DE60131146T2

DE60131146T2 - Material und verfahren die hybridvaskularendothelwachstumfaktoren dns und proteine enthalten und screeningverfahren für modulatoren

Info

Publication number: DE60131146T2
Application number: DE60131146T
Authority: DE
Inventors: Kari Molecular/Cancer Biology Labora ALITALO; Markku M. Molecular JELTSCH
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Vegenics Ltd Toorak Victoria Au
Priority date: 2000-02-25
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2021-02-27
Also published as: US6965010B2; AU2001239884C1; ATE377081T1; AU2001239884B2; JP4981229B2; WO2001062942A2; US20090318352A1; DE60131146D1; US20050267024A1; US20020151680A1; AU3988401A; EP1259626A2; AU2006235995A1; EP1259626B1; US20080058263A1; US8278098B2; US7902149B2; US7566566B2; WO2001062942A3; JP2004507208A

Description

Die PDGF-Proteine und deren Rezeptoren (PDGFRs) sind an der Regulation der Zellproliferation, am Überleben und der Migration etlicher Zelltypen beteiligt. Die VEGF-Proteine und deren Rezeptoren (VEGFRs) spielen eine bedeutende Rolle sowohl bei der Vaskulogenese, der Entwicklung der embryonalen Vaskulatur aus frühen differenzierenden Endothelzellen, und der Angiogenese, dem Vorgang der Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden [Risau et al., Dev Biol 125 : 441–450 (1988); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30 : 1169–1174 (1998); Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999) Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)]. Beide Prozesse hängen von der/dem streng kontrollierten Endothelzell-Proliferation, -Migration, -Differenzierung und -Überleben ab. Die Fehlfunktion des Endothelzellregulationssystems ist ein Schlüsselmerkmal von Krebs und etlichen Krankheiten, die mit einer anormalen Angiogenese verbunden sind, wie beispielsweise proliferativen Retinopathien, altersbedingter Muskeldegeneration, rheumatoider Arthritis und Psoriasis. Das Verständnis der spezifischen biologischen Funktion der Schlüsselakteure, die an der Regulation von Endothelzellen beteiligt sind, wird zu effizienteren therapeutischen Anwendungen zur Behandlung solcher Erkrankungen führen [Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169–1174 (1998); Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999); Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)].
Die PDGF/VEGF-Familie
Die PDGF/VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren beinhaltet zumindest die folgenden Mitglieder: PDGF-A (siehe z.B. GenBank- Zugriffsnummer Q16889, hier aus Gründen der Klarheit als VEGF-A oder durch eine bestimmte Isoform bezeichnet), PlGF (siehe z.B. GenBank-Zugriffsnummer X54936, Plazentawachstumsfaktor), VEGF-B (siehe z.B. GenBank-Zugriffsnummer U48801; auch als bekannt als VEGF-verwandter Faktor (VEGF related factor, VRF)), VEGF-C (GenBank-Zugriffsnummer X94216; auch bekannt als VEGF-verwandtes Protein (VEGF related Protein, VRP)), VEGF-D (auch bekannt als c-fos-induzierter Wachstumsfaktor (FIGF); siehe z.B. GenBank-Zugriffsnummer S67522), NZ2 VEGF (auch bekannt als OV NZ2; siehe z.B. GenBank-Zugriffsnummer S67520), D1701 VEGF-artiges Protein (siehe z.B. GenBank-Zugriffsnummer AF106020; Meyer et al., EMBO J 18:363–374), und NZ10 VEGF-artiges Protein (beschrieben in der internationalen Patentanmeldung PCT/US99/25869 ) [Stacker und Achen, Growth Factors 17:1–11 (1999); Neufeld et al., FASER J 13:9–22 (1999); Ferrara, J Mol Med 77:527–543 (1999)].
Die Mitglieder der PDGF/VEGF-Familie sind gekennzeichnet durch eine Anzahl von Strukturmotiven, einschließlich einem konservierten PDGF-Motiv, das definiert ist durch die Sequenz: P-[PS]-C-V-X(3)-R-C-[GSTA]-G-C-C (SEQ ID NO: 1200). Die eckigen Klammern zeigen an, dass an dieser Position in dem Polypeptid jede der innerhalb der Klammern enthaltenen Aminosäuren stehen kann. Die in runden Klammern angegebene Ziffer zeigt die Zahl von Aminosäuren an, die den "V"- und "R"-Rest voneinander trennen. Dieses konservierte Motiv fällt in eine große Domäne von 70–150 Aminosäuren, die teilweise durch acht hochkonservierte Cystein-Reste definiert ist, die inter- und intramolekulare Disulfidbindungen bilden. Diese Domäne bildet ein Cystein-Knoten-Motiv, bestehend aus zwei Disulfidbindungen, die eine kovalent verknüpfte Ringstruktur zwischen zwei benachbarten β-Strängen bildet, und einer drit ten Disulfidbindung, die den Ring durchdringt [siehe zum Beispiel 1 in Muller et al., Structure 5: 1325–1338 (1997)], ähnlich derjenigen, die in anderen Cystein-Knoten-Wachstumsfaktoren, z.B. dem transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF β) gefunden wird. Die Aminosäuresequenz aller bekannten PDGF/VEGF-Proteine, mit Ausnahme von VEGF-E, enthält die PDGF-Domäne. Die Proteine der PDGF/VEGF-Familie sind vornehmlich sekretierte Glykoproteine, die entweder Disulfidverknüpfte oder nicht-kovalent gebundene Homo- oder Heterodimere bilden, deren Untereinheiten in einer antiparallelen Weise angeordnet sind [Stacker und Achen, Growth Factors 17: 1–11 (1999); Muller et al., Structure 5: 1325–1338 (1997)].
Die PDGF-Unterfamilie
Die PDGFs regulieren die Zellproliferation, das Zellüberleben und die Chemotaxis vieler Zelltypen in vitro (Überblick in Heldin et al., Biochimica et Biophysica Acta 1378: F79–113 (1998)]. Die beiden Ketten, die PDGF, PDGF-A und PDGF-B ausmachen, können homo- oder heterodimerisieren, wodurch drei verschiedene Isoformen gebildet werden: PDGF-AA, PDGF-AB oder PDGF-BB. PDGF-A ist lediglich in der Lage, den PDGF-α-Rezeptor (PDGFR-α) zu binden, wohingegen PDGF-B sowohl den PDGF-α- als auch einen zweiten PDGF-Rezeptor (PDGF-ß) binden kann. In vivo zeigen die PDGF-Proteine ihre Wirkungen in einer parakrinen Weise, da sie oft in epithelialen (PDGF-A) oder endothelialen (PDGF-B) Zellen in dichter Apposition zu den PDGF-Rezeptor exprimierendem Mesenchym exprimiert werden (Übersicht in Ataliotis et al., Int Rev Cytology 172: 95–127 (1997)]. Die Überexpression der PDGFs ist bei etlichen pathologischen Zuständen, einschließlich Malignitäten, Arteriosklerose und fibroproliferativen Erkrankungen, beobachtet worden. Bei in vitro angezogenen Tumorzellen und -zellinien erzeugte die Koexpression der PDGFs und PDGF-Rezeptoren autokrine Schleifen, die für die zelluläre Transformation wichtig sind [Betsholtz et al., Cell 39: 447–57 (1984); Keating et al., Science 239: 914–6 (1988)].
Die Bedeutung der PDGFs als Regulatoren der Zellproliferation und des Zellüberlebens ist durch Gen-Targeting-Untersuchungen an Mäusen gut illustriert worden. Homozygote Nullmutationen für entweder PDGF-A oder PDGF-B sind in Mäusen lethal. Ungefähr 50% der homozygoten PDGF-A-defizienten Mäuse haben einen früh lethalen Phänotyp, während die überlebenden Tiere einen komplexen postnatalen Phänotyp, mit Lungenemphysem aufgrund fehlerhafter Alveolarseptumbildung, und einen dermalen Phänotyp aufweisen, der durch dünne Dermis, missgestaltete Haarfollikel und dünnes Haar gekennzeichnet ist. PDGF-A wird auch für die normale Entwicklung von Oligodendrozyten und die anschließende Myelinisierung des Zentralnervensystems benötigt. Die PDGF-B-defizienten Mäuse entwickeln renale, hämatologische und kardiovaskuläre Abnormalitäten; wobei die renalen und kardiovaskulären Defekte zumindest teilweise auf das Fehlen korrekter Rekrutierung muraler Zellen (vaskulärer glatter Muskelzellen, Perizyten oder mesangialer Zellen) zu Blutgefäßen zurückzuführen sind.
Die VEGF-Unterfamilie
Die VEGF-Unterfamilie ist zusammengesetzt aus PDGF/VEGF-Mitgliedern, denen eine VEGF-Homologiedömäne (VHD) gemeinsam ist, die gekennzeichnet ist durch die Sequenz: C-X(22-24)-P[PSR]-C-V-X(3)-R-C-[GSTA]-G-C-C-X(6)-C-X(32-41)-C (SEQ ID NO: 1201). Die VHD-Domäne, bestimmt durch Analyse der VEGF-Unterfamilienmitglieder, umfasst das PDGF-Motiv, ist jedoch spezifischer.
VEGF-A wurde ursprünglich auf Basis seiner mitogenen Aktivität gegenüber Endothelzellen und auch anhand seiner Fähigkeit zur Induktion der mikrovaskulären Permeabilität aus verschiedenen Quellen gereinigt, und wird daher auch als vaskulärer Permeabilitätsfaktor (vascular permeability factor, VPF) bezeichnet. Es ist anschließend gezeigt worden, dass VEGF-A eine Reihe von biologischen Vorgängen induziert, einschließlich der Mobilisierung intrazellulären Kalziums, der Induktion der Plasminogenaktivator- und Plasminogenaktivatorinhibitor-1-Synthese, der Förderung der Monozytenmigration in vitro, der Induktion der antiapoptischen Proteinexpression in menschlichen Endothelzellen, der Induktion von Fenestrierungen in Endothelzellen, der Förderung der Zelladhäsionsmolekülexpression in Endothelzellen und der Induktion der durch Stickstoffdioxid vermittelten Vasodilatation und Hypotonie [Ferrara, J Mol Med 77:527–543 (1999); Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169–1174 (1998)].
VEGF-A ist ein aus 23 kDa-Untereinheiten zusammengesetztes sekretiertes, Disulfid-verknüpftes homodimeres Glykoprotein. Fünf menschliche VEGF-A-Isoformen mit einer Länge von 121, 145, 165, 189 oder 206 Aminosäuren (VEGF_121–206), kodiert durch verschiedene mRNA-Spleißvarianten, sind beschrieben worden, die sämtlich in der Lage sind, die Mitogenese in Endothelzellen zu stimulieren. Jede Isoform unterscheidet sich jedoch in der biologischen Aktivität, Rezeptorspezifität und Affinität für Zelloberflächen- und extrazellularmatrixassoziierte Heparansulfat-Proteoglykane, die sich wie niederaffine Rezeptoren für VEGF-A verhalten. VEGFR₁₂₁ bindet weder an Heparin noch an Heparansulfat; VEGF₁₄₅ und VEGF₁₆₅ (GenBank-Zugriffsnummer M32977) sind beide zur Bindung an Heparin befähigt; und VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ zeigen die stärkste Affinität für Heparin und Heparansulfat. VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅ und VEGF₁₆₅ werden in einer löslichen Form ausgeschieden, obwohl der größte Teil des VEGF₁₅₅ auf Zelloberflächen- und Extrazellularmatrix-Proteoglykane beschränkt ist, wohingegen VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ mit der extrazellulären Matrix assoziiert bleiben. Sowohl VEGF₁₈₉ als auch VEGF₂₀₅ können durch Behandlung mit Heparin oder Heparinase freigesetzt werden, was darauf hinweist, dass diese Isoformen über Proteoglykane an die extrazelluläre Matrix gebunden sind. Zellgebundenes VEGF₁₈₉ kann auch durch Proteasen wie beispielsweise Plasmin gespalten werden, was zur Freisetzung eines aktiven löslichen VEGF₁₁₀ führt. Die meisten Gewebe, die VEGF exprimieren, exprimieren mehrere VEGF-Isoformen gleichzeitig, obwohl VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅ die vorherrschenden Formen sind, wohingegen VEGF₂₀₆ selten festgestellt wird [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)]. VEGF₁₄₂ unterscheidet sich darin, dass es primär in Zellen exprimiert wird, die sich von Fortpflanzungsorganen ableiten [Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999)].
Das Muster der VEGF-A-Expression legt seine Beteiligung an der Entwicklung und Erhaltung des normalen Gefäßsystems und an der mit Tumorwachstum und anderen pathologischen Zuständen wie beispielsweise rheumatoider Arthritis verbundenen Angiogenese nahe. VEGF-A wird in embryonalen Geweben, die mit dem sich entwickelnden Gefäßsystem verbunden sind, exprimiert und wird durch zahlreiche Tumorzelllinien sekretiert. Die Analyse von Mäusen, bei denen VEGF-A durch gezielte Genzerstörung ausgeschaltet wurde, zeigt, dass VEGF-A kritisch für das Überleben ist, und dass die Entwicklung des kardiovaskulären Systems gegenüber VEGF-A-Konzentrationsgradienten hoch empfindlich ist. Mäusen, denen eine einzelne Kopie von VEGF-A fehlt, sterben zwischen Tag 11 und 12 der Gestation. Diese Embryos zeigen ein beeinträchtigtes Wachstum und etliche Entwicklungsanormalitäten, einschließlich Defekten in der Entwicklung der sich entwickelnden Kardiovaskulatur. VEGF-A wird auch postnatal für das Wachstum, die Organentwicklung, die Regulation der Wachstumsplatten-Morphogenese und der endochondralen Knochenbildung benötigt. Der Bedarf an VEGF-A erhöht sich mit dem Alter, insbesondere nach der vierten postnatalen Woche. Bei erwachsenen Tieren ist VEGF-A primär für die aktive Angiogenese bei Vorgängen wie beispielsweise der Wundheilung und der Entwicklung des Corpus luteum erforderlich. [Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999); Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)]. Die VEGF-A-Expression wird primär durch Hypoxie und eine Reihe von Hormonen und Zytokinen, einschließlich des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), TGF-β und verschiedenen Interleukinen, beeinflusst. Die Regulation erfolgt transkriptionell und auch posttranskriptionell, beispielsweise durch erhöhte mRNA-Stabilität [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)].
PlGF, ein zweites Mitglied der VEGF-Unterfamilie, ist im Vergleich zu VEGF-A im Allgemeinen ein schlechter Stimulator der Angiogenese und der Endothelzellen-Proliferation, und die Rolle von PlGF in vivo wird nicht gut verstanden. Drei Isoformen von PlGF, hergestellt durch alternatives mRNA-Spleißen, sind beschrieben worden [Hauser et al., Growth Factors 9: 259–268 (1993); Maglione et al., Oncogene 8: 925–931 (1993)]. PlGF bildet mit VEGF-A sowohl Disulfid-verknüpfte Homodimere als auch Heterodimere. Die PlGF-VEGF-A-Heterodimere sind bei der Induzierung der Endothelzell-Proliferation und Angiogenese wirksamer als die PlGF-Homodimere. PlGF wird primär in der Plazenta exprimiert, und wird während der frühen Embryogenese auch zusammen mit VEGF-A in den trophoblastischen Riesenzellen des parietalen Dottersacks exprimiert [Stacker und Achen, Growth Factors 17: 1–11 (1999)].
VEGF-B, im Detail in der Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 96/26736 und den U.S.-Patenten 5.840.693 und 5.607.918 beschrieben, hat ungefähr 44% Aminosäureidentität mit VEGF-A gemeinsam. Obwohl die biologischen Funktionen von VEGF-B in vivo weiterhin unvollständig verstanden werden, ist gezeigt worden, dass es angiogene Eigenschaften aufweist, und auch an der Zelladhäsion und -Migration und an der Regulation des Abbaus der extrazellulären Matrix beteiligt sein kann. Es wird in zwei Isoformen von 167 und 186 Aminosäureresten exprimiert, die durch alternatives Spleißen erzeugt werden. VEGF-B₁₆₇ ist über eine Heparinbindende Domäne mit der Zelloberfläche oder der extrazellulären Matrix assoziiert, wohingegen VEGF-B₁₈₆ sekretiert wird. Sowohl VEGF-B₁₆₇ als auch VEGF-B₁₈₆ können Disulfid-verknüpfte Homodimere oder Heterodimere mit VEGF-A bilden. Die Verbindung von VEGF-B₁₆₅-VEGF-B186-Heterodimeren mit der Zelloberfläche scheint durch die VEGF-B-Komponente bestimmt zu werden, was nahelegt, dass die Heterodimerisierung für die Sequestrierung von VEGF-A wichtig sein kann. VEGF-B wird primär in embryonalen und adulten Herz- und Skelettmuskelgeweben exprimiert [Joukov et al., J Cell Physiol 173: 211–215 (1997); Stacker und Achen, Growth Factors 17: 1–11 (1999)]. Mäuse, denen VEGF-B fehlt, überleben, besitzen jedoch kleinere Herzen, eine dysfunktionale koronare Vaskulatur und zeigen eine beeinträchtigte Erholung von Herzischämie [Bellomo et al., Circ Res 2000; E29–E35].
Ein viertes Mitglied der VEGF-Unterfamilie, VEGF-C, umfasst eine VHD, die auf dem Aminosäureniveau ungefähr 30% identisch zu VEGF-A ist. VEGF-C wird ursprünglich als ein größeres Vor läuferprotein, Präpro-VEGF-C, exprimiert, das umfangreiche, die VHD flankierende amino- und carboxyterminale Peptidsequenzen aufweist, wobei das C-terminale Peptid tandemartig wiederholte Cystein-Reste in einem Motiv enthält, das für Balbiani-Ring-3-Protein typisch ist. Präpro-VEGF-C durchläuft eine umfangreiche proteolytische Reifung, die die aufeinander folgende Spaltung eines Signalpeptids, des C-terminalen Propeptids und des N-terminalen Propeptids beinhaltet. Sekretiertes VEGF-C-Protein besteht aus einem nichtkovalent verknüpften Homodimer, bei dem jedes Monomer die VHD enthält. Die durch partielles proteolytisches Processing hergestellten intermediären Formen von VEGF-C zeigen eine zunehmende Affinität für den VEGFR-3-Rezeptor, und das reife Protein ist auch in der Lage, an den VEGFR-2-Rezeptor zu binden. [Joikov et al., EMBO J., 16(13): 3898–3911 (1997)]. Es ist auch gezeigt worden, dass ein mutiertes VEGF-C, bei dem ein einzelnes Cystein an Position 156 entweder durch eine andere Aminosäure ersetzt oder deletiert ist, die Fähigkeit verliert, VEGFR-2 zu binden, jedoch in der Lage bleibt, VEGFR-3 zu binden und zu aktivieren [Publikation der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/33917 ]. Bei Hausembryos wird VEGF-C-mRNA primär in der Allantois, im Halsbereich und im Metanephros exprimiert. [Joukov et al., J Cell Physiol 173: 211–215 (1997)]. VEGF-C ist an der Regulation der lymphatischen Angiogenese beteiligt: wenn VEGF-C in der Haut von transgenen Mäusen überexprimiert wurde, wurde ein hyperplastisches lymphatisches Gefäßnetzwerk beobachtet, was darauf hindeutet, dass VEGF-C lymphatisches Wachstum induziert [Jeltsch et al., Science, 276: 1423–1425 (1997)]. Die fortgesetzte Expression von VEGF-C im Erwachsenen deutet auch auf eine Rolle bei der Erhaltung von differenziertem lymphatischen Endothel hin [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)]. VEGF-C zeigt auch angiogene Eigenschaften: es kann die Migration von kapillären Rinderendothelzellen (bovine capillary endothelial (BCE) cells) in Kollagen stimulieren und das Wachstum von menschlichen Endothelzellen fördern [siehe z.B. die Publikation der internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/33917 , die hier durch Inbezugnahme aufgenommen ist].
VEGF-D ist strukturell und funktionell am nächsten mit VEGF-C verwandt [siehe die Publikation der internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/07832 , durch Inbezugnahme hier aufgenommen]. Wie VEGF-C, wird VEGF-D anfänglich als Präpro-Peptid exprimiert, das einem N-terminalen und C-terminalen proteolytischen Processing unterzogen wird, und nichtkovalent verknüpfte Dimere bildet. VEGF-D stimuliert in vitro mitogene Reaktionen bei Endothelzellen. Während der Embryogenese wird VEGF-D in einem komplexen zeitlichen und räumlichen Muster exprimiert und seine Expression dauert in Herz, Lunge und Skelettmuskeln bei Erwachsenen an. Die Isolierung eines biologisch aktiven Fragments von VEGF-D, das als VEGF-DΔNΔC bezeichnet wird, ist in der Publikation der internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/07832 , die hier durch Inbezugnahme aufgenommen ist, beschrieben. VEGF-DΔNΔC besteht aus den Aminosäureresten 93 bis 201 von VEGF-D, geknüpft an das Affinitätsmarkerpeptid FLAG^®.
Vier weitere Mitglieder der VEGF-Unterfamilie sind bei Poxviren identifiziert worden, die Menschen, Schafe und Ziegen infizieren. Der Orf-Virus-kodierte VEGF-E und NZ-VEGF sind potente Mitogene und permeabilitätsverstärkende Faktoren. Beide zeigen ungefähr 25% Aminosäureidentität mit Säugetier-VEGF-A, und werden als Disulfid-verknüpfte Homodimere exprimiert. Die Infektion durch diese Viren ist gekennzeichnet durch eine pustuläre Dermatitis, die eine Endothelzellen-Proliferation und eine Gefäßpermeabilität beinhalten kann, die durch diese viralen VEGF-Proteine induziert wurde. [Ferrara, J MoI Med 77: 527–543 (1999); Stacker und Achen, Growth Factors 17: 1–11 (1999)]. VEGF-artige Proteine sind auch bei zwei weiteren Stämmen des Orf-Virus, D1701 [GenBank-Zugriffsnummer AF106020; beschrieben in Meyer et al, EMBO J 18: 363–374 (1999)] und NZ10 [beschrieben in der internationalen Patentanmeldung PCT/US99/25869 , durch Inbezugnahme hier aufgenommen] identifiziert worden. Von diesen viralen VEGF-artigen Proteinen wurde gezeigt, dass sie VEGFR-2 binden, der auf Wirtsendothel vorhanden ist, und diese Bindung wichtig für die Infektionsentwicklung und die virale Induktion der Angiogenese ist [Meyer et al., EMBO J 18: 363–374 (1999); Internationale Patentanmeldung PCT/US99/25869 ].
PDGFR/VEGF-Rezeptoren
Sieben Zelloberflächenrezeptoren, die mit PDGF/VEGF-Familienmitgliedern Wechselwirken, sind identifiziert worden. Diese beinhalten PDGFR-α (siehe z.B., GenBank Zugr.-Nr. NM006206), PDGFR-β (siehe z.B., GenBank Zugr.-Nr. NM002609), VEGFR-1/Flt-1 (fms-artige Tyrosinkkinase-1; GenBank Zugr.-Nr. X51602; De Vries et al., Science 255: 989–991 (1992)); VEGFR-2/KDR/Flk-1 (Kinase-Insertionsdomänen-haltiger Rezeptor/fötale Leberkinase-1; GenBank Zugr.-Nrn. X59397 (Flk-1) und L04947 (KDR); Tennan et al., Biochem Biophys Res Comm 187: 1579–1586 (1992); Matthew et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 9026–9030 (1991)); VEGFR-3/Flt4 (fms-artige Tyrosinkinase 4 ; U.S.-Patent Nr. 5.776.755 und GenBank Zugr.-Nr. X68203 und 566407; Pajusola et al., Oncogene 9: 3545–3555 (1994)), Neuropilin-1 (GenBank Zugr.-Nr. NM003873), und Neuropilin-2 (GenBank Zugr.-Nr. NM003872). Die beiden PDGF-Rezeptoren vermitteln die Signalübertragung von PDGFs wie oben beschrieben. VEGF₁₂₁, VEGF₁₆₅, VEGF-B, PlGF-1 und PlGF-2 binden VEGF-R1; VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E und NZ2-VEGF binden VEGF-R2; VEGF-C und VEGF-D binden VEGFR-3; VEGF₁₆₅, PlGF-2 und NZ2-VEGF binden Neuropilin-1; und VEGF₁₆₅ bindet Neuropilin-2. [Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999); Stacker und Achen, Growth Factors 17: 1–11 (1999); Ortega et al., Fron Biosci 4: 141–152 (1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169–1174 (1998); Petrova et al., Exp Cell Res 253: 117–130 (1999)].
Die PDGF-Rezeptoren sind Protein-Tyrosinkinaserezeptoren (PTKs), die fünf Immunglobulin-artige Schleifen in ihren extrazellulären Domänen aufweisen. VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 umfassen eine Untergruppe der PDGF-Unterfamilie von PTKs, die sich durch die Anwesenheit von sieben Ig-Domänen in ihrer extrazellulären Domäne und eine Split-Kinase-Domäne in der zytoplasmatischen Region unterscheiden. Sowohl Neuropilin-1 als auch Neuropilin-2 sind Nicht-PTK-VEGF-Rezeptoren. NP-1 besitzt einen extrazellulären Bereich, der eine MAN-Domäne; Homologieregionen zu den Gerinnungsfaktoren V und VIII, MFGPs und der DDR-Tyrosinkinase; und zwei CUB-artige Domänen beinhaltet.
Mehrere der VEGF-Rezeptoren werden in mehr als einer Isoform exprimiert. Eine lösliche Isoform von VEGFR-1, der die siebente Ig-artige Schleife, die Transmembrandomäne und die zytoplasmatische Region fehlt, wird in Endothelzellen humaner Nabelvenen exprimiert. Diese VEGFR-1-Isoform bindet VEGF-A mit hoher Affinität und ist in der Lage, VEGF-A-induzierte mitogene Reaktionen zu verhindern [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169–1174 (1998)]. Eine C-terminal trunkierte Form von VEGFR-2 ist ebenfalls beobachtet worden [Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169–1174 (1998)]. Beim Menschen existieren zwei Isofor men des VEGFR-3-Proteins, die sich in der Länge ihrer C-terminalen Enden unterscheiden. Studien legen nahe, dass die längere Isoform für die meisten biologischen Eigenschaften von VEGFR-3 verantwortlich ist.
Die Rezeptoren für die PDGFs, PDGF-α-Rezeptor (PDGFR-α) und der β-Rezeptor (PDGFR-β) werden in vielen in vitro angezogenen Zellinien exprimiert, und werden in vivo hauptsächlich durch mesenchymale Zellen exprimiert (beschrieben in [Raines et al., Peptide growth factors and their receptors, Heidelberg, Springer-Verlag (1990)]. Wie oben erwähnt, bindet PDGF-B beide PDGFRs, während PDGF-A PDGFR-α selektiv bindet.
Gen-Targeting-Untersuchungen an Mäusen haben, ungeachtet der überlappenden Ligandenspezifitäten der PDGFRs, eindeutige physiologische Rollen für die PDGF-Rezeptoren ergeben [Rosenkranz et al., Growth Factors 16: 201–16 (1999)]. Homozygote Nullmutationen für einen der PDGF-Rezeptoren sind letal. PDGFR-α-defiziente Mäuse sterben während der Embryogenese bei e10 und zeigen unvollständigen Schädelschluss, beeinträchtigte Neuralleistenentwicklung, Skelettdefekte und Ödeme. Die PDGFR-β-defizienten Mäuse entwickeln Phänotypen, die denen von Tieren mit PDGF-B-Mangel ähneln, die gekennzeichnet sind durch renale, hämatologische und kardiovaskuläre Abnormalitäten; wobei die renalen und kardiovaskulären Defekte zumindest teilweise auf das Fehlen einer geeigneten Rekrutierung von muralen Zellen (Gefäß-Glattmuskelzellen, Perizyten oder mesangiale Zellen) zu Blutgefäßen zurückzuführen ist.
Die Expression von VEGFR-1 erfolgt hauptsächlich in Gefäßendothelzellen, obwohl einige auch auf Monozyten, Trophoblastenzellen und renalen mesangialen Zellen zugegen sein können [Neufeld et al., FASEB J 13 : 9–22 (1999)]. Hohe Ni veaus von VEGFR-1-mRNA werden auch in adulten Organen festgestellt, was darauf hindeutet, dass VEGFR-1 eine nicht mit dem Zellwachstum verbundene Funktion in ruhendem Endothel von reifen Gefäßen hat. VEGFR-1-/-Mäuse sterben in utero zwischen Tag 8,5 und 9,5. Obwohl sich bei diesen Tieren Endothelzellen entwickelten, war die Bildung funktionsfähiger Blutgefäße stark beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass VEGFR-1 an Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Wechselwirkungen, die mit der Zellmigration verbunden sind, beteiligt ist. Kürzlich wurde gezeigt, dass Mäuse, die ein mutiertes VEGFR-1 exprimieren, bei dem lediglich die Tyrosinkinasedomäne fehlte, normale Angiogenese und normales Überleben zeigen, was darauf hindeutet, dass die Signalgebungsfähigkeit von VEGFR-1 nicht wesentlich ist [Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999); Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)].
Die VEGFR-2-Expression ähnelt derjenigen von VEGFR-1 darin, dass er allgemein im Gefäßendothel exprimiert wird, er ist jedoch auch in hämatopoetischen Stammzellen, Megakaryozyten und retinalen Vorläuferzellen vorhanden [Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999)]. Obwohl die Expressionsmuster von VEGFR-1 und VEGFR-2 ausgedehnt überlappen, deuten Hinweise darauf hin, dass VEGFR-2 in den meisten Zelltypen der Hauptrezeptor ist, durch den die meisten der VEGFs ihre biologischen Aktivitäten ausüben. Die Untersuchung von Mausembryos mit einem VEGFR-2-Mangel zeigt darüber hinaus, dass dieser Rezeptor sowohl für die Endothelzelldifferenzierung als auch die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen erforderlich ist [Joukov et al., J Cell Physiol 173: 211–215 (1997)].
VEGFR-3 wird während der frühen Embryogenese allgemein in Endothelzellen exprimiert. Im Verlauf späterer Stadien der Entwicklung wird die Expression von VEGFR-3 auf sich entwickeln de Lymphgefäße beschränkt [Kaipainen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3566–3570 (1995)]. Bei Adulten exprimieren lymphatische Endothelien und einige Hochendothelvenolen VEGFR-3, und eine erhöhte Expression tritt in lymphatischen Sinusen in metastatischen Lymphknoten und beim Lymphangiom auf. VEGFR-3 wird auch in einer Untergruppe von hämatopoetischen CD34⁺-Zellen exprimiert, die die myelopoetische Aktivität von VEGF-C vermitteln können, wie durch Überexpressionsstudien gezeigt wurde [ WO 98/33917 ]. Zielgerichtete Zerstörung des VEGFR-3-Gens in Mausembryos führt zum Versagen der Remodellierung des primären Gefäßnetzwerks und zum Tod nach dem embryonalen Tag 9,5 [Dumont et al., Science, 282: 946–949 (1998)]. Diese Studien weisen auf eine wichtige Rolle für VEGFR-3 bei der Entwicklung der embryonalen Vaskulatur und auch während der Lymphangiogenese hin.
Strukturelle Analysen der VEGF-Rezeptoren deuten darauf hin, dass die VEGF-A-Bindungsstelle bei VEGFR-1 und VEGFR-2 in der zweiten und dritten Ig-artigen Schleife lokalisiert ist. Gleichermaßen sind die VEGF-C und VEGF-D-Bindungsstellen auf VEGFR-2 und VEGFR-3 ebenfalls innerhalb der zweiten Ig-Schleife enthalten [Taipale et al., Curr Top Microbiol Immnunol 237: 85–96 (1999)]. Die zweite Ig-artige Schleife vermittelt auch die Ligandenspezifität, wie durch Domänenaustauschexperimente gezeigt wurde [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)]. Rezeptor-Liganden-Studien weisen darauf hin, dass durch Proteine der VEGF-Familie gebildete Dimere in der Lage sind, zwei VEGF-Rezeptormoleküle zu binden, wodurch VEGF-Rezeptoren dimerisiert werden. Die vierte Ig-artige Schleife bei VEGFR-1, und möglicherweise auch bei VEGFR-2, fungiert als Rezeptordimerisierungsdomäne, die zwei Rezeptormoleküle bei Bindung der Rezeptoren an ein Ligandendimer verknüpft [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999)]. Obwohl die Regionen von VEGF-A, die VEGFR-1 und VEGFR-2 binden, weitgehend überlappen, ergaben Studien zwei separate Domänen innerhalb vom VEGF-A, die entweder mit VEGFR-1 oder VEGFR-2 interagieren, sowie spezifische Aminosäurereste innerhalb dieser Domänen, die für die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen kritisch sind. Mutationen innerhalb einer VEGF-Rezeptor-spezifischen Domäne, die die Bindung eines bestimmten VEGF-Rezeptors spezifisch verhindern, sind ebenfalls entdeckt worden [Neufeld et al., FASER J 13: 9–22 (1999)].
VEGFR-1 und VEGFR-2 sind strukturell ähnlich, haben gemeinsame Liganden (VEGF₁₇₁ und VEGF₁₆₅) und zeigen ähnliche Expressionsmuster während der Entwicklung. Die durch VEGFR-1 und VEGFR-2 durch denselben Liganden vermittelten Signale scheinen jedoch leicht unterschiedlich zu sein. Von VEGFR-2 wurde gezeigt, dass er in Reaktion auf VEGF-A eine Autophosphorylierung durchmacht, währende eine Phosphorylierung von VEGFR-1 unter identischen Bedingungen jedoch kaum detektierbar. VEGFR-2-vermittelte Signale verursachen auffällige Veränderungen in der Morphologie, der Aktinreorganisation und der Membrankräuselung von Schweine-Aortaendothelzellen, die diesen Rezeptor rekombinant überexprimieren. In diesen Zellen vermittelte VEGFR-2 auch die ligandeninduzierte Chemotaxis und Mitogenität; wohingegen VEGFR-1-transfizierten Zellen mitogene Reaktionen auf VEGF-A fehlten. Mutationen in VEGF-A, die die Bindung an VEGFR-2 zerstören, induzieren die Proliferation von Endothelzellen nicht, wohingegen VEGF-A-Mutanten, die hinsichtlich der Bindung an VEGFR-1 defizient sind, nach wie vor in der Lage sind, die endotheliale Proliferation zu fördern. Gleichermaßen führt die VEGFR-Stimulation von Zellen, die nur VEGFR-2 exprimieren, zu einer mitogenen Reaktion, wohingegen eine vergleichbare Stimulierung von Zellen, die nur VEGFR-1 exprimieren, auch zu einer Zellmigration führt, die Zellproliferation jedoch nicht induziert. Darüber hinaus unterscheiden sich Phosphoproteine, die mit VEGFR-1 und VEGFR-2 kopräzipitieren, was darauf hindeutet, dass verschiedene Signalmoleküle mit rezeptorspezifischen intrazellulären Sequenzen Wechselwirken.
Die sich daraus ergebende Hypothese ist, dass die primäre Funktion von VEGFR-1 bei der Angiogenese darin bestehen kann, die Aktivität von VEGF-A durch dessen Bindung negativ zu regulieren und auf diese Weise seine Wechselwirkung mit VEGFR-2 zu verhindern, wohingegen von VEGFR-2 angenommen wird, dass er der Hauptvermittler von VEGF-A-Signalen in Endothelzellen ist. Diese Hypothes wird dadurch unterstützt, dass Mäuse, die hinsichtlich VEGFR-1 defizient sind, als Embryos sterben, während Mäuse, die einen VEGFR-1-Rezeptor exprimieren, der in der Lage ist, VEGF-A zu binden, dem jedoch die Tyrosinkinasedomäne fehlt, überleben und keine anormale embryonale Entwicklung oder Angiogenese zeigen. Darüber hinaus zeigen Analysen von VEGF-A-Mutanten, die nur VEGFR-2 binden, dass sie die Fähigkeit bewahren, mitogene Reaktionen in Endothelzellen zu induzieren. Die VEGF-vermittelte Migration von Monozyten ist jedoch abhängig von VEGFR-1, was darauf hindeutet, dass die Signalübertragung durch diesen Rezeptor für zumindest eine biologische Funktion wichtig ist. Darüber hinaus ist die Fähigkeit von VEGF-A, die Reifung von dendritischen Zellen zu verhindern, auch verbunden mit der VEGFR-1-Signalübertragung, was darauf hindeutet, dass VEGFR-1 in anderen Zelltypen als Endothelzellen eine Funktion ausüben kann [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169–1174 (1998)].
Neuropilin-1 wurde ursprünglich als ein Rezeptor für die Familie von Collapsin/Semaphorin-Proteinen, die an der Axonlen kung beteiligt sind, kloniert [Stacker und Achen, Growth Factors 17: 1–11 (1999)]. Es wird sowohl in Endothelien als auch spezifischen Untergruppen von Neuronen während der Embryogenese exprimiert, und es wird angenommen, dass es an der Koordination der Entwicklung des neuronalen und vaskulären Systems beteiligt ist. Obwohl die Aktivierung von Neuropilin-1 in Abwesenheit von Tyrosinkinase-Rezeptoren der VEGF-Familie keine biologischen Reaktionen auszulösen scheint, führt ihre Anwesenheit auf Zellen zur effizienteren Bindung von VEGF₁₆₅ und zu VEGFR-2-vermittelten Reaktionen [Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999)].
Neuropilin-2 wurde durch Expressionsklonierung identifiziert und ist ein Collapsin/Semaphorin-Rezeptor, der eng mit Neuropilin-1 verwandt ist. Neuropilin-2 ist dahingehend ein Isoform-spezifischer VEGF-Rezeptor, dass er lediglich VEGF₁₆₅ bindet. Wie Neuropilin-1 wird Neuropilin-2 sowohl in Endothelien als auch bestimmten Neuronen exprimiert, und soll aufgrund seiner vergleichsweise kurzen intrazellulären Domäne nicht unabhängig fungieren. Die Funktion von Neuropilin-2 bei der Gefäßentwicklung ist unbekannt [Neufeld et al., FASEB J 73: 9–22 (1999); WO 99/30157 ].
Therapeutische Anwendungen von VEGF-Polypeptiden und -Antagonisten
Die Entdeckung von VEGF-A als Schlüsselregulator der Gefäßentwicklung hat die aktive Forschung unter Einsatz von VEGF-basierter therapeutischer Angiogenese in der kardiovaskulären Medizin sowie hinsichtlich der Behandlung von Krankheiten, die durch pathologische Angiogenese gekennzeichnet sind, mit VEGF-Antagonisten, angespornt. Die anschließende Identifikation weiterer VEGF-Proteine der VEGF-Familie und deren Rolle bei der Vaskularisierung haben auch zu der Entwicklung von Therapien geführt, die auf diesen Wachstumsfaktoren basieren [Ferrara und Alitalo, Nature Med 5: 1359–1364 (1999)]. Tierversuche zur Ischämie hinterer Gliedmaßen und Myokardischämie unter Verwendung von VEGF-A oder VEGF-C, zugeführt durch Verabreichung von rekombinantem Protein oder Gentransfer unter Verwendung nackter DNA oder adenoviraler Vektoren, bringen diese Moleküle in Verbindung mit der Förderung der Vaskularisierung und der Erhöhung des koronaren Blutflusses. Diese viel versprechenden Ergebnisse haben zu klinischen Versuchen geführt, bei denen Patienten mit Gliedmaßenischämie durch arteriellen oder intramuskulären Gentransfer nackter VEGF₁₆₅ kodierender DNA behandelt wurden. Patienten mit Myokardischämie oder Burger-Krankheit (Thromboangiitis obliterans) wurde ebenfalls lokal VEGF₁₅₅-Plasmid DNA injiziert. Obwohl diese Versuche nicht plazebokontrolliert waren, zeigten die Patienten klinische Verbesserungen und Hinweise auf Angiogenese in Ischämiegeweben. Versuche, die den Gentransfer von nackter VEGF-C-DNA oder Gentherapie mit VEGF₁₂₁ unter Verwendung adenoviraler Vektoren zur Behandlung von Patienten mit Myokardischämie einsetzen, befinden sich gegenwärtig in Phase I [Ferrara, J Mol Med 77: 527–543 (1999); Neufeld et al., FASEB J 13: 9–22 (1999); Ferrara und Alitalo, Nature Med 5: 1359–1364 (1999)]. Die therapeutischen Wirkungen der Verabreichung rekombinanten VEGF-A-Proteins werden auch in laufenden klinischen Versuchen getestet. Ergebnisse aus Phase-I-Studien von Patienten mit Koronarischämie, die mit einer intrakoronaren Infusion von rekombinantem VEGF₁₆₅ behandelt wurden, zeigen Hinweise auf eine verbesserte Perfusion und Kollateralisierung. Bei den anschließenden Phase-II-Studien zeigten die Patienten jedoch keine signifikante Verbesserung gegenüber der plazebokontrollierten Gruppe. Andere potentielle therapeutische Verwendungen für die VEGF-Wachstumsfaktoren beinhalten die Verwendung von VEGF-C zur Förderung der Lymphangiogenese bei Patienten, deren axilläre Lymphknoten bei einer Brustkrebsoperation entfernt wurden. Therapien unter Verwendung von Kombinationen von Wachstumsfaktoren zur Förderung der Vaskularisierung bei Geweben können sich ebenfalls als vorteilhaft bei der Behandlung bestimmter Krankheiten erweisen [Ferrara und Alitalo, Nature Med 5: 1359–1364 (1999)].
Therapien, die auf der Hemmung der Aktivität von VEGF-Wachstumsfaktoren basieren, werden getestet, um Krankheitszustände zu behandeln, die durch pathologische Angiogenese gekennzeichnet sind. Die VEGF-Expression wird bei den meisten menschlichen Tumoren, einschließlich primärem Brustkrebs und Magenkrebs, hochreguliert. Studien bei Mausen zeigen, dass die Tumor-assoziierte Angiogenese und das Wachstum von Tumorzellen durch Behandlung der Tiere mit monoklonalen Antikörpern gegen VEGF-A gehemmt werden kann. Weitere Tierversuche zeigten, dass die Expression einer dominant negativen VEGFR-2-Mutante, die die Signalübertragung durch diesen Rezeptor verhindert, oder die Verabreichung von rekombinanten VEGFR-1- oder VEGFR-2-Mutanten, die lediglich den extrazellularen Teil dieser Rezeptoren enthalten, das Wachstum etlicher Tumorzelllinien supprimiert. Diese ermutigenden Ergebnisse führten zu klinischen Versuchen unter Verwendung humanisierter hochaffiner monoklonaler Antikörper gegen VEGF-A (rhuMAk VEGF) als VEGF-A-Inhibitoren. Phase-II-Studien unter Verwendung von rhuMAk-VEGF zur Behandlung des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms, kolorektalen Karzinoms, Brust- und Nierenzellkarzinoms laufen derzeit. Verbindungen, die auf die Hemmung der VEGF-C-Aktivität gerichtet sind, werden ebenfalls auf therapeutische Verwendung bei Krebspatienten getestet: kleinmolekulare Inhibitoren von VEGF-C befinden sich in Phase-II- Versuchen und monoklonale Antikörper gegen VEGF-C treten in klinische Versuche ein.
Retinopathie, die mit Diabetes mellitus, Verschluss der retinalen Vene oder Frühgeburten verbunden ist, ist mit erhöhten Niveaus von VEGF-A korreliert worden. Tierversuche unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen VEGF-A oder löslicher VEGFR-1- oder vor VEGFR-2-Mutanten, die lediglich die extrazelluläre Domäne enthalten, fusioniert an die Immunglobulin-γFc-Domäne, zeigen eine Suppression der retinalen Angiogenese. VEGF-A wird auch bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) festgestellt, und seine Expression wird als Ursache für die Neovaskularisierung bei dieser Erkrankung angenommen. Die intravitreale Zufuhr von rekombinantem humanisierten Anti-VEGF-A-Fab-Antikörper-Fragment oder die Injektion von 2'Fluorpyrimidin-RNA-Oligonukleotid-Liganden (Aptameren) zur Behandlung von AMD befinden sich gegenwärtig in klinischen Versuchen. Verbindungen, die die Aktivität von VEGF-Wachstumsfaktoren hemmen, können auch verwendet werden, um andere Krankheitszustände zu behandeln, die eine anomale Angiogenese beinhalten. Diese beinhalten Ischämie/Reperfusionsbedingte Hirnödeme und -schäden, Zustände, die mit Ovarhyperplasie und Hypervaskularität verbunden sind, wie beispielsweise das polyzystische Ovarsyndrom, Endometriose und ovarielles Hyperstimulationssyndrom [Ferrara und Alitalo, Nature Med 5: 1359–1364 (1999)].
Aus der vorstehenden Diskussion wird ersichtlich, dass die VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren, und Inhibitoren davon, ein enormes Potenzial als Therapeutika aufweist. Zum Beispiel sind solche Wachstumsfaktoren und Inhibitoren nützlich zur Förderung oder Hemmung der Angiogenese, soweit erforderlich, wie beispielsweise bei der Behandlung von Ischämie-Funktions störungen, der Förderung der Wundheilung oder der Hemmung oder Behebung neoplastischer Funktionsstörungen, die Angiogenese-abhängig sind. Die verschiedenen natürlich vorkommenden Mitglieder dieser Wachstumsfaktorfamilie binden jedoch oftmals mehrere Rezeptoren, und die verschiedenen bekannten Rezeptoren werden von mehreren Zelltypen exprimiert und weisen Expressionsmuster auf, die in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium und der Anwesenheit oder Abwesenheit pathologischer Zustände variieren können. Die biologischen Wirkungen jedes einzelnen Wachstumsfaktors können rezeptorabhängig, isoformabhängig und zelltypabhängig sein. Eine durch einen Rezeptor vermittelte wünschenswerte therapeutische Wirkung kann von unerwünschten Nebenwirkungen begleitet sein, die durch einen anderen Rezeptor vermittelt werden. Alternativ kann eine gewünschte therapeutische Wirkung durch Stimulation mehrerer Rezeptoren verstärkt werden, die mit einem einzelnen bekannten Wachstumsfaktor, der in der Natur auftritt, nicht simuliert werden kann. Es besteht daher ein Bedarf an neuen Peptid-Wachstumsfaktoren mit ihrem eigenen einzigartigen Profil rezeptorbindender und rezeptorstimulierender oder rezeptorhemmender Aktivitäten.
Die vorliegende Erfindung befriedigt die oben angegebenen Bedürfnisse durch Bereitstellung neuer Polypeptid-bindender Moleküle für natürlich vorkommende vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktorrezeptoren und Polynukleotide, die die neuen Polypeptide kodieren und für die rekombinante Expression der Polypeptide nützlich sind. Für die Zwecke der Beschreibung der Erfindung wird der Ausdruck "vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor" und die Abkürzung "VEGF" (ohne Modifikator) hier in einem allgemeinen Sinne verwendet, um jedes Polypeptid aus einer Wachstumsfaktorfamilie zu beschreiben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den vaskulären endo thelialen Wachstumsfaktor A (VEGF-A), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor B (VEGF-B), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor C (VEGF-C), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor D (VEGF-D), Plättchen-Wachstumsfaktor A (PDGF-A), Plättchen-Wachstumsfaktor B (PDG-B), Plazentawachstumsfaktor (PlGF) und viral kodierte VEGF-artige Moleküle. VEGF-A wird im Stand der Technik allgemein als "vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor" oder als "VEGF" bezeichnet, wird hier jedoch aus Gründen der Klarheit als VEGF-A bezeichnet oder in spezifischen Isoformen (zum Beispiel VEGF₁₆₅) von VEGF-A angegeben.
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95% identisch zu den in der SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63 oder SEQ ID NO: 163 angegeben Aminosäuren 1–102 ist, wobei das Polypeptid an mindestens einen Rezeptor bindet, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem VEGFR-1, menschlichem VEGFR-2 und menschlichem VEGFR-3.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95% identisch zu den in der SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173 oder SEQ ID NO: 175 angegebenen Aminosäuren 1–104 ist, wobei die Polypeptide an mindestens einen Rezeptor binden, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem VEGFR-1, menschlichem VEGFR-2 und menschlichem VEGFR-3.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95% identisch zu den in der SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157 oder SEQ ID NO: 159 angegebenen Aminosäuren 1–105 ist, wobei das Polypeptid an genau einen Rezeptor bindet, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem VEGFR-1, menschlichem VEGFR-2 und menschlichem VEGFR-3.
Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95% identisch zu den in der SEQ ID NO: 161 angegebenen Aminosäuren 1–103 ist, wobei das Polypeptid an menschlichen VEGFR-1, menschlichen VEGFR-2 und menschlichen VEGFR-3 bindet.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung stellt ein Hybrid-Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindestens 95% identisch zu dem Expressionsprodukt des Klons Nummer 11.9 (SEQ ID NO: 433), 11.13 (SEQ ID NO: 945), 12.16 (SEQ ID NO: 1185), 13.9 (SEQ ID NO: 465), 13.11 (SEQ ID NO: 529), 13.13 (SEQ ID NO: 977), 13.15 (SEQ ID NO: 1041), 14.1 (SEQ ID NO: 193), 14.5 (SEQ ID NO: 705), 14.7 (SEQ ID NO: 769), 22.3 (SEQ ID NO: 303), 22.4 (SEQ ID NO: 431), 23.12 (SEQ ID NO: 671), 23.14 (SEQ ID NO: 1119), 32.9 (SEQ ID NO: 485), 32.11 (SEQ ID NO: 549), 32.15 (SEQ ID NO: 1061), 32.16 (SEQ ID NO: 1189), 33.1 (SEQ ID NO: 213), 33.3 (SEQ ID NO: 277), 33.9 (SEQ ID NO: 469), 43.1 (SEQ ID NO: 219), 52.9 (SEQ ID NO: 487), 52.11 (SEQ ID NO: 551), 52.14 (SEQ ID NO: 1127), 53.1 (SEQ ID NO: 215), 53.7 (SEQ ID NO: 791), 61.3 (SEQ ID NO: 249), 62.1 (SEQ ID NO: 233), 62.8 (SEQ ID NO: 937), 62.10 (SEQ ID NO: 617), 62.13 (SEQ ID NO: 1001), 63.3 (SEQ ID NO: 281), 63.6 (SEQ ID NO: 857), 73.7 (SEQ ID NO: 797), 73.15 (SEQ ID NO: 1053), 74.8 (SEQ ID NO: 909), 74.10 (SEQ ID NO: 589), 74.12 (SEQ ID NO: 653), 81.9 (SEQ ID NO: 435), 81.13 (SEQ ID NO: 947), 82.5 (SEQ ID NO: 739), 82.14 (SEQ ID NO: 1123), 82.16 (SEQ ID NO: 1187), 83.9 (SEQ ID NO: 467), 83.13 (SEQ ID NO: 979), 84.1 (SEQ ID NO: 195) oder 84.5 (SEQ ID NO: 707) ist, wobei das Polypeptid an genau einen Rezeptor bindet, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem VEGFR-1, menschlichem VEGFR-2 und menschlichem VEGFR-3.
Ein Polynukleotid, ein Vektor oder eine Wirtszelle, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polynukleotid gemäß einer der hinsichtlich des ersten bis fünften Aspekts der Erfindung aufgeführten Sequenzen kodiert, ist ebenfalls vorgesehen.
Der Begriff "natürlich vorkommendes Vertebraten-Gefäßendothelwachstumsfaktor-Polypeptid" bezeichnet Polypeptide mit den folgenden Eigenschaften:

(1) das Polypeptid wird durch genomische DNA eines Wirbeltieres kodiert (zum Beispiel ein Reptil, Amphib, Vogel oder Säugetier, vorzugsweise ein Vogel oder Säugetier, am meisten bevorzugt ein Säugetier; insbesondere ein Primaten-Säugetier wie beispielsweise ein Affe, Menschenaffe oder Mensch) oder wird durch das Genom eines Vertebratenpathogens wie beispielsweise eines Säugetier-Poxvirus kodiert;
(2) das Polypeptid umfasst vollständig oder teilweise eine Aminosäuresequenz, die durch einen Vertebraten exprimiert wird (d.h. von der Transkription/Translation der genomischen Vertebraten-DNA oder von viral induzierter Transkription/Translation im Falle von Polypeptiden, die durch virale Nukleinsäuren kodiert werden);
(3) das Polypeptid oder der Teil umfasst eine VEGF/PDGF-Homologiedomäne (V/PHD) von etwa 70–150 Aminosäuren, die an natürlich vorkommende Rezeptoren bindet, und die teilweise gekennzeichnet ist durch das Aminosäuremotiv C-X(18-28)-P-X-C-X(4)-R-C-X-G-C(1-2)-X(6-12)-C-X(30-46)-C (SEQ ID NO: 1202), wobei X eine beliebige Aminosäure repräsentiert, und Ziffern in Klammern einen erlaubten Bereich von Aminosäuren repräsentieren (z.B. repräsentiert X(18–28) einen Abschnitt von 18–28 beliebigen Aminosäuren; C(1–2) repräsentiert eine oder zwei Cysteinreste). Die V/PHD beinhaltet im allgemeinen acht konservierte Cysteine, die ein Cystein-Knoten-Motiv bilden, ähnlich demjenigen das bei den menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren A, B, C und D (VEGF-A, -B, -C und -D) und bei menschlichen Plättchenwachstumsfaktoren (PDGFs) gefunden wird. Bevorzugte Polypeptide oder Teile umfassen V/PHD, das durch das speziellere Aminosäuremotiv C-X(22-24)-P-[PSR]-C-V-X(3)-R-C-X-G-C-C-X(6)-C-X(32-41)-C (SEQ ID NO: 1203) gekennzeichnet ist, wobei die Aminosäuren in eckigen Klammern (z.B. [PSR]) Alternativen für eine einzelne Position in der Aminosäuresequenz repräsentieren; und
(4) das Polypeptid bindet an mindestens einen Zelloberflächenrezeptor, der auf Endothelzellen exprimiert wird, die Vertebraten-Blut- oder -Lymphgefäße auskleiden oder Perizyten/Glattmuskelzellen, die Blutgefäße auskleiden und stützen. Bevorzugte Polypeptide binden an mindestens einen Zelloberflächenrezeptor, der auf Endothelzellen exprimiert wird.

Der Begriff "natürlich vorkommende Vertebraten-VEGF-Polypeptide" bedeutet daher Polypeptide, die bestimmte spezifizierte strukturelle und funktionelle Eigenschaften besitzen. Der Begriff soll in diesem Zusammenhang keine Herkunftsquelle implizieren. Rekombinant hergestellte Polypeptide, die die oben genannten Kriterien erfüllen, weil sie eine Aminosäuresequenzen oder rezeptorbindende Eigenschaften von VEGF-Polypeptiden aufweisen, die in der Natur vorkommen, werden daher als "natürlich vorkommend" angesehen. Zahlreiche beispielhafte natürlich vorkommende vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Polypeptide sind bereits im Stand der Technik bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor A (VEGF-A), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor B (VEGF-B) vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor C (VEGF-C), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor D (VEGF-D), Plättchenwachstumsfaktor A (PDGF-A), Plättchenwachstumsfaktor B (PDGF-B), Plazentawachstumsfaktor (PlGF); Säugetier- und Vogel-Orthologa davon (wobei der Begriff "ortholog" spezieshomolog bedeutet); und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor E (VEGF-E), NZ2 VEGF und die beiden in den Stämmen D1701 und NZ10 identifizierten VEGF-artigen Proteine, die in Poxviren identifiziert wurden. Die Verwendung natürlich vorkommender humaner VEGFs ist bevorzugt für die Zwecke der Entwicklung chimärer Moleküle, die als Humantherapeutika geeignet sind, um die Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung von Chimerika zu minimieren, die eine Immunantwort beim Menschen erzeugen. In vielen Fällen besteht jedoch eine sehr hohe Homologie zwischen VEGF-Speziesorthologa, insbesondere in rezeptorbindenden Domänen, und es ist vorgesehen, dass nicht-menschliche natürlich vorkommende VEGFs ebenfalls verwendet werden können, um chimäre Moleküle zur Verwendung bei der Behandlung von Menschen zu erzeugen.
Chimäre Polypeptide können aus jedem Paar oder aus drei oder vier oder mehr der hier beschriebenen VEGFs oder deren Speziesorthologa abgeleitet sein.
Der Ausdruck "chimär" erfordert, dass die Aminosäuresequenz des chimären Moleküls mindestens einen Abschnitt aus ein oder mehreren Aminosäuren (vorzugsweise Abschnitte von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Aminosäuren) aus jedem der natürlich vorkommenden VEGFs, aus denen sie abgeleitet sind, beinhaltet. Das chimäre Polypeptid ist daher ein "Hybrid" oder "Mosaik" aus zwei oder mehr Polypeptiden. Mit "chimär" ist gemeint, dass das erfindungsgemäße Polypeptid nicht identisch ist zu irgend einer natürlich vorkommenden VEGF-Sequenz (oder einem Fragment einer natürlichen VEGF-Sequenz).
Der Begriff "abgeleitet von" (wie in "abgeleitet von zwei oder mehr natürlich vorkommenden VEGF-Polypeptiden") bedeutet, dass, wenn die Aminosäuresequenzen des chimären Polypeptids und die zwei oder mehr natürlich vorkommenden VEGFs unter Verwendung eines Standardalgorithmus aliniert werden, im Wesentlichen alle Aminosäuren in dem chimären Polypeptid mit einem identischen Rest in einem oder mehreren der natürlich vorkommenden VEGFs aliniert sind, aus denen das chimäre Molekül abgeleitet wurde.
Standard-Proteinalinierungsalgorithmen, zum Beispiel das Clustal-Verfahren [Nucl Acids Res 22: 4673–80 (1994)], das Jotun-Hein-Verfahren [Methds Enzymol 183: 626–645 (1990)] oder das Feng-Doolittle-Verfahren [J Mol Evol 25: 351–360 (1987)], können verwendet werden, um natürlich vorkommende Vertebraten-Gefäßendothelwachstumsfaktor-Polypeptide zu alinieren, wobei solche Alinierungen durch die Anwesenheit der acht hochkonservierten Cysteine, die über die V/PHD verteilt sind, stark erleichtert wird. Es kann daher auf einfache Weise festgestellt werden, dass ein chimäres Polypeptid von zwei oder mehr natürlich vorkommenden VEGFs "abgeleitet" ist, indem eine Alinierung unter Verwendung allgemein anerkannter Protein-Alinierungsalgorithmen durchgeführt wird. Wenn nach Alinierung der Aminosäuresequenzen eines chimären Polypeptids und zweier oder mehr natürlich vorkommender VEGFs unter Verwendung eines beliebigen Standardalgorithmus im wesentlichen alle Aminosäuren in dem chimären Polypeptid mit einem identi schen Rest in einem oder mehr der natürlich vorkommenden VEGFs aliniert wurden, dann wurde das chimäre Polypeptid von den natürlich vorkommenden VEGFs abgeleitet.
Die Verwendung des Begriffs "im Wesentlichen alle" spiegelt die Tatsache wieder, dass hier beschriebene Techniken zur Herstellung chimärer Polypeptide manchmal Mutationen wie beispielsweise Insertionen, Deletionen oder Substitutionen einführen, wodurch 100% Korrelation zu den Elternsequenzen verhindert wird. In solchen Fällen alinieren mindestens etwa 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Reste des chimären Polypeptids mit identischen Resten von mindestens einem der natürlichen VEGFs.
Wenn dem Fachmann ein chimäres Polypeptid präsentiert wird, das perfekt oder im Wesentlichen mit den natürlichen VEGF-Polypeptiden, aus denen es abgeleitet wurde, aliniert, liegt es innerhalb seines Fachkönnens, absichtlich Mutationen (insbesonder konservative Mutationen) in das chimäre Polypeptid einzuführen und solch ein modifiziertes chimäres Polypeptid auf sein Rezeptorbindungsprofil zu untersuchen.
In Zusammenhang mit solchen chimären Polypeptiden bedeutet der Begriff "mehrere Peptiduntereinheiten" zwei oder mehr Peptiduntereinheiten. Beispielhaft angegeben sind hier chimäre Polypeptide, die erhalten wurden durch Fragmentierung zweier natürlich vorkommender VEGF-cDNAs (humaner VEGF-A und humaner VEGF-C) zu neun Untereinheiten von jeweils etwa 8–16 Kodons, Rekombinieren dieser Fragmente zu allen 512 Permutationen dieser neun Untereinheiten (unter Beibehaltung der Untereinheitenreihenfolge) und Exprimieren der erhaltenen chimären cDNAs. Die Anzahl und Größe der Fragmente wird nicht als kritisches Merkmal angesehen. Wie hier beispielhaft be schrieben, werden die "Untereinheiten" durch Peptidbindungen zur Bildung einer Polypeptidkette verbunden.
In Zusammenhang mit chimären erfindungsgemäßen chimären Polypeptiden oder natürlich vorkommenden VEGF-Polypeptiden bedeutet die Feststellung des "Gefäßendothel-Wachstumsfaktorrezeptor-Bindungsprofils" die Feststellung der Rezeptoren, an die ein Polypeptid bindet, und der Rezeptoren, an die es nicht bindet. Bekannte VEGF-Rezeptoren, einschließlich VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3, werden hier anderweitig in größerer Ausführlichkeit beschrieben. Bekannte PDGF-Rezeptoren werden hier ebenfalls an anderer Stelle in größerer Ausführlichkeit beschrieben. Wenn ein chimäres Polypeptid teilweise aus einer natürlich vorkommenden PDGF-Sequenz abgeleitet wurde, ist die Untersuchung des chimären Polypeptids auf die Bindung an PDGF-Rezeptoren als Teil der Feststellung des Rezeptorbindungsprofils vorgesehen). Als Beispiel sei genannt, dass, wenn ein chimäres Polypeptid von einem VEGF-A abgeleitet wurde, das an VEGFR-1 und VEGFR-2 bindet, und von einem VEGF-C, das an VEGFR-2 und VEGFR-3 bindet, das chimäre Polypeptid ein anderes Rezeptorbindungsprofil als seine beiden Elternmoleküle aufweist, wenn es lediglich einen der drei Rezeptoren bindet, oder wenn es an alle drei Rezeptoren bindet oder wenn es an VEGFR-1 und VEGFR-3, nicht jedoch an VEGFR-2 bindet.
Das Screening von erfindungsgemäßen Polypeptiden auf die Bindung an die Neuropiline NP-1 und NP-2 ist nicht als Teil der Rezeptorbindungsprofilbestimmung vorgesehen, da die für die NP-1- und NP-2-Bindung verantwortlichen Bereiche von VEGF (und anderen Familienmitgliedern) Bereiche außerhalb der V/PHD-Kernregion sind. Die NP-1-Bindung wird vermittelt durch die Aminosäurereste 142 bis 185 der SEQ ID NO: 2 für VEGF-A und der Aminosäurereste 138 bis 182 für VEGF-B [Soker et al., J Biol Chem 271: 5761–7 (1996); Makinen et al., J Biol Chem 274: 21217–22 (1999)]. Wie unten erläutert, ist die Hinzufügung von Sequenzen stromabwärts oder stromaufwärts zu erfindungsgemäßen chimären Polypeptiden vorgesehen, und von einigen hinzugefügten Sequenzen ist vorgesehen, dass sie zu einer NP-1- oder NP-2-Bindung führen.
Es wird davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung die erste Offenbarung eines Polypeptids bereitstellt, das in der Lage ist, an VEGFR-1, VEGFR-2 sowie VEGFR-3 zu binden. Alle Polypeptide, die dieses Rezeptorbindungsprofil aufweisen, werden als in den Bereich der Erfindung fallend angesehen.
Natürlich vorkommende VEGF-Polypeptide binden ihre jeweiligen Rezeptoren im allgemeinen mit hoher Affinität, was in diesem Zusammenhang im allgemeinen dahingehend verstanden wird, dass eine Bindung mit einer subnanomolaren Dissoziationskonstante gemeint ist. Beispielsweise bindet VEGF-A VEGFR-1 und VEGFR-2 mit einer Kd von ungefähr 16 pM beziehungsweise 760 pM; und VEGF-C bindet VEGFR-2 und VEGFR-3 mit einer Kd von ungefähr 410 pM beziehungsweise 135 pM. Da es möglich ist, ein therapeutisches Wachstumsfaktorprotein zu verabreichen, um Konzentrationen zu erreichen, die normale Serumkonzentrationen übersteigen, und solche Polypeptide so zu formulieren, dass ihre biologische Halbwertszeit erhöht ist, wird davon ausgegangen, dass chimäre Polypeptide, die eine niedrigere Rezeptoraffinität (d.h. höhere Dissoziationskonstante) aufweisen, nichtsdestotrotz als Rezeptoragonisten und -antagonisten geeignet sein werden. Für die Zwecke der Bewertung der Rezeptorbindung von chimären Polypeptiden wird ein Grenzwert bei einer Dissoziationskonstante von 50 nanomolar gewählt. Chimäre Polypeptide, die einen Rezeptor mit einer Dissoziationskonstante von weniger als 50 nanomolar binden, festge stellt durch ein beliebiges konventionelles oder anerkanntes Verfahren, wie jene, die in Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, New York, John Wiley & Sons, Inc., S. A.5 A.1–A.5 A.40 (1998), beschrieben sind, wird als an einen Rezeptor bindend gewertet, und Polypeptide mit geringeren Affinitäten werden als nichtbindend gewertet.
Es ist in der Literatur gut bekannt, dass natürlich vorkommende VEGF als Spleißvarianten und/oder als Präprotein-Moleküle und/oder als Präpro-Proteinmoleküle exprimiert werden, die einem proteolytischen Processing unterzogen werden. Erfindungsgemäße chimäre Polypeptide beinhalten chimäre (hybride) Rezeptorbindungsdomänen, wie in den vorstehenden Absätzen erläutert, und können optional zusätzliche Stromauf- oder Stromab-Sequenzen aus natürlich vorkommenden VEGFs beinhalten, einschließlich Stromauf- und Stromab-Sequenzen, die in reifen Isoformen von natürlich vorkommenden zirkulierenden VEGFs vorhanden sind; und/oder Stromauf- oder Stromab-Propeptidsequenzen, die während des normalen intrazellulären oder extrazellulären Processings entfernt werden. Zur Veranschaulichung: die in Beispiel 1 beschriebenen Polypeptide wurden unter Verwendung der Reste 34–135 (SEQ ID NO: 2) von VEGF-A und unter Verwendung von 112–216 von humanem Präpro-VEGF-C (SEQ ID NO: 22) hergestellt. Erfindungsgemäße chimäre Polypeptide beinhalten die Peptide, die tatsächlich als Beispiele angegeben sind, und beinhalten auch solche Peptide, die durch Hinzufügung von Stromauf- oder Stromab-VEGF-A- oder -VEGF-C-Sequenzen aus SEQ ID NO: 2 oder 22 modifiziert wurden. Hinsichtlich chimärer VEGF-A-/VEGF-C-Polypeptide, wie sie hier beispielhaft beschrieben sind, ist insbesondere die Hinzufügung von Stromauf- und Stromab-Sequenzen, die mit amino- und/oder carboxyterminalen Sequenzen übereinstimmen, die für natürliche VEGF-A- oder VEGF-C-Isoformen charakteristisch sind, vorgesehen.
Es ist in der Literatur auch sehr gut bekannt, Proteine mit einem Initiator-Methionin, mit einem heterologen Signalpeptid, mit einer oder mehr Markersequenzen zur Erleichterung der Aufreinigung, als Fusionen mit anderen Polypeptiden und dergleichen rekombinant zu exprimieren. Es ist ebenfalls gut bekannt, Polypeptide durch Glykosylierung, Pegylierung oder andere Modifikationen, von denen einige die Stabilität, die Zirkulationshalbwertszeit verbessern oder (im Falle der Glykosylierung) das Polypeptid endogenen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren ähnlicher machen können. Chimäre Polypeptide gemäß der Erfindung können beliebige solcher Modifikationen und Hinzufügungen zu der aus zwei oder mehr natürlich vorkommenden Invertebraten-Gefäßendothelwachstumsfaktor-Polypeptiden abgeleiten Aminosäuresequenz umfassen.
Es wird erwartet, dass eine erhöhte Rezeptorbindungsaffinität mit größerer Potenz als Rezeptoraktivator oder -inhibitor korreliert. Im allgemeinen sind die durch ein beliebiges anerkanntes Verfahren bestimmten Dissoziationskonstanten (Kd) ein Hinweis auf die Rezeptoraffinität, wobei eine niedrigere Kd auf eine größere Bindungsaffinität hinweist.
Die EC₅₀, oder die halbwirksame Konzentration, ist die Konzentration, die 50% der maximalen Wirkung erzeugt. Ein beispielhafter Test für die Bestimmung der EC50 eines mutmaßlichen Liganden für einen bestimmten Rezeptor ist unten in Beispiel 6 erläutert.
Das unten erläuterte Beispiel stellt eine Beschreibung für die Synthese und Testung zahlreicher spezifischer Hybrid-Polypeptide bereit.
Anfängliche Untersuchungen deuten darauf hin, dass die folgenden spezifischen Konstrukte (unten im Detail beschrieben) an genau einen Rezeptor binden, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus humanem VEGFR-1, humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3: 82-14, 82-16, 22-3, 72-6, 12-14, 12-16, 32-11, 32-14, 32-15, 32-16, 52-9, 52-11, 52-14, 52-15, 14-7, 23-10, 23-12, 23-14, 33-1, 33-3, 33-6, 33-9, 53-1, 53-3, 53-7, 62-8, 62-10, 62-13, 63-3, 63-6, 73-7, 73-15,-8, 74-10, 74-12, 11-9, 11-13, 12-1, 12-5, 81-9, 81-13, 13-9, 13-11, 13-13, 13-15, 14-1, 14-5, 41-1, 43-1, 83-9, 83-13, 83-15, 61-1, 61-3, 62-1, 82-5, 84-1, 84-5.
Anfängliche Untersuchungen deuten darauf hin, dass die folgenden spezifischen Konstrukte an VEGFR-1 und VEGFR-3, nicht jedoch an VEGFR-2 binden: 12-9, 12-13, 14-9, 82-9, 82-13, 84-9.
Anfängliche Untersuchungen deuten darauf hin, dass die folgenden spezifischen Konstrukte an VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 binden: 12-7, 12-11, 82-11, 84-11.
Wie in größerer Ausführlichkeit unten beschrieben, scheint das vierte Fragment (X₄) Reste zu beinhalten, die für die Vermittlung der VEGFR-3-Bindungsaffinität wichtig sind. Die Fragmente 5 und 8 von VEGF-C scheinen ebenfalls zur VEGFR-3-Bindung beizutragen. Gleichermaßen deuten die Daten darauf hin, dass die Fragmente 2 und 7 von VEGF-A zur VEGFR-1 Bindung beitragen.
Die unten beschriebenen Rekombinationsexperimente zur Erzeugung von Hybridmolekülen wurden nur mit Rezeptorbindungsdomänen von humanem VEGF-A und VEGF-C durchgeführt statt mit Sequenzen, die den natürlichen sekretierten Formen von VEGF-A und VEGF-C oder Präprotein- oder Präpro-Protein-Sequenzen entsprechen. Routinemäßige rekombinante DNA-Techniken, wie sie beispielsweise in Ausubel, et al. (Hrsg.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994–1999) oder Sambrook et al., (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben sind, können verwendet werden, um Polynukleotide, die die Hybridproteine kodieren, mit Polynukleotiden, die VEGF-A- oder VEGF-C-Sequenzen kodieren, die in natürlich vorkommenden Proteinen stromaufwärts oder stromabwärts von der rezeptorbindenden Domäne gefunden werden, insbesondere Sequenzen, die in natürlich vorkommenden sekretierten und zirkulierenden Formen von VEGF-A oder VEGF-C gefunden werden, zu verbinden.
Die Erfindung stellt Hydridpolypeptide wie oben beschrieben bereit, wobei das Polypeptid darüber hinaus ein oder mehrere Aminosäuresequenzen beinhaltet, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Präpro-VEGF-C-Signalpeptid, einem aminoterminalen Präpro-VEGF-C-Propeptid und einem carboxyterminalen Präpro-VEGF-C-Propeptid.
Die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden ist jedoch nicht beschränkt auf die Expression nur mit natürlich vorkommenden flankierenden VEGF-A- oder VEGF-C-Sequenzen. Die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden in Bakterien kann erreicht werden durch Einfügen eines Initiator-Methionins oder -Methionin-Lysins stromaufwärts von den Hybrid-VEGF-Sequenzen, wohingegen die Expression und Sekretion bei Säuge tierzellen am einfachsten dadurch erreicht wird, dass zumindest ein Signalpeptid eingefügt wird.
Die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden als Fusionen mit anderen heterologen Sequenzen wie beispielsweise Markersequenzen zur Erleichterung der Aufreinigung oder die Expression als Teil eines größeren Fusionspeptids ist ebenfalls vorgesehen. Ein beispielhafter Marker dieses Typs ist eine Polyhistidinsequenz von im Allgemeinen etwa sechs Histidin-Resten, die die Isolierung einer solchermaßen markierten Verbindung unter Einsatz von Nickel-Chelatbildung ermöglicht. Andere Kennzeichnungen und Marker wie beispielsweise der FLAG^®-Marker (Eastman Kodak, Rochester, NY), die gut bekannt und routinemäßig im Stand der Technik verwendet werden, sind von der Erfindung umfasst. Beispielhafte Fusionen beinhalten die Verwendung von kommerziell erhältlichen Vektoren, die ein gewünschtes Polypeptid als Teil eines Glutathion-S-transferase(GST)-Fusionsproduktes exprimieren. Nach der Abspaltung der GST-Komponente von dem gewünschten Polypeptid kann ein zusätzlicher Glycinrest an Position –1 verbleiben. Varianten, die sich durch Expression in anderen Vektorsystemen ergeben, sind ebenfalls vorgesehen.
Mittels des hier beschriebenen Rezeptorbindungs- und -aktivitätstests stellt die vorliegende Erfindung auch Varianten (Analoga) der erfindungsgemäßen Hybridpolypeptide bereit, wobei ein oder mehrere Aminosäuren der Hybridpeptid-Aminosäuresequenz addiert, deletiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert wurde, und wobei das Hybrid die rezeptorbindenden und/oder eine biologische Aktivität, die für das Hybridpolypeptid charakteristisch ist, bewahrt.
Substitutionsvarianten, bei denen hauptsächlich konservative Substitutionen eingeführt wurden (z.B. durch Modifikationen von Polynukleotiden, die erfindungsgemäße Polypeptide kodieren) sind als Äquivalente von erfindungsgemäßen Hybridpolypeptiden vorgesehen. Aminosäuren können nach ihren physikalischen Eigenschaften und ihrem Beitrag zur sekundären und tertiären Proteinstruktur klassifiziert werden. Als eine konservative Substitution wird im Stand der Technik ein Austausch einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure angesehen, die ähnliche Eigenschaften aufweist. Beispielhafte konservative Austausche auf Basis der Aminosäureseitenketteneigenschaften sind in der unmittelbar folgenden Tabelle unter Verwendung der Standard-Ein-Buchstaben-Abkürzungen dargelegt.

Seitenketteneigenschaft Aminosäure

Aliphatisch

unpolar G, A, P, I, L, V

polar – ungeladen C, S, T, M, N, Q

polar – geladen D, E, K, R

Aromatisch F, W, Y

Andere N, Q, D, E

Alternativ können konservative Aminosäuren wie in Lehninger [Biochemistry, Zweite Auflage; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), S. 71–77] beschrieben gruppiert werden, wie in der unmittelbar folgenden Tabelle dargestellt ist.

Unpolare (hydrophobe)	Seitenkette
aliphatisch:	A, L, I, V, P
aromatisch:	F, W
schwefelhaltig:	M
grenzwertig:	G
ungeladene polare Seitenkette
Hydroxyl:	S, T, Y
Amide:	N, Q
Sulfhydryl:	C
grenzwertig	G
Positiv geladen (basisch):	K, R, H
Negativ geladen (sauer):	D, E

Die folgende Tabelle stellt noch eine weitere alternative Gruppe konservativer Aminosäureaustausche bereit. Sowohl Ein-Buchstaben- als auch Drei-Buchstaben-Abkürzungen sind dargestellt:

Ursprünglicher	Konservative
Rest	Austausche
Ala(A)	Val, Leu, Ile
Arg(R)	Lys, Gln, Asn
Asn(N)	Gln, His, Lys, Arg
Asp(D)	Glu
Cys(C)	Ser
Gln(Q)	Asn
Glu(E)	Asp
His(H)	Asn, Gln, Lys, Arg
Ile(I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu(L)	Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys(K)	Arg, Gln, Asn
Met(M)	Leu, Phe, Ile
Phe(F)	Leu, Val, Ile, Ala
Pro(P)	Gly
Ser(S)	Thr
Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
Tyr(Y)	Trp, Phe, Thr, Ser
Val(V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala

Für viele Proteine ist es unwahrscheinlich, dass die Wirkungen einer beliebigen einzelnen oder kleinen Gruppe von Aminosäureänderungen die biologischen Eigenschaften wesentlich ändern, insbesondere wenn die Änderungen konservative Substitutionen sind, vorausgesetzt, die Änderungen werden nicht an kritischen Resten eingeführt. Bevorzugte Varianten der erfindungsgemäßen Hybridpolypeptide haben mindestens etwa 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Aminosäureidentität mit Hybriden gemeinsam, die vollständig aus Aminosäuresequenzen bestehen, die von natürlich vorkommenden VEGFs abgeleitet sind.
Die Identität und Ähnlichkeit von verwandten Nukleinsäuremolekülen und Polypeptiden kann auf einfache Weise durch bekannte Verfahren berechnet werden. Solche Verfahren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf jene, die in Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil 1, Griffin, A. M., und Griffin, H. G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) beschrieben sind.
Bevorzugte Verfahren zur Feststellung der Identität und/oder Ähnlichkeit sind darauf ausgelegt, die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Verfahren zur Feststellung der Identität und Ähnlichkeit werden in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen beschrieben. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Feststellung der Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN und FASIA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403–410 (1990)). Das BLASTX-Programm ist öffentlich erhältlich vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) und anderen Quellen (BLAST-Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., oben). Der gut bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Feststellung der Identität verwendet werden.
Bevorzugte Parameter für einen Polypeptidsequenzvergleich beinhalten folgendes:
Algorithmus: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48, 443–453 (1970);
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 von Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915–10919 (1992);
Lückenstrafe ("Gap Penalty"): 12
Lückenlängenstrafe ("Gap Length Penalty"): 4
Ähnlichkeitsschwellenwert ("Threshold of Similarity"): 0 Bevorzugte Parameter für Sequenzvergleiche von Nukleinsäuremolekülen beinhalten folgendes:
Algorithmus: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48, 443–453 (1970);
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlpassung = 0 Lückenstrafe ("Gap Penalty"): 50
Lückenlängenstrafe ("Gap Length Penalty"): 3
Unter einer "nicht natürlich vorkommenden Gefäßendothelwachstumsfaktor-Aminosäuresequenz" wird eine Sequenz verstanden, die nicht identisch ist zu irgend einer bekannten natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, wie zum Beispiel in diesem Fall rezeptorbindenden Domänen von bekannten VEGF-A- oder VEGF-C-Sequenzen.
Die Erfindung stellt Polynukleotide (z.B. cDNA, cDNA mit eingeführten Introns zur Erleichterung der Expression in eukaryotischen Systemen, synthetische DNA, RNA oder Kombinationen davon, einzel- oder doppelsträngig) bereit, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren. Gereinigte und isolierte Polynukleotide sind bevorzugt. Aufgrund der gut bekannten Degeneration des genetischen Codes existieren mehrere Polynukleotidsequenzen, die jede erfindungsgemäße Polypeptid-Aminosäuresequenz kodieren. Solche Polynukleotide sind für die rekombinante Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide geeignet.
Beispielhafte hochstringente Hybridisierungsbedingungen sind wie folgt: Hybridisierung bei 65°C für mindestens 12 Stunden in einer Hybridisierungslösung umfassend 5X SSPE, 5X Denhardts, 0,5% SDS und 2 mg ultraschallbehandelte nichthomologe DNA pro 100 ml Hybridisierungslösung; zweimaliges Waschen für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer Waschlösung umfassend 2X SSPE und 0,1% SDS; gefolgt von einer einmaligen Waschung für 15 Minuten bei 65°C mit 2X SSPE und 0,1% SDS; gefolgt von einer letzten Waschung für 10 Minuten bei 65°C mit 0,1X SSPE und 0,1% SDS. Moderate Stringenzwaschungen können erreicht werden durch Waschung mit 0,5X SSPE anstatt 0,1X SSPE in der letzten 10-minütigen Waschung bei 65°C. Niedrig stringente Waschungen können erreicht werden durch Verwendung von 1X SSPE für die 15-minütige Waschung bei 65°C und Weglassen der letzten 10-minütigen Waschung. Es ist in der Fachwelt selbstverständlich, dass Bedingungen entsprechender Stringenz durch Variieren von Temperatur und Puffer oder Salzkonzentration erreicht werden können, wie in Ausubel, et al. (Hrsg.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), S. 6.0.3 bis 6.4.10, beschrieben. Modifikationen der Hybridisierungsbedingungen können empirisch ermittelt oder auf Basis der Länge und des Prozentanteils an Guanosin/Cytosin(GC)-Basenpaarung der Sonde genau berechnet werden. Die Hybridisierungsbedingungen können wie in Sambrook et al., (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), S. 9.47 bis 9.51. beschriebenen berechnet werden.
Die Erfindung stellt Vektoren bereit, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen. Solche Vektoren sind zum Beispiel nützlich für die Amplifikation der Polynukleotide in Wirtszellen, um geeignete Mengen davon zu erzeugen.
Der Vektor kann ein Expressionsvektor sein, wobei das erfindungsgemäße Polynukleotid funktionsfähig mit einem Polynukleotid verknüpft ist, das eine Expressionskontrollsequenz umfasst. Autonom replizierende rekombinante Expressionskonstrukte wie beispielsweise Plasmide und virale DNA-Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide beinhalten, sind insbesondere vorgesehen. Expressionskontroll-DNA-Sequenzen beinhalten Promotoren, Enhancer und Operatoren und werden im allgemeinen auf Basis des Expressionssystems ausgewählt, in denen das Expressionskonstrukt verwendet werden soll. Bevorzugte Promotor- und Enhancer-Sequenzen werden im allgemeinen auf die Fähigkeit zur Verstärkung der Genexpression hin ausgewählt, während Operatorsequenzen im allgemeinen auf ihre Fähigkeit zur Regulation der Genexpression hin ausgewählt werden. Expressionsvektoren sind nützlich zur rekombinanten Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden. Erfindungsgemäße Expressionskonstrukte können auch Sequenzen beinhalten, die ein oder mehrere selektierbare Marker kodieren, die die Identifikation von das Konstrukt tragenden Wirtszellen ermöglichen. Expressionskonstrukte können auch Sequenzen beinhalten, die die homologe Rekombination in einer Wirtszelle erleichtern und vorzugsweise fördern. Bevorzugte erfindungsgemäße Konstrukte beinhalten auch Sequenzen, die für die Replikation in einer Wirtszelle erforderlich sind.
Vektoren sind auch nützlich für "Gentherapie"-Behandlungsschemata, wobei ein Polynukleotid, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, in ein Subjekt, das einer Behandlung bedarf, die die Modulation (Stimulation oder Blockierung) von vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptoren beinhaltet, in einer Form eingeführt wird, die die Zellen in dem Subjekt dazu veranlasst, die erfindungsgemäßen Polypeptide in vivo zu exprimieren.
Die Erfindung stellt Wirtszellen, einschließlich prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, bereit, die mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder erfindungsgemäßen Vektoren (stabil oder transient) transformiert oder transfiziert sind. Erfindungsgemäße Polynukleotide können in die Wirtszelle als Teil eines ringförmingen Plasmids oder als lineare DNA eingeführt werden, die eine kodierende Region eines isolierten Proteins oder einen viralen Vektor umfasst. Im Stand der Technik gut bekannte und routinemäßig praktizierte Verfahren zur Einführung von DNA in die Wirtszelle beinhalten Transfor mation, Transfektion, Elektroporation, Kerninjektion oder Fusion mit Trägern wie beispielsweise Liposomen, Mizellen, Geisterzellen und Protoplasten. Wie oben angegeben, sind solche Wirtszellen für die Amplifizierung der Polynukleotide und auch für die Expression der durch das Polynukleotid kodierten erfindungsgemäßen Polypeptide nützlich. Solche Wirtszellen sind in Tests nützlich, wie sie hier beschrieben werden. Für die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden ist jede Wirtszelle akzeptabel, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Invertebraten- (z.B. Insekten-), Vertebraten- und Säugetier-Wirtszellen. Für die Entwicklung therapeutischer Zubereitungen ist die Expression in Säugetierzellinien, insbesondere menschlichen Zellinien, bevorzugt. Von der Verwendung von Säugetier-Wirtszellen wird erwartet, dass sie jene posttranslationalen Modifikationen (zum Beispiel Glykosylierung, Trunkierung, Lipidierung und Phosphorylierung) gewährleisten, die wünschenswert sind, um eine optimale biologische Aktivität auf erfindungsgemäße rekombinante Expressionsprodukte zu übertragen. Glykosylierte und nicht-glykosylierte Formen von Polypeptiden sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Gleichermaßen umfasst die Erfindung oben beschriebene Polypeptide, die kovalent modifiziert wurden, um ein oder mehrere wasserlösliche Polymer-Anhänge wie beispielsweise Polyethylenglykol, Polyoxyethylenglykol oder Polypropylenglykol zu beinhalten.
Erfindungsgemäße Polypeptide können auch chemisch synthetisiert sein.
Die Isolierung des Polypeptids aus den Zellen oder aus dem Medium, in dem die Zellen angezogen werden, wird durch im Stand der Technik bekannte Aufreinigungsverfahren erreicht, zum Beispiel konventionelle chromatographische Verfahren, einschließlich Immunaffinitätschromatographie, Rezeptoraffinitätschromatographie, Chromatographie unter Nutzung hydrophober Wechselwirkung, Lektinaffinitätschromatographie, Ausschlussfiltration, Kationen- oder Anionenaustauschchromatographie, Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), Umkehrphasen-HPLC und dergleichen. Andere Verfahren zur Aufreinigung beinhalten jene, bei denen das gewünschte Protein als ein Fusionsprotein exprimiert und aufgereinigt wird, das eine spezifische Markierung, Kennzeichnung oder einen spezifischen chelatbildenden Rest aufweist, der durch einen spezifischen Bindungspartner oder ein spezifisches Bindungsmittel erkannt wird. Das gereinigte Protein kann gespalten werden, um das gewünschte Protein zu erhalten, oder als intaktes Fusionsprotein belassen werden. Die Abspaltung der Fusionskomponente kann eine Form des gewünschten Proteins erzeugen, die als Ergebnis des Spaltungsprozesses zusätzliche Aminosäurereste aufweist.
Ebenfalls innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Polypeptide oder Polynukleotide umfassen. Solche Zusammensetzungen können ein oder mehrere erfindungsgemäße Polynukleotide oder Polypeptide umfassen, die mit einem pharmazeutisch annehmbarem (z.B. sterilen und nicht toxischen) Diluens oder Träger formuliert wurden. Flüssige, halbfeste oder feste Diluens sehen, die als pharmazeutische Träger, Exzipientien oder Medien dienen, sind bevorzugt. Jedes im Stand der Technik bekannte Diluens kann verwendet werden. Beispielhafte Diluenzien beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösungen, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Magnesiumstearat, Methyl- und Propylhydroxybenzoat, Talkum, Alginate, Stärken, Galaktose, Saccharose, Dextrose, Sorbit, Mannit, Glycerin, Kalziumphosphat, Mineralöl und Kakaobutter. Solche Formulierungen sind z.B. für die Verabreichung von erfindungsgemäßen Polypeptiden oder Polynukleotiden an Säugetier-Subjekte (einschließlich Menschen) in therapeutischen Schemata nützlich.
Gleichermaßen können erfindungsgemäße Polypeptide oder Polynukleotide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von hier beschriebenen Funktionsstörungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Funktionsstörungen, die durch unerwünschte Endothelzellproliferation gekennzeichnet sind und/oder Funktionsstörungen, die durch Ischämie und/oder Gefäßverschluss gekennzeichnet sind, wobei eine Neovaskularisierung erwünscht ist.
Ein Kit, umfassend ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, Polypeptid oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, verpackt in einem Behälter, wie beispielsweise einer Phiole oder Flasche, und ferner umfassend ein Etikett, das an dem Behälter befestigt oder damit verpackt ist, wobei das Etikett die Inhalte des Behälters beschreibt und Indikationen und/oder Instruktionen hinsichtlich der Verwendung des Inhaltes des Behälters zur Behandlung einer oder mehrerer Krankheitszustände, wie hier beschrieben, bereitstellt, ist ebenfalls vorgesehen.
Erfindungsgemäße Polypeptide, die an zytotoxische Mittel oder andere Mittel, die das Zeltwachstum modulieren, konjugiert sind, sind vorgesehen.
Einzelsträngige Oligonukleotide können auf Grundlage der Kenntnis von Säugetier-VEGF-Polypeptidsequenzen und des universellen genetischen Codes und unter Verwendung konventioneller chemischer Synthesetechniken hergestellt werden. Beispiel 1 unten zeigt solch eine Technik, wobei synthetische Oligonukleotidpaare hergestellt und angelagert wurden, um doppelsträngige Polynukleotide mit einzelsträngigen kohäsiven Enden herzustellen, die Fragmente von menschlichem VEGF-A und menschlichem VEGF-C kodierten. cDNAs oder genomische DNAs (vorzugsweise cDNAs), die natürliche VEGFs kodieren, können unter Verwendung einer oder mehrerer Restriktionsendonukleasen, unter Verwendung von DNase I oder unter Verwendung von Exonuklease 111 fragmentiert werden [siehe z.B. Chang et al., Nature Biotechnology 17: 793–797 (1999) (DNase-I-Verfahren); Kikuchi et al., Gene 236: 159–167 (1999) (Restriktionsendonukleaseverfahren); Harayama et al., TIBTECH 16: 76–82 (1998) (Review); Patten et al., Curr. Opin. Biotechnology 8: 724–733 (1997) (Review, DNase I); Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504–09 (1997) (DNase-I-Verfahren); Stemmer, Proc. Natl. Accd. Sci. USA 91: 10747–1074 (1997) (DNase-I-Verfahren); Stemmer, Nature 370: 389–391 (1994) (DNase-I-Verfahren); und Ostermeier et al., Nature Biotechnology 17: 1205–1209 (1999) (ExoIII-Verfahren)].
Eine cDNA (kodierender oder nicht-kodierender Strang) kann als Matrize verwendet werden, um unter Verwendung von DNA-Polymerase und Kettenterminationsreagenzien komplementäre Fragmente zu synthetisieren [siehe z.B. Lehtovaara et al., Protein Engineering 2: 63–68 (1988)].
Polynukleotide können mit komplementären kohäsiven einzelsträngigen Enden hergestellt wurden, um die Anlagerung von Fragmenten in einer gewünschten Reihenfolge unter konventionellen Anlagerungs- und Ligationsbedingungen für Polynukleotide zu erleichtern. Beispiel 1 unten bietet eine Demonstration dieser Technik, um 510 menschliche VEGF-A/VEGF-C-Hybride zu erzeugen. Solch eine Technik kann auch zur Anlagerung von Fragmentmischungen von zwei oder mehr VEGF-cDNAs, die mit Restriktionsendonukleasen verdaut wurden, geeignet sein. Alternativ können Polynukleotide gemischt und einer "Self-priming"-PCR-Reaktion unterzogen werden, die aufeinander folgende Schritte der Denaturierung, Anlagerung und Extension beinhaltet [siehe z.B. Chang et al (1999); Kikuchi et al. (1999); Patten et al. (1997); Zhang et al. (1997); Stemmer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747–1074 (1994); und Stemmer, Nature 370: 389–391 (1994)]. Eine PCR kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die Fehler (Mutationen) in die PCR-Produkte einführt. Solche Mutationen führen zusätzliche molekulare Variationen ein und es wird erwartet, dass dadurch der prozentuale Anteil biologisch aktiver Moleküle ingesamt verringert wird, jedoch auch Moleküle mit unerwartet überlegenen Aktivitäten erzeugt werden können.
Hybrid-DNA-Moleküle werden durch beliebige im Stand der Technik bekannte Mittel exprimiert. In einer Variation werden die Moleküle in Expressionsvektoren kloniert, die wiederum verwendet werden, um Zellen zu transformieren oder zu transfizieren, um die Polypeptide zu exprimieren. In einer anderen Variation werden die Polynukleotide zum Screening in ein Phagendisplay-Vektorsystem kloniert [siehe z.B. Chang et al (1999)]. Screeningtests können einen direkten Rezeptorbindungsprofiltest nach sich ziehen, wie unten in Beispiel 3 beschrieben. Alternativ kann die Rezeptorbindung indirekt durch Untersuchung auf eine durch Rezeptorbindung induzierte biologische Aktivität getestet werden. Das Screening kann das Inkontaktbringen des Hybrid-Polypeptids mit einer Zelle umfassen, die den Rezeptor exprimiert, wobei Änderungen im Zellwachstum oder Zellüberleben, die durch das Hybrid-Polypeptid induziert werden, die Bindung zwischen dem Hybrid-Polypeptid an dem Rezeptor anzeigen.
Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Polypeptide erzeugt werden können, und erfindungsgemäße Polypeptide mit größerer Affinität als für jeden natürlich vorkommenden VEGF binden, sind ebenfalls vorgesehen. Polypeptide, die die antigenbindenden Fragmente solcher Antikörper umfassen, sind ebenfalls vorgesehen. Antikörper, die an erfindungsgemäße Polypeptide, nicht jedoch an Vertebraten-VEGF-C binden, sind vorgesehen.
Allgemein gesprochen, sind erfindungsgemäße Polypeptide nützlich zur Modulierung (Stimulierung oder Hemmung) zellulärer Vorgänge, die durch irgend einen der Rezeptoren der PDGF/VEGF-Familie wie beispielsweise PDGFR-α, PDGFR-β, VEGFR-1, VEGFR-2 und/oder VEGFR-3 vermittelt werden. Diese Rezeptoren können in bestimmten Prozessen einzeln und in anderen Prozessen in Kombination, in unterschiedlichem Ausmaß, beteiligt sein. Erfindungsgemäße Polypeptide besitzen viele verschiedene Rezeptorbindungsprofile, und einer der Vorteile der Erfindung besteht in der Fähigkeit, ein Polypeptid mit einem Rezeptorbindungsprofil auszuwählen, das dem Rezeptorexpressionsprofil des zu modulierenden biologischen Prozesses entspricht.
1 stellt eine perspektivische Ansicht eines dreidimensionalen Modells eines VEGF-A-Monomers dar, bei dem ausgewählte Sekundärstrukturelemente kenntlich gemacht sind. Ein VEGF-A-kodierendes Polynukleotid wurde zur Konstruktion von VEGF-A/VEGF-C-Chimären in neun Segmente aufgeteilt, und die Kennzeichnungen 1–9 machen den Ort der Peptide kenntlich, die durch die neun Segmente jeweils kodiert werden.
2 ist ein schematisches Diagramm von 9 VEGF-A- und 9 VEGF-C-DNA-Fragmenten, die zur Konstruktion der VEGF-A/VEGF-C-Hybridmoleküle verwendet wurden. Diese Fragmente sind oben von 1 bis 9 durchnummeriert. Die N123-, N45-, C67- und 1089-Fragmentgruppen sind ebenfalls gekennzeichnet. N123 besteht aus 3 VEGF-A-Fragmenten und 3 VEGF-C-Fragmenten (Fragmente 1–3), wohingegen N45 (Fragmente 4–5), C67 (Fragmente 6–7) und C89 (Fragmente 8–9) jeweils aus 2 VEGF-A-Fragmenten und 2 VEGF-C-Fragmenten bestehen. Ausgewählte Restriktionsendonukleasestellen sind ebenfalls dargestellt.
3 stellt schematisch alle 8 möglichen DNA-Moleküle dar, die der N123-Region entsprechen, resultierend aus der Ligation verschiedener Kombinationen der Fragmente 1, 2 und 3 von VEGF-A (A1, A2 A3) und VEGF-C (C1, C2 und C3).
4 stellt schematisch alle 4 möglichen DNA-Moleküle dar, die der N45-Region entsprechen, resultierend aus der Ligation verschiedener Kombinationen der Fragmente 4 und 5 von VEGF-A und VEGF-C.
5 stellt schematisch alle 4 möglichen DNA-Moleküle dar, die der C67-Region entsprechen, resultierend aus der Ligation verschiedener Kombinationen der Fragmente 6 und 7 von VEGF-A und VEGF-C.
6 stellt schematisch alle 4 möglichen DNA-Moleküle dar, die der C89-Region entsprechen, resultierend aus der Ligation verschiedener Kombinationen der Fragmente 8 und 9 von VEGF-A und VEGF-C.
Die 7A–7D stellen in Rahmen die durch die DNA-Fragmente A1–A9 (SEQ ID NO: 128–136) und C1–C9 (SEQ ID NO: 137–145) kodierten Aminosäuresequenzen dar, und stellen die Art und Weise dar, in der längere kodierte Aminosäuresequenzen durch Verbinden der Fragmente A1–A3 und C1–C3 in der N123-Ligation (7A), der Fragmente A4–A5 und C4–C5 in der N45-Ligation (7B), der Fragmente A6–A7 und C6–C7 in der C67-Ligation, und der Fragmente A8–A9 und C8–C9 in der C89-Ligation gebildet wurden. In jeder Figur repräsentieren Pfeile Peptidbindungen zwischen kodierten Aminosäuresequenzen, die aus richtiger Ligation kompatibler DNA-Fragmente und Translation der erhaltenen ligierten DNA resultieren.
8 ist ein dreidimensionales Modell, das die Wechselwirkung eines VEGF-A-Dimers mit zwei VEGFR-1-Molekülen zeigt. Reste innerhalb der VEGF-A-Monomere, die für die Kopplung mit VEGFR-1 wichtig sind, sind an den zwei Enden des VEGF-A-Dimers gebündelt und beinhalten die N-terminale Helix und Teile des β5-Strangs.
9 ist ein dreidimensionales Modell, das die durch ein VEGF-C-Dimer gebildete Furche darstellt. Der Eingang und die Seiten dieser Furche werden durch die in Beispiel 4 beschriebenen Fragmente gebildet, die für die Vermittlung der VEGFR-3-Spezifität wichtig sind.
10 ist ein dreidimensionales Modell einer der Wechselwirkung zwischen einem VEGF-C-Dimer und einem einzelnen VEGFR-3-Molekül, extrapoliert aus dem VEGF-A/VEGFR-A-Modell.
Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren synthetisiert werden, einschließlich jener, die in der Zusammenfassung der Erfindung und den Beispielen beschrieben sind. Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können konventionellen Techniken entsprechend in Lösung oder auf einem festen Träger syntheti siert werden. Verschiedene automatische Synthetisierer sind kommerziell erhältlich und können nach bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe z.B. Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Co., (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442, (1983); Merrifield, Science, 232: 341–347, (1986); und Barany und Merrifield, The Peptides, Gross und Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, 1–284; Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705–739 (1987); und U.S.-Pat. Nr. 5.424.398).
Festphasen-Peptidsyntheseverfahren verwenden ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer enthaltend 0,1–1,0 mNol Amine/g Polymer. Diese Verfahren für die Peptidsynthese verwenden Butyloxycarbonyl(t-BOC) oder 9-Fluorenylmethyloxycarbony(FMOC) zum Schutz von Alpha-Aminogruppen. Beide Verfahren beinhalten schrittweise Synthesen, wobei, beginnend am C-Terminus des Peptids, mit jedem Schritt eine einzelne Aminosäure addiert wird (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Einheit 9). Nach der Vervollständigung der chemischen Synthese können die Peptide entschützt werden, um die t-BOC- oder FMOC-Aminosäure-Blockierungsgruppe zu entfernen, und durch Behandlung mit Säure bei verminderter Temperatur (z.B. flüssiges HF-10% Anisol für etwa 0,25 bis etwa 1 Stunde bei 0°C) vom Polymer abgespalten werden. Nach Verdampfung der Reagenzien werden die Peptide von dem Polymer mit 1% Essigsäurelösung extrahiert, die dann lyophylisiert wird, um das Rohmaterial zu erhalten. Dies kann normalerweise durch solche Techniken wie die Gelfiltration auf Sephadex-G15 unter Verwendung von 5% Essigsäure als Lösungsmittel gereinigt werden. Lyophylisation von geeigneten Fraktionen der Säule ergibt das homogene Peptid oder Peptidderivate, die dann durch solche Standardtechniken wie beispielsweise Aminosäureanalyse, Dünnschichtchromatographie, Hochdruckflüssigch romatographie, Ultraviolettabsorptionsspektroskopie, molare Drehung oder Löslichkeit charakterisiert und durch Festphasen-Edman-Abbau quantifiziert werden können.
Andere Verfahren, wie beispielsweise die Selektierung von Peptiden aus einer Phagendisplaybibliothek, sind zur Verbesserung bei den speziell hier beschriebenen Peptiden erhältlich. Bibliotheken können aus Gruppen von Aminosäuren, wie hier beschrieben, hergestellt werden. Das Phagendisplay kann insbesondere bei der Identifizierung bindender Peptide effektiv sein, die gemäß der Erfindung geeignet sind. Kurz gesagt, stellt man eine Phagenbibliothek her (unter Verwendung von z.B. ml-13-, fd- oder Lambda-Phagen), die Insertionen von 4 bis etwa 80 Aminosäureresten anzeigen. Die Insertionen können zum Beispiel einen vollständige degenerierten oder unausgewogenen Bereich repräsentieren. Anschließend kann man Phagentragende Insertionen auswählen, die an den/die Ziel-VEGF-Rezeptor(en) binden. Dieses Verfahren kann über mehrere Zyklen der Reselektion von Phagen, die den/die Ziel-Rezeptoren) binden, wiederholt werden. Wiederholte Runden führen zur Anreicherung von Phagen, die bestimmte Sequenzen tragen. Eine DNA-Sequenzanalyse kann durchgeführt werden, um die Sequenzen der exprimierten Polypeptide zu identifizieren. Der minimale lineare Teil der Sequenz, der an den/die Ziel-Rezeptor(en) bindet, kann festgestellt werden. Man kann dieses Verfahren wiederholen unter Verwendung einer unausgewogenen Bibliothek, die Insertionen enthält, die die minimalen linearen Bereiche teilweise oder vollständig plus ein oder mehr zusätzliche degenerierte Reste stromaufwärts oder stromabwärts davon enthalten. Diese Techniken können erfindungsgemäße Peptide mit noch größerer Rezeptorbindungsaffinität als hier bereits beschriebene Peptide identifizieren. Das Screening des erhaltenen Peptids gegen mehrere Rezeptoren identifiziert Peptide mit multiplen Rezeptorbindungsaffinitäten. Hefe-Zwei-Hybrid-Screeningverfahren können ebenfalls verwendet werden, um Polypeptide zu identifizieren, die an den/die Ziel-Rezeptoren) binden.
Alternativ kann eine Vielzahl von Expressionsvektor/Wirtssystemen verwenden werden, um die chimären Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zu beinhalten und zu exprimieren. Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Mikroorganismen wie beispielsweise mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformierte Bakterien, mit Hefeexpressionsvektoren transformierte Hefe; mit Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infizierte Insektenzellsysteme; mit Virus-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus CaMV, Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti- oder pBR322-Plasmid) transfizierte Pflanzenzellsysteme; oder Tierzellsysteme. Säugetierzellen, die bei der Herstellung rekombinanter Proteine geeignet sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf VERO-Zellen, HeLa-Zellen, Chinahamsterovar(CHO-)Zellinien, COS-Zellen (wie beispielsweise COS-7), W138-, BHK-, HepG2-, 3T3-, RIN-, MDCK-, A549-, PC12-, K562- und 293-Zellen. Beispielhafte Protokolle für die rekombinante Expression des Proteins sind unten beschrieben.
Das chimärer Propeptid kann beispielsweise unter Verwendung kommerziell erhältlicher Expressionssysteme, zum Beispiel dem Pichia-Expressionssystem (Invitrogen, San Diego, CA), nach Herstelleranweisungen in Hefe rekombinant exprimiert werden. Dieses System beruht auch auf der Präpro-Alphasequenz zur Steuerung der Sekretion, die Transkription der Insertion wird jedoch durch den Alkoholoxidase-Promotor bei Induktion durch Methanol angetrieben.
Das sekretierte Peptid wird zum Beispiel durch die Verfahren, die zur Aufreinigung des chimären Peptids aus Bakterien- und Säugetierzellüberständen eingesetzt werden, aus dem Hefeanzuchtsmedium aufgereinigt.
Alternativ kann die das Peptid kodierende cDNA in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 (PharMingen, San Diego, SA) kloniert werden. Dieser Vektor wird dann nach den Anweisungen des Herstellers (PharMingen) eingesetzt, um Spodopterafrugiperda-Zellen in sF9-proteinfreien Medien zu infizieren und rekombinantes Protein herzustellen. Das Protein wird aus den Medien unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) und sequenzieller "Molecularsizing"-Säulen (Amicon, Beverly, MA) aufgereinigt und konzentriert und in PBS resuspendiert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt eine einzelne Bande und bestätigt die Größe des Proteins, und Edman-Sequenzierung mit einem Porton-2090-Peptidsequenzierer bestätigt dessen N-terminale Sequenzen.
Alternativ kann das Peptid in einem Insektensystem exprimiert werden. Insektensysteme für die Proteinexpression sind dem Fachmann gut bekannt. In einem solchen System wird der nukleäre Polyhedrose-Virus von Autographa californica (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene in Spodoptera-frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven eingesetzt. Die peptidkodierende Sequenz wird in eine unwesentliche Region des Virus, wie beispielsweise das Polyhedrin-Gen, kloniert und unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gebracht. Die erfolgreiche Insertion des Peptids inaktiviert das Polyhedrin-Gen und erzeugt rekombinanten Virus, dem die Hülle aus dem Hüllprotein fehlt. Die rekombinanten Viren werden dann verwendet, um S.-frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren, in denen das Peptid exprimiert wird (Smith et al., J Virol 46: 584, 1983; Engelhard EK et al., Proc Nat Acad Sci 91: 3224–7, 1994).
In einem anderen Beispiel wird die für das Peptid kodierende DNA-Sequenz durch PCR amplifiziert und in einen geeigneten Vektor, zum Beispiel pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ), kloniert. Der pGEX-Vektor ist dazu ausgelegt, ein Fusionsprotein herzustellen, welches durch den Vektor kodierte Glutathion-S-transferase (GST) und ein Protein umfasst, das durch ein in die Klonierungsstelle des Vektors inseriertes DNA-Fragment kodiert wird. Die Primer für die PCR können so erzeugt werden, dass sie beispielsweise eine geeignete Spaltstelle beinhalten.
Wenn der Fusionspartner nur dazu verwendet wurde, die Expression zu erleichtern oder ansonsten nicht als Anhang des interessierenden Peptids erwünscht ist, kann das rekombinante Fusionsprotein dann von dem GST-Teil des Fusionsproteins abgespalten werden. Das pGEX-3X/Chimärprotein-Konstrukt wird in E.-coli-XL-1-Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla CA) transformiert und einzelne Transformanten werden isoliert und angezogen.
Plasmid-DNA von einzelnen Transformanten wird gereinigt und teilweise sequenziert unter Verwendung eines automatischen Sequenzierers, um die Anwesenheit der Nukleinsäureinsertion, die das chimäre Peptid kodiert, in der richtigen Orientierung zu bestätigen.
Besonders bevorzugte Peptidzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind solche, die mit einem beliebigen Antitumor-Peptid wie beispielsweise einem Tumornekrosefaktor (TNF) konjugiert sind. In einem besonders bevorzugten Verfahren werden die TNF-Peptidchimären als rekombinante Fusionen mit "in frame" zu TNF (Novagen) kodierenden Sequenzen fusionierten peptidkodierenden Sequenzen fusioniert. Peptid-TNF-cDNA wird in den pET-11b-Vektor (Novagen) kloniert und die Expression von TNF-Peptiden in E. coli BL21 wird gemäß Anweisungen des Herstellers von pET-11b induziert. Lösliche TNF-Peptide werden durch Ammoniumsulfatpräparation, Hydrophobizitätsinteraktionschromatographie auf Phenyl-Sepharose-6 Fast Flow, Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose Fast Flow und Gelfiltrationschromatographie auf Sephacryl-S-300-HR aus Bakterienlysaten gereinigt.
Es ist vorgesehen, dass die Herstellung rekombinanten Proteins auch dazu verwendet werden kann, chimäre Peptidzusammensetzungen herzustellen. Zum Beispiel wird die Induktion der GST/Peptidchimäre erreicht durch Anzucht der transformierten XL-1-Blue-Kultur bei 37°C in LB-Medium (versetzt mit Carbenicillin) zu einer optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm von 0,4, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 4 Stunden in Gegenwart von 0,5 mM Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Das Fusionsprotein, von dem erwartet wird, dass es in den Bakterien als unlösliche Einschlusskörper hergestellt wird, kann wie folgt aufgereinigt werden. Die Zellen werden durch Zentrifugationen geerntet; in 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA gewaschen; und mit 0,1 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co.) für 15 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Das Lysat wird durch Ultraschallbehandlung geklärt und die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 ×g niedergeschlagen. Der Fusionsprotein-haltige Niederschlag wird in 50 mM Tris, pH 8, und 10 mM EDTA resuspen diert, über 50% Glycerin geschichtet und für 30 Minuten bei 6000 × g zentrifugiert. Der Niederschlag wird in gewöhnlicher phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), frei von Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺, resuspendiert. Das Fusionsprotein wird durch Fraktionierung des resuspendierten Niederschlags in einem denaturierenden SDS-Polyakrylamidgel (Sambrook et al., oben) weiter aufgereinigt. Das Gel wird in 0,4 M KCl getränkt, um das Protein sichtbar zu machen, welches ausgeschnitten und in Gel-Laufpuffer ohne SDS elektroeluiert wird. Wenn das GST/Peptidchimäre-Fusionsprotein als lösliches Protein in Bakterien hergestellt wird, kann es unter Verwendung des GST-Reinigungsmoduls (Pharmacia Biotech) gereinigt werden.
Das Fusionsprotein kann einem Verdau unterzogen werden, um das GST von dem erfindungsgemäßen chimären Peptid abzuspalten. Die Verdauungsreaktion (20–40 µg Fusionsprotein, 20–30 Einheiten menschliches Thrombin (4000 U/mg (Sigma) in 0,5 ml PBS) wird 16–48 Std. bei Raumtemperatur inkubiert und auf ein denaturierendes SDS-PAGE-Gel geladen, um die Reaktionsprodukte zu fraktionieren. Das Gel wird in 0,4 M KCl getränkt, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Die Identität der Proteinbande, die dem erwarteten Molekulargewicht des chimären Peptids entspricht, kann durch Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung eines automatisierten Sequenzierers (Applied Biosystems Modell 473A, Foster City, CA) bestätigt werden. Alternativ kann die Identität mittels Durchführung von HPLC und/oder Massenspektrometrie der Peptide bestätigt werden.
Alternativ kann die das chimäre Peptid kodierende DNA-Sequenz in ein Plasmid kloniert werden, das einen gewünschten Promotor und, optional, eine Leadersequenz beinhaltet (siehe z.B. Retter et al., Science, 240: 1041–43, 1988). Die Sequenz dieses Konstrukts kann durch automatisierte Sequenzierung bestä tigt werden. Das Plasmid wird dann unter Verwendung von Standardverfahren unter Einsatz von CaCl₂-Inkubation und Hitzeschockbehandlung der Bakterien. in den E.-coli-Stamm MC1061 transformiert (Sambrook et al., oben). Die transformierten Bakterien werden in mit Carbenicillin versetztem LB-Medium angezogen und die Herstellung des exprimierten Proteins wird durch Anzucht in einem geeigneten Medium induziert. Falls vorhanden, wird die Leadersequenz die Sekretion des chimären Peptids bewirken und bei der Sekretion abgespalten.
Das sekretierte rekombinante Protein wird durch die hier beschriebenen Verfahren aus dem bakteriellen Kulturmedium aufgereinigt.
Säugetierwirtssysteme für die Expression des rekombinanten Proteins sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt. Wirtszellstämme können hinsichtlich der besonderen Fähigkeit, das exprimierte Protein zu verarbeiten oder bestimmte posttranslationelle Modifikationen zu produzieren, die zur Bereitstellung von Proteinaktivität nützlich sind, ausgewählt werden. Solche Modifikationen des Polypeptids beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Verschiedene Wirtszellen wie beispielsweise CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 und dergleichen weisen spezifische zelluläre Maschinerien und charakteristische Mechanismen für solche posttranslationellen Aktivitäten auf und können dahingehend ausgewählt werden, die korrekte Modifikation und Prozessierung des eingeführten fremden Proteins sicherzustellen.
Es ist bevorzugt, dass die transformierten Zellen für eine langfristige und hohe Erträge erzielende Proteinproduktion verwendet werden, und daher ist eine stabile Expression wün schenswert. Sobald solche Zellen einmal mit Vektoren transformiert wurden, die zusammen mit der gewünschten Expressionskassette selektierbare Marker enthalten, können die Zellen für 1–2 Tage in einem Anreicherungsmedium angezogen werden, bevor sie auf Selektionsmedium umgesetzt werden. Der selektierbare Marker ist dahingehend gestaltet, Resistenz zur Selektion zu übertragen, und seine Anwesenheit ermöglicht Wachstum und Gewinnung von Zellen, die die eingeführten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klumpen stabil transformierter Zellen können unter Verwendung von Zellkulturtechniken, die für die Zellen angemessen sind, proliferiert werden.
Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden, um die Zellen, die transformiert wurden, für die Herstellung rekombinanten Proteins zu gewinnen. Solche Selektionssysteme beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf HSV-Thymidinkinase-, Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase- und Adenin-Phosphoribosyltransferasegene in tk-, hgprt- bzw. aprt-Zellen. Antimetabolitenresistenz kann als Basis der Selektion für dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat überträgt; gpt, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure überträgt; neo, das Resistenz gegenüber dem Aminoglykosid G418; das auch Resistenz gegenüber Chlorsulfon überträgt; und hygro, das Resistenz gegenüber Hygromycin überträgt, verwendet werden. Weitere selektierbare Gene, die nützlich sein können, beinhalten trpB, das es Zellen ermöglicht, Indol an Stelle von Tryptophan zu verwenden, oder hisD, welches es Zellen ermöglicht, Histinol an Stelle von Histidin zu verwenden. Marker, die eine visuelle Anzeige zur Identifikation von Transformanten geben, beinhalten Anthocyane, Beta-Glucoronidase und dessen Substrat, und Luziferase und dessen Substrat Luziferin.
Für bestimmte Anwendungen kann es wünschenswert sein, Peptide oder Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, die gegenüber proteolytischem Verdau resistent sind. Solche Peptide können nicht-hydrolysierbare Peptidbindungen beinhalten und Peptide, die Endmodifikationen wie beispielsweise ein Amid (z.B. CONH₂) am C-Terminus oder eine Acetylgruppe am N-Terminus aufweisen. Es ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Peptide modifiziert werden, so dass ihre Halbwertszeit in vivo erhöht ist, ihre physikalische Stabilitat erhöht ist, die Freisetzungsgeschwindigkeit in vivo und die Geschwindigkeit der Beseitigung ("clearance") in vivo ebenfalls beeinflusst sein kann.
Um nicht-hydrolysierbare Peptide herzustellen, kann man Peptide aus einer Bibliothek nicht-hydrolysierbarer Peptide selektieren oder in ausgewählte Peptide Modifikationen, wie beispielsweise ein oder mehrere D-Aminosäuren oder ein oder mehrere nicht-hydrolysierbare Aminosäure verbindende Peptidbindungen einführen. Zum Beispiel kann man Peptide auswählen, die ein gewünschtes Rezeptorbindungsprofil aufweisen und dann diese Peptide soweit erforderlich modifizieren, um das Hydrolysepotenzial durch Proteasen zu vermindern. Zum Beispiel können Peptide zur Feststellung der Empfindlichkeit gegenüber proteolytischer Spaltung markiert und mit Zellextrakten oder gereinigten Proteasen inkubiert und dann isoliert werden, um festzustellen, welche Peptidbindungen gegenüber Proteolyse empfindlich sind, zum Beispiel durch Sequenzierung von Peptiden und proteolytischen Fragmenten. Alternativ können potentiell empfindliche Peptidbindungen durch Vergleich der Aminosäuresequenz des Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung mit der bekannten Spaltstellenspezifität einer Reihe von Proteasen identifiziert werden. Auf Grundlage der Ergebnisse sol cher Tests können einzelne Peptidbindungen, die gegenüber Proteolyse empfindlich sind, durch In-vitro-Synthese des Peptids mit nicht-hydrolysierbaren Peptidbindungen ersetzt werden.
Viele nicht-hydrolysierbare Peptidbindungen sind zusammen mit Verfahren zur Synthese von Peptiden, die solche Bindungen enthalten, im Stand der Technik bekannt. Nicht-hydrolysierbare Bindungen beinhalten -[CH₂NH]- reduzierte Amid-Peptidbindungen, -[CH(CN)NH]-(Cyanomethylen)amino-Peptidbindungen, -[CH₂CH(OH)]-Hydroxyethylen-Peptidbindungen, -[CH₂O)]-Peptidbindungen und -[CH₂S)]-Thiomethylen-Peptidbindungen (siehe z.B. U.S.-Patent 6.172.043 ).
Bei der Erfindung nützliche Peptide können linear sein oder können zyklisch oder durch natürliche oder synthetische Mittel zyklisiert sein. Zum Beispiel können Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten eine Peptidsequenz zyklisieren. Bifunktionelle Reagenzien können verwendet werden, um eine Verknüpfung zwischen zwei oder mehr Aminosäuren eines Peptids zu bilden. Andere Verfahren zur Zyklisierung von Peptiden wie beispielsweise jene, die durch Anwer et al. (Int. J Pep. Protein Res. 36: 392–399, 1990) und Rivera-Baeza et al. (Neuropeptides 30: 327–333, 1996) beschrieben wurden, sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt.
Darüber hinaus sind auch Nichtpeptid-Analoga von Peptiden vorgesehen, die eine stabilisierte Struktur oder einen verminderten Bioabbau ergeben. Peptid-nachahmende Analoga können auf Basis eines ausgewählten Peptids durch Ersetzung von einem oder mehreren Resten durch Nichtpeptid-Reste hergestellt werden. Vorzugsweise erlauben die Nichtpeptid-Reste es dem Peptid, seine natürliche Konformation zu bewahren oder eine bevorzugte z.B. bioaktive Konformation zu stabilisieren. Ein Beispiel für Verfahren zur Herstellung von mimetischen Nichtpeptid-Analoga aus Peptiden ist in Nachman et al., Regul. Pept. 57: 359–370 (1995) beschrieben. Der hier verwendete Ausdruck Peptid umfasst alles Vorstehende.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide beinhalten Polypeptide, die zum Beispiel durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung oder durch die Erzeugung von Säureadditionssalzen, Amiden, Estern, insbesondere C-terminalen Estern, und N-Acyl-Derivaten modifiziert sind.
Wie oben beschrieben, umfasst die Erfindung auch Polypeptide, die durch Bildung kovalenter oder nicht-kovalenter Komplexe mit anderen Resten modifiziert sind. Kovalent gebundene Komplexe können durch Verknüpfung der chemischen Reste mit funktionellen Gruppen auf den Seitenketten von Aminosäuren, die die Peptide ausmachen, oder am N- oder C-Terminus hergestellt werden.
Insbesondere ist vorgesehen, dass die vorstehend genannten Peptide an eine Reportergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine Radiomarkierung, eine Fluoreszenzmarkierung, ein Enzym (das z.B. eine kolorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysiert), ein Substrat, eine feste Matrix oder einen Träger (zum Beispiel Biotin oder Avidin) konjugiert werden können. Die Erfindung stellt entsprechend ein Molekül bereit, das ein chimäres Polypeptid umfasst, umfassend eine Mehrzahl von Peptiduntereinheiten, die aus einem oder mehr Gefäßendothelwachstumsfaktor-Polypeptiden abgeleitet sind, wobei das chimäre Polypeptid vorzugsweise darüber hinaus eine Reportergruppe umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Radiomarkierung, einer Fluo reszenzmarkierung, einem Enzym, einem Substrat, einer festen Matrix und einem Träger. Die Verwendung solcher Markierungen ist gut bekannt und z.B. im US Patent Nr. 3.817.837 , U.S.-Patent Nr. 3.850.752 , U.S.-Patent Nr. 3.996.345 und im US Patent Nr. 4.277.437 beschrieben. Andere Markierungen, die geeignet sein werden, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf radioaktive Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen. U.S.-Patente, die die Verwendung solcher Markierungen betreffen, beinhalten zum Beispiel das U.S.-Patent Nr. 3.817.837 , U.S.-Patent Nr. 3.850.752 , U.S.-Patent Nr. 3.939.350 und das US Patent Nr. 3.996.345 . Jedes der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein, zwei oder mehrere dieser Markierungen umfassen.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide
Die vielen biologischen Aktivitäten, die durch die PDGF/VEGF-Rezeptorfamilie vermittelt werden (einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Beeinflussung des Wachstums und der Migration von Gefäßendothelzellen und Blutgefäßen; die Förderung des Wachstums von lymphatischen Endothelzellen und Lymphgefäßen; die Erhöhung der vaskulären Permeabilität; und die Beeinflussung der Myelopoese) stützen zahlreiche diagnostische sowie klinische In-vitro- und In-vivo-Anwendungen für erfindungsgemäße Polypeptide, die in der Lage sind, einen oder mehrere Mitglieder der VEGF-Rezeptorfamilie zur Modulierung (Stimulierung oder Inhibierung) dieser biologischen Aktivitäten zu binden.
Es existieren vielfältige Mechanismen, durch die erfindungsgemäße Polypeptide als Wachstumsfaktoren (d.h. Agonisten oder Rezeptorstimulanzien) wirken werden. Zum Beispiel werden erfindungsgemäße Polypeptide, die Homodimere bilden, die eine oder mehrere Mitglieder der VEGF-Rezeptorfamilie binden und aktivieren, als vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren nützlich sein. Alternativ werden erfindungsgemäße Polypeptide, die Heterodimere mit endogenen Wachstumsfaktor-Polypeptiden (VEGF-A oder VEGF-C oder anderen Familienmitgliedern) bilden, auch wirksame Agonisten sein, vorausgesetzt, dass die so gebildeten Heterodimere in der Lage sind, Rezeptoren zur Induktion der Signalübertragung zu binden und zu aktivieren.
Es existieren vielfältige Mechanismen, durch die erfindungsgemäße Polypeptide als Inhibitoren (Antagonisten) von Wachstumsfaktoren der VEGF-Familie agieren werden. Erfindungsgemäße Polypeptide, die einen oder mehrere Rezeptoren binden, diese jedoch nicht stimulieren, werden die Stimulation des Rezeptors durch endogenen Wachstumsfaktor hemmen, wodurch sie als Inhibitor von endogenem Wachstumsfaktor agieren. Solch ein Versagen hinsichtlich der Stimulation kann vollständig oder teilweise auf die Unfähigkeit zurückzuführen sein, den Rezeptor zu dimerisieren, möglicherweise aufgrund einer Unfähigkeit des erfindungsgemäßen Hybridpolypeptids, Wachstumsfaktor-Homodimere zu bilden. Erfindungsgemäße Polypeptide, die Heterodimere mit endogenen Wachstumsfaktor-Polypeptiden bilden, werden die Stimulation von VEGF-Rezeptoren hemmen, wenn das Heterodimer keine Rezeptoren bindet, oder wenn das Heterodimer nur an einen einzelnen Rezeptor oder ein heterologes Rezeptorpaar in einer Weise bindet, die die Rezeptoraktivierung und Signalübertragung verhindert. Unabhängig vom Mechanismus sind erfindungsgemäße Polypeptide, die aktivitätszerstörende Heterodimere mit endogenen VEGF-Polypeptiden bilden (und die keine aktiven Homodimere bilden), als Antagonisten der natürlichen endogenen VEGF-Aktivität nützlich. Darüber hinaus kann jedes Polypeptid, das einen Rezeptor bindet, an ein zytotoxisches oder zytostatisches Mittel konju giert werden, um solche Mittel einer Zielzelle zuzufügen. Die Anheftung eines solchen Mittels ist ein anderes Mittel zur Hemmung des Wachstums von Zellen, bei denen VEGF-Polypeptide eine mitogene Reaktion zeigen. Beispielhafte Toxine beinhalten Chemotherapeutika, Radionuklide, Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussistoxin etc.
Es wird auch ersichtlich sein, dass zwei oder mehr erfindungsgemäße Hybridpolypeptide gemischt werden können, und das so gebildete Heterodimere in Abhängigkeit von ihren rezeptorbindenden und -stimulierenden Eigenschaften als Modulatoren nützlich sein werden. Da erfindungsgemäße Polypeptide Hybride sind, die von natürlich vorkommenden vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren abgeleitet sind, die unterschiedliche Rezeptorbindungsprofile aufweisen können, ist vorgesehen, dass einige der Hybride als Aktivatoren von einem oder mehreren Rezeptoren und einige als Inhibitoren von einem oder mehreren Rezeptoren agieren werden. Hier beschriebene Verfahren und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren können verwendet werden, um die rezeptorbindenden, rezeptoraktivierenden und rezeptorhemmenden Eigenschaften von erfindungsgemäßen Polypeptiden zu bestimmen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die einen oder mehrere VEGF-Rezeptoren binden und aktivieren, können zur Förderung der Angiogenese und/oder Lymphangiogenese nützlich sein, zum Beispiel, um die Wundheilung zu fördern, die Gewebetransplantation zu erleichtern und um die Bildung von kollateralen Gefäß um arterielle Stenosen herum und in verletzten Geweben nach einem Infarkt zu fördern, um Ischämie zu behandeln. Auf der anderen Seite können erfindungsgemäße Polypeptide, die als Antagonisten von endogenen VEGF-Proteinen fungieren, in therapeutischen Anwendungen zur Behandlung von Krankheiten wie beispielsweise Neoplasien, Retinopathie, rheumatoider Arthritis und Psoriasis, bei denen die Suppression der Angiogenese wünschenswert ist, verwendet werden.
Erfindungsgemäße Polypeptide unterscheiden sich von natürlichen VEGF-Rezeptor-Liganden darin, dass einige von ihnen einen der VEGF-Rezeptoren selektiv binden und auf diese Weise dazu verwendet werden können, die Signalübertragung durch einen bestimmten VEGF-Rezeptor spezifisch zu induzieren. Zum Beispiel können Polypeptide, die ausschließlich die VEGFR-3-Signalübertragung induzieren, therapeutisch verwendet werden, um die lymphatischen Endothelien von Individuen, die an lymphatischen Funktionsstörungen leiden, anzusteuern, um die Struktur und Funktion der lymphatischen Vaskulatur solcher Individuen zu verbessern. Solche Polypeptide können auch verwendet werden, um eine Neoplasie anzugehen, die durch Zellen gekennzeichnet ist, die VEGFR-3 auf ihren Oberflächen exprimieren. Die Chemotaxis von Monozyten/Makrophagen [Barleon et al., Blood 87: 3336–3343 (1996)) aufgrund von VEGFs wird durch VEGFR-1 vermittelt. Moleküle, die den VEGFR-1-Rezeptor spezifisch ansteuern, können daher verwendet werden, um therapeutische Wirkungen auf diesen bestimmten VEGF-Rezeptor auszuüben. Inhibitoren von VEGFR-1 können beispielsweise verwendet werden, um eine viral induzierte Angiogenese zu verhindern, und Moleküle, die VEGFR-1 spezifisch aktivieren, können verwendet werden, um die Monozyten/Makrophagen-Migration zu fördern. VEGFR-2 ist für die Angiogenese essentiell und ausreichend für die viral induzierte Angiogenese. Inhibitoren von VEGFR-2 können daher verwendet werden, um die Angiogenese, einschließlich der durch virale VEGFs induzierten, zu hemmen, wohingegen Moleküle, die VEGFR-2 stimulieren, zur Förderung der Angiogenese nützlich sein können.
Eine Untergruppe der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung kann Kombinationen von VEGF-Rezeptoren binden, die für bekannte natürliche VEGF-Liganden nicht demonstriert wurden, oder sind in der Lage, alle drei bekannten VEGF-Rezeptoren VEGFR-1,R2 und R-3 zu binden. Diese Polypeptide können für Therapien nützlich sein, bei denen die Aktivierung oder Hemmung verschiedener Kombinationen von VEGF-Rezeptoren gewünscht ist.
Erfindungsgemäße Polypeptide, die VEGFR-3 aktivieren können, können verwendet werden, um die endothelialen Funktionen von Lymphgefäßen und -geweben zu fördern, um beispielsweise den Verlust von Lymphgefäßen, Okklusionen von Lymphgefäßen, Lymphangiome und primäre idiopathische Lymphödeme, einschließlich der Milroy-Krankheit und Lymphödema praecox sowie sekundäre Lymphödeme, einschließlich jenen, die aus der Entfernung von Lymphknoten und -gefäßen, Strahlentherapie und Operationen bei der Krebs-, Trauma- und Infektionsbehandlung resultieren, zu behandeln. Polynukleotide oder Polypeptide gemäß der Erfindung könnten als bloße prophylaktische Behandlung zur Vorbeugung von Lymphödemen bei Personen verabreicht werden, die einem Risiko ausgesetzt sind, ein Lymphödem zu entwickeln, oder als therapeutische Behandlung bei Personen, die unter Lymphödemen leiden, um deren Symptome (z.B. Schwellung aufgrund der Ansammlung von Lymphe) zu lindern.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Polypeptide, die VEGFR-3 aktivieren, können auch verwendet werden, um das Neuwachstum oder die Permeabilität von Lymphgefäßen bei Patienten zu fördern, deren axilläre Lymphgefäße während eines operativen Eingriff bei der Behandlung von Krebs (z.B. Brustkrebs) entfernt wurden. Erfindungsgemäße Polynukleotide und Polypeptide können verwendet werden, um die Vaskularisierung bei zum Beispiel organtransplantierten Patienten zu behandeln. Eine Zusammensetzung, die das/die erfindungsgemäße(n) Polypeptid(e) enthält, kann direkt auf den isolierten Gefäßabschnitt angewendet werden, bevor er in vivo verpflanzt wird, um die Abstoßung des transplantierten Materials zu minimieren und die Vaskularisierung des transplantierten Materials zu stimulieren.
Erfindungsgemäße Polypeptide, die die VEGF-Rezeptor-Aktivität aktivieren, können verwendet werden, um Wunden, Operationsschnitte und andere Indikationen zu behandeln, bei denen vernünftigerweise anzunehmen ist, dass deren Heilung gefördert wird, wenn der Prozess der Neovaskularisierung induziert und/oder beschleunigt werden kann.
Wie in größerer Ausführlichkeit oben erklärt und in der Literatur berichtet, ist die Expression von Rezeptoren für vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren in bestimmten Vorläuferzellen, wie beispielsweise hämatopoetischen Vorläuferzellen, beobachtet wurden, und von VEGF-C ist myelopoetische Aktivität beobachtet worden. Diese Beobachtungen geben einen Hinweis darauf, dass Polynukleotide oder Polypeptide gemäß der Erfindung verwendet werden können, um Entzündungen, Infektionen oder Immunfunktionsstörungen durch Modulation der Proliferation, Differenzierung und Reifung, oder Migration von Immunzellen oder hämatopoetischen Zellen zu behandeln oder zu verhindern. Polynukleotide oder Polypeptide gemäß der Erfindung können auch nützlich sein zur Förderung oder Hemmung des Trafficking von Leukozyten zwischen Geweben und Lymphgefäßen und der Migration in den und aus dem Thymus.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Polypeptide können zur Stimulierung der Myelopoese (insbesondere Wachstum von neutrophilen Granulozyten) oder deren Hemmung verwendet werden.
Erfindungsgemäße Polynukleotide und Polypeptide können auch bei der Behandlung von Lungenfunktionsstörungen verwendet werden, um die Blutzirkulation in der Lunge und/oder den Gasaustausch zwischen der Lunge und dem Blutstrom zu verbessern; um die Blutzirkulation zum Herzen und die O₂-Gaspermeabilität in Fällen von Herzinsuffizienz zu verbessern; um den Blutfluss und Gasaustausch bei chronisch-obstruktiver Atemwegserkrankung zu verbessern; und um Zustände wie beispielsweise das kongestive Herzversagen, das die Ansammlung von Flüssigkeit in z.B. der Lunge als Resultat des Anstiegs der Gefäßpermeabilität beinhaltet, zu behandeln, indem auf die Gefäßpermeabilität eine heraufsetzende Wirkung ausgeübt wird, um der Flüssigkeitsansammlung entgegenzuwirken.
Erfindungsgemäße Polynukleotide und Polypeptide könnten zur Behandlung von Malabsorptionssyndromen im Darmtrakt als Ergebnis ihrer die Blutzirkulaticn steigernden und die Gefäßpermeabilität steigernden Aktivitäten verwendet werden.
Polypeptide, die binden, die Signalübertragung durch einen oder mehrere VEGF-Rezeptoren jedoch nicht stimulieren, können verwendet werden, um chronische Entzündungen zu behandeln, die durch erhöhte Gefäßpermeabilität, mit Diabetes verbundene Retinopathie, rheumatoide Arthritis und Psoriasis verursacht werden.
Polynukleotide oder Polypeptide, die in der Lage sind, die Funktion von ein oder mehreren VEGF-Rezeptoren zu hemmen, können auch verwendet werden, um Ödeme, periphere Arterien verschlusskrankheit, Kaposi-Sarkom oder die anomale retinale Entwicklung bei Frühgeburten zu behandeln.
Da Angiogenese und Neovaskularisierung für das Tumorwachstum essentiell sind, kann die Hemmung der angiogenen Aktivität das weitere Wachstum verhindern und sogar zur Rückbildung von soliden Tumoren führen. Gleichermaßen kann die Hemmung der Lymphangiogenese bei Verhinderung von Metastasen dienlich sein. Erfindungsgemäße Polynukleotide und Polypeptide können durch Hemmung der Tumorangiogenese nützlich sein zur Behandlung von Neoplasien, einschließlich Sarkomen, Melanomen, Karzinomen und Gliomen.
Es ist daher vorgesehen, dass eine große Vielzahl von Krebsen unter Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, einschließlich Krebsen von Gehirn (Glioblastom, Astrozytom, Oligodendrogliom, Ependymome), Lunge, Leber, Milz, Niere, Lymphknoten, Pankreas, Dünndarm, Blutzellen, Dickdarm, Magen, Brust, Endometrium, Prostata, Hoden, Eierstock, Haut, Kopf und Nacken, Speiseröhre, Knochenmark, Blut oder anderem Gewebe.
In vielen Zusammenhängen ist es nicht erforderlich, dass die Tumorzellen abgetötet oder dahingehend induziert werden, einen normalen Zelltod oder "Apoptose" durchzumachen. Um eine sinnvolle Behandlung zu erreichen, ist es vielmehr lediglich erforderlich, dass das Tumorwachstum auf ein gewisses Maß verlangsamt oder auf einen bestimmen örtlichen Bereich beschränkt wird und an der Ausbreitung zu anderen Stellen gehindert wird. Es kann jedoch sein, dass das Tumorwachstum vollständig blockiert wird, oder dass eine gewisse Tumorregression erreicht wird. Klinische Begriffe wie beispielsweise "Remission" und "Reduktion der Tumor"-Last sind ebenfalls e benfalls in ihrer normalen Verwendung vorgesehen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann die therapeutische Wirkung aus einer Hemmung der Angiogenese und/oder einer Hemmung der Lymphangiogenese resultieren.
Die Ansteuerung von VEGFR-3 bei der Tumorbildgebung und Antitumortherapie ist in der PCT/US99/23525 ( WO 00/21560 ), veröffentlicht am 20. April 2000, beschrieben. Andere VEGF-Rezeptoren (z.B. VEGFR-1) sind ebenfalls bei der Tumorangiogenese oder -metastase einbezogen worden.
Es gibt Hinweise, dass zumindest VEGF-C und VEGF-D aus der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren zur Verhinderung von Stenose oder Restenose von Blutgefäßen von Nutzen sind. Siehe die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US99/24054 ( WO 00/24412 ), "Use of VEGF-C or VEGF-D Gene or Protein to Prevent Restenosis", eingereicht am 26. Oktober 1999. Erfindungsgemäße Polypeptide und Polynukleotide werden ebenfalls für diese Indikationen von Nutzen sein.
Polynukleotide oder Polypeptide gemäß der Erfindung könnten rein als prophylaktische Behandlung zur Verhinderung von Stenose oder kurz vor und/oder gleichzeitig mit und/oder kurz nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie-Maßnahme verabreicht werden, um die Restenose des Gefäßes zu verhindern.
Mit Verhinderung von Stenose oder Restenose ist eine prophylaktische Behandlung gemeint, um die Stenose oder Restenose, die häufig bei solchen chirurgischen Maßnahmen auftritt, in der Menge/Schwere zu reduzieren oder im Wesentlichen zu unterbinden. Das Polynukleotid oder Polypeptid wird in einer Menge und Form in die Zusammensetzung aufgenommen, die wirk sam ist, die Stimulation von VEGF-Rezeptoren in einem Blutgefäß des Säugetiersubjekts zu fördern, wodurch die Stenose oder Restenose des Blutgefäßes verhindert wird.
Erfindungsgemäße Polypeptide können in einer geeigneten Weise unter Verwendung eines passenden pharmazeutisch annehmbaren Vehikels, z.B. eines pharmazeutisch annehmbaren Diluens, Adjuvans, Exzipiens oder Trägers, verabreicht werden. Die zu verabreichende Zusammensetzung gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst (zusätzlich zu dem Polynukleotid oder Vektor) vorzugsweise eine pharmazeutisch annehmbare Trägerlösung wie beispielsweise Wasser, Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, Glukose oder andere Träger, die üblicherweise verwendet werden, um Therapeutika intramuskulär zuzuführen. Eine Multigentherapie ist ebenfalls vorgesehen, wobei die Zusammensetzung optional sowohl das/den erfindungsgemäße(n) Polynukleotid/Vektor und ein(en) weiteres/weiteren Polynukleotid/Vektor umfasst, der dazu ausgewählt wurde, Restenose zu verhindern. Beispielhafte Kandidatengene/-vektoren für die Kotransfektion mit Transgenen, die erfindungsgemäße Polypeptide kodieren, sind in der oben angegebenen Literatur beschriebenen, einschließlich Genen, die zytotoxische Faktoren, zytostatische Faktoren, endotheliale Wachstumsfaktoren und Wachstums-/Migrationsinhibitoren von Glattmuskelzellen kodieren.
Die vorgenommene "Verabreichung" kann unter Verwendung beliebiger medizinisch anerkannter Mittel zur Einführung eines Therapeutikums direkt oder indirekt in die Vaskulatur eines Säugetiersubjekts vorgenommen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Injektionen (z.B. intravenös, intramuskulär, subkutan oder Katheter); orale Aufnahme; intranasale oder topische Verabreichung; und dergleichen.
Die therapeutische Zusammensetzung kann dem Patienten an mehreren Stellen zugeführt werden. Die mehrfachen Verabreichungen können gleichzeitig vorgenommen werden oder können über eine Zeitdauer von mehreren Stunden verabreicht werden. In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, einen kontinuierlichen Fluss der therapeutischen Zusammensetzung bereitzustellen. Eine weitere Therapie kann auf einer periodischen Basis zum Beispiel täglich, wöchentlich oder monatlich verabreicht werden.
Im allgemeinen sind perorale Dosierformen für die therapeutische Zufuhr von Peptiden ineffizient, da das Peptid, wenn solch eine Formulierung effektiv sein soll, vor der enzymatischen Umgebung des Magendarmtraktes geschützt werden muss.
Darüber hinaus muss das Peptid in einer Weise formuliert werden, dass es leicht durch die Epithelzellbarriere in ausreichenden Konzentrationen absorbiert werden kann, um ein therapeutisches Ergebnis zu bewirken. Die erfindungsgemäßen Peptide können zur Erhöhung ihrer Effizienz mit Aufnahme- oder Absorptionsförderern formuliert werden. Solche Förderer beinhalten zum Beispiel Salicylat, Glykocholat/Linoleat, Glykocholat, Aprotinin, Bacitracin, SDS-Caprat und dergleichen. Für eine weitere Diskussion oraler Formulierungen von Peptiden für die therapeutische Zufuhr wird der Fachmann auf Fix (J. Pharm. Sci., 85(12) 1282–1285, 1996) und Oliyai und Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 521–544, 1993) verwiesen.
Die Mengen von Peptiden in einer gegebenen Dosis werden entsprechend der Größe des Individuums, an das die Therapie verabreicht wird, sowie den Eigenschaften der behandelten Funk tionsstörung variieren. In beispielhaften Behandlungen kann es notwendig sein, etwa 50 mg/Tag, 75 mg/Tag, 100 mg/Tag, 150 mg/Tag, 200 mg/Tag, 250 mg/Tag zu verabreichen. Diese Konzentrationen können als einzelne Dosierform oder als Mehrfachdosen verabreicht werden.
Die Polypeptide können auch durch Expression solcher Polypeptide in vivo eingesetzt werden, was häufig als Gentherapie bezeichnet wird. Ein rekombinanter DNA-Vektor, der ein heterologes Segment enthält, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, der in der Lage ist, in einen Mikroorganismus oder eine eukaryotische Zelle inseriert zu werden, und der in der Lage ist, das kodierte Protein zu exprimieren, ist ebenfalls vorgesehen.
Im Zusammenhang mit der Behandlung von Restenose oder Stenose ist die Verabreichung direkt an den Ort der Angioplastie oder des Bypasses bevorzugt. Zum Beispiel kann die Verabreichung durch Katheter-vermittelten Transfer der Transgen-haltigen Zusammensetzung in ein Blutgefäß des Säugetiersubjekts, insbesondere in eine Koronararterie des Säugetiersubjekts, erfolgen. Beispielhafte Materialien und Verfahren für die lokale Zufuhr sind in Lincoff et al., Circulation, 90: 2070–2084 (1994); und Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med., 3: 163–170 (1993), beschrieben. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung verabreicht werden unter Verwendung von Infusions-Perfusions-Ballonkathetern (vorzugsweise mikroporösen Ballonkathetern) wie jenen, die in der Literatur für intrakoronare Arzneimittelinfusionen beschrieben worden sind. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5.713.860 (Intravaskulärer Katheter mit Infusionsanordung); U.S.-Patent Nr. 5.087.244 ; U.S. Patent Nr. 5.653.689 ; und Wolinsky et al., J. Am. Coil. Cardiol. 15: 475–481 (1990) (Wolinsky-Infusionskatheter); und Lambert et al., Coron. Artery Dis. 4: 469–475 (1993). Die Verwendung solcher Katheter für die ortsgerichtete Somazell-Gentherapie ist z.B. in Mazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21: 104–111 (1994), beschrieben. Wenn ein ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierendes Transgen in einem adenoviralen Vektor verabreicht wird, wird der Vektor vorzugsweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bei einem Titer von 10⁷–10¹³ Virenpartikeln, und besonders bevorzugt bei einem Titer von 10⁹–10¹¹ Virenpartikeln verabreicht. Die Adenovirenvektor-Zusammensetzung wird bevorzugt über eine Zeitdauer von 15 Sekunden bis 30 Minuten, besonders bevorzugt 1 bis 10 Minuten, infundiert.
Bei Patienten mit Angina pectoris aufgrund einzelner oder mehrerer Läsionen in Koronararterien, bei denen auf Basis anfänglicher Koronarangiogramm-Befunde PTCA verschrieben wurde, beinhaltet ein beispielhaftes Protokoll beispielsweise die Durchführung von PTCA durch einen 7F-Führungskatheter gemäß klinischer Standardpraxis unter Verwendung des femoralen Zugangs. Wenn ein optimales Ergebnis mit PTCA allein nicht erreicht wird, wird auch ein endovaskulärer Stent implantiert. (ein nicht-optimales Ergebnis ist definiert als residuelle Stenose von > 30% des luminalen Durchmesser nach visueller Schätzung und Dissektion vom B- oder C-Typ). Der arterielle Gentransfer am Ort der Ballondilatation wird mit einem replikationsdefizienten adenoviralen Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert, unmittelbar nach der Angioplastie, jedoch vor der Stentimplantation, unter Verwendung eines Infusions-Perfusions-Ballonkatheters durchgeführt. Die Größe des Katheters wird danach ausgewählt, dem Durchmesser der Arterie, wie sie im Angiogramm gemessen wurden, zu entsprechen, und variiert z.B. von 3,0 bis 3,5F im Durchmesser. Der Ballon wird auf den optimalen Druck aufgepumpt und der Gentransfer wird während einer zehnminütigen Infusion bei einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min mit einem Virustiter von 1,15 × 10¹⁰ vorgenommen.
Die intravaskuläre Verabreichung mit einem gelbeschichteten Katheter ist vorgesehen, wie sie in der Literatur für die Einführung anderer Transgene beschrieben ist. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5.674.192 (Katheter, beschichtet mit einem hartnäckig anhaftenden quellbaren Hydrogel-Polymer); Riessen et al., Human Gene Therapy, 4: 749–758 (1993); und Steg et al., Circulation, 96: 408–411 (1997) und 90: 1648–1656 (1994). Kurz gesagt, wird DNA in Lösung (z.B. ein erfindungsgemäßes Polynukleotid) ein oder mehrere Male ex vivo auf die Oberfläche eines aufgepumpten Angioplastie-Katheterballons aufgebracht, der mit einem Hydrogel-Polymer beschichtet ist (z.B. Schieber mit Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA). Die Hydroplus-Beschichtung ist ein hydrophiles Polyacrylsäurepolymer, das mit dem Ballon quervernetzt ist, um ein Hydrogel hohen Molekulargewichts zu bilden, das eng am Ballon anhaftet. Das DNA-bedeckte Hydrogel wird trocknen gelassen, bevor der Ballon entleert wird. Erneutes Aufpumpen des Ballons intravaskulär während des Angioplastievorgangs verursacht den Transfer der DNA an die Gefäßwand.
Eine dehnbare elastische Membran oder eine ähnliche Struktur, die auf einem Ballon-Angioplastiekatheter oder Stent aufgebracht oder darin integriert ist, kann eingesetzt werden, um das ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Transgen zuzuführen (Siehe z.B. U.S.-Patente Nr. 5.707.385 , 5.697.967 , 5.700.286 , 5.800.507 und 5.776.184 .
In einer weiteren Variante wird die Zusammensetzung, die das ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Transgen enthält, extravaskulär verabreicht, z.B. unter Verwendung einer Vorrichtung, um ein Gefäß einzufassen oder einzukapseln. Siehe z.B. die internationale Patent-Publikation WO 98/20027 , die eine Manschette beschreibt, die um das Äußere einer Arterie angeordnet wird (z.B. während einer Bypassoperation), um ein Transgen über ein Plasmid oder einen Liposomenvektor an die Arterienwand zuzuführen.
In einer weiteren Variante können Endothelzellen oder endotheliale Vorläuferzellen ex vivo mit dem ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierenden Transgen transfiziert werden und die transfizierten Zellen können an ein Säugetiersubjekt verabreicht werden. Beispielhafte Verfahren zur Beimpfung eines Gefäßtransplantats mit genetisch modifizierten Endothelzellen sind im U.S.-Patent Nr. 5.785.965 beschrieben.
Erfindungsgemäße Polynukleotide können ferner zusätzliche Sequenzen umfassen, um die Gentherapie zu erleichtern. Ein "nacktes" ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierendes Transgen (d.h. ein Transgen ohne einen viralen, liposomalen oder anderen Vektor zur Erleichterung der Transfektion) kann für die Gentherapie eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Polynukleotid umfasst vorzugsweise eine geeignete Promotor- und/oder Enhancer-Sequenz (z.B. Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer [Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494–2502 (1991); Boshart et al., Cell, 41: 521–530 (1985)]; Rous-Sarkom-Virus-Promotor [Davis et al., Hum. Gene Ther., 4: 151 (1993)]; Tie-Promotor [Korhonen et al., Blood, 86 (5): 1828–1835 (1995)] oder Simian-Virus-40-Promotor zur Expression in den Ziel-Säugetierzellen, wobei der Promotor stromaufwärts (d.h. 5') von der Polypeptid-kodierenden Sequenz funktionsfä hig verknüpft ist. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide beinhalten des weiteren vorzugsweise eine geeignete Polyadenylierungssequenz (z.B. die Polyadenylierungssequenz von SV40 oder vom Gen des menschlichen Wachstumshormons), stromabwärts (d.h. 3') von der Polypeptid-kodierenden Sequenz funktionsfähig verknüpft. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen auch vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die ein "in-frame" mit der Polypeptidsequenz fusioniertes sekretorische Signalpeptid kodiert. Das sekretorische Signalpeptid steuert die Sekretion des erfindungsgemäßen Polypeptids durch die Zellen, die das Polynukleotid exprimieren, und wird durch die Zelle von dem sekretierten Polypeptid abgespalten. Die Signalpeptidsequenz kann die eines anderen sekretierten Protein sein oder kann eine vollständig synthetische Signalsequenz sein, die bei Zellen des Säugetiersubjekts eine Sekretion bewirkt.
Das Polynukleotid kann ferner optional Sequenzen umfassen, deren einzige vorgesehene Funktion darin besteht, die Massenproduktion des Vektors, z.B. in Bakterien, zu erleichtern, beispielsweise einen bakteriellen Replikationsursprung und eine einen selektierbaren Marker kodierende Sequenz.
Es ist bevorzugt, dass solche Sondersequenzen zumindest teilweise vor der Verabreichung an Menschen abgespalten werden. Man kann solche Polynukleotide zur Erreichung einer erfolgreiche Gentherapie unter Verwendung von Verfahren herstellen und verabreichen, die in der Literatur für andere Transgene beschrieben wurden. Siehe z.B. Isner et al., Circulation, 91: 2687–2692 (1995); und Isner et al., Human Gene Therapy, 7: 989–1011 (1996).
Jeder geeignete Vektor kann verwendet werden, um das ein oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide kodierende Transgen in den Wirt einzuführen. Beispielhafte Vektoren, die in der Literatur beschrieben worden sind, beinhalten replikationsdefiziente retrovirale Vektoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lentivirus-Vektoren [Kim et al., J. Virol., 72 (1): 811–816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, Oktober, 1998, S. 43–46]; adenoassoziierte virale Vektoren [ U.S.-Patent Nr. 5.474.935 ; U.S.-Patent Nr. 5.139.941 ; U.S.-Patent Nr. 5.622.856 ; U.S.-Patent Nr. 5.658.776 ; U.S.-Patent Nr. 5.773.289 ; U.S.-Patent Nr. 5.789.390 ; U.S.-Patent Nr. 5.834.441 ; U.S.-Patent Nr. 5.863.541 ; U.S.-Patent Nr. 5.851.521 ; U.S.-Patent Nr. 5.252.479 ; Gnatenko et al., J. Investig. Med., 45: 87–98 (1997)]; adenovirale Vektoren [siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5.792.453 ; U.S.-Patent Nr. 5.824.544 ; U.S. Patent Nr. 5.707.618 ; U.S.-Patent Nr. 5.693.509 ; U.S. Patent Nr. 5.670.488 ; U.S.-Patent Nr. 5.585.362 ; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581–2584 (1992); Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626–630 (1992); und Rosenfeld et al., Cell, 68: 143–155 (1992)]; ein adenoviral-adenoassoziiertes Virus-Hybrid (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5.856.152 ) oder ein Vakzinevirus oder ein Herpesvirus (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5.879.934 ; U.S.-Patent Nr. 5.849.571 ; U.S.-Patent Nr. 5.830.727 ; U.S.-Patent Nr. 5.661.033 ; U.S.-Patent Nr. 5.328.688 ; Lipofectinvermittelter Gentransfer (BRL); liposomale Vektoren [siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5.631.237 (Liposomen umfassende Sendai-Virus-Proteine)]; und Kombinationen davon. Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren sind bevorzugt.
Vorgesehene andere nicht-virale Zuführungsmechanismen beinhalten Kalziumphosphat-Präzipitation (Graham und Van Der Eb, Virology, 52: 456–467, 1973; Chen und Okayama, Mol. Cell Biol., 7: 2745–2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10: 689–695, 1990) DEAE-Dextran (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188– 1190, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716–718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7161–7165, 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094–1099, 1985.), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Serie, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185–190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348–3352, 1979; Felgner, Sci Am. 276(6): 102–6, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7(15): 1791–3, 1996), Ultraschallbehandlung von Zellen (Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8463–8467, 1987), Genbeschuss unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568–9572, 1990), und rezeptorvermittelte Transfektion (Wu und Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429–4432, 1987; Wu und Wu, Biochemistry, 27: 887–892, 1988; Wu und Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159–167, 1993).
Ein Expressionskonstrukt (oder tatsächlich die oben diskutierten Peptide) kann in ein Liposom eingeschlossen sein. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelschichtmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen weisen mehrere Lipidschichten auf, die durch wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidbestandteile machen vor der Bildung geschlossener Strukturen eine Selbstumlagerung durch und schließen Wasser und gelöste Solute zwischen den Lipid-Doppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Decker, S. 87–104, 1991). Die Zugabe von DNA zu kationischen Liposomen verursacht einen topologischen Übergang von Liposomen zu optisch doppelbrechenden flüssigkristallinen kondensierten Kügelchen (Radler et al., Science, 275 (5301): 810–4, 1997). Diese DNA-Lipid-Komplexe sind potentielle nicht-virale Vektoren zur Verwendung in der Gentherapie und -zufuhr.
Die Liposomen-vermittelte Nukleinsäurezufuhr und -expression von Fremd-DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen. Bei der vorliegenden Erfindung sind auch verschiedene kommerzielle Ansätze vorgesehen, die "Lipofektions"-Technologie beinhalten.
Ein Liposom kann mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert werden. Es ist gezeigt worden, dass dies die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt von in Liposomen eingeschlosser DNA fördert (Kaneda et al., Science, 243: 375–378, 1989). Ein Liposom kann komplexiert oder in Verbindung mit nuklearen chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen (HMG-1) Kato et al., J. Biol. Chem., 266: 3361–3364, 1991) eingesetzt werden. Dadurch, dass solche Expressionskonstrukte bei Transfer und Expression von Nukleinsäuren in vitro und in vivo erfolgreich eingesetzt wurden, sind sie für die vorliegende Erfindung anwendbar.
Andere Vektor-Zufuhrsysteme, die eingesetzt werden können, um eine ein therapeutisches Gen kodierende Nukleinsäure einer Zelle zuzuführen, beinhalten rezeptorvermittelte Zufuhrvehikel. Diese machen sich die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch rezeptorvermittelte Endozytose in nahezu allen eukaryotischen Zellen zu Nutze. Aufgrund der zelltypspezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren kann die Zufuhr hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993, oben).
Rezeptor-vermittelte Gen-Targeting-Vehikel bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zellrezeptor-spezifischen Liganden und einem DNA-bindenden Mittel. Etliche Liganden sind für den rezeptorvermittelten Gentransfer eingesetzt worden. Die am ausführlichsten gekennzeichneten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987, oben) und Transferin (Wagner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87 (9): 3410–3414, 1990). Kürzlich ist ein synthetisches Neoglykoprotein, welches denselben Rezeptor wie ASOR erkennt, als Genzufuhrvehikel verwendet worden (Ferkol et al., FASEB J., 7: 1081–1091, 1993; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 4086–4090, 1994) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist ebenfalls verwendet worden, um Gene an Plattenepithelkarzinomzellen zuzuführen (Myers, EPO 0273085).
Ein Zufuhrvehikel kann einen Liganden und ein Liposom umfassen. Zum Beispiel setzten Nicolau et al. (Methods Enzymol., 149: 157–176, 1987) in Liposomen aufgenommenes Laktosylceramid ein, ein galaktose-terminales Asialogangliosid, und beobachteten einen Anstieg in der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten. Es ist daher machbar, dass eine Nukleinsäure, die ein therapeutisches Gen kodiert, auch durch eine beliebige Anzahl von Rezeptor-Liganden-Systemen mit oder ohne Liposomen spezifisch in einen bestimmten Zelltyp eingeführt werden kann.
Ein Expressionskonstrukt kann einfach aus nackter rekombinanter DNA oder Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann durch jedes der oben genannten Verfahren vorgenommen werden, das die Zellmembran physikalisch oder chemisch permeabilisiert. Dies gilt insbesondere für den Transfer in vitro, kann jedoch gleichermaßen auch für die Verwendung in vivo gelten. Dubensky et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7529–7533, 1984) injizierten erfolgreich Polyomavirus-DNA in Form von CaPO₄-Präzipitaten in Leber und Milz von adulten und neugeborenen Mäusen, und zeigten eine aktive Virenreplikation und akute Infektion. Benvenisty und Neshif (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9551–9555, 1986) zeigten ebenfalls, dass die direkte intraperitoneale Injektion von CaPO₄-präzipitierten Plasmiden zur Expression des transfizierten Gens führt.
Partikelbeschuss kann ebenfalls zum Transfer eines Expressionskonstrukts aus nackter DNA in Zellen einbezogen werden. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, was es ihnen ermöglicht, die Zellmembran zu durchdringen und in die Zellen einzutreten, ohne sie zu töten (Klein et al., Nature, 327: 70–73, 1987). Etliche Vorrichtungen zur Beschleunigung kleiner Partikel sind entwickelt worden. Eine solche Vorrichtung beruht auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Stroms, der wiederum die Antriebskraft bereitstellt (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568–9572, 1990). Die verwendeten Mikroprojektile haben aus biologisch inerten Substanzen wie beispielsweise Wolfram oder Goldkügelchen bestanden.
Wenn ein viraler Vektor eingesetzt wird, beinhalten bevorzugte Polynukleotide weiterhin einen geeigneten Promotor und eine Polyadenylierungssequenz wie oben beschrieben. Darüber hinaus ist leicht ersichtlich, dass das Polynukleotid ferner Vektor-Polynukleotidsequenzen (z.B. adenovirale Polynukleotidsequenzen) beinhaltet, die mit der ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierenden Sequenz funktionsfähig verknüpft sind.
Ein Kit beinhaltet eine hier als nützlich zur Ausübung der Erfindung beschriebene Verbindung oder Zusammensetzung (z.B. Polynukleotide oder Polypeptide gemäß der Erfindung), verpackt in einem Behälter wie beispielsweise einer/einem ver schlossenen Flasche oder Gefäß, mit einem an dem Behälter befestigten oder in der Verpackung enthaltenen Etikett, das die Verwendung der Verbindung oder Zusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschreibt. Vorzugsweise ist die Verbindung oder Zusammensetzung in einer Einheitsdosierform verpackt. Ein Kit kann eine Zusammensetzung von sowohl einem Polynukleotid als auch einem Polypeptid beinhalten, die zusammen mit einer physikalischen Vorrichtung verpackt sind, die zur Ausführung erfindungsgemäßer Verfahren nützlich sind, wie beispielsweise ein Stent, ein Katheter, eine extravaskuläre Manschette, eine Polymerfolie oder dergleichen. Ein Kit kann Zusammensetzungen von sowohl einem Polynukleotid als auch Polypeptid gemäß der Erfindung beinhalten, verpackt zusammen mit einem Hydrogel-Polymer oder Mikropartikelpolymer oder anderen hier als nützlich für die Zuführung der Polynukleotide oder Polypeptide an einen Patienten beschriebenen Trägern.
Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei diagnostischen oder prognostischen Tests zur Detektion der VEGF-Rezeptor-Proteinexpression. Erfindungsgemäße Polypeptide, die ein oder mehrere VEGF-Rezeptoren binden, können zur Detektion und Messung der Anwesenheit spezifischer Rezeptorproteinen in Proben zu Zwecken wie beispielsweise der medizinischen Bildgebung, der Detektion, des Screenings oder der zielgerichteten Therapie verwendet werden. Detektierbare Markierungen wie beispielsweise radioaktive oder nicht-radioaktive Markierungen, einschließlich Enzymmarkierungen oder Markierungen des Biotin/Avidin-Systems können werden verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide zu markieren. Die Polypeptide können auch kovalent oder nichtkovalent an ein geeignetes supramagnetisches, paramagnetisches, elektronendichtes, ökogenes oder radioaktives Mittel für die Bildgebung gekoppelt werden.
Ein diagnostischer Test zur Detektion veränderter Niveaus von VEGF-Rezeptorproteinen in verschiedenen Geweben ist ebenfalls vorgesehen, denn die Überexpression des Proteins im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben kann das Vorhandensein einer Erkrankung oder die Empfänglichkeit für eine Erkrankung, zum Beispiel anomales Zellwachstum oder anomale Zelldifferenzierung, nachweisen. Erfindungsgemäße Polypeptide können verwendet werden, um zukünftige Metastaserisiken durch Untersuchung von Biopsiematerial auf Anwesenheit aktiver Rezeptoren oder Liganden in einem Bindungstest oder -kit unter Verwendung detektierbar markierter erfindungsgemäßer Polypeptide zu quantifizieren.
Hybridpolypeptide gemäß der Erfindung, die VEGF-Rezeptoren binden, können als spezifische Marker für bestimmte Gewebe und Zelltypen verwendet werden. Zum Beispiel können jene erfindungsgemäßen Polypeptide, die spezifisch VEGFR-3 binden, als Marker für lymphatische Endothelzellen dienen.
Gleichermaßen können erfindungsgemäße Polypeptide auf eine Fähigkeit gescreent werden, das Wachstum isolierter Zellen oder Zellinien zu modulieren. Zum Beispiel sind bestimmte neoplastische Krankheitszustände gekennzeichnet durch das Auftreten von VEGF-Rezeptoren auf Zelloberflächen [Valtola et al., Am J Path 154: 1381–90 (1999)]. Erfindungsgemäße Polypeptide können gescreent werden, um die Fähigkeit der Polypeptide zur Modulierung des Wachstums der neoplastischen Zellen festzustellen. Andere Krankheitszustände sind voraussichtlich durch Mutationen in VEGF-Rezeptoren gekennzeichnet [Fenell et al., Hum Mol Genetics 7: 2073–78 (1998)]. Erfin dungsgemäße Polypeptide, die die Aktivität der mutierten Formen des VEGF-Rezeptors in einer Weise modulieren, die sich von natürlich vorkommenden vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren unterscheidet, werden zur Modulation der Symptome und Schwere solcher Krankheitszustände nützlich sein.
Die In-vivo-Bildgebung oder Gewebebiopsie kann ergeben, dass bestimmte neoplastische Zellen eine bestimmte Kombination von Rezeptoren exprimiert, wodurch ein Hinweis auf erfindungsgemäße Polypeptide bereitgestellt wird, die die exprimierte Gruppe von Rezeptoren binden und das Liganden-vermittelte Wachstum hemmen.
Die Verwendung einer solchen diagnostischen Bildgebung ist besonders geeignet zur Erhaltung eines Bildes von, zum Beispiel, einer Tumormasse oder der Neovaskularisierung in der Nähe einer Tumormasse. Es ist vorgesehen, dass die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung für die Bildgebung in einer Weise eingesetzt werden, die den im U.S.-Patent Nr. 6.107.046 offenbarten Antikörper-basierten Verfahren analog sind.
Viele geeignete Bildgebungsmittel sowie auch Verfahren zur Anheftung der Markierungsmittel an die erfindungsgemäßen Peptide sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4.965.392 , U.S.-Patent Nr. 4.472.509 , U.S.-Patent Nr. 5.021.236 und U.S.-Patent Nr. 5.037.630 . Die markierten Peptide werden in einem pharmazeutisch annehmbarem Träger an ein Subjekt verabreicht und an einem Zielort, der den VEGFR-3-Rezeptor aufweist, akkumuliert. Dieses Peptidbildgebungsmittel dient dann als Kontrastreagenz für die Röntgen-, Magnetresonanz-, Ultraschall- oder Szintigraphie-Bildgebung des Zielortes. Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind eine zweckdienliche und wichtige Ergänzung zu dem verfügbaren Arsenal an medizinischen Bildgebungswerkzeugen für die diagnostische Untersuchung von Krebs und anderen VEGFR-3-bezogenen Funktionsstörungen.
Paramagnetische Ionen, die in den Bildgebungsmitteln gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten zum Beispiel Chrom (III), Mangan (II), Eisen (III), Eisen (II), Kobalt (II), Nickel (II), Kupfer (II), Neodym (III), Samarium (III), Ytterbium (III), Gadolinium (III), Vanadium (II), Terbium (III), Dysprosium (III), Holmium (III) und Erbium (III). Ionen, die für die Röntgenbildgebung nützlich sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Lanthan (III), Gold (III), Blei (II) und insbesondere Wismut (III). Radioisotope für diagnostische Anwendungen beinhalten zum Beispiel ²¹¹Astatin, ¹⁴Kohlenstoff, ⁵¹Chrom, ³⁶Chlor, ⁵⁷Kobalt, ⁶⁷Kupfer, ¹⁵²Eu, ⁶⁷Gallium, ³Wasserstoff, ¹²³Iod, ¹²⁵Iod, ¹¹¹Indium, ⁵⁹Eisen, ³²Phosphor, ¹⁸⁶Rhenium, ⁷⁵Selen, ³⁵Schwefel, ^99mTechnetium und ⁹⁰Yttrium.
Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können gemäß Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, markiert werden. Zum Beispiel können die Peptide durch Inkontaktbringen des Peptids mit Natrium- oder Kaliumiodid und einem chemischen Oxidationsmittel wie beispielsweise Natriumhypochlorit oder einem enzymatischen Oxidationsmittel wie beispielsweise Laktoperoxidase iodiert werden. Peptide können mit Technetium-99m durch Ligandenaustausch, zum Beispiel durch Reduktion von Pertechnat mit zinnhaltiger Lösung, Chelieren des reduzierten Technetiums auf einer Sephadex-Säule und Aufbringen des Peptids auf die Säule, markiert werden. Diese und andere Techniken zur Markierung von Proteinen und Peptiden sind dem Fachmann gut bekannt.
Verwendung von erfindungsgemäßen Polypeptiden in der Kombinationstherapie bei neoplastischen Funktionsstörungen
Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber DNA-schädigenden Mitteln bildet ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie. Ein Ziel der gegenwärtigen Krebsforschung besteht darin, Wege zu finden, die Effizienz der Chemo- und Strahlentherapie zu verbessern. Wie oben beschrieben, können die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang mit chemo- oder strahlentherapeutischen Eingriffen, der Immuntherapie oder mit einer anderen antiangiogenen/antilymphangiogenen Therapie verabreicht werden.
Um Zellen zu töten, das Zellwachstum zu hemmen, die Metastase zu hemmen, die Angiogenese zu hemmen oder den malignen Phänotyp von Tumorzellen via Kombinationstherapie unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf andere Weise umzukehren oder zu reduzieren, würde man ein(e) "Ziel"-Zelle oder -Gewebe (z.B. einen Tumor und/oder dessen Vaskulatur) im allgemeinen mit den therapeutischen Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung (entweder als Peptidzusammensetzung oder als das Peptid exprimierendes Expressionskonstrukt) und mindestens einem weiteren Mittel, das optional an das erfindungsgemäße Peptid konjugiert ist, in Kontakt bringen. Diese Zusammensetzungen würden in einer kombinierten Menge, die zur Tötung oder Hemmung der Proliferation des Krebses durch Töten und/oder Hemmen der Proliferation der Krebszellen und/oder der Endothelien von Blut- und Lymphgefäßen, die die Krebszellen versorgen und ihnen dienlich sind, wirksam ist, bereitgestellt werden. Dieses Verfahren kann das Inkontaktbringen der Zellen mit dem Peptid oder Expressionskonstrukt und den(dem) Mittel(n) oder Faktor(en) zur selben Zeit beinhalten. Dies kann durch Inkontaktbringen der Zelle mit einer einzelnen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel enthält, oder durch gleichzeitiges Inkontaktbringen der Zelle mit zwei verschiedenen Zusammensetzungen oder Formulierungen, wobei eine Zusammensetzung das Peptid oder Expressionskonstrukt enthält und die andere das zweite Mittel enthält, erreicht werden.
Alternativ kann die die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung einsetzende therapeutische Behandlung der Behandlung mit den anderen Mitteln in Zeitabständen im Bereich von Minuten bis Wochen vorangehen oder nachfolgen. Wenn das andere Mittel und das Expressionskonstrukt getrennt verabreicht werden, wird man im Allgemeinen sicherstellen, dass zwischen den jeweiligen Zufuhrzeiten keine beträchtliche Zeitdauer verstreicht, so dass das Mittel und das Peptid-basierte Therapeutikum weiterhin in der Lage sein werden, eine vorteilhafte Kombinationswirkung zu entfalten. In solchen Fällen ist es vorgesehen, dass man beide Modalitäten innerhalb von etwa 12–24 Stunden voneinander und besonders bevorzugt innerhalb von etwa 6–12 Stunden voneinander, mit einem besonders bevorzugten zeitlichen Verzug von lediglich etwa 12 Stunden, verabreichen würde. In einigen Situationen kann es jedoch wünschenswert sein, die Zeitdauer für die Behandlung beträchtlich zu verlängern, wobei mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen vergehen. Wiederholte Behandlungen mit einem oder beiden Mitteln ist insbesondere vorgesehen. Es kann eine Antikrebstherapie zugeführt werden, die die Krebszellen direkt in einer Weise attackiert, um die Krebszelle zu töten, zu hemmen oder zu nekrotisieren, darüber hinaus wird eine therapeutische Zusammensetzung auf Basis der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung dem Individuen ebenfalls in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine antiangio gene und/oder antilymphangiogene Wirkung aufzuweisen. Die Peptidzusammensetzungen können nach dem anderen Antikrebsmittel, vor dem anderen Antikrebsmittel oder tatsächlich zur gleichen Zeit wie das andere Antikrebsmittel, optional an das andere Mittel konjugiert, verabreicht werden.
Mittel oder Faktoren, die zur Verwendung in einer Kombinationstherapie geeignet sind, sind beliebige chemische Verbindungen oder Behandlungsverfahren, die bei Anwendung auf eine Zelle DNA-Schäden hervorrufen. Solche Mittel und Faktoren beinhalten Strahlen und Wellen, die DNA-Schäden hervorrufen, wie beispielsweise γ-Strahlen, Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Mikrowellen, Elektronenemissionen und dergleichen. Eine Vielzahl von chemischen Verbindungen, die auch als "chemotherapeutische Mittel" beschrieben werden, rufen DNA-Schäden hervor, und sind sämtlich dazu vorgesehen, bei den hier offenbarten Kombinationsbehandlungsverfahren von Nutzen zu sein. Chemotherapeutische Mittel, die als nützlich vorgesehen sind, beinhalten z.B. im Adriamycin, 5-Fluoruracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP) und selbst Wasserstoffperoxid.
Die Verwendung einer Kombination von ein oder mehreren DNA-schädigenden Mitteln, ob strahlungsbasiert oder tatsächliche Verbindung, wie beispielsweise die Verwendung von Röntgenstrahlen mit Cisplatin oder die Verwendung von Cisplatin mit Etoposid, ist ebenfalls vorgesehen.
Bei der Krebsbehandlung würde man die Tumorzellen und/oder die Endothelien der Tumorgefäße zusätzlich zu dem ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide umfassenden therapeutischen Mittel mit einem Mittel in Kontakt bringen. Dies kann durch Bestrahlung des lokalisierten Tumorortes mit Strahlen wie beispielsweise Röntgenstrahlen, UV-Licht, Gammastrahlen oder selbst Mikrowellen erreicht werden. Alternativ können die Tumorzellen mit dem Mittel durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung wie beispielsweise Adriamycin, 5-Fluoruracil, Etoposid, Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C oder Cisplatin, an das Subjekt mit dem Mittel in Kontakt gebracht werden. Kinaseinhibitoren sind in Kombinationstherapien mit den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls als nützlich vorgesehen. Das Mittel kann als kombinierte therapeutische Zusammensetzung oder Kit hergestellt und verwendet werden, indem es mit einem chimären erfindungsgemäßen Peptid wie oben beschrieben kombiniert wird.
Mittel, die Nukleinsäuren, insbesondere DNA, direkt quervernetzen, sind vorgesehen, um DNA-Schäden zu erleichtern, die zu einer synergistischen, antineoplastischen Kombination mit einer Chimärpeptid-basierten Therapie führen. Mittel wie beispielsweise Cisplatin und andere DNA-alkylierende Mittel können verwendet werden. Cisplatin ist weithin zur Behandlung von Krebs verwendet worden, mit in klinischen Anwendungen verwendeten wirksamen Dosen von 20 mg/m² für 5 Tage alle drei Wochen für insgesamt drei Durchlaufe. Cisplatin wird oral nicht absorbiert und muss daher intravenös, subkutan, intratumoral oder intraperitoneal durch Injektion zugeführt werden.
Mittel, die die DNA schädigen, beinhalten auch Verbindungen, die die DNA-Replikation, Mitose und Chromosomentrennung stören. Solche chemotherapeutischen Verbindungen beinhalten Adriamycin, auch bekannt als Doxorubicin, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und dergleichen. Bei breiter Verwendung in einer klinischen Situation zur Behandlung von Neoplasmen, werden diese Verbindungen intravenös durch Bolusinjektionen verabreicht, bei Dosen im Bereich von 25–75 mg/m² in 21-Tage-Intervallen für Adriamycin, zu 35–50 mg/m² für Etoposid intravenös oder der doppelten intravenösen Dosis oral.
Mittel, die die Synthese und Genauigkeit von Nukleinsäurevorläufern und -untereinheiten stören, führen ebenfalls zu DNA-Schäden. Von daher ist eine Anzahl von Nukleinsäurenvorläufern entwickelt worden. Besonders nützlich sind Mittel, die einer ausgiebigen Erprobung unterzogen wurden und leicht erhältlich sind. Von daher werden Mittel wie beispielsweise 5-Fluoruracil (5-FU) vorzugsweise von neoplastischem Gewebe verwendet, was dieses Mittel für die Ansteuerung neoplastischer Zellen besonders nützlich macht. Obwohl ziemlich toxisch, ist 5-FU in einer großen Auswahl von Trägern anwendbar, auch topisch, obwohl intravenöse Verabreichung mit Dosen im Bereich von 3 bis 15 mg/kg/Tag häufig verwendet wird.
Beispielhaft findet sich im folgenden eine Liste von chemotherapeutischen Mitteln und den Krebsen, von denen gezeigt wurde, dass sie durch die Verabreichung solcher Mittel gesteuert werden. Kombinationen dieser Chemotherapeutika mit den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung können sich als nützlich bei der Linderung verschiedener neoplastischer Funktionsstörungen erweisen. Beispiele für diese Verbindungen beinhalten Adriamycin (auch bekannt als Doxorubicin), VP-16 (auch bekannt als Etoposid) und dergleichen, Daunorubicin (interkaliert in DNA, blockiert die DNA-abhängige RNA-Polymerase und hemmt die DNA-Synthese); Mitomycin (auch bekannt als Mutamycin und/oder Mitomycin-C) ist ein aus Medium von Streptomyces caespitosus isoliertes Antibiotikum, von dem gezeigt wurde, dass es eine Antitumoraktivität aufweist; Actinomycin D kann auch ein nützliches in Kombination mit den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzendes Arzneimittel sein, da Tumore, die nicht auf die systemische Behandlung reagieren, manchmal auf lokale Perfusion mit Dactinomycin reagieren, von dem ebenfalls bekannt ist, dass es die Strahlentherapie verstärkt. Es wird auch in Kombination mit primärer Operation, Strahlentherapie und anderen Arzneimitteln, insbesondere Vincristin und Cyclophosphamid, verwendet, und hat sich als wirksam gegen Ewing-Tumor, Kaposi-Sarkom und Weichgewebesarkome, Chorionkarzinom, metastatische Hodenkarzinome, Hodgkin-Krankheit und Nicht-Hodgkin-Lymphome erwiesen.
Bleomycin ist eine Mischung aus zytotoxischen Glykopeptid-Antibiotika, die von einem Stamm von Streptomyces verticillus isoliert wurden, und ist wirksam bei der Behandlung der folgenden Neoplasmen entweder als einzelnes Mittel oder in erprobten Kombinationen mit anderen anerkannten chemotherapeutische Mitteln beim Plattenepithelkarzinom wie beispielsweise Kopf und Nacken (einschließlich Mund, Zunge, Tonsillen, Nasopharynx, Oropharynx, Sinus, Gaumen, Lippe, bukkale Mukosa, Zahnfleisch, Epiglottis, Larynx), Haut, Penis, Zervix und Vulva. Es ist auch bei der Behandlung von Lymphomen und Hodenkarzinom verwendet worden.
Cisplatin ist weithin verwendet worden, um Krebse wie beispielsweise metastatisches Hoden- oder Ovarkarzinom, fortgeschrittenen Blasenkrebs, Kopf- oder Nackenkrebs, Gebärmuttershalskrebs, Lungenkrebs oder andere Tumoren zu behandeln, und kann in Kombination mit den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein. VP16 (Etoposid) wird primär zur Behandlung von Hodentumoren verwendet, in Kombination mit Bleomycin und Cisplatin, und in Kombination mit Cisplatin für kleinzelliges Lungenkarzinom. Es ist auch wirksam gegen Nicht-Hodgin-Lymphome, akute Nicht-Lymphozyten-Leukämie, Brustkarzinom, und mit dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) verbundenes Kaposi-Sarkom. Tumornekrosefaktor [TNF; Cachectin) Glykoprotein, das einige Arten von Krebszellen tötet, die Zytokinproduktion aktiviert, Makrophagen und Endothelzellen aktiviert, die Produktion von Kollagen und Kollagenasen fördert, ist ein Entzündungsmediator und auch ein Mediator von septischem Schock, und fördert Katabolismus, Fieber und Schlaf. TNF kann bei alleiniger Verwendung in wirksamen Dosen ziemlich toxisch sein, so dass die optimalen Regime es möglicherweise in niedrigeren Dosen in Kombination mit anderen Arzneimitteln einsetzen werden. Seine immunsuppressiven Wirkungen werden durch γ-Interferon verstärkt, so dass die Kombination möglicherweise gefährlich ist. Von einem Hybrid aus TNF und Interferon-α ist ebenfalls gefunden worden, dass es Antikrebswirkung besitzt.
Taxol, ein ursprünglich von der Borke der Esche, Taxus brevifolia, isoliertes antimitotisches Mittel und sein Derivat Paclitaxol haben sich als nützlich gegen Brustkrebs erwiesen und können in Kombinationstherapien verwendet werden. Vorteilhafte Reaktionen auf Vincristin sind bei Patienten mit verschiedenen anderen Neoplasmen, insbesondere Wilms-Tumor, Neuroblastom, Hirntumoren, Rhabdomyosarkom und Karzinomen von Brust, Blase und des männlichen und weiblichen Fortpflanzungssystems berichtet worden. Vinblastin ist auch bei denselben Krebsen wie Vincristin als nützliches Therapeutikum indiziert. Die häufigste klinische Verwendung von Vinblastin geschieht mit Neomycin und Cisplatin bei der kurativen Therapie von metastatischen Hodentumoren. Es ist auch wirksam beim Kaposi-Sarkom, Neuroblastom und der Letterer-Siwe-Krankheit (Histiozytose X) sowie beim Brustkarzinom und beim Chorionkarzinom bei Frauen.
Melphalan, auch bekannt als Alkeran, L-Phenylalanin-Lost, L-PAM oder L-Sarcolysin ist ein Derivat von Stickstofflost. Melphalan ist ein bifunktionelles alkylierendes Mittel, das wirksam ist gegen ausgewählte menschliche neoplastische Erkrankungen. Melphalan ist das aktive L-Isomere des als Medphalan bekannten D-Isomers, welches weniger aktiv ist gegen bestimmte Tiertumore, und die zur Erzeugung einer Wirkung auf Chromosomen erforderliche Dosis ist größer als die, die mit dem L-Isomer erforderlich ist. Melphalan ist in einer Form erhältlich, die für die orale Verabreichung geeignet ist, und ist verwendet worden, um multiples Myelom zu behandeln. Verfügbare Hinweise deuten darauf hin, dass etwa ein Drittel bis zur Hälfte der Patienten mit multiplem Myelom eine vorteilhafte Reaktion auf die orale Verabreichung des Arzneimittels zeigen. Melphalan ist bei der Behandlung von epithelialem Ovarkarzinom verwendet worden.
Cyclophosphamid ist im Magendarmtrakt stabil, wird gut vertragen und bei oralen und parenteralen Routen wirksam und verursacht keine lokale Blasenbildung, Nekrose, Phlebitis oder gar Schmerzen. Chlorambucil, ein bifunktionelles alkylierendes Mittel vom Stickstofflost-Typ, von dem gefunden wurde, dass es wirksam ist gegen ausgewählte menschliche neoplastische Erkrankungen. Chlorambucil ist bei der Behandlung von chronischer lymphatischer (lymphozytischer) Leukämie, malignen Lymphomen einschließlich Lymphsarkom, Riesenfollikellymphom und Hodgkin-Krankheit indiziert. Es heilt keine dieser Funktionsstörungen, kann jedoch eine klinisch nützliche Linderung hervorrufen.
Andere Faktoren, die eine DNA-Schädigung verursachen und ausgiebig verwendet worden sind, beinhalten, was allgemein be kannt ist als Gammastrahlen, Röntgenstrahlen und/oder die direkte Zufuhr von Radioisotopen zu Tumorzellen. Andere Formen von DNA-schädigenden Faktoren sind ebenfalls vorgesehen wie beispielsweise Mikrowellen und UV-Strahlung. Es ist sehr wahrscheinlich, dass all diese Faktoren in breitem Umfang Schäden an DNA, bei Vorläufern von DNA, der Replikation und Reparatur von DNA und dem Zusammenbau und der Erhaltung von Chromosomen bewirken. Dosierungsbereiche für Röntgenstrahlen reichen von täglichen Dosen von 50 bis 200 Röntgen für längere Zeitdauern (3 bis 4 Wochen) bis zu einzelnen Dosen von 2000 bis 6000 Röntgen. Dosierungsbereiche für Radioisotope variieren in weiten Bereichen und hängen von der Halbwertszeit des Isotops, der Stärke und der emittierten Strahlenart und der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Auflage, Kapitel 33, insbesondere die Seiten 624–652). Einige Variation in der Dosierung tritt notwendigerweise in Abhängigkeit vom Zustand des behandelten Subjekts auf. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird in jedem Fall die angemessene Dosis für das jeweilige Subjekt bestimmen. Darüber hinaus sollten die Zubereitungen zur Verabreichung an den Menschen Standards hinsichtlich Sterilität, Pyrogenität, allgemeiner Sicherheit und Reinheit entsprechen, wie sie vom Amt für biologische Standards der US-Gesundheitsbehörde (FDA) gefordert werden.
Zusätzlich zur Kombination von Therapien auf Basis chimärer Peptide mit chemo- und Strahlentherapien ist auch vorgesehen, dass eine Kombination mit Gentherapien vorteilhaft sein wird. Zum Beispiel kann das gleichzeitige gezielte Ansteuern von Chimärpeptid-basierten Therapien und p53- oder p16-Mutationen eine verbesserte Antikrebsbehandlung erbringen. Jedes andere tumorbezogenen Gen kann auf diese Weise erreichbar angesteu ert werden, zum Beispiel p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, BCRA2, p16, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl und abl.
Zusätzlich zu den oben diskutierten Antikrebstherapien ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Peptide mit anderen Angiogenesehemmern kombiniert werden. Es wird erwartet, dass die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sowohl antilymphangiogene als auch antiangiogene Eigenschaften aufweisen. Viele antiangiogene Arzneimittel können auch antilymphangiogene Eigenschaften haben.
http: //cancertrials.nci.nih.govinews/angio ist eine von den nationalen US-Gesundheitsinstituten (National Institutes of Health) unterhaltene Internetseite, die aktuelle Informationen über die gegenwärtig mit antiangiogenen Mitteln durchgeführten Versuche bereitstellt. Diese Mittel beinhalten zum Beispiel Marimastat (British Biotech, Annapolis MD; indiziert für nicht-kleinzelligen Lungen-, kleinzelligen Lungen- und Brustkrebs); AG3340 (Agouron, LaJolla, CA; für Glioblastoma multiforme); COL-3 (Collagenex, Newtown PA; für Hirntumoren); Neovastat (Aetema, Quebec, Canada; für Nieren- und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs) BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb, Wallingford CT; für metastatischen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs); Thalidomid (Celgen; für Melanom, Kopf- und Nackenkrebs, Ovar-, metastatisches Prostata- und Kaposi-Sarkom; rezidivierenden oder metastatischen kolorektalen Krebs (mit Adjuvanzien); gynäkologische Sarkome, Leberkrebs; multiples Myelom; CLL, rezidivierender oder progressiver Hirnkrebs, multiples Myelom, nicht-kleinzelliger Lungen-, nicht metastatischer Prostata-, refraktäres multiples Myelom und Nierenkrebs); Squalamin (Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting, PA; nicht-kleinzelliger Krebs und Ovarkrebs); Endostatin (EntreMEd, Rockville, MD; für solide Tumoren); SU5416 (Sugen, San Francisco, CA; rezidivierende Kopf- und Nacken-, fortgeschrittene solide Tumoren, Stadium-IIIB- oder -IV-Brustkrebs; rezidivierender oder progressiver Hirnkrebs (pädiatrisch); Ovarkrebs, AML; Gliom, fortgeschrittene Malignitäten, fortgeschrittener kolorektaler Krebs, von-Hippel-Lindau-Krankheit, fortgeschrittener Weichgewebekrebs; Prostatakrebs, kolorektaler Krebs, metastatisches Melanom, multiples Myelom, malignes Mesotheliom; metastatischer Nieren-, fortgeschrittener oder rezidivierender Kopf- und Nacken-, metastatischer kolorektaler Krebs); SU6668 (Sugen San Francisco, CA; fortgeschrittene Tumoren); Interferon-α; Anti-VEGF-Antikörper (National Cancer Institute, Bethesda MD; Genentech San Franscisco, CA; refraktäre solide Tumoren; metastatischer Nierenzellkrebs, bei unbehandeltem fortgeschrittenen kolorektalen Krebs); EMD121974 (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland; HIV-bezogenes Kaposi-Sarkom, progressives oder rezidivierendes anaplastisches Gliom); Interleukin 12 (Genetics Institute, Cambridge, MA; Kaposi-Sarkom) und IM862 (Cytran, Kirkland, WA; Ovarkrebs, und behandelte metastatische Krebse von Kolon- und rektalem Ursprung und Kaposi-Sarkom). Die den Mitteln in Klammern folgenden Information weist auf die Krebse hin, gegen die diese Mittel in diesen Versuchen eingesetzt werden. Es ist vorgesehen, dass jede dieser Funktionsstörungen mit den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden kann, entweder allein oder in Kombination mit den aufgeführten Mitteln.
Weitere Merkmale der Empfindung werden anhand der folgenden Beispiele ersichtlich.
Beispiel 1
Konstruktion von VEGF-A/VEGF-C-Hybridmolekülen:
Obwohl die Aminosäurereste der rezeptorbindenden Domäne von VEGF-Familienmitgliedern konservierte Motive gemeinsam haben, zeigen diese Proteine verschiedene Rezeptorspezifitäten. In dem folgenden Experiment wurden DNA-Moleküle, die verschiedene Teile der rezeptorbindenden Domäne von entweder VEGF-A oder VEGF-C enthaltende Polypeptide kodieren, unter Verwendung eines kombinatorischen Ansatzes konstruiert, um neue Hybridmoleküle mit einzigartigen strukturellen und funktionellen Eigenschaften zu erzeugen.
Zur Erzeugung der neuen Moleküle wurden die Nukleotidsequenzen von VEGF-A und reifem VEGF-C analysiert, um örtlich begrenzte Bereiche mit Nukleotididentität festzustellen, die geeignet wären zur Erzeugung kurzer DNA-Fragmente, die synthetisiert und leicht rekombiniert werden können. Acht entsprechende Identitätsbereiche wurden in jedem Molekül als Stellen für die Fragmentierung (in neun Fragmente) und Rekombination zu chimären (Hybrid-)Molekülen ausgewählt. Diese Fragmentierungsstellen wurden auf Basis der Nukleotidsequenz und auch, weil die resultierenden Fragmente Strukturelementen (z.B. Alphahelix, Schleife etc.) auf Basis der Kristallstruktur von VEGF-A (siehe Fig. Und 1) entsprechen würden, ausgewählt.
Fragmentierung von VEGF-A
Neun Paare synthetischer Oligonukleotide wurden auf Grundlage der kodierenden Sequenz für VEGF₁₂₁ zum Zweck der Bildung von neun DNA-Fragmenten, welche die die rezeptorbindende Domäne kodierende Region von VEGF-A (entsprechend den Nukleotiden 156 bis 461 der SEQ ID NO: 1, die die Aminosäurereste 34 bis 135 der SEQ ID NO: 2 kodiert) umfassen, entwickelt. Jedes Oligonukleotidpaar umfasste eine einen Vorwärts-Primer enthal tende kodierende Sequenz und einen Rückwärts-Primer mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Bereich des Vorwärts-Primers komplementär war, um die Anlagerung der Primer aneinander zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment zu ermöglichen. Entweder der Vorwärts- oder der Rückwärts-Primer jedes Paares enthielt auch eine kurze 5'- und 3'-Nukleotidsequenz, die zu keiner Sequenz ihrer gepaarten Primer komplementär war. Diese kurzen zusätzlichen Sequenzen entsprechen den oben beschriebenen örtlich begrenzten Bereichen mit Nukleotididentität. Im Anschluss an die Anlagerung der Primerpaare bildete diese zusätzliche Sequenz einzelsträngige Überhänge, die hinsichtlich der Anlagerung mit anderen doppelsträngigen aneinandergelagerten Primerpaaren kompatibel waren, wie unten in größerer Ausführlichkeit beschrieben wird. Die Nukleotidsequenzen der VEGF-A-Vorwärts- und Rückwärts-Primer sind in den Tabellen 1A bzw. 1B dargestellt. Tabelle 1A – Vorwärts-(Kodierende)Primer für VEGF-A
Die Nukleotidsequenzen der Vorwärts-Primer A1-F bis A9-F sind in den SEQ ID NO: 3–11 angegeben. Für jeden der aufgeführten Primer zeigt der obere Strang die DNA-Sequenz und der untere Strang gibt die durch den jeweiligen Primer kodierten Aminosäuren an, SEQ ID NO: 128–136. In einigen Fällen sind lediglich zwei Nukleotide eines gegebenen Kodons in einem Primer enthalten und das verbleibende Nukleotid des Kodons ist in dem vorangegangenen oder folgenden Primer enthalten. In diesen Fällen ist die Aminosäure unter dem Primer aufgeführt, der 2 der 3 Nukleotide des jeweiligen Kodons enthält. Fettdruck zeigt Nukleotide an, die für Aminosäuren kodieren, die eine Protein-Linker-Region darstellen und nicht Teil der Stamm-VEGF-A oder VEGF-C-Moleküle sind, unterstrichene Nukleotide sind solche, die während des Zusammenbaus der Fragmente zu Hybridkonstrukten entfernt werden; und in Kleinsbuchstaben sind Nukleotide angegeben, die einen Überhang produzieren, wenn die Oligonukleotidpaare aneinander angelagert werden, um die 9 Fragmente zu bilden. Tabelle 1B – Rückwärts-(Nicht-kodierende)Primer für VEGF-A
Die Nukleotidsequenzen der Rückwärts-Primer A1-R bis A9-R sind in den SEQ ID NO: 12–20 wiedergegeben. Fett gedruckte, unterstrichene und Kleinbuchstaben werden wie in Tabelle 1A beschrieben verwendet.
Neun VEGF-A-Polynukleotid-Fragmente wurden durch Anlagerung eines passenden Paares synthetischer Oligonukleotidprimer zusammengesetzt. Zum Beispiel wurde Fragment A1 erzeugt durch Anlagerung von Primer A1-F mit Primer A1-R, Fragment A2 wurde erzeugt durch Anlagerung von A2-F mit A2-R und so weiter. Die Anlagerung wurde durchgeführt durch Inkubation von 2 pmol/µl jedes geeigneten Primers, 20 mM Tris/HCl, 2 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl, pH 7,4 bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von einer Abkühlung der Lösung auf 37°C bei einer Geschwindigkeit von 1°C/Minute. Wie in Tabelle 1A dargestellt, kodiert A1 die Aminosäurereste 34 bis 42 und einen Teil der Aminosäure 42 der SEQ ID NO: 2; Fragment A2 kodiert einen Teil der Aminosäure 43 und der Aminosäuren 44–53 der SEQ ID NO: 2; Fragment A3 kodiert die Aminosäuren 54 bis 63 und einen Teil der Aminosäure 64 der SEQ ID NO: 2; Fragment A4 kodiert einen Teil der Aminosäure 64, der Aminosäuren 65 bis 71 und einen Teil der Aminosäure 72 der SEQ ID NO: 2; Fragment A5 kodiert einen Teil der Aminosäure 72, die Aminosäuren 73 bis 83 und einen Teil der Aminosäure 84 der SEQ ID NO: 2; Fragment A6 kodiert einen Teil der Aminosäure 84, die Aminosäuren von 80 bis 92 und einen Teil der Aminosäure 93 der SEQ ID NO: 2; Fragment A7 kodiert einen Teil der Aminosäuren 93, die Aminosäuren 94 bis 107 und einen Teil der Aminosäure 108 der SEQ ID NO: 2; Fragment A8 kodiert einen Teil der Aminosäuren 108 und die Aminosäuren 109 bis 122 der SEQ ID NO: 2; und Fragment A9 kodiert die Aminosäuren 123 bis 135 der SEQ ID NO: 2.
Fragmentierung von VEGF-C
In einer ähnlichen Weise wurden neun Paare von Oligonukleotiden auf Grundlage der Aminosäuresequenz der rezeptorbindenden Domäne von VEGF-C (entsprechend den Nukleotiden 658 bis 999 der SEQ ID NO: 21, welche die Aminosäurereste 112 bis 216 der SEQ ID NO: 22 kodieren) konstruiert und synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen der neun Vorwärts-Primer und neun Rückwärts-Primer sind in Tabelle 2A (SEQ ID NO 23–31) und Tabelle 2B (SEQ ID NO: 32–40) wiedergegeben. Die von den neun Vorwärts-Primern kodierten Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NO: 137–145 wiedergegeben. Tabelle 2A – Vorwärts-(Kodierende) Primer für VEGF-C

Tabelle 2B – Vorwärts-(Kodierende)Primer für VEGF-C
Fett gedruckte, unterstrichene und Kleinbuchstaben werden in Tabelle 2A und 2B wie in Tabelle 1A beschrieben verwendet.
Primerpaare wurden aneinandergelagert, um neun doppelsträngige DNA-Fragmente zu bilden, die zusammen die rezeptorbindende Domäne von VEGF-C kodierten, und welche geeignete einzelsträngige Überhänge für die Anlagerung an andere Fragmente besaßen, wie oben für VEGF-A beschrieben.
Fragment C1 kodiert die Aminosäurereste 112 bis 120 und einen Teil der Aminosäure 121 der SEQ ID NO: 22; Fragment C2 kodiert einen Teil der Aminsäure 121 und der Aminosäuren 122 bis 132 der SEQ ID NO: 22; Fragment C3 kodiert die Aminosäuren 133 bis 142 und einen Teil der Aminosäure 143 der SEQ ID NO:22; Fragment C4 kodiert einen Teil der Aminosäure 143, der Aminosäuren 144 bis 150 und einen Teil der Aminosäure 151 der SEQ ID NO:22; Fragment C5 kodiert einen Teil der Aminosäure 151, der Aminosäuren 152 bis 162 und einen Teil der Aminosäure 163 der SEQ ID NO:22; Fragment C6 kodiert einen Teil der Aminosäure 163 und der Aminosäuren 164 bis 171 und einen Teil der Aminosäure 172 der SEQ ID NO: 22; Fragment C7 kodiert einen Teil der Aminosäure 172, der Aminosäuren 173 bis 186 und einen Teil der Aminosäure der SEQ ID NO: 22; Fragment C8 kodiert einen Teil der Aminosäure 187, der Aminosäuren 188 bis 203 der SEQ ID NO:22; und Fragment C9 kodiert die Aminosäuren 204 bis 216 der SEQ ID NO:22.
Diskussion hinsichtlich der Synthese der VEGF-A- und VEGF-C-Fragmente
Auf diese Weise wurden durch Synthetisieren und Zusammenlagern von neun Paaren von aus der VEGF-A-Aminosäuresequenz konstruierten Primern und neun Paaren von aus der VEGF-C-Aminosäuresequenz konstruierten Primern 18 DNA-Fragmente erzeugt. 2 ist ein schematisches Diagramm, das die Konstruktion der 9 VEGF-A- und 9 VEGF-C-DNA-Fragmente darstellt. Die Oligonukleotide wurden dahingehend konstruiert, doppelsträngige DNA-Fragmente zu erzeugen, die bei Aneinanderlagerung einzigartige kohäsive Enden enthalten. Die Ligierung der 9 VEGF-A-DNA-Fragmente erzeugt eine einzelne lineare doppelsträngige DNA, die die Aminosäuren 34–135 von VEGF-A (SEQ ID NO:2) kodiert, und die Ligierung der 9 VEGF-C-DNA-Fragmente führt zu einer einzelnen DNA, die die Aminosäuren 112–216 von VEGF-C (SEQ ID NO: 22) kodiert.
Obwohl die Einfügung von kohäsiven Enden die Ligierung von Fragmenten in einer gewünschten Reihenfolge und Orientierung stark erleichtert, wird es ersichtlich sein, dass die Ligie rung von Fragmenten auch ohne kohäsive Enden erreicht werden kann. Stumpfendige Fragmente können ebenfalls hergestellt und aneinander gelagert werden, um unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren Hybridproteine zu erzeugen. Mit einer Stumpfendstrategie brauchen die Nukleotidsequenzen der Stammmoleküle nicht auf Anwesenheit von Nukleotididentität untersucht werden, um die Erzeugung von kohäsiven Enden zu ermöglichen. Ein zusätzliches Screening nach der Ligierung kann jedoch erforderlich sein, um Hybride zu identifizieren, die Fragmente in der gewünschten Ordnung und Orientierung enthalten.
Etliche weitere Details hinsichtlich der synthetischen Primer und der doppelsträngigeen DNA-Fragmente verdienen es, hervorgehoben zu werden. Erstens ist es erwähnenswert, dass für das VEGF-A-Fragment A1 und das VEGF-C-Fragment C1 die ersten beiden kodierten Aminosäuren, Asp und Pro, einen Protein-Linker bilden (kodiert durch eine manipulierte BamHI-Erkennungsstelle) und weder VEGF-A- noch VEGF-C-Sequenzen entsprechen.
Zweitens ist es unter Bezugnahme auf die 1 und 2 erwähnenswert, dass viele der Fragmente dahingehend konstruiert wurden, diskreten Strukturelementen innerhalb der rezeptorbindenden Domäne von Proteinen der VEGF-Familie zu entsprechen. Fragment 2 entspricht der N-terminalen Helix; Fragment 4 entspricht β2; Fragment 6 entspricht der β3-β4-Schleife, Fragment 7 entspricht β5; Fragment 8 entspricht der β5–β6-Schleife; und Fragment 9 entspricht β7.
Drittens ist es erwähnenswert, dass die konstruierten sechsunddreißig Oligonukleotide nicht exakt nativen menschlichen VEGF-A- oder VEGF-C-cDNA-Sequenzen (d.h. DNA-Gegenstücken von natürlich vorkommenden menschlichen mRNA-Sequenzen) entspre chen, trotz der Tatsache, dass die Oligonukleotide dahingehend konstruiert wurden, kodierte Aminosäuresequenzen der menschlichen VEGF-A- und VEGF-C-Polypeptide zu bewahren. Zum Beispiel wurden die Oligonukleotide in einer Weise konstruiert, dass die (endogene) menschliche Nukleotidsequenz, die die rezeptorbindende Domäne sowohl von VEGFR-A als auch VEGF-C kodiert, modifiziert wurden, um neue Restriktionsstellen zu erzeugen, um längere Strecken mit Nukleotididentität bereitzustellen, wobei Überlappungen zwischen den "A"- und "C"-Fragmenten erwünscht waren, oder die Kodonnutzung für die Expression in menschlicher Zellkultur zu verbessern. Alle Nukleotidmutationen (relevant für die nativen Sequenzen) waren still. Daher sind die Aminosäuresequenzen der rezeptorbindenden Domäne von VEGF-A (resultierend aus der Anlagerung der Fragmente A1–A9) und VEGF-C (aus der Anlagerung der Fragmente C1–C9) identisch zu derjenigen des entsprechenden Stammmoleküls.
Viertens, unter erneuter Bezugnahme auf 2, ist es erwähnenswert, dass jedes der neun VEGF-A-Fragmente mit dem entsprechenden VEGF-C aliniert und ein kompatibles kohäsives Ende aufweist, um sich mit benachbarten Fragmenten des anderen Moleküls zusammenzulagern. Zum Beispiel entsprechen die Fragmente A1 und C1 denselben relativen Bereichen von VEGF-A beziehungsweise VEGF-C, und weisen identische kohäsive Enden an den oberen Strängen auf. Diese kohäsiven Enden sind exakt komplementär zu den kohäsiven Enden der unteren Stränge beider Fragmente A2 und C2, so dass sich A1 entweder an A2 oder C2 anlagern könnte, und C1 könnte sich auch an A2 oder C2 anlagern. Die Fragmente A2 und C2 entsprechen denselben relativen Bereichen von VEGF-A und VEGF-C, und jedes besitzt ein anderes kohäsives Ende am unteren Strang, das exakt komplementär ist zu den kohäsiven Enden der oberen Stränge der Fragmente A3 und C3 und so weiter. Auf diese Weise wurde jeder Satz von neun Fragmenten nicht lediglich dahingehend konstruiert, sich mit benachbarten Fragmente seines Stamm-VEGF-A/VEGF-C-Moleküls zusammenzulagern, sondern auch, um sich mit benachbarten Fragmenten des anderen Moleküls zusammenzulagern.
Zusammenbau chimärer (hybrider) VEGF-Moleküle
Der Zusammenbau der 9 VEGF-A- und 9 VEGF-C-DNA-Fragmente zu Hybrid-DNAs, die Regionen sowohl von VEGF-A als auch VEGF-C beinhalten, wurde durch Ligierung verschiedener Kombinationen der VEGF-A- und VEGF-C-DNA-Fragmente bewerkstelligt. Alle DNA-Fragmente wurden nach Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen und Gelelektrophorese unter Verwendung von Qiaex-II-Perlen (Qiagen) isoliert. Es wird ersichtlich sein, dass, wenn die richtige Reihenfolge (1-2-3-4-5-6-7-8-9) der Fragmente bewahrt wird, die neun VEGF-A-Fragmente und die neun VEGF-C-Fragmente zu 512 unterschiedlichen Hybriden rekombiniert und zusammengelagert werden können, von denen zwei natürlich vorkommende Sequenzen (A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9 und C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9) repräsentieren und 510 neue Hybride repräsentieren. Alle 512 Sequenzen wurden unter Verwendung des folgenden Drei-Schritt-Verfahrens rekonstruiert.
Zuerst wurden die rezeptorbindenden Domänen von VEGF-A und VEGF-C in 4 als N123, N45, C67 und C89 bezeichneten Subdomänen geteilt, wie in 2 dargestellt ist. N123 besteht aus den ersten 3 die rezeptorbindende Domäne sowohl von VEGF-A als auch VEGF-C kodierenden DNA-Fragmenten. N45, C67 und C89 bestehen jeweils aus 2 DNA-Fragmenten, wobei N45 die Fragmente 4 und 5 beinhaltet, C67 aus den Fragmenten 6 und 7 besteht und C89 die Fragmente 8 und 9 beinhaltet.
Zusammenhängende DNAs, die der N123-Region entsprachen, wurden durch Ligierung der Fragmente 1, 2 und 3 von entweder VEGF-A oder VEGF-C konstruiert, wodurch insgesamt acht mögliche verschiedene in 3 schematisch dargestellte N123-DNA-Segmente hergestellt wurden. Gleichermaßen wurden zusammenhängende DNAs konstruiert, die den N45-, C67- und C89-Regionen entsprachen, indem zwei geeignete DNA-Fragmente von VEGF-A oder VEGF-C ligiert wurden. In diesen Fällen wurden alle vier möglichen verschiedenen Moleküle für jede der Regionen hergestellt. 4 ist ein schematisches Diagramm, das alle vier möglichen N45-DNA-Segmente darstellt, 5 stellt alle vier möglichen C67-DNA-Segmente dar und 6 zeigt alle vier möglichen C89-DNA Segmente. Alle diese Moleküle wurden als Teil der Ligierungsreaktion in die multiple Klonierungsstelle des pKO-Scrambler-V912-BX-Vektors (Lexicon Genetics Inc.) kloniert. Alle Ligierungen wurden durchgeführt durch Kombinieren von 8 nmol/µl Vektor, geschnitten mit dem passenden Restriktionsenzym, das die Klonierung der Insertionen, und dephosphoryliert; jeweils 80 nmol/µl der in den Vektor zu inserierenden DNA-Fragmente; und 5 Weiss-Einheiten von T4-DNA Ligase in 50 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/ml BSA und 5% PEG-4000, pH 7,5, mit anschließender Inkubation für 12 Stunden bei 16°C. Die 7A–7D stellen die Aminosäuresequenzen dar, die jeweils durch die Fragmente A1–A9 und C1–C9 kodiert werden; und stellen schematisch alle Permutationen von kodierten Peptiden dar, die aus Rekombinationen resultieren, die die acht N123-Konstrukte (7A), vier N45-Konstrukte (7B), vier C67-Konstrukte (7C) und vier C89-Konstrukte (7D) bilden.
Im zweiten Schritt wurden die N123-Fragmente mit N45-Fragmenten verbunden und die C67-Fragmente wurden mit C89- Fragmenten verbunden. Die N123- und N45-Fragmente wurden aus ihrem pKO-Scrambler-V912-Wirtsvektor durch Verdau mit Restriktionsenzymen entfernt, die die Ligation von N123 mit N45 ermöglichten, und die auch die Entfernung der nicht proteinkodierenden Regionen der Fragmente 3 und 4 (siehe Tabellen 1A, 1B, 2A und 2B) erzielte. Durch Ligierung jeder der acht verschiedenen N123-Regionen mit allen vier möglichen N45-Regionen wurden 32 unterschiedliche N-terminale Bereiche der rezeptorbindenden Domänen erhalten. Diese Klone wurden weiter in den pSecTagI-Vektor (SEQ ID NO: 41) inseriert. Der pSecTagI-Vektor ist ein kombinierter E.-coli/Säugetier-Expressionsvektor, der durch Modifikation des pSecTagA-Vektors (Invitrogen) konstruiert wurde. pSecTagA wurde dahingehend modifiziert, dass bestimmte Restriktionsschnittstellen unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese und synthetischer Linker eliminiert wurden, und die EM7-Promotoren von pICZα-A (Invvitrogen) und pTRACER-CMV wurden stromabwärts zu dem CMV-Promotor von pSecTagA addiert. Sowohl pSecTagI als auch sein Stammvektor, pSecTagA, ermöglichen ein hohes Expressionsniveau in Säugerzellkultur unter Verwendung geeigneter Zellinien, z.B. 293T-Zellen, Zeocin-Selektion von stabil transfizierten Säugetierzellen, enthalten ein Säuger-Signalpeptid für die Sekretion des exprimierten Proteins und enthalten ein C-terminales myc-Epitop und einen Polyhistidin-Marker für die Detektion, Quantifizierung und Aufreinigung des exprimierten Proteins. Der pSecTagI-Vektor unterscheidet sich vom pSpecTagA-Vektor darin, dass die Expression E. coli konstitutiv ist und Modifikation der Restriktionsstellen die Klonierung der Hybrid-Konstrukte erleichterte.
Die C67- und C89-Fragmente wurden aus ihrem pKO-Scrambler-V912-Wirtsvektor entfernt durch Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen, die auch die Entfernung der nicht protein kodierenden Regionen der Fragmente 6 und 9 (siehe Tabellen 1A, 1B, 2A und 2B) erzielten. Die Ligation der vier verschiedenen C67-Moleküls mit den vier verschiedenen C89-Molekülen erzeugte 16 unterschiedliche C-terminale Hälften der rezeptorbindenden Domäne. Die C67–C89-Fragmente wurden bei dieser Ligation in den pKO-Scrambler-Vektor kloniert. Schließlich führten 512 letzte Ligationen, die die 32 verschiedenen N-terminalen Bereiche und die 16 unterschiedlichen C-terminalen Regionen kombinierten, zu insgesamt 512 unterschiedlichen Molekülen, von denen 510 Hybride sind, die aus sowohl VEGF-A- als auch VEGF-C-Aminosäureresten zusammengesetzt sind. Bei diesem Schritt wurden die 512 Konstrukte in den pSecTagI-Vektor kloniert, der die 32 verschiedenen N-terminalen Bereiche enthielt. Die verbleibenden 2 Moleküle entsprechen den ursprünglichen VEGF-A- und VEGF-C-Sequenzen, die die rezeptorbindende Domäne kodieren. Die vorhergesagten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für alle 512 Hybridmoleküle sind in dem Sequenzprotokoll dargestellt, das in Tabelle 2.5 zusammengefasst ist. Tabelle 2.5

* Konstruktnomenklatur ist identisch zur Nomenklatur der Tabelle 3

Der Zusammenbau der Hybridmoleküle kann auch mit weniger Ligationsschritten als oben skizziert erzielt werden. Zum Beispiel kann die Ligierung von N123, N45, C67 und C89 in einer einzigen Ligationsreaktion vervollständigt werden. Durch Konstruktion von Fragmenten mit kohäsiven Enden, die lediglich mit kohäsiven Enden benachbarter Fragmenten perfekte Komplemente bilden, ist es möglich, in einer einzigen Ligationsreaktion mehrere Fragmente in einer korrekten Reihenfolge zu ligieren.
Beispiel 2
Expression der Hybridmoleküle
Jedes der 512 Konstrukte wurde getrennt transient in 293T-Zellen transfiziert, um die verschiedene Hybridkonstrukte zu exprimieren. Die 293T-Zellen wurden gemäß Standardprotokollen in Medium, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (D-MEM) und 10% fötalem Rinderserum (FBS) angezogen. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion wurden konfluente Schalen 1:10 mit frischem Medium in 6 Näpfen verdünnt. Vier Stunden vor der Transfektion wurde das Medium ausgetauscht. Für jedes Konstrukt wurden 3 µg DNA unter Verwendung von Standard-Protokollen für die Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion transfiziert [Sambrool et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual S. 16.33–16.36 (1989)]. Zwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zweimal mit warmer PBS gewaschen und 2 ml Medium wurden zu jedem Napf zugegeben.
Erste Versuche wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die transfizierten Zellen die durch die Hybrid-DNA-Moleküle kodierten Hybrid-VEGF-Polypeptide exprimierten. Daher wurde 48 Stunden nach der Transfektion die metabolische Markierung mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein begonnen unter Verwendung von 1,3 ml/Napf Markierungsmedium, zusammengesetzt aus MEM, dem Cystein und Methionin fehlten, 0,1% BSA, 24 µCi ³⁵S-Methionin-Cystein/ml (Redivue PRO-MIX, Amersham). Der Zellüberstand wurde 72–78 Stunden nach der Transfektion geerntet, durch Zentrifugation geklärt und bei 4°C aufbewahrt.
Der Überstand wurde mit Anti-Pentahistidin-Antikörper (Quiagen) durch Mischen von 175 µl des Probenüberstandes mit 100 µl IP-Mischung (PBS mit 1,5% BSA, 0,05% Tween 20 und 12 µl/ml Anti-Pentahistidin-Antikörper) bei 4°C über Nacht, unter Umwälzung, immunpräzipitiert. (Der pSecTagI-Expressionsvektor wurde so konstruiert, dass er jedes der Hybrid-VEGF-Proteine mit einem Polyhistidinmarker exprimierte). Um immunpräzipitiertes Protein zu sammeln, wurden 50 µl einer 30% Protein-A-Sepharose(PAS, Pharmacia)-Aufschlämmung in PBS gegeben und unter Rühren für mindestens 1,5 Stunden bei 4°C inkubiert. Standardpuffer wurde zu jeder Immunpräzipitationsprobe zugegeben und für 5 Minuten bei 95°C gekocht, währenddessen die immunpräzipitierten Proteine von der Protein-A-Sepharose dissoziierten. Nach Zentrifugation wurden 10 µl jeder Probe auf 15% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Gele wurden getrocknet und für entweder 12 Stunden gegenüber Phosphorimager-Platten oder 4 Wochen gegenüber Röntgenfilm exponiert. Die Ergebnisse dieser Experimente sind unten in Tabelle 3 in der mit "EXP" für Expression markierten Spalte wiedergegeben. Wie in der Tabelle mit "Ja" gezeigt, waren die anfänglichen Versuche, die große Mehrzahl der Hybridkonstrukte zu exprimieren, erfolgreich. Die Konstrukte, für die in den Vorversuchen eine schwache ("schwach") und keine Expression ("keine") beobachtet wurde, sind ebenfalls angegeben. Fehlende Expression in den anfänglichen Studien ist der Vollständigkeit halber angegeben, und soll keine Schlussfolgerung hinsichtlich fehlender Lebensfähigkeit oder anderer identifizierter Probleme widerspiegeln. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die nicht exprimierten Konstrukte nahezu alle jene chimären Moleküle waren, bei denen das Fragment 3 von VEGF-A stammte und das Fragment 7 von VEGF-C stammte. Die Analyse der physikalischen Beziehung zwischen diesen beiden Fragmenten zeigt, dass Reste von diesen beiden Fragmenten einander auf dem atomaren Niveau kaum kontaktieren, wie anhand der VEGF-A-Kristallstruktur beurteilt wurde. Die Inkompatibilität von Fragment 3 von VEGF-A und Fragment 7 von VEGF-C mag von unkorrekter Faltung des Moleküls herrühren, die möglicherweise zum Teil von der raschen Glykosylierung des von VEGF-C stammenden Fragments 7 hervorgerufen wird, wenn das Molekül im endoplasmatischen Retikulum erscheint. Die Glykosylierungsstellen innerhalb von VEGF-A sind in einem Abstand von der rezeptorbindenden Domäne lokalisiert, wohingegen die Glykosylierungsstellen innerhalb VEGF-C näher zu der vom Fragment 3 gebildeten Region des Moleküls angeordnet sind, von der vorhergesagt wird, dass es Kontakte mit der dritten Domäne des Rezeptors bildet. Die Kohlenhydratreste können bei der Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor ebenfalls beteiligt sein.
Beispiel 3
Bindungstests von Hybridmolekülen an lösliche VEGF-Rezeptor-Fc-Fusionsproteine
Die Hybridproteine, die in 293T-Zellen exprimiert wurden (siehe Beispiel 2 und Tabelle 1), wurden auf ihre Fähigkeit getestet, lösliche VEGF-Rezeptor-Fc-Fusionsproteine zu binden. Die Bindung der Hybridproteine an alle drei VEGF-Rezeptoren, VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3, wurde auf diese Weise analysiert. Beispielhafte Bindungstests sind in Achen et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 548–53 (1998) beschrieben, hier vollständig durch Inbezugnahme aufgenommen.
Es wird ersichtlich sein, dass die Bindungstests mit jeder Form natürlich vorkommender VEGF-Rezeptoren durchgeführt werden können, die die Fähigkeit bewahren, ihre entsprechenden Liganden zu binden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ganze Zellen, die natürlicherweise einen Rezeptor exprimieren, oder die rekombinant modifiziert wurden, um den Rezeptor zu exprimieren; trunkierte, solubilisierte extrazelluläre ligandenbindende Domänen des Rezeptors; Fusionen, umfassend extrazelluläre Rezeptordomänen, fusioniert mit anderen Proteinen wie beispielsweise alkalischer Phosphatase (z.B. VEGFR-2-AP, beschrieben in Cao et al., J Biol. Chem. 271: 3154–62 (1996)) oder Immunglobulinsequenzen; und Fusionen, umfassend extrazelluläre Rezeptordomänen, fusioniert an Markersequenzen (z.B. einen Polyhistidinmarker), die geeignet sind, um das Protein mit einem Antikörper oder mit einem festen Träger einzufangen; und extrazelluläre Rezeptordomänen, die chemisch an einen festen Träger wie beispielsweise CNBr-aktivierte Sepharose-Perlen angeheftet wurden.
Für die vorliegenden Experimente wurde die Rezeptorbindung unter Verwendung von Konstrukten getestet, die die extrazelluläre Domäne von VEGFR-1, VEGFR-2 oder VEGFR-3, fusioniert an Ketten der konstanten Region von Immunglobulin, umfassen. Die ersten drei Ig-Domänen von VEGFR-1 wurden an das Fc- Fragment des Signal-pIgPlus-Vektors (Ingenius/Novagen/R&D Systems) fusioniert. Dieses Konstrukt (VEGFR-1-Fc) wurde stabil in Drosophila-Schneider-2(S2)-Zellen exprimiert und unter Verwendung von Protein-A-Sepharose gereinigt. Die Reinheit wurde durch Silberfärbung auf einem PAGE-Gel analysiert und die Funktionalität des Fusionsproteins wurde anhand seiner Fähigkeit getestet, ³⁵S-markiertes VEGF-Protein zu binden. Der VEGFR-2-Fc-Rezeptor umfasst die ersten 3 Ig-Domänen von VEGFR-2 (kodiert durch die Nukleotide 64–972 der GenBank-Zugriffsnummer X61656), fusioniert an das Fc-Fragment des pIg-Vektors. Der VEGFR-3-Fc-Rezeptor besteht gleichermaßen aus den ersten drei Ig-Domänen von VEGFR-3 (kodiert durch die Nukleotide 20–1005 der GenBank-Zugriffsnummer X68203), fusioniert an das Fc-Fragment des pIg-Vektors. VEGFR-2-Fc- und VEGFR-3-Fc-Proteine wurden in 293T-Zellen exprimiert und wie oben für VEGFR-1-Fc beschrieben gereinigt.
Das Bindungstestverfahren war identisch zu der Immunpräzipitation unter Verwendung von Pentahistidin-Antikörper, beschrieben in Beispiel 2, mit Ausnahme der Zusammensetzung der Immunpräzipitations(IP)-Mischung. Die für die Rezeptorbindungsanalysen verwendeten IP-Mischungen waren wie folgt: für VEGFR-1-Bindungstests bestand die IP-Mischung aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 1,5% BSA, 0,06% Tween 20, 3 µg/ml Heparin und 400 ng/ml VEGFR-1-Fc-Fusionsprotein (100 µl dieser IP-Mischung wurden zu 200 µl Probenüberstand zugegeben); für VEGFR-2-Bindungstests bestand die IP-Mischung aus 82% konditioniertem Zellüberstand von 293T-Zellen, die VEGFR-2-Fc-Fusionsprotein transient exprimierten, in Mischung mit 18% einer PBS-Lösung, die 5% BSA, 0,2% Tween 20 und 10 µg/ml Heparin enthielt (250 µl IP-Mischung wurden zu 200 µl Probenüberstand zugegeben); und für VEGFR-3-Bindungstests bestand die IP-Mischung aus 82% konditioniertem Zellüberstand von 293T-Zellen, die VEGFR-3-Fc-Fusionsprotein transient exprimierten, 18% PBS enthaltend 5% BSA, 0,2% Tween 20 und 10 µg/ml Heparin (250 µl IP-Mischung wurden zu 200 µl Probenüberstand zugegeben). Einige wenige ausgewählte Konstrukte (die Klone 12-1, 12-5, 12-7, 12-9, 12-11, 12-13, 12-14, 14-9, 23-1, 32-14, 52-15, 53-3, 82-7, 82-9, 82-11, 82-13, 83-15, 84-9 und 84-11) wurden mehr als einmal untersucht.
Die Ergebnisse der Bindungstests unter Verwendung von ³⁵S-markierten Hybridproteinen sind unten in Tabelle 3 zusammengefasst. Die apparenten Molekulargewichte der detektierten Proteinen lagen zwischen 18 und 27 kDa. Üblicherweise waren zwei Banden mit unterschiedlichen Bandenintensitäten sichtbar. Manchmal war die zweite Bande nur nach langer Exposition detektierbar. Die Anwesenheit von zwei Banden korreliert mit dem Ursprung der Fragmente 7 und 9 des untersuchten Hybridproteins. Fragment 7 enthält eine potentielle Glykosylierungsstelle, unabhängig davon, ob es von VEGF-A oder VEGF-C abgeleitet wurde, wohingegen Fragment 9 lediglich dann eine Glykosylierungsstelle enthält, wenn es von VEGF-C stammte. Die mehrfachen Banden sind daher wahrscheinlich auf eine differentielle Glykosylierung des analysierten Hybridprotein zurückzuführen. Im Folgenden sind vorhergesagte Banden für verschiedene Kombinationen von Glykosylierungsstellen angegeben:

(1) Fragment 7, abgeleitet von VEGF-A, und Fragment 9 von VEGF-A, erzeugt zwei Banden von –18 und –22 kD.
(2) Fragment 7, abgeleitet von VEGF-A und Fragment 9 von VEGF-C erzeugt eine –26-kD-Bande (eine zweite Bande von –22 kD fehlt manchmal, eine dritte extrem schwache Bande von –18 kD ist manchmal sichtbar).
(3) Fragment 7, abgeleitet von VEGF-C, und Fragment 9 von VEGF-A erzeugt eine Bande von –22 kD (eine zweite Bande von –18 kD fehlt manchmal).
(4) Fragment 7, abgeleitet von VEGF-C, und Fragment 9 von VEGF-C erzeugt eine Bande von –23 kDa

Die Ergebnisse des Bindungstests deuten darauf hin, dass, wenn beide Glykosylierungsstellen von VEGF-C abgeleitet waren, weniger heterogene Glykosylierung beobachtet wurde. Moleküle, die sowohl Fragment 7 von VEGF-A als auch Fragment 9 von VEGF-C enthielten, scheinen eine künstliche Hyperglykosylierung zu fördern. Die in Fragment 7 enthaltene VEGF-A-Glykosylierungsstelle ist ebenfalls für unvollständige Glykosylierung anfällig.
Die Bindungstestdaten deuten darauf hin, dass etliche Hybridmoleküle neue Bindungseigenschaften zeigen. Obwohl die Analyse nicht quantitativ war, zeigten einige der Hybridmoleküle unterschiedliche relative Signalstärken. Klon 72-10 beispielsweise scheint den größten Teil seiner Affinität für VEGFR-3 verloren zu haben, während er den größten Teil seiner Affinität für VEGFR-2 beibehalten hat. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass unter den Hybridprotein, die die Rezeptorspezifitäten für eines der Stammproteine (VEGF-A oder VEGF-C) bewahrten, einige unterschiedliche Änderungen hinsichtlich ihrer Bindungsaffinitäten zu den entsprechenden Rezeptoren durchgemacht haben.
In Tabelle 3 unten führt Spalte 1 die Bezeichnungen der untersuchten Konstrukte auf. Spalte 2 führt nacheinander die neun Fragmente jedes Konstrukt auf, wobei A = Fragment von VEGF-A und C = Fragment von VEGF-C. Die mit "EXP" gekennzeichnete Spalte 3 führt die Ergebnisse der Experimente zur Expression in 293T-Zellen, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf. In dieser Spalte bedeutet "keine", das kein detektierbares Protein exprimiert wurde; "schwach" bedeutet, dass eine schwache Expression detektierbar war; und "Ja" bedeutet, dass das exprimierte Protein leicht detektierbar war. Die letzten drei Spalten führen Ergebnisse der in Beispiel 3 beschriebenen Rezeptorbindungstests auf, wobei die Bindung an VEGFR-1-Fc; VEGFR-2-Fc; und VEGFR-3-Fc untersucht wurde. Für diese letzten drei Spalten bedeutet "Ja" Bindung, "keine" bedeutet keine detektierbare Bindung an den Rezeptor und "0" bedeutet, dass dieses Konstrukt in 293T-Zellen nicht exprimiert wurde, so dass es für den Bindungstest nicht verwendet werden konnte. Tabelle 3 Ergebnisse der Hybridmolekülexpression und Rezeptorbindungsanalyse
Rezeptorbindende Eigenschaften wurden nur für Konstrukte analysiert, die exprimiert wurden. Wenn ein Klon schwach exprimiert wurde, wurden seine rezeptorbindenden Eigenschaften nur analysiert, wenn deren Maß eine Unterscheidung von der endogenen VEGF-A-Expression ermöglichte, oder wenn seine Aminosäurezusammensetzung die Entfernung von endogenem VEGF-A unter Verwendung monoklonaler Anti-VEGF-A-Antikörper (R&D-Systems) vor der Untersuchung der Rezeptorbindung ermöglichte. Obwohl das Epitop, das durch diesen Anti-VEGF-A-Antikörper erkannt wird, nicht charakterisiert worden ist, deuten unsere vorläufigen Ergebnisse darauf hin, dass das Epitop innerhalb von ein oder mehreren der Fragmente 2, 3, 4, 7 oder 9 von VEGF-A lokalisiert ist. Auf diese Weise wurde die Antikörper-Präzipitation von endogenem VEGF-A für alle Konstrukte durchgeführt, bei denen die Fragmente 2, 3, 4, 7 oder 9 von VEGF-C abgeleitet wurden. Die weitere Kartierung des Epitops dieses Antikörpers kann eine ähnliche Untersuchung weiterer Konstrukte ermöglichen. Wenn eine nachfolgende Analyse darauf hindeutet, dass das Epitop sich nicht in Fragment 2 befindet, können zum Beispiel Konstrukte, bei denen Fragment 2 von VEGF-A abgeleitet wurde, ebenfalls durch dieses Verfahren analysiert werden. Dieses Verfahren wurde für die Bindung an VEGFR-1 oder VEGFR-2 durchgeführt, um festzustellen, wie viele mit niedriger Affinität bindende Hybridmoleküle aufgrund der Wechselwirkung mit endogenem VEGF nicht detektiert wurden. Die fehlende Detektion eines Signals oder die Detektion eines schwachen Signals in dem Rezeptorbindungstest zeigt nicht zwingend eine fehlende oder geringe Rezeptorbindungsaffinität an. Der spezifische Aufbau des Experiments ermöglicht keine Detektion von niedrig affinen Bindemitteln von VEGFR-1 und VEGFR-2, die schwach exprimiert werden. Daher kann es sein, dass der Bindungstest niedrig affine Bindemittel von VEGFR-1 und VEGFR-2 für einige der Hybridproteine, die schwach exprimiert wurden, nicht detektiert hat.
Bei diesem Test könnte eine ersichtlich niedrige Rezeptorbindungsaffinität eines auf geringem Niveau exprimierten Hybridmoleküls auf Heterodimerisierung mit endogenem VEGF zurückzuführen sein. Wenn zum Beispiel ein Hybridprotein selbst keine Rezeptoraffinität aufweist, aber in der Lage ist, mit endogenem VEGF-A zu dimerisieren, kann ein solches Heterodimer in der Lage sein, ein oder mehrere Rezeptoren mit niedriger Affinität zu binden. Die Aufreinigung von chimären Polypeptiden gemäß der Erfindung (z.B. unter Verwendung von Immunaffinitätschromatographie mit einem Antikörper, der entweder die myc- oder HA-Marker-Sequenzen erkennt) und unter Verwendung des gereinigten Polypeptids in Rezeptorbindungstests wird jede Unklarheit, die durch endogenes VEGF-A in konditioniertem Medium hervorgerufen wird, beseitigen. Alternativ werden die Hybridproteine in den Insektenzellen, zum Beispiel S9-Zellen, exprimiert, um eine Kontamination mit endogenem VEGF-A zu verhindern.
Das Fehlen einer Expression oder Expression auf niedrigem Niveau eines bestimmten Konstrukts kann auf die Eigenschaften des Hybridproteins selbst, Variationen in der DNA-Qualität zurückzuführen sein, oder kann Mutationen in der DNA wider spiegeln, die während der Konstruktion des Hybridklons erworben wurden. Im vorliegenden Fall wurden alle Konstrukte nach dem ersten Ligierungsschritt sequenziert und die ausgewählten Klone wurden nach dem zweiten Ligierungsschritt sequenziert. Die Analyse dieser Sequenzen deutete darauf hin, dass während des ersten Schrittes keine Mutationen auftraten, und keine der nach dem zweiten Konstruktionsschritt untersuchten Sequenzen Mutationen enthielt. Daher traten alle Mutationen, die in dem endgültigen Klon vorhanden waren, sehr wahrscheinlich während des letzten Ligierungsschritts auf.
Sechsunddreißig der 512 Klone wurden sequenziert, um die Häufigkeit festzustellen, mit der Konstrukte während der Konstruktion der Klone Mutationen erwarben, die zu Änderungen auf dem Aminosäureniveau führten. Die Konstrukte, die sequenziert wurden, waren die Klone 11-1 (SEQ ID NO: 42-43), 11-16 (SEQ ID NO: 44–45), 21-1 (SEQ ID NO: 46–47), 22-16 (SEQ ID NO: 48–49), 12-1 bis 12–16 (SEQ ID NO: 50–81) und 31-1 bis 31-16 (SEQ ID NO: 82–113). Nur 2 von 36 Klonen, 12–13 und 12–16, zeigten eine Abweichung von der erwarteten Sequenz. Klon 12–16 war einem Verlust von zwei Basenpaaren an der Ligationsverbindungsstelle zwischen N45 und C67 unterworfen, was zu einer Leserahmenverschiebungsmutation nach dem RCG-Trielet von Fragment C5 und einem Stopkodon nur wenige Kodons danach führte. Klon 12-13 hatte eine Punktmutationen erworben, die zu einer Substitution von Asp durch Asn an der letzten C-terminalen Aminosäure dieses Hybridproteins führt.
Von den untersuchten 512 Hybridkonstrukten wurden vier für die weitere Analyse, einschließlich der Sequenzierung, um etwaige während der Konstruktion des Hybridproteins auftretenden Mutationen festzustellen, und der Wiederholung der Bindungstests zur Bestätigung der ursprünglichen Ergebnisse, ausgewählt. Die Ergebnisse aus den Bindungstests dieser vier bestimmten Hybridproteine: Konstrukte 12-13, 12-11, 12-9 und 12-7 deuten darauf hin, dass sie neue Bindungsmuster zeigen, die bekannte VEGF-Rezeptor-Liganden nicht aufweisen. 12-9 und 12-13 zeigen eine Bindung an VEGFR-1 und VEGFR-3, aber nicht an VEGFR-2, wohingegen 12-7 und 12-11 eine Bindung an alle drei VEGF-Rezeptoren zeigen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, durch kombinatorische Vorgehensweisen VEGF-verwandte Wachstumsfaktoren bereitzustellen, die modifizierte Eigenschaften aufweisen. Von den in einigen Fällen konstruierten neuen Molekülen wurde gezeigt, dass sie im Vergleich zu ihren Wildtyp-Vorläufern modifizierte biologische Wirkungen aufweisen und daher in Anwendungen verwendet werden können, bei denen Spezifität und Feinabstimmung biologischer Wirkungen erforderlich ist. Insbesondere zeigen diese Experimente, dass es möglich ist, einen "Super-VEGF", wie beispielsweise die Klone 12-7 und 12-11, zu konstruieren, die alle drei bekannten VEGFRs binden und daher bei der Induktion des Gefäßwachstum eine einzigartige Potenz aufweisen sollten.
Beispiel 4
Untersuchung von VEGF-A- und VEGF-C-Rezeptor bindenden Epitopen
Die VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine können verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen VEGF-A oder VEGF-C und deren Rezeptoren zu untersuchen. Die Analyse der Ergebnisse aus den Rezeptorbindungstests, wie sie beispielsweise in Tabelle 3 Beispiel 3 beschrieben sind, ermöglichen die sorgfältige Untersuchung der rezeptorbindenden Epitope dieser zwei VEGF-Wachstumsfaktoren. Die Fähigkeit bestimmter Hybridproteine, einen der VEGF-Rezeptoren zu binden, kann mit der Anwesenheit von einem oder mehreren bestimmten Fragmenten korreliert werden, die von einem der Stammmoleküle abgeleitet wurden. Solche Daten können dabei helfen, Aminosäurereste zu bestimmen, die für die Bindung an einen spezifischen VEGF-Rezeptor wichtig sind. Die Kenntnis der genauen rezeptorbindenden Epitope eines bestimmten VEGF-Proteins kann die Konstruktion von hemmenden Molekülen erleichtern, die für therapeutische Zwecke nützlich sind.
Einundzwanzig VEGF-Reste, die für die Kopplung mit VEGFR-1 wichtig sind, sind in groß- und fettgedrucktem Text angegeben:
Daten aus den Chimären-Experimenten deuten darauf hin, dass jene Reste aus Fragment 2, die der N-terminalen Helix entsprechen und Reste aus Fragment 7, die dem β5-Strang entsprechen, für die Verleihung von VEGFR-1-Spezifität besonders wichtig sind. 8 ist ein dreidimensionales Modell der Wechselwirkung eines VEGF-A-Dimers mit zwei VEGFR-1-Molekülen. Die beiden VEGF-A-Monomere sind grün beziehungsweise blau gefärbt. Die Domäne 2 der zwei VEGFR-1-Rezeptoren ist in Grau dargestellt. Rot repräsentiert den Ort von Resten innerhalb der VEGF-A-Monomere, die für die VEGFR-1-Kopplung wichtig sind. Diese Reste sind an den beiden Enden des VEGF-Dimers gebündelt und beinhalten die N-terminale Helix und einen Teil des β5-Strangs.
Die entsprechenden einundzwanzig Reste in VEGF-C, die analog an der Kopplung von VEGFR-3 beteiligt wären, sind unten in groß- und fettgedrucktem Text angegeben:
Interessanterweise deutet die Analyse der Rezeptorbindungsmuster aus den Chimären-Experimenten darauf hin, dass ein VEGF-C-abgeleitetes Fragment 4 (das den β2-Strang des Moleküls enthält) für die VEGFR-3-Bindungsspezifität absolut notwendig ist. Die Fragmente 5 (welches den β3-Strang enthält) und 8 scheinen zwei andere wichtige VEGF-C-Fragmente für die VEGFR-3-Bindung darzustellen. Die Aminosäuresequenz der VEGF-C-Fragmente 4 und 5 ist EFGVATNTFFKPPCVSVYRCG SEQ ID NO: 1205). Das Restequintett TNTFxxxP (SEQ ID NO: 1204) ist besonders erwähnenswert, weil diese Reste bei VEGF-C von Mensch, Wachtel und Rind und bei menschlichem VEGF-D konserviert sind, die alle VEGFR-3 binden. Die analogen Reste in menschlichem VEGF-A, die VEGFR-3 nicht binden, weichen ab: IEYIxxxS (SEQ ID NO: 1211). 10 ist ein dreidimensionales Modell der Wechselwirkung zwischen Bereichen eines VEGF-C-Dimers und einem einzelnen VEGFR-3-Molekül, extrapoliert aus dem VEGF-A/VEGFR-1-Modelle. Blau und grün repräsentieren die beiden VEGF-C-Monomere und grau repräsentiert VEGFR-3. Fragment 5 des grünen VEGF-C-Monomers ist in orange gezeigt und Fragment 4 desselben Monomers ist in weiß dargestellt. Reste in Rot sind jene innerhalb der Fragmente 4 oder 5 lokalisierten, die möglicherweise in Kontakt mit dem Rezeptor stehen.
9 ist ein dreidimensionales Modell, das die Furche darstellt, die zwischen den Fragmenten gebildet wurde, die wichtig für die VEGFR-3-Spezifität zu sein scheinen. Von dieser Furche wird gemutmaßt, dass sie die Linker-Region zwischen Domäne 2 und 3 des VEGFR-3-Rezeptors beherbergt. Der Eingang und die Seiten dieser Furche werden durch die Fragmente gebildet, die für die Verleihung der VEGFR-3-Spezifität wichtig zu sein scheinen. Das Grün und Blau weist auf die zwei VEGF-C-Monomeren hin, und das Grau bezeichnet das VEGFR-3-Rezeptormolekül. Die VEGF-C-Reste, von denen angenommen wird, dass sie an der Bindung von VEGFR-3 beteiligt sind, sind in gelb gezeigt.
Obwohl die Fragmente 6 und 9 an der Wechselwirkung zwischen den VEGF-Rezeptoren beteiligt sind, scheinen diese Fragmente an der Bestimmung der Rezeptorspezifität nicht beteiligt zu sein.
Beispiel 5
Analyse der Rezeptor-Aktivierung oder -Hemmung durch die Hybrid-VEGF-Proteine
Die VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine können für therapeutische Anwendungen verwendet werden, bei denen entweder die Aktivierung oder Hemmung von einem oder mehreren VEGF-Rezeptoren erwünscht ist. Zum Beispiel kann ein Kandidaten-Hybridprotein zu stabilen Zelllinien zugegeben werden, die einen bestimmten VEGF-Rezeptor exprimieren, dessen Aktivierung für das Zellüberleben notwendig ist. Das Überleben der Zellinie zeigt, dass das Kandidaten-Hybridprotein in der Lage ist, diesen bestimmten VEGF-Rezeptor zu binden und zu aktivieren. Auf der anderen Seite zeigt der Tod der Zellinie, dass das Kandidaten-Hybridprotein den Rezeptor nicht aktiviert. Beispielhafte Beispiele solcher Zellüberlebenstests sind in der Publikation der internationalen Patentenmeldung Nr. WO 98/07832 und in Achen et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 548–553 (1998) beschrieben.
Dieser Test setzt Ba/F3-NYK-EpoR-Zellen ein, die Ba/F3-Prä-B-Zellen sind, die mit einem Plasmid transfiziert worden sind, der einen chimären Rezeptor kodiert, der aus der extrazellulären Domäne von VEGFR-2 und der zytoplasmatischen Domäne des Erythropoietin-Rezeptors (EpoR) besteht. Diese Zellen werden routinemäßig in Interleukin-3 (IL-3) passagiert und sterben in Abwesenheit von IL-3. Wenn die Signalübertragung jedoch von der zytoplasmatischen Domäne des chimären Rezeptors induziert wird, überleben diese Zellen und proliferieren in Abwesenheit von IL-3. Solch eine Signalgebung wird durch Liganden induziert, die an die VEGFR-2-Extrazellulardomäne des chimären Rezeptors binden. Zum Beispiel veranlasst die Bindung von VEGF-A oder VEGF-D an die VEGFR-2-Extrazellulardomäne die Zellen dazu, in Abwesenheit von IL-3 zu überleben und zu proliferieren. Elterliche Ba/F3-Zellen, denen der chimäre Rezeptor fehlt, werden weder durch VEGF-A noch durch VEGF-D dahingehend induziert, in Abwesenheit von IL-3 zu proliferieren, was darauf hindeutet, dass die Reaktionen des Ba/F3-NYK-EpoR-Zellen auf diese Liganden vollständig von dem chimären Rezeptor abhängig sind.
Kandidaten-Hybridproteine können auf Bindung an die VEGFR-2-Extrazellulardomäne und anschließende Aktivierung des chimären Rezeptors getestet werden, indem das Zellüberleben in Abwesenheit von IL-3 untersucht wird. Auf der andern Seite werden Hybridproteine, die die Bindung von VEGFR-2-Liganden, wie beispielsweise VEGF-A oder VEGF-D an die extrazelluläre Domä ne oder die Aktivierung der zytoplasmatischen Domäne stören, den Zelltod in Abwesenheit von IL-3 verursachen.
Zellen werden, solange erfordlich, in Anwesenheit von IL-3 kultiviert, dann dreimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, in IL-3-freiem Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), versetzt mit fötalem Kälberserum (10%), L-Glutamin (1%), Geneticin (1 mg/ml), Streptomycin (100 µg/ml) und Penicillin (60 µg/ml)) resuspendiert und zurück auf 72-Napf-Kulturplatten (Nunc, Dänemark) zu einer Dichte von ungefähr 1000 Zellen/Napf plattiert. Zur Untersuchung auf Rezeptoraktivität werden Kandidaten-Hybridproteine zu Kulturennäpfen bei einer Endkonzentration von 10^-10 bis 10^-5 M zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C in 10% CO₂ kultiviert. Zur Untersuchung der Fähigkeit des Kandidaten-Hybridprotein, die Aktivierung des VEGFR-2/EpoR zu hemmen, wird rekombinantes VEGF-A oder VEGF-D zu Hybridproteinhaltigen Näpfen in einer Konzentration zugegeben, um ein nahezu maximales Überleben der Ba/F3-NYK-EpoR-Zellen zu erzeugen (typischerweise 500 ng/ml). Positivkontrollkulturen enthalten entweder VEGF-A- oder VEGF-D-Überstand allein und Negativkontrollkulturen enthalten weder Hybridprotein noch Wachstumsfaktor. Die Zellen werden dann für 48 Stunden in Kultur angezogen, wonach eine Lösung von 3-(3,4-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT; 500 µg/ml) zu den Kulturen zugegeben und für weitere 30 Minuten inkubiert wird. MTT wird durch Mitochondrien zu einem blauen Formazan-Produkt umgewandelt, wodurch lebende Zellen blau angefärbt werden. Überlebende blaue Zellen in Experimenten, in denen entweder die Aktivierung (Hybridprotein allein) oder Hemmung (Hybridprotein + VEGF-A oder VEGF-D) untersucht wurde, wurden unter einem Mikroskop mit invertierter Optik (100x Vergrößerung) gezählt und mit dem Zellüberleben in den Näpfen der Po sitivkontrolle (VEGF-A oder VEGF-D allein) verglichen. Das Zellüberleben wird normalisiert, so dass das Überleben in den Negativkontrollen auf 0 gesetzt wird (typischerweise wurden in den Negativkontrollen keine lebensfähigen Zellen beobachtet), während das Überleben in Positivkontrollen auf 100% gesetzt wird (typischerweise 300–400 Zellen/Napf)
Die Daten werden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, mit einem post-hoc durchgeführten multiplen Vergleichstest nach Bonferroni, um auf Unterschiede zwischen einzelnen Kulturen von Hybridprotein allein (zur Untersuchung der Bindung und Aktivierung des Rezeptors) oder Hybridprotein + VEGF-A oder VEGF-D (zur Untersuchung der Hemmung der Rezeptoraktivierung), mit VEGF-A oder VEGF-D allein (Positivkontrolle) zu testen.
Die Wiederholung desselben Tests unter Verwendung von mit verschiedenen chimären Rezeptoren (zum Beispiel VEGFR-3/EpoR) transfizierten Zellen ermöglicht das Screening auf Aktivierung verschiedener VEGFRs.
VEGFR-2(KDR)- und VEGFR-3(Flt4)-Autophosphorylierungstests
Als alternativer Aktivitätsindikator kann auch die Fähigkeit eines Hybridproteins untersucht werden, die Autophosphorylierung eines bestimmten VEGF-Rezeptors zu stimulieren. Ein Kandidaten-Hybridprotein wird zu Zellen zugegeben, die einen bestimmten VEGF-Rezeptor exprimieren. Die Zellen werden dann lysiert und mit Anti-VEGF-Rezeptor-Antiserum immunpräzipitiert und durch Western-Blotting unter Verwendung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern analysiert, um eine Hybridproteininduzierte Phosphorylierung des VEGF-Rezeptors festzustellen.
Ein Expressionsvektor, der ein ein erfindungsgemäßes Hybrid-VEGF-Molekül kodierendes Polynukleotid umfasst, wird in eine geeignete Wirtszelle (z.B. 293-EBNA-Zellen unter Verwendung einer Kalziumphosphat-Transfektionsmethode transfiziert. Etwa 48 Stunden nach der Transfektion wird das Wachstumsmedium der transfizierten Zellen gewechselt (z.B. zu DMEM-Medium ohne fötales Kälberserum) und die Zellen werden inkubiert (z.B. für 36 weitere Stunden), um ein konditioniertes Medium zu liefern. Das konditionierte Medium wird gesammelt und bei 5000 × g für 20 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wird konzentriert.
Das konzentrierte konditionierte Medium wird verwendet, um Zellen zu stimulieren, die einen VEGF-Rezeptor exprimieren. Zum Beispiel werden PAE-KDR-Zellen (Pajusola et al., Oncogene, 9: 3545–55 (1994); Waltenberger et al., J Biol. Chem., 269: 26988–26995 (1994)) in Hams F12-Medium-10% fötales Kälberserum (FCS) angezogen, oder konfluente NIH-3T3-Zellen, die VEGFR-3 exprimieren, werden in DMEM-Medium angezogen. Die Zellen werden über Nacht in DMEM Medium oder Hams F12, versetzt mit 0,2% Rinderserumalbumin (BSA), ausgehungert und dann für 5 Minuten mit den unkonzentrierten, 2-fach, 5-fach und/oder 10-fach konzentrierten konditionierten Medien inkubiert. Rekombinanter menschlicher VEGF-A oder VEGF-C und konditioniertes Medium von "mock"-transfizierten Zellen sind beispielhafte Kontrollen. Zusätzlich zu konditioniertem Medium können gereinigte Hybridpolypeptide bei diesem oder bei anderen hier beschriebenen Tests eingesetzt werden.
Nach Stimulation mit konditioniertem Medium werden die Zellen zweimal mit eiskalter Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), enthaltend 100 mM Natriumorthovanadat, gewaschen und in RIPA-Puffer, enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1 U/ml Aprotinin und 100 mM Natriumorthovanadat, lysiert. Die Lysate werden einer Ultraschallbehandlung unterzogen, durch Zentrifugationen bei 16.000 × g für 20 Minuten geklärt und für 3–6 Stunden auf Eis mit 3–5 µl für VEGFR-3 oder VEGFR-2 spezifischen Antiseren inkubiert. Immunpräzipitate werden an Protein-A-Sepharose gebunden, dreimal mit RIPA-Puffer, enthaltend 1 mM PMSF, 1 mM Natriumorthovanadat, gewaschen, zweimal mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) gewaschen und einer SDS-PAGE unter Verwendung eines 7%-Gels unterzogen. Polypeptide werden durch Western-Blotting auf Nitrozellulose übertragen und unter Verwendung von Phosphotyrosin-spezifischen monoklonalen Antikörpern PY20 (Transduction Laboratories) oder rezeptorspezifischem Antiserum und dem ECL-Detektionsverfahren (Amersham Corp.) analysiert.
Die Fähigkeit eines Hybridpolypeptids, die Autophosphorylierung (detektiert unter Verwendung der Anti-Phosphotyrosin-Antikörper) zu stimulieren, wird als Stimulation des Rezeptors bewertet. Das Niveau der beobachteten Stimulation für verschiedene Konzentrationen von Hybridpolypeptid im Verhältnis zu bekannten Konzentrationen von VEGF-A oder VEGF-C ergibt einen Hinweis auf die Rezeptorstimulationspotenz. Polypeptide, von denen sich gezeigt hat, dass sie den Rezeptor binden, jedoch unfähig sind, die Rezeptorphosphorylierung zu stimulieren, werden als Inhibitoren gewertet. Inhibitorische Aktivität kann ferner durch Mischen eines bekannten Rezeptoragonisten wie beispielsweise rekombinantem VEGF-A oder VEGF-C mit entweder Medium allein oder mit konzentriertem konditioniertem Medium getestet werden, um festzustellen, ob das konzentrierte konditionierte Medium die VEGF-A-vermittelte oder VEGF-C-vermittelte Rezeptorphosphorylierung hemmt.
In anfänglichen Experimenten zur Untersuchung der durch ausgewählte VEGFR-2 oder VEGFR-3 bindende Hybridmoleküle vermittelten Tyrosinphosphorylierung von VEGFR-2 und VEGFR-3 wurde beobachtet, dass alle getesteten Hybridproteine in der Lage waren, die Phosphorylierung des Rezeptors zu induzieren, jedoch in einem geringeren Maß als die, die durch VEGF-A oder VEGF-C vermittelt wurde. Weitere Untersuchungen der Expressionsniveaus der Hybridproteine in dem Baculovirus-System, das verwendet wurde, um die Proteine herzustellen, deuten darauf hin, dass die Proteine nicht alle in vergleichbaren Mengen exprimiert werden. Die unterschiedlichen Expressionsniveaus der Hybridproteine können einen Teil der niedrigeren Aktivitäten erklären, die diese Proteine bei Untersuchung auf ihre Fähigkeit zur Stimulation der Tyrosinphosphorylierung von VEGFR-2 und VEGFR-3 aufweisen. Darüber hinaus korreliert das Maß der unter Verwendung dieses bestimmten Tests ermittelten durch diese Hybridmoleküle induzierten Phosphorylierung möglicherweise nicht mit der biologischen Aktivität in vivo.
Beispiel 6
Analyse der Rezeptorbindungsaffinitäten von Hybridproteinen
Die vorläufige Analyse der 512 Hybridproteine weist darauf hin, dass eine Anzahl von ihnen in der Lage sind, einen oder mehrere der VEGFRs binden. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse dieses Experiments darauf hin, dass einige unterschiedliche Bindungsaffinitäten zu einem oder mehreren VEGFRs zeigen. Für diese Experimente wird das Hybridprotein in einem Insektenzellsystem, z.B. S9-Zellen, exprimiert, um eine Kontamination mit in Säugetierzellen gefundenem VEGF-A auszuschließen. Um die relativen Bindungsaffinitäten ausgewählter Hybridproteine zu messen, wird ein ELISA-artiger Ansatz verwendet. Zum Beispiel werden Verdünnungsreihen konkurrierender VEGFR-1-IgG-Fusionsproteine und eine Untersättigungskonzentration des mit dem myc-Epitop markierten Kandidaten-Hybridproteins in mit VEGFR-1 beschichtete Mikrotiterplatten gegeben und inkubiert, bis sich ein Gleichgewicht einstellt. Die Platten werden dann gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen. Hybridmoleküle, die an die VEGFR-1-beschichteten Platten gebunden bleiben, werden unter Verwendung eines an einen leicht detektierbaren Marker, zum Beispiel Meerrettichperoxidase, konjugierten Anti-myc-Antikörpers detektiert. Die Bindungsaffinitäten (EC50) können als die Konzentration des konkurrierenden VEGF-IgG-Fusionsproteins ermittelt werden, die zu einer halbmaximalen Bindung führt. Diese Werte können mit jenen verglichen werden, die aus der Analyse von VEGF-A oder VEGF-C zur Feststellung von Änderungen der Bindungsaffinität von einem oder mehreren der VEGFRs erhalten wurden. Gleichermaßen wird die Bindung an VEGFR-2 erreicht durch Verwendung von VEGFR-2-IgG-Fusionsprotein, und die Bindung an VEGFR-3 wird bestimmt unter Verwendung eines VEGFR-3-IgG-Fusionsproteins.
Beispiel 7
Durch VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine vermittelte Endothelzellmigration in Kollagengel
Sowohl VEGF-A als auch VEGF-C stimulieren die Endothelzellmigration in Kollagengel. Die Hybridproteine werden untersucht, um festzustellen, ob sie in der Lage sind, die Endothelzellmigration in Kollagengel zu stimulieren, wodurch ein weiteres Indiz auf biologische Aktivität bereitgestellt wird. Beispielhafte Beispiele eines solchen Zellmigrationstests sind in der Publikation der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/33917 beschrieben. Kurz gesagt, werden bovine kapilläre Endothelzellen (BCE) auf eine Kollagenschicht in Ge webekulturplatten geimpft. Konditionierte Medien von mit einem Expressionsvektor transfizierten Zellen, die das Kandidaten-Hybridprotein herstellen, werden in Näpfen platziert, die ungefähr 4 mm von dem Ort der angehefteten BCE-Zellen entfernt in Kollagengel hergestellt wurden. Die Zahl der BCE-Zellen, die aus dem ursprünglichen Gebiet in dem Kollagengel in Richtung der das Hybridprotein enthaltenden Näpfe gewandert sind, wird dann gezählt, um die Fähigkeit des Hybridproteins zu ermitteln, die Zellmigration zu induzieren.
BCE-Zellen (Folkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 5217–5221 (1979)) werden wie in Pertovaara et al., J. Biol. Chem., 269: 6271–74 (1994) beschrieben kultiviert. Kollagengele werden durch Mischen von Typ-I-Kollagen-Stammlösung (5 mg/ml in 1 mM HCl) mit einem gleichen Volumen von 2 × MEM und 2 Volumina MEM, enthaltend 10% Neugeborenen-Kälberserum, um eine endgültige Kollagenkonzentration von 1,25 mg/ml zu ergeben, hergestellt. Gewebekulturplatten (5 cm Durchmesser) werden mit einer etwa 1 mm dicken Schicht der Lösung beschichtet, die bei 37° polymerisiert wird. BCE-Zellen werden auf diese Schicht aufgeimpft.
Für die Migrationstests wird es den Zellen ermöglicht, sich im Inneren eines Kunststoffringes (1 cm Durchmesser) anzuheften, der auf der ersten Kollagenschicht platziert wird. Nach 30 Minuten wird der Ring entfernt und nicht angeheftete Zellen werden fortgewaschen. Eine zweite Schicht Kollagen und eine Schicht Wachstumsmedium (5% Neugeborenen-Kälberserum (NCS)), verfestigt durch 0,75% Agar mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC BioProducts, Rockland), werden zugegeben. Auf beiden Seiten des Zellflecks wird in einem Abstand von 4 mm ein Napf (3 mm Durchmesser) durch alle Schichten gestanzt und Medien, die ein Hybrid-VEGF-Polypeptid enthalten (oder Medien allein oder Medien, die VEGF-A oder VEGF-C enthalten, um als Kontrolle zu dienen) werden täglich in die Näpfe pipettiert. Mikrofotografien der von dem Fleckenrand fortwandernden Zellen werden z.B. nach sechs Tagen durch ein Olympus-CK2-Inversmikroskop, das mit einer Phasenkontrastoptik ausgestattet ist, angefertigt. Die migrierenden Zellen werden nach Kernfärbung mit dem fluoreszierenden Farbstoff Bisbenzimid (1 mg/ml, Hoechst 33258, Sigma) gezählt.
Die Zahl von Zellen, die in verschiedenen Abständen von der ursprünglichen Anheftungsstelle zu Näpfen wandern, die durch die nicht-transfizierten (Kontrolle) oder transfizierten ("mock"; Hybrid; VEGF-C; oder VEGF-A) Zellen konditionierte Medien enthalten, werden 6 Tage nach Zugabe der Medien bestimmt. Die Zahl von Zellen, die aus dem ursprünglichen Anheftungsring herauswanderten, werden in fünf angrenzenden Quadraten von 0,5 mm × 0,5 mm unter Verwendung eines Mikroskopokularlinsenrasters und 10x Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Zellen, die weiter als 0,5 mm wanderten, werden in gleicher Weise gezählt, indem das Raster in 0,5-mm-Schritten versetzt wird.
Die Fähigkeit eines Hybridpolypeptids, die Migration von BCE-Zellen zu induzieren, zeigt eine Rezeptoragonistenaktivität an. Die Zahl von in Anwesenheit eines Hybridproteins migrierenden Zellen im Vergleich zu einer gleiche Konzentration von VEGF-A oder VEGF-C gibt einen Hinweis auf die Stärke der Agonistenaktivität. Polypeptide, von denen gezeigt wurde, dass sie die auf BCE-Zellen exprimierten Rezeptoren binden, jedoch unfähig sind, die Migration zu stimulieren, werden als potentielle Inhibitoren gewertet. Eine hemmende Aktivität kann ferner getestet werden durch Mischen eines bekannten Rezeptoragonisten wie beispielsweise rekombinantem VEGF-A oder VEGF- C mit entweder Medium allein oder mit konzentrierten konditionierten Medien, um festzustellen, ob die konzentrierten konditionierten Medien die VEGF-A-vermittelte oder VEGF-C-vermittelte BCE-Migration hemmen.
Beispiel 8
Analyse der Fähigkeit von Hybridproteinen, die Gefäßpermeabilität zu induzieren
Sowohl VEGF-A als auch VEGF-C sind in der Lage, die Permeabilität von Blutgefäßen zu erhöhen. Die Hybridproteine werden getestet, um festzustellen, welche dieser Proteine diese biologische Aktivität besitzen und welche sie hemmen. Zum Beispiel werden Gefäßpermeabilitätstests gemäß Miles und Miles, J. Physiol 118: 228–257 (1952), verwendet, um die Hybridproteine zu analysieren. Kurz gesagt, wird Tieren, beispielsweise Meerschweinchen, im Anschluss an die intravenöse Injektion eines Vitalfarbstoffes, wie beispielsweise Pontamin-Himmelblau, intradermal eine das zu untersuchende Kandidaten-Hybridprotein enthaltende Zusammensetzung injiziert. Für Kontrollen werden in gleicher Weise Medien allein oder VEGF-A oder VEGF-C enthaltende Medien indiziert. Nach einer Zeitdauer wird die Ansammlung von Farbstoff an der Injektionsstelle auf der Haut gemessen. Jene Hybridproteine, die die Permeabilität erhöhen, werden im Vergleich zu jenen Hybridproteinen, die die Gefäßpermeabilität nicht induzieren, zu einer größeren Ansammlung von Farbstoff an der Injektionsstelle führen.
In einer Variante dieses Tests werden Hybridpolypeptide, von denen angenommen wird, Inhibitoren von VEGF-A oder VEGF-C zu sein, zunächst mit VEGF-A oder VEGF-C in verschiedenen Verhältnissen (z.B. 50:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10) gemischt und die Mischungen werden intradermal in die Tiere injiziert. Auf diese Weise wird die Fähigkeit der Hybridpolypeptide, die VEGF-A-vermittelte oder VEGF-C-vermittelte Gefäßpermeabilität zu hemmen, getestet.
Beispiel 9
Endothelzellproliferationstest
Die mitogene Aktivität von Hybridproteinen kann untersucht werden unter Verwendung von Endothelzellproliferationstests, wie sie beispielsweise in Breier et al., Dev 114: 521–532 (1992), hier durch Inbezugnahme vollständig aufgenommen, beschrieben sind. Die Hybridproteine werden in einer Säugetierzelllinie, z.B. COS-Zellen, exprimiert. Kulturüberstände werden dann gesammelt und auf mitogene Wirkung auf Rinderaortaendothel(BAE)-Zellen untersucht, indem die Überstände zu den BAE-Zellen zugegeben werden. Nach drei Tagen werden die Zellen mit Trypsin dissoziiert und unter Verwendung eines Zytometers gezählt, um jede Wirkung des Hybridproteins auf die proliferative Aktivität der BAE-Zellen festzustellen. Als Negativkontrollen können mit 10% FCS versetztes DMEM und die konditionierten Medien von untransfizierten COS-Zellen oder von mit Vektor allein transfizierten COS-Zellen verwendet werden. Überstände von mit Konstrukten transfizierten Zellen, die Proteine exprimieren, von denen gezeigt wurde, dass sie die Proliferation von BAE-Zellen induzieren (z.B. VEGF-A) können als Positivkontrolle verwendet werden.
Beispiel 10
Untersuchung der Fähigkeit von durch den menschlichen K14-Keratinpromotor exprimierten Hybridproteinen, das Wachstum von Lymphgefäßen in Haut von transgenen Mäusen zu induzieren
Es wurden Versuche in transgenen Mäusen durchgeführt, um die spezifischen Wirkungen der Überexpression von Hybridproteinen in Geweben zu analysieren. Die physiologischen Wirkungen in vivo geben einen Hinweis auf das Rezeptoraktivierungs-/hemmungsprofil und einen Hinweis auf die potentielle therapeutische Wirkung eines Hybridproteins. In einer Variante wird der menschliche K14-Keratinpromotor, der in den Basalzellen von stratifizierten Plattenepithelien aktiv ist [Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 1563–1567 (1989)], als Expressionskontrollelement in dem rekombinanten Hybridprotein-Transgen verwendet. Der den K14-Promotor enthaltende Vektor ist in Vassar et al., Genes Dev, 5: 714–727 (1991) und Nelson et al., J. Cell Biol. 97: 244–251 (1983) beschrieben.
Ein den K14-Promotor, die Hybridprotein-cDNA und das K14-Polyadenylierungssignal enthaltendes DNA-Fragment wird synthetisiert, isoliert und in fertilisierte Oozyten des FVB-NIH-Mausstammes injiziert. Die injizierten Zygoten werden in Ovidukte scheinschwangerer C57BL/6 × DBA/2J-Hybridmäuse transplantiert. Die resultierenden Gründermäuse werden anschließend durch Polymerasekettenreaktion von "Tail"-DNA unter Verwendung geeigneter Primer oder durch Southern-Analyse auf Anwesenheit des Transgens untersucht.
Diese transgenen Mausen werden dann hinsichtlich Hinweisen auf Angiogenese oder Lymphangiogenese in der Haut, wie beispielsweise die Lymphangiogenese, die bei transgenen Mausen beobachtet wird, die VEGF-C überexprimieren [siehe internationale Publikation WO 98/33917 ], untersucht. Die histologische Untersuchung transgener K14-VEGF-C-Mäuse zeigte, dass die dorsale Dermis im Vergleich zu der Haut von Wildtyp-Wurfgefährten atrophisch war und Bindegewebe durch große Lakunen ersetzt wurde, denen rote Blutzellen fehlten, die jedoch mit einer dünnen Endothelschicht ausgekleidet waren. Diese vergrößerten gefäßartigen Strukturen ähnelten jenen, die bei menschlichen Lymphangiomen beobachtet werden. Die Zahl von Hautanhangsorganen und Haarfollikeln war reduziert. In der Schnauzenregion wurde ebenfalls eine erhöhte Anzahl von Gefäßen beobachtet.
Die Untersuchung der Gefäße in der Haut von transgenen Mäusen unter Verwendung von Antikörpern, die Proteine erkennen, die entweder für Blut- oder Lymphgefäße spezifisch sind, kann darüber hinaus die Identität dieser Gefäße verifizieren. Die Kollagentypen IV, XVIII [Muragaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8763–8776 (1995)] und Laminin werden in Gefäßendothelzellen exprimiert, während die Desmoplakine I und II (erogen) in lymphatischen Endothelzellen exprimiert werden. Siehe Schmelz et al., Differentiation 57: 97–117 (1994).
Beispiel 11
Analyse von Hybridproteinen bei der Förderung oder Hemmung der Myelopoese
Die Überexpression von VEGF-C in der Haut von transgenen K14-VEGF-C Mausen korreliert mit einer bestimmten Veränderung in den Leukozytenpopulationen [siehe die internationale Veröffentlichung WO 98/33917 ]. Namentlich waren die gemessenen Populationen von Neutrophilen bei transgenen Mausen merklich erhöht. Diese Effekte der Hybridproteine auf die Hämatopoese können unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierungsanalyse unter Verwendung von Antikörpern, die Proteine erkennen, die auf bestimmten Leukozytenzellpopulationen exprimiert werden, analysiert werden. Leukozytenpopulationen werden in Blutproben analysiert, die von in Beispiel 13 be schriebenen transgenen F1-Mäusen und von ihren nicht-transgenen Wurfgenossen genommen wurden.
Beispiel 12
Wirkungen von Hybridproteinen auf Wachstum und Differenzierung menschlicher CD34⁺-Vorläuferzellen in vitro
Die Zugabe von VEGF-C zu Kulturen von Nabelschnurblut-CD34⁺-Zellen induziert die Zellproliferation. Kokulturen von GM-CSF, IL-3, GM-CSF + IL-3 oder GM-CSF + SCF mit VEGF-C führt zu einem Anstieg der Anteile von myeloiden Zellen [siehe die internationale Veröffentlichung WO 98/33917 ]. Erfindungsgemäße Hybridproteine können auch auf ihre Fähigkeit untersucht werden, das Wachstum von CD34⁺-Vorläuferzellen in vitro zu induzieren. Menschliche CD34⁺-Vorläuferzellen (HPC, 10 × 10³) werden aus Knochenmark oder Nabelschnurblut-Mononuklearzellen unter Verwendung des MACS-CD34-Vorläuferzell-Isolierungskits (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) nach Anweisung des Herstellers isoliert und in RPMI-1640-Medium, versetzt mit L-Glutamin (2,5 mM), Penicillin (125 IE/ml), Streptomycin (125 µg/ml) und gepooltem 10% umbilikalen Nabelschnurblut(CB)-Plasma bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre in Anwesenheit von 5% CO₂ für sieben Tage mit oder ohne Hybridprotein bei Konzentrationen im Bereich von 10 ng/ml bis 1 µg/ml inkubiert. Nach sieben Tagen wurde die Gesamtzellzahl in jeder Kultur ermittelt.
Die kostimulatorische Wirkung von Hybridproteinen in Kulturen, die entweder mit rekombinantem menschlichen Stammzellfaktor (rhSCF, 20 ng/ml PreproTech, Rocky Hill, NY) allein oder einer Kombination aus Granulozyten-Makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (rhGM-CSF, 100 ng/ml, Sandoz, Basel, Schweiz) plus SCF 11 versetzt wurden, kann ebenfalls unter sucht werden. Es können auch Experimente durchgeführt werden, um die kostimulatorischen Wirkungen von Hybridprotein auf den Gesamtzellertrag von serumfreien Kulturen von CB-CD34⁺-HPC-Zellen zu analysieren, die entweder mit GM-CSF allein, IL-3 (rhIL-3, 100 U/ml, Behring AG, Marburg, Deutschland) allein; oder einer Kombination aus GM-CSF plus IL-3 versetzt wurden.
Zellen von den oben beschriebenen (7-Tages-)plasmaergänzten Kulturen werden auch auf die Expression des frühen Granulomonozytenmarkermoleküls Lysozym (LZ) und Myeloperoxidase (MPO) sowie den Lipopolysaccharid(LPS)-Rezeptor CD14 unter Verwendung von Immunfluoreszenz untersucht.
In einer anderen Reihe von Experimenten wurden CD34⁺-Zellen in Medium, versetzt mit 50 ng/ml M-CSF, mit oder ohne 100 ng/ml Hybridprotein für sieben Tage kultiviert. Nach sieben Tagen wurden die Kulturen analysiert, um den prozentualen Anteil von CD14⁺-Zellen und die mittlere Fluoreszenzintensität zu bestimmen.
Beispiel 13
Analyse von Hybridproteinen unter Verwendung von CAM-Tests
Der in Oh et al., Dev Biol 188: 96–109 (1997) beschriebene Chorioallantoismembran(CAM)-Test ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Untersuchung der In-vivo-Wirkungen angiogener Faktoren. Unter Verwendung dieses Tests hat sich gezeigt, dass VEGF-Wachstumsfaktoren, einschließlich sowohl VEGF-A als auch VEGF-C, die Entwicklung von Blutgefäßen induzieren [Oh et al., Dev Biol 188: 96–109 (1997)]. Dieses Verfahren kann daher verwendet werden, um die angiogenen Eigenschaften der Hybridproteine zu studieren.
Kurz gesagt wird an Tag 4 der Entwicklung ein Fenster in die Eischale von Hühnern oder in Wachteleier geschnitten. Die Embryonen werden auf normale Entwicklung geprüft, das Fenster in der Eischale wird mit Klebeband verschlossen und die Eier werden bis Tag 13 der Entwicklung inkubiert. Ungefähr 3,3 µg Hybridprotein, gelöst in 5 µl destilliertem Wasser, werden zu Thermanox-Deckgläschen (Nunc, Naperville, IL) gegeben, die in Scheiben mit einem Durchmesser von ungefähr 5 mm geschnitten wurden, und luftgetrocknet. Scheiben ohne zugegebenes Protein werden als Kontrolle verwendet. Die getrockneten Scheiben werden dann auf die Chorioallantoismembran (CAM) der Eier aufgebracht. Nach 3 Tagen werden die Scheiben entfernt und in 3% Glutaraldehyd und 2% Formaldehyd fixiert und in 0,12 M Natriumkakodylat-Puffer gespült. Die fixierten Proben werden fotografiert und für Semi(0,75-µm)- und Ultradünn(70-nm)-Schnitte in Eponharz (Serva, Deutschland) eingebettet. Sowohl Semi- als auch Ultradünnschnitte werden unter Verwendung eines Ultracut S (Leika, Deutschland) geschnitten. Ultradünnschnitte werden durch ein EM in 10 (Zeiss, Deutschland) analysiert. Die Proben werden dann auf Hinweise von Wachstum neuer Kapillaren untersucht, was darauf hindeuten würde, dass das untersuchte Hybridprotein in der Lage ist, die Angiogenese zu stimulieren.
Beispiel 14
Analyse der Homo- oder Heterodimerisierung der VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine
Die Aktivierung von Tyrosin-Rezeptoren wird häufig durch Liganden-induzierte Rezeptordimerisierung vermittelt. Die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen VEGF und VEGFR-2 deutet darauf hin, dass die Rezeptordimerisierung mittels Ligandendimerisierung erzielt wird, indem beide Rezeptoren ei nen Teil von jedem der zwei Ligandenproteine binden, die das Homo- oder Heterodimer ausmachen. Mutanten-VEGF-Proteine, die an VEGFR-2 binden können, aber nicht dimerisieren können, können den Rezeptor nicht aktivieren [Fuh et al., J Biol Clin 273: 11197–11204 (1998)]. Alle VEGF-Familienmitglieder sind zur Homo- und/oder Heterodimerisierung befähigt. VEGF-A und VEGF-C bilden keine Heterodimere miteinander. Einige der VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine können jedoch miteinander oder mit einem oder beiden Stammmolekülen dimerisieren. Die Hybridproteine können auch zur Homodimerisierung befähigt sein. Die folgenden Protokolle sind dazu ausgelegt, die Dimerisierungsfähigkeiten der Hybridproteine zu identifizieren. Ein Kandidaten-Hybridprotein wird mit einem anderen Hybridprotein oder einem der Stammmoleküle in einer Zellinie, z.B. 293T- oder S9-Zellen, koexprimiert. Extrakte von diesen Zellen werden hergestellt und unter Verwendung eines Antikörpers, der nur eines der beiden untersuchten Proteine erkennt, für die Immunpräzipitation verwendet. Die immunpräzipitierten Proteine werden dann einer SDS-PAGE unterzogen und analysiert. Wenn beide Proteine in dem Gel detektiert werden, trat eine Heterodimerisierung zwischen den beiden untersuchten Proteinen auf. Wenn auf der anderen Seite lediglich das Protein detektiert wird, das durch den Antikörper erkannt wird, der bei der Immunpräzipitation verwendet wurde, trat keine Dimerisierung zwischen den beiden Proteinen auf. Da die Dimerisierung für die Rezeptoraktivierung kritisch zu sein scheint, wird von Hybridproteinen, die den Rezeptor binden, jedoch nicht mit Selbst- oder mit natürlichen VEGF-Wachstumsfaktoren, die endogen von den Zellen exprimiert werden, dimerisieren, erwartet, dass sie Inhibitoren der endogenen Gefäßendothelwachstumsfaktoraktivität sind.
Heterodimere, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit anderen erfindungsgemäßen Polypeptiden oder mit natürlich vorkommenden Mitgliedern der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren umfassen, können im wesentlichen wie in Cao et al., J. Biol. Chem., 271: 3154–62 (1996) beschrieben erzeugt werden. Kurz gesagt, wird ein rekombinant hergestelltes Hybridpolypeptid in einem äquimolaren Verhältnis mit einem anderen rekombinant hergestellten interessierenden Polypeptid, wie beispielsweise einem VEGF-A-, VEGF-B-, VEGF-C-, VEGF-D-, PlGF-, PDGFα-, PDGFβ- oder c-fos-induzierten Wachstumsfaktor-Polypeptid gemischt. (Siehe z.B. Collins et al., Nature, 316: 748–750 (1985) (PDGF-β, GenBank Zugr.-Nr. X02811); Claesson-Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (13): 4917–4921 (1989) (PDGF-α, GenBank Zugr.-Nr. M22734); Claesson-Welsh et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3476–3486 (1988) (PDGF-β, GenBank Zugr.-Nr. M21616); Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 93: 2576–2581 (1996) (VEGF-β, GenBank Zugr.-Nr. U48801); Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci, (USA), 88(20):9267–9271 (1996) (PlGF, GenBank Zugr.-Nr. X54936); Heldin et al., Growth Factors, 8: 245–252 (1993); Folkman, Nature Med., 1: 27–31 (1995); Friesel et al., FASEB J, 9: 919–25 (1995); Mustonen et al., J. Cell. Biol., 129: 895–98 (1995); Orlandini, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(21): 11675–11680 (1996); und andere andernorts hier zitierte. Die gemischten Polypeptide werden in Gegenwart von Guanidin-HCl und DTT inkubiert. Die Thiolgruppen werden dann mittels S-Sulfonierung geschützt, und das Protein wird über Nacht dialysiert, anfangs gegen Harnstoff/Glutathion-SH, Glutathion-S-S-Glutathion und anschließend gegen 20 mM Tris-HCl.
Die Heterodimere werden gescreent, um deren Bindungsaffinität hinsichtlich Rezeptoren der VEGF/PDGF-Familie (insbesondere VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3) und deren Fähigkeit, die Rezep toren zu stimulieren, zu bestimmen (z.B. die Untersuchung auf Dimer-stimulierte Rezeptorphosphorylierung in Zellen, die den interessierenden Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren). Die Bindungstests können kompetitive Bindungstests sein, wie beispielsweise jene, die hier und im Stand der Technik beschrieben sind. In den anfänglichen Bindungstests sind rekombinant hergestellte Proteine einsetzbar, die die extrazellulären Domänen von Rezeptoren umfassen, wie in vorstehenden Beispielen für VEGFR-2 und VEGFR-3 beschrieben. Heterodimere, die Rezeptoren binden und stimulieren, sind als rekombinante Wachstumsfaktorpolypeptide nützlich. Heterodimere, die Rezeptoren binden, jedoch nicht stimulieren, sind als Wachstumsfaktorantagonisten nützlich. Heterodimere, die in den Screeningstests agonistische oder antagonistische Aktivitäten zeigen, werden unter Verwendung von z.B. Endothelzellmigrationstests, Gefäßpermeabilitätstests und In-vivo-Tests weiter gescreent. Es wird aus den vorstehenden Beispielen auch ersichtlich sein, dass Dimere, die zwei VEGF-C-Polypeptide (d.h. Dimere aus identischen VEGF-C-Polypeptiden sowie Dimere aus unterschiedlichen VEGF-C-Polypeptiden) umfassen, unter Einsatz derselben Tests vorteilhaft auf agonistische und antagonistische Aktivitäten gescreent werden können.
Beispiel 15
Bestimmung der biologischen Halbwertszeit der VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine
Die Kenntnis der biologischen Halbwertszeit einer Verbindung in vivo ist wertvoll für therapeutische Anwendungen. Obwohl die biologische Halbwertszeit der Hybridproteine nicht in vivo bestimmt wurde, deuten vorläufige Ergebnisse in vitro darauf hin, dass die oben beschriebenen VEGF-A/VEGF-C-Hybridproteine verschiedene Halbwertszeiten aufweisen. Die Inkuba tion von bestimmte Hybridproteine enthaltenden Zellüberständen bei 4°C für ungefähr zwei Monate ergibt für die verschiedenen Hybridproteine unterschiedliche Proteinstabilitäten. Die Untersuchung der biologischen In-vivo-Halbwertszeit kann durch Injektion von Iod-markiertem Hybridprotein in Tiere festgestellt werden. Kurz gesagt werden 50 µg Hybridprotein unter Verwendung von IODO-GEN (Pierce) nach Anweisungen des Herstellers zu einer spezifischen Radioaktivität von ungefähr 2–10 µCi/µg Protein iodiert. Die iodierten Proteine werden unter Verwendung von PD-10 Sephadex (Pharmacia) nach Herstelleranweisungen gereinigt. 12–16 Wochen alte Mäuse (Gewicht 20–25 g) werden im Verlaufe des Experiments mit Natriumpentobarbital (1 mg/20 g Mauskörpergewicht) anästhesiert. 5–10 pmol des radiomarkierten Proteins, verdünnt in 100 µl steriler Salzlösung, werden über 30 Sekunden in die Schwanzvenen injiziert. Zu bestimmten Zeitpunkten (1 min, 2 min, 4 min, 8 min, 15 min, 30 min, 60 min und 120 min) werden 41–50 µl Blut durch periorbitale Blutung oder aus der Schwanzarterie entnommen. 25 µl der Plasmafraktion jeder Blutprobe werden dann auf Whatman-Filterpapier getüpfelt, mit 10% Trichloressigsäure (TCA) präzipitiert und mit Ethanol gespült. Die Menge in der Plasmafraktion vorhandenem radiomarkierten Proteins wird durch Quantifizierung der Radioaktivität unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt. Polypeptide, die im Vergleich zu den natürlich vorkommenden VEGFs eine verbesserte Halbwertszeit zeigen, sind eine bevorzugte Gattung erfindungsgemäßer Polypeptide. Polypeptide, die 25%, 50%, 75% oder 100% Verbesserung der Halbwertszeit gegenüber den natürlich vorkommenden VEGF-C zeigen, sind besonders bevorzugt.
Beispiel 16
Konstruktion von Hybridmolekülen unter Verwendung anderer Proteine der VEGF-oder PDGF-Familie
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren kann erweitert werden, um Hybridmoleküle unter Verwendung von jedem der PDGF/VEGF-Wachstumsfaktoren zu erzeugen. Mitglieder der PDGF/VEGF-Familie, die zumindest VEGF-A (SEQ ID NO: 1 und 2), PlGF (SEQ ID NO: 114 und 115), VEGF-B (SEQ ID NO: 116 und 117), VEGF-C (SEQ ID NO: 21 und 22), VEGF-D (SEQ ID NO: 118 und 119), VEGF-D (SEQ ID NO: 120 und 121) und NZ2-VEGF (SEQ ID NO: 122 und 123), D1701-VEGF (SEQ ID NO: 150 und 151); NZ10-VEGF [beschrieben in SEQ ID NO: 11 der internationalen Patentanmeldung PCT/US99/25869 , PDGF-A (SEQ ID NO: 124 und 125), PDGF-B (SEQ ID NO: 126 und 127) und Fallotein (SEQ ID NO: 148 und 149) umfassen, teilen genügend Homologie innerhalb der rezeptorbindenden Domäne miteinander, um die Konstruktion von Oligonukleotiden mit einzigartigen kohäsiven Enden, wie in Beispiel 1 hinsichtlich VEGF-A und VEGF-C gelehrt, zu ermöglichen. Wie durch die erfolgreichen Ergebnisse in den Beispielen 1–3 gezeigt, reichen Oligonukleotide, die dahingehend konstruiert wurden, doppelsträngige Fragmente mit kohäsiven Enden bereitzustellen, die eine Länge von nur 3–6 Basen aufweisen, aus, um eine erfolgreiche Rekombination zu neuen Hybridmolekülen (mit sehr wenigen unbeabsichtigten Mutationen) zu erlauben.
Obwohl die Anwesenheit von kohäsiven Enden die Ligierung von Fragmenten in einer gewünschten Reihenfolge und Orientierung stark erleichterte, wird es ersichtlich sein, dass die Ligierung von Fragmenten auch ohne kohäsive Enden erreicht werden kann. Stumpfendige Fragmente können ebenfalls synthetisiert und aneinander gelagert werden, um unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens Hybridproteine zu erzeugen. Mit einer Stumpfendstrategie müssen die Nukleotidsequenzen der Stammmoleküle nicht auf Anwesenheit von Nukleotididentität untersucht werden, um die Erzeugung von kohäsiven Enden zu ermöglichen. Ein zusätzliches Screening nach der Ligierung kann jedoch erforderlich sein, um Hybride zu identifizieren, die Fragmente in der gewünschten Ordnung und Orientierung enthalten.
Unter Anwendung solcher Richtlinien werden Oligonukleotidpaare wie in Beispiel 1 beschrieben konstruiert und aneinandergelagert, um DNA-Fragmente des Rezeptors für die Bindungsdomäne von zwei oder mehr VEGF-Proteinen bereitzustellen. Die kombinatorische Ligation der verschiedenen DNA-Fragmente erzeugt neue Hybridpolypeptide, die auf Rezeptorbindung und auf biologische Eigenschaften wie beispielsweise die Fähigkeit, Endothelzellwachstum und -migration zu stimulieren oder zu hemmen und die Gefäßpermeabilität zu modulieren, gescreent werden.
Beispiel 17
Erzeugung von Hybridmolekülen unter Verwendung von PCR-gestütztem DNA-Shuffling
Das folgende Protokoll stellt eine alternative "DNA-Shuffling"-Methodik zur Erzeugung hybrider Gefäßendothelwachstumsfaktor-kodierender Polynukleotide und Polypeptide bereit. DNA-Shuffling-Verfahren sind in der Literatur für Enzyme wie beispielsweise Antibiotikaresistenz vermittelnde Proteine und einige wenige andere Proteinfamilien beschrieben worden [siehe Chang et al., Nature Biotechnology, 17: 793–797 (1999); Kikuchi et al., Gene, 236: 159–167 (1999); Harayama et al., TIBTECH, 16: 76–82 (1998); Crameri et al., Nature, 391: 288–291 (1998); Patten et al., Curr. Opin. Biotechnology, 8: 724–733 (1997); Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504–09 (1997); Stemmer, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 91: 10747–1074 (1994); und Stemmer, Nature, 370: 389–391 (1994), alle vollständig durch Inbezugnahme hier aufgenommen].
Zwei oder mehrere cDNAs, die Gefäßendothelwachstumsfaktor-Polypeptide kodieren, werden zunächst kloniert und amplifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nur jene Bereiche der cDNAs, die mindestens VEGF-Rezeptor-Bindungsdomänen kodieren, und optional zusätzliche kleine 5'- und 3'-Sequenzen der cDNA kodieren, amplifiziert.
Die gereinigten und isolierten cDNAs werden unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen und/oder DNAseI zu Fragmenten von etwa 10–75 Basenpaaren verdaut, und die Fragmente dieses gewünschten Größenbereichs werden gereinigt und isoliert (zum Beispiel durch Agarosegelelektrophorese, Elektroelution und Ethanolpräzipitation).
Die gereinigten und isolierten Fragmente von den zwei oder mehr VEGFs werden gemischt und einer "Selfpriming"-Polymerasekettenreaktion unterzogen, um die Fragmente durcheinanderzumischen, um neue Hybridmoleküle zu bilden. Beispielhafte PCR-Protokolle sind in Kilcuchi et al. (1999) und Stemmer (1994) dargestellt. Die Anlagerungstemperaturen in den PCR-Reaktionen wird auf Grundlage des Ausmaßes der Sequenzidentität zwischen den ursprünglichen cDNAs eingestellt, um sicherzustellen, dass die Anlagerung von heterologen Sequenzen, die unvollständige Passungen enthalten, möglich ist. Nach Durchführung von 22–50 PCR-Zyklen ohne Primer, wird eine Teilmenge der PCR-Reaktion ausgewählt und als Matrize für die zweite PCR-Runde mit Primern auf Basis von 5'- und 3'-Sequenzen der ursprünglichen cDNAs verwendet. Vorzugsweise enthalten die Primer auch Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen, um die Klonierung der in der zweiten Runde erhaltenen PCR-Produkte in einen Expressionsvektor zu erleichtern.
Die erhaltenen Klone werden in einen Expressionsvektor ligiert und in Wirtszellen transformiert oder transfiziert, um die dadurch kodierten neuen Hybrid-VEGF-Polypeptide (falls vorhanden) zu exprimieren. Die Proteine werden unter Verwendung von Rezeptorbindungs- und/oder -aktivitätstests wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben gescreent, um jene Klone auszuwählen, die Polypeptide kodieren, die gewünschte Rezeptoragonisten-/Antagonistenprofile aufweisen.
Index für das Sequenzprotokoll
SEQ ID NO: 1 & 2 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von VEGF-A
SEQ ID NO: 3–11 sind VEGF-A-Vorwärtsprimer
SEQ ID NO: 12–20 sind VEGF-A-Rückwärtsprimer
SEQ ID NO: 21 & 22 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von VEGF-C
SEQ ID NO: 23–31 sind VEGF-C-Vorwärtsprimer
SEQ ID NO: 32–40 sind VEGF-C Rückwärtsprimer
SEQ ID NO: 41 ist die Nukleotidsequenz von pSecTagI
SEQ ID NO: 42 & 43 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 11-1. Die VEGF-Rezeptorbindungsdomäne (abgeleitet von VEGF-A und VEGF-C) entspricht den Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 43.
SEQ ID NO: 44 & 45 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 11-16 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 45).
SEQ ID NO: 46 & 47 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 22-1 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 47)
SEQ ID NO: 48 & 49 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 22-16 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 49)
SEQ ID NO: 50-51 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klone 12-1 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 51)
SEQ ID NO: 52-53 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-2 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 53)
SEQ ID NO: 54–55 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-3 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 55)
SEQ ID NO: 56–57 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-4 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 57)
SEQ ID NO: 58–59 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-5 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ TD NO: 59)
SEQ ID NO: 60–61 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-6 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 61)
SEQ ID NO: 62–63 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-7 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 63)
SEQ ID NO: 64–65 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-8 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 65)
SEQ ID NO: 66–67 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-9 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 67)
SEQ ID NO: 68–69 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-10 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 104 von SEQ ID NO: 69)
SEQ ID NO: 70–71 sind die Nukleotide und Aminosäuresequenzen von Klon 12-11 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 71)
SEQ ID NO: 72–73 sind die Nukleotid und Aminosäuresequenzen von Klon 12-12 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 73)
SEQ ID NO: 74–75 sind die Nukleotide und Aminosäuresequenzen von Klon 12-13 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 75)
SEQ ID NO: 76–77 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-14 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 77)
SEQ ID NO: 78–79 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-15 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 79)
SEQ ID NO: 80–81 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 12-16 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–54 von SEQ ID NO: 81)
SEQ ID NO: 82–83 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-1 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 83)
SEQ ID NO: 84–85 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-2 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 85)
SEQ ID NO: 86–87 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-3 (VEGF Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 87)
SEQ ID NO: 88–89 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-4 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 89)
SEQ ID NO: 90–91 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-5 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 91)
SEQ ID NO: 92–93 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-6 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 93)
SEQ ID NO: 94–95 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-7 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 95)
SEQ ID NO: 96–97 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-8 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 97)
SEQ ID NO: 98–99 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-9 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 99)
SEQ ID NO: 100–101 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-10 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 101)
SEQ ID NO: 102–103 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-11 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 103)
SEQ ID NO: 104–105 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-12 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 105)
SEQ ID NO: 106–107 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-13 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 107)
SBQ ID NO: 10S-109 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-14 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 109)
SEQ ID NO: 110–111 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-15 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 111)
SEQ ID NO: 112–113 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 31-16 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 113)
SEQ ID NO: 114 & 115 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von PlGF
SEQ ID NO: 116 & 117 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von VEGF-B
SEQ ID NO: 118 & 119 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von VEGF-D
SEQ ID NO: 120 & 121 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von VEGF-E
SEQ ID NO: 122 & 123 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von NZ2-VEGF
SEQ ID NO: 124 & 125 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von PDGF-A
SEQ ID NO: 126 & 127 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von PDGF-B
SEQ ID NO: 128–136 sind die Aminosäuresequenzen der Fragmente A1–A9
SEQ ID NO: 137–145 sind die Aminosäuresequenzen der Fragmente C1–C9
SEQ ID NO: 146 & 147 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der 232-Aminosäure-Isoform von VEGF-A
SEQ ID NO: 148 & 149 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Fallotein
SEQ ID NO: 150 & 151 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen D1701-VEGF
SEQ ID NO: 152 & 153 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 14-9 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 153)
SEQ ID NO: 154 & 155 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 23-10 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 155)
SEQ ID NO: 156 & 157 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 32-14 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1-105 von SEQ ID NO: 157)
SEQ ID NO: 158 & 159 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 52-15 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–105 von SEQ ID NO: 159)
SEQ ID NO: 160 & 161 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 53-3 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–103 von SEQ ID NO: 161)
SEQ ID NO: 162 & 163 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 82-7 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–102 von SEQ ID NO: 163)
SEQ ID NO: 164 & 165 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 82-9 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 165)
SEQ ID NO: 166 & 167 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 82-11 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 167)
SEQ ID NO: 168 & 169 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 82-13 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 169)
SEQ ID NO: 170 & 171 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 83-15 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1-104 von SEQ ID NO: 171)
SEQ ID NO: 172 & 173 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 84-9 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1-104 von SEQ ID NO: 173)
SEQ JOD NO: 174 & 175 sind die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Klon 84-11 (VEGF-Rezeptorbindungsdomäne = Aminosäuren 1–104 von SEQ ID NO: 175)
SEQ ID NO: 176–1199 sind oben in Beispiel 1 in Tabelle 2.5 verzeichnet
SEQ ID NO: 1200 is die Sequenzformel P-[PS]-C-V-X(3)-R-C-[GSTA]-G-C-C
SEQ ID NO: 1201 ist die Sequenzformel C-X(22-24)-P-[PSR]-C-V-X(3)-R-C-[GSTA]-G-C-C-X(6)-C-X(32-41)-C
SEQ ID NO: 1202 ist die Sequenzformel C-X(18-28)-P-X-C-X(4)-R-C-X-G-C(1-2)-X(6-12)-C-X(30-46)-C
SEQ ID NO: 1203 ist die Sequenzformel C-X(22-24)-P-[PSR]-C-V-X(3)-R-C-X-G-C-C-X(6)-C-X(32-41)-C
SEQ ID NO: 1204 ist die Sequenzformel TNTFxxxP
SEQ ID NO: 1205 ist die Sequenzformel EFGVATNTFFKPPCVSVYRCG
SEQ ID NO: 1206 ist die Sequenzformel TNTFFKPP
SEQ ID NO: 1207 ist die Sequenzformel TNTFFKPPCVxxxR
SEQ ID NO: 1208 ist die Sequenzformel TNTFFKPPCVxxxRCGGCC
SEQ ID NO: 1209 ist eine Sequenz einer VEGF-Region, die an der VEGFR-1-Binding beteiligt ist
SEQ ID NO: 1210 ist eine Sequenz einer VEGF-C-Region, die an der VEGFR-3-Binding beteiligt ist
SEQ ID NO: 1211 ist die Sequenzformel IEYIxxxS
SEQ ID NO: 1212 ist die Sequenzformel TNTFXnP SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 95 % identisch mit den Aminosäuren 1–102 – wie in SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:63 oder SEQ ID NO:163 dargelegt – ist, wobei das Polypeptid an mindestens einen Rezeptor bindet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanem VEGFR-1, humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 95 % identisch mit den Aminosäuren 1–104 – wie in SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:173 oder SEQ ID NO:175 dargelegt – ist, wobei das Polypeptid an mindestens einen Rezeptor bindet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanem VEGFR-1, humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 95 % identisch mit den Aminosäuren 1–105 – wie in SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157 oder SEQ ID NO:159 dargelegt – ist, wobei das Polypeptid an genau einen Rezeptor bindet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanem VEGFR-1, humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 95 % identisch mit den Aminosäuren 1–103 – wie in SEQ ID NO:161 dargelegt – ist, wobei das Polypeptid an den humanen VEGFR-1, humanen VEGFR-2 und humanen VEGFR-3 bindet.
Hybrid-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 95 % identisch mit dem Expressionsprodukt des Klons Nummer 11.9 (SEQ ID NO:433), 11.13 (SEQ ID NO:945), 12.16 (SEQ ID NO:1185), 13.9 (SEQ ID NO:465), 13.11 (SEQ ID NO:529), 13.13 (SEQ ID NO:977), 13.15 (SEQ ID NO:1041), 14.1 (SEQ ID NO:193), 14.5 (SEQ ID NO:705), 14.7 (SEQ ID NO:769), 22.3 (SEQ ID NO:303), 22.4 (SEQ ID NO:431), 23.12 (SEQ ID NO:671), 23.14 (SEQ ID NO:1119), 32.9 (SEQ ID NO:485), 32.11 (SEQ ID NO:549), 32.15 (SEQ ID NO:1061), 32.16 (SEQ ID NO:1189), 33.1 (SEQ ID NO:213), 33.3 (SEQ ID NO:277), 33.9 (SEQ ID NO:469), 43.1 (SEQ ID NO:219), 52.9 (SEQ ID NO:487), 52.11 (SEQ ID NO:551), 52.14 (SEQ ID NO: 1127), 53.1 (SEQ ID NO: 215), 53.7 (SEQ ID NO:791), 61.3 (SEQ ID NO:249), 62.1 (SEQ ID NO: 233), 62.8 (SEQ ID NO:937), 62.10 (SEQ ID NO:617), 62.13 (SEQ ID NO:1001), 63.3 (SEQ ID NO:281), 63.6 (SEQ ID NO:857), 73.7 (SEQ ID NO:797), 73.15 (SEQ ID NO:1053), 74.8 (SEQ ID NO:909), 74.10 (SEQ ID NO:589), 74.12 (SEQ ID NO:653), 81.9 (SEQ ID NO:435), 81.13 (SEQ ID NO:947), 82.5 (SEQ ID NO:739), 82.14 (SEQ ID NO:1123), 82.16 (SEQ ID NO:1187), 83.9 (SEQ ID NO:467), 83.13 (SEQ ID NO:979), 84.1 (SEQ ID NO:195) oder 84.5 (SEQ ID NO:707) ist, wobei das Polypeptid an genau einen Rezeptor bindet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanem VEGFR-1, humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3.
Polynukleotid, Vektor oder Wirtszelle, umfassend eine Nukleotidsequenz, kodierend für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–5.