DE69932510T2

DE69932510T2 - Vaskularisierungsinhibitoren

Info

Publication number: DE69932510T2
Application number: DE69932510T
Authority: DE
Inventors: Tadamitsu Kishimoto; Takashi Nagasawa; Kazunobu Tachibana
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-23
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2019-03-24
Also published as: EP2311495A1; EP1072273A1; AU2855399A; US20130236889A1; JP4974408B2; EP1745797A3; US8119126B2; ES2268854T3; EP2311495B1; ES2525669T3; US20040209837A1; EP1072273A4; WO1999048528A1; EP1745797A2; JP2009256359A; DE69932510D1; EP1072273B1; ATE333896T1; EP2108377A1; JP5285513B2

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines CXCR4-Inhibitors als Wirkstoff als neuer Vaskularisierungsinhibitor, ein Mittel gegen festen Krebs und ein Therapeutikum für eine Erkrankung, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung ausgelöst wird.
Stand der Technik
In der Vergangenheit war es bekannt, dass, wenn Tumorzellen aus den Blutgefäßen austreten, die vaskulären Endothelzellen aufbrechen. Es war auch bekannt, dass die Neovaskularisierung intensiv an einer Proliferation und Migration von Krebs beteiligt ist und dass Tumorzellen eine Vielzahl von Neovaskularisierungsfaktoren erzeugen und freisetzen. Insbesondere wird die Neovaskularisierung als grundlegend für die Proliferation von festen Tumoren angesehen.
Daher hat eine Substanz, die die Neovaskularisierung inhibiert, das Potential, ein Antikrebsmittel zu sein, das mit einem neuen Wirkungsmechanismus ausgestattet ist. Aus diesem Grund wurden etliche Arten von Neovaskularisierungs-inhibitorischen Substanzen, wie z.B. Steroide und Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen, bereits für diese Verwendung getestet. ("Manual for Studies on Cancer Invasion and Metastasis", The Cancer Metastasis Society Hrsg., Kinhodo Publisher, 159-182 (1994)). Es besteht jedoch ein starker Bedarf, dass neue Neovaskularisierungs-inhibitorischer Substanzen mit einer Wirkung einer effektiveren Inhibition der Proliferation und Metastase von Krebs entdeckt wurden.
Offenbarung der Erfindung
Diese Erfindung stellt die Verwendung einer Substanz bereit, die die Wirkung aufgrund von CXCR4 inhibiert bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Vaskularisierung, eines Mittels gegen festen Krebs oder eines Therapeutikums für eine Erkrankung, die pathologisch durch Neovaskularisierung ausgelöst wird, jeweils umfassend einen Inhibitor eines Chemokin-Rezeptors mit einer effektiven Inhibition der Proliferation, Invasion und Metastase von Krebs, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Substanz, die die Bindung zwischen SDF-1 und CXCR4 inhibiert; (2) einer Substanz, die die Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen inhibiert; (3) einer Substanz, die die Expression von CXCR4 inhibiert und (4) einer Substanz, die die Expression von SDF-1 inhibiert.
Spezifisch verfolgten die gegenwärtigen Erfinder intensive Untersuchungen, um die oben identifizierten Probleme zu lösen, und im Ergebnis haben sie entdeckt, dass, wenn Knockout-Mäuse, denen der Prä-B-Zellwachstum-stimulierende Faktor/Stromazellen-ableitete Faktor (hiernach bezeichnet als "PBSF/SDF-1" oder "SDF-1") fehlte, wobei es sich um ein CXC-Chemokin handelt, wie auch CXCR4, wobei es sich um einen Chemokinrezeptor handelt, erzeugt werden, die Vaskularisierung bei den Mäusen unterdrückt ist, und insbesondere die Unterdrückung von CXCR4 führt zu einer Unterdrückung der Vaskularisierung. Eine solche Feststellung bedeutet, dass der Chemokinrezeptor CXCR4 für die Neovaskularisierung essentiell ist.
Die Neovaskularisierung von lebenden Geweben tritt allgemein durch eine Neu-Modellierung eines vorher existierenden vaskulären Systems auf, wenn sie wachsen, um ihre spezifischen Funktionen während der Entwicklung auszuüben. Analysen der mutierten Mäuse haben bestimmt, dass die für die frühen vaskulären Systeme nötigen Moleküle im wesentlichen Rezeptortyrosinkinase und ihre Liganden sind. (W. Risau, Nature 386, 671-674 (1997); J. Folkman & D'Amore, P. A. Cell 87, 1158-1155 (1996); und P. Lindahl et al., Science 277, 242-245 (1997)). Die für die Vaskularisierung während der Organogenese verantwortlichen Substanzen wurden jedoch noch nicht identifiziert, da die meisten dieser Mäuse während der früheren Gestation vor der Entwicklung ihrer Gewebe sterben.
Die Struktur des Chemokinrezeptors CXCR4 gemäß dieser Erfindung war bereits bekannt. (C.C. Bleul et al., Nature 382, 829-883 (1996); E. Oberlin et al., Nature 382, 888-835 (1996); und T. Nagasawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14726-14729 (1996)). CXCR4 ist ein Sieben-Transmembranüberbrückendes G-Protein-gekoppeltes Protein und ein Rezeptor für PBSF/SDF-1, wobei es sich um ein CXC-Chemokin handelt. Der vorher genannte Faktor soll vermutlich für die B-Zelllymphopoese verantwortlich sein, für die Knochenmarkmyelopoese und die Bildung des ventrikulären Septums des Herzens (T. Nagasawa et al., Nature 382, 685-688 (1996)).
CXCR4 wirkt auch als Co-Rezeptor für T-Zelllinien-tropischen HIV-1 (Y. Feng et al., Science 272, 872-877 (1996)). Es wurde weiterhin berichtet, dass CXCR4 in kultivierten Endothelzellen exprimiert wird (M. V. Volin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 46-53 (1998)).
Zusätzlich haben die gegenwärtigen Erfinder entdeckt, dass der oben erwähnte CXCR4 in sich entwickelnden vaskulären Endothelzellen exprimiert wird und dass Mäuse, denen CXCR4 oder der Ligand PBSF/SDF-1 fehlt, eine defekte Bildung der großen Blutgefäße zeigen, die dem Gastrointestinaltrakt zugeführt werden. Eine solche Feststellung bedeutet, dass die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Signalsysteme für die Bildung der Medianarteriovene (arteriovein) essentiell sind, die Nährmittel zum Gastrointestinaltrakt führt. Weiterhin haben die gegenwärtigen Erfinder festgestellt, dass Mäuse, denen CXCR4 fehlt, dazu neigen, in der Gebärmutter zu sterben, genau wie dies bei Mäusen beobachtet wird, denen PGSF/SDF-1 fehlt. Eine solche Feststellung legt nahe, dass CXCR4 der besonders kritische, primäre physiologische Rezeptor für PBSF/SDF-1 ist.
Basierend auf den vorstehenden Beobachtungen durch die gegenwärtigen Erfinder wurde betrachtet, dass Substanzen, die die Aktion aufgrund von CXCR4 inhibieren können, eine Vaskularisierung inhibieren könnten und so effektive Antikrebsmittel sein könnten, dass die Vaskularisierung für den Erhalt und die Vergrößerung von Krebsgeweben essentiell ist.
Es wurde außerdem betrachtet, dass Substanzen, die CXCR4 inhibieren können, Therapeutika für die Behandlung von Erkrankungen sein könnten, die eine Neovaskularisierung involvieren.
Es wurde weiter betrachtet, dass die Unterstützung der Wirkung aufgrund von CXCR4 die Vaskularisierung beschleunigt und so ein Heilmittel für eine Erkrankung sein kann, bei der die Vaskularisierung gewünscht ist.
Genauer gesagt und wie unten zusammengefasst, stellt diese Erfindung einen Vaskularisierungsinhibitor, ein Krebsmittel gegen festen Krebs oder ein Therapeutikum für eine Erkrankung bereit, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung ausgelöst wird, die jeweils als Wirkstoff eine Substanz umfassen, die die Wirkung aufgrund von CXCR4 inhibiert.
So stellt diese Erfindung die Verwendung eines CXCR4-Inhibitors als Wirkstoff als Vaskularisierungsinhibitor bereit.
Diese Erfindung stellt auch die Verwendung eines CXCR4-Inhibitors als Wirkstoff als ein Mittel gegen feste Krebsarten bereit.
Weiterhin stellt diese Erfindung die Verwendung eines CXCR4-Inhibitors als Wirkstoff als Therapeutikum für eine Erkrankung bereit, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung ausgelöst wird.
Da die Bildung der medianen oder großen Arteriovenen für den Erhalt und die Vergrößerung eines Krebsgewebes essentiell sind, das eine bestimmte Größe überschreitet, blockiert der Vaskularisierungsinhibitor dieser Erfindung das CXCR4 oder PBSF/SDF-1-Signalsystem und unterdrückt so den Erhalt und die Vergrößerung des Krebsgewebes.
Die durch diese Erfindung erhaltene Feststellung legt die Möglichkeit nahe, dass die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Signalsysteme zu der allgemeinen Vaskularisierung beitragen. Daher ist es bei Erkrankungen, bei denen eine bestimmte Krebsart oder Neovaskularisierung die hauptpathologische Ursache ist, wahrscheinlich, dass CXCR4 oder PBSF/SFD-1 intensiv an dem pathologischen Grund beteiligt sind; oder es besteht die Möglichkeit, dass diese Erkrankungen durch die Blockierung von CXCR4 oder PBSF/SDF-1 unterdrückt werden können, und zwar individuell oder zusammen mit anderen Molekülen.
In der gegenwärtigen Beschreibung und den Zeichnungen sind die Abkürzungen für Basen oder Aminosäuren diejenigen, die der IUPAC-IUB Commission on Biochemistry Nomenclature folgen oder diejenigen, die auf den Üblichen auf dem Gebiet basieren. Illustriert werden unten ihre Beispiele. Wenn Aminosäuren gemeint werden und es ihre optischen Isomere geben kann, repräsentieren sie die L-Formen, wenn dies nicht anders angegeben ist.

DNA:: Desoxyribonucleinsäure
cDNA:: komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
RNA:: Ribonucleinsäure
mRNA:: Boten-Ribonucleinsäure
G oder Gly:: Glycin
A oder Ala:: Alanin
V oder Val:: Valin
L oder Leu:: Leucin
I oder Ile:: Isoleucin
S oder Ser:: Serin
T oder Thr:: Threonin
C oder Cys:: Cystein
M oder Met:: Methionin
E oder Glu:: Glutaminsäure
D oder Asp:: Aspartinsäure
K oder Lys:: Lysin
R oder Arg:: Arginin
H oder His:: Histidin
F oder Phe:: Phenylalanin
Y oder Tyr:: Tyrosin
W oder Trp:: Tryptophan
P oder Pro:: Prolin
N oder Asn:: Asparagin
Q oder Gln:: Glutamin
BSA:: Rinderserumalbumin
FBS:: fötales Rinderserum
PBS:: Phosphatpuffer-Salzlösung
SDS:: Natriumdodecylsulfat

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Grafik, die eine Zielstrategie für das CXCR4-Gen darstellt. In der Figur werden das CXCR4-Wildtyp-Allel oben dargestellt, ein Zielvektor in der Mitte und ein vorhergesagtes mutiertes Allel unten. Die codierenden Bereiche der Gene sind durch schwarze Kästen angegeben. Leere Kästen zeigen die 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereiche. Punktierte Linien zeigen homologe Fragmente, die in dem Zielvektor verwendet werden. Sonde A ist eine externe Sonde für die Southern-Hybridisierung. Restriktionsstellen sind E (EcoRI), Sh (SphI) bzw. X (XhoI).
2A ist eine Fotografie, die die Southern-Blot-Analyse von Schwanz-DNAs vom Wildtyp (+/+) und heterozygoten mutierten (+/–)-Mäusen darstellt. Die EcoRI-EcoRI-Fragmente von dem 11,8-kb Wildtyp und dem 8,2-kb Zielallel, die durch Sonde A identifiziert wurden, sind in der Figur dargestellt.
2B ist eine Fotografie, die die RT-PCR-Amplifikationsanalyse der CXCR4-Expression darstellt. Gesamt-RNAs wurden aus E18.5 Wildtyp und homozygoten mutierten Embryos hergestellt und mit den CXCR4-spezifischen Primern amplifiziert. Die RT-PCR-Amplifikation verwendete G3PDH-mRNA, die universell exprimiert wurde als Kontrolle für die Gegenwart irgendeiner amplifizierbaren RNA.
3 ist eine Fotografie, die Defekte der Gastrointestinalblutgefäße in Mesenterium und Mitteldarm-Schleifenbereichen bei einem Wildtyp CXCR4^–/–-Embryo an E13.5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und Verdauungstrakts mit anti-PECAM-1-Antikörper ergeben. Der Pfeil zeigt eine große Verzweigung der Arteria mesenterica superior oder der Vena mesenterica superior an, die zu dem Dünndarm im Wildtyp-Mesenterium führen. "du" repräsentiert das Duodenum; "p" den proximalen Teil der Mitteldarmschleife und "dm" den distalen Teil der mittleren Schleife.
4 ist eine Fotografie, die Defekte der gastrointestinalen Blutgefäße in Querschnitten des Mesenteriums in dem Wildtyp CXCR4^–/–-Embryo an E13.5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und des Verdauungstrakts mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben. "a" bedeutet Arterie und "v" Vene.
5 ist eine Fotografie, die Defekte von Gastrointestinalblutgefäßen im Jejunum in einem Wildtyp-CXCR4^–/–-Embryo an E17.5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und des Verdauungstrakts mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben. Der Pfeil zeigt eine große Verzweigung der Arteria mesenterica superior oder der Vena mesenterica superior an, die zu dem Dünndarm führen, im Wildtyp-Mesenterium.
6 ist eine Fotografie, die Defekte von gastrointestinalen Blutgefäßen im distaleren Teil des Jejunum in dem Wildtyp-CXCR4^–/–-Embryo an E17.5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und des Verdauungstrakts mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben. Der Pfeil zeigt eine große Verzweigung der Arteria mesenterica superior oder Vena mesenterica superior, die zum Dünndarm führen, im Wildtyp-Mesenterium.
7 ist eine Fotografie, die Defekte von Gastrointestinalblutgefäßen in dem Mesenterium und Mitteldarm-Schleifenregionen an einem mutierten CXCR4^–/–-Embryo an E13.5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und Verdauungstrakts von Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben. "p" bedeutet den proximalen Teil der Mitteldarmschleife und "dm" den distalen Teil der Mitteldarmschleife.
8 ist eine Fotografie, die Defekte von gastrointestinalen Blutgefäßen an Querschnitten des Mesenteriums in dem mutierten CXCR4^–/–-Embryo an E13.5. darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und Verdauungstrakts des Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben.
9 ist eine Fotografie, die Defekte der gastrointestinalen Blutgefäße im Jejunum in einem mutierten CXCR4^–/–-Embryo an E17.5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und des Verdauungstrakts des Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben.
10 ist eine Fotografie, die Defekte von gastrointestinalen Blutgefäßen in einem distaleren Teil des Jejunums in dem mutierten CXCR4^–/–-Embryo an 17,5 darstellt, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und Verdauungstrakts des Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben.
11 ist eine Fotografie, die Defekte von gastrointestinalen Blutgefäßen darstellt, die eine hämorrhagische Läsion des nicht-gefärbten Verdauungstrakts einer mutierten Maus sind, einem E16,5-mutierten CXCR4^–/–-Embryo, die sich aus einer Immunhistofärbung des Mesenteriums und Verdauungstrakts des Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper ergeben.
12A ist eine Fotografie, die das Ergebnis der Immunhistofärbung des Magens eines E13.5-Wildtyps mit dem anti-PECAM-1-Antikörper darstellt. Der Pfeil zeigt das große Gefäß, das nur beim Wildtyp gesehen wird.
12B ist eine Fotografie, die das Ergebnis der Immunhistofärbung des Magens eines E13.5-Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper darstellt.
12C ist eine Fotografie, die das Ergebnis der Immunhistofärbung des Magens eines E15,5-Wildtyps mit dem anti-PECAM-1-Antikörper darstellt. Der Einsatz in der Fotografie zeigt Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Sektionen von großen Gefäßen in der Wand von einem gefärbten Magen an E15.5. Der Pfeil zeigt ein großes Gefäß an, das nur im Wildtyp beobachtet wird.
12D ist eine Fotografie, die das Ergebnis der Immunhistofärbung des Magens eines E15.5-Mutanten mit dem anti-PECAM-1-Antikörper darstellt.
13A ist eine Fotografie, die die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Expression im Gastrointestinaltraktgewebe durch in situ-Hybridisierung darstellt. Serielle Sektionen des Wildtyp-Mesenteriums, die mit der Mitteldarmschleife verbunden sind, wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. "m" bedeutet Mesenterium, "i" Verdauungstrakt, "a" Arteria mesenterica superior und "v" Vena mesenterica superior.
13B ist eine Fotografie, die die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Expression in einem Gastrointestinaltraktgewebe durch in situ-Hybridisierung darstellt. Die Hybridisierung wurde mit einer CXCR4-spezifischen Sonde durchgeführt. Die Pfeile zeigen die gefärbten Endothelzellen der Mesenteriumsgefäße.
13C ist eine Fotografie, die die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Expression in einem Gastrointestinaltraktgewebe durch in situ-Hybridisierung darstellt. Die Hybridisierung wurde mit einer PBSF/SDF-1-spezifischen Sonde durchgeführt. PBSF/SDF-1 wurde in Mesenchymzellen exprimiert, die die Endothelzellen im Mesenterium umgeben.
13D ist eine Fotografie, die die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Expression im Gastrointestinaltraktgewebe durch in situ-Hybridisierung darstellt. Serielle Sektionen des Wildtyp-Mesenteriums, die mit der Mitteldarmschleife verbunden sind, wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. 13D ist eine Vergrößerung von Blutgefäßen, die sich aus der Arteria mesenterica superior erheben, wie dargestellt in 13A, wo eine starke Expression von CXCR4 in den vaskulären Endothelzellen beobachtet wurde.
13E ist eine Fotografie, die die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Expression im Gastrointestinaltraktgewebe durch in situ-Hybridisierung darstellt. Die Hybridisierung wurde mit der CXCR4-spezifischen Sonde durchgeführt. 13E ist eine Vergrößerung von Blutgefäßen, die sich aus der Arteria mesenterica superior, wie dargestellt in 13B, erheben, wo eine starke Expression von CXCR4 in den vaskulären Endothelzellen beobachtet wurde. Der Pfeil zeigt die gefärbten Endothelzellen der Mesenteriumsgefäße.
13F ist eine Fotografie, die die CXCR4 und PBSF/SDF-1-Expression in einem Gastrointestinaltraktgewebe durch in situ-Hybridisierung darstellt. Es handelt sich um eine Sektion eines E18.5-Wildtyp-embryonalen Knochenmarks und zeigt die CXCR4-Expression in hämatopoetischen Zellen, jedoch keine Expression in spindelförmigen Stromazellen.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Der Vaskularisierungsinhibitor, das Krebsmittel gegen festen Krebs oder das Therapeutikum für eine Erkrankung, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung gemäß dieser Erfindung ausgelöst wird, umfasst als Wirkstoff eine Substanz, die die Wirkung von CXCR4 inhibiert, wobei es sich um einen Chemokinrezeptor handelt.
Die Aminosäuresequenz von CXCR4 war bereits bekannt. Spezifisch sind die Aminosäuresequenz von menschlichem CXCR4 und die Aminosäuresequenz von murinem CXCR4 in SEQ ID NO: 1 bzw. 3 dargestellt. Die Basensequenz von menschlichem CXCR4 und die Basensequenz von murinem CXCR4 sind in SEQ ID No: 2 (Basenpositionen 1-1056) bzw. SEQ ID NO: 4 (Basenpositionen 1-1077) dargestellt.
Außerdem war die Aminosäuresequenz von SDF-1, wobei es sich um einen an CXCR4 bindenden Liganden handelt, bereits bekannt. Es gibt zwei Arten von SDF-1, die sich in der Länge der Aminosäuresequenz unterscheiden, d.h. SDF-1-α und SDF-1-β. Spezifisch ist die Aminosäuresequenz vom menschlichem SDF-1-α in SEQ ID NO: 5 und die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 (Basenpositionen 474-740) dargestellt. Menschliches SDF-1-β (SEQ ID NO: 9) ist von menschlichem SDF-1-α durch Anhängung von vier Aminosäureresten, Arg Phe Lys Met, an den C-Terminus davon abgeleitet.
Die Aminosäuresequenz von murinem SDF-1-α ist in SEQ ID NO: 7 und die Basensequenz in SEQ ID NO: 8 (Basenpositionen 82-348) dargestellt. Murines SDF-1-β (SEQ ID NO: 10) ist von murinem SDF-1-α durch Anhängung von vier Aminosäureresten, Arg Leu Lys Met, an den C-Terminus davon abgeleitet. Für menschliche und murine SDF-1 ist die Sequenz von der ersten Aminosäure (Met) bis zur 21. Aminosäure (Gly) eine Signalsequenz.
CXC-Chemokine, die bis jetzt bekannt waren, beinhalten zusätzlich zu dem oben erwähnten PBSF/SDF-1 IL-8 (T. Yoshimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 9233-9237 (1987)), NAP-2 (A. Walz et al., Biochem. Biophys. Res. Comun., 159, 969-975 (1989)), NAP-4, GRO alpha (A. Richmondo et al., J. Cell. Biochem., 36, 185-198 (1988)), GRO beta (S. Haskill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 77732-7736 (1990)), GRO gamma (S. Haskill et al., ibid. (1990)), GCP-2 (P. Proost et al., J. Immunol., 150, 1000-1010 (1993)), ENA-78 (A. Wayz et al., J. Exp. Med., 174, 1355-1362 (1991)), PF-4 (T. F. Deuel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2256-2258 (1977)), und IP-10 (B. Dewald et al., Immunol. Lett., 32, 81-84 (1992)).
Spezifisch sind die Substanzen der vorliegenden Erfindung: (1) eine Substanz, basierend auf der Inhibition der Bindung selbst zwischen dem Liganden (SDF-1) und dem Rezeptor (CXCR4); (2) eine Substanz, basierend auf der Inhibition der Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen; (3) eine Substanz, die die Expression von CXCR4 selbst inhibiert; und (4) eine Substanz, die die Expression von SDF-1 selbst inhibiert.

(1) Für die Substanz, die die Bindung selbst zwischen SDF-1 und CXCR4 inhibiert, gibt es eine Substanz, die SDF-1 inhibiert und eine Substanz, die CXCR4 inhibiert.

Genauer gesagt ist die Substanz, die SDF-1 inhibiert, in eine Substanz klassifiziert, die CXCR4 in antagonistischem Wettstreit mit SDF-1 inhibiert und eine Substanz, die SDF-1 an einer Bindung an CXCR4 durch Bindung an SDF-1 inhibiert. Für die Substanz, die CXCR4 in antagonistischem Wettstreit mit SDF-1 inhibiert, werden konkret ein Protein erwähnt mit einer SDF-1-ähnlichen Struktur, ein Fusionsprotein des vorstehenden Proteins mit einem anderen Peptid oder Polypeptid oder ein Teilpeptid von SDF-1.
Für die Substanz, die SDF-1 an einer Bindung an CXCR4 durch Bindung an SDF-1 hindert, werden konkret ein anti-SDF-1-Antikörper, ein Fragment davon, das eine Bindungsaktivität besitzt, ein Fusionsprotein, das eine Bindungsaktivität an SDF-1 besitzt, erwähnt.
Genauer gesagt, wird die Substanz, die CXCR4 inhibiert, in eine Substanz klassifiziert, die CXCR4 in antagonistischer Weise zur CXCR4-Bindung an SDF-1 inhibiert und eine Substanz, die SDF-1 an einer Bindung an CXCR4 durch Bindung an CXCR4 hindert. Für die Substanz, die CXCR4 in antagonistischem Wettstreit mit CXCR4 im Hinblick auf die Bindung an SDF-1 inhibiert, werden konkret ein lösliches CXCR4 erwähnt, das mit CXCR4 in der Inhibition in antagonistischer Weise wirkt, ein Protein mit einer CXCR4-ähnlichen Struktur, ein Fusionsprotein des vorstehenden Proteins mit einem anderen Peptid oder Polypeptid oder ein Teilpeptid von CXCR4.
Für die Substanz, die SDF-1 an einer Bindung an CXCR4 durch Bindung an CXCR4 inhibiert, werden konkret ein anti-CXCR4- Antikörper, ein Fragment davon, das dessen Bindungsaktivität besitzt, und ein Fusionsprotein, das eine Bindungsaktivität an CXCR4 besitzt, erwähnt.
Beispiele für die Substanz, die die Bindung selbst zwischen CXCR4 und SDF-1 inhibieren, beinhalten T22 (T. Murakami et al., J. Exp. Med., 186, 1389-1393 (1997)), ALX40-4C (J. Exp. Med., 186, 1395-1400 (1997)), AMD3100 (J. Exp. Med., 186, 1383-1388 (1997); Nat. Med., 4, 72-77 (1998)) und dergleichen. Im Hinblick auf Herstellungsverfahren für diese Substanzen können diese beispielsweise durch das in J. Exp. Med., 186, 1189-1191 (1997) beschriebene Verfahren mit allen möglichen Modifikationen durchgeführt werden.

(2) Es gibt keine besondere Begrenzung für die Substanz, basierend auf einer Inhibition der Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen, soweit es sich um eine Substanz mit einer solchen Wirkung handelt. Für die Substanz, basierend auf der Inhibition der Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen, werden Inhibitoren des Signalbildungssystems erwähnt, die stromabwärts von einem G-Protein-gekoppelten Protein existieren, wie z.B. der MAK-Kaskadeninhibitor, ein Phospholipase C (PLC)-Inhibitor und ein Kinaseinhibitor für die PI3-Kinase.
(3) Für die Substanz, die die Expression von CXCR4 selbst inhibiert, wird eine Substanz erwähnt, die die Expression von CXCR4 selbst inhibiert.

Für die Substanz, die die Expression von CXCR4 selbst inhibiert, werden konkret ein Antigen, ein Antisinn-Molekül (Antisinn-Oligonucleotid und Antisinn-RNA, exprimiert durch einen Antisinn-Vektor), ein Ribozym und eine Substanz erwähnt, die die Expressionskontrollstelle von CXCR4 inhibiert, wie z.B. einen Promotor oder einen Enhancer.
Aus den Beispielen, die später beschrieben werden, wird deutlich, dass, wenn ein Vektor, enthaltend einen Teil des CXCR4-Gens, verwendet wird, um die Defizienz von CXCR4 auszulösen, die Vaskularisierung unterdrückt wird. Daher wird die Inhibition von CXCR4 durch das Antigen, Antisinnmolekül oder Ribozym von CXCR4 die Vaskularisierung unterdrücken.
Antisinn-Oligonucleotide, die in dieser Erfindung vorzugsweise verwendet werden können, beinhalten CXCR4-Gene, SDF-1-Gene gegen CXCR4, Nucleotide (DNAs oder RNAs), selektiv hybridisierbar mit den Genen der Substanzen, die am Signalbildungssystem involviert sind, basierend auf CXCR4, und Derivate davon (wie z.B. Antisinn-Oligonucleotide). Diese Erfindung umfasst beispielsweise Antisinn-Oligonucleotide, die mit irgendeiner Stelle der Basensequenz des menschlichen CXCR4-Gens, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, hybridisieren.
Vorzugsweise ist das Antisinn-Oligonucleotid ein Antisinn-Oligonucleotid mit bis zu mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in der Basensequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2. Noch bevorzugter ist das Antisinn-Oligonucleotid die mindestens 20 aufeinanderfolgende Nucleotide, enthaltend ein Translationsinitiationscodon.
Wie hier verwendet, ist ein "Antisinn-Oligonucleotid" nicht nur ein solches mit Nucleotiden, die zu den Nucleotiden korrespondieren, die die bestimmte Region der DNA oder RNA bilden und die alle komplementär dazu sind, sondern kann auch kein oder mehr Fehlpaarungen eines Nucleotids darin vorliegend aufweisen, solange das Oligonucleotid und die DNA oder die RNA dazu in der Lage sind, mit der Basensequenz gemäß SEQ ID NO: 2 selektiv und stabil zu hybridisieren. Unter "selektiv und stabil hybridisieren" werden diejenigen verstanden, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, noch bevorzugter mindestens 90%, besonders bevorzugt 95% oder mehr, Homologie zu der Basensequenz in der Nucleotidsequenzregion von mindestens 20 und vorzugsweise 30 aufeinanderfolgenden Nucleotiden aufweisen. In der gegenwärtigen Beschreibung bedeutet "Homologie" "Identität".
Wenn das in dieser Erfindung verwendete Oligonucleotidderivat ein Desoxyribonucleotid ist, wird die Struktur von jedem Derivat durch Formel 1 repräsentiert:
In der Formel kann X unabhängig jedes von Sauerstoff (O), Schwefel (S), eine Niederalkylgruppe, ein primäres Amin und ein sekundäres Amin sein. Y kann unabhängig entweder Sauerstoff (O) oder Schwefel (S) sein. B wird aus Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin gewählt und ist prinzipiell ein Oligonucleotid, komplementär zu der DNA oder RNA des menschlichen CXCR4-Gens. R ist unabhängig Wasserstoff (H), eine Dimethoxytrytylgruppe oder eine Niederalkylgruppe. n ist 7 bis 28.
Bevorzugte Oligonucleotidderivate sind nicht auf Oligonucleotide begrenzt, die nicht modifiziert wurden, sondern können auch modifizierte Oligonucleotide sein, wie unten illustriert. Diese modifizierten Formen beinhalten Niederalkylphosphonatderivate solcher Arten wie Methylphosphonat oder Ethylphosphonat, Phosphorthioatderivate, Phosphoramidate und ähnliche.
Diese Oligonucleotidderivate können durch Standardverfahren, wie unten beschrieben, erhalten werden. Die Oligonucleotide der Formel (1), worin X und Y beide O sind, können einfach mit einem kommerziellen Synthetisierer hergestellt werden, wie z.B. dem von Applied Biosystems erhältlichen; für ihr Herstellungsverfahren können eine Festphasensynthese unter Verwendung von Phosphoramiditen, eine Festphasensynthese unter Verwendung von Hydrogenphosphonaten und ähnliches verwendet werden, um sie zu erhalten.
Die Phosphorsäuretriester-modifizierten Formen, worin X eine Niederalkoxygruppe ist, können durch Standardverfahren erhalten werden: beispielsweise werden durch chemische Synthese erhaltene Oligonucleotide mit einer DMF/Methanol/2,6-Lutidin-Lösung von Tosylchlorid behandelt. Die Alkylphosphonat-modifzierten Formen, worin X eine Alkylgruppe ist, können gemäß Standardverfahren beispielsweise unter Verwendung von Phosphoamiditen erhalten werden. Die Phosphorthioat-modifizierten Formen, worin X 5 ist, können gemäß Standardverfahren erhalten werden, beispielsweise durch Festphasensynthese unter Verwendung von Schwefel oder alternativ durch Festphasensynthese unter Verwendung von Tetraethylthiuramdisulfid. Die Phosphordithioat-modifizierten Formen, worin X und Y beide S sind, können gemäß einer Festphasensynthese erhalten werden, beispielsweise durch Umwandlung von Bisamiditen in Thioamidite, und indem man Schwefel auf die Thioamidite einwirken lässt. Die Phosphoramidat-modifizierten Formen, worin X ein primäres oder sekundäres Amin ist, können gemäß einer Festphasensynthese erhalten werden, beispielsweise durch Behandlung von Hydrogenphosphonaten mit einem primären oder sekundären Amin; alternativ können sie durch Oxidation von Amiditen mit tert-Butylhydrogenperoxid erhalten werden.
Die Reinigung und die Sicherstellung der Reinheit können durch Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatographie oder Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt werden. Die Bestätigung der Molekulargewichte kann durch Elektrosprayionisierungsmassenspektrometrie oder durch Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie durchgeführt werden.
Die Antisinn-Oligonucleotidderivate, die in dieser Erfindung verwendet werden, wirken auf einen CXCR4-Rezeptor oder einen Liganden davon, wie auch auf Zellen, die eine Signalsubstanz erzeugen, basierend auf CXCR4, und binden an DNA oder RNA, codierend das Peptid und inhibieren dadurch die Transkription oder Translation oder unterstützen den Abbau von mRNR; im Ergebnis besitzen sie eine inhibitorische Wirkung auf die Wirkung aufgrund von CXCR4 durch Unterdrückung der Expression des Peptids.
Demzufolge haben die Antisense-Oligonucleotide, die in dieser Erfindung verwendet werden, eine Nützlichkeit bei der Inhibition der Neovaskularisierung.
Neovaskularisierungsinhibitoren, umfassend die Antisinn-Oligonucleotide dieser Erfindung, sind als Therapeutika für Krebs, insbesondere feste Krebstypen, nützlich.
Die Herstellung von CXCR4-Antisinnvektoren kann entsprechend üblicherweise verwendeten Verfahren geschehen. Spezifisch wird eine cDNA, die CXCR4 codiert, an einen AAV-Vektor (Adeno-assoziierten Virusvektor), MLV-Vektor (murinen Leukämievirusvektor), HIV-Vektor oder ähnliches in Antisinn-Richtung gebunden. Unter "Antisinn-Richtung" wird die Bindung an die 3'-Seite der cDNA verstanden, die stromabwärts vom Promotor eingeführt werden soll. Die Antisinn-RNAs, die aus cDNAs synthetisiert wurden, enthalten in diesen Vektoren, supprimieren die Expression von CXCR4 in den Wirten konstitutiv.
Antisinn-DNAs oder RNAs können in Zellen unter Verwendung von Mitteln, wie dem Liposomenverfahren, dem HVJ-Liposomenverfahren oder dem positiv geladenen Liposomenverfahren eingeführt werden. Die Einführung einer CXCR4-Antisinn-DNA oder -RNA ermöglicht eine konstitutive Inhibition der Expression von CXCR4.

(4) Für die Substanz, die die Expression von SDF-1 selbst gegen CXCR4 inhibiert, werden eine Antisinn-Substanz erwähnt, die die Expression von SDF-1 inhibiert und eine Substanz, die die Expressionskontrollstelle, wie z.B. einen Promotor, inhibiert.

Die oben beschriebenen Antikörper, die in dieser Erfindung verwendet werden können, wie z.B. anti-SDF-1-Antikörper und anti-CXCR4-Antikörper können als polyklonale oder monoklonale Antikörper unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Insbesondere werden monoklonale Antikörper, die von Säugern abgeleitet sind, als Antikörper bevorzugt, die in der Erfindung verwendet werden. Die von Säugern abstammenden monoklonalen Antikörper beinhalten diejenigen, die von Hybridomen erzeugt werden und diejenigen, die von den Wirten erzeugt werden, die mit Expressionsvektoren transformiert wurden, die Antikörpergene enthielten, und zwar durch genetische Manipulationsverfahren. Diese Antikörper sind diejenigen, die die oben erwähnten Eigenschaften besitzen.
Antikörper-erzeugende Hybridome können prinzipiell unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren auf die folgende Weise hergestellt werden. Das heißt, ein gewünschtes Antigen wird als sensibilisierendes Antigen verwendet, um eine Immunisierung gemäß einem konventionellen Immunisierungsverfahren durchzuführen; und die resultierenden immunisierten Zellen werden mit Elternzellen, wie bekannt auf dem Gebiet, durch ein konventionelles Zellfusionsverfahren fusioniert, und monoklonale Antikörper-erzeugende Zellen werden einer Klonierung durch ein konventionelles Klonierungsverfahren unterworfen.
Die mit dem sensibilisierenden Antigen zu immunisierenden Säuger sind nicht besonders begrenzt, sollten jedoch vorzugsweise unter Betrachtung ihrer Kompatibilität mit den Elternzellen, die bei der Zellfusion verwendet werden sollen, gewählt werden. Allgemein werden Tiere, die zu der Familie der Nager gehören, wie z.B. Mäuse, Ratten und Hamster, verwendet. Die Immunisierung von Tieren mit dem sensibilisierenden Antigen wird durch ein auf dem Gebiet bekanntes Verfahren durchgeführt.
Für die als andere Elternzellen für die Fusion mit den Immunozyten verwendeten Säuger-Myelomzellen kann eine Vielzahl von Zelllinien, die bereits auf dem Gebiet bekannt sind, in geeigneter Weise verwendet werden. Die Zellfusion zwischen den Immunozyten und Myelomzellen kann im Grunde gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden, wie z.B. dem Verfahren von Milstein et al. (G. Köhler und C. Milstein, Methods Enzymol., 73, 3-46 (1981)), mit allen möglichen Modifikationen.
Die erhaltenen Hybridome werden durch Kultivierung in einem üblichen Selektionsmedium, wie z.B. einem HAT-Medium (Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält), selektiert. Die Kultivierung in dem HAT-Medium wird für eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um ein Abtöten aller anderen Zellen als der Ziel-Hybridome (die nicht fusionierten Zellen) zu ermöglichen, wobei es sich in der Regel um einige Tage bis einige Wochen handelt. Das übliche limitierende Verdünnungsverfahren wird dann für das Screening und Klonieren von Hybridomen durchgeführt, die die Zielantikörper erzeugen. Antikörper können aus den so erhaltenen Hybridomen, folgend einem Verfahren, erworben werden, das üblicherweise verwendet wird.
Zusätzlich zu dem Erwerb der Hybridome durch Immunisierung eines anderen Tiers als einem Menschen mit dem Antigen, wie oben beschrieben, werden menschliche Lymphozyten in vitro mit einem gewünschten Antigenprotein oder einer Antigen-exprimierenden Zelle sensibilisiert, und die sensibilisierten B-Lymphozyten werden mit menschlichen Myelomzellen, wie z.B. U266, fusioniert, wodurch gewünschte humanisierte Antikörper, die die Bindungsaktivität an das gewünschte Antigen oder die Antigen-exprimierende Zellen besitzen, erhalten werden können. Weiterhin können die gewünschten humanisierten Antikörper gemäß dem vorher erwähnten Verfahren durch Verabreichung des Antigens oder der Antigen-exprimierenden Zelle an ein transgenes Tier mit einem Repertoire menschlicher Antikörpergene erhalten werden.
Ein Antigengen wird als monoklonaler Antikörper aus dem Hybridom kloniert und in einen geeigneten Vektor inkorporiert, und dieser wird in einen Wirt eingeführt und die Genmanipulationstechnologie wird verwendet, um einen rekombinanten Antikörper zu erzeugen, der dann in dieser Erfindung verwendet werden kann. Siehe beispielsweise Carl, A.K. Borrenbaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, veröffentlicht in UK durch Macmillan Publishers Ltd., 1990.
In dieser Erfindung können rekombinante Antikörper, die künstlich zum Zweck der Erniedrigung der heterogenen Antigenizität gegen Menschen modifiziert wurden, wie z.B. chimäre Antikörper (Europäische Patentveröffentlichung EP 0 125 023 ) und humanisierte Antikörper (Europäische Patentveröffentlichung EP 125 023 ), verwendet werden. Diese Antikörper können durch bekannte Verfahren erzeugt werden.
Der chimäre Antikörper umfasst die variable Region eines Antikörpers, der von einem anderen Säuger als einem Menschen abstammt und die konstante Region (C-Region), die von einem menschlichen Antikörper abstammt. Der humanisierte Antikörper umfasst einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich eines Antikörpers, der von einem anderen Säuger als einem Menschen abstammt, eine Framework-Region (FR), abgeleitet von einem menschlichen Antikörper, und eine C-Region. Sie sind als Wirkstoff in dieser Erfindung geeignet, da sie eine verminderte Antigenizität im menschlichen Körper aufweisen.
Die in dieser Erfindung verwendeten Antikörper können Fragmente von Antikörpern oder modifizierte Substanzen davon sein, soweit sie in gewünschter Weise in der Erfindung verwendet werden können. Die Fragmente des Antikörpers beinhalten beispielsweise Fab, F(ab')₂, Fv und Einzelketten-Fv (scFv), erhältlich durch Bindung von Fv der H-Kette und Fv der L-Kette über einen geeigneten Linker. Spezifisch wird ein Antikörper mit einem Enzym, wie z.B. Papain oder Pepsin, behandelt, um Antikörperfragmente zu erzeugen. Alternativ werden Gene, die diese Antikörperfragmente codieren, konstruiert und in einen Expressionsvektor eingeführt, woraufhin sie in geeignete Wirtszellen exprimiert werden.
Das Phagenbibliotheksverfahren kann verwendet werden, um die Antikörper zu erhalten, die in dieser Erfindung verwendet werden (C. Marks et al., The New England Journal Medicine 335, 730-733). Beispielsweise wird eine cDNA-Bibliothek von menschlichen B-Zellen erworben, die eine menschliche Antikörper-V-Region umfassen, wie z.B. das Gen, codierend scFv. Diese cDNA-Bibliothek wird in einen Phagenvektor, wie z.B. den M13-Phagenoberflächen-präsentierenden Vektor eingeführt, und man lässt diesen E. coli infizieren. Die cDNA-Bibliothek wird in E. coli exprimiert, und die Antikörper-V-Region wird auf den Zelloberflächen erzeugt. wenn eine Selektion auf einer Platte durchgeführt wird, die mit dem gewünschten Antigen beschichtet ist, und zwar basierend auf der Antigenbindungsaktivität, kann ein Gen, codierend den gewünschten Antikörper, erhalten werden.
Antikörper, die eine stärkere Bindungsaktivität an Antigene besitzen, können durch das Ketten-Shuffling-Verfahren erhalten werden, unter Anwendung des Phagenbibliotheksverfahrens. (Y. Akamatsu und N. Tsurushita, Medical Immunology 27, 273-286 (1994)). Spezifisch wird ein Mitglied der V-Region eines Antikörpergens, das abgetrennt wurde (wie z.B. VH), fixiert und eine neue Bibliothek wird aus der Mischung des einen Mitglieds und eines anderen Mitglieds, hergestellt aus B-Zellen (wie z.B. VL) konstruiert. Klone, die an das Antigen stärker binden als die anderen, können aus der Bibliothek abgetrennt werden.
Es ist auch möglich, Antikörper zu erhalten, die eine stärkere Bindungsaktivität an Antigene besitzen, indem künstliche Mutationen in die Aminosäuresequenzen der Antikörper eingeführt werden (Y. Akamatsu und N. Tsurushita, N. Medical Immunology 27, 273-286 (1994)). Genauer gesagt wird die Mutation in ein Gen eingeführt, das die klonierte Antikörper-V-Region codiert, und dieses Gen wird durch das Phagenbibliotheksverfahren, wie oben beschrieben, exprimiert. Dadurch wird es möglich, ein Gen zu erhalten, das den Antikörper codiert, der eine stärkere Bindungsaktivität an das Antigen besitzt.
Diese Antikörperfragmente können durch Wirte erzeugt werden, nachdem ihre Gene auf dieselbe Weise wie vorher oben beschrieben, erworben und exprimiert wurden. Wie in der gegenwärtigen Beschreibung verwendet, umfasst "Antikörper" diese Fragmente von Antikörpern.
Modifizierte Formen des Antikörpers können Antikörper verwenden, die an verschiedene Moleküle gebunden sind, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG). Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, umfasst der "Antikörper" diese modifizierten Antikörperformen. Der Erwerb dieser modifizierten Antikörperformen kann durchgeführt werden, indem man die erhaltenen Antikörper einer chemischen Modifikation unterwirft. Diese Verfahren wurden auf dem Gebiet bereits etabliert.
Die Antikörper, die wie oben beschrieben, exprimiert und erzeugt wurden, können aus den Wirtszellen intrazellulär oder extrazellulär abgetrennt werden und können zur Homogenität gemäß Verfahren, die allgemein verwendet werden, gereinigt werden. Eine Konzentrationsmessung kann durch die Messung der Absorption, ELISA oder ähnliches durchgeführt werden.
Für den in dieser Erfindung verwendeten CXCR4-Inhibitor wird ein Protein erwähnt, dass eine SDF-1- oder CXCR4-ähnliche Struktur aufweist (strukturähnelndes Protein). Diese Substanz ist eine, die eine Bindungsaktivität an SDF-1 oder CXCR4 besitzt und die biologische Aktivität nicht überträgt. Das heißt, sie blockiert die Signalbildung durch SDF-1, da sie in kompetitiver Weise zu SDF-1 an CXCR4 bindet, jedoch die biologische Aktivität von SDF-1 nicht überträgt.
SDF-1-strukturähnelnde Proteine können durch Einführung von Mutationen in die Aminosäuresequenz von SDF-1 durch Substitution von Aminosäureresten davon hergestellt werden. Für SDF-1, worauf die SDF-1-strukturähnelnden Proteine basieren, ist die Quelle nicht von Wichtigkeit; es wird jedoch bevorzugt, menschliches SDF-1 im Hinblick auf seine Antigenizität oder ähnliche zu verwenden. Spezifisch wird die Aminosäuresequenz von SDF-1 verwendet, um die Sekundärstruktur unter Verwendung von molekularen Modellierungsprogrammen, die auf dem Gebiet bekannt sind, vorherzusagen, wie z.B. WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics 8, 52-56 (1990)); und weiterhin wird der Einfluss des zu substituierenden Aminosäurerestes auf die Gesamtheit bewertet, um die Präparation durchzuführen.
Nachdem ein geeigneter Aminosäurerest, der substituiert werden soll, bestimmt wurde, wird ein Vektor, der die Basensequenz enthält, die das menschliche SDF-1-Gen codiert, als Matrize verwendet, und die Einführung einer Mutation wird durch das PCR-Verfahren (Polymerasekettenreaktion) durchgeführt, was üblicherweise durchgeführt wird, so dass die Aminosäure ersetzt werden kann. Dies ermöglicht es, ein Gen zu erhalten, das ein SDF-1-strukturähnelndes Protein codiert. Dieses Gen wird in einen geeigneten Expressionsvektor je nach Bedarf inkorporiert und das SDF-1-strukturähnelnde Protein kann gemäß Verfahren für die Expression, Produktion und Reinigung der rekombinanten Antikörper, wie vorher beschrieben, erhalten werden. SDF-1, dessen N-Terminus deletiert wurde, ist als SDF-1-strukturähnelndes Protein bekannt (EMBO J. 16, 6996-7007 (1997)).
Das SDF-1-Teilpeptid oder das CXCR4-Teilpeptid, das in dieser Erfindung verwendet wird, ist eine Substanz, die eine Bindungsaktivität an CXCR4 oder SDF-1 besitzt und die biologische Aktivität von SDF-1 nicht überträgt. Das heißt, das SDF-1-Teilpeptid oder CXCR4-Teilpeptid inhibieren SDF-1 spezifisch an einer Bindung an CXCR4, da sie jeweils an CXCR4 oder SDF-1 binden, und eines von Beiden einfangen.
Dementsprechend blockieren sie die Signalbildung durch SDF-1, da sie die biologische Aktivität von SDF-1 nicht übertragen.
Das SDF-1-Teilpeptid oder das CXCR4-Teilpeptid ist ein Peptid, umfassend einen Teil oder die Gesamtheit der Aminosäuresequenz der Region, die für die Bindung zwischen SDF-1 und CXCR4 verantwortlich ist, und zwar in der Aminosäuresequenz von SDF-1 oder von CXCR4. Ein solches Peptid umfasst üblicherweise 10 bis 80 Aminosäurereste, vorzugsweise 20 bis 50 Aminosäurereste und noch bevorzugter 20 bis 40 Aminosäurereste.
Das SDF-1-Teilpeptid oder das CXCR4-Teilpeptid kann hergestellt werden, indem in der Aminosäuresequenz von SDF-1 oder von CXCR4 die Region identifiziert wird, die für die Bindung zwischen SDF-1 und CXCR4 verantwortlich ist und durch Herstellung eines Teils oder der Gesamtheit der Aminosäuresequenz der Region gemäß einem Verfahren, das üblicherweise bekannt ist, wie z.B. einer Technik einer genetischen Manipulation oder Peptidsynthese.
Um das SDF-1-Teilpeptid oder das CXCR4-Teilpeptid durch eine Technik der genetischen Manipulation herzustellen, wird eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Peptid codiert, in einen Expressionsvektor eingebaut und die Verfahren für die Expression, Produktion und Reinigung der rekombinanten Antikörper, wie früher beschrieben, werden mit jeden möglichen Modifikationen befolgt und ermöglichen so die Präparation.
Um das SDF-1-Teilpeptid oder das CXCR4-Teilpeptid durch eine Peptidsynthese herzustellen, werden Verfahren, die üblicherweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, wie z.B. eine Festphasensynthese oder eine Flüssigphasensynthese, verwendet. Konkret kann das Verfahren, wie in "Development of Drugs", Peptide Synthesis, Band 14, herausgegeben durch Nariaki Yajima, Hirokawa Publisher (1991) beschrieben, mit jeden möglichen Modifikationen befolgt werden. Für die Festphasensynthese wird beispielsweise das folgende Verfahren verwendet: Eine Aminosäure, korrespondierend zum C-Terminus des zu synthetisierenden Peptids lässt man an einen Träger binden, der in einem organischen Lösungsmittel unlöslich ist und eine Reaktion, worin eine Aminosäure mit einer geeigneten Schutzgruppe an der α-Aminogruppe und einer Seitenkettenfunktionalen Gruppe geschützt wird, wird mit der vorstehenden Aminosäure kondensiert, und zwar Aminosäure pro Aminosäure in Richtung vom C-Terminus zum N-Terminus, und die Reaktion für die Ablösung der Schutzgruppe für die α-Aminogruppe der Aminosäure oder der Peptidbindung an das Harz werden alternierend wiederholt, um die Peptidkette zu verlängern. Die Festphasenpeptidsynthese ist grob in das Boc-Verfahren und das Fmoc-Verfahren klassifiziert, abhängig von der Art der zu verwendenden Schutzgruppen.
Nachdem das Zielpeptid auf diese Weise synthetisiert wurde, wird eine Reaktion zur Entfernung von Schutzgruppen durchgeführt, und das Peptid wird von dem Träger für die Peptidkette gespalten. Bei der Spaltungsreaktion von der Peptidkette kann das Boc-Verfahren üblicherweise Hydrogenfluorid oder Trifluormethansulfonsäure verwenden, und das Fmoc-Verfahren kann üblicherweise TFA verwenden. Bei dem Boc-Verfahren wird das oben erwähnte geschützte Peptidharz beispielsweise in Hydrogenfluorid in Gegenwart von Anisol behandelt. Darauffolgend wird durch Entfernung der Schutzgruppen und Spaltung von dem Träger das Peptid gewonnen.
Das Produkt wird lyophilisiert, um ein Rohpeptid zu ergeben. Bei dem Fmoc-Verfahren können die Entfernung der Schutzgruppen und die Spaltungsreaktion von dem Träger für die Peptidgruppe auch in TFA unter Verwendung von ähnlichen Manipulationen, wie den oben erwähnten, durchgeführt werden.
Das resultierende Rohpeptid kann durch Anwendung auf HPLC getrennt und gereinigt werden. Die Elution kann dann unter optimalen Bedingungen mit einem Lösungsmittel des Wasser-Acetonitril-Systems durchgeführt werden, das üblicherweise verwendet wird, um Proteine zu reinigen. Die Fraktionen, die zu den Peaks des erhaltenen Profils der Chromatographie korrespondieren, werden fraktional getrennt und lyophilisiert. Die so gereinigten Peptidfraktionen werden durch eine Molekulargewichtsanalyse durch Massenspektrometrie, Aminosäurezusammensetzungsanalyse, Aminosäuresequenzierung oder ähnliches identifiziert.
Für das SDF-1-Teilpeptid oder das CXCR4-Teilpeptid, das in dieser Erfindung verwendet wird, ist die Sequenz nicht von Bedeutung, soweit dies jeweils an CXCR4 oder SDF-1 bindet und keine Signalaktivität besitzt. Die Aminosäuresequenzen, die bereits bekannt sind, können für sowohl das SDF-1-Teilpeptid als auch das CXCR4-Teilpeptid verwendet werden. Wenn der Ligand beispielsweise SDF-1 ist, sind die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 5 (Mensch) und SEQ ID NO: 7 (Maus) verwendbar.
Wie oben erklärt, ermöglicht die Verwendung des Vaskularisierungsinhibitors gemäß dieser Erfindung, umfassend den CXCR4-Inhibitor als Wirkstoff, die Inhibition der Vaskularisierung; daher wird dieser eine Antitumorwirkung (Inhibition der Neovaskularisierung) auf festen Krebs zusätzlich zu Antitumorwirkungen auf ein Angiosarkom (Krebs der Blutgefäße selbst) oder ein Kaposi-Sarkom ausüben. Sie werden auch therapeutische Wirkungen gegen Erkrankungen ausüben, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung ausgelöst werden, wie z.B. chronischer Gelenkrheumatismus, Psoriasis und Diabetes-Retinopathie.
Wenn das Therapeutikum, das die Substanz umfasst, die die Wirkung von CXCR4 potenziert, für eine Erkrankung, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung ausgelöst wird, verwendet wird, wird es möglich, die Neovaskularisierung zu unterstützen. Die Verwendung wird therapeutische Wirkungen auf einen Myokardinfarkt und Erkrankungen ausüben, die eine Neovaskularisierung nach einer Chirurgie involvieren, wie z.B. eine Wundheilung, eine Reparatur und Remodellierung von Knochen, eine Reparatur von Knorpel, das Wachstum von Haar, einen Myokardinfarkt, einen Gehirnschlag und ein Gehirntrauma.
Für die Neovaskularisierungsinhibitions- und Unterstützungstestverfahren, die in dieser Erfindung verwendet werden können, kann ein Neovaskularisierungsassay verwendet werden. Es gibt keine besondere Begrenzung für den Assay und ein Verfahren, das üblicherweise bekannt ist, kann vorzugsweise verwendet werden. ("Research Manual for the Invasion and Metastasis of Cancers" the Cancer Metastasis Study Group, Hrsg., Kinhodo, 159-182, (1994)). Spezifisch werden unter anderem (I) das Verfahren zur Messung der Abstände zwischen den Räumen zwischen vaskulären Endothelzellen verwendet werden (d.h. die Wirkung auf die vaskulären Endothelzellen), das auf der Feststellung basiert, dass die vaskulären Endothelzellen aufbrechen, wenn Tumorzellen aus den Blutgefäßen austreten (aus der Permeabilität von FITC-Dextran); (II) das Cornea-Verfahren, das als ein in vivo-Messverfahren zur Identifizierung eines Kandidatenfaktors bekannt ist, der die Funktion eines Neovaskularisierungs-induzierenden Faktors in vivo ausübt; (IV) das CAM-Verfahren (Hühnerembryochorioallantoinsäuremembran); (V) das dorsale Subcutanea-Verfahren zur Messung der Menge des induzierten Blutgefäßes mit dem bloßen Auge und (VI) das Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Lumen durch vaskuläre Endothelzellen.
Um die Antitumorwirkung zu bestätigen, können in vivo-Experimente erwähnt werden, die ein Transplantatmodell oder ein Transplantatmetastasemodell verwenden, und in vitro-Experimente mit Krebszellen. Spezifisch kann das Verfahren verwendet werden, das in "Research Manual for the Invasion and Metastasis of Cancers" the Cancer Metastasis Study Group, Hrsg., Kinhodo, 7-158 (1994) beschrieben wird.
Der Vaskularisierungsinhibitor, das Mittel gegen festen Krebs, das Therapeutikum gemäß dieser Erfindung, können systemisch (auf dem oralen Weg) oder lokal verabreicht werden. Beispielsweise kann eine intravenöse Injektion (wie z.B. eine intravenöse Tropfinfusion), eine intramuskuläre Injektion, eine intraperitoneale Injektion oder subkutane Injektion gewählt werden: ein geeignetes Verabreichungsverfahren kann abhängig von dem Alter oder der Schwere des Subjekts gewählt werden.
Die effektive Einheitsdosis wird in einem Bereich von 0,09 bis 100 mg pro kg Körpergewicht gewählt. Alternativ kann eine Dosis von 1 bis 1.000 mg, vorzugsweise eine Dosis von 5 bis 50 mg, für das Subjekt gewählt werden.
Der Vaskularisierungsinhibitor, das Mittel gegen festen Krebs und das Therapeutikum gemäß dieser Erfindung können zusammen pharmazeutisch annehmbare Träger oder Additive enthalten, abhängig vom Verabreichungsweg. Beispiele für solche Träger und Additive beinhalten Wasser, organische Lösungsmittel, die pharmazeutisch annehmbar sind, Collagen, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Carboxyvinylpolymer, Natriumcarboxymethylcellulose, Natriumpolyacrylat, Natriumalginat, wasserlösliches Dextran, Natriumcarboxymethylstärke, Pektin, Methylcellulose, Xanthangummi, Gummi arabicum, Casein, Gelatine, Agar, Diglycerin, Propylenglykol, Poly(ethylenglykol), Vaseline, Paraffin, Stearylalkohol, Stearinsäure, menschliches Serumalbumin (HSA), Mannit, Sorbit, Lactose, Tenside, die als Arzneimitteladditive akzeptiert sind, usw.
Die zu verwendenden Additive können in geeigneter weise (oder in Kombination) unter den oben erwähnten ausgewählt werden, abhängig von der Dosierungsform, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
Die Erfindung wird hiernach in größerem Detail durch die Beispiele illustriert.
Beispiele
Erzeugung und Analyse von Mäusen, denen CXCR4 vollständig fehlt
Genomische DNA, die den CXCR4-Locus enthielt, wurde aus der murinen Zelllinie 129DNA-Bibliotheken (STRATAGENE) isoliert.
Ein 1,1-kb-genomisches Fragment, enthaltend die 5'-codierende Region von Exon-2 wurde durch das Neomycin-Resistenzgen ersetzt, und das Herpes simplex-Thymidinkinasegen wurde mit dem 5'-Terminus verbunden.
Der Zielvektor wurde in die Zellen am Tag 14.1 der Embryogenese (hiernach bezeichnet als "E14.1") durch Elektroporation eingeführt und eine homologe Rekombination wurde durch Verwendung von G418 und Ganciclovir selektiert und durch PCR identifiziert.
Die Struktur des mutierten Locus und die Gegenwart eines einzelnen Inserts in der ES-Zellkolonie wurden durch Southern-Hybridisierung bestätigt. Gemäß dem von T. Nagasawa et al., Nature 382, 685-688 (1996) beschriebenen Verfahren wurde die mutierte ES-Zellkolonie verwendet, um eine mutierte Maus durch Injektion von nicht-differenzierten embryonalen Zellen zu erzeugen.
Für die Southern-Hybridisierung wurde eine Schwanz-DNA mit EcoRI verdaut, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer 550 bp-Sonde A mit der 5'-Homologieregion hybridisiert.
Die RT-PCR wurde für 40 Zyklen durchgeführt, wobei 3 μg Gesamt-RNA, isoliert aus der fötalen Leber von E18.5 Embryos als Startmaterial, verwendet wurde, und zwar gemäß dem Standardverfahren. Ein 630-bp PCR-Produkt wurde unter Verwendung von CXCR4-spezifischen Primern amplifiziert, d.h. einem Vorwärtsprimer (SEQ ID NO: 11) und einem reversen Primer (SEQ ID NO: 12). Histologische Analyse und Flusszytometrieanalyse wurden im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von T. Nagasawa et al., Nature 382, 685-688 (1996) durchgeführt.
Die Immunhistofärbung folgte im Wesentlichen dem Verfahren von S. Adachi, H. Yoshida, H. Kataoka, S.-I. Nishikawa, Int. Immunol. 9, 507-514. Die Sektionen von Embryos und Organen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit Methanol dehydratisiert, mit 30% Hydrogenperoxid in Methanol entfärbt und wiederum hydratisiert.
Nach einer Inkubation in PBSMT (PBS, enthaltend 1 entfettetes Milchpulver und 0,3% V/V Triton X-100) wurde die Probe mit verdünntem anti-PECAM-Antikörper (1:250) (PharMingen) in PBSMT über Nacht bei 4°C inkubiert. Dann wurde die Probe mit PBSMT gewaschen und mit verdünntem Meerrettichperoxidase-markiertem Anti-Ratten-Ig-Antikörper (1:500) (Biosource) in dem PBST über Nacht bei 4°C inkubiert.
Darauffolgend wurde die Probe ausgiebig gewaschen. Der Embryo wurde in PBS inkubiert, enthaltend 250 μg/ml Diaminobenzidin (Dojin Chemicals) und 0,08% NiCl₂ für 30 Minuten. Hydrogenperoxid wurde der Probe zur Bereitstellung einer Endkonzentration von 0,01% zugefügt, woraufhin die Peroxidasefärbung durchgeführt wurde. Die Reaktion wurde nach ungefähr 30 Minuten gelöscht.
Gemäß dem von T. Nagasawa et al. in Nature 382, 685-688 (1996) beschriebenen Verfahren wurde ein Fragment von muriner CXCR4 oder PBSF/SDF-1-cDNA als Sonde verwendet, um eine Antisinn-Transkription durchzuführen.
Mäuse, denen CXCR4 fehlte, wurden erzeugt, um die physiologische Funktion von CXCR4 zu bestimmen. Spezifisch wurde ein Zielvektor konstruiert, so dass das Meiste von Exon-2 innerhalb des CXCR4-Gens, das alle Transmembran überspannenden Regionen enthielt, die für die Rezeptorfunktion kritisch sind, deletiert war, und der deletierte Bereich wurde durch das Neomycinresistenzgen (neo) ersetzt. Dies würde dazu führen, dass nach homologer Rekombination das vollständige CXCR4-Gen im Wesentlichen deletiert sein würde.
1 ist eine Graphik, die eine Zielstrategie für das CXCR4-Gen darstellt (bezeichnet als oben, Mitte und unten).
Dort sind das CXCR4-Wildtyp-Allel oben, ein Zielvektor in der Mitte und ein vorhergesagtes mutiertes Allel unten dargestellt. Die codierenden Regionen der Gene sind durch schwarze Kästen angegeben. Leere Kästen zeigen die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen an. Gepunktete Linien zeigen homologe Fragmente an, die in dem Zielvektor verwendet werden. Sonde A ist eine externe Sonde für die Southern-Hybridisierung. Hier sind die Restriktionsstellen E (EcoRI), Sh (SphI) bzw. X (XhoI).
2A ist eine Fotografie, die die Southern-Blot-Analyse von Schwanz-DNAs von Wildtyp (+/+) und heterozygot-mutierten (+/–) Mäusen darstellt. Die EcoRI-EcoRI-Fragmente von dem 11,8-kb Wildtyp und dem 8,2-kb Zielallel, die durch Sonde A identifiziert wurden, sind in der Figur dargestellt. 2B ist eine Fotografie, die die RT-PCR-Amplifikationsanalyse der CXCR4-Expression darstellt. Gesamt-RNAs wurden aus E18.5 Wildtyp und homozygot-mutierten Embryos hergestellt und mit CXCR4 spezifischen Primern amplifiziert. Die RT-PCR-Amplifikation verwendete G3PDH mRNA, die universell exprimiert wurde, als Kontrolle für die Gegenwart von jeder amplifizierten RNA.
Mäuse mit einer CXCR4^+/– heterozyten Mutation wurden erzeugt. Die Mäuse waren gesund und fertil. CXCR4^–/– homozygote mutierte Embryos waren in den erwarteten Anteilen bis E15.5 der Embryogenese vorhanden. Jedoch ungefähr die Hälfte der CXCR4^–/–-Embryos waren an E18.5 tot und CXCR4^–/–Neugeborene starben innerhalb einer Stunde, ähnlich wie Mäuse, denen PBSF/SDF-1 fehlte, wie früher berichtet (T. Nagasawa et al., Nature 382, 685-688 (1996)).
Um die Funktionen von CXCR4 während der Embryogenese zu erhellen, wurde die Expression von CXCR4 in sich entwickelnden Embryos durch in situ-Hybridisierung untersucht. Hohe Niveaus der CXCR4-Transkripts wurden im Endothel von sich entwickelnden Blutgefäßen während der Embryogenese nachgewiesen.
Basierend auf dieser Feststellung wurde die Wirkung der CXCR4-Gendefizienz auf die Vaskularisierung untersucht. Bei visueller Überprüfung waren Vitellin und Nabelschnurgefäße normal. Die histologische Überprüfung von E18.5 CXCR4^–/–-Embryos demonstrierte die Gegenwart der Hauptblutgefäße, einschließlich der Aorta, der Vena cava, Carotidarterie, der Jugularvene, der Arteria coeliaca und der Arteria mesenterior superior und der Vena mesenterior superior. Um das vaskuläre System der Organe zu visualisieren, wurden Gesamtpräparationen von Wildtyp und mutierten Embryos dann mit einem anti-PECAM-1-Antikörper immungefärbt. Es ist bekannt, dass PECAM-1 in allen Endothelzellen spezifisch und stabil, während der embryonalen Periode exprimiert wird. (A. Vecchi et al., Eur. J. Cell Biol. 63, 247-255 (1994); H. S. Baldwin et al., Development 120, 2539-2558 (1994)).
Dementsprechend wurde im Gastrointestinaltrakt, einschließlich des Magens, dem Verdauungstrakt und dem Mesenterium ein hoch verzweigtes homogenes vaskuläres Netzwerk sowohl bei dem Wildtyp als auch bei dem Mutanten an E11.5 beobachtet. Die Bildung großer und kleiner Gefäße durch Remodellierung im Mesenterium, verbunden mit der Mitteldarmschleife wurde an ungefähr E12.5 beobachtet. Wie 3 darstellt, wurden viele große Verzweigungen der Arteria mesenterica superior und Vena mesenterica superior, die dem Verdauungstrakt Nährstoffe zuführen, in Wildtypembryos an E13.5 gebildet. Andererseits waren diese großen Verzweigungen in den Mesenterien von CXCR4^–/–-Embryos an E13.5 nicht vorhanden; stattdessen wurden nur kleine Gefäße gebildet. Die histologische Analyse durch Mikroskopie ergab obere Mesenteriumsarterien und -venen in den Mesenterien von Wildtypembryos an E13.5. Dies zeigte, dass die verzweigten Gefäße zwischen der Arterie und der Vene gepaart waren (4). Demgegenüber waren die meisten der Gefäße in den CXCR4^–/–-Embryos nicht gepaart, jedoch einzeln, wie in 8 beobachtet werden kann. Die oberen Mesenteriumsarterien und -venen in den Mesenterien der Wildtyp-Embryos waren normal. In E17.5-Wildtyp-Embryos verzweigten sich die großen Mesenteriumsgefäße in viele Verzweigungen und erreichten den Verdauungstrakt (5 und 6). In den CXCR4^–/–-Embryos lagen jedoch solche Gefäße, die zu den großen Mesenteriumsgefäßen korrespondierten, im wesentlichen nicht vor (6 und 9). Außerdem wurden einige große Gefäße mit einer abweichenden Verzweigung in den mutierten Mesenterien beobachtet (6 und 9). Bei den meisten von E16.5 mutierten Embryos wurden multiple hämorrhagische Läsionen in ihrem Dünndarm beobachtet, und zwar aufgrund dieses defekten vaskulären Systems. Diese Pathogenese ist vermutlich das Ergebnis der Abweichung des Kreislaufsystems, das den Verdauungstrakt beherrscht (11).
Die oben erwähnten Ergebnisse haben demonstriert, dass CXCR4 für eine normale Vaskularisierung im Dünndarm essentiell ist: es wird angenommen, dass der Mechanismus darauf zurückzuführen ist, dass CXCR4 an einer Verzweigung und/oder Remodellierung der Mesenteriumsgefäße beteiligt ist.
Im Magen wurden große Gefäße, die sich aus den Mesenchymalgefäßen entlang der geringeren Kurvatur abzweigten, gebildet und verteilten sich hin zu den gesamten ventralen und dorsalen Oberflächen der Wildtyp-Embryos an E13.5 (12A und 12C). Die histologische Analyse ergab, dass diese Gefäße zwischen der Arterie und der Vene an den E15.5-Wildtyp-Mäusen gepaart waren, wie der Einsatz in 12C zeigt. Die korrespondierenden Gefäße wurden in den mutierten Embryos jedoch nicht angetroffen (12B und 12D). Die Bildung des Netzwerkes kleiner Gefäße, die den Magen umgeben, schien bei den mutierten Embryos normal zu sein (12D).
Eine histologische Analyse des Magens und des Verdauungstrakts von E18.5 mutierten Embryos wies keine deutlichen Abnormalitäten der Organogenese nach. Beispielsweise schienen die Schichten der glatten Muskeln (sowohl die äußeren als auch die inneren Schichten) des Gastrointestinaltrakts von mutierten Mäusen in Längs- und vertikalen Richtungen normal zu sein.
Die 3 bis 6 sind Fotografien, die die Defekte der Gastrointestinalgefäße bei den CXCR4^–/–-Embryos darstellen, und auch Fotografien, die eine Immunhistofärbung von Mesenterien und Verdauungstrakts von Wildtypen mit dem anti-PECAM-Antikörper darstellen. 3 zeigt das Mesenterium und die Mitteldarfschleifenregionen an E13.5. 5 zeigt ein Jejunum an E17.5. 6 zeigt ein Jejunum an E17.5. 7 zeigt einen Querschnitt eines gefärbten Mesenteriums an E13.5. Die Pfeile in den 3, 5 und 6 zeigen große Verzweigungen der Arteria mesenterica superior und der Vena mesenterica superior, die Nährstoffe zum Dünndarm zuführen bei Wildtyp-Mesenterien.
In ähnlicher Weise sind die 7 bis 11 Fotografien, die Defekte der Gastrointestinalgefäße in den CXCR4^–/–-Embryos darstellen, und auch Fotografien, die eine Immunhistofärbung von Mesenterien und Verdauungstrakts von Mutanten mit dem anti-PECAM-Antikörper darstellen. 7 zeigt das Mesenterium und die Mitteldarmschleifenregionen an E13.5. 9 zeigt ein Jejunum an E17.5. 10 zeigt ein Jejunum an E17.5. 7 zeigt einen Querschnitt des gefärbten Mesenteriums an E13.5. 11 zeigt die hämorrhagischen Läsionen eines ungefärbten Verdauungstrakts einer mutierten Maus an E16.5. Die Pfeile in den 9 und 10 geben große Gefäße an, die einen abweichenden Verlauf und/oder eine Verzweigung bei mutierten Mäusen zeigen.
Die 12A bis 12D sind Fotografien, die die Ergebnisse einer Immunhistofärbung von Mägen mit dem anti-PECAM-Antikörper darstellen. Die 12A und 12B zeigen E13.5; die 12C und 12D zeigen E15.5; die 12A und 12C zeigen die Wildtypen; und die 12B und 12D zeigen die Mutanten. Der Einsatz in der Fotografie von 12C zeigt eine Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Sektion der großen Gefäße in der Wand eines gefärbten Magens an E15.5. Die Pfeile in den 12A und 12C zeigen große Gefäße, die nur bei den Mutanten beobachtet werden. "du" bedeutet Duodenum; "p" bedeutet den proximalen Teil der Mitteldarmschleife; "dm" bedeutet den distalen Teil der Mitteldarmschleife; "a" bedeutet Arterie" und "v" bedeutet Vene.
Diese Feststellungen zeigen an, dass die Abnormalitäten bei der Vaskularisierung bei den CXCR4^–/–-Mäusen kein sekundäres Ergebnis derjenigen im Gastrointestinaltrakt selbst sind. Ähnliche Abnormalitäten wie die bei der Vaskularisierung wurden auch bei den Mäusen beobachtet, denen PBSF/SDF-1 fehlte.
Die in situ-Hybridisierungsanalyse zeigte an, dass die CXCR4-Transkripte in den Endothelzellen von Blutgefäßen im Mesenterium und in der Wand des Verdauungstrakts und des Magens bei E12.5 Wildtyp-Embryos exprimiert wurden (13B und 13E). Insbesondere wurde bei den Endothelzellen von Verzweigungen, die sich aus der Arteria mesenterica superior ergaben, eine starke Expression beobachtet (13B und 13E). Demgegenüber wurde PBSF/SDF-1 in hohen Niveaus in Mesenchymzellen, die die Endothelzellen des Mesenteriums umgeben, exprimiert, jedoch nicht in den Endothelzellen oder der Wand des Verdauungstrakts und Magens (13C).
Die 13A bis 13F sind Fotografien, die eine Analyse der CXCR4- und PBSF/SDF-1-Expression im Gastrointestinaltrakt durch in situ-Hybridisierung darstellen. Serielle Sektionen des Wildtyp-Mesenteriums, die die mittlere Verdauungstraktschleife verbinden, wurden verwendet; ein Stück wurde mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (13A und 13D); ein anderes Stück wurde mit der CXCR4-spezifischen Sonde hybridisiert (13B und 13E); ein zusätzliches Stück wurde mit PBSF/SDF-1-spezifischen Sonde hybridisiert (13E). Die 13D und 13E sind Vergrößerungen von verzweigten Gefäßen, die sich auf der Arterica mesenterica superior ergeben, wie dargestellt in den 13A und 13B und zeigen eine starke Expression von CXCR4 in Endothelzellen des Gefäßes. Die Pfeile und Pfeilspitzen in den 13B und 13E zeigen die Endothelzellen von Mesenteriumsblutgefäßen mit einer beobachteten CXCR4-Expression. PBSF/SDF-1 wird in den Mesenchymzellen exprimiert, die die Endothelzellen im Mesenterium umgeben (13E). 13F ist ein Querschnitt von Knochenmark des E18.5 Wildtyp-Embryos und zeigt die CXCR4-Expression in hämatopoetischen Zellen, jedoch nicht in spindelförmigen Stromazellen. "m" bedeutet Mesenterium, "i" bedeutet Verdauungstrakt, "a" bedeutet obere Mesenteriumsarterie; und "v" bedeutet obere Mesenteriumsvene.
Die erhaltenen Expressionsmuster zeigen an, dass von Mesenchymzellen erzeugtes PBSF/SDF-1 auf CXCR4 auf Endothelzellen wirkt und dies legt deutlich die Gegenwart eines parakrinen Signals durch ein Zytokin nahe, das eine extrem wichtige Rolle in dem Mesenteriumsmesenchym spielt. So kann sich ein Phänotyp, dem große Gefäße im Magen von CXCR4^–/– und PBSF/SDF-1^–/– fehlen, aus Abnormalitäten in der vaskulären Verzweigung und/oder Remodellierung im Mesenchym entlang der geringeren Kurvatur des Magen ergeben.
Um die vaskulären Systeme anderer Organe zu untersuchen, wurden ein Gesamtdottersack, Gehirn und Herz mit einem anti-PECAM-1-monoklonalen Antikörper gefärbt. Es gab keinen deutlichen Unterschied zwischen CXCR4^–/– und PBSF/SDF-1^–/– und dem Wildtyp bei der Bildung der großen und kleinen Gefäße in dem Dottersack (E12.5, E14.5), im Kopfbereich (E11.5) und dem Herzen (E12.5-E14.5).
Zusammengefasst haben die oben erwähnten experimentellen Ergebnisse gezeigt, dass CXCR4 und PBSF/SDF-1 für die Bildung eines reifen vaskulären Systems essentiell sind, das dem Gastrointestinaltrakt zugeführt wird durch Wirkung auf die Endothelzellen von Blutgefäßen und Regulierung der vaskulären Verzweigung und/oder Remodellierung.
Eine flusszytometrische Analyse ergab, dass die Zahl von B-Zellvorläufern in fötalen Lebern von CXCR4^–/–-Mäusen deutlich reduziert war. In der histologischen Analyse wurden keine Myelozyten und ihre Vorläufer in der medullären Höhlung nachgewiesen. Zusätzlich wurden Defekte des membranösen Teils des Herz-ventrikulären Septums in den Herzen von E18.5-mutierten Mäusen angetroffen. Diese Abnormalitäten sind sehr ähnlich zu dem Phänotyp, der bei den Mäusen angetroffen wird, denen PBSF/SDF-1 fehlt und unterstützt den Glauben, dass CXCR4 ein primärer physiologischer Rezeptor für PBSF/SDF-1 ist.
Bei dem E18.5-Wildtyp-embryonalen Knochenmark, wie durch in situ-Hybridisierung bestimmt, wurden CXCR4-Transkripte in hämatopoetischen Zellen exprimiert, während sie nicht in spindelförmigen Stromazellen exprimiert wurden, wo eine Expression von PBSF/SDF-1-Transkripten beobachtet worden war (3D). Die Ergebnisse dieser Expressionsmuster bedeuten die Gegenwart eines parakrinen Signals im Knochenmark.
Analysen der Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), wie z.B. Flk-1 und Tie-2, und ihrer Liganden, wie z.B. VEGF, Angiopoietin-1 und PDGF-B, über die bis jetzt berichtet wurde, wobei mutierte Mäuse verwendet wurden, haben angezeigt, dass sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des vaskulären Systems spielen und dass viele von ihnen auf einer sehr frühen Stufe der Vaskularisierung bei der Genese wie auch für die Vaskularisierung in allen Teilen des Körpers, einschließlich dem Dottersack und der Extraembryonalvaskulatur, benötigt werden. (Shalaby, F. et al., Nature 376, 62-66 (1995); Fong, G.-H., Rossant, J., Gertsenstein, M. & Breitman, M. L., Nature 376, 66-70 (1995); Dumount, D. H. et al., Genes Dev. 8, 1897-1909 (1994); Sato, T. N. et al., Nature, 376, 70-74 (1995); Carmeliet, P. et al., Nature, 880, 435-439 (1996); Ferrara, N. et al., Nature, 380, 439-442 (1996); und Suri, C. et al., Cell 87, 1171-1180 (1996)).
Demgegenüber wirken die Funktionen von CXCR4 und PBSF/SDF-1 auf spätere Stufen der Genese und sind organspezifisch. Tie-2 und sein Ligand, Angiopoietin-1, sind wohl für die Verzweigung und/oder Remodellierung in frühen vaskulären Systemen nötig. (Sato, T. N. et al., Nature 376, 70-74 (1995); Suri, C. et al., Cell 87, 1171-1180 (1996)). Ihre Rollen bei der Bildung des reifen vaskulären Systems im Gastrointestinaltrakt sind nicht klar. Eindeutige Abnormalitäten, die im Dottersack-vaskulären System von Tie-2 oder Angiopoietin-1^–/–-Mäusen angetroffen werden, wurden bei den CXCR4- oder PBSF/SDF-1^–/–-Mäusen nicht bemerkt. CXC-Chemokine, wie z.B. PF4 (Maione, T. E. et al., Science 247, 77-79 (1990)), IL-8 (Koch, A. E. et al., Science 258, 1798-1801 (1992)), IP-10 (Luster, A. D. et al., J. Exp. Med. 182, 219-231 (1995)), und Gro beta (Cao, Y. H., et al., J. J. Exp. Med. 182, 2069-2077 (1995)), sind wie berichtet Neovaskularisierungsregulatoren. Die Expression ihrer Rezeptoren in Endothelzellen und ihre physiologischen Rollen wurden jedoch noch nicht aufgeklärt. Obwohl der Koagulationsfaktor V (Cui, J., et al., Nature, 384, 66-68 (1996)) und der Gewebefaktor (Carmeliet, P. et al., Nature 883, 75-78 (1996)) offensichtlich für das Dottersackvaskuläre System essentiell sind, ist nicht klar, welche Art von Akzeptor diese Faktoren vermittelt.
Vor dem oben erwähnten Hintergrund kann festgehalten werden, dass diese Erfindung die Gegenwart eines neuen Signalisierungssystems – Chemokine und Sieben-Transmembranüberspannende, G-Protein-gekoppelter Rezeptoren – die für die Vaskularisierung essentiell sind, demonstriert hat.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass Mäuse, denen die α-Untereinheit des heterotrimeren GTP-bindenden Proteins Gα13 fehlte, Abnormalitäten aufweisen, wie z.B. keine Bildung des Dottersack-vaskulären Systems und eine Vergrößerung von embryonalen kleinen Gefäßen. Obwohl sich die Phänotypen von denjenigen von Mäusen unterscheiden, denen CXCR4 fehlt, ist es notwendig, die Möglichkeit der CXCR4-Kopplung an Gα13 zu untersuchen.
Es ist bekannt, dass CXCR4 und CCR5 essentielle Co-Rezeptoren sind, wenn T-Zelllinien-tropische bzw. Makrophagen-tropische HIV-1-Stämme Wirtszellen infizieren. (Feng, Y., et al., Science 272, 872-877 (1996); Fauci, A. S., Nature 884, 529-584 (1996)). Zwischen den beiden wurden die für eine CCR5-Deletion homozygoten Personen entdeckt, und sie sind gegen eine HIV-1-Infektion resistent und haben keine offensichtlichen Gesundheitsprobleme. (Liu, R et al., Cell 86, 367-377 (1996); Samson, M. et al., Nature 382, 722-725 (1996); und Dean, M. et al., Science 273, 1856-1861).
Betreffend das andere CXCR4, wurde jedoch intensiv vorgeschlagen, dass eine homologe CXCR4-Deletion vermutlich beim Menschen nicht auftritt, da Mäuse, denen CXCR4 fehlt, üblicherweise in der Gebärmutter sterben. Es bleibt immer noch die Möglichkeit, dass zusätzliche genetische Faktoren oder homologe lebensfähige Mutationen bei Langzeitüberlebenden existieren könnten, die gegen T-Zelllinientropisches HIV-1 resistent sind.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Basierend auf den Feststellungen dieser Erfindung, dass die Vaskularisierung bei CXCR4-Knockout-Mäusen unterdrückt ist, kann ein Vaskularisationsinhibitor, umfassend eine Substanz, die die Wirkung von CXCR4 inhibiert, als Wirkstoff hergestellt werden: da die Vaskularisierung für den Erhalt und die Vergrößerung von krebsartigen Geweben essentiell ist, wird diese Feststellung bei der Herstellung eines Mittels gegen festen Krebs verwendet und eines Therapeutikums für eine Erkrankung, die pathologisch durch eine Neovaskularisierung ausgelöst wird, das als Wirkstoff eine Substanz umfasst, die die Wirkung von CXCR4 inhibiert.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung einer Substanz, die die Wirkung aufgrund von CXCR4 inhibiert bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Vaskularisierung, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Substanz, die die Bindung zwischen SDF-1 und CXCR4 inhibiert; (2) einer Substanz, die die Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen inhibiert; (3) einer Substanz, die die Expression von CXCR4 inhibiert und (4) einer Substanz, die die Expression von SDF-1 inhibiert.
Verwendung einer Substanz, die die Wirkung aufgrund von CXCR4 inhibiert bei der Herstellung eines Medikaments für einen festen Krebs, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Substanz, die die Bindung zwischen SDF-1 und CXCR4 inhibiert; (2) einer Substanz, die die Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen inhibiert; (3) einer Substanz, die die Expression von CXCR4 inhibiert und (4) einer Substanz, die die Expression von SDF-1 inhibiert.
Verwendung einer Substanz, die die Wirkung aufgrund von CXCR4 inhibiert bei der Herstellung eines Medikaments für eine Erkrankung, die pathologisch durch Neuvaskularisierung ausgelöst wird, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Substanz, die die Bindung zwischen SDF-1 und CXCR4 inhibiert; (2) einer Substanz, die die Signalbildung von CXCR4 zu den Kernen inhibiert; (3) einer Substanz, die die Expression von CXCR4 inhibiert und (4) einer Substanz, die die Expression von SDF-1 inhibiert.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substanz SDF-1 inhibiert.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substanz CXCR4 inhibiert.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Substanz CXCR4 in antagonistischem Wettbewerb mit SDF-1 inhibiert.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Substanz SDF-1 an einer Bindung an CXCR4 durch Bindung an SDF-1 hindert.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Substanz eine solche ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem SDF-1-ähnlichen Protein, einem Fusionsprotein des vorstehenden Proteins mit einem anderen Peptid oder Polypeptid und einem Teilpeptid von SDF-1.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Substanz eine solche ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem anti-SDF-1-Antikörper, einem Fragment des Antikörpers, das die Aktivität des anti-SDF-1-Antikörpers besitzt, und einem Fusionsprotein, das die Bindungsaktivität an SDF-1 besitzt.
Verendung gemäß Anspruch 5, wobei die Substanz CXCR4 in antagonistischem Wettbewerb mit CXCR4 für die Bindung an SDF-1 inhibiert.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Substanz SDF-1 an einer Bindung an CXCR4 durch Bindung an CXCR4 inhibiert.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Substanz eine solche ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem löslichen CXCR4, das antagonistisch zu CXCR4 bei der Inhibition wirkt, einem Protein mit einer CXCR4-ähnlichen Struktur, einem Fusionsprotein des vorstehenden Proteins mit einem anderen Peptid oder Polypeptid und einem Teilpeptid von CXCR4.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die Substanz eine solche ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem anti-CXCR4-Antikörper, einem Fragment des Antikörpers, das die Aktivität des anti-CXCR4-Antikörpers besitzt, und einem Fusionsprotein, das die Bindungsaktivität an CXCR4 besitzt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substanz eine Substanz ist, die genau die Expression von CXCR4 inhibiert und eine solche ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Antisinn-Polynukleotid, einer Antisinn-RNA exprimiert durch einen Antisinn-Vektor, einem Ribozym und einem Inhibitor gegen die Expressionskontrollstelle von CXCR4.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substanz eine Antisinn-Substanz für die Inhibition der Expression von SDF-1 ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substanz eine Inhibition gegen die Expressionskontrollstelle von SDF-1 zeigt.