen, die identisch mit der Sequenz des aus murinen Embryoidkörpern isolierten CHF oder mit jener des entspre chenden menschlichen CHF ist. Andere bevorzugte CHF-Fragmente umfassen jene, die als Ergebnis chemischer oder enzymatischer Hydrolyse oder Verdauung des gereinigten CHF produziert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von CHF-Molekülen, umfassend das Kontaktieren einer die zu reinigenden CHF-Moleküle enthaltenden CHF-Quelle mit einem immobilisierten Rezeptor oder Antikörper-Polypeptid unter Bedingungen, wodurch die zu reinigenden CHF-Moleküle selektiv an den/das immobilisierte(n) Rezeptor oder Antikörper-Polypeptid adsorbiert werden, Waschen des immobilisierten Trägers zur Entfernung von nicht adsorbiertem Material und Eluieren der zu reinigenden Moleküle vom immobilisierten Rezeptor oder Antikörper-Polypeptid, an den/das sie adsorbiert sind, mit einem Elutionspuffer. Die das CHF enthaltende Quelle kann/können eine Zellsuspension oder Embryoidkörper sein.
Alternativ dazu ist die das CHF enthaltende Quelle die rekombinante Zellkultur, wo die Konzentration von CHF entweder im Kulturmedium oder in Zelllysaten allgemein höher als im Plasma oder in anderen natürlichen Quellen ist. In diesem Fall ist das oben beschriebene Immunoaffinitätsverfahren, obgleich nach wie vor zweckdienlich, üblicherweise nicht notwendig, und es können herkömmlichere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Proteinreinigungsverfahren angewendet werden. Zusammenfassend umfasst das bevorzugte Reinigungsverfahren zur Herstellung von im Wesentlichen reinem CHF: Entfernen partikulärer Bruchstücke durch beispielsweise Zentrifugation oder Ultrafiltration; gegebenenfalls Konzentrieren des Proteinpools mit einem in Handel erhältlichen Proteinkonzentrierungsfilter; und danach Reinigen des CHF von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden, wobei die folgenden Verfahren beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren sind: durch Fraktionierung an Immunaffinitäts- oder Ionentauschersäulen; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silika oder an einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Toyopearl- und MONO-Q- oder MONO-S-Chromatographie; Gelfiltration unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75; Chromatographie an Säulen, die CHF binden, sowie Protein-A-Sepharose zur Entfernung von Verunreinigungen, wie z.B. IgG. Eines der bevorzugten Reinigungsschemata für natives sowie rekombinantes CHF verwendet eine Butyl-Toyopearl-Säule, gefolgt von einer MONO-Q-Säule und einer Umkehrphasen-C4-Säule, wie unten ausführlicher beschrieben wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung einen isolierten Antikörper bereit, der zur Bindung an das CHF fähig ist. Ein bevorzugter isolierter Anti-CHF-Antikörper ist monoklonal (Kohler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975); Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al. (Hrsg.), Bd. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985); und Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989)). Ein bevorzugter isolierter Anti-CHF-Antikörper ist einer, der an CHF mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁶ l/mol bindet. Insbesondere bevorzugt bindet der Antikörper mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁷ l/mol. Insbesondere bevorzugt wird der Antikörper gegen ein CHF hergestellt, dass eine der oben beschriebenen Effektorfunktionen aufweist.
Der zur Bindung an das CHF fähige isolierte Antikörper kann gegebenenfalls an ein zweites Polypeptid fusioniert sein, und der Antikörper oder die Fusion davon kann verwendet werden, um CHF wie oben für immobilisiertes CHF-Polypeptid aus einer Quelle zu isolieren und zu reinigen. In einem weiteren bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren des CHF in vitro oder in vivo bereit, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Antikörpers mit einer Probe, insbesondere einer Serumprobe, von der vermutet wird, dass sie das CHF enthält, sowie den Nachweis umfasst, ob eine Bindung aufgetreten ist.
Die Erfindung stellt außerdem ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das für CHF oder Fragmente davon kodiert, wobei das Nucleinsäuremolekül unmarkiert oder mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann, sowie ein Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die zu einem Nucleinsäuremolekül mit einer für ein CHF kodierenden Sequenz komplementär ist oder daran unter stringenten Bedingungen oder mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert. Eine bevorzugte CHF-Nucleinsäure ist RNA oder DNA, die für ein biologisch aktives CHF kodiert, die zumindest 75 %, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, noch bevorzugter zu mindest 90 % und insbesondere bevorzugt zumindest 95 %, Sequenzidentität mit dem murinen oder menschlichen CHF gemeinsam hat.
Bevorzugtere isolierte Nucleinsäuremoleküle sind DNA-Sequenzen, die für biologisch aktives CHF kodieren und aus Folgendem ausgewählt sind: (a) DNA auf Basis der kodierenden Region eines Säugetier-CHF-Gens (z.B. DNA, die die in 1 oder 5 bereitgestellte Nucleotidsequenz oder Fragmente davon umfasst); (b) DNA, die zur Hybridisierung an eine DNA aus (a) unter mäßig stringenten Bedingungen fähig ist; und (c) DNA, die zu einer in (a) oder (b) definierten DNA degeneriert ist, was aus der Degeneration des genetischen Codes resultiert. Es wird erwogen, dass die hierin beschriebenen neuen CHFs Elemente einer Familie von Liganden sein können, die eine geeignete Sequenzidentität aufweisen, so dass ihre DNA mit der DNA aus 1 oder 5 (oder Fragmenten davon) unter niedrigen bis moderaten Stringenzbedingungen hybridisieren kann. Daher umfasst ein weiterer Aspekt dieser Erfindung DNA, die unter niedrigen bis mäßigen Stringenzbedingungen mit DNA hybridisiert, die für die CHF-Polypeptide kodiert.
Vorzugsweise ist das Nucleinsäuremolekül cDNA, die für das CHF kodiert, und umfasst außerdem einen replizierbaren Vektor, in dem die cDNA operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einem mit dem Vektor transformierten Wirt erkannt wird. Dieser Aspekt umfasst außerdem mit diesem Vektor transformierte Wirtszellen und ein Verfahren zur Verwendung der cDNA, um die Produktion von CHF zu bewirken, umfassend das Exprimieren der für das CHF kodierenden cDNA in einer Kultur der transformierten Wirtszellen und das Gewinnen des CHF aus der Wirtszellkultur. Das auf diese Weise hergestellte CHF ist vorzugsweise im Wesentlichen homogenes murines oder menschliches CHF.
Die Erfindung umfasst außerdem ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers mit Herzinsuffizienz oder einer arrhythmischen, inotropen oder neurologischen Störung, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines CHF an das Säugetier. Gegebenenfalls wird das CHF in Kombination mit einem ACE-Inhibitor, wie z.B. Captopril, im Falle kongestiver Herzinsuffizienz oder mit einem anderen myokardiotrophen, anti-arrhythmischen oder inotropen Faktor im Falle anderer Typen von Herzinsuffizienz oder Herzstörung oder mit einem neurotrophen Molekül, wie z.B. IGF-I, CNTF, NGF, NT-3, BDNF, NT-4, NT-5 usw., im Falle einer neurologischen Störung verabreicht.
2. Herstellung von CHF natürlicher Sequenz und Varianten
Der Großteil der untenstehenden Diskussion betrifft die Herstellung von CHF durch Kultivieren von Zellen, die mit einem CHF-Nucleinsäurevektor transformiert sind, sowie das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur. Es wird außerdem ins Auge gefasst, dass das CHF dieser Erfindung durch homologe Rekombination hergestellt werden kann, wie in der am 16. Mai 1991 veröffentlichten WO 91/06667 vorgesehen ist. Zusammenfassend umfasst dieses Verfahren das Transformieren primärer Säugetierzellen, die endogenes CHF-Gen enthalten (z.B. menschliche Zellen, falls das gewünschte CHF ein menschliches ist), mit einem Konstrukt (z.B. Vektor), der ein amplifizierbares Gen (wie z.B. Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder andere unten erörterte) und zumindest eine flankierende Region einer Länge von zumindest ungefähr 150 bp umfasst, die mit einer DNA-Sequenz am Locus der kodierenden Region des CHF-Gens homolog ist, um für die Amplifikation des CHF-Gens zu sorgen. Das amplifizierbare Gen muss sich an einer Stelle befinden, die die Expression des CHF-Gens nicht stört. Die Transformation wird so durchgeführt, dass das Konstrukt homolog in das Genom der Primärzellen integriert wird, um eine amplifizierbare Region zu definieren.
Primärzellen, die das Konstrukt enthalten, werden dann mithilfe des amplifizierbaren Gens oder eines anderen im Konstrukt vorhandenen Gens selektiert. Die Gegenwart des Markergens gilt als Nachweis für die Gegenwart und Integration des Konstrukts in das Wirtsgenom. Es muss keine weitere Selektion der Primärzellen durchgeführt werden, da die Selektion im zweiten Wirt vorgenommen wird. Falls erwünscht, kann das Auftreten des homologen Rekombinationsereignisses ermittelt werden, und zwar durch Einsetzen von PCR und entweder Sequenzieren der resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen oder Bestimmen der richtigen Länge des PCR-Fragments, wenn DNA aus korrekten homologen Integranten zugegen ist, und Vermehren von nur jenen Zellen, die derartige Fragmente enthalten. Falls erwünscht, können die selektierten Zellen außerdem an dieser Stelle amplifiziert werden, indem die Zellen mit dem geeigneten Amplifikationsmittel (wie z.B. Methotrexat, falls das amplifizierbare Gen DHFR ist) Stress ausgesetzt werden, so dass mehrere Kopien des Zielgens erhalten werden. Vorzugsweise wird jedoch der Amplifikationsschritt nicht vor der unten beschriebenen zweiten Transformation durchgeführt.
Nach dem Selektionsschritt werden DNA-Abschnitte des Genoms, die ausreichend groß sind, um die gesamte amplifizierbare Region zu umfassen, aus den selektierten Primärzellen isoliert. Sekundäre Säugetierexpression-Wirtszellen werden dann mit diesen genomischen DNA-Abschnitten transformiert und kloniert, und es werden Klone selektiert, die die amplifizierbare Region enthalten. Die amplifizierbare Region wird dann mithilfe eines Amplifikationsmittels amplifiziert, wenn sie nicht bereits in den Primärzellen amplifiziert wurde. Schließlich werden die Wirtszellen der Sekundärexpression, die nunmehr mehrere Kopien der CHF enthaltenden amplifizierbaren Region umfassen, gezüchtet, um das Gen zu exprimieren und das Protein zu produzieren.
A. Isolation von für CHF kodierender DNA
Die für CHF kodierende DNA kann aus jeglicher aus Gewebe hergestellten cDNA-Bibliothek erlangt werden, von der angenommen wird, dass sie die CHF-mRNA enthält und sie in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Die mRNA wird in geeigneter Weise beispielsweise aus für sieben Tage differenzierten Embryoidkörpern hergestellt. Das CHF-Gen kann außerdem aus einer genomischen Bibliothek oder durch In-vitro-Oligonucleotidsynthese wie oben definiert unter der Voraussetzung erlangt werden, dass die vollständige Nucleotid- oder Aminosäuresequenz bekannt ist.
Bibliotheken werden mit den konstruierten Sonden gescreent, um das Gen von Interesse oder das von ihm kodierte Protein zu identifizieren. Für cDNA-Expressionsbibliotheken umfassen geeignete Sonden, beispielsweise: monoklonale oder po lyklonale Antikörper, die CHF erkennen und spezifisch daran binden; Oligonucleotide von etwa 20-80 Basen Länge, die für bekannte oder mutmaßliche Abschnitte der CHF-cDNA aus derselben oder einer anderen Spezies kodieren; und/oder komplementäre oder homologe cDNAs oder Fragmente davon, die dafür oder für ein ähnliches Gen kodieren. Geeignete Sonden zum Screening genomischer DNA-Bibliotheken umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Oligonucleotide, cDNAs oder Fragmente davon, die dafür oder für ein ähnliches Gen kodieren und/oder homologe genomische DNAs oder Fragmente davon. Das Screening der cDNA oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Anwendung der in Kapiteln 10-12 in Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen Standardverfahren durchgeführt werden.
Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für CHF kodierenden Gens ist die Anwendung des im Abschnitt 14 von Sambrook et al., siehe oben, beschriebenen PCR-Verfahrens. Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von Oligonucleotidsonden, die an das CHF hybridisieren. Strategien zu Auswahl von Oligonucleotiden sind unten beschrieben.
Ein bevorzugtes Verfahren zur praktischen Durchführung dieser Erfindung ist die Verwendung sorgfältig ausgewählter Oligonucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Geweben, vorzugsweise differenzierten Embryoidkörpern und Plazenta-, Herz- und Gehirn-Zelllinien, aus Säugetieren zu screenen. Bevorzugter werden menschliche Embryo-, Plazenta-, Herz- und Gehirn-cDNA-Bibliotheken mit den Oligonucleotidsonden gescreent.
Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten von ausreichender Länge und ausreichend eindeutig sein, so dass falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Die tatsächliche(n) Nucleotidsequenz(en) basierten üblicherweise auf konservierten oder höchst homologen Nucleotidsequenzen. Die Oligonucleotide können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwendung degenerierter Oligonucleotide kann von besonderer Wichtigkeit sein, wo die Bibliothek aus einer Spezies gescreent wird, deren Codonverwendung unbekannt ist.
Das Oligonucleotid muss markiert sein, so dass es nach Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist die Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekanntem, ³²P-markiertem ATP mit Polynucleotidkinase, um das Oligonucleotid radioaktiv zu markieren. Jedoch können andere Verfahren verwendet werden, um das Oligonucleotid zu markieren, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Biotinylierung und Enzymmarkierung.
Von besonderem Interesse ist die CHF-Nucleinsäure, die für ein Polypeptid voller Länge kodiert. Bei manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nucleinsäuresequenz die native CHF-Signalsequenz. Nucleinsäure, die die gesamte für Protein kodierende Sequenz aufweist, wird erlangt, indem ausgewählte cDNA- oder genomische Bibliotheken unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten abgeleiteten Aminsäuresequenz gescreent werden und, falls erforderlich, unter Anwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie sie im Abschnitt 7.79 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben werden, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die möglicherweise nicht zu cDNA revers transkribiert worden sind.
B. Aminosäuresequenzvarianten von nativem CHF
Aminosäuresequenzvarianten von nativem CHF werden hergestellt, indem geeignete Nucleotidänderungen in die native GHF-DNA eingeführt werden, oder durch In-vitro-Synthese des gewünschten CHF-Polypeptids. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der für murines CHF in 1 und für menschliches CHF in 5 gezeigten Aminosäuresequenz. Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird vorgenommen, um zum endgültigen Konstrukt unter der Voraussetzung zu gelangen, dass das endgültige Konstrukt die gewünschten Eigenschaften besitzt. Von Schutzumfang dieser Erfindung ausgeschlossen sind CHF-Varianten oder Polypeptidsequenzen, die das Ratten-Homolog von CHF sind. Die Aminosäureänderungen können außerdem posttranslationelle Prozesse des nativen CHF verändern, wie z.B. Ändern der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen.
Zur Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten von nativem CHF wird der Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation von der/den zu modifizierenden CHF-Eigenschaft(en) abhängen. Beispielsweise werden Kandidat-CHF-Antagonisten oder -Superagonisten zunächst ausgewählt, indem Stellen lokalisiert werden, die unter CHF und anderen Liganden, die an Elemente der Wachstumshormon-(GH-)/Cytokin-Rezeptorfamilie, insbesondere CNTF und Leukämie-hemmenden Faktor (LIF), binden, identisch oder höchst konserviert sind. Die Mutationsstellen können einzeln oder hintereinander modifiziert werden, z.B. (1) indem zuerst mit konservativ ausgewählten Aminosäuren und dann mit drastischer ausgewählten in Abhängigkeit von den erzielten Ergebnissen substituiert wird, (2) durch Deletieren des Zielrests oder (3) Insertieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse in Nachbarschaft zur lokalisierten Stelle oder Kombinationen der Optionen 1-3.
Ein zweckdienliches Verfahren zur Identifizierung gewisser Reste oder Regionen des nativen CHF-Polypeptids, die bevorzugte Orte zur Mutagenese sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt und von Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), beschrieben. Dabei wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z.B. geladene Reste, wie z.B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die eine funktionelle Sensitivität auf die Substitutionen zeigen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Varianten an den oder anstelle der Substitutionsstellen eingeführt werden. Folglich muss die Beschaffenheit der Mutation, obgleich die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, an sich nicht vorherbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, wird Alanin-Scanning- oder Zufallsmutagenese am Zielcodon oder an der Zielregion durchgeführt, und die hergestellten CHF-Varianten werden auf optimale Kombination gewünschter Aktivität gescreent.
Es gibt zwei prinzipielle Variablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: den Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation. Diese sind Varianten der Sequenz aus 1 oder 5 und können natürlich vorkommende Allele (die keine Manipulation der nativen CHF-DNA erfordern) oder vorherbestimmte Mutantenformen darstellen, die durch Mutieren der DNA hergestellt werden, um entweder zu einem Allel oder zu einer Variante zu gelangen, die sich in der Natur nicht findet. Im Allgemeinen werden Ort und Beschaffenheit der gewählten Mutation von den Eigenschaften des zu modifizierenden CHF abhängen.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend. Zusammenhängende Deletionen werden für gewöhnlich in gerader Anzahl von Resten vorgenommen, jedoch liegen einzelne oder ungeradzahlige Deletionen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Deletionen können in Regionen niedriger Homologie zwischen CHF und anderen an die GH-/Cytokin-Rezeptorfamilie bindenden Liganden eingeführt werden, die am meisten Sequenzidentität mit der menschlichen CHF-Aminosäuresequenz gemeinsam haben, um die Aktivität von CHF zu modifizieren. Deletionen aus CHF in Bereichen wesentlicher Homologie mit einer der Rezeptorbindungsstellen anderer Liganden, die an die GH-/Cytokin-Rezeptorfamilie binden, werden mit höherer Wahrscheinlichkeit die biologische Aktivität von CHF signifikant modifizieren. Die Anzahl an aufeinander folgenden Deletionen wird so gewählt, dass die Tertiärstruktur von CHF in der betroffenen Domäne, z.B. Beta-Faltblatt oder Alpha-Helix, erhalten bleibt.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen einer Länge im Bereich von einem Rest bis hin zu Polypeptiden, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen in die reife CHF-Sequenz) können im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, bevorzugter 1 bis 5, insbesondere bevorzugt 1 bis 3, liegen. Insertionen werden vorzugsweise in gerader Anzahl vorgenommen, jedoch ist dies nicht erforderlich. Beispiele terminaler Insertionen umfassen reifes CHF mit einem N-terminalen Methionylrest, einem Arte fakt der direkten Produktion von reifem CHF in rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des reifen CHF-Moleküls, um die Sekretion von reifem CHF aus rekombinanten Wirten zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus der vorgesehenen Wirtszellspezies erlangt und sind daher zu ihr homolog. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. coli, Alpha-Faktor für Hefe und Virussignale, wie z.B. Herpes-gD für Säugetierzellen.
Andere Insertionsvarianten des nativen CHF-Moleküls umfassen die Fusion immunogener Polypeptide, z.B. bakterieller Polypeptide, wie z.B. Beta-Lactamase, oder ein vom E.-coli-trp-Locus kodiertes Enzym oder Hefeprotein an den N- oder C-Terminus von nativem CHF sowie C-terminale Fusionen mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B. konstante Immunglobulinregionen (oder andere Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie in der am 6. April 1989 veröffentlichten WO 89/02922 beschrieben ist.
Eine dritte Gruppe von Varianten sind Aminosäuresubstitutionsvarianten. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im nativen CHF-Molekül entfernt und an seiner Stelle ein anderer Rest insertiert. Die Stellen von größtem Interesse für Substitutionsmutagenese umfassen Stellen, die als aktive Stelle(n) von nativem CHF identifiziert sind, und Stellen, an denen sich die in den bekannten Analoga findenden Aminosäuren bezüglich Seitenkettensperrigkeit, Ladung und Hydrophobie wesentlich unterscheiden, wo jedoch auch ein hoher Grad an Sequenzidentität an der gewählten Stelle in verschiedenen Tier-CHF-Spezies besteht oder wo die sich in bekannten, an Elemente der GH-/Cytokin-Rezeptorfamilie bindenden Liganden findenden Aminosäuren und neue CHF bezüglich Seitenkettensperrigkeit, Ladung und Hydrophobie wesentlich unterscheiden, wo jedoch auch ein hoher Grad an Sequenzidentität an der gewählten Stelle in verschiedenen Tier-Analoga derartiger Liganden besteht (z.B. unter allen der Tier-CNTF-Moleküle). Diese Analyse wird Reste hervorheben, die an der Unterscheidung von Aktivität der herzhypertrophen-, anti-arrhythmischen, inotropen und neurotrophen Faktoren beteiligt sind und daher könnten Variationen an diesen Stellen derartige Aktivitäten beeinflussen.
Andere Stellen von Interesse sind jene, bei denen bestimmte Reste des aus verschiedenen Spezies erlangten CHF unter allen Tierspezies von CHF und anderen GH-/Cytokin-Rezeptorfamilienmoleküle bindenden Liganden identisch sind, wobei dieser Grad an Übereinstimmung auf die Bedeutung bei der Erzielung der für diese Enzyme gemeinsamen biologischen Aktivität hinweist. Diese Stellen, insbesondere jene, die innerhalb einer Sequenz von zumindest drei anderen gleichartig konservierten Stellen liegen, werden auf eine relativ konservative Weise substituiert. Derartige konservative Substitutionen sind in Tabelle 1 unter der Überschrift bevorzugter Substitutionen gezeigt. Falls derartige Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität resultieren, dann werden substantiellere Änderungen, die in Tabelle 1 als beispielhafte Substitutionen bezeichnet sind, oder wie unten in Bezug auf Aminosäureklassen ausführlicher beschrieben ist, eingeführt und die Produkte gescreent.
Tabelle 1
Wesentliche Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität des nativen CHF werden erzielt, indem Substitutionen gewählt werden, die sich wesentlich unterscheiden, und zwar in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seiteketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, die die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht-konservative Substitutionen bedingen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen gegen eine andere. Derartige substituierte Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, vorzugsweise, in die verbleibenden (nicht konservierten) Stellen eingeführt werden.
In einer der Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine oder mehrere Proteasespaltstellen zu inaktivieren, die im Molekül zugegen sind. Diese Stellen werden durch Prüfung der kodierten Aminosäuresequenz identifiziert, im Falle von Trypsin beispielsweise auf einen Arginyl- oder Lysinylrest. Wenn Proteasespaltstellen identi fiziert sind, werden sie gegen proteolytische Spaltung inaktiviert, indem der Zielrest mit einem anderen Rest, vorzugsweise einem basischen Rest, wie z.B. Glutamin, oder einem hydrophoben Rest, wie z.B. Serin, substituiert wird; indem der Rest deletiert wird; oder indem ein Prolylrest unmittelbar nach dem Rest insertiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jeglicher Methionylrest, der nicht der Start-Methionylrest der Signalsequenz ist, oder jeglicher innerhalb von drei Resten N-terminal oder C-terminal von jedem derartigen Methionylrest befindliche Rest mit einem anderen Rest substituiert (vorzugsweise gemäß Tabelle 1) oder deletiert. Alternativ dazu werden etwa 1-3 Reste an derartige Stellen angrenzend insertiert.
Jegliche Cysteinreste, die nicht an der Erhaltung der richtigen Konformation von nativem CHF beteiligt sind, können ebenfalls, im Allgemeinen mit Serin, substituiert werden, um die oxidative Stabilität des Moleküls zu verbessern und anomale Vernetzung zu verhindern.
Für die Aminosäuresequenzvarianten von nativem CHF kodierende Nucleinsäuremoleküle werden durch eine Vielzahl von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Isolation aus einer natürlichen Quelle (im Falle von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten) oder Herstellung durch Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Varianten- oder einer Nicht-Varianten-Version von nativem CHF.
Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von nativer CHF-DNA. Diese Technik ist auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und wird von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Zusammenfassend wird native CHF-DNA verändert, indem ein für die gewünschte Mutation kodiertes Oligonucleotid an ein DNA-Templat hybridisiert wird, wobei das Templat die einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, das die unveränderte oder native DNA-Sequenz von CHF enthält. Nach Hybridisierung wird DNA-Polymerase verwendet, um einen voll ständigen zweiten komplementären Strang des Templats zu synthetisieren, der folglich den Oligonucleotidprimer enthalten und für die gewählte Veränderung in der nativen CHF-DNA kodieren wird.
Im Allgemeinen werden Oligonucleotide einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid wird 12 bis 15 Nucleotide aufweisen, die vollständig komplementär zum Templat an beiden Seiten des/der für die Mutation kodierenden Nucleotids/e sind. Dies gewährleistet, dass das Oligonucleotid in korrekter Weise an das einzelsträngige DNA-Templat-Molekül hybridisieren wird. Die Oligonucleotide können leicht unter Anwendung von Techniken synthetisiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. mit jenen, die von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978), beschrieben werden.
Das DNA-Templat kann durch jene Vektoren erzeugt werden, die sich entweder von Bakteriophagen-M13-Vektoren (die im Handel erhältlichen M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet) oder jenen Vektoren herleiten, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten, wie von Viera et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987), beschrieben wird. Daher kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren insertiert werden, um einzelsträngiges Templat zu erzeugen. Die Herstellung des einzelsträngigen Templats wird in Abschnitten 4.21-4.41 von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben.
Alternativ dazu kann einzelsträngiges DNA-Templat erzeugt werden, indem doppelsträngige Plasmid-(oder eine andere)DNA unter Anwendung von Standardtechniken denaturiert wird.
Zur Veränderung der nativen DNA-Sequenz (beispielsweise zur Erzeugung von Aminosäuresequenzvarianten) wird das Oligonucleotid unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an das einzelsträngige Templat hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird dann zugesetzt, um den komplementären Strang des Templats unter Verwendung des Oligonucleotids als Primer für die Synthese synthetisieren. Folglich bildet sich ein Heteroduplexmolekül, so dass ein Strang für die mutierte Form von nativem CHF kodiert und der andere Strang (das ursprüngliche Templat) für die native, unveränderte Sequenz von CHF kodiert. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in einen geeigneten Wirt, üblicherweise einen Prokaryoten, wie z.B. E. coli JM101, transformiert. Nachdem die Zellen gezüchtet worden sind, werden sie auf Agaroseplatten ausplattiert und unter Verwendung des mit ³²P markierten Oligonucleotidprimers gescreent, um jene Bakterienkolonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten. Die mutierte Region wird dann entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinproduktion gesetzt, im Allgemeinen in einen Expressionsvektor des Typs, der typischerweise zur Transformation eines geeigneten Wirts eingesetzt wird.
Das gerade oben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplexmolekül erzeugt wird, worin beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthalten. Die Modifizierungen sind die folgenden: Das einzelsträngige Oligonucleotid wird wie oben beschrieben an das einzelsträngige Templat anneliert. Ein Gemisch aus drei Desoxyribonucleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP), wird mit einem modifizierten Thio-Desoxyribocytosin kombiniert, das dCTP-(aS) genannt wird (das von Amersham Corporation erhalten werden kann). Das Gemisch wird dem Templat-Oligonucleotid-Komplex zugegeben. Nach Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wird ein DNA-Strang erzeugt, der mit dem Templat mit Ausnahme der mutierten Basen identisch ist. Zusätzlich wird dieser neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP enthalten, das dem Schutz gegen Restriktionsendonucleaseverdau dient.
Nachdem der Templatstrang des doppelsträngigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym genickt worden ist, kann der Templatstrang mit ExoIII-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease hinter der Region verdaut werden, die die zu mutierende(n) Stelle(n) enthält. Die Reaktion wird dann gestoppt, um ein Molekül zu hinterlassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleotidtriphosphate, ATP und DNA- Ligase gebildet. Dieses Homoduplexmolekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle, wie z.B. E. coli JM101, wie oben beschrieben transformiert werden.
DNA, die für Mutanten von nativem CHF mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure kodiert, kann auf eine von mehreren Weisen erzeugt werden. Falls sich die Aminosäuren nahe beieinander in der Polypeptidkette befinden, können sie gleichzeitig unter Verwendung von einem Oligonucleotid mutiert werden, das für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Falls sich jedoch die Aminosäuren in einigem Abstand voneinander befinden (durch mehr als etwa zehn Aminosäuren getrennt), ist es schwieriger, ein einziges Oligonucleotid zu erzeugen, das für alle der gewünschten Änderungen kodiert.
In einem ersten Verfahren wird ein gesondertes Oligonucleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Templat-DNA anneliert, und der zweite DNA-Strang, der aus dem Templat synthetisiert wird, wird für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodieren.
Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehrere Mutageneseumläufe, um die gewünschte Mutante herzustellen. Der erste Umlauf wird für die einzelnen Mutanten beschrieben: DNA der Wildform wird für das Templat verwendet, ein für die erste(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierendes Oligonucleotid wird an dieses Templat anneliert, und ein Heteroduplex-DNA-Molekül wird dann erzeugt. Der zweite Mutageneseumlauf setzt die im ersten Umlauf der Mutagenese produzierte mutierte DNA als Templat ein. Folglich enthält dieses Templat bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n) gewünschten(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierende Oligonucleotid wird dann an dieses Templat anneliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für Mutationen aus dem ersten sowie zweiten Mutageneseumlauf. Diese resultierende DNA kann als Templat in einem dritten Mutageneseumlauf verwendet werden usw.
PCR-Mutagenese ist ebenfalls zur Herstellung von Aminosäurevarianten von nativem CHF zweckdienlich. Obgleich sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, versteht es sich, dass die Technik auch mit RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich im Allgemeinen auf das folgende Verfahren (siehe Erlich, siehe oben, das Kapitel von R. Higuchi, S. 61-70). Wenn kleine Mengen von Templat-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich hinsichtlich der Sequenz von der entsprechenden Region in einer Templat-DNA leicht unterscheiden, zur Erzeugung relativ großer Mengen eines speziellen DNA-Fragments verwendet werden, das sich von der Templatsequenz nur an jenen Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom Templat unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so konstruiert, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss mit einem Sequenzabschnitt am entgegengesetzten Strang des Plasmids identisch sein, jedoch kann sich diese Sequenz an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden jeder des ersten befindet, so dass am Ende die gesamte amplifizierte Region der durch die Primer gebundenen DNA leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars wie des gerade beschriebenen resultiert in einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der durch die Primer festgelegten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheidet, da das Kopieren von Templat etwas fehleranfällig ist.
Wenn das Verhältnis von Templat zu Produktmaterial extrem niedrig ist, beinhaltet die überwiegende Mehrheit von Produkt-DNA-Fragmenten die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses Produktmaterial wird verwendet, um unter Anwendung von standardmäßiger DNA-Technologie die entsprechende Region im Plasmid zu ersetzen, die als PCR-Templat diente. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem entweder ein mutierter zweiter Primer verwendet oder eine zweite PCR mit anderen mutierten Primern durchgeführt wird und die beiden resultierenden PCR-Fragmente gleichzeitig an das Vektorfragment in einer dreiteiligen (oder mehrteiligen) Ligation ligiert werden.
In einem speziellen Beispiel von PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden 100 ng zu einem PCR-Gemisch auf ein Endvolumen von 50 μl zugegeben, das PCR-Puffer, der die vier Desoxyribonucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp^®-Sets enthalten ist (bezogen von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA), und 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers enthält. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Das Reaktionsgemisch wird für fünf Minuten bei 100 °C denaturiert, kurz auf Eis gegeben und dann mit 1 μl DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) (5 Units/μl, bezogen von Perkin-Elmer Cetus) unter die Mineralölschicht versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA-Thermocycler (bezogen von Perkin-Elmer Cetus) eingesetzt, der wie folgt programmiert war:
2 min bei 55 °C
30 sec bei 72 °C, dann 19 Zyklen von Folgendem:
30 sec bei 94 °C
30 sec bei 55 °C und
30 sec bei 72 °C
Am Ende des Programms wird das Reaktionsfläschchen vom Thermocycler entfernt und die wässrige Phase in ein neues Fläschchen überführt, mit Phenol/Chloroform (50/50 Vol.) extrahiert und mittels Ethanol präzipitiert und die DNA mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend den geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassettenmutagenese, basiert auf der Technik, die von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschrieben wurde. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende native CHF-DNA enthält. Das/die Codon(s) in der zu mutierenden nativen CHF-DNA wird/werden identifiziert. Es muss sich eine einzigartige Restriktionsendonucleasestelle an jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) befinden. Falls derartige Restriktionsstellen nicht vorhanden sind, können sie unter Verwendung des oben beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Orten in der nativen CHF-DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Es wird unter Anwendung von Standardverfahren ein doppelsträngiges Oligonucleotid synthetisiert, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, jedoch die gewünschte(n) Mutation(en) enthält. Die beiden Stränge werden gesondert synthetisiert und dann unter Anwendung von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt in das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die aus einem nativen CHF mutierte CHF-DNA-Sequenz.
C. Insertion von Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor
Die für CHF kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) wird in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Amplifikation von DNA) oder zur Expression insertiert. Es sind zahlreiche Vektoren verfügbar, und die Auswahl des geeigneten Vektors wird von Folgendem abhängen: 1) ob er für DNA-Amplifikation oder DNA-Expression zu verwenden ist, 2) von der Größe der in den Vektor zu insertierenden Nucleinsäure und 3) von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten, die von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtzelle abhängen, mit der er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
(i) Signalsequenzkomponente
Die CHFs dieser Erfindung können rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspeptid mit einem heterologen Polypeptid produziert werden, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids ist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil der CHF-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die gewählte heterologe Signalsequenz sollte vorzugsweise eine sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h., von einer Signalpeptidase gespalten) wird. Für prokaryotische Wirtszellen, die die native CHF-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz ersetzt, die beispielsweise aus der aus alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Für die Sekretion in Hefe kann die native Signalsequenz beispielsweise durch den Hefe-Invertase-Leader, Alphafaktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei der letztere im am 23. April 1991 erteilten US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist), Hefe-Saure-Phosphatase-Leader, Maus-Speichel-Amylase-Leader, Carboxypeptidase-Leader, Hefe-BAR1-Leader, Humicola-lanuginosa-Lipase-Leader, den Glucoamylase-Leader aus C. albicans ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der am 15. November 1990 veröffentlichten WO 90/13646 beschriebene Signal ersetzt werden. Bei der Säugetierzellexpression ist die native Signalsequenz (z.B. die CHF-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von nativem CHF aus menschlichen Zellen in vivo steuert) zufrieden stellend, obgleich andere Säugetier-Signalsequenzen geeignet sein können, wie z.B. Signalsequenzen aus anderen tierischen CHFs, Signalsequenzen aus einem Liganden, der an ein anderes GH-/Cytokin-Rezeptorfamilienelement bindet, und Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das gD-Signal aus Herpes simplex.
Die DNA für eine derartige Vorläuferregion wird im Leseraster zur für die reifen CHF kodierende DNA ligiert.
(ii) Replikationsstartpunktkomponente
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der Wirtschromosomen-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien zweckdienlich, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe und verschiedene Virenstartpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetieren zweckdienlich. Im Allgemeinen wird der Replikationsstartpunkt für Säugetier-Expressionsvektoren nicht benötigt (der SV40-Startpunkt wird typischerweise in erster Linie nur deshalb verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. dass sie zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig sind, jedoch in einen anderen Organismus zur Expression transfiziert werden können. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert und dann derselbe Vektor in Hefe oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert, obgleich er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Wirtszellchromosom zu replizieren.
DNA wird außerdem durch Insertion in das Wirtsgenom kloniert. Dies kann leicht durch Verwenden von Bacillus-Spezies als Wirte erzielt werden, beispielsweise durch Aufnehmen einer DNA-Sequenz in den Vektor, die zu einer sich in genomischer Bacillus-DNA findenden Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in der homologen Rekombination mit dem Genom und Insertion von CHF-DNA. Jedoch ist die Gewinnung genomischer DNA, die für CHF kodiert, komplexer als die eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um die CHF-DNA herauszuschneiden.
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch Selektionsmarker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für Überleben und Wachstum transformierter, in einem Selektivkulturmedium gezüchteter Wirtszellen notwendig ist. Nicht mit diesem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformierte Wirtszellen werden im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Nährmedien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Eines der Beispiele eines Selektionsschemas verwendet ein Medikament, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, exprimieren ein Protein, das Medikamentresistenz verleiht und überleben daher das Selektionsregime. Beispiele einer derartigen dominanten Selektion verwenden die Medikamente Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sudgen et al., Mol. Gel. Biol. 5, 410-413 (1985)). Die drei oben genannten Beispiele setzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle ein, um Resistenz gegen das geeignete Medikament G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein weiteres Beispiel geeigneter Selektionsmarker für Säugetierzellen sind jene, die eine Identifizierung von Zellen ermöglichen, die kompetent zur Aufnahme der CHF-Nucleinsäure sind, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, dem nur Transformanten aufgrund der Aufnahme des Markers einzigartig zum Überleben angepasst sind. Selektions druck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium nacheinander verändert wird, was zur Amplifikation des Selektionsgens sowie der DNA führt, das für CHF kodiert. Amplifikation ist der Prozess, durch den Gene mit höherem Bedarf für die Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins in den Chromosomen aufeinander folgender Generationen rekombinanter Zellen tandemwiederholt werden. Erhöhte Mengen von CHF werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele amplifizierbarer Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosin-Deaminase, Ornithin-Decarboxylase usw.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx) enthält. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte Chinahamster-Eierstock (CHO-)Zelllinie, die wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann gegenüber erhöhten Mengen an Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und, gleichzeitig, mehrerer Kopien anderer DNA, die die Expressionsvektoren umfasst, wie z.B. die für CHF kodierende DNA. Diese Amplifikationstechnik kann mit jeglichem ansonsten geeigneten Wirt, z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Gegenwart von endogenem DHFR verwendet werden, falls beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen eingesetzt wird, das gegen Mtx höchst resistent ist ( EP 117.060 ).
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert sind, die für CHF, DHFR der Wildform kodieren, und ein weiterer Selektionsmarker, wie z.B. Aminoglycosid-3-phosphotransferase (APH), durch Zellwachstum in Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den Selektionsmarker, wie z.B. ein aminoglykosidisches Antibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält. (Siehe auch US-Patent Nr. 4.965.199.)
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellgenom stellt dann eine wirksame Umgebung für den Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Gleichermaßen werden Leu2-defekte Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide komplementiert.
Außerdem können vom zirkulären 1,6-μm-Plasmid pKD1 hergeleitete Vektoren zur Transformation von Kluyveromyces-Wirten verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). In jüngerer Zeit wurde ein Expressionssystem für die Produktion von Kälber-Chymosin für K. lactis im Großmaßstab beschrieben. Van der Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrfachkopie-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem, rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch Industriestämme von Kluyveromyces sind ebenfalls offenbart worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991).
(iv) Promotorkomponente
Expressionsvektoren und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die CHF-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromauf (5') vom Startcodon eines Strukturgens (im Allgemeinen innerhalb von 100 bis 1.000 bp) befinden, die die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäure, wie z.B. der CHF-Nucleinsäuresequenz, steuern. Derartige Promotoren gehören typischerweise zwei Klassen an, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Ausmaße an Transkription aus DNA unter ihrer Kontrolle als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen, z.B. auf die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder einer Temperaturänderung, auslö sen. Derzeit ist eine große Anzahl an Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl an möglichen Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an für CHF kodierende DNA gebunden, indem der Promotor aus der Quell-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird. Die native CHF-Promotorsequenz sowie viele heterologe Promotoren können verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der CHF-DNA zu steuern. Jedoch sind heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im Allgemeinen höhere Transkription und höhere Ausbeuten von rekombinant hergestelltem CHF im Vergleich zum nativen CHF-Promotor ermöglichen.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) und EP 36.776) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)). Jedoch sind andere bakterielle Promotoren ebenfalls geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch es einem geübten Fachmann ermöglicht wird, sie operabel an für CHF kodierende DNA zu ligieren (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), und zwar unter Verwendung von Linkern und Adaptoren, um jegliche benötigten Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine Shine-Dalgarno-(SD-)Sequenz enthalten, die operabel an die für CHF kodierende DNA gebunden ist.
Es sind Promotorsequenzen für Eukaryoten bekannt. Nahezu alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf der Stelle befindet, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene findet, ist die CXCAAT-Region, wobei X jegliches Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal zur Hinzufügung des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein könnte. Alle dieser Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängende Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in Hitzeman et al., EP 73.657 , weiterführend beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet.
Die CHF-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren erlangt werden, wie z.B. aus Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere bevorzugt Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschock-Promotoren und aus dem Promotor, der normalerweise mit der CHF-Sequenz assoziiert ist, und zwar unter der Voraussetzung, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckdienlicherweise als SV40-Restriktionsfragment erlangt, das außerdem den SV40- Virus-Replikationsstartpunkt enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978), Mulligan und Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981)). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird zweckdienlicherweise als HindIIIE-Restriktionsfragment erlangt (Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982)). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifizierung dieses Systems wird im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982), über die Expression von cDNA, die für menschliches Immuninterferon kodiert, in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982), über die Expression menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors aus dem Herpes-simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982), über die Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982), über die Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung aus dem Rous-Sarkomvirus als Promotor.
(v) Enhancerelementkomponente
Die Transkription einer für das CHF dieser Erfindung kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, die üblicherweise eine Länge von etwa 10 bis 300 bp aufweisen, die an einem Promotor agieren, um seine Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und sind 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cel. Biol. 3, 1108 (1983)) der Transkriptionseinheit, in einem Intron (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie in der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cel. Biol. 4, 1293 (1984)) gefunden worden. Zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen sind nun bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α- Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus einer eukaryotischen Zelle verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100-270), den frühen Promotor-Enhancer aus Cytomegalovirus, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982), über Enhancer-Elemente für die Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Stelle 5' oder 3' der CHF-kodierenden Sequenz gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Menschen oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise aus den 5'- und gelegentlich aus den 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für CHF kodierenden mRNA transkribiert werden.
(vii) Konstruktion und Analyse von Vektoren
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form neu ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Plasmide aus den Transfor manten werden hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mit dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
(viii) Vorübergehende Expressionsvektoren
Insbesondere zweckdienlich bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression von für CHF kodierender DNA in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, so dass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors anreichert und dann hohe Ausmaße eines gewünschten, vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Sambrook et al. (siehe oben), S. 16.17-16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, die von klonierten DNAs kodiert werden, sowie das schnelle Screening derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Folglich sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung insbesondere zum Zwecke des Identifizierens von Analoga und Varianten von nativem CHF zweckdienlich, die biologisch aktives CHF sind.
(ix) Geeignete beispielhafte Vertebratenzellvektoren
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese von CHF in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden beschrieben in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 . Ein insbesondere geeignetes Plasmid zur Säugetierzellproduktion von CHF ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B (WO 91/08291, veröffentlicht am 13. Juni 1991). Das pRK5-Derivat pRKSB (Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) ist für eine solche Expression besonders geeignet.
D. Wahl und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung und Expression der Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten zu diesem Zweck umfassen Eubakterien, wie z.B. Gram-positive oder Gram-negative Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere Stämme, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli DH5α und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein üblicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren. Beispielweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen zu bewirken, die für die für den Wirt fremden Proteine kodieren, wobei Beispiele derartiger Wirte die folgenden umfassen: E. coli W3110, Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonAΔ aufweist; E. coli W3110, Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 aufweist; E. coli W3110, Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF – lac)169 ΔdegP ΔompT kan^r aufweist; E. coli W3110, Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF – lac)169 ΔdegP ΔompT Δrebs7 ilvG kan^r aufweist; E. coli W3110, Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer Nicht-Kanamycin-resistenten degP-Deltionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm, die eine in dem am 7. August 1990 erteilten US-Patent Nr. 4.946.783 offenbarte mutierte periplasmatische Protease aufweist. Alternativ dazu sind In-vitro-Verfahren der Klonierung, z.B. PCR und andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mirkaorganismen, wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für CHF-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Jedoch ist eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein verfügbar und hierin zweckdienlich, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al. (siehe oben)), wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al. (siehe oben)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)), Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und filamentöse Pilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10 Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen zur Expression von CHF stammen von mehrzelligen Organismen. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere Eukaryotenzellkultur brauchbar, ob sie aus Vertebraten- oder aus Invertebratenzellkultur stammt. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Es sind zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten und permissive Insektenwirtszellen aus Wirten, wie z.B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, identifiziert worden. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, J.K. Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8, Plenum Publishing, S. 277-279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985)). Eine Vielzahl an Virusstämmen zur Transfektion ist öffentlich verfügbar, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können als das Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdäpfel (Kartoffel), Sojabohne, Petunie, Paradeiser (Tomate) und Tabak können als Wirte eingesetzt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit gewissen Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, die vorher manipuliert worden sind, um die CHF-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für CHF kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt übertragen, so dass er transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die CHF-DNA exprimiert. Außerdem sind mit den Pflanzenzellen kompatible Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, wie z.B. der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem sind aus der Stromaufregion des T-DNA-780-Gens isolierte DNA-Segmente zur Aktivierung oder Erhöhung von Transkriptionsausmaßen Pflanzen-exprimierbarer Gene in rekombinantem, DNA-enthaltendem Gewebe fähig. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Jedoch bestand größtes Interesse an Vertebratenzellen, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Kruse und Patterson (Hrsg.), Academic Press (1973)). Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien sind durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenlinie (293-Zellen oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL10); Chinahamster-Einerstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatze-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinom zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert sind.
Transfektion bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Es sind dem durchschnittlichen Fachmann zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO₄ oder Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Betätigung dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
Unter Transformation wird das Einführen von DNA in einen Organismus verstanden, so dass die DNA replizierbar ist, und zwar entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben wird, oder Elektroporation wird allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transfektion gewisser Pflanzenzellen wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben verwendet. Außerdem können Pflanzen unter Anwendung von Ultraschallbehandlung wie in der am 10. Jänner 1991 veröffentlichten WO 91/00358 beschrieben transfiziert werden.
Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978) bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtssystemtransformationen sind von Axel im am 16. August 1983 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach der Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin usw., ebenfalls verwendet werden. Für verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
E. Kultivieren der Wirtszellen
Prokaryotische Zellen, die zur Produktion des CHF-Polypeptids dieser Erfindung verwendet werden, werden in geeigneten Nährmedien wie in Sambrook et al. (siehe oben) allgemein beschrieben kultiviert.
Die zur Produktion des CHF dieser Erfindung verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Reihe von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((D-MEM), Sigma) und D-MEM/F-12 (Gibco BRL), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann ein beliebiges der beispielsweise in Ham und Wallace, Methods in Enzymology 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patenten Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 5.122.469; oder 4.560.655; US-Patent Re. Nr. 30.985; WO 90/03430; oder WO 87/00195 beschriebenen Medien als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wie erforderlich mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin, Aprotinin und/oder Epidermiswachstumsfaktor (EGF)), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin^TM-Medikament), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere notwendige Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die vorher mit der zur Expression gewählten Wirtszelle verwendet worden sind, und sind dem durchschnittlichen Fachmann offensichtlich.
Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von In-vitro-Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991).
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in In-vitro-Kultur sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
F. Nachweisen der Genamplifikation/Expression
Die Amplifikation und/oder Expression eines Gens kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, am gebräuchlichsten sind Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können andere Techniken ebenfalls eingesetzt werden, wie z.B. die Verwendung von Biotinmodifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Stelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielfalt an Markern markiert werden können, wie z.B. mit Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper können ihrerseits markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch immunohistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Bei immunohistochemischen Färbetechniken wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Entwässerung und Fixierung, gefolgt von der Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Marker üblicherweise visuell nachweisbar sind, wie z.B. enzymatische Marker, fluoreszierende Marker, lumineszierende Marker und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbetechnik, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich ist, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734-738 (1980), beschrieben.
Für die immunohistochemische Färbung und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Säugetier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein natives CHF-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen wie im unten stehenden Abschnitt 4 näher beschrieben hergestellt werden.
G. Reinigung des CHF-Polypeptids
CHF wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als sekretiertes Polypeptid gewonnen, obgleich es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal produziert wird.
Wenn CHF in einer rekombinanten Zelle produziert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist das CHF völlig frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es notwendig, CHF von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die hinsichtlich CHF im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt werden partikuläre Trümmer, entweder Wirtszellen oder lysierte Fragmente, beispielsweise durch Zentrifugation oder Ultrafiltration entfernt. Gegebenenfalls kann das Protein mit einem im Handel erhältlichen Proteinkonzentrierungsfilter konzentriert werden, gefolgt vom Trennen von CHF von anderen Verunreinigungen durch einen oder mehrere Schritte, die aus Immunaffinitätschromatographie, Ionenaustauschsäulenfraktionierung (z.B. an DEAE oder Matrices, die Carboxymethyl- oder Sulfopropylgruppen enthalten), Chromatographie an Blue-Sepharose, CM-Blue-Sepharose, Mono-Q, Mono-S, Lentil-Lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con-A-Sepharose, Ether-Toyopearl, Butyl-Toyopearl, Phenyl-Toyopearl oder Protein-A-Sepharose, SDS-PAGE-Chromatographie, Silika-Chromatographie, Chromatofukussierung, Umkehrphasen-HPLC (z.B. Silikagel mit angefügten aliphatischen Gruppen), Gelfiltration unter Verwendung von z.B. Sephadex-Molekularsieb oder Größenausschlusschromatographie, Chromatographie an Säulen, die CHF selektiv binden, sowie Ethanol- oder Ammoniumsulfatpräzipitation gewählt sind. Es kann ein Proteaseinhibitor in jedem der vorangehenden Schritte enthalten sein, um Proteolyse zu verhindern. Beispiele geeigneter Proteaseinhibitoren umfassen Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin, 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid-Bestatin, Chymostatin und Benzamidin.
Ein bevorzugtes Reinigungsschema umfasst das Einstellen des durch die mit dem maßgeblichen Klon transfizierten Zellen konditionierten Kulturmediums auf 1,5 M NaCl und Aufgeben auf eine Butyl-Toyppearl^TM-Säule. Die Säule wird mit NaCl ent haltendem Tris[hydroxymethyl]aminomethan-Hydrochlorid (TRIS-HCl), pH 7,5, gewaschen und die Aktivität mit 10 mM Zwittergent^TM-Tensid 3-10 enthaltendem TRIS-HCl, pH 7,5, eluiert. Der Aktivitätspeak wird auf 150 mM NaCl pH 8,0, eingestellt und auf eine MONO-Q-Fast-Flow-Säule aufgegeben. Diese Säule wird mit NaCl und Octylglucosid enthaltendem TRIS-HCl, pH 8,0, gewaschen. Aktivität findet sich in der Durchflussfraktion. Das aktive Material wird dann auf eine Umkehrphasen-C4-Säule in 0,1 % TFA, 10 % Acetonitril aufgegeben und mit einem Gradienten von 0,1 % TFA bis zu 80 % eluiert. Die Aktivität eluiert bei etwa 15-30 kDa an Gelfiltrationssäulen. Es wird erwartet, dass ein Chaotrop, wie z.B. Guanidin-HCl, zur Auftrennung und Gewinnung erforderlich ist.
CHF-Varianten, bei denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, werden in derselben Weise wie CHF gewonnen, wobei jegliche wesentlichen durch die Variation veranlassten Veränderungen der Eigenschaften berücksichtigt werden. Beispielsweise erleichtert die Herstellung einer CHF-Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z.B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Antikörper gegen das Antigen enthaltende Immunoaffinitätssäule kann verwendet werden, um das Fusionspolypeptid zu adsorbieren. Immunoaffinitätssäulen, wie z.B. eine polyklonale Kaninchen-Anti-CHF-Säule, kann eingesetzt werden, um die CHF-Variante durch seine Bindung an zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren. Ein Proteaseinhibitor, wie z.B. die oben definierten, kann ebenfalls zweckdienlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika mit aufgenommen werden, um das Wachstum hinzukommender Kontaminanten zu verhindern. Ein qualifizierter Fachmann wird anerkennen, dass für natives CHF geeignete Reinigungsverfahren Modifizierungen erfordern können, um Veränderungen der Beschaffenheit von CHF oder seiner Varianten nach Produktion in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
H. Kovalente Modifikationen der CHF-Polypeptide
Kovalente Modifikationen der CHF-Polypeptide sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Sowohl natives CHF als auch Aminosäuresequenzvarianten von na tivem CHF können kovalent modifiziert werden. Eine im Schutzumfang dieser Erfindung enthaltene Art der kovalenten Modifikation ist ein Varianten-CHF-Fragment. Varianten-CHF-Fragmente mit bis zu etwa 40 Aminosäureresten können bequem durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Volllängen- oder Varianten-CHF-Polypeptids hergestellt werden. Andere Arten kovalenter Modifikationen des CHF oder von Fragmenten davon werden in das Molekül eingeführt, indem die Ziel-Aminosäurereste des CHF oder von Fragmenten davon mit einem organischen Derivatisierungsmittel zu Reaktion gebracht werden, das fähig ist, mit gewählten Seitenketten der N- oder C-terminalen Reste zu reagieren.
Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, zur Reaktion gebracht, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu liefern. Cysteinylreste werden außerdem durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Bromo-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Ladungsumkehr der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion wegen des hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der Epsilon-Aminogruppe von Arginin reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann mit besonderem Interesse der Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan durchgeführt werden. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I und ¹³¹I iodiert, um markierte Protein zur Verwendung im Radioimmuntest herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' unterschiedliche Alkylgruppen sind, wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Vernetzung von CHF an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-CHF-Antikörpern und umgekehrt zweckdienlich. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithio-bis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleinimide, wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,3-octan. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Ausbildung von Vernetzungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive was serunlösliche Matrices, wie z.B. Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate, und die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128: 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substrate zur Proteinimmobilisierung eingesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten deamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen deamidiert. Die deamidierte Form dieser Reste liegt im Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- und Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco, S. 79-86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxylgruppe.
Eine andere Art der kovalenten Modifikation des CHF-Polypeptids, die im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst das Verändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter Verändern wird das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen verstanden, die sich im nativen CHF finden, und/oder das Anfügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im nativen CHF nicht vorhanden sind.
Die Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Anbringung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbringung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette, wobei X jegliche Aminosäure außer Prolin sein kann. Folglich erzeugt die Gegenwart von einem dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O-gebunden bezieht sich auf die Anbringung von einem der Zucker N- Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin ebenfalls verwendet werden können.
Die Anfügung von Glykosylierungsstellen an das CHF-Polypeptid kann bequem erzielt werden, indem die Aminosäuresequenz derart verändert wird, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen aufweist (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Veränderung kann auch durch Addition von oder Substitution mit einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an der nativen CHF-Sequenz vorgenommen werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Der Einfachheit halber wird die native CHF-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Änderungen auf der DNA-Ebene verändert, insbesondere durch Mutieren der für das native CHF-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Die DNA-Mutation(en) kann/können unter Anwendung der oben im Abschnitt 2B beschriebenen Verfahren vorgenommen werden.
Ein anderes Mittel zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am CHF-Polypeptid ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind dahingehend vorteilhaft, dass sie nicht die Produktion des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die die Fähigkeit zur N- oder O-gebundenen Glykosylierung aufweist. In Abhängigkeit von der verwendeten Kopplungsart kann/können der/die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z.B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie z.B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z.B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin angebunden werden. Diese Verfahren sind in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259-306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung jeglicher am CHF-Polypeptid vorhandener Kohlenhydratgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch erzielt werden. Chemische Deglykosylierung erfordert, dass das Polypeptid der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer gleichwertigen Verbindung ausgesetzt wird. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verbindenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt bleibt. Die chemische Glykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben erzielt werden.
Die Glykosylierung an potenziellen Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin wie von Duskin et al, J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschrieben verhindert werden.
Eine weitere Art der kovalenten Modifikation von CHF umfasst die Bindung des CHF-Polypeptids an eines von zahlreichen nicht-proteinartigen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.47; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
CHF kann außerdem eingeschlossen sein, und zwar in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden (beispielsweise Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]-Mikrokapseln), in kolloidalen Medikamentabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
CHF-Präparate sind auch bei der Erzeugung von Antikörpern, als Standards in Tests auf CHF (z.B. durch Markieren von CHF zur Verwendung als Standard in einem Radioimmuntest, enzymgebundenen Immuntest oder Radiorezeptortest), bei Affinitätsreinigungstechniken und in Rezeptorbindungstests der kompetitiven Art zweckdien lich, wenn sie mit radioaktivem Iod, Enzymen, Fluorophoren, Spinmarkern und dergleichen markiert sind.
Da es häufig schwierig ist, die Eigenschaften eines Varianten-CHF vorherzusagen, ist anzuerkennen, dass ein gewisses Screening der gewonnenen Variante notwendig sein wird, um die optimale Variante auszuwählen. Man kann auf verstärkte Herzhypertrophe, anti-arrhythmische, inotrope oder neurotrophe Aktivität, Besitz von CHF-Antagonistenaktivität, erhöhte Expressionsstärken, oxidative Stabilität, Fähigkeit zur Sekretion in höheren Ausbeuten und dergleichen screenen. Beispielsweise wird eine Veränderung des immunologischen Charakters des CHF-Moleküls, wie z.B. die Affinität für einen bestimmten Antikörper durch einen Immuntest des kompetitiven Typs, gemessen. Die Variante wird auf Änderungen hinsichtlich der Unterdrückung oder Verstärkung ihrer hypertrophen, anti-arrhythmischen, inotropen oder neurotrophen Aktivitäten durch Vergleich zu den entsprechenden Aktivitäten getestet, die im selben Test für das native CHF beobachtet werden (beispielsweise unter Anwendung der in den unten stehenden Beispielen beschriebenen Hypertrophie- und neurotrophischen Aktivitäten). Andere mögliche Modifikationen von Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie z.B. Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Empfindlichkeit auf proteolytischen Abbau oder die Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden mittels Verfahren getestet, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
I. Antagonisten von CHF
Antagonisten gegen CHF können durch Verwendung der vorhergesagten Familie von Rezeptoren für CHF (die GH-/Cytokin-Rezeptorfamilie, einschließlich der CNTF-, LIF- und Oncostatin-M-Rezeptor-Unterfamilie) hergestellt werden. Folglich kann der Rezeptor aus der Familie expressionskloniert werden; dann wird eine lösliche Form des Rezeptors hergestellt, indem die extrazelluläre Domäne identifiziert und die Transmembrandomäne aus ihr herausgeschnitten wird. Die lösliche Form des Rezeptors kann dann als Antagonist verwendet werden, oder der Rezeptor kann ver wendet werden, um auf kleine Moleküle zu screenen, die die CHF-Aktivität üblicherweise antagonisieren.
Alternativ dazu werden unter Verwendung der in 1 gezeigten murinen Sequenz oder der in 5 gezeigten menschlichen Sequenz Varianten von nativem CHF hergestellt, die als Antagonisten agieren. Da die GH-/Cytokin-Rezeptorfamilie bekanntermaßen zwei Bindungsstellen am Liganden aufweist, können die Rezeptorbindungsstellen von CHF durch Bindungsstudien ermittelt und einer davon durch Standardtechniken (Deletion oder drastische Substitution) eliminiert werden, so dass das Molekül als Antagonist agiert. Antagonistenaktivität kann durch mehrere Mittel, einschließlich die hierin beschriebenen Hypertrophie- und neurotrophen Tests, ermittelt werden.
J. Hypertrophietest
Es wird vorzugsweise ein miniaturisierter Test verwendet, um auf hypertrophe Aktivität zu testen. In diesem Test ermöglicht das verwendete Medium den Zellen bei einer niedrigen Ausplattierdichte ohne Serum zu überleben. Durch direktes Ausplattieren in dieses Medium werden Waschschritte eliminiert, so dass weniger Zellen entfernt werden. Die Ausplattierdichte ist wichtig: sehr viel weniger Zellen und das Überleben wird herabgesetzt; sehr viel mehr Zellen und die Myozyten beginnen die Selbstinduktion der Hypertophie.
Die umfassten Schritte sind:

(a) Ausplattieren von 96-Well-Platten mit einer Suspension von Myozyten bei einer Zelldichte von etwa 7,5 × 10⁴ Zellen pro ml in D-MEM/F-12-Medium, das zumindest mit Insulin, Transferrin und Aprotinin ergänzt ist;
(b) Kultivieren der Zellen;
(c) Zusetzen einer zu testenden Substanz (wie z.B. einer, von der vermutet wird, dass sie ein CHF enthält);
(d) Kultivieren der Zellen mit der Substanz; und
(e) Messen auf Hypertrophie.

Das Medium kann mit weiteren Elementen, wie z.B. EGF, ergänzt werden, das eine längere Lebensfähigkeit der Zellen gewährleistet, jedoch sind derartige Ergänzungen nicht essentiell. D-MEM/F-12-Medium ist von Gibco BRL, Gaithersburg, MD, erhältlich und besteht aus einem der folgenden Medien:
Der bevorzugte Hypertrophietest umfasst:

(a) Vorbeschichten der Wells einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit einem Medium, das Kälberserum, vorzugsweise 4 % Fötalkälberserum, enthaltendes D-MEM/F-12-Medium enthält, worin vorzugsweise die Wells mit dem Medium für etwa acht Stunden bei etwa 37 °C inkubiert werden;
(b) Entfernen des Mediums;
(c) Ausplattieren einer Suspension von Myozyten in die inneren 60 Wells mit 7,5 × 10⁴ Zellen pro ml in D-MEM/F-12-Medium, das mit Insulin, Transferrin und Aprotinin ergänzt ist;
(d) Kultivieren der Myozyten für zumindest 24 Stunden;
(e) Zusetzen der Testsubstanz;
(f) Kultivieren der Zellen mit der Testsubstanz (vorzugsweise für etwa 24-72 Stunden, bevorzugter für etwa 48 Stunden); und
(g) Messen auf Hypertrophie, vorzugsweise mit Kristallviolett-Farbstoff.

Vorzugsweise ist das im Schritt (c) verwendete Medium ein serumfreies Medium, das außerdem Penicillin/Streptomycin (pen/strep) und Glutamin enthält. Insbesondere bevorzugt enthält das Medium 100 ml D-MEM/F-12, 100 μl Transferrin (10 mg/ml), 20 μl Insulin (5 mg/ml), 50 μl Aprotinin (2 mg/ml), 1 ml pen/strep (JRH Biosciences Nr. 59602-77P) und 1 ml L-Glutamin (200 mM).
Die Testkapazität von 1.000 Einzelproben pro Woche, gepaart mit der kleinen erforderlichen Probengröße von 100 μl oder weniger hat die Expressionsklonierung und Proteinreinigung ermöglicht, die zu erzielen unter Anwendung der gegenwärtig verfügbaren Verfahren unmöglich gewesen wäre.
Ein weiteres Verfahren zum Testen der Hypertrophie umfasst das Messen auf die Freisetzung von atrialem natriuretischem Peptid (ANP) mittels eines Tests, der die Bindungskonkurrenz von ¹²⁵I-Ratten-ANP für ein Ratten-ANP-Rezeptor-A-IgG-Fusionsprotein bestimmt. Das zur Anwendung geeignete Verfahren ist jenem ähnlich, das zur Ermittlung von gp120 unter Verwendung eines CD4-IgG-Fusionsproteins verwendet und von Chamow et al., Biochemistry 29, 9885-9891 (1990), beschrieben wird.
K. Neurotropher Test
Der in Leung, Neuron 8, 1045-1053 (1992), beschriebene, für die neurotrophe Aktivität von Ziliarganglien verwendete Test ist hierin geeignet. Zusammenfassend werden Ziliarganglien aus E7-E8-Hühnerembryos präpariert und in Trypsin-EDTA (Gibco 15400-013) losgelöst, zehnfach in phosphatgepufferter Salzlösung für 15 Minuten bei 37 °C verdünnt. Die Ganglien werden mit drei Waschungen mit Wachstumsmedium (D-MEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % Fötalrinderserum, 1,5 mM Glutamin, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) von Trypsin befreit und dann vorsichtig in 1 ml Wachstumsmedium zu einer Einzelzellsuspension zerrieben. Neuronen werden angereichert, indem dieses Zellgemisch in 5 ml Wachstumsmedium auf eine 100-mm-Gewebekulturplatte für 4 Stunden bei 37 °C in einem Gewebekulturinkubator ausplattiert wird. Während dieser Zeit haften die nicht-neuronalen Zellen an die Platte an, und die Neuronen können am Ende der Inkubation vorsichtig abgewaschen werden. Die angereicherten Neuronen werden dann in eine vorher mit Collagen beschichtete 96-Well-Platte ausplattiert. In jeden Well werden 1.000 bis 2.000 Zellen in ein Endvolumen von 100 bis 500 μl mit Verdünnungen des zu testenden CHF ausplattiert. Nach einer Inkubation von 2-4 Tagen bei 37 °C wird die Anzahl lebender Zellen durch Färben lebender Zellen unter Verwendung des Vitalfarbstoffs Metallothionin (MTT) festgestellt. Ein Fünftel des Volumens von 5 mg/ml MTT (Sigma M2128) wird den Wells zugesetzt. Nach einer Inkubation von 2-4 Stunden bei 37 °C werden lebende Zellen (gefüllt mit einem dichten violetten Präzipitat) durch Phasenkontrastmikroskopie bei 100facher Vergrößerung gezählt.
3. Verwendungen und Therapeutische Zusammensetzungen und Verabreichung von CHF
Es wird angenommen, dass CHF als Medikament zur Behandlung von Säugetieren (z.B. Tieren oder Menschen) in vivo Verwendung finden wird, die Herzinsuffizienz, arrhythmische oder inotrope Störungen und/oder periphere Neuropathien und andere neurologische Störungen aufweisen, die motorische oder andere Neuronen umfassen, bei denen CNTF aktiv ist.
Beispielsweise kann CHF bei der Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz in Fällen zweckdienlich sein, wo ACE-Inhibitoren nicht eingesetzt werden können oder nicht so wirksam sind. CHF wird gegebenenfalls mit anderen Mitteln, einschließlich ACE- Inhibitoren, zur Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz kombiniert oder zusammen verabreicht.
Die wirksame Menge von zu verabreichendem ACE-Inhibitor unterliegt, falls er eingesetzt wird, dem Ermessen des Arztes oder Veterinärs. Dosisverabreichung und Einstellung werden vorgenommen, um eine optimale Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz zu erzielen, und berücksichtigt Idealerweise Diuretika oder Digitalis sowie Leiden wie Hypotension und Nierenbeeinträchtigung. Die Dosis wird zusätzlich von solchen Faktoren wie dem Typ des verwendeten Inhibitors und den jeweils zu behandelnden Patienten abhängen. Typischerweise wird die eingesetzte Menge dieselbe Dosis wie jene sein, die verwendet wird, als wenn der ACE-Inhibitor ohne CHF zu verabreichen wäre.
Daher beträgt beispielsweise eine Testdosis von Enalapril 5 mg, die dann je nach Toleranz des Patienten auf 10-20 mg pro Tag, einmal am Tag, hochgefahren wird. Als weiteres Beispiel wird Captopril anfänglich menschlichen Patienten in einer Testdosis von 6,25 mg oral verabreicht und die Dosis dann je nach Toleranz des Patienten auf 25 mg zweimal am Tag (BID) oder dreimal am Tag (TID) gesteigert und kann auf 50 mg BID oder TID titriert werden. Das Toleranzniveau wird abgeschätzt, indem ermittelt wird, ob eine Abnahme des Blutdrucks von Anzeichen von Hypotension begleitet ist. Wenn angezeigt, kann die Dosis auf bis zu 100 mg BID oder TID erhöht werden. Captopril wird zur Verabreichung als aktiver Bestandteil in Kombination mit Hydrochlorothiazid und als ein pH-stabilisierter Kern produziert, der eine Beschichtung für enterische oder verzögerte Freisetzung aufweist, die Captopril bis zum Erreichen des Darms schützt. Captopril ist zur Verabreichung in Tabletten- oder Kapselform verfügbar. Eine Diskussion der Dosierung, Verabreichung, Indikationen und Kontraindikationen, die mit Captopril und anderen ACE-Inhibitoren in Verbindung stehen, finden sich im „Physicians Desk Reference", Medical Economics Data Production Co., Montvale, NJ, 2314-2320 (1994).
CHF ist potenziell bei Erzeugung, Reifung und Überleben von Oligodendrozyten in vitro zum Schutz von Oligodendrozyten gegen natürlichen und Tumornekrosefaktor induzierten Tod, beim Überleben und bei der Differenzierung von Astrozyten und bei der Induktion der Typ-2-Astozyten-Entwicklung und bei der Stimulierung der rekombinanten Produktion von niedrigaffinem Nervenwachstumsfaktorrezeptor und CD-4 bei Ratten-Zentralnervensystem-(CNS-)Ganglien zweckdienlich.
CHF ist außerdem potenziell zweckdienlich, indem es eine trophische Wirkung auf denervierten Skelettmuskel aufweist. Außerdem wird von ihm erwartet, dass es die proliferativen Reaktionen und Bindungseigenschaften von blutbildenden Zellen aufweist, die mit niedrigaffinen Rezeptoren für Leukämie-inhibierenden Faktor, Oncostatin und ziliaren neurotrophen Faktor transfiziert sind, um die Fibrinogen-Gen-Expression in Hepatozyten durch Bindung an den Interleukin-6-Rezeptor zu regulieren, um trophische Wirkungen auf murine Embryonalkarzinomzellen aufzuweisen, um ein endogenes Pyrogen zu sein und um eine mitogene Wirkung auf menschliche IMR-32-Neuroblastomzellen aufzuweisen.
Außerdem wird von CHF erwartet, dass es die Reaktion von kultivierten sympathischen Neuronen auf Nervenwachstumsfaktor verstärkt, um Motoneuronen und ihre Zielmoleküle in sich entwickelnden Ratten zu erhalten, um die Motoneuronensprossung in vivo auszulösen, um das Überleben von zur Großhirnrinde und Rückenmark gehörenden neonatalen Ratten-Neuronen in vitro zu fördern, um die Degeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra adulter Ratten in vivo zu verhindern, um den Schwellenwert der Empfindlichkeit von Hippokampus-Pyramidenzellen gegen exzitotoxische Schädigung zu verändern, um Neuronendegeneration zu verhindern und die Produktion von niedrigaffinem NGF-Rezeptor im adulten Ratten-CNS zu fördern und um das Überleben von Neuronen in embryonalen Ratten-Hippokampus-Kulturen zu steigern.
Diese Aktivitäten können in die Behandlung aller neurodegenerativen Erkrankungen durch CHF übertragen werden, einschließlich peripherer Neuropathien (motorisch und sensorisch), ALS, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schlaganfall, Huntington-Krankheit und ophthalmischer Krankheiten, beispielsweise jener, die die Retina umfassen.
CHF kann außerdem als Zusatzbehandlung neurologischer Störungen zusammen mit neurotrophen Faktoren wie z.B. CNTF, NGF, BDNF, NT-3, NT-4 und NT-5 zweckdienlich sein.
Die für das CHF kodierende Nucleinsäure kann als Diagnosemittel für die gewebespezifische Typisierung verwendet werden. Beispielsweise können derartige Verfahren, wie In-situ-Hybridisierung, Northern- und Southern-Blotting und PCR-Analyse, verwendet werden, um zu ermitteln, ob für CHF kodierende DNA und/oder RNA in dem/den zu beurteilenden Zelltyp(en) vorhanden ist.
Ein isoliertes CHF-Polypeptid kann außerdem in quantitativen Diagnosetests als Standard oder Kontrolle verwendet werden, wogegen unbekannte Mengen an CHF enthaltende Proben hergestellt werden können.
Therapeutische Formulierungen von CHF zur Behandlung von Herzinsuffizeinz und neurologischen Störungen werden zur Lagerung hergestellt, indem CHF mit dem gewünschten Reinheitsgrad gegebenenfalls mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, siehe oben) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wässriger Lösungen vermischt wird. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Das zur Verabreichung in vivo zu verwendende CHF muss steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt werden. CHF wird für gewöhnlich in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische CHF-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Einfüllöffnung gegeben, beispielsweise in einen Beutel für intravenöse Lösungen oder in ein Fläschchen mit einem von einer Subkutankanüle durchstechbaren Stopfen.
Der Weg der CHF- oder CHF-Antikörper-Verabreichung steht im Einklang mit bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intraarterielle oder intraläsionale Wege, oder über die unten erwähnten Systeme mit nachhaltiger Freisetzung. CHF wird kontinuierlich durch Infusion oder Bolusinjektion verabreicht. CHF-Antikörper wird in derselben Weise oder durch Verabreichung in die Blutbahn oder Lymphe verabreicht.
Geeignete Beispiele von Präparaten mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die das Protein enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilchen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele von Matrices mit nachhaltiger Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) wie beschrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982), oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547-556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. das Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat zusammengesetzt sind) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen für mehr als 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Protein für kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte Proteine für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Folge der Exposition mit Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Es können rationale Strategien zur Proteinstabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise entdeckt wird, dass der Aggregationsmechanismus die Bildung intermolekularer S-S-Bindungen über Thio-Disulfid-Austausch ist, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrolle des Feuchtegehalts, unter Verwendung geeigneter Zusätze und Entwickeln spezieller Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
CHF-Zusammensetzungen mit nachhaltiger Freisetzung umfassen außerdem in Liposomen eingeschlossenes CHF. CHF enthaltende Liposomen werden durch Verfahren hergestellt, die an sich bekannt sind: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324 . Für gewöhnlich sind Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Angström) einschichtigen Typ, bei dem der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil für die optimale CHF-Therapie eingestellt wird.
Eine wirksame Menge des therapeutisch einzusetzenden CHF wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und vom Leiden des Patienten abhängen. Demgemäß wird es für den Therapeuten notwendig sein, die Dosierung zu titrieren und den Verabreichungsweg wie erforderlich zu modifizieren, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische Tagesdosis kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis zu 100 mg/kg Patientenkörpergewicht oder mehr pro Tag, in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren, vorzugsweise etwa 10 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag, liegen. Typischerweise wird der Kliniker den CHF verabreichen, bis eine Dosierung erreicht ist, die die gewünschte Wirkung zur Behand lung von Herz- und neuronaler Dysfunktion erzielt. Beispielswiese ist die Menge üblicherweise eine, die die Ventrikelkontrahierbarkeit erhöht und den Periphergefäßwiderstand vermindert, bessert oder Leiden ähnlicher Bedeutung bei Patienten mit kongestiver Herzinsuffizienz behandelt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch herkömmliche Tests überprüft werden.
4. CHF-Antikörper-Herstellung
(i) Ausgangsmaterialien und Verfahren
Immunglobuline (Ig) und bestimmte Varianten davon sind bekannt, und viele sind in rekombinanter Zellkultur hergestellt worden. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.745.055; EP 256.654 ; EP 120.694 ; EP 125.023 ; EP 255.694 ; EP 266.663 ; WO 88/03559; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Koehler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984). Neusortierte Immunglobulinketten sind ebenfalls bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.444.878; WO 88/03565; und EP 68.763 und darin zitierte Literaturstellen. Die Immunglobulingruppierung in den Chimären der vorliegenden Erfindung können aus IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, vorzugsweise jedoch aus IgG-1 oder IgG-3, erlangt werden.
(ii) Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper gegen CHF-Polypeptide oder CHF-Fragmente werden im Allgemeinen in Tieren durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen von CHF oder CHF-Fragment und eines Adjuvans hergestellt. Es kann zweckdienlich sein, CHF oder ein die Zielaminosäuresequenz enthaltendes CHF-Fragment an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor unter Verwendung bifunktioneller oder derivatisierender Mit tel, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wobei R und R¹ verschiedene Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen das CHF-Polypeptid oder CHF-Fragment, immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 μg des Peptids oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Freundschem kompletten Adjuvans kombiniert und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge Konjugat in Freundschem kompletten Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf CHF- oder CHF-Fragment-Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer sein Plateau erreicht hat. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat desselben CHF- oder CHF-Fragments, jedoch konjugiert an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsmittel, geboostet. Konjugate können außerdem in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Außerdem werden Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, in geeigneter Weise verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
(iii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt, d.h. dass die die Population umfassenden einzelnen Antikörper mit Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Folglich weist der Modifikator „monoklonal" auf die Beschaffenheit des Antikörpers hin, dass er nicht ein Gemisch unterschiedlicher Antikörper ist.
Beispielsweise können die monoklonalen CHF-Antikörper der Erfindung mit dem erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (Cabilly et al., siehe oben).
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. Hamster, wie hierin oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten anzuregen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das zur Immunisierung verwendete CHF oder CHF-Fragment binden werden. Alternativ können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59-103 (1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden ausgesät und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten elterlichen Myelomzellen hemmen. Wenn beispielsweise den elterlichen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defekter Zellen verhindert.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile Expression von Antiköpern durch die selektierten Antikörper-produzierenden Zellen in hohem Ausmaß fördern und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium, empfindlich sind. Unter diesen bevorzugten Myelomzelllinien sind murine Myelomlinien, wie z.B. jene, die sich von MPOC-21- und MPC-11-Maustumoren herleiten, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, erhältlich sind, und SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind.
Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion von gegen CHF gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von durch Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörpern mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELSIA), ermittelt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mit der Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert worden sind, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, siehe oben). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise D-MEM- oder RPMI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumore in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise von Kulturmedium, Aszitesflüssigkeit oder Serum durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie getrennt.
Für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann leicht isoliert und sequenziert werden, wobei herkömmliche Verfahren angewendet werden (z.B. durch Verwenden von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten muriner Antikörper kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn einmal isoliert, kann die die DNA in Expressionsvektoren gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. E.-coli-Zellen, Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein Immungobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Überblicksartikel über rekombinante Ex pression von für den Antikörper kodierender DNA in Bakterien umfassen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5, 256-262 (1993), und Plückthun, Immunol. Revs. 130, 151-188 (1992).
Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Ersetzen der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Abschnitts der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Protein an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Auf diese Weise werden „chimäre" oder „Hybrid"-Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines monoklonalen Anti-CHF-Antikörpers hierin aufweisen.
Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung durch derartige Nicht-Immunglobulin-Polypeptide ersetzt, oder es werden die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der Erfindung ersetzt, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen, der eine Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein CHF und eine weitere Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre Antikörper und Hybrid-Antikörper können außerdem in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einsetzen, hergestellt werden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Für diagnostische Anwendungen werden die Antikörper der Erfindung typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung kann jegliche sein, die fähig ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop sein, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemi lumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; Biotin; radioaktive Isotopenmarker, wie z.B. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C oder ³H, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.
Jegliches auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur gesonderten Konjugation des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung kann eingesetzt werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jeglichem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie z.B. in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., S, 147-158 (1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (der ein CHF oder ein immunologisch reaktiver Teil davon sein kann), mit dem Testprobenanalyten (CHF) um die Bindung mit einer begrenzten Menge Antikörper zu konkurrieren. Die Menge an CHF in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge an Standard, die an die Antikörper gebunden wird. Um die Ermittlung der Menge an Standard, die gebunden wird, zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion solubilisiert, so dass Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden werden, leicht von ungebunden verbliebenem Standard und Analyten getrennt werden können.
Sandwichtests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, die beide fähig sind, an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein anderes Epitop des nachzuweisenden Proteins (CHF) zu binden. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der an einen festen Träger immobilisiert ist, worauf ein zweiter Antikörper an den Analyten bindet, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. David und Greene, US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkter Sandwichtest) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwichtest). Beispielweise ist eine der Arten von Sandwichstests ein ELISA-Test, wobei in diesem Fall die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist (z.B. Meerrettichperoxidase).
(iv) Humanisierte Antikörper
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt worden sind, die nicht menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach den Verfahren von Winter und Mitarbeitern durchgeführt werden (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), indem die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nager-CDRs oder -CDR-Sequenzen ersetzt werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, siehe oben), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern ersetzt sind.
Die Auswahl menschlicher variabler Domänen, sowohl schwerer als auch leichter Domänen, die bei der Herstellung der humanisierten Antikörper zu verwenden sind, ist zur Verminderung der Antigenität sehr wichtig. Nach dem so genannten „Best-fit"-Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagerantikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter menschlicher Sequenzen variabler Domänen gescreent. Jene menschliche Sequenz, die jener des Nagers am nächsten kommt, wird dann als das menschliche Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren verwendet ein bestimmtes Gerüst, das sich von der Konsensussequenz aller menschlichen Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten herleitet. Dasselbe Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Es ist ferner wichtig, dass Antikörper mit Erhaltung hoher Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper nach einem bevorzugten Verfahren durch einen Prozess der Analyse der elterlichen Sequenzen und der verschiedenen konzeptionellen humanisierten Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der elterlichen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung geläufig. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen gewählter Kandidat-Immunglobulinsequenzen illustrieren und darstellen. Die Prüfung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle des Rests bei der Funktion der Kandidat-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidat-Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste aus den Konsensus- und Importsequenzen gewählt und kombiniert werden, so dass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e), erzielt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und sehr wesentlich an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt.
(v) Menschliche Antikörper
Menschliche monoklonale Antikörper können mittels Hybridomverfahren hergestellt werden. Mensch-Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper sind beschrieben worden, beispielsweise von Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Produc tion Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, S. 51-63 (1987); und Boerner et al., J. Immunol. 147, 86-95 (1991).
Es ist nunmehr möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) herzustellen, die fähig sind, nach Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-(J_H-)Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen in der vollständigen Hemmung endogener Antikörperproduktion resultiert. Die Übertragung der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in derartige keimbahnmutierte Mäuse wird in der Produktion menschlicher Antikörper nach Antigenexposition resultieren. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993).
Alternativ dazu kann die Phagendisplay-Technologie (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990)) verwendet werden, um menschliche Antikörper und Antikörperfragmente in vitro aus variablen (V-)Immunglobulin-Domänen-Genrepertoires aus nicht-immunisierten Spendern herzustellen. Gemäß dieser Technik werden Antikörper-V-Domänen-Gene In-frame mit entweder einem Haupt- oder Neben-Hüllproteingen eines filamentösen Bakteriophagen, wie z.B. M13 oder fd, kloniert und als funktionelle Antikörperfragmente an der Oberfläche der Phagenteilchen präsentiert. Da das filamentöse Teilchen eine einzelsträngige DNA-Kopie des Phagengenoms enthält, resultieren auf den funktionellen Eigenschaften des Antikörpers beruhende Selektionen auch in der Selektion des Gens, das für den diese Eigenschafen zeigenden Antikörper kodiert. Daher ahmt der Phage manche der Eigenschaften der B-Zelle nach. Phagendisplay kann in einer Reihe von Formaten durchgeführt werden; für einen Überblick darüber siehe z.B. Kevin S. Johnson und David J. Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Mehrere Quellen von V-Gen-Segmenten können für den Phagendisplay verwendet werden. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), isolierten ein mannigfaltiges Feld von Anti-Oxazolon-Antikörpern aus einer kleinen kombinatorischen Bibliothek von V-Genen, die aus den Milzen immuni sierter Mäuse stammten. Ein Repertoire von V-Genen aus nicht-immunisierten menschlichen Spendern kann konstruiert werden, und Antikörper gegen ein mannigfaltiges Feld von Antigenen (einschließlich Selbst-Antigenen) können im Wesentlichen nach den von Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), oder Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993), beschriebenen Techniken isoliert werden.
Bei einer natürlichen Immunantwort akkumulieren Antikörpergene Mutationen mit einer hohen Rate (somatische Hypermutation). Einige dieser eingeführten Veränderungen verleihen eine höhere Affinität, und B-Zellen, die hochaffines Oberflächen-Immunglobulin präsentieren, werden während der anschließenden Antigenexposition bevorzugt repliziert und differenziert. Dieser natürliche Prozess kann durch Einsetzen einer Technik nachgeahmt werden, die als „Chain-shuffling" bekannt ist (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 (1992)). Bei diesem Verfahren kann die Affinität von durch Phagendisplay erlangten „primären" menschlichen Antikörpern verbessert werden, indem die Schwer- und Leichtketten-V-Region-Gene nacheinander mit aus nicht-immunisierten Spendern erlangten Repertoires natürlich vorkommender Varianten (Repertoires) von V-Domänen-Genen ersetzt werden. Diese Technik ermöglicht die Produktion von Antikörpern und Antikörperfragmenten mit Affinitäten im nM-Bereich. Eine Strategie zur Herstellung sehr großer Phagenantikörper-Repertoires ist von Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993), beschrieben worden.
Gen-shuffling kann außerdem verwendet werden, um menschliche Antikörper von Nager-Antikörpern herzuleiten, wobei der menschliche Antikörper dem anfänglichen Nager-Antikörper ähnliche Affinitäten und Spezifitäten aufweist. Nach diesem Verfahren, das auch als „Epitop-Prägung" bezeichnet wird, wird das Schwer- oder Leichtketten-V-Domänen-Gen der durch die Phagendisplay-Technik erlangten Nager-Antikörper durch ein Repertoire menschlicher V-Domänen-Gene ersetzt, wodurch Nager-Mensch-Chimären erzeugt werden. Die Selektion auf Antigen resultiert in der Isolierung von Mensch-Variablen, die zur Wiederherstellung einer funktionellen Antigenbindungsstelle fähig sind, d.h. dass das Epitop die Partnerwahl bestimmt (prägt). Wenn der Prozess wiederholt wird, um die verbleibende Nager-V-Domäne zu ersetzen, wird ein menschlicher Antikörper erhalten (siehe PCT WO 93/06213, veröffentlicht am 1. April 1993). Im Gegensatz zur herkömmlichen Humanisierung von Nager-Antikörpern durch CDR-Aufpfropfung stellt diese Technik vollständig menschliche Antikörper bereit, die keine aus Nagern stammenden Gerüst- oder CDR-Reste aufweisen.
(vi) Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für ein CHF, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für einen anderen Liganden, der an ein GH-/Cytokin-Rezeptorfamilienelement bindet. Beispielsweise liegen bispezifische Antikörper, die ein CHF und neurotrophen Faktor oder zwei verschiedene Arten von CHF-Polypeptiden spezifisch binden, im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Wegen der zufälligen Zusammenstellung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch von 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte durchgeführt wird, ist ziemlich mühsam, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in der am 13. Mai 1993 veröffentlichten WO 93/08829 und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Nach einem anderen und bevorzugteren Verfahren werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierenden Stellen) an konstante Immunglobulindomänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Abschnitt der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es ist bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), die die zur Leichtkettenbindung benötigte Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für diese Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtketten kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Dies sorgt für eine hohe Flexibilität bei der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente bei Ausführungsformen, wo ungleiche Verhältnisse der bei der Konstruktion verwendeten drei Polypeptidketten die optimalen Ausbeuten bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Produktion von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen in hohen Ausbeuten resultiert oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Relevanz sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (der eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) im anderen Arm zusammengesetzt. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für eine einfache Art und Weise der Trennung sorgt. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
(vii) Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Derartige Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-Patent Nr. 4.676.980), und zur Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360, WO 92/00373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Anwendung eines beliebigen zweckdienlichen Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
5. Verwendungen von CHF-Antikörpern
CHF-Antikörper sind in diagnostischen Tests für CHF zweckdienlich, z.B. für seine Produktion in speziellen Zellen, Geweben oder Serum. Die Antikörper werden in derselben Weise wie CHF wie oben beschrieben markiert und/oder werden an eine unlösliche Matrix immobilisiert. In einer der Ausführungsformen eines Rezeptorbindungstests wird eine Antikörperzusammensetzung, die an alle oder an eine ausgewählte Anzahl von CHFs bindet, an eine unlösliche Matrix immobilisiert, die Testprobe mit der immobilisierten Antikörperzusammensetzung kontaktiert, um alle CHFs zu adsorbieren, und dann die immobilisierten CHFs mit mehreren Antikörpern kontaktiert, die für jedes der CHF spezifisch sind, wobei jeder der Antikörper jeweils als für ein vorherbestimmtes CHF spezifisch identifizierbar ist, wie z.B. mittels einzigartiger Marker, wie z.B. unterscheidbarer Fluorophore und dergleichen. Durch Bestimmen der Gegenwart und/oder Menge jedes einzigartigen Markers können relativer Anteil und Menge jedes CHF bestimmt werden.
Die Antikörper dieser Erfindung sind außerdem bei der passiven Immunisierung von Patienten zweckdienlich.
CHF-Antikörper sind außerdem für die Affinitätsreinigung von CHF aus rekombinanter Zellekultur oder natürlichen Quellen zweckdienlich. CHF-Antikörper, die keine nachweisbare Kreuzreaktion mit dem Ratten-CHF zeigen, können CHF frei von derartigem Protein reinigen.
Geeignete Diagnosetests für CHF und seine Antikörper sind an sich wohlbekannt. Zusätzlich zu den in den unten stehenden Beispielen beschriebenen Biotests, worin das Kandidat-CHF getestet wird, um festzustellen, ob es hypertrophe, anti-arrhythmische, inotrope oder neurotrophe Aktivität aufweist, sind kompetitive, Sandwich- und Immuntesttechniken für sterische Hinderung zweckdienlich. Die kompetitiven und Sandwich-Verfahren setzen einen Phasentrennschritt als integralen Teil des Verfahrens ein, während ein Test der sterischen Hinderung in einem einzigen Reaktionsgemisch durchgeführt wird. Grundsätzlich werden dieselben Verfahren für den Test von CHF und für CHF bindende Substanzen verwendet, obgleich gewisse Verfahren in Abhängigkeit vom Molekulargewicht der getesteten Substanzen bevorzugt sein werden. Daher wird die zu testende Substanz hierin als Analyt bezeichnet, und zwar ungeachtet ihrer sonstigen Stellung als Antigen oder Antikörper; und den Analyten bindende Proteine werden, ob sie nun Antikörper, Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene sind, als Bindungspartner bezeichnet.
Analytische Verfahren für CHF oder seine Antikörper verwenden alle eines oder mehrere der folgenden Reagenzien: markiertes Analyten-Analogon, immobilisiertes Analyten-Analogon, markierten Bindungspartner, immobilisierten Bindungspartner und sterische Konjugate. Die markierten Reagenzien sind auch als „Tracer" bekannt.
Die verwendete Markierung (und diese ist auch zur Markierung von CHF-Nucleinsäure zur Verwendung als Sonde zweckdienlich) ist jede nachweisbare Funktionalität, die die Bindung von Analyt an seinen Bindungspartner nicht stört. Es sind zahlreiche Marker zur Verwendung im Immuntest bekannt, wie z.B. fluorochrome, chemilumineszente und radioaktive Marker sowie Gruppierungen, wie z.B. Enzyme, die umgesetzt oder derivatisiert werden müssen, um nachgewiesen zu werden. Beispiele derartiger Marker umfassen die Radioisotope ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H und ¹³¹I; Fluorophore, wie z.B. Komplexe seltener Erden oder Fluorescein und seine Derivate; Rhodamin und seine Derivate; Dansyl; Umbelliferon; Luciferase, z.B. Leuchtkäfer-Luciferase und bakterielle Luciferase (US-Patent Nr. 4.737.456); Luciferin; 2,3-Dihydrophthalazinodione; Malatdehydrogenase; Urease; Peroxidase, wie z.B. Meerrettichperoxidase (HRP); alkalische Phosphatase; β-Galactosidase; Glucoamylase; Lysozym; Saccharidoxidasen, z.B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose- 6-phosphatdehydrogenase; heterozyklische Oxidasen, wie z.B. Uricase und Xanthinoxidase, gekoppelt mit einem Enzym, das Wasserstoffperoxid einsetzt, um einen Farbstoffvorläufer zu oxidieren, wie z.B. HRP, Lactoperoxidase oder Microperoxidase; Biotin/Avidin; Spinmarker; Bakteriophagenmarker; stabile Radikale; und dergleichen.
Der durchschnittliche Fachmann wird andere geeignete Marker kennen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die Bindung dieser Marker an CHF, Antikörper oder Fragmente davon kann durch Standardtechniken erzielt werden, die dem durchschnittlichen Fachmann allgemein bekannt sind. Beispielsweise können Kopplungsmittel, wie z.B. Dialdehyde, Carbodiimide, Dimaleinimide, Bis-Imidate, Bis-diazotiertes Benzidin und dergleichen, verwendet werden, um das Polypeptid mit den oben beschriebenen fluoreszenten, chemilumineszenten und enzymatischen Markern zu markieren. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 3.940.475 (Fluorimetrie) und 3.645.090 (Enzyme); Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods 40, 219-230 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407-412 (1982); O'Sullivan et al., „Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in: Methods in Enzymology, J.J. Langone und H. Van Vunakis (Hrsg.), Bd. 73, Academic Press, New York, S. 146-166 (1981); Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70, 1-31 (1976); und Schure et al., Clin. Chim. Acta 81, 1-40 (1977). In der letzteren Literaturstelle erwähnte Kopplungstechniken sind das Glutaraldehyd-Verfahren, das Periodat-Verfahren, das Dimaleinimid-Verfahren und das m-Maleinimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren.
Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Enzymmarker eine bevorzugte Ausführungsform. Kein einzelnes Enzym ist ideal zur Verwendung als Marker in jedem denkbaren Test. Stattdessen muss man ermitteln, welches Enzym für ein bestimmtes Testsystem geeignet ist. Für die Auswahl von Enzymen wichtige Kriterien sind die Wechselzahl des reinen Enzyms (die Anzahl an Substratmolekülen, die pro Enzymstelle pro Zeiteinheit zu Produkt umgesetzt werden), Reinheit des Enzympräparats, Empfindlichkeit des Nachweises seines Produkts, Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Detektion der Enzymreaktion, Abwesenheit störender Faktoren oder enzymähnlicher Aktivität in der Testflüssigkeit, Stabilität des Enzyms und seines Konjugats, Verfügbarkeit und Kosten des Enzyms und seines Konjugats und dergleichen. Unter den als bevorzugte Marker in den Tests der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzymen umfasst sind alkalische Phosphatase, HRP, Beta-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Malatdehydrogenase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Urease befindet sich unter den bevorzugteren Enzymmarkern, insbesondere wegen chromogenen pH-Indikatoren, die seine Aktivität dem bloßen Auge leicht erkennbar machen.
Für gewisse Testverfahren ist die Immobilisierung von Reagenzien erforderlich. Die Immobilisierung bedingt das Abtrennen des Bindungspartners von jeglichem frei in Lösung verbleibenden Analyten. Dies wird zweckdienlicherweise erzielt, indem entweder Bindungspartner oder Analyten-Analogon vor der Testprozedur insolubilisiert werden, wie z.B. durch Adsorption an eine wasserunlösliche Matrix oder Oberfläche (Bennich et al., US-Patent Nr. 3.720.760), durch kovalente Kopplung (beispielsweise unter Verwendung von Glutaraldehyd-Vernetzung) oder durch nachträgliches Insolubilisieren des Partners oder Analogons, z.B. durch Immunpräzipitation.
Andere Testverfahren, die als kompetitive oder Sandwich-Tests bekannt sind, sind gut eingeführt und werden in der gewerblichen Diagnostika-Industrie weithin verwendet.
Kompetitive Tests beruhen auf der Fähigkeit eines Tracer-Analogons, mit dem Testprobenanalyten um eine beschränkte Zahl von Bindungsstellen an einem gemeinsamen Bindungspartner zu konkurrieren. Der Bindungspartner wird im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion insolubilisiert, und dann werden Tracer und an den Bindungspartner gebundener Analyt von ungebundenem Tracer und Analyten getrennt. Diese Trennung wird durch Dekantieren (wo der Bindungspartner vorher insolubilisiert wurde) oder durch Zentrifugieren (wo der Bindungspartner nach der kompetitiven Reaktion präzipitiert wurde) erzielt. Die Menge an Testprobenanalyten ist umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Tracer, wie durch die Menge an Markersubstanz gemessen wird. Dosisreaktionskurven mit bekannten Analytmengen werden hergestellt und mit den Testergebnissen verglichen, um die Menge von in der Testprobe vorhandenem Analyten quantitativ zu bestimmen. Diese Tests werden ELISA-Systeme genannt, wenn Enzyme als nachweisbare Marker verwendet werden.
Eine weitere Art des kompetitiven Tests, die „homogener" Test genannt wird, erfordert keine Phasentrennung. Hier wird ein Konjugat eines Enzyms mit dem Analyten hergestellt und so verwendet, dass bei Bindung von Anti-Analyt an den Analyten die Gegenwart des Anti-Analyten die Enzymaktivität verändert. In diesem Fall werden CHF oder seine immunologisch aktiven Fragmente mit einer bifunktionellen organischen Brücke an ein Enzym, wie z.B. Peroxidase, konjugiert. Konjugate werden zur Verwendung mit Anti-CHF so gewählt, dass die Bindung des Anti-CHF die Enzymaktivität des Markers hemmt oder ermöglicht. Dieses Verfahren an sich wird unter dem Namen EMIT weithin praktiziert.
Sterische Konjugate werden bei Verfahren der sterischen Hinderung für den homogenen Test verwendet. Diese Konjugate werden durch kovalentes Binden eines niedermolekularen Haptens an einen kleinen Analyten synthetisiert, so dass der Antikörper gegen das Hapten im Wesentlichen unfähig ist, das Konjugat zur selben Zeit wie Anti-Analyt zu binden. Bei diesem Testverfahren wird der in der Testprobe vorhandene Analyt Anti-Analyt binden, wodurch es dem Anti-Hapten ermöglicht wird, das Konjugat zu binden, was in einer Veränderung der Eigenschaft des Konjugat-Haptens resultiert, z.B. einer Veränderung der Fluoreszenz, wenn das Hapten ein Fluorophor ist.
Sandwich-Tests sind insbesondere zur Bestimmung von CHF oder CHF-Antikörpern zweckdienlich. Bei sequenziellen Sandwich-Tests wird ein immobilisierter Bindungspartner verwendet, um Testprobenanalyten zu adsorbieren, wird die Testprobe durch Waschen entfernt, wird der gebundene Analyt verwendet, um markierten Bindungspartner zu adsorbieren, und wird gebundenes Material dann von verbleibendem Tracer abgetrennt. Die Menge an gebundenem Tracer ist direkt proportional zum Testprobenanalyten. Bei „simultanen" Sandwichtests wird die Testprobe vor Zugabe des markierten Bindungspartners nicht abgetrennt. Ein sequenzieller Sandwich-Test unter Verwendung eines monoklonalen Anti-CHF-Antikörpers als einer der Antikörper und eines polyklonalen Anti-CHF-Antikörpers als der andere Antikörper ist beim Testen von Proben auf CHF-Aktivität zweckdienlich.
Die vorhergehenden Tests sind lediglich beispielhafte Diagnosetests für CHF und Antikörper. Andere nunmehr oder hiernach entwickelte Verfahren zur Bestimmung dieser Analyten sind im Schutzumfang hiervon enthalten, einschließlich der oben beschriebenen Biotests.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration bereitgestellt und schränken die vorliegende Erfindung nicht ein. Die Offenbarungen aller Zitate in der Patentbeschreibung sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
BEISPIEL I
Identifizierung und In-vitro-Aktivität eines CHF
A. Test auf expressionskloniertes Material
Der für Hypertrophie verwendete Test ist ein In-vitro-Test für neonatale Ratten-Herzhypertrophie, der allgemein wie folgt beschrieben wird:
1. Herstellung der Myozyten-Zellsuspension
Die Herstellung der Myozyten-Zellsuspension basiert auf Verfahren, die in Chien et al., J. Clin. Invest. 75, 1770-1780 (1985), und Iwaki et al., siehe oben, umrissen sind. Ventrikel aus den Herzen von 1-2 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten-Jungtieren wurden entfernt und in drei gleiche Teile geteilt. Die zerhackten Ventrikel wurden mit einer Reihe von aufeinander folgenden Collagenase-Behandlungen verdaut. Die Reinigung der resultierenden Einzelzellsuspension an einem diskontinuierlichen Per coll-Gradienten resultierte in einer Suspension von Myozyten mit einer Reinheit von 95 %.
2. Ausplattieren und Kultur der Myozyten
Zwei veröffentlichte Verfahren zum Ausplattieren und Kultivieren der Myozyten sind die Folgenden: (1) Long et al., siehe oben, plattierten die Zellsuspension für 30 Minuten in MEM/5 % Kälberserum als Vorkultur aus. Die nicht anhaftenden Myozyten wurden dann in serumfreiem, mit Insulin, Transferrin, BrdU und Rinderserumalbumin ergänztem MEM in 35-mm-Gewebekulturplatten bei einer Dichte von 7,5 × 10⁴ Zellen pro ml ausplattiert. (2) Iwaki et al, siehe oben, plattierten die Zellsuspension in D-MEM/199/5 % Pferdeserum/5 % Fötalkälberserum in 10-cm-Gewebekulturplatten bei 3 × 10⁵ Zellen pro ml aus. Nach 24 Stunden in Kultur wurden die Zellen gewaschen und in serumfreiem D-MEM/199 inkubiert.
Ein anderes Protokoll ist gemäß dieser Erfindung zum Ausplattieren und Kultivieren dieser Zellen entwickelt worden, um die Testkapazität mit einem miniaturisierten Test zu erhöhen. Die Wells von 96-Well-Gewebekulturplatten werden mit D-MEM/F12/4 % Fötalkälberserum für 8 Stunden bei 37 °C vorbeschichtet. Dieses Medium wird entfernt, und die Zellsuspension wird in die inneren 60 Wells bei 7,5 × 10⁴ Zellen pro ml in mit Insulin, Transferrin und Aprotinin ergänztem D-MEM/F12 ausplattiert. Das Medium enthält typischerweise auch ein Antibiotikum wie z.B. Penicillin/Streptomycin und Glutamin. Dieses Medium ermöglicht diesen Zellen das Überleben bei dieser niedrigen Ausplattierdichte ohne Serum. Testsubstanzen werden direkt zu den Wells zugesetzt, nachdem die Zellen sich für 24 Stunden in Kultur befunden haben.
3. Ablesung der Hypertrophie
Nach Stimulierung mit alpha-adrenergen Agonisten oder Endothelin zeigen neonatale Ratten-Herzzellen in Kultur mehrere Merkmale der In-vivo-Herzmuskelhypertrophie, die bei kongestiver Herzinsuffizienz beobachtet wird, einschließlich eine Vergrößerung der Zellen und eine Steigerung der Assemblierung eines einzelnen kontraktilen Proteins zu organisierten kontraktilen Einheiten. Chien et al., FASEB J., siehe oben. Diese Veränderungen können mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop beobachtet und das Ausmaß an Hypertrophie mit einer willkürlichen Skala von 7 bis 0 bewertet werden, wobei 7 vollständig hypertrophierte Zellen und 3 nicht-stimulierte Zellen sind. Die Zustände 3 und 7 können in Simpson et al., Circulation Research 51, 787-801 (1982), 2, A bzw. B, erkannt werden. Um die mikroskopische Ablesung der 96-Well-Kulturen zu erleichtern und einen dauerhaften Beleg zu generieren, werden die Myozyten nach der geeigneten Testdauer mit Kristallviolett in Methanol fixiert und gefärbt. Kristallviolett ist ein häufig verwendeter Proteinfarbstoff für kultivierte Zellen.
Zusätzlich kann eine Aliquote aus den 96-Well-Platten entnommen und auf Expression von Proteinmarkern oder die Reaktion, wie z.B. Freisetzung von ANF oder ANP, überprüft werden.
B. Expressionsklonierung
Poly(A)⁺-RNA wurde isoliert (Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972); Cathala et al., DNA 2, 329-335 (1983)), und zwar aus 7 Tage alten Maus-Embryoidkörpern. Embryoidkörper wurden durch die Differenzierung von pluripotenten embryonalen Stamm-(ES-)Zellen erzeugt (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27-45 (1985)). Die embryonale Stammzelllinie ES-D3 (ATCC-Nr. CRL 1934) wurde in einem LIF enthaltenden Medium undifferenziert gehalten (Williams et al., Nature 336, 684-687 (1988)). Dieses Medium enthielt D-MEM (hoher Glucosegehalt), 1 % Glutamin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, Penicillin-Streptomycin, 15 % hitzeinaktiviertes Fötalkälberserum und 15 ng/ml Maus-LIF. Wenn diese Zellen in Suspensionskultur in dasselbe, 20 % hitzeinaktiviertes Fötalkälberserum enthaltende Medium ohne LIF gegeben wurden (Tag 0), aggregierten und differenzierten sie zu mehrzelligen, Embryoidkörper genannten Strukturen. Mit dem Tag 8 der Kultur bildeten sich schlagende primordiale herzähnliche Strukturen auf einem Teil der Körper. Die Embryoidkörper wurden hinsichtlich Produktion von CHF-Aktivität beurteilt, indem die differenzierenden ES-Zellen für eine 24-stündige Akkumulierung auf serumfreies Medium (D-MEM/F-12, 1 % Glutamin, Penicillin-Streptomycin, enthaltend 0,03 % Rinderserumalbumin) umgestellt wurden. Vor dem Test wurde das konditionierte Medium mit einer 3-K-Ultrafiltrationsmembran (Amicon) 10fach konzentriert und gegen Testmedium dialysiert. Für 24 Stunden konditioniertes Medium beginnend am Tag 3 lieferte eine Hypertrophiebewertung von 4,5-5,5 und beginnend am Tag 6 eine Bewertung von 5,5-7,5.
Eine cDNA-Bibliothek im Plasmidexpressionsvektor pRK5B (Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) wurde nach einer Vektorpriming-Strategie (Strathdee et al., Nature 356, 763-767 (1992)) hergestellt, Der Vektor, pRK5B, wurde an der NotI-Stelle linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und an das einzelsträngige Oligonucleotid ocd1.1.3 mit der folgenden Sequenz ligiert:
5'-GCGGCCGCGAGCTCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (Seq.-ID Nr. 5). Das ligierte Produkt wurde dann mit BstXI geschnitten, und das Vektorfragment von 4.700 bp wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Der Vektor wurde mittels Oligo-dA-Chromatographie weiter gereinigt.
Die Expressionsbibliothek wurde unter Verwendung von 1 μg der Poly(A)+-RNA, 5 μg Vektorprimer und Reagenzien von Amersham konstruiert. Nach Erst- und Zweitstrangsynthese und T4-DNA-Polymerase-Auffüllreaktioenen wurde das Material nach Größe auf Inserte von mehr als 500 bp mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und mittels Ligation stumpfer Enden ohne Anfügung von Linkern zirkularisiert. Die Ligationen wurden verwendet, um den E.-coli-Stamm DH5α mittels Elektroporation zu transformieren. Aus 1 μg Poly(A)⁺-RNA wurden 499 ng doppelsträngige cDNA erzeugt. Siebzehn Nanogramm cDNA wurden ligiert und 3,3 ng transformiert, um 780.000 Klone zu liefern, von denen 83 % Inserte einer Durchschnittsgröße von 1.470 bp aufwiesen.
DNA wurde aus Pools von 75-15.000 Klonen isoliert und in menschliche Urnieren-293-Zellen durch Lipofectamin-Transfektion (Gibco BRL) transfiziert. Zwei Mikro gramm DNA wurden verwendet, um 200.000 Zellen in 6-Well-Platten zu transfizieren. Die Zellen wurden in 2 ml serumfreiem Testmedium für vier Tage inkubiert. Dieses Medium bestand aus 100 ml D-MEM/F-12, 100 μl Transferrin (10 mg/ml), 20 ml Insulin (5 mg/ml), 50 μl Aprotinin (2 mg/ml), 1 ml pen/strep (JRH Biosciences Nr. 59602-77P) und 1 ml L-Glutamin (200 mM). Transfektions- und Expressionseffizient wurden durch Einbeziehung von 0,2 μg DNA für ein Plasmid überprüft, das eine sekretierte Form von alkalischer Phosphatase exprimierte (Tate et al., FASEB J. 4, 227-231 (1990)).
Einhundert Mikroliter konditioniertes Kulturmedium aus jedem transfizieren Pool wurden auf Hypertrophie in einem Endvolumen von 200 μl getestet. Für einige Pools wurde das konditionierte Medium vor dem Test mit Centricon-3^TM-Mikrokonzentratoren (Amicon) 4-5fach konzentriert. Neunzig Pools von 10.000-15.000 Klonen, 359 Pools von 1.000-5.800 Klonen und 723 Pools von 75-700 Klonen wurden transfiziert und auf Hypertrophieaktivität getestet. Von diesen 1.172 Pools erwiesen sich zwei als positiv. Pool 437 (ein Pool von 187 Klonen) und Pool 781 (ein Pool von 700 Klonen) lieferten Bewertungen von 4. Ein reiner Klon (als pchf.437.48 bezeichnet) aus Pool 437 wurde durch neuerliche Transfektion von positiven Klonen isoliert, die immer weniger Klone enthielten, bis ein einziger Klon erlangt wurde. Ein reiner Klon aus Pool 781 (als pchf.781 bezeichnet) wurde durch Koloniehybridisierung an das Insert aus Klon pchf.473.48 isoliert.
Die Sequenz für das Insert von Klon pchf.781 ist in 1 bereitgestellt (Seq.-ID Nr. 1, 2 und 3 für die beiden Nucleotidstränge bzw. Aminosäuresequenz). Die Sequenz des Inserts von Klon pchf.437.48 stimmt mit Klon 781 beginnend mit Base 27 überein (unterstrichen).
Das erste offene Leseraster von Klon pchf.781 (siehe Translation, 1) kodiert für ein Protein von 203 Aminosäuren (translatiertes MW = 21,5 kD). Dieses Protein enthält einen Cysteinrest, eine potenzielle N-gebundene Glykosylierungsstelle und keine hydrophobe N-terminale Sekretionssignalsequenz. Die 3'-untranslatierte Region von Klon pchf.781 enthält eine herkömmliche Maus-Wiederholung, die als b1 be kannt ist (bp ~895-1.015). Die Hybridisierung von Poly(A)⁺-RNA 7 Tage alter Embryoidkörper mit einer Sonde aus Klon pchf.781 zeigt eine einzige Bande von ~1,4 kb, die ungefähr dieselbe Größe wie das Insert aus den cDNA-Klonen aufweist.
Die kodierte Sequenz hat keine hohe Ähnlichkeit (>35 % Aminosäuresequenzidentität) mit irgendwelchen bekannten Proteinsequenzen in der Dayhoff-Datenbank. Sie zeigt jedoch einen niedrigen Grad an Ähnlichkeit mit einer Familie entfernt verwandter Proteine, einschließlich CNTF, Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-11 (IL-11), LIF und Oncostatin M (OSM) (Bazan, Neuron 7, 197-208 (1991)). Maus-CHF weist 24 % Aminosäureidentität mit Maus-LIF (Rose und Todaro, WO 93/05169) und 21 % Aminosäureidentität mit menschlichem CNTF auf (McDonald et al., Biochim. Biophys. Acta 1090, 70-80 (1991)). Siehe 2 für eine Abgleichung von Maus-CHF und menschlichen CNTF-Sequenzen. CNTF, IL-6, IL-11, LIF und OSM verwenden ähnliche Rezeptorsignalproteine, einschließlich pg130, die Elemente der GH-/Cytokin-Rezeptorfamilie sind (Kishimoto et al., Cell 76, 253-262 (1994)). CNTF weist wie CHF keine N-terminale Sekretionssignalsequenz auf.
C. Identität und Aktivität des Klons
Um nachzuweisen, dass Klon pchf.781 für ein CHF kodiert, wurden Expressionsstudien durch Transfektion von 293-Zellen sowie durch Einsatz eines gekoppelten Invitro-SP6-Transkriptions-/Translations-Systems durchgeführt. ³⁵S-Methionin- und Cystein-Markierung der von pchf.781-transfizierten 293-Zellen produzierten Proteine (im Vergleich mit Vektor-transfizierten Zellen) zeigte, dass das konditionierte Medium ein markiertes Protein von etwa 21,8 kD enthielt und dass der Zellextrakt ein Protein von 22,5 kD enthielt. Konditionierte Medien aus diesen Transfektionen ergaben eine Morphologie-Bewertung von 6 im Test auf Herzhypertrophie bei einer Verdünnung von 1:4 unter Anwendung des oben beschriebenen Tests. Konditionierte Medien aus unmarkierten Transfektionen ergaben eine Morphologie-Bewertung von 5,5-6,5 bei einer Verdünnung von 1:1.
Diese Tests waren auch für eine zweite Messung von Herzhypertrophie-ANP-Freisetzung positiv. Siehe 3. Dieser Test wurde mittels Bestimmung der Konkurrenz der Bindung von ¹²⁵I-Ratten-ANP um ein Ratten-ANP-Rezeptor-A-IgG-Fusionsprotein durchgeführt. Dieses Verfahren ist ähnlich jenem, das für die Bestimmung von gp120 unter Verwendung eines CD4-IgG-Fusionsproteins verwendet wird (Chamow et al., Biochemistry 29, 9885-9891 (1990)). Zusammenfassend wurden Mikrotiter-Wells mit 100 μl Ratten-Anti-Mensch-IgG-Antikörper (2 μg/ml) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Nach dem Waschen mit 0,5 % Rinderserumalbumin enthaltender phosphatgepufferter Salzlösung wurden die Wells mit 100 μl Ratten-ANP-Rezeptor-A-IgG (3 ng/ml) (hergestellt und gereinigt auf eine Weise analog zum menschlichen ANP-Rezeptor-A-IgG (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991))) für eine Stunde bei 24 °C inkubiert. Die Wells wurden mit 50 μl Ratten-ANP-Standard oder Probe für eine Stunde bei 24 °C gewaschen und inkubiert. Dann wurden 50 μl ¹²⁵I-Ratten-ANP (Amersham) für eine weitere Inkubation von einer Stunde zugesetzt. Die Wells wurden gewaschen und gezählt, um das Ausmaß der Bindungskonkurrenz zu ermitteln. ANP-Konzentrationen in der Probe wurden durch Vergleich mit einer Ratten-ANP-Standardkurve bestimmt.
³⁵S-Methionin-Markierung der mittels SP6-gekoppelter In-vitro-Transkription/Translation (Materialien von Promega) von Klon pchf.781 hergestellten Proteine zeigte ein markiertes Protein von 22,4 kD. Das markierte Translationsprodukt war aktiv, wenn es auf Herzhypertrophie bei einer Verdünnung von 1:200 getestet wurde (Morphologie-Bewertung 5-6). Um zu verifizieren, dass die markierte 22,4-kD-Bande für die Hypertrophieaktivität verantwortlich war, wurde das markierte Translationsprodukt auf eine in 10 % Acetonitril, 0,1 % TFA äquilibrierte Umkehrphasen-C4-Säule (Synchropak RO-4-4000) aufgegeben und mit einem Acetonitrilgradienten eluiert. Übereinstimmende Peaks von markiertem Protein und Hypertrophieaktivität eluierten aus dieser Säule bei ~55 % Acetonitril.
Eine Herzmyozyten-Hypertrophieaktivität ist beschrieben und aus Ratten-Herzfibroblasten partiell gereinigt worden. Long et al., siehe oben. Um die Identität des CHF hierin weiter zu untersuchen, wurden Ratten-Herzfibroblasten kultiviert. Konditionier tes Medium aus diesen Primärkulturen weist Herzhypertrophie im neonatalen Ratten-Herzhypertrophie-In-vitro-Test hierin auf. Die Blot-Hybridisierung von aus diesen Kulturen isolierter Ratten-Fibroblasten-RNA zeigt eine eindeutige Bande bei 1,4 kb bei Sondierung mit einem Fragment der kodierenden Region des Klons pchf.781. (Die Hybridisierung wurde in 5 × SSC, 20 % Formamid bei 42 °C mit einem letzten Waschvorgang in 0,2 × SSC bei 50 °C durchgeführt.)
D. Reinigung des Faktors
Das Kulturmedium, das durch Zellen konditioniert war, die mit dem Klon pchf.781 oder einem menschlichen Klon transfiziert waren, wird auf 1,5 M NaCl eingestellt und auf eine Toyopearl^TM-Butyl-650M-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl gewaschen und die Aktivität mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Zwittergent^TM 3-10 eluiert. Der Aktivität aufweisende Peak wird auf 150 mM NaCl, pH 8,0, eingestellt und auf eine MONO-Q-Fast-Flow-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % Octylglucosid gewaschen, und es findet sich Aktivität in der Durchflussfraktion. Das aktive Material wird dann auf eine Umkehrphasen-C4-Säule in 0,1 % TFA, 10 % Acetonitril aufgegeben und mit einem Gradienten von 0,1 % TFA bis auf 80 % eluiert. Es wird erwartet, dass ein chaotropes Mittel, wie z.B. Guanidin-HCl, zur Auftrennung und Gewinnung erforderlich ist.
BEISPIEL II
Testen auf In-vivo-Hypertrophieaktivität
A. Normale Ratten
Das gereinigte CHF aus Beispiel I wurde in normalen Ratten getestet, um seine Wirkung auf kardiovaskuläre Parameter, wie z.B. Blutdruck, Herzfrequenz, systemischen Gefäßwiderstand, Kontraktilität, Kraft des Herzschlags, konzentrische oder dilatierte Hypertrophie, systolischen Druck der linken Herzkammer, mittleren Druck der linken Herzkammer, enddiastolischen Druck der linken Herzkammer, Herzminutenvolumen, Schlagvolumenindex, histologische Parameter, Herzkammergröße, Wanddicke usw. zu beobachten.
B. Druck-Überbelastungs-Mausmodell
Das gereinigte CHF wurde außerdem im Druck-Überbelastungs-Mausmodell getestet, worin die Lungenarterie verengt wird, was das Versagen der rechten Herzkammer bewirkt.
C. Murines RV-Dysfunktions-Modell
Ein retrovirales murines Modell der Herzkammer-Dysfunktion kann verwendet werden, um gereinigtes CHF zu testen, und dP/dt, Auswurffraktion, und Volumina können mit dem oben beschriebenen Hypertrophietest getestet werden. In diesem Modell wird die Lungenarterie der Maus verengt, so dass Lungenhypertrophie und -Versagen hervorgerufen werden.
D. Transgenes Maus-Modell
Transgene Mäuse, die ein Muskel-Actinpromotor-IGF-I-Fusionsgen beherbergen, zeigen Herz- und Skelettmuskelhypertrophie ohne Anzeichen von Myopathie oder Herzinsuffizienz. Darüber hinaus zeigen Mäuse, auf die das IGF-I-Gen gerichtet ist, Defekte der Herz-(sowie Skelett-)Myogenese, einschließlich deutlich verminderter Expression der Gene für kontraktiles Herzkammermuskelprotein. Das gereinigte CHF wird in diesen beiden Modellen getestet.
Weitere auf Genetik basierende Modelle der dilatierten Kardiomyopathie und Herzfunktionsstörung ohne Nekrose können in transgenen Mäusen und Mäusen, auf die das Gen gerichtet ist, (MLC-ras-Mäusen; Aortabänderung heterozygoter IGF-I-defekter Mäuse) entwickelt werden.
E. Post-Myokardinfarkt-Rattenmodell
Das gereinigte CHF wird außerdem in einem Post-Myokardinfarkt-Rattenmodell getestet, das bei der Produktion von natriuretischem Peptid für menschliche kongestive Herzinsuffizienz prognostisch ist. Im Speziellen werden männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Breeding Laboratories, Inc., acht Wochen alt) für zumindest eine Woche vor dem chirurgischen Eingriff der Anlage akklimatisiert. Die Ratten werden mit pelletiertem Rattenfutter und Wasser nach Belieben gefüttert und in einem licht- und temperaturregulierten Raum gehalten.
1. Koronararterienligatur
Myokardinfarkt wird durch Ligatur der linken Koronararterie wie von Greenen et al., J. Appl. Physiol. 93, 92-96 (1987), und Buttrick et al., Am. J. Physiol. 260, 11473-11479 (1991), beschrieben hervorgerufen. Die Ratten werden mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg, intraperitoneal) anästhesiert, über Luftröhrenschnitt intubiert und mit einem Respirator (Harvard Apparatus Model 683) beatmet. Nach einem linksseitigen Luftröhrenschnitt wird die linke Koronararterie ungefähr 2 mm von ihrem Ursprung mit einer 7-0-Seidennaht ligiert. Scheinbehandelte Tiere werden derselben Prozedur mit der Ausnahme unterzogen, dass die Naht unter die Koronararterie geführt und dann entfernt wird. Alle Ratten werden gemäß der am 11. November 1984 von der American Heart Association freigegebenen „Position of the American Heart Association on Research Animal Use" gehandhabt. Vier bis sechs Wochen nach der Ligation konnte sich der Myokardinfarkt in Ratten zu Herzinsuffizienz entwickeln.
Bei klinischen Patienten ist der Myokardinfarkt oder die Koronararterienerkrankung die häufigste Ursache der Herzinsuffizienz. Kongestive Herzinsuffizienz in diesem Modell ahmt kongestive Herzinsuffizienz bei den meisten Patienten in angemessener Weise nach.
2. Elektrokardiogramme
Ein Woche nach dem chirurgischen Eingriff werden Elektrokardiogramme unter leichter Metofan-Anästhesie erlangt, um die Entwicklung von Infarkten zu dokumentieren. Die ligierten Ratten dieser Studie werden nach Tiefe und Beständigkeit pathologischer Q-Zacken quer über die präkordialen Ableitungen in Gruppen unterteilt. Buttrick et al., siehe oben; Kloner et al., Am. Heart J. 51, 1009-1013 (1883). Dies stellt eine grobe Abschätzung der Infarktgröße bereit und gewährleistet, dass große und kleine Infarkte in den ligierten, mit CHF oder CHF-Antagonist und Vehikel behandelten Ratten nicht unterschiedlich verteilt sind. Die Bestätigung erfolgt durch präzise Messung der Infarktgröße.
3. CHF- oder CHF-Antagonisten-Verabreichung
Vier Wochen nach dem chirurgischen Eingriff wird CHF oder CHF-Antagonist (10 μg/kg bis 10 mg/kg zweimal am Tag für 15 Tage) oder Salzlösungsvehikel subkutan in ligierte Ratten sowie scheinbehandelte Kontrollen injiziert. Das Körpergewicht wird zweimal die Woche während der Behandlung gemessen. CHF oder CHF-Antagonist wird in Salzlösung oder Wasser als Vehikel verabreicht.
4. Katheterung
Nach 13-tägiger Behandlung mit CHF, CHF-Antagonist oder Vehikel wurden die Ratten mit Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg, intraperitoneal) anästhesiert. Ein Katheter (mit PE 50 fusioniertes PE 10), gefüllt mit Heparin-Salzlösung (50/U/ml), wird in die Bauchaorta durch die rechte Femoralarterie zur Messung von Arteriendruck und Herzfrequenz implantiert. Ein zweiter Katheter (PE 50) wird in das rechte Atrium durch die rechte Drosselvene zur Messung des rechten Arteriendrucks und zur Injektion von Salzlösung implantiert. Zur Messung von rechtem Atrium-Druck und Kontraktilität (dP/dt) wird ein dritter Katheter (PE 50) in die linke Herzkammer durch die rechte Karotis implantiert. Zur Messung des Herzminutenvolumens durch ein Thermodilutionsverfahren wird ein Thermistor-Katheter (Lyons Medical Instrument Co., Sylmar, CA) in den Aortenbogen eingeführt. Die Katheter werden auf der Rückseite des Nackens mithilfe eines subkutan durchgeführten Edelstahldrahts nach außen verlagert. Nach der Katheterimplantation werden alle Ratten einzeln gehalten.
5. Hämodynamische Messungen
Einen Tag nach der Katheterung wird der Thermistor-Katheter in einem Mikrocomputersystem (Lyons Medical Instrument Co.) für die Ermittlung des Herzminutenvolumens ausgewertet, und die anderen drei Katheter werden an einen mit einem Polygraphen (Grass Modell 7, Grass Instruments, Quincy, MA) gekoppelten Druckumwandler (Modell CP-10, Century technology Company, Inglewood, CA) angeschlossen. Mittlerer Arteriendruck (MAP), systolischer Arteriendruck (SAP), Herzfrequenz (HR), rechter Atriumsdruck (RAP), linker systolischer Herzkammerdruck (LVSP), linker mittlerer Herzkammerdruck (LVMP), linker enddiastolischer Herzkammerdruck (LVEDP) und linkes Herzkammermaximum (dP/dt) werden in bei Bewusstsein befindlichen, nicht eingeschränkten Ratten gemessen.
Zur Messung des Herzminutenvolumens werden 0,1 ml isotonische Salzlösung bei Raumtemperatur als Bolus über den Drosselvenenkatheter injiziert. Die Thermodilutionskurve wird mittels VR-16-Simultrace-Schreibern (Honeywell Co., NY) aufgezeichnet, und das Herzminutenvolumen (CO) wird durch den Mikrocomputer in digitaler Form erhalten. Schlagvolumen (SV)=CO/HR; Herzindex (CI)=CO/BW; systemischer Gefäßwiderstand (SVR)=MAP/CI.
Nach der Messung dieser hämodynamischer Parameter wird 1 ml Blut über den Arterienkatheter abgenommen. Serum wird abgetrennt und bei –70 °C zur Messung von CHF-Konzentrationen oder verschiedener biochemischer Parameter je nach Wunsch gelagert.
Nach Beendigung der Experimente werden die Ratten mit Pentobarbital-Natrium (60 mg/kg) anästhesiert und das Herz mit intraatraler Injektion von KCl (1 M) in der Diastole angehalten. Das Herz wird entfernt und das Atrium und die großen Gefäße aus der Herzkammer geschnitten. Die Herzkammer wird gewogen und in 10 % gepuffertem Formalin fixiert.
Alle experimentellen Verfahren werden vom „Institutional Animal Care and Use Committee" von Genentech, Inc., vor Beginn der Studie genehmigt.
6. Messungen der Infarktgröße
Die rechte freie Herzkammerwand wird von der linken Herzkammer getrennt. Die linke Herzkammer wird in vier quer verlaufende Scheiben von der Spitze zur Basis zerschnitten. Es werden 5 μm dicke Schnitte angefertigt und mit Massonschem Trichromfarbstoff gefärbt und montiert. Die endokardialen und epikardialen Peripherien der linken Infarkt- und Nicht-Infarkt-Herzkammer werden mit einem Planimeter „Digital Image Analyzer" ermittelt. Die Infarkt-Peripherie und die linke Herzkammer-Peripherie aller vier Schnitte werden gesondert für die epikardialen und endokardialen Oberflächen aufsummiert und die Summen als Verhältnis von Infarkt-Peripherie zur linken Herzkammer-Peripherie für jede Oberfläche ausgedrückt. Diese beiden Verhältnisse werden dann gemittelt und als prozentueller Anteil für Infarktgröße ausgedrückt.
7. Statistische Analyse
Ergebnisse werden als Mittelwerte +/- SEM angegeben. Two-way- und One-way-Varianzanalyse (ANOVA) werden durchgeführt, um Unterschiede der Parameter unter den Gruppen festzustellen. Signifikante Unterschiede werden dann einer Post-Hoc-Analyse unter Anwendung des Newman-Keuls-Verfahrens unterzogen.
p < 0,05 wird als signifikant erachtet.
8. Ergebnisse
Es wird erwartet, dass das mittlere Körpergewicht vor und nach Behandlung mit CHF oder CHF-Antagonist oder Vehikel sich unter den Versuchsgruppen nicht unter scheidet. Es wird erwartet, dass sich die Infarktgröße bei ligierten Ratten zwischen der Vehikel-behandelten Gruppe und der CHF- oder CHF-Antagonisten-behandelten Gruppe nicht unterscheidet.
Es wird erwartet, dass die Verabreichung von CHF oder CHF-Antagonist an die ligierten Ratten in den oben dargelegten Dosen in einer verbesserten Herzhypertrophie durch Erhöhen der Herzkammerkontraktilität und Verminderung des peripheren Gefäßwiderstands im Vergleich zu der/dem bei den Vehikel-behandelten Schein- und ligierten Rattenkontrollen beobachteten resultiert. Dieses erwartete Ergebnis würde beweisen, dass die Verabreichung von CHF oder CHF-Antagonist die Herzfunktion bei kongestiver Herzinsuffizienz verbessert. Bei scheinbehandelten Ratten wird jedoch nicht erwartet, dass die Verabreichung von CHF oder CHF-Antagonist in dieser Dosis die Herzfunktion signifikant verändert, mit der möglichen Ausnahme einer leichten Verminderung von Arteriendruck und peripherem Gefäßwiderstand.
Es kann vernünftigerweise erwartet werden, dass die Ratten-Daten hierin auf Pferde, Rinder, Menschen und andere Säugetiere extrapoliert werden können, wobei um das Körpergewicht des Säugetiers gemäß anerkannter veterinärer und klinischer Verfahren korrigiert wird. Unter Anwendung von Standardprotokollen und Verfahren wird der Veterinär oder Kliniker in der Lage sein, Dosen, Zeitablauf und Art der Verabreichung von CHF oder eines CHF-Antagonisten abzustimmen, um maximale Wirkungen im gewünschten zu behandelnden Säugetier zu erzielen. Es wird angenommen, dass Menschen ebenfalls auf diese Weise reagieren.
BEISPIEL III
Vorgeschlagene klinische Behandlung von dilatierter Kardiomyopathie
A. Eingriff
Patienten-Selbstverabreichung von CHF oder CHF-Antagonist in einer Anfangsdosis von 10-150 μg/kg/Tag wird vorgeschlagen. Die Dosis wird üblicherweise bei nachtei ligen Wirkungen nach unten angepasst. Falls keine nutzbringenden Wirkungen und keine einschränkenden Wirkungen zum Zeitpunkt der neuerlichen Evaluierung festgestellt werden, wird die Dosis üblicherweise nach oben angepasst. Die Dosierungen gleichzeitiger Medikation (z.B. Captopril als ACE-Inhibitor und Diuretika) werden normalerweise nach Ermessen des Arztes der Studie angepasst. Nachdem die maximale Dosis für 8 Wochen verabreicht worden ist, wird die Verabreichung von CHF oder CHF-Antagonist gestoppt, und es wird eine neuerliche Evaluierung nach einem ähnlichen Zeitraum ohne Behandlung (oder unter Behandlung mit einem Placebo) durchgeführt.
B. Aufnahmekriterien
Patienten werden für die Studie in Betracht gezogen, wenn sie die folgenden Kriterien erfüllen:

– Dilatierte Kardiomyopathie (DCM). Idiopathische DCM oder ischämische DCM ohne getrennte Bereiche von Akinese/Dyskinese der linken Herzkammer (LV) am Kontrast-Ventrikulogramm oder 2D-Echokardiogramm. Anzeichen von beeinträchtigter systolischer Funktion, umfassend entweder enddiastolische LV-Dimension (EDD) > 3,2 cm/m² BSA oder EDV > 82 ml/m² am 2D-Echokardiogramm, teilweise LV-Verkürzung < 28 % am Echokardiogramm, oder Auswurffraktion (mittels Kontrast-Ventrikulographie oder Radionuklid-Angiographie) < 0,49.
– Symptome. „New York Heart Association" der Klasse III oder Spitzenleistungs-VO₂ <16 ml/kg/min (angepasst ans Alter), stabil für zumindest ein Monat auf Digoxin, Diuretika und Vasodilatoren (ACE-Inhibitoren).
– Gleichzeitige ACE-Inhibitor-Therapie.
– Adäquate Echokardiographie-„Fenster", um die Feststellung von Volumen und Masse der linken Herzkammer zu ermöglichen.
– Fähigkeit zur Selbstverabreichung von CHF oder CHF-Antagonisten gemäß dem Dosierungsschema und zur verlässlichen Rückkehr für Nachbewertungen.
– Einverständnis des Patienten oder des Primärarztes des Patienten zur Teilnahme.
– Fehlen von Ausschlusskriterien.

C. Ausschlusskriterien
Patienten werden üblicherweise aus folgenden Gründen von der Betrachtung ausgeschlossen:

– Dilatierte Kardiomyopathie aufgrund von Herzklappenerkrankung (operierbar oder nicht), speziell behandelbaren Krankheitsursachen (einschließlich Alkohol, falls eine Abstinenz nicht versucht worden ist) oder operierbarer Koronarerkrankung.
– Körperliche Betätigung eingeschränkt durch Brustschmerzen oder obstruktive periphere Gefäßerkrankung.
– Chronische obstruktive Lungenerkrankung.
– Diabetes mellitus oder beeinträchtigte Glucosetoleranz.
– Karpaltunnelsyndrom-Anamnese oder Anzeichen von positivem Hoffmann-Tinel-Zeichen bei Untersuchung.
– Nierensteinanamnese.
– Symptomatische Osteoarthritis.
– Unfähigkeit zur Zustimmung oder Teilnahme an fortlaufender Fahrradergometrie mit invasiver hämodynamischer Beobachtung (wie unten beschrieben).
– Aktive Malignität

D. Patientenbewertung

1) Hauptbewertungspunkte: Basislinie; nach dem Maximum Aufrecherhaltung einer stabilen CHF- oder CHF-Antagonist-Dosis für 8 Wochen; nach gleichem Zeitraum nach Absetzen des Wirkstoffs.
– Es wird erwartet, das Patienten für zwei bis drei Tage bei Beginn der aktiven Behandlung im Spital verbleiben mit täglichen Messungen von Köpergewicht und Labordaten, einschließlich Elektrolyten, Phosphor, BUN, Creatinin und Glucose. Anschließend werden sie üblicherweise in der Abteilung „Clinical Research Center" täglich für zwei oder drei weitere Tage beobachtet.
i. Ärztliche Untersuchung
ii. „Symptom Point Score" (Kelly et al., Amer. Heart J. 119, 1111 (1990)
iii. Labordaten: CBC; Elektrolyte (einschließlich Mg²⁺ und Ca²⁺); BUN; Creatinin; Phosphor; Fasten-Glucose- und Lipidprofile (Gesamtcholesterin, HDL-C, LDL-C, Triglyceride); Lebertunktionstests (AST, ALT, alkalische Phosphatase, Gesamt-Bilirubin); Gesamtprotein; Albumin; Harnsäure; und CHF.
iv. 2D-, M-Modus- und Doppler-Echokardiographie, einschließlich: diastolische und systolische Ausdehnungen auf Papillarmuskelebene; Auswurffraktion-Abschätzung durch Flächenplanimetrie aus apikalen 2-Kammer- und 4-Kammer-Ansichten, geschätzte systolische und diastolische Volumina mittels Simpson-Regel-Verfahren und geschätzte linke Herzkammermasse; Doppler-Bewertung des Mitralklappen-Zulaufprofils (IVRT, Peak E, Peak A, Verzögerungszeit, A-Wellen-Dauer) und Lungenvenen-Durchflussprofils (systolischer Strömungsquerschnitt, diastolischer Strömungsquerschnitt, A-Umkehrdauer und Geschwindigkeit).
v. Ruhe- und Last-Hämodynamik und gemessener Sauerstoffverbrauch unter Anwendung von Fahrradergometrie mit perkutan eingeführten Lungenarterien- und Arterien-Kathetern. Das empfundene Belastungsniveau würde man an der Borg-Skale bewerten, und Messungen des systolischen, diastolischen und mittleren Lungenarteriendrucks sowie der Arteriendrücke und des Lungenkapillarverschlussdrucks werden üblicherweise bei jeder Erhöhung der Arbeitslast zusammen mit dem Arterien- und venösen Mischblut-Sauerstoffgehalt zur Berechnung des Herzminutenvolumens gemessen.
vi. Bewertung von Körperfett und fettfreier Körpermasse sowie Skelettmuskelkraft und Ausdauer.
2) Zwischenbeurteilungspunkte: wöchentlich
i. Ärztliche Untersuchung.
ii. „Symptom-Point-Score".
iii. Labordaten: Elektrolyte, BUN, Creatinin, Phosphor, Fasten-Glucose, Somatomedin-C und CHF.

E. Möglicher Nutzen

1) Verbessertes Wohlbefinden.
2) Erhöhte Belastungstoleranz.
3) Erhöhte Muskelkraft und fettfreie Körpermasse.
4) Verminderter systemischer Gefäßwiderstand.
5) Verstärkte Herzleistung.
6) Verstärkte kompensatorische Myokardhypertrophie.

BEISPIEL IV
Testen auf neurotrophe In-vitro-Aktivität
Ein für die neurotrophe Aktivität von Ziliarganglien verwendeter Test wurde wie in Leung, Neuron 8, 1045-1053 (1992), beschrieben durchgeführt. Zusammenfassend wurden Ziliarganglien aus E7-E8-Hühnerembryos seziert und in Trypsin-EDTA (Gibco 15400-013), zehnfach verdünnt in phosphatgepufferter Salzlösung für 15 Minuten bei 37 °C aufgetrennt. Die Ganglien wurden mit drei Waschvorgängen mit Wachstumsmedium (D-MEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % Fötalkälberserum, 1,5 mM Glutamin, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) vom Trypsin befreit und dann vorsichtig in 1 ml Wachstumsmedium zu einer Einzelzellsuspension zerrieben. Neuronen wurden durch Ausplattieren dieses Zellgemischs in 5 ml Wachstumsmedium auf eine 100-mm-Gewebekulturplatte für 4 Stunden bei 37 °C in einem Gewebekulturinkubator angereichert. Während dieser Zeit blieben vorzugsweise nicht-neuronale Zellen an der Platte kleben, und Neuronen wurden am Ende der Inkubation vorsichtig freigewaschen.
Die angereicherten Neuronen wurden dann in eine vorher mit Collagen beschichtete 96-Well-Platte ausplattiert. In jeden Well wurden 1.000 bis 2.000 Zellen in ein Endvolumen von 100 bis 250 μl mit Verdünnungen des konditionierten Mediums aus den pchf.781-transfizierten 293-Zellen aus Beispiel 1 ausplattiert. Die Zellen wurden außerdem mit dem transfizierten 293-konditionierten Medium als Kontrolle und mit einem CNTF-Standard als Vergleich ausplattiert. Nach einer Inkubation für 2-4 Tage bei 37 °C wurde die Anzahl lebender Zellen durch Färben lebender Zellen unter Verwendung des Vitalfarbstoffs Metallothionin (MTT) festgestellt. Ein Fünftel des Volumens von 5 mg/ml MTT (Sigma M2128) wurden zu den Wells zugegeben. Nach einer Inkubation für 2-4 Stunden bei 37 °C wurden lebende Zellen (gefüllt mit einem tiefvioletten Präzipitat) mittels Phasenkontrastmikroskopie bei 100facher Vergrößerung gezählt.
Die Ergebnisse des Tests sind in 4 dargestellt. Es ist erkennbar, dass die pchf.781-Transfektion (Dreiecke) das Überleben der lebenden (mittels Zellzahlzählung gemessenen) Neuronen bei Erhöhung des Testvolumenanteils an transfiziertem 293-konditioniertem Medium steigerte. Dieses Ergebnis ist ähnlich dem Muster für den CNTF-Standard (Kreise) und steht im Gegensatz zur Kontroll-Transfektion (Quadrate), die keine Steigerung des Überlebens als Funktion des erhöhten Testvolumenanteils an konditioniertem Medium zeigte. Dies weist darauf hin, dass CHF als neurotrophes Mittel dienlich ist und eine ähnliche Wirkung aufweist, die mit CNTF beobachtet wird.
BEISPIEL V
Eine Quelle von mRNA, die für menschliches CHF (auch als menschliches Cardiotrophin-1 (CT-1) bekannt) kodiert, wurde durch Screening von Poly(A)⁺-RNA aus mehreren adulten Geweben mit einer Sonde aus den Maus-CHF-cDNA-Klonen identifiziert. Herz, Skelettmuskel, Darm, Eierstock und Prostata zeigten eine Bande bei 1,8 kb bei Blot-Hybridisierung mit einer 180-bp-Maus-CHF-Sonde (die sich von 19 bp 5' des Initiations-ATG bis zur Aminosäure 50 erstreckt) in 20 % Formamid, 5 × SSC bei 42 °C mit einem abschließenden Waschvorgang bei 0,25 × SSC bei 52 °C. Für menschliches CT-1 kodierende Klone wurden durch Screenen einer menschlichen Herz-cDNA-Bibliothek (Clontech) mit derselben Sonde und unter denselben Bedingungen (abschließender Waschvorgang bei 55 °C) isoliert.
Elf Klone wurden aus 1 Million gescreenten isoliert. Die EcoRI-Inserte mehrerer der Klone wurden in Plasmidvektoren subkloniert und ihre DNA-Sequenzen ermittelt.
Die DNA-Sequenz aus Klon h5 (Seq.-ID Nr. 6 und 7 für die Sinn- bzw. Antisense-Stränge) ist in Fig. gezeigt und umfasst die gesamte kodierende Region. Klon h5 (pBSSK+.hu.CT1.h5) wurde am 26. Juli 1994 bei der American Type Culture Collection als ATCC-Nr. 75.841 hinterlegt. Die DNA-Sequenz eines anderen als h6 bezeichneten Klons stimmt mit der von Klon h5 im Bereich der Überlappung überein. Klon h6 beginnt bei Base 47, von Klon h5 und erstreckt sich 3' vom Klon h5 für wei tere 521 Basen. Die kodierte Proteinsequenz von menschlichem CT-1 (Seq.-ID Nr. 8) ist zu 79 % identisch mit der Maus-CHF-Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), wie aus 6 eindeutig erkennbar ist, worin Erstere als „humct1" und Letztere als „chf.781" bezeichnet wird.
Um zu zeigen, dass vom Klon h5 kodiertes menschliches CT-1 biologisch aktiv ist, wurde das EcoRI-Fragment in den Säugetier-Expressionsvektor pRK5 ( EP 307.247 ) an der einzigartigen EcoRI-Stelle kloniert, um das Plasmid pRK5.hu.CT1 zu liefern. Dieses Plasmid wurde in menschliche 293-Zellen transfiziert, und die Zellen wurden für 3-4 Tage in serumfreiem Medium gehalten. Dieses Medium wurde dann auf Herzmyozytenhypertrophie wie oben für Maus-CHF beschrieben getestet. Das transfizierte 293-konditionierte Medium war in diesem Test eindeutig aktiv (Hypertrophiebewertung 5,5 bei einer Verdünnung von 1:20).
Hinterlegung von Material
Das folgende Plasmid ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt worden:
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC §122 und den dazugehörigen Regeln des Patentbevollmächtigten berechtigt ist (einschließlich 37 CFR § 1,14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638).
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass das Plasmid, falls eine Kultur des hinterlegten Plasmids bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen absterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch ein anderes desselben Plasmids ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Plasmids ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
Die vorangehende niedergeschriebene Patentschrift wird als ausreichend erachtet, einem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung in die Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte Konstrukt in seinen Ansprüchen nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht ist und jegliche funktionell gleichwertigen Konstrukte im Schutzumfang dieser Erfindung liegen. Die Hinterlegung von Material hierin stellt kein Zugeständnis dar, dass die hierin enthaltene niedergeschriebene Beschreibung unzulänglich ist, um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsart davon, zu ermöglichen, noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die sie verkörpert. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Herzhypertrophiefaktor-(CHF-)Polypeptid, ausschließlich jenes von Ratten, das zumindest 75 % Sequenzidentität mit der in 1 gezeigten translatierten Sequenz aufweist und eine biologische Aktivität aus hypertropher, inotroper, antiarrhythmischer oder neurotropher Aktivität eines nativen CHF-Polypeptids aufweist.
CHF-Polypeptid nach Anspruch 1, das die in 1 gezeigte translatierte Sequenz aufweist.
CHF-Polypeptid nach Anspruch 1, das reifer menschlicher CHF mit der in 5 gezeigten translatierten Sequenz ist.
Isolierter Antikörper, der zu Bindung des CHF-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 in der Lage ist.
Antikörper nach Anspruch 4, umfassend einen monoklonalen, chimären, humanisierten oder bispezifischen Antikörper oder ein Antigenbindungsfragment davon.
Hybridomzelllinie, die den Antikörper nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 produziert.
Verfahren zur Detektion von CHF, umfassend das Kontaktieren des Antikörpers nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 mit einer Probe oder Zelle, von der angenommen wird, dass sie CHF enthält, und das Nachweisen, ob Bindung aufgetreten ist.
Verfahren zur Reinigung von CHF-Molekülen, umfassend das Kontaktieren einer CHF-Quelle, die die zu reinigenden CHF-Moleküle enthält, mit dem Antikörper nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, der an einen Träger immobilisiert ist, unter Bedingungen, unter denen die zu reinigenden CHF-Moleküle selektiv an dem immobilisierten Antikörper adsorbiert werden, das Waschen des Trägers, um nicht adsorbiertes Material zu entfernen, und das Eluieren der zu reinigenden Moleküle vom Antikörper, an den sie adsorbiert sind, mit einem Elutionspuffer.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für den CHF nach Anspruch 1, 2 oder 3 kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, umfassend die in 1 gezeigte Nucleinsäuresequenz des offenen Leserasters.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, umfassend die in 5 gezeigte Nucleinsäuresequenz des offenen Leserasters.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, ferner umfassend einen Promotor, der operabel an das Nucleinsäuremolekül gebunden ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, das DNA ist und die in 1 gezeigte translatierte DNA-Sequenz umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, das DNA ist und die in 5 gezeigte translatierte DNA-Sequenz umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, das markiert ist.
Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9.
Expressionsvektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, operabel an Kontrollsequenzen gebunden, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9.
Verfahren zur Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das für CHF kodiert, um die Produktion von CHF zu bewirken, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 18.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der CHF aus der Wirtszelle gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 19, worin der CHF aus dem Wirtszellenkulturmedium gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der ein CHF-Nucleinsäuremolekül umfasst.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines CHF-Nucleinsäuremoleküls in einer Testprobe, umfassend das Hybridisieren des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 9 an eine Testproben-Nucleinsäure und das Bestimmen der Gegenwart von CHF-Nucleinsäure.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäuren-Testprobe, umfassend das Primen einer Nucleinsäure-Polymerasekettenreaktion in der Testprobe mit dem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9.
Verfahren zum Testen einer Testprobe auf hypertrophe Aktivität, umfassend: (a) das Ausplattieren einer Suspension von Myozyten bei einer Zelldichte von etwa 7,5 × 10⁴ Zellen pro ml in D-MEM/F-12-Medium, das Insulin, Transferrin und Aprotinin umfasst, in 96-Well-Platten; (b) das Kultivieren der Zellen; (c) das Zusetzen der Testprobe zu den kultivierten Zellen; (d) das Kultivieren der Zellen mit der Testprobe; und (e) das Messen auf Hypertrophie.
Verwendung eines CHF-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neurologischen Erkrankung, von Herzinsuffizienz oder einer arrhythmischen oder inotropen Störung.
Verwendung nach Anspruch 26, worin das Medikament zur Verabreichung mit einem ACE-Inhibitor, mit einem anderen myokardiotrophen, anti-arrhythmischen oder inotropen Faktor oder mit einem neurotrophen Molekül zur Behandlung der Erkrankung konzipiert ist.