BRPI0513826A2 - processo para expressão de proteìna melhorada através de engenharia de cepa - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para melhorar os níveis de produção de proteínas ou peptídeos recombinantes ou melhorar o nível de proteínas ou peptídeos recombinantes ativos expressos em células hospedeiras. A invenção é um processo de comparar dois perfis genéticos de uma célula que expressa uma proteína recombinante e modificar a célula para alterar a expressão de um produto de gene que é sobre-regulado em resposta à expressão da proteína recombinante. O processo pode melhorara produção de proteína ou pode melhorar a qualidade da proteína, por exemplo, aumentando a solubilidade de uma proteína recombinante.

Description

Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARAEXPRESSÃO DE PROTEÍNA MELHORADA ATRAVÉS DE ENGENHARIADE CEPA".

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido ProvisórioUS N° 60/591.489, depositado em 26 de julho de 2004.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de produção de proteína,e em particular é um processo para melhorar os níveis de produção de pro-teínas ou peptídeos recombinantes ou melhorar o nível de proteínas ou pep-tídeos recombinantes ativos expressos em células hospedeiras.

ANTECEDENTES

Mais que 155 proteínas e peptídeos recombinantementes produ-zidos foram aprovados pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) para ouso como fármacos e vacinas de biotecnologia, com outros 370 em experi-mentações clínicas. Diferente das terapêuticas de molécula pequena que sãoproduzidas através de síntese química, as proteínas e peptídeos são maiseficazmente produzidos em células vivas. Em muitos casos, a célula ou or-ganismo foi geneticamente modificado para produzir ou aumentar a produçãoda proteína.

Quando uma célula é modificada para produzir quantidadesgrandes de uma proteína alvo, a célula é colocada sob tensão e freqüente-mente reage induzindo ou suprimindo outras proteínas. A tensão que umacélula hospedeira sofre durante a produção de proteínas recombinantes podeaumentar a expressão, por exemplo, de proteínas específicas ou co-fatorespara causar degradação da proteína recombinante sobre-expressada. A ex-pressão aumentada de proteínas compensatórias pode ser contra-produtiva àmeta de expressar níveis altos de proteína recombinante ativa, de compri-mento total. Expressão diminuída ou carência de expressão adequada deoutras proteínas pode causar desdobramento e agregação da proteína re-combinante. Embora seja conhecido que uma célula sob tensão alterará seuperfil de expressão de proteína, não é conhecido em qualquer exemplo dadoque proteínas específicas serão sobre-reguladas ou sub-reguladas.

MICROARRANJOS

Tecnologia de microarranjo pode ser usada para identificar apresença e nível de expressão de um número grande de polinucleotídeos emum ensaio simples. Ver por exemplo patente U.S. N° 6.040.138, depositadaem 15 de setembro de 1995, patente U.S. N° 6.344.316, depositada em 25 dejunho de 1997, patente U.S. N° 6.261.776, depositada em 15 de abril de 1999,patente U.S. N° 6.403.957, depositada em 16 de outubro de 2000, patente U.S.N° 6.451.536, depositada em 27 de setembro de 2000, patente U.S. N°6.532.462, depositada em 27 de agosto de 2001, patente U.S. N° 6.551.784,depositada em 9 de maio de 2001, patente U.S. N° 6.420.108, depositada em9 de fevereiro de 1998, patente U.S. N° 6.410.229, depositada em 14 dedezembro de 1998, patente U.S. N° 6.576.424, depositada em 25 de janeirode 2001, patente U.S. N° 6.687.692, depositada em 2 de novembro de 2000,patente U.S. N° 6.600.031, depositada em 21 de abril de 1998 e patente U.S.N° 6.567.540, depositada em 16 de abril de 2001, todas atribuídas a Affyrne-trix, Inc.

Patente U.S. N° 6.607.885 de E. I. duPont de Nemours e Co.descreve métodos para perfilar e identificar as alterações de expressão degene após submeter uma célula bacteriana a expressão alterando as condi-ções mediante comparação de uma primeira e segunda medição de micro-arranjo.

Wei et al. usou uma análise de microarranjo para investigar perfisde expressão de gene de E. coli com indução de gene de lac (Wei Y., et al.(2001) High-density microarray-mediated gene expression profiling of Es-cherichia coli. J Bacteriol. 183(2):545-56). Outros grupos também investiga-ram os perfis transcripcionais regulados após mutação de genes endógenosou deleção de genes reguladores (Sabina, J., et al (2003) Interfering withDifferent Steps of Protein Synthesis Explored by Transcriptional Profiling ofEscherichia coli K-12 J Bacteriol. 185:6158-6170; Lee JH (2003) Globalanalyses of transcriptomes and proteomas of a parent strain and anL-threonine-overproducing mutant strain. J Bacteriol. 185(18):5442-51; KabirMM, et al. (2003) Gene expression pattems for metabolic pathway in pgiknockout Escherichia coli with and without phb genes based on RT-PCR JBiotechnol. 105(1-2): 11-31; Eymann C, et al. (2002) Bacillus subtilis func-tional genomics: global characterization of the stringent response by proteomaand transcriptome analysis. JBacteriol. 184(9):2500-20.

Gill et al. descreve o uso de tecnologia de microarranjo para i-dentificar alterações na expressão de genes relacionados à tensão em E. coliapós expressão de proteínas de fusão recombinantes de cloranfenicol acetil-transferase (Gill et al. (2001) Genomic Analysis of High-Cell-Density Recom-binant Escherichia coli Fermentation and "Cell Conditioning" for ImprovedRecombinant Protein Yield Biotech. Bioengin. 72:85-95). O perfil de trans-crição de gene de tensão, compreendendo apenas 16% do genoma total, emdensidade de célula alta foi usado para avaliar estratégias de "condiciona-mento de célula" para alterar os níveis das chaperonas, proteases e outrasproteínas intracelulares antes da sobre-expressão da proteína recombinante.

As estratégias para "condicionamento" envolveram manipulação farmacoló-gica das células, incluindo através de tratamentos de ditiotreitol e etanol.

Asai et al. descreve o uso de análise de microarranjo para identi-ficar genes alvos ativados por sobre-expressão de certos fatores sigma quesão tipicamente induzidos após tensões de célula (Asai K., et al. (2003) DNAmicroarray analysis of Bacillus subtilis sigma factors of extracytoplasmicfunction family. FEMS Micróbio!. Lett. 220(1 ):155-60). Células que so-bre-expressam fatores sigma como também genes repórteres ligados aospromotores de fator sigma foram usadas para mostrar indução de gene re-guiada por tensão.

Choi et al. descreveu a análise e sobre-regulação de genes me-tabólicos que são sub-regulados em culturas de batelada de alta densidadede E. coli que expressa proteína de fusão de fator de crescimento similar àinsulina humana (IGF-If) (Choi et al. (2003) Enhanced Production of Insu-lin-Like Growth Factor I Fusion Protein in Escherichia coli by Coexpression ofthe Down-Regulated Genes Identified by Transcriptome Profiling App. Envir.Micróbio. 69:4737-4742). O foco deste trabalho estava nas alterações me-tabólicas que ocorrem durante as condições de alta densidade após induçãode proteína. Genes que foram sub-regulados após indução de produção deproteína recombinante durante condições de crescimento de densidade altaforam identificados e genes metabólicos específicos que tinham sidosub-regulados foram expressados em células produzindo IGF-If recombinante.

O trabalho mostrou que aumentando a produção metabólica de certas basesde nucleotídeo e aminoácidos poderia aumentar a produção de proteína eaquelas taxas de crescimento poderiam ser modificadas aumentando a ex-pressão de uma molécula transportadora metabólica sub-regulada. Estasestratégias foram projetadas para alterar o ambiente celular para reduzirtensões metabólicas associadas à produção de proteína em geral ou comcultura de densidade alta.

DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNA

Degradação indesejada de proteína recombinante apresenta umobstáculo ao uso eficiente de certos sistemas de expressão. A expressão deproteínas exógenas freqüentemente induz respostas de tensão em célulashospedeiras que podem ser, por exemplo, defesas naturais a uma fonte decarbono limitada. Todas as células contêm um número grande de genes ca-pazes de produzir proteínas degradativas. Não é possível prognosticar quaisproteases serão reguladas por um hospedeiro dado em resposta à expressãode uma proteína recombinante particular. Por exemplo, as bactérias P. fluo-rescens contém até 200 proteases e proteínas relacionadas à protease.

No citoplasma de E. coli, a proteólise é em geral realizada por umgrupo de proteases e moléculas de co-fator. Etapas de degradação maisprecoces são realizadas por cinco Hsps ATP-dependentes: Lon/La FtsH/HflB,CIpAP, CIpXP e CIpYQ/HslUV (Gottesman S (1996) Proteases and theirtar-gets in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 30:465-506). Junto com FtsH (umaprotease associada à membrana interna, o sítio ativo desta opõem-se aocitoplasma), CIpAP e CIpXP são responsáveis pela degradação de proteínasmodificadas em seus términos carboxila pela adição da cauda de desestabi-lização não-polar AANDENYALAA (Gottesman S, et al. (1998) The CIpXP andCIpAP proteases degrade proteins with carboxil-terminal peptide tails addedby the SsrA-tagging system. Genes Dev. 12:1338-1347; Herman C, et al.(1998) Degradation of carbóxi-terminal-tagged cytoplasmic proteins by theEscherichia coli protease HflB (FtsH). Genes Dev. 12:1348-1355).

Vários métodos foram tomados para evitar degradação durante aprodução de proteína recombinante. Um método é produzir cepas hospe-deiras que carregam mutações em um gene de protease. Baneyx e Georgiou,por exemplo, utilizaram uma cepa deficiente de protease para melhorar orendimento de uma proteína de fusão de proteína A-(3-lactamase (Baneyx F,Georgiou G. (1991) Construction and characterization of Escherichia coli s-trains deficient in multiple secreted proteases: protease III degrades hi-gh-molecular-weight substrates in vivo. J Bacteriol 173: 2696-2703). Park et al.usou um método mutacional similar para melhorar a atividade da proteínarecombinante 30% comparada com a cepa de origem de E. coli (Park S. et al.(1999) Secretory production of recombinant protein by a high cell densityculture of a protease negative mutant Escherichia coli strain. Biotechnol. Progr.15:164-167). Patentes U.S. N°s 5.264.365 e 5.264.365 descrevem a cons-trução de E, coli deficiente de protease, particularmente múltiplas cepas de-ficientes de protease, para produzir polipeptídeos proteoliticamente sensíveis.Publicação de PCT N° WO 90/03438 descreve a produção de cepas de E. colique incluem cepas deficientes de protease ou cepas incluindo um inibidor deprotease. Similarmente, Publicação de PCT N° WO 02/48376 descreve cepasde E. coli deficientes em proteases DegP e Prc.

DOBRAMENTO DE PROTEÍNA

Outro obstáculo principal na produção de proteínas recombinan-tes em células hospedeiras é que a célula freqüentemente não é adequa-damente equipada para produzir proteína solúvel ou ativa. Embora a estruturaprimária de uma proteína seja definida por sua seqüência de aminoácido, aestrutura secundária é definida pela presença de hélices alfas ou folhas beta,e a estrutura ternária por ligações covalentes entre extensões de proteínaadjacentes, como ligações de dissulfeto. Ao expressar proteínas recombi-nantes, particularmente em grande escala, a estrutura secundária e terciáriada própria proteína é de importância crítica. Qualquer alteração significativaem estrutura de proteína pode render uma molécula funcionalmente inativa,ou uma proteína com atividade biológica significativamente reduzida. Emmuitos casos, uma célula hospedeira expressa moduladores de dobramento(FMs) que são necessários para produção apropriada de proteína recombi-nante ativa. Porém, nos níveis altos de expressão em geral requeridos paraproduzir produtos de biotecnologia utilizáveis, economicamente satisfatórios,uma célula freqüentemente não pode produzir modulador ou moduladores dedobramento nativo suficiente para processar a proteína recombinante.

Em certos sistemas de expressão, superprodução de proteínasexógenas pode ser acompanhada por seu desdobramento e segregação emagregados insolúveis. Em células bacterianas, estes agregados são conhe-cidos como corpos de inclusão. Em E. coli, a rede de moduladores/ chape-ronas de dobramento inclui a família de Hsp70. A chaperona de Hsp70 prin-cipal, DnaK, impede agregação da proteína e suporta eficazmente o redo-bramento das proteínas estragadas. A incorporação de proteínas de choquetérmico em agregados de proteína pode facilitar a desagregação. Porém,proteínas processadas para corpos de inclusão podem, em certos casos, serrestabelecidas através de processamento adicional da fração insolúvel. Pro-teínas encontradas em corpos de inclusão tipicamente têm que ser purifica-das através de etapas múltiplas, incluindo desnaturação e renaturação.

Processos de renaturação típicos para proteínas alvejadas por corpo de in-clusão envolvem tentativas de dissolver o agregado em desnaturante con-centrado e remoção subseqüente do desnaturante por diluição. Agregadossão freqüentemente formados novamente neste estágio. O processamentoadicional soma custo, não há nenhuma garantia que o redobramento in vitrorenderá produto biologicamente ativo, e as proteínas restabelecidas podemincluir quantidades grandes de impurezas de fragmento.

Um método para reduzir agregação de proteína é através deengenharia de fermentação, mais comumente reduzindo a temperatura decultivo (ver Baneyx F (1999) In vivo folding of recombinant proteins in Esche-richia coli. In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Ed. Davieset al. Washington, DC: American Society for Microbiology ed. 2:551-565 ereferências nele). A mais recente realização que dobramento de proteína invivo é assistida por chaperonas moleculares, que promove a isomerizaçãoapropriada e alvejamento celular de outros polipeptídeos transientementeinteragindo com intermediários de dobramentos, e por foldases, que aceleraas etapas limitativas de taxa ao longo da via de dobramento, forneceu mé-todos adicionais para combater o problema de formação de corpo de inclusão(ver por exemplo Thomas JG et al. (1997). Molecular chaperonas, foldingcatalysts and the recovery of active recombinant proteins from E. coli: to fold orto refold. Appl Biochem Biotechnol, 66:197-238).

Em certos casos, a sobre-expressão de chaperonas foi observadaaumentar os rendimentos solúveis de proteínas propensas à agregação (verBaneyx, F. (1999) Recombinant Protein Expression in E. coli Curr. Opin. Bi-otech. 10:411-421 e referências nele). O processo não parece envolver dis-solução de corpos de inclusão recombinantes pré-formados mas está rela-cionado ao dobramento melhorado das cadeias de proteína recentementesintetizadas. Por exemplo, Nishihara et al. co-expressou groESL ednaJK/grpE no citoplasma para melhorar a estabilidade e acumulação deCryj2 recombinante (um alergênio de pólen de cedro japonês) (Nishihara K,Kanemori M, Kitagawa M, Yanagi H, Yura T. 1998. Chaperone coexpressionplasmids: differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and Gro-EL-GroES in assisting folding of an allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2,in Escheríchia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64:1694). Lee e Olins tambémco-expressaram GroESL e DnaK e aumentaram a acumulação de procola-genase humana em dez vezes (Lee S, Olins P. 1992. Effect of overproductionof heat shock chaperones GroESL and DnaK on human procollagenaseproduction in Escheríchia coli. JBC 267:2849-2852). O efeito benéfico asso-ciado a um aumento na concentração intracelular destas chaperonas parecealtamente dependente da natureza da proteína superproduzida, e o sucessonão é de forma alguma garantido.

Uma necessidade existe por processos para desenvolvimento decepas hospedeiras que mostram produção, atividade ou solubilidade melho-radas de proteína ou peptídeo recombinante para reduzir os custos de fa-bricação e aumentar o rendimento dos produtos ativos.

É, portanto, um objetivo da invenção fornecer processos paramelhorar expressão de proteína recombinante em um hospedeiro.

É um outro objetivo da invenção fornecer processos que au-mentam os níveis de expressão em células hospedeiras expressando prote-ínas ou peptídeos recombinantes.

É outro objetivo da invenção fornecer processos para aumentaros níveis de proteína solúvel feita em sistemas de expressão recombinante.

É ainda outro objetivo da invenção fornecer processos para au-mentar os níveis de proteína ativa feita em sistemas de expressão recombi-nante.

SUMÁRIO

Um processo é fornecido para melhorar a expressão de umaproteína ou peptídeo recombinante compreendendo:

i) expressar a proteína ou peptídeo recombinante em uma célulahospedeira;

ii) analisar um perfil genético da célula e identificar um ou maisprodutos de gene endógeno que são sobre-regulados na expressão ou so-bre-expressão da proteína ou peptídeo recombinante; e

iii) alterar a expressão de um ou mais produtos de gene endógenoidentificados geneticamente modificando a célula.

O processo pode fornecer expressão melhorada como medidapor rendimentos melhorados de proteína, ou pode melhorar a recuperação daproteína ativa, por exemplo aumentando a solubilidade da proteína recom-binante expressa, ou uma proteína ou peptídeo relacionado.

Usando este processo, pode ser determinado quais das muitasproteínas celulares são "escolhidas" pela célula para compensar a expressãoda proteína recombinante estranha, e esta informação pode levar ao desen-volvimento de sistemas de expressão de proteína mais eficazes. Por exemplo,é conhecido que, tipicamente, uma célula seletivamente sobre-regulará umaou mais proteases para degradar uma proteína recombinante sobre-expres-sada. Porém, pode não ser prognosticado com antecedência qual(is) prote-ase(s) a célula sobre-regulará para compensar a tensão causada por qual-quer proteína recombinante dada. Análise do perfil genético da célula pormicroarranjo ou tecnologia equivalente pode identificar quais proteases sãosobre-reguladas em uma célula dada em resposta à produção de proteínaexógena. Esta informação é depois usada para geneticamente modificar acélula para diminuir a expressão destas proteases particulares, poupandooutras proteínas que são úteis ou até mesmo necessárias para homeóstasede célula.

Como outro exemplo, uma célula pode seletivamente so-bre-regular um ou mais moduladores ou co-fatores de dobramentos paraaumentar a capacidade de dobramento ou solubilidade da proteína recom-binante. Novamente, não pode ser prognosticado com antecedência quaismoduladores ou co-fatores de dobramentos serão selecionados em um sis-tema dado para ajudar no processamento de uma proteína recombinanteespecífica. Analisando o perfil genético através de microarranjo ou tecnologiaequivalente permite á identificação dos moduladores ou co-fatores de do-bramentos que foram sobre-regulados. Com base nesta informação, a célulaé geneticamente modificada para aumentar a expressão dos moduladores ouco-fatores de dobramentos selecionados preferidos pela célula para a prote-ína recombinante dada. Esta modificação pode aumentar o percentual deproteína ativa se restabelecida, enquanto minimizando o impacto prejudicialem homeóstase de célula.

Portanto, o rendimento e/ou atividade e/ou solubilidade da pro-teína recombinante pode(m) ser aumentado(s) ou modificando o organismohospedeiro ou aumentando ou diminuindo a expressão de uma proteínacompensatória (isto é uma proteína que é sobre-regulada em resposta àtensão de célula dada) de uma maneira que é seletiva e que deixa outrosmecanismos benéficos inteiros da célula.

O processo pode ser usado iterativamente até a expressão deproteína recombinante ativa ser otimizado. Por exemplo, usando o processodescrito acima, a célula ou organismo hospedeiro é geneticamente modifi-cado para sobre-regular, sub-regular, knock-in ou knock-out uma ou maisproteínas compensatórias identificadas. A célula ou organismo hospedeiroassim modificado pode depois ser cultivado para expressar a proteína re-combinante, ou uma proteína ou peptídeo relacionado, e proteínas compen-satórias adicionais identificadas por meio de microarranjo ou análise equiva-lente. A célula ou organismo hospedeiro modificado é depois de novo gene-ticamente modificado para sobre-regular, sub-regular, knock-in ou knock-outas proteínas compensatórias adicionais selecionadas. Este processo podeser iterado até uma célula ou organismo hospedeiro ser obtido que exibeexpressão máxima de ativo e/ou proteína solúvel sem enfraquecimento in-devido do organismo ou célula hospedeira. Estas etapas por exemplo podemser repetidas por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito,nove, ou dez ou mais vezes.

Em outra modalidade, o processo também compreende: iv) ex-pressar a proteína ou peptídeo recombinante em uma célula geneticamentemodificada. Em ainda outra modalidade, o processo também compreende: v)analisar um segundo perfil genético da célula geneticamente modificada ex-pressando proteína ou peptídeo recombinante e identificando um ou maisprodutos de gene adicionais que são diferencialmente expressos na célulamodificada que expressa a proteína ou peptídeo recombinante. Em uma outramodalidade, o processo adicionalmente compreende: vi) alterar a expressãode um ou mais produtos de gene adicionais identificados para fornecer umacélula modificada dupla. Opcionalmente, a proteína ou peptídeo recombinante,ou uma proteína ou peptídeo relacionado, pode ser expressado na célulamodificada dupla. Os produtos de gene diferencialmente regulados identifi-cados na célula modificada podem ser sobre ou sub-regulados quandocomparados à célula hospedeira ou quando comparados à célula modificadaque não expressa proteína ou peptídeo recombinante.

Em ainda outra modalidade, o processo também compreende: iv)analisar um segundo perfil genético de uma célula geneticamente modificadaexpressando a proteína ou peptídeo recombinante e identificar um ou maisprodutos de gene adicionais que são diferencialmente expressos na célulamodificada que não está expressando a proteína ou peptídeo recombinante.Em uma outra modalidade, o processo adicionalmente compreende: v) alterara expressão de um ou mais produtos de gene adicionais identificados nacélula modificada para fornecer uma célula modificada dupla. Os produtos degene diferencialmente regulados identificados na célula modificada podemser sobre ou sub-regulados quando comparados à célula ou organismohospedeiro ou quando comparados à célula modificada que não expressa aproteína ou peptídeo recombinante.

Em uma modalidade específica, um processo é fornecido paramelhorar a expressão de uma proteína ou peptídeo recombinante compre-endendo: i) expressar a proteína ou peptídeo recombinante em uma célulahospedeira; ii) analisar um perfil genético da célula e identificar pelo menosuma protease que é sobre-regulada quando a proteína ou peptídeo recom-binante é expressado; e iii) alterar a expressão de uma protease identificadageneticamente modificando a célula ou organismo hospedeiro para reduzir aexpressão da protease sobre-regulada. Em uma outra modalidade, o pro-cesso compreende alterar a expressão de pelo menos uma segunda proteaseidentificada na célula modificada para fornecer uma célula modificada deprotease dupla. Em outra modalidade, o processo também compreende: iv)expressara proteína ou peptídeo recombinante, ou uma proteína ou peptídeorelacionado, em uma célula modificada de protease. Em outra modalidade, oprocesso também compreende analisar um segundo perfil genético da célulamodificada de protease para identificar um ou mais produtos de gene adi-cionais que são diferencialmente expressos na célula modificada.

Em outra modalidade, um processo é fornecido para melhorar aexpressão de uma proteína ou peptídeo recombinante compreendendo: i)expressara proteína ou peptídeo recombinante em uma célula hospedeira; ii)analisar um perfil genético da célula e identificar pelo menos um modulador dedobramento sobre-regulado (FM) que é sobre-regulado após sobre-expres-são da proteína ou peptídeo recombinante; e iii) alterar a expressão de pelomenos um modulador de dobramento identificado geneticamente modificandoa célula para fornecer uma célula modificada de FM. Em uma outra modali-dade, o processo compreende alterar a expressão de pelo menos um se-gundo modulador de dobramento identificado na célula modificada para for-necer uma célula modificada de FM duplo. Em outra modalidade, o processotambém compreende: iv) expressar a proteína ou peptídeo recombinante, ouuma proteína ou peptídeo relacionado, em uma célula modificada de FM. Emoutra modalidade, o processo também compreende analisar um segundoperfil genético da célula modificada de FM para identificar um ou mais pro-dutos de gene adicionais que são diferencialmente expressos na célula mo-dificada.

O termo "perfil genético" como aqui usado é significado para in-cluir uma análise de genes em um genoma, mRNA transcrito de genes nogenoma (ou o cDNA equivalente), produtos de transcrição que foram modi-ficados por uma célula como variantes de encaixe de genes em sistemaseucarióticos, ou proteínas ou peptídeos translados de genes em um genoma,incluindo proteínas que são modificadas pela célula ou transladada de vari-antes de encaixe de mRNA transladado do genoma. Um perfil genético ésignificado incluir mais de um gene ou produto de gene, e tipicamente incluium grupo de pelo menos 5, 10, 50, 100 ou mais genes ou produtos de geneque são analisados.

Em uma modalidade, o perfil genético analisado pode ser umperfil de transcriptoma, isto é um perfil dos produtos de transcrição de genesdo genoma. O processo pode incluir analisar o perfil de transcriptoma usandoum microarranjo ou tecnologia equivalente. Nesta modalidade, o microarranjopode incluir os pares de ligação para pelo menos uma porção do transcrip-toma da célula hospedeira, e tipicamente inclui amostras de pares de ligaçãopara os produtos de gene de pelo menos 50% do genoma do organismo. Maistipicamente, o microarranjo inclui amostras de pelo menos 80%, 90%, 95%,98%, 99% ou 100% dos pares de ligação para produtos de gene no genomada célula hospedeira.

Em uma modalidade separada, o microarranjo pode incluir umsubconjunto selecionado de pares de ligação para genes ou produtos de geneque representam classes de produtos que são afetadas pela expressão deproteína recombinante. Exemplos não-limitativos incluem proteases putativasou conhecidas, co-fatores de proteases ou proteínas similares à protease;moduladores de dobramentos, moduladores co-fatores de dobramentos ouproteínas que podem melhorar o dobramento ou solubilidade da proteína;fatores de transcrição; proteínas envolvidas em estabilidade de ácido nucléicoou iniciação translacional; cinases; receptores extracelulares ou intracelulares;enzimas metabólicas; co-fatores metabólicos; proteínas de envelope; fatoresde sigma; proteínas ligadas à membrana; proteínas de transmembrana; pro-teínas associadas à membrana e genes de manutenção. O perfil genéticopode ser analisado medindo a ligação dos genes expressos da célula hos-pedeira que expressa a proteína ou peptídeo recombinante para o microar-ranjo. O perfil de transcriptoma pode também ser analisado usando ensaiosde não-microarranjo como ensaios de mancha, incluindo ensaios de northernblot, ou colunas revestidas com pares de ligação.

Em outra modalidade, o perfil genético analisado pode ser umperfil de proteoma, isto é um perfil das proteínas produzidas de genes em umorganismo dado. O processo pode incluir analisar o perfil de proteoma usando,por exemplo, eletroforese bidimensional. Técnicas como espectrometria demassa em combinação com ferramentas de separação como eletroforese emgel bidimensional ou cromatografia líquida multidimensional, podem tambémser usadas no processo. Em eletroforese bidimensional, as proteínas sepa-radas podem incluir proteínas de pelo menos 10% do proteoma do organismo.Mais tipicamente, proteínas de pelo menos 20%, 30%, 40%, 60%, 80% ou90% das proteínas no proteoma da célula hospedeira são separados e ana-lisados através de técnicas como tingimento de proteínas e/ou espectrometriade massa.

Em modalidade adicional, o perfil de proteoma é analisado u-sando espectrometria de massa. Há várias técnicas relacionadas que usamcromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa (MS) e es-pectrometria de massa de tandem (MS/MS) para identificar proteínas e medirsua abundância relativa. Freqüentemente, uma amostra é marcada com ummarcador de isótopo pesado que permite a comparação com a outra amostrasem alterar as propriedades químicas. Por exemplo, em uma amostra a eis-teína de aminoácido pode ser marcada com um marcador que contém oitoátomos de hidrogênio. A outra amostra é marcada com um marcador quecontém oito átomos de deutério ("pesado") no lugar de (+8 Dáltons). Os dadosde MS podem ser usados para encontrar pares de peptídeos de 8 Dáltonsseparadamente e quantificar a diferença. Dados de MS/MS dos mesmospeptídeos fornecem uma aproximação de seqüência primária, e a proteína ID.Outros experimentos identificam as proteínas in vivo mediante cultivo dascélulas com aminoácidos "pesados". Estes tipos de técnicas podem ser u-sados para identificar milhares de proteínas em um experimento simples eestimar a abundância relativa se presente em ambas as amostras (ver Goo-dlett DR e Aebersold RH (2001). Mass Spectrometry in Proteomics. ChemRev101:269-295). ICAT é um tipo de MS/MS, representa Marcadores de Afi-nidade Codificados de Isótopo (ver Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F,Gelb MH, e Aebersold RH (1999). Quantitative analysis of complex proteinmixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech 17:994-999).

Em outra modalidade, o processo pode incluir analisar o perfil deproteoma usando, por exemplo, um microarranjo. Nesta modalidade, o arranjopode incluir os pares de ligação para pelo menos uma porção das proteínasexpressas pela célula hospedeira sob condições de crescimento apropriadas,e tipicamente inclui os pares de ligação para proteínas de pelo menos 10% doproteoma do organismo. Mais tipicamente, o microarranjo inclui os pares deligação para proteínas de pelo menos 20%, 30%, 40%, 60%, 80% ou 90% dasproteínas no proteoma da célula hospedeira. Os pares de ligação podem seranticorpos que podem ser fragmentos de anticorpo como fragmentos de an-ticorpo de cadeia simples. Em uma modalidade separada, o microarranjopode incluir os pares de ligação para um subconjunto selecionado de prote-ínas do proteoma, incluindo, por exemplo, proteínas de protease putativa oumoduladores de dobramentos putativos. O microarranjo pode tipicamentetambém incluir um conjunto de pares de ligação para proteínas que são u-sadas como controles. O perfil genético pode ser analisado medindo a ligaçãodas proteínas da célula hospedeira que expressa a proteína ou peptídeo re-combinante aos pares de ligação no microarranjo. O perfil de proteoma podetambém ser analisado em um formato de ensaio padrão, como um ensaio deElisa ou um ensaio de western blot padrão.

As amostras no perfil genético podem ser analisadas individual-mente ou agrupadas em agrupamentos. Os agrupamentos podem tipica-mente ser agrupados por similaridade em expressão de gene. Em modali-dades particulares, os agrupamentos podem ser agrupados como genes quesão sobre-regulados a uma extensão similar ou genes que são sub-reguladosa uma extensão similar.

O gene sobre-regulado identificado é tipicamente identificadocomparando um perfil genético da célula hospedeira que expressa a proteínaou peptídeo recombinante a um perfil genético da célula hospedeira que nãoexpressa a proteína ou peptídeo recombinante. Em uma outra modalidade,uma célula hospedeira que expressa uma proteína homóloga é analisadapara a primeira proteína recombinante.

O genoma da célula hospedeira que expressa a proteína oupeptídeo recombinante pode ser modificado através de recombinação, porexemplo recombinação homóloga ou recombinação heteróloga. O genomapode também ser modificado por mutação de um ou mais nucleotídeos emuma estrutura de leitura aberta que codifica um gene, particularmente umaprotease identificada. Em outra modalidade, a célula hospedeira é modificadaincluindo um ou mais vetores que codificam um inibidor de um gene ou pro-duto de gene identificado, como um inibidor de protease. Em outra modali-dade, a célula hospedeira é modificada por inibição de um promotor que podeser um promotor nativo. Em uma modalidade separada, a célula hospedeira émodificada incluindo um ou mais vetores que codificam um gene, tipicamenteum modulador de dobramento ou um co-fator de um modulador de dobra-mento. Em outra modalidade, a célula hospedeira é modificada intensificandoum promotor para um modulador de dobramento identificado ou um co-fatorpara um modulador de dobramento, incluindo adicionando um promotor e-xógeno ao genoma da célula hospedeira.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula capaz de produzirproteína ou peptídeo recombinante. Em uma modalidade, a célula hospedeiraé um procarioto, como uma célula bacteriana incluindo, mas não limitada auma espécie de Escherichia ou uma de Pseudonaonas. A célula hospedeirapode ser uma célula de Pseudomonas como uma célula de P. fluorescens.Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de E. coli. Em outramodalidade a célula hospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo umacélula de inseto, incluindo mas não limitado a uma célula de uma espécie deSpodoptera, Trichoplusia, Drosophila ou Estignaene, ou uma célula mamífera,incluindo mas não limitada a uma célula murina, uma célula de hamster, umade macaco, uma de primata ou uma célula humana. Em outra modalidade, acélula hospedeira é uma célula de planta, incluindo, mas não limitada a, umacélula de tabaco, milho, uma célula de uma espécie de Arabidopsis, célula debatata ou arroz. Em outra modalidade, um organismo inteiro é analisado noprocesso, incluindo mas não limitado a um organismo transgênico.

Em uma modalidade, os genes ou produtos de gene compensa-tórios sobre-regulados identificados são uma ou mais proteases e/ou um oumais moduladores de dobramentos. Em certas modalidades, um gene ouproduto de gene identificado pode também ser uma subunidade de umaprotease ou um modulador de dobramento ou um co-fatorde uma protease ouum co-fator de um modulador de dobramento. Em uma modalidade, o geneidentificado pode ser selecionado de uma peptidase serina, treonina, cisteína,aspártico ou metalo. Em certas outras modalidades, o gene ou produto degene identificado pode ser selecionado de hslV, hsIU, cIpA, dpB e dpX. Ogene ou produto de gene identificado pode também ser um co-fator de umaprotease. Em outra modalidade, o gene ou produto de gene identificado é ummodulador de dobramento. Em certas modalidades, o gene ou produto degene identificado pode ser selecionado de uma proteína de chaperona, umafoldase, uma peptidil prolil isomerase e uma isomerase de ligação de dissul-feto. Em uma modalidade, o gene ou produto de gene identificado pode serselecionado de htpG, cbpA, dnaJ, dnaKe fkbP. Em uma modalidade, um geneou produto de gene homólogo ao gene sobre-regulado identificado é modifi-cado no genoma do hospedeiro.

O processo pode levar à produção aumentada de proteína oupeptídeo recombinante em uma célula hospedeira, por exemplo, aumentandoa quantidade de proteína por grama de proteína de hospedeiro (proteína decélula total) em uma quantidade dada de tempo, ou aumentando a quantidadede comprimento de tempo durante o qual a célula ou organismo está produ-zindo a proteína recombinante. A produção aumentada pode otimizar a efi-ciência da célula ou organismo, por exemplo, diminuindo a despesa de e-nergia, aumentando o uso de recursos disponíveis ou diminuindo os reque-rimentos para suplementos de crescimento em meios de crescimento. Aprodução aumentada pode também resultar em um nível aumentado deproteína recuperável ou peptídeo, como proteína solúvel, produzido porgrama de recombinante ou por grama de proteína de célula hospedeira.

A invenção também inclui uma célula hospedeira recombinantemelhorada que é produzida pelo processo reivindicado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 é um gráfico de uma comparação de crescimento (den-sidade óptica com o passar do tempo) de cepas diferentes de P. fluorescens.As células foram induzidas com 0,3 M de IPTG em 24 h após inoculação. Ascepas são: DC280 que abriga o vetor vazio pDOW1339, DC240 que produz aenzima de nitrilase citoplásmica solúvel e DC271 que produz a hGH peri-plásmica parcialmente insolúvel. DC206, a cepa parental de DC280, DC240 eDC271, foi incluída como um controle. As amostras foram tiradas em 0 e 4 hde indução pós-IPTG para isolamento de RNA e profilação da expressão degene, como indicado pelas setas.

Figura 2 é um gráfico de agrupamento hierárquico de todos osgenes de cepas de P. fluorescens DC280, DC240 e DC271 em 12 agrupa-mentos em 4 h após IPTG quando comparados em 0 h IPTG (indicado nofundo da figura). Com base no valor e tendência, os genes foram aglomeradose agrupados usando o algoritmo de agrupamento hierárquico de SpotfireDecisionSite. Linhas pontilhadas indicam pontos de dados que foram filtradosdevido à qualidade de manchas fraca ou baixo nível de expressão. O eixogeométrico x representa a comparação de cada cepa; o eixo geométrico yrepresenta o valor de expressão com relação 4 h atrás para antes da induçãode IPTG. Todos os FMs identificados são realçados. Agrupamento 7 mostra 2genes de FM e 2 de subunidade de protease que são altamente expressos emcepa DC271, que superproduzem a proteína de hGH periplásmica. Os genesde FM restantes são agrupados no agrupamento 6.

Figura 3 é uma análise de agrupamento hierárquico do agrupa-mento 6 da Figura 2. No agrupamento 8 novo, dois moduladores de dobra-mentos, DnaK e DnaJ, foram identificados ambos destes mostraram níveis deexpressão mais altos para produção de proteína recombinante periplásmicasimilar ao HsIVU, CbpA e HtpG previamente identificado. Agrupamento 6mostra onde o resto dos FMs estão agrupados.

Figura 4 é um diagrama de Venn mostrando a protease so-bre-regulada e FMs dos três conjuntos de experimentos na Tabela 5, 6 e 7.Como resumido na Tabela 5, 6 e 7, a lista de genes foi organizada em es-quema de Venn para realçar a sobreposição da lista de gene entre os trêsconjuntos de experimentos indicados no canto. Para cada gene, a razão decada experimento foi exibida com 2 como um corte.

Figura 5 é um gráfico da análise de seqüência dos genes hslV(RXF01961) e hslil (RXF01957) de P. fluorescens gerados por Artemis. Odiagrama de uso de códon (painel do topo) indica que o limite de gene estácorreto. Este é confirmado pelos melhores homólogos das seqüências deproteína de HslV e HsIU de P. aeruginosa como indicado em baixo dos genesde RXF01961 e RXF01957. O diagrama de contagem de qualidade de Phrapmostra que a qualidade de seqüência é boa, isto é a linha de contagem estáacima da linha horizontal indicando uma qualidade melhor que 1 erro em 10kb (painel mediano). As caixas apontadas brancas abertas abaixo dos genesmostram a localização das sondas geradas para uso nos experimentos demicroarranjo de DNA.

Figura 6 é uma ilustração esquemática de uma construção demutante de hsIU onde um produto de PCR de aproximadamente 550 bp dehsIU (caixa azul claro) foi ligado no vetor de clonagem TOPO TA2.1 (círculo).O plasmídeo resultante foi transformado em células de P. fluorescens com-petentes e colônias resistentes à canamicina (kan) foram analisadas em PCRdiagnostica para confirmar a construção de uma mutação de inserção no genede hslU.

Figura 7 é um gráfico de uns ensaios de curva de crescimentocomparando cepa do tipo selvagem com de mutante de hslU que superproduzhGH ou pbp::hGH em meio de produção de frasco de agitação. As setas in-dicam pontos de tempo onde foram tiradas as amostras.

Figura 8 é uma imagem de análise de SDS-PAGE das cepasDC271 e DC373 que expressam pbp::hGH. As amostras de DC271 (tiposelvagem, W) e DC373 (mutante de hslU, M) foram tiradas logo antes daindução da proteína (0 h) e depois 4 h, 8 h, 24 h, e 30 h após adição de IPTG.Frações solúveis (S) e insolúveis (I) foram preparadas para cada amostraanalisada. A produção de hGH não processado e processado é indicada pelassetas. O marcador (Ma) de peso molecular (MW) é mostrado à direita dos géis.

Figura 9 é uma imagem da análise de SDS-PAGE das cepasDC369 e DC372 que expressam hGH no citoplasma. As amostras foram ti-radas de DC369 (tipo selvagem, W) e DC372 (mutante de hslU, M) logo antesda indução da proteína (0 h) e depois 4 h, 8 h, 24 h, 30 h e 50 h após adição deIPTG. Frações solúveis (S) e insolúveis (I) foram preparadas para cada a-mostra analisada. A produção de hGH é indicada por uma seta. O marcador(Ma) de peso molecular (MW) é mostrado à direita dos géis.

Figura 10 é um gráfico de curvas de crescimento de cepas queexpressam a proteína de fusão de hGH::COP. As cepas incluem: DC369 queexpressa hGH apenas (não fundido com COP) como um controle negativo;

HJ104, o tipo selvagem que expressa hGH::COP; HJ105, o mutante de hslUque expressa hGH::COP.

Figura 11 é um gráfico das medições da atividade de fluorescên-cia verde para cepas que expressam a proteína de fusão de hGH::COP u-sando um fluorímetro. Cinco OD600 de cultura de célula foram ensaiadaspara cada cepa abrigando hGH ou hGH::COP em pontos de tempo diferentesapós indução de IPTG. As cepas testadas incluem: DC369 que expressa hGHapenas (não fundido com COP) como um controle negativo; HJ104, o tiposelvagem que expressa hGH::COP; HJ105, o mutante de hslil que expressahGH::COP. A tabela inserida mostra o percentual de aumento da fluorescên-cia relativa no mutante de hsIU comparado ao tipo selvagem em pontos detempo diferentes após indução de IPTG.

Figura 12 é uma representação pictórica do processo de medirabundância relativa de mRNA entre duas amostras.

Figura 13 é uma representação da construção de deleção cro-mossômica de gene de hslUV na cepa pyrF-negativa. A. PlasmídeoPDOW2050 contém fragmentos de DNA de 505 bp e 634 bp flanqueando ogene de hslUV. Uma vez que plasmídeo de suicídio pDOW2050 não podereplicar em P. fluorescens, as células resistentes à tetraciclina apenas serãogeradas após um evento de recombinação simples em uma das regiõeshomólogas que integram o plasmídeo inteiro no genoma. B. Células resis-tentes à tetraciclina contêm o plasmídeo inteiro integrado no genoma. Estascélulas também contêm o gene de pyrF codificado do plasmídeo. Seleçãopara células que têm o segundo evento recombinante ocorreu através decélulas de colocação em placa em placas de ágar suplementadas com FOA,que em cepas pyrF-positivas, são convertidas em um composto tóxico. C. Acepa de deleção cromossômica foi confirmada por análise de seqüenciação.

Figura 14 é um gráfico de fluorescência relativa com o passar dotempo para medições de atividade de fluorescência verde para as cepas queexpressam a proteína de fusão de hGH::COP usando um fluorímetro. Dupli-catas foram usadas tanto para cepa de deleção do tipo selvagem (HJ104)como de hslUV (HJ117).

Figura 15 são imagens de géis de SDS-PAGE de cepas que ex-pressam hGH com ou sem moduladores de dobramentos GrpE-DnakJ. A-mostras foram removidas em vários tempos após indução por IPTG (0, 4, 8,24 e 48 h), normalizadas em OD600 de 20 e lisadas usando EasyLyse. Asfrações solúveis (S) insolúveis (I) foram separadas em um Critério de BioRad15% de Tris HCI gel de SDS-PAGE e tingido com Coomassie.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Um processo é fornecido para melhorar a expressão de umaproteína ou peptídeo recombinante compreendendo i) expressara proteína oupeptídeo recombinante em uma célula hospedeira; ii) analisar um perfil ge-nético da célula e identificar um ou mais produtos de gene sobre-reguladosendógenos, incluindo uma ou mais proteases ou moduladores de dobra-mentos que são sobre-regulados na expressão da proteína ou peptídeo re-combinante; e iii) alterar a expressão de um ou mais produtos de gene iden-tificados geneticamente modificando a célula. Em outra modalidade, o pro-cesso também compreende expressar a proteína ou peptídeo recombinanteem uma célula geneticamente modificada. Em outra modalidade, o processotambém compreende analisar um segundo perfil genético da célula geneti-camente modificada para identificar um ou mais produtos de gene adicionaisque são diferencialmente expressos na célula modificada. Em uma outramodalidade, o processo compreende alterar a expressão de pelo menos umsegundo produto de gene identificado na célula modificada para fornecer umacélula modificada dupla. O processo pode fornecer expressão melhoradacomo medido por rendimentos melhorados de proteína, ou pode melhorar arecuperação de proteína ativa, por exemplo aumentando solubilidade daproteína recombinante expressa.

Mais em geral, a invenção inclui um processo para melhorar aexpressão de uma proteína ou peptídeo recombinante em uma célula ouorganismo hospedeiro compreendendo:

i) expressar a proteína ou peptídeo recombinante na célula ouorganismo hospedeiro recombinante;

ii) analisar um perfil genético da célula recombinante para identi-ficar um gene compensatório ou produto de gene que é expressado em umnível mais alto na célula recombinante que em um de uma célula hospedeiraque não foi modificada para expressar a proteína recombinante ou uma célularecombinante que não está expressando a proteína recombinante; e

iii) alterar a expressão do gene compensatório ou produto de geneidentificado na célula recombinante através de modificação genética parafornecer uma célula recombinante modificada que alcança um aumento naexpressão, atividade ou solubilidade de proteína recombinante.Ao longo do relatório descritivo, quando uma faixa for fornecida,deveria ser entendido que os componentes são significados ser indepen-dentes. Por exemplo, uma faixa de 1-6 significa independentemente 1, 2, 3, 4,5 ou 6.

As etapas do processo são descritas em mais detalhe abaixo.

ETAPA I: MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE CÉLULA OU ORGANISMOHOSPEDEIRO PARA EXPRESSAR UMA PROTEÍNA OU PEPTÍDEO RE-COMBINANTE EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA

Na primeira etapa do processo, uma célula hospedeira é modifi-cada para ter a capacidade para expressar uma proteína ou peptídeo re-combinante. A célula hospedeira pode ser modificada usando qualquer téc-nica conhecida na técnica. Por exemplo, a proteína recombinante pode serexpressada de um vetor de expressão que é exógeno ao genoma da célula eque é transfeccionado ou transformado na célula. A construção de vetores deexpressão como também técnicas para transfecção ou transformação édescrita abaixo. A célula hospedeira pode também ser modificada para ex-pressar uma proteína ou peptídeo recombinante de uma inserção genômicacomo descrito abaixo. Um gene que codifica a proteína ou peptídeo recom-binante pode ser inserido no genoma da célula ou organismo hospedeiroatravés de técnicas como recombinação homóloga ou heteróloga. Estas téc-nicas são descritas abaixo.

A proteína ou peptídeo recombinante pode ser expressado sob ocontrole de um elemento que requer manipulação adicional da célula. Porexemplo, tratamento químico da célula pode ser requerido para iniciar ouintensificar a expressão de proteína ou de peptídeo. Os elementos de pro-motor e de repressor que governam a expressão de proteínas ou peptídeosrecombinantes nas células hospedeiras são descritos abaixo e são bem co-nhecidos na técnica. Estes podem incluir elementos de promotor com base nopromotor "tac" responsivo a IPTG.

SELEÇÃO DE UMA CÉLULA OU ORGANISMO HOSPEDEIRO

O processo da invenção pode ser usado em qualquer sistemahospedeiro dado, incluindo de origem eucariótica ou procariotica. O processoé em geral limitado apenas pela disponibilidade de informação bastante ge-nética para análise de um perfil genético para identificar um gene identificado.Embora seja em geral típico que as seqüências representativas de umaporcentagem grande do genoma estão disponíveis, por exemplo pelo menos50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% das seqüências ex-pressas ou encontradas no genoma, transcriptoma ou proteoma, a invençãopode ser praticada usando apenas uma porção das seqüências no genoma,transcriptoma ou proteoma. Em particular, em circunstâncias quando a in-formação disponível incluir informação sobre um grupo de seqüências rela-cionadas, como um grupo metabolicamente ligado, apenas uma porção pe-quena das seqüências representativas do genoma pode ser usada para oprocesso da invenção. O processo é também não limitado às proteínas re-combinantes particulares sendo expressadas, como um aspecto fundamentaldo processo a capacidade é racional e iterativamente para sistemas de ex-pressão de projeto com base em técnicas para identificar alterações celularesque ocorrem em uma célula hospedeira na expressão de proteínas ou pep-tídeos recombinantes e para modular a célula hospedeira usando procedi-mentos conhecidos na técnica.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula capaz de produzirproteína ou peptídeo recombinante. Em uma modalidade, a célula hospedeiraé uma célula microbiana, isto é, uma célula de uma bactéria, fungo, leveduraou outros eucariotas unicelulares, procariotos e vírus. Os sistemas comu-mente usados para produzir proteínas ou peptídeos recombinantes incluemcertas células bacterianas, particularmente E. coli, por causa de seus reque-rimentos de crescimento relativamente baratos e capacidade de potencialpara produzir proteína em culturas de batelada grandes. Levedura é tambémusada para expressar proteínas e peptídeos biologicamente relevantes, par-ticularmente para propósitos de pesquisa. Sistemas incluem Saccharornycescerevisiae ou Pichia pastoris. Estes sistemas são bem caracterizados, for-necem em geral níveis aceitáveis de expressão de proteína total e sãocomparativamente rápidos e baratos. Sistemas de expressão de célula deinseto também emergiram como uma alternativa para expressar proteínasrecombinantes em forma biologicamente ativa. Em alguns casos, proteínascorretamente dobradas que são pós-translacionalmente modificadas podemser produzidas. Sistemas de expressão de célula mamífera, como células deovário de hamster chinês, também foram usados para a expressão de pro-teínas recombinantes. Em uma escala pequena, estes sistemas de expressãosão freqüentemente eficazes. Certos biológicos podem ser derivados deproteínas mamíferas, particularmente em aplicações de saúde animal ouhumana. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de planta,incluindo, mas não limitada a, uma célula de tabaco, milho, uma célula de umaespécie de Arabidopsis, célula de batata ou de arroz. Em outra modalidade,um organismo multicelular é analisado ou modificado no processo, incluindomas não limitado a um organismo transgênico. Técnicas para analisar e/oumodificar um organismo multicelular são em geral com base nas técnicasdescritas para modificar as células descritas abaixo.

Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser um proca-rioto como uma célula bacteriana incluindo, mas não limitada a uma es-pécie de Escherichia ou Pseudomonas. Células bacterianas típicas sãodescritas, por exemplo, em "Biological Diversity: Bactéria and Archaeans",a chapter ofthe On-Line Biology Book, fornecido por Dr MJ Farabeedo Estrella Mountain Community College, Arizona, USA em URL:http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_2.html.

Em certas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célulade Pseudomonas, e pode tipicamente ser uma célula de P. fluorescens. Emoutras modalidades, a célula hospedeira pode também ser uma célula de E.coli. Em outra modalidade a célula hospedeira pode ser uma célula eucarió-tica, por exemplo uma célula de inseto, incluindo mas não limitada a umacélula de uma espécies de Spodoptera, Trichoplusia, Drosophila ou Estig-mene, ou uma célula mamífera, incluindo mas não limitada a uma célula mu-rina, uma célula de hamster, um macaco, um primata ou uma célula humana.

Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula dePseudomonad, e pode ser por exemplo um organismo de P. fluorescens.

Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser um membrode qualquer da taxa bacteriana. A célula pode, por exemplo, ser um membrode qualquer espécie de eubactéria. O hospedeiro pode ser um membroqualquer um da taxa: Acidobacteria, Actinobacteira, Aquificae, Bacteroidetes,Chlorobi, Chlamydiae, Choroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferri-bacteres, Deinococcus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria,Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteo-bacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermoto-gae, Thermus (Thermales) ou Verrucomicrobia. Em uma modalidade de umacélula hospedeira eubacteriana, a célula pode ser um membro de qualquerespécie de eubactéria, excluindo Cyanobacteria.

O hospedeiro bacteriano pode também ser um membro dequalquer espécie de Proteobacteria. Uma célula hospedeira proteobacterianapode ser um membro de qualquer um da taxa Alphaproteobacteria, Beta-proteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria ou Epsilonprote-obacteria. Além disso, o hospedeiro pode ser um membro de qualquer um dataxa Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, or Gammaproteobacteria, eum membro de qualquer espécie de Gammaproteobacteria.

Em uma modalidade de um hospedeiro Gammaproteobacteriano,o hospedeiro será o membro de qualquer um da taxa Aeromonadales, Alte-romonadales, Enterobacteriales, Pseudomonadales ou Xanthomonadales; ouum membro de qualquer espécie dos Enterobacteriales ou Pseudomonadales.

Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser da ordem Enterobacteri-ales, a célula hospedeira será um membro da família Enterobacteriaceae, ouum membro de qualquer um dos gêneros Erwinia, Escherichia ou Serratia; ouum membro do gênero Escherichia. Em uma modalidade de uma célulahospedeira da ordem Pseudomonadales, a célula hospedeira será um mem-bro da família Pseudomonadaceae, até mesmo do gênero Pseudomonas.Hospedeiros de proteobacterianos gama incluem os membros das espéciesEscherichia coli e membros das espécies Pseudomonas fluorescens.

Outros organismos de Pseudomonas podem também ser úteis.

Pseudomonads e espécies estritamente relacionadas incluem ProteobacteriaGram (-) Subgrupo 1, que inclui o grupo de Proteobacteria que pertence àsfamílias e/ou gêneros descritos como "Gram-Negative Aerobic Rods andCocei" por R.E. Buchanan e N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Deter-minative Bacteriology, págs. 217-289 (8a ed., 1974) (The Williams & WilkinsCo., Baltimore, MD, USA) (doravante "Bergey (1974)"). A tabela a seguirapresenta estes famílias e gêneros de organismos.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

"Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 1" também inclui Proteobacte-ria que seria classificada neste título de acordo com os critérios usados naclassificação. O título também inclui grupos que foram previamente classifi-cados nesta seção mas não são mais, como os gêneros Acidovorax, Bre-vundimonas, Burkholderia, Hydrogenophaga, Oceanimonas, Ralstonia eStenotrophomonas, o gênero Sphingomonas (e o gênero Blastomonas, delederivado), que foi criado reagrupando organismos pertencentes (e previa-mente chamados espécie de) ao gênero Xanthomonas, ao gênero Acido-monas, que foi criado reagrupando os organismos pertencentes ao gêneroAcetobacíer conforme definido em Bergey (1974). Além disso, hospedeirospodem incluir células do gênero Pseudomonas, Pseudomonas enalia (ATCC14393), Pseudomonas nigrífaciens (ATCC 19375) e Pseudomonas putrefa-ciens (ATCC 8071), que foram reclassificados respectivamente como Alte-romonas haloplanktis, Alteromonas nigrífaciens e Alteromonas putrefaciens.Similarmente, por exemplo, Pseudomonas acidovorans (ATCC 15668) ePseudomonas testosteroni (ATCC 11996) foram reclassificados como Co-mamonas acidovorans e Comamonas testosteroni, respectivamente; ePseudomonas nigrífaciens (ATCC 19375) e Pseudomonas piscicida (ATCC15057) foram reclassificads respectivamente como Pseudoalteromonas ni-grífaciens e Pseudoalteromonas piscicida. "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo1" também inclui Proteobacteria classificadas como pertencentes a qualqueruma das famílias: Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae (agora freqüen-temente chamada pelo sinônimo, o "grupo de Azotobacter" de Pseudomo-nadaceae), Rhizobiaceae e Methylomonadaceae (agora freqüentementechamada pelo sinônimo, "Methylococcaceae"). Conseqüentemente, alémdaqueles gêneros do contrário descritos aqui, outros gêneros de Proteobac-terial caindo dentro de "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 1" incluem: 1)bactérias do grupo de Azotobacter do gênero Azorhizophilus; bactérias dafamília Pseudomonadaceae dos gêneros Cellvibrío, Oligella e Teredinibacter,3) bactérias da família Rhizobiaceae dos gêneros Chelatobacter, Ensifer,Liberibacter (também chamado "Candidatus Liberibacter") e Sinorhizobium; e4) bactérias da família Methylococcaceae dos gêneros Methylobacter, Meth-ylocaldum, Methylomicrobium, Methylosarcina e Methylosphaera.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada de"Proteobacteria Gram (-) Subgrupo 2". "Proteobacteria Gram (-) Subgrupo 2" édefinido como o grupo de Proteobacteria dos gêneros a seguir (com os nú-meros totais das cepas depositadas publicamente disponíveis listadas nocatálogo destes indicadas entre parêntese, todas depositadas na ATCC,exceto como do contrário indicado): Acidomonas (2); Acetobacter (93); Glu-conobacter (37); Brevundimonas (23); Beijerinckia (13); Derxia (2); Brucella(4); Agrobacterium (79); Chelatobacter (2); Ensifer (3); Rhizobium (144); Si-norhizobium (24); Blastomonas (1); Sphingomonas (27); Alcaligenes (88);Bordetella (43); Burkholderia (73); Ralstonia (33); Acidovorax (20); Hycyro-genophaga (9); Zoogloea (9); Methylobacter (2); Methylocaldum (1 emNCIMB); Methylococcus (2); Methylomicrobium (2); Methylomonas (9); Metf?-ylosarcina (1); Methylosphaera; Azomonas (9); Azorhizophilus (5); >Azofo-bacter (64); Cellvibrio (3); Oligella (5); Pseudomonas (1139); Francisella (4);Xanthomonas (229); Stenotrophomonas (50); e Oceanimonas (4).

Espécies de célula hospedeira exemplares de "ProteobacteriaGram (-) Subgrupo 2" incluem, mas não são limitadas às bactérias a seguir(com os números de depósito de ATCC ou outros de cepa(s) exemplar(es)destas mostrados entre parêntese): Acidomonas methanolica (ATCC 43581);

Acetobacter aceti (ATCC 15973); Gluconobacter oxidans (ATCC 19357);

Brevundimonas diminuta (ATCC 11568); Beijerinckia indica (ATCC 9039 eATCC 19361); Derx/a gumrnosa (ATCC 15994); Brucella melitensis (ATCC23456), Brucella abortus (ATCC 23448); Agrobacterium tumefaciens (ATCC23308), Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358), Agrobacterium rhizogenes(ATCC 11325); Chelatobacter heintzii (ATCC 29600); Ens/fer adhaerens(ATCC 33212); Rhizobium leguminosarum (ATCC 10004); Sinorhizobiumfredii (ATCC 35423); Blastomonas natatoria (ATCC 35951); Sphingomonaspaucimobilis (ATCC 29837); Alcaligenes faecalis (ATCC 8750); Bordetellapertussis (ATCC 9797); Burkholderia cepacia (ATCC 25416); Ralstonia pic-kettii (ATCC 27511); Acidovorax facilis (ATCC 11228); Hydrogenophaga fiava(ATCC 33667); Zoogloea ramigera (ATCC 19544); Methylobacter luteus(ATCC 49878); Methylocaldum gracile (NCIMB 11912); Methylococcus cap-sulatus (ATCC 19069); Methylomicrobium agile (ATCC 35068); Methylomo-nas methanica (ATCC 35067); Methylosarcina fibrata (ATCC 700909); Meth-ylosphaera hansonii (ACAM 549); Azomonas agilis (ATCC 7494); Azorhizo-philus paspali (ATCC 23833); Azotobacter chroococcum (ATCC 9043); Cell-vibrio mixtus (UQM 2601); Oligella urethralis (ATCC 17960); Pseudomonasaeruginosa (ATCC 10145), Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858); Fran-cisella tularensis (ATCC 6223); Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637);Xanthomonas campestris (ATCC 33913); e Oceanimonas doudoroffii (ATCC27123).

Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada de'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 3". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 3" édefinida como o grupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Brevundi-monas; Agrobacterium; Rhizobium; Sinorhizobium; Blastomonas; Sphingo-monas; Alcaligenes; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga;Methylobacter, Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Meth-ylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; A-zotobacter, Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter, Francisella;Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada de'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 4". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 4" édefinida como o grupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Brevundi-monas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax;Hydrogenophaga; Methylobacter, Methylocaldum; Methylococcus; Methylo-microbium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; A-zorhizophilus; Azotobacter, Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter,Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada de'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 5". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 5" édefinida como o grupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Methylo-bacter, Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas;Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter,Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter, Francisella; Stenotro-phomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.A célula hospedeira pode ser selecionada de 'ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 6". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 6" é definida como ogrupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Brevundimonas; Blastomo-nas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga;

Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter, Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas;Teredinibacter, Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.

A célula hospedeira pode ser selecionada de 'ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 7". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 7" é definida como ogrupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Azomonas; Azorhizophilus;

Azotobacter, Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter, Stenotro-phomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.

A célula hospedeira pode ser selecionada de 'ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 8". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 8" é definida como ogrupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Brevundimonas; Blastomo-nas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga;Pseudomonas; Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.

A célula hospedeira pode ser selecionada de 'ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 9". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 9" é definida como ogrupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Brevundimonas; Burkholde-ria; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Pseudomonas; Stenotropho-monas; e Oceanimonas.

A célula hospedeira pode ser selecionada de 'ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 10". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 10" é definida comoo grupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Burkholderia; Ralstonia;

Pseudomonas; Stenotrophomonas; e Xanthomonas.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada de'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 11". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 11"é definida como o grupo de Proteobacteria dos seguintes gêneros: Pseudo-monas; Stenotrophomonas; e Xanthomonas. A célula hospedeira pode serselecionada de 'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 12". "ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 12" é definida como o grupo de Proteobacteria dos se-guintes gêneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas. A célula hospedeirapode ser selecionada de 'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 13". "Proteo-bacteria Gram(-) Subgrupo 13" é definida como o grupo de Proteobacteria dosseguintes gêneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas; e Xanthomonas.A célula hospedeira pode ser selecionada de 'Proteobacteria Gram(-) Sub-grupo 14". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 14" é definida como o grupo deProteobacteria dos seguintes gêneros: Pseudomonas e Xanthomonas. Acélula hospedeira pode ser selecionada de 'Proteobacteria Gram(-) Subgrupo15". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 15" é definida como o grupo de Pro-teobacteria do gênero Pseudomonas.

A célula hospedeira pode ser selecionada de 'ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 16". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 16" é definida comoo grupo de Proteobacteria das seguintes espécies de Pseudomonas (com osnúmeros de depósito da ATCC ou outros de cepa(s) exempla(es) mostrada(s)entre parênteses): Pseudomonas abietaniphila (ATCC 700689); Pseudomo-nas aeruginosa (ATCC 10145); Pseudomonas alcaligenes (ATCC 14909);Pseudomonas anguilliseptica (ATCC 33660); Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674); Pseudomonas flavescens (ATCC 51555); Pseudomonasmendocina (ATCC 25411); Pseudomonas nitroreducens (ATCC 33634);Pseudomonas oleovorans (ATCC 8062); Pseudomonas pseudoalcaligenes(ATCC 17440); Pseudomonas resinovorans (ATCC 14235); Pseudomonasstraminea (ATCC 33636); Pseudomonas agarici (ATCC 25941); Pseudomo-nas alcaliplaila; Pseudomonas alginovora; Pseudomonas andersonii; Pseu-domonas asplenii (ATCC 23835); Pseudomonas azelaica (ATCC 27162);Pseudomonas beijerinckii (ATCC 19372); Pseudomonas borealis; Pseudo-monas boreopolis (ATCC 33662); Pseudomonas brassicacearum; Pseudo-monas butanovora (ATCC 43655); Pseudomonas cellulosa (ATCC 55703);Pseudomonas aurantiaca (ATCC 33663); Pseudomonas chlororaphis (ATCC9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); Pseudomonas fragi (ATCC4973); Pseudomonas lundensis (ATCC 49968); Pseudomonas taetrolens(ATCC 4683); Pseudomonas cissicola (ATCC 33616); Pseudomonas coro-nafaciens; Pseudomonas diterpeniphila; Pseudomonas elongata (ATCC10144); Pseudomonas flectens (ATCC 12775); Pseudomonas azotoformans;Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata(ATCC 29736); Pseudomonas exagitaçãoientalis; Pseudomonas fluorescens(ATCC 35858); Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseu-domonas mandelii (ATCC 700871); Pseudomonas marginalis (ATCC 10844);Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens (ATCC 4685); Pseudo-monas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha (ATCC9890); Pseudomonas tolaasii (ATCC 33618); Pseudomonas veronii (ATCC700474); Pseudomonas frederiksbergensis; Pseudomonas geniculata (ATCC19374); Pseudomonas gingeri; Pseudomonas graminis; Pseudomonas gri-montii; Pseudomonas halodenithficans; Pseudomonas halophila; Pseudo-monas hibiscicola (ATCC 19867); Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670);Pseudomonas hydrogenovora; Pseudomonas jessenii (ATCC 700870);Pseudomonas kilonensis; Pseudomonas lanceolata (ATCC 14669); Pseu-domonas Uni; Pseudomonas marginata (ATCC 25417); Pseudomonas me-phitica (ATCC 33665); Pseudomonas denitrificans (ATCC 19244); Pseudor-nonas pertucinogena (ATCC 190); Pseudomonas pictorum (ATCC 23328);Pseudomonas psychrophila; Pseudomonas fulva (ATCC 31418); Pseudo-monas monteilii (ATCC 700476); Pseudomonas mosselii; Pseudomonas ory-zihabitans (AT CC 43272); Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 700383);

Pseudomonas putida (ATCC 12633); Pseudomonas reactans; Pseudomonasspinosa (ATCC 14606); Pseudomonas balearica; Pseudomonas luteola(ATCC 43273); Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588); Pseudomonas amyg-dali (ATCC 33614); Pseudomonas avellanae (ATCC 700331); Pseudomonascaricapapayae (ATCC 33615); Pseudomonas cichorii (ATCC 10857); Pseu-domonas ficuserectae (ATCC 35104); Pseudomonas fuscovaginae; Pseu-domonas meliae (ATCC 33050); Pseudomonas syringae (ATCC 19310);Pseudomonas viridiflava (ATCC 13223); Pseudomonas therrnocarboxidovo-rans (ATCC 35961); Pseudomonas thermotolerans; Pseudomonas thiverva-lensis; Pseudomonas vancouverensis (ATCC 700688); Pseudomonaswisconsinensis; e Pseudomonas xiamenensis.

A célula hospedeira pode ser selecionada da "ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 17". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 17" é definida comoo grupo de Proteobacteria conhecida na técnica como as "Pseudomonadsfluorescentes" incluindo aquelas pertecentes, por exemplo, às seguintes es-pécies de Pseudomonas: Pseudomonas azotoformans; Pseudomonasbrenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata; Pseudomonasexagitaçãoientalis; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas gessardii;Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas marginalis;Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens; Pseudomonas orientalis;Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas tolaasii; ePseudomonas veronii.

A célula hospedeira pode ser selecionada de "ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 18". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 18" é definida comoo grupo de todas as subespécies, variedades, cepas e outras unidadessub-especiais das espécies Pseudomonas fluorescens, incluindo aquelaspertecentes, por exemplo, às seguintes (com os números de depósito deATCC ou outros de cepa(s) exemplar(es) mostrados entre parênteses):Pseudomonas fluorescens biotipo A, também chamada biovar 1 ou biovar I(ATCC 13525); Pseudomonas fluorescens biotipo B, também chamada biovar2 ou biovar II (ATCC 17816); Pseudomonas fluorescens biotipo C, tambémchamada biovar 3 ou biovar III (ATCC 17400); Pseudomonas fluorescensbiotipo F, também chamada biovar 4 ou biovar IV (ATCC 12983); Pseudo-monas fluorescens biotipo G, também chamada biovar 5 ou biovar V (ATCC17518); Pseudomonas fluorescens biovar VI; Pseudomonas fluorescensPf0-1; Pseudomonas fluorescens Pf-5 (ATCC BAA-477); Pseudomonas flu-orescens SBW25; and Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa (NCIMB10462).

A célula hospedeira pode ser selecionada de "ProteobacteriaGram (-) Subgrupo 19". "Proteobacteria Gram (-) Subgrupo 19" é definidacomo o grupo de todas as cepas de Pseudomonas fluorescens biotipo A. Umacepa típica deste biotipo é a cepa de P. fluorescens MB101 (ver patente US N°5.169.760 de Wilcox), e derivados desta. Um exemplo de um derivado desta éa cepa de P. fluorescens MB214, construída inserindo no lócus de asd cro-mossômico de MB 101 (gene de aspartato desidrogenase), uma construçãonativo de E. coli de Placl-lacl-lacZYA (isto é em que PlacZ foi deletado).

Cepas de P. fluorescens adicionais que podem ser usadas napresente invenção incluem Pseudomonas fluorescens Migula e Pseudomo-nas fluorescens Loitokitok, enquanto tendo as designações de ATCC a seguir:

A célula hospedeira pode ser selecionada de "ProteobacteriaGram(-) Subgrupo 19". "Proteobacteria Gram(-) Subgrupo 19" é definida comoo grupo de todas as cepas de Pseudomonas fluorescens biotipo A. Uma cepatípica A típica deste biotipo é cepa de P. fluorescens MB101 (ver Patente USN° 5.169.760 de Wilcox), e derivados destes. Um exemplo de um derivadodeste é a cepa de P. fluorescens MB214, construída inserindo dentro do lócusde asd cromossômico de MB 101 (gene de aspartato desidrogenase), aconstrução nativa de P1acl-lacl-lacZYA de E. coli (isto é em que PlacZ foideletado).

Cepas adicionais de P. Fluorescens que podem ser usadas napresente invenção incluem Pseudomonas fluorescens Migula e Pseudomo-nas fluorescens Loitokitok, tendo as seguintes designações da ATCC: [NCIB8286]; NRRL B-1244; NCIB 8865 cepa C01; NCIB 8866 cepa C02; 1291[ATCC 17458]; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1864; pirrolidina; PW2[ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899]; 13475; NCTC 10038; NRRL B1603[6; IFO 15840]; 52-1C; CCEB 488-A [BU 140]; CCEB 553 [IEM 15/47J; IAM1008 [A1-H-27]; IAM 1055 [AHH-23]; 1 [IFO 15842]; 12 [ATCC 25323; NTH 11;den Dooren de Jong 216]; 18 [IFO 15833; WRRL P-7]; 93 [TR-10]; 108 [52-22;IFO 15832]; 143 [IFO 15836; PL]; 149 [2-40-40; IFO 15838]; 182 [IFO 3081;PJ 73]; 184 [IFO 15830]; 185 [W2 LA]; 186 [IFO 15829; PJ 79]; 187 [NCPPB263]; 188 [NCPPB 316]; 189 [PJ227; 1208]; 191 [IFO 15834; PJ 236; 22/1];194 [Klinge R-60; PJ 253]; 196 [PJ 288]; 197 [PJ 290]; 198 [PJ 302]; 201 [PJ368]; 202 [PJ 372]; 203 [PJ 376]; 204 [IFO 15835; PJ 682]; 205 [PJ 686]; 206[PJ 692]; 207 [PJ 693]; 208 [PJ 722]; 212 [PJ 832]; 215 [PJ 849]; 216 [PJ 885];267 [B-9]; 271 [B-1612]; 401 [C71A; IFO 15831; PJ 187]; NRRL B-3178 [4; IFO15841]; KY 8521; 3081; 30-21; [IFO 3081]; N; PYR; PW; D946-B83 [BU 2183;FERM-P 3328]; P-2563 [FERM-P 2894; IFO 13658]; IAM-1126 [43F]; M-1;A506 [A5-06]; A505 [A5-05-1]; A526 [A5-26]; B69; 72; NRRL B-4290; PMW6[NCIB 11615]; SC 12936; Al [IFO 15839]; F 1847 [CDC-EB]; F 1848 [CDC 93];NCIB 10586; P17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02; 6519E01; N1;SC15208; BNL-WVC; NCTC 2583 [NCIB 8194]; H13; 1013 [ATCC 11251;CCEB 295]; IFO 3903; 1062; ou Pf-5.

Outros hospedeiros adequados incluem aqueles classificados emoutras partes da referência, como Proteobactérias Gram (+). Em uma moda-lidade, a célula hospedeira é um E. coli. A seqüência de genoma para E. colifoi estabelecida para MG1655 de E. coli (Blattner, et al. (1997) The completegenome sequence of Escherichia coli K-12 Science 277(5331): 1453-74) emicroarranjo de DNA estão comercialmente disponíveis para K12 de E. coli(MWG Inc, High Point, NC). E. coli pode ser cultivado em um meio rico comoLuria-Bertani (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCI, 5 g/L de extrato de le-vedura) ou um meio mínimo definido como M9 (6 g/L de Na2HP04, 3 g/L deKH2P04, 1 g/L de NH4CI, 0,5 g/L NaCI, pH 7,4) com uma fonte de carbonoapropriada como 1% de glicose. Habitualmente, uma cultura durante a noitede células de E. coli é diluída e inoculadas em meio fresco rico ou mínimo emum frasco agitador ou um fermentador e crescida a 37°C.

Um hospedeiro pode também ser de origem mamífera, como umacélula derivada de um mamífero incluindo qualquer mamífero humano ounão-humano. Mamíferos podem incluir, mas não são limitados a primatas,macacos, porcino, ovino, bovino, roedores, ungulado, porcos, suínos, ovelha,carneiro, cabras, gado, cervos, mulas, cavalos, macacos, bugios, cachorros,gatos, ratos e camundongos.

Uma célula hospedeira pode também ser de origem de planta.Qualquer planta pode ser selecionada para a identificação de genes e se-qüências reguladoras. Exemplos de alvos de planta adequados para o iso-lamento de genes e seqüências reguladoras incluiriam mas não limitariam aalfafa, maçã, abricó, Arabidopsis, alcachofra, rúcula, aspargos, abacate, ba-nana, cevada, feijões, beterraba, amora-preta, mirtilo, brócolos, cou-ve-de-bruxelas, repolho, óleo de canola, cantalupo, cenoura, mandioca,mamona, couve-flor, aipo, cereja, chicória, coentro, cítrico, clementinas, trevo,coco, café, milho, algodão, oxicoco, pepino, abeto de Douglas, berinjela, en-dívia, escarola, eucalipto, funcho, figos, alho, cabaço, uva, toronja, melãohoneydew, jicama, kiwi, alface, alho-porró, limão, lima, pinheiro-amarelo,linhaça, manga, melão, cogumelo, nectarina, noz, aveia, óleo de palma, óleode colza, quiabo, azeitona, cebola, laranja, uma planta ornamental, palma,mamão, salsa, pastinaca, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui,pinheiro, abacaxi, musa, ameixa, romã, álamo, batata, jerimum, marmelo,pinho, radicchio, rabanete, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinheirodo Sul, feijão-soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba-açucareira, ca-na-de-açúcar, girassol, batata-doce, liquidambar, mexerica, chá, tabaco, to-mate, triticale, grama, nabo, uma videira, melancia, trigo, inhames e abobrinha.

Em algumas modalidades, plantas úteis no processo são Arabidopsis, milho,trigo, feijão-soja e algodão.

Para expressão de uma proteína ou peptídeo recombinante, oupara modulação de um gene compensatório identificado, qualquer promotorde planta pode ser usado. Um promotor pode ser um promotor de RNA po-limerase II de planta. Elementos incluídos em promotores de planta podemser uma caixa de TATA ou caixa de Goldberg-Hogness, tipicamente posi-cionada aproximadamente 25 a 35 pares de base a montante (5') do sítio deiniciação de transcrição, e a caixa de CCAAT, localizada entre 70 e 100 paresde base a montante. Em plantas, a caixa de CCAAT pode ter uma seqüênciade consenso diferente que a seqüência funcionalmente análoga dos promo-tores mamíferos (Messing et al., Em: Genetic Engineering of Plants, Kosugeet al., eds., págs. 211-227, 1983). Virtualmente além disso, todos promotoresincluem seqüências de ativação ou intensificadores adicionais a montante(Benoist e Chambon, Nature 290:304-310,1981; Gruss et al., Proc. A/aí. Acad.Sei. USA 78:943-947, 1981; e Khoury e Gruss, Ce//27:313-314, 1983) es-tendendo-se por volta de -100 bp a -1.000 bp ou mais a montante do sítio deiniciação de transcrição.

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA OU PEPTÍDEO RECOMBINANTE

Como descrito abaixo, uma célula ou organismo hospedeiro podeser criado para expressar proteína ou peptídeo recombinante usando técnicaspadrão. Por exemplo, proteína recombinante pode ser expressada de umvetor ou de um gene exógeno inserido no genoma do hospedeiro. Vetores quepodem ser usados para expressar proteínas exógenas são bem conhecidosna técnica e são descritos abaixo. Genes para expressar proteína ou peptídeorecombinante podem também ser inseridos no genoma usando técnicas comorecombinação homóloga ou heteróloga, como descritas abaixo.

A proteína ou peptídeo recombinante pode ser expressado apósindução com um composto químico sob expressão de um gene endógeno oude produto de gene. A proteína recombinante pode também ser expressaquando a célula hospedeira for colocada em um ambiente particular. Ele-mentos promotores específicos são descritos abaixo. Estes incluem, mas nãosão limitados a, promotores que podem ser induzidos sob tratamento da cé-lula com químicas como IPTG, benzoato ou antranilato.

PROTEÍNAS/PEPTÍDEOS RECOMBINANTES

A célula hospedeira foi projetada para expressar uma proteína oupeptídeo recombinante. Este pode ser de qualquer espécie e de qualquertamanho. Porém, em certas modalidades, a proteína ou peptídeo recombi-nante é uma proteína ou peptídeo terapeuticamente útil. Em algumas moda-lidades, a proteína pode ser uma proteína mamífera, por exemplo uma pro-teína humana, e pode ser, por exemplo, um fator de crescimento, uma citocina,um quimiocina ou uma proteína de sangue. A proteína ou peptídeo recom-binante pode ser expressado primariamente em uma forma inativa na célulahospedeira. Em certas modalidades, a proteína ou peptídeo recombinante émenos que 100 kD, menos que 50 kD ou menos que 30 kD em tamanho. Emmodalidades de ceratina, a proteína ou peptídeo recombinante é um peptídeode pelo menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos.

Vetores de expressão existentes permitem a produção de prote-ína recombinante em E. coli. Para todos estes sistemas de expressão deproteína procedimentos de clonagem rotineiros como descritos mais cedopodem ser seguidos (Sambrook, et al. (2000) Molecular cloning: A laboratorymanual, terceira edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Cold Spring HarborLaboratory Press).

O sistema expressão Champion® pET fornece um nível alto deprodução de proteína. Expressão é induzida do promotor de T7lac forte. Estesistema tira proveito da atividade alta e especificidade da bacteriófago T7RNA polimerase para transcrição de nível alto do gene de interesse. O ope-rador de lac localizado na região de promotor fornece regulação mais firmeque os vetores baseados em T7 tradicionais, melhorando a estabilidade doplasmídeo e viabilidade da célula (Studier, F. W. e B. A. Moffatt (1986) Use ofbacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression ofcloned genes Journal of Molecular Biology 189(1): 113-30; Rosenberg, et al.(1987) Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA poly-merase Gene 56(1): 125-35). O sistema de expressão de T7 usa o promotorde T7 e T7 RNA polimerase (T7 RNAP) para transcrição de nível alto do genede interesse. Expressão de nível alto é alcançada em sistemas de expressãode T7 porque o T7 RNAP é mais processiva que E. coli RNAP nativa e é de-dicada à transcrição do gene de interesse. Expressão do gene identificado éinduzida fornecendo uma fonte de T7 RNAP na célula hospedeira. Isto é rea-lizado usando um hospede de E. coli de BL21 contendo uma cópia cromos-sômica do gene de T7 RNAP. O gene de T7 RNAP está sob o controle dopromotor lacUV 5 que pode ser induzido por IPTG. 17 RNAP é expressado emindução e transcreve o gene de interesse.

O sistema de expressão de pBAD permite expressão firmementecontrolada, titulável da proteína recombinante através da presença de fontesde carbono específicas como glicose, glicerol e arabinose (Tight regulation,modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinosePBAD promote" Journal of Bacteriology 177(14): 412130). Os vetores depBAD são projetados exclusivamente para dar controle preciso nos níveis deexpressão. Expressão de gene heterólogo dos vetores de pBAD é iniciada nopromotor de araBAD. O promotor é positiva e negativamente regulado peloproduto do gene de araC. AraC é um regulador transcripcional que forma umcomplexo com L-arabinose. Na ausência de L-arabinose, o dímero de AraCbloqueia a transcrição. Para ativação transcripcional máxima dois eventos sãorequeridos: (i.) L-arabinose ligue a AraC permitindo a transcrição começar, (ii.)

O complexo de proteína de ativador de cAMP (CAP)-cAMP liga ao DNA eestimula a ligação de AraC na localização correta da região de promotor.

O sistema de expressão de trc permite nível alto, expressão re-gulada em E. coli do promotor de trc. Os vetores de expressão de trc foramotimizados para expressão de genes eucarióticos em E. coli. O promotor detrc é um promotor híbrido forte derivado dos promotores triptofano (trp) elactose (lac). Ele é regulado pelo operador de lacO e o produto do gene delacQ (Brosius, J. (1984) Toxicity of an overproduced foreign gene product inEscherichia coli and its use in plasmid vectors for the selection of transcriptionterminators Gene 27(2): 161-72).

A invenção também inclui a célula hospedeira recombinantemelhorada que é produzida pelo processo reivindicado. Em uma modalidade,a invenção inclui uma célula produzida pelo processo descrito. Em outramodalidade, a invenção inclui uma célula ou organismo hospedeiro que ex-pressa uma proteína recombinante que foi geneticamente modificada parareduzir a expressão de pelo menos duas proteases. Em outras modalidades,a invenção inclui uma célula ou organismo hospedeiro que expressa umaproteína recombinante que foi geneticamente modificada para reduzir a ex-pressão de pelo menos uma protease selecionada do grupo que consiste emprodutos de genes de hslV, hsIU, dpX, cIpA e dpB, e em certas submoda-liddes, a célula ou organismo foi modificado para reduzir a expressão de HslVou HsIU. Em certas modalidades, a célula ou organismo hospedeiro modifi-cado expressa uma proteína derivada mamífera recombinante, e pode ex-pressar proteína derivada que pode ser hormônio de crescimento humanopara um humano recombinante. A célula pode ser modificada por qualquertécnica conhecida na técnica, por exemplo por uma técnica em que pelomenos um gene de protease é knock-out do genoma, ou mutando pelo menosum gene de protease para reduzir a expressão de uma protease, ou alterandopelo menos um promotor de pelo menos um gene de protease para reduzirexpressão de uma protease.

Em outra modalidade, hospedeiro ou organismo que expressamuma proteína recombinante que é apresentada que foi geneticamente modi-ficada para aumentar a expressão de pelo menos um, pelo menos dois mo-duladores de dobramentos, ou pelo menos três moduladores de dobramentos.Em certas submodalidades, os moduladores de dobramentos não são subu-nidades de modulador de dobramentos. O modulador de dobramento podeser selecionado do grupo que consiste em produtos de genes de cbpA, htpG,dnaK, dnaJ, fkbP2, groES e groEL, e, em certas submodalidades, pode serhtpG ou cbpA. A célula ou organismo hospedeiro podem, em um exemplonão-limitativo, expressar uma proteína mamífera, como uma proteína humana.

A proteína pode ser hormônio de crescimento humano. O modulador oumoduladores de dobramento podem ser aumentados, por exemplo, incluindoum vetor de expressão como descrito aqui na célula. A expressão de modu-lador de dobramento pode também ser aumentada, por exemplo, mutando umpromotor de um modulador de dobramento ou subunidade de modulador dedobramento. Uma célula ou organismo hospedeiro que expressa uma prote-ína recombinante pode também ser geneticamente modificado para aumentara expressão de pelo menos um modulador de dobramento e diminui a ex-pressão de pelo menos uma protease ou proteína de protease. Organismoscompreendendo uma ou mais células produzidas pelo processo descrito es-tão também inclusos na invenção.

ETAPA II: ANÁLISE DE UM PERFIL GENÉTICO PARA IDENTIFICAR UMGENE OU PRODUTO DE GENE COMPENSATÓRIO QUE É EXPRESSADOEM UM NÍVEL MAIS ALTO NA CÉLULA RECOMBINANTE

O processo da invenção inclui analisar um perfil genético da cé-lula recombinante para identificar um gene compensatório ou produto de geneque são expressados a um nível mais alto na célula recombinante que em ouuma célula hospedeira que não foi modificada para expressar a proteína re-combinante ou uma célula recombinante que não estão expressando a pro-teína recombinante.

Um "perfil genético" como aqui usado pode incluir genes em umgenoma, mRNA transcreveram de genes no genoma ou cDNA derivaram demRNA transcrito de genes no genoma. Um perfil genético pode também in-cluir produtos de transcrição que foram modificados por uma célula comovariantes de encaixe de genes em sistemas eucarióticos, ou proteínastransladadas dos genes em um genoma, incluindo proteínas que são modi-ficadas pela célula ou transladadas de variantes de encaixe de mRNA trans-ladado do genoma. Um perfil genético é significado referir-se somente à aná-lise simultânea de entidades múltiplas, como em um arranjo ou outro sistemade multiplexação, incluindo análise de borrão simultânea múltipla ou croma-tografia de coluna com pares de ligação de múltiplos ligados ao pacote. Deacordo com a invenção, pelo menos 5, 10, 25, 50, 70, 80, 90 ou 100 ou maisgenes ou produtos de gene são analisados simultaneamente.

TRANSCRIPTOMA

Em uma modalidade, o perfil genético analisado é um perfil detranscriptoma. Um transcriptoma completo refere-se ao conjunto completo detranscrições de mRNA produzidas pelo genoma de uma só vez. Ao contráriodo genoma, o transcriptoma é dinâmico e varia consideravelmente em cir-cunstâncias divergentes devido aos padrão diferentes de expressão de gene.

Transcriptômicos, o estudo do transcriptoma, é um meio inclusivo de identi-ficar padrão de expressão de gene. O transcriptoma analisado pode incluir oconjunto conhecido completo de genes transcritos, isto é o conteúdo demRNA ou cDNA correspondente de uma célula ou organismo hospedeiro dehospedeiro. O cDNA pode ser uma cadeia de nucleotídeos, um polinucleotí-deo, nucleotídeo, molécula de ácido nucléico isolados ou qualquer fragmentoou complemento destes que originou recombinante ou sinteticamente e ébifilamentar ou unifilamentar, de codificação e/ou de não-codificação, uméxon ou um íntron de uma molécula de DNA genômica, ou combinado comcarboidrato, lipídios, proteína ou elementos ou substâncias inorgânicas. Acadeia de nucleotídeo pode ser pelo menos 5, 10, 15, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90 ou 100 nucleotídeos em comprimento. O transcriptoma pode também in-cluir apenas uma porção do conjunto conhecido de transcrições genéticas.Por exemplo, o transcriptoma pode incluir menos que 98%, 95, 90, 85, 80, 70,60 ou 50% das transcrições conhecidas em um hospedeiro. O transcriptomapode também ser alvejado a um conjunto específico de genes.

Em uma modalidade, o processo de triagem pode incluir triagemusando um arranjo ou um microarranjo para identificar um perfil genético. Emoutra modalidade, o perfil de transcriptoma pode ser analisado usando pro-cessos conhecidos como hibridização em ensaios de borrão como northernblots. Em outra modalidade, o processo pode incluir processos com base emPCR como RT-PCR que podem quantificar a expressão de um conjunto par-ticular de genes. Em uma modalidade da invenção, um gene identificado, porexemplo uma proteína de modulador de dobramento (FM) ou proteína deprotease, isto é uma protease, peptidase, ou polipeptídeo ou co-fator asso-ciado, é identificada por um processo de triagem de processamento alto.

O processo pode incluir analisar o perfil de transcriptoma usandoum microarranjo ou técnica equivalente. Nesta modalidade, o microarranjopode incluir pelo menos uma porção do genoma transcrito da célula hospe-deira, e tipicamente inclui os pares de ligação para amostras de genes de pelomenos 50% dos genes transcritos do organismo. Mais tipicamente, o micro-arranjo ou técnica equivalente inclui os pares de ligação para amostras depelo menos 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% dos genes transcritos nogenoma da célula hospedeira. Porém, em uma modalidade separada, o mi-croarranjo pode incluir os pares de ligação para um subconjunto selecionadode genes do genoma, incluindo mas não limitados a, genes de protease pu-tativos ou genes de modulador de dobramento putativos. Um microarranjo outécnica equivalente pode tipicamente também incluir os pares de ligação paraum conjunto dê genes que são usados como controles, como genes de ma-nutenção. Um microarranjo ou técnica equivalente pode também incluir genescrescidos em cachos em grupos como genes que codificam para proteínasdegradativas, moduladores e co-fatores de dobramentos, proteínas metabó-licas como proteínas envolvidas em metabolismo de glicose ou aminoácido ousíntese de nucleobase, fatores de transcrição, fatores de estabilização deácido nucléico, genes regulados de sinal extracelular como cinases e recep-tores ou proteínas de andaime.

Um microarranjo é em geral formado ligando um número grandede pares de ligação distintos que podem incluir polinucleotídeos, aptameros,químicas, anticorpos ou outras proteínas ou peptídeos a um suporte sólidocomo um microfatia, lâmina de vidro ou outros, em um padrão definido.Contatando o microarranjo com uma amostra obtida de uma célula de inte-resse e detectando a ligação dos pares de ligação expressos na célula quehibridam com as seqüências na fatia, o padrão formado pelos polinucleotí-deos de hibridização permite a identificação de genes ou agrupamentos degenes que são expressados na célula. Além disso, onde cada membro ligadoao suporte sólido for conhecido, a identidade dos pares de hibridização comos da amostra de ácido nucléico pode ser identificada. Uma tecnologia deresistência de microarranjo é que permite a identificação da expressão degene de diferencial simplesmente comparando os padrão de hibridização.

Exemplos de processos de triagem de processamento alto in-cluem hibridização de mRNA de célula hospedeira ou cDNA substancialmentecorrespondente, para um/uns arranjo(s) hidrolizável(is) ou microarranjo(s). Oarranjo ou microarranjo pode ser um ou mais arranjo(s) de oligômeros oupolímeros de ácido nucléico ou de análogos de ácido nucléico. Em umamodalidade, o(s) arranjo(s) ou microarranjo(s) será(ão) independente ou co-letivamente um/uns arranjo(s) ou microarranjo(s) amplo(s) em genoma decélula hospedeira, contendo uma população de oligômeros ou polímeros deácido nucléico ou de análogos de ácido nucléico cujas seqüências de nucle-otídeo são hidrolizáveis em porções representativas de todos os genes co-nhecidos codificar ou prognosticados como codificando FMs na cepa de cé-lula hospedeira ou todos os genes conhecidos codificar ou prognosticadoscodificar proteases ou proteínas de protease na cepa de célula hospedeira.Um microarranjo amplo em genoma inclui seqüências que ligam a uma porçãorepresentativa de todas das seqüências de estrutura de leitura aberta (ORF)conhecidas ou prognosticadas, como de mRNA ou cDNA correspondente dohospedeiro.

As seqüências de oligonucleotídeo ou análogos no arranjo tipi-camente hibridam com as seqüências de mRNA ou de cDNA correspondentesda célula hospedeira e tipicamente compreendem uma seqüência de nucleo-tídeo complementar a pelo menos uma porção de uma seqüência de mRNAou cDNA hospedeira, ou uma seqüência homóloga à seqüência de mRNA oude cDNA hospedeira. Filamentos de DNA simples com seqüências comple-mentares podem emparelhar entre si e formarem moléculas bifilamentares.Microarranjo em geral aplicam-se ao princípio de hibridização em um formatoaltamente paralelo. Em vez de um identificado, milhares de identificados po-tenciais diferentes podem ser arranjados em um suporte sólido de miniatura.

Em vez de uma única sonda de DNA marcado, uma mistura complexa demoléculas de DNA marcado é usada, preparada do RNA de um tipo de célulaou tecido particular. As abundâncias de moléculas de DNA marcado indivi-duais nesta sonda complexa tipicamente refletem os níveis de expressão dosgenes correspondentes. Em um processo simplificado, quando hibridarcom oarranjo, as seqüências abundantes gerarão sinais fortes e seqüências rarasgerarão sinais fracos. A resistência do sinal pode representar o nível de ex-pressão de gene na amostra original.

Em uma modalidade, um arranjo ou microarranjo amplo em ge-noma será usado. Em uma modalidade, o arranjo representa mais que 50%das estruturas de leitura aberta no genoma do hospedeiro, ou mais que 55%,60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 99% ou 100% das estruturas de leitura aberta conhecidas nogenoma. O arranjo pode também representar pelo menos uma porção de pelomenos 50% das seqüências conhecidas codificar proteína na célula hospe-deira. Em modalidades separadas, o arranjo representa mais que 50% dosgenes ou genes putativos da célula hospedeira, ou mais que 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou 100% dos genes conhecidos ou genes putativos. Em uma modalidade,mais de um oligonucleotídeo ou análogo podem ser usados para cada geneou seqüência de gene putativo ou estrutura de leitura aberta. Em uma moda-lidade, estes múltiplos oligonucleotídeos ou análogos representam porçõesdiferentes de um gene conhecido ou seqüência de gene putativo. Para cadagene ou seqüência de gene putativo, de cerca de 1 a cerca de 10000 ou de 1a cerca de 100 ou de 1 a cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20,15, 10 ou menosoligonucleotídeos ou análogos podem estar presentes no arranjo.

Um microarranjo ou um arranjo ou microarranjo amplo em ge-noma completo pode ser preparado de acordo com qualquer processo co-nhecido na técnica, com base no conhecimento das(s) seqüência(s) do ge-noma de célula hospedeira, ou das seqüências de codificação propostas nogenoma, ou com base no conhecimento das seqüências de mRNA expressasna célula hospedeira ou organismo hospedeiro.

Para tipos diferentes de células hospedeiras, o mesmo tipo demicroarranjo pode ser aplicado. Os tipos de microarranjo incluem microarranjode DNA complementar (cDNA) (Schena, M., et al. (1995) Quantitative moni-toring of gene expression patterns with a complementar/ DNA microarray.Science 270:467-70) e microarranjo de oligonucleotídeo (Lockhart, et al.(1996) Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotidearrays. A/aí Biotechnol 14:1675-80). Para microarranjo de cDNA, o fragmentode DNA de uma estrutura de leitura aberta parcial ou inteira é impresso naslâminas. As características de hibridização podem ser diferentes ao longo dalâmina porque porções diferentes das moléculas podem ser impressas emlocalizações diferentes. Para os arranjos de oligonucleotídeo, oligos 2080 merpodem ser sintetizados ou in situ (na fatia) ou por síntese convencional se-guida por imobilização na fatia, porém em geral todas as sondas são proje-tadas para ser similares com respeito à temperatura de hibridização e afini-dade de ligação (Butte, A. (2002) The use and analysis of microarray data. A/arRev Drug Discov 1:951 -60).

Na análise do perfil de transcriptoma, os oligômeros ou polímerosde ácido nucléico ou de análogos de ácido nucléico podem ser RNA, DNA, ouum análogo de RNA ou DNA. Tais análogos de ácido nucléico são conhecidosna técnica e incluem, por exemplo: ácidos nucléicos de peptídeo (PNA); á-cidos nucléicos de arabinose; ácidos nucléicos de altritol; ácidos nucléicosligados (BNA), por exemplo, ácidos nucléicos ligados a 2'-0,4'-C-etileno eácidos nucléicos ligados a 2'-0,4'-C-metileno; ácidos nucléicos de cicloexenila;ácidos nucléicos com base em nucleotídeo 2',5'-ligado; ácidos nucléicos demorfolino (unidades de morfolino nucleobase-substituídas conectadas, porexemplo, através de ligações de fosforodiamidato); análogos de ácido nu-cléico substituídos na cadeia principal, por exemplo, ácidos nucléicos2-substituídos, em que pelo menos um dos átomos de carbono 2' de um ácidonucléico do tipo oligo ou polissacarídeo ou análogo é independentementesubstituído com, por exemplo, qualquer um de um grupo halo, tio, amino,alifático, oxialifático, tioalifático ou aminoalifático (em que alifático é tipica-mente C1-C10 alifático).

Oligonucleotídeos ou análogos de oligonucleotídeo no arranjopodem ser de tamanho uniforme e, em uma modalidade, podem ser cerca de10 a cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 20 a cerca de 1000, 20 a cerca de500, 20 a cerca de 100, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 40,cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de100 nucleotídeos de comprimento.

O arranjo de sondas de oligonucleotídeo pode ser um arranjo dedensidade alta compreendendo mais que cerca de 100, ou mais que cerca de1.000 ou mais sondas de oligonucleotídeo diferentes. Tais arranjos de den-sidade alta podem compreender uma densidade de sonda de mais que cercade 60, mais em geral maior que cerca de 100, mais em geral maior que cercade 600, freqüentemente maior que cerca de 1000, mais freqüentemente maiorque cerca de 5.000, o mais freqüentemente maior que cerca de 10.000, tipi-camente maior que cerca de 40.000 mais tipicamente maior que cerca de100.000, e em certas circunstâncias é maior que cerca de 400.000 sondas deoligonucleotídeo diferentes por cm2 (onde oligonucleotídeos diferentes refe-rem-se aos oligonucleotídeos que têm seqüências diferentes). As sondas deoligonucleotídeo variam de cerca de 5 a cerca de 500, ou cerca de 5 a 50, oude cerca de 5 a cerca de 45 nucleotídeos, ou de cerca de 10 a cerca de 40nucleotídeos e o mais tipicamente de cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeosem comprimento. Arranjos particulares contêm sondas que variam de cercade 20 a cerca de 25 oligonucleotídeos em comprimento. O arranjo podecompreender mais que 10, ou mais que 50, ou mais que 100, e tipicamentemais de 1000 sondas de oligonucleotídeo específicas para cada gene identi-ficado. Em uma modalidade, o arranjo compreende pelo menos 10 sondas deoligonucleotídeo diferentes para cada gene. Em outra modalidade, o arranjotem 20 ou menos oligonucleotídeos complementares a cada gene. Emborauma superfície de arranjo planar seja típica, o arranjo pode ser fabricado emuma superfície de virtualmente qualquer forma ou até mesmo em superfíciesmúltiplas.

O arranjo pode também compreender sondas de controle dedisparidade. Onde tais controles de disparidade estão presentes, a etapa dequantificação pode compreender calcular a diferença em intensidade do sinalde hibridização entre cada uma das sondas de oligonucleotídeo e sua sondade controle de disparidade correspondente. A quantificação pode tambémcompreender calcular a diferença média em intensidade do sinal de hibridi-zação entre cada uma das sondas de oligonucleotídeo e sua sonda de con-trole de disparidade correspondente para cada gene.

Em alguns formatos de ensaio, a sonda de oligonucleotídeo podeser presa, isto é, através de ligação covalente, a um suporte sólido. Arranjosde oligonucleotídeo podem ser quimicamente sintetizados através de pro-cessos de síntese de polímero imobilizado paralela ou por processos desíntese de polímero de direcionada por luz, por exemplo em substratos depoli-L-lisina como lâminas. Arranjos quimicamente sintetizados são vantajo-sos em que a preparação da sonda não requer clonagem, uma etapa deamplificação de ácido nucléico ou síntese enzimática. O arranjo inclui sondasde teste que são sondas de oligonucleotídeo cada uma destas tem uma se-qüência que é complementar a uma subseqüência de um dos genes (ou omRNA ou o cRNA antissense correspondente) cuja expressão é para serdetectada. Além disso, o arranjo pode conter controles de normalização,controles de disparidade e controles do nível de expressão como descritosaqui.

Um arranjo pode ser projetado para incluir um oligonucleotídeo dehibridização por gene conhecido em um genoma. Os oligonucleotídeos oupares de ligação equivalentes podem ser 5'-amino modificados para suportarligação covalente às lâminas revestidas com epóxi. Os oligonucleotídeospodem ser projetados para reduzir hibridização cruzada, por exemplo redu-zindo a identidade de seqüência para menos que 25% entre os oligonucleo-tídeos. Em geral, a temperatura de fundição dos oligonucleotídeos é anali-sada antes de o projeto do arranjo assegurar teor de GC consistente e Tm, e aestrutura secundária dos pares de ligação de oligonucleotídeo é otimizada.Para perfilação de transcriptoma, a estrutura secundária é tipicamente mini-mizada. Em uma modalidade, cada oligonucleotídeo é impresso em pelomenos duas localizações diferentes na lâmina para aumentar a precisão.Oligonucleotídeos de controle podem também ser projetados com base nasseqüências de diferentes espécies que a célula ou organismo hospedeiropara mostrar ligação de base.

As amostras no perfil genético podem ser analisadas individual-mente ou agrupadas em agrupamentos. Os agrupamentos podem tipica-mente ser agrupados por similaridade em expressão de gene. Em uma mo-dalidade, os agrupamentos podem ser individualmente agrupados como ge-nes que são regulados a uma extensão similar em uma célula hospedeira. Osagrupamentos podem também incluir grupos de genes que são regulados auma extensão similar em uma célula hospedeira recombinante, por exemplogenes que são sobre-regulados ou sub-regulados a uma extensão similarcomparada a uma célula hospedeira ou uma célula modificada ou uma inal-terada. Os agrupamentos podem também incluir grupos relacionados porestrutura de gene ou de proteína, função ou, no caso de um arranjo detranscriptoma, por colocação ou agrupamento dos pares de ligação aos genesno genoma do hospedeiro. Grupos de pares de ligação ou grupos de genes ouproteínas analisados podem incluir genes selecionados de, mas não limitadosa: genes que codificam para proteases putativas ou conhecidas, co-fatores deproteases ou proteínas similares à protease; moduladores de dobramentos,co-fatores de moduladores de dobramentos ou proteínas que poderiam me-lhorar o dobramento ou solubilidade da proteína; fatores de transcrição; pro-teínas envolvidas em estabilidade de ácido nucléico ou iniciação translacional;cinases; receptores extracelulares ou intracelulares; enzimas metabólicas;co-fatores metabólicos; proteínas de envelope; fatores de sigma; proteínasligadas à membrana; proteínas de transmembrana; proteínas associadas àmembrana e genes de manutenção.

PROTEOMA

Em outra modalidade, o perfil genético analisado é um perfil deproteoma. O proteoma de um hospedeiro é o conjunto completo de proteínasproduzidas pelo genoma de uma só vez. O proteoma é em geral muito maiscomplexo que o genoma ou o transcriptoma porque cada proteína pode serquimicamente modificada após a síntese. Muitas proteínas são clivadas du-rante a produção, fosforiladas, acetiladas, metiladas, ou tem grupos carboi-drato acrescentados a elas, dependendo da célula hospedeira. O proteoma étambém muito dinâmico. Proteômicos, o estudo do proteoma, pode abrangervários aspectos diferentes da estrutura de proteína, expressão de proteína efunção. As técnicas para análise de proteoma não são tão diretas quanto àsusadas em transcriptômicos. Porém, uma vantagem dos proteômicos é queas moléculas funcionais da célula estão sendo estudadas.

O processo pode incluir técnicas que medem os níveis de ex-pressão de proteína, interações de proteína-proteína, interações de proteí-na-molécula pequena ou atividades enzimáticas. Em uma modalidade, oproteoma é analisado usando um processo de triagem que inclui medição detamanho de certas proteínas, tipicamente usando espectrometria de massa.

Em uma modalidade, a técnica para analisar o perfil de proteoma inclui hibri-dização de um anticorpo com uma proteína de interesse. Por exemplo, oprocesso pode incluir processos de western blot como conhecido na técnicaou pode incluir cromatografia de coluna. O processo pode também incluirprocessos padrão como triagem de Elisa conhecida na técnica. O processopode também incluir ligação de pares de ligação modificados de ácido nu-cléico que podem ser aptâmeros ou podem ser proteína ou os pares de li-gação química para proteínas ou fragmentos de peptídeo no proteoma e umprocesso de triagem pode incluir amplificação dos ácidos nucléicos. O pro-cesso pode também incluir compostos químicos que ligam às proteínas oufragmentos de proteínas em um proteoma e o processo pode incluir mediçãoda ligação através de meios químicos. A medição pode também incluir me-dição dos produtos de reação em uma reação química, ou por ativação de umfluoróforo. Técnicas como espectrometria de massa em combinação comferramentas de separação como eletroforese em cromatografia líquida em gelbidimensional ou multidimensional, pode também ser usado no processo.Tipicamente, o processo inclui uma técnica de triagem de processamento alto.

O processo da invenção pode incluir analisar o perfil de proteomausando, por exemplo, eletroforese bidimensional. Este é um método para aseparação e identificação das proteínas em uma amostra através de deslo-camento em duas dimensões orientadas em ângulos retos um ao outro. Istopermite a amostra separar em uma área maior, aumentando a resolução decada componente. A primeira dimensão é tipicamente com base na carga deuma molécula particular enquanto a segunda dimensão pode ser com base notamanho de uma molécula. Na primeira dimensão, as proteínas são resolvi-das de acordo com seus pontos isoelétricos usando eletroforese de gradientede pH imobilizado (IPGE), focalização isoelétrica (IEF) ou eletroforese degradiente de pH de não-equilíbrio. Sob condições padrão de temperatura econcentração de uréia, os pontos de focalização observados da grande mai-oria das proteínas estritamente aproxima-se dos pontos isoelétricos prog-nosticados calculados das composições de aminoácido das proteínas. Emgeral, a primeira etapa após a preparação de uma amostra do hospedeiroinclui operar a amostra junto de um gradiente de pH, um processo conhecidocomo focalização isoelétrico. Os gradientes de pH podem ser gerados a-crescentando anfólitos a um gel de acrilamida. Esta é uma mistura de espé-cies anfotéricas com uma faixa de valores de pl. Os gradientes de pH podemtambém ser gerados adicionando Immobilines que é similar aos anfólitos masforam imobilizados dentro do gel de poliacrilamida produzindo um gradientede pH imobilizado que não necessita ser pré-focalizado.

A segunda dimensão em eletroforese bidimensional pode serseparação por tamanho de proteínas. As proteínas podem ser separadas deacordo com seu peso molecular aproximado usando poli-acrilamida-eletro-forese de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A técnica é extensamenteusada e conhecida na técnica. A idéia básica é revestir as proteínas com umdetergente (SDS) que reveste todas as proteínas em uma amostra e negati-vãmente as carrega. As proteínas são depois submetidas à eletroforese emgel. Os géis podem tipicamente ser géis de acrilamida e pode estar em umgradiente de densidade. A carga colocada no gel empurra as proteínas a-través do gel com base no tamanho. Em eletroforese bidimensional, as pro-teínas separadas podem incluir proteínas de pelo menos 10% do proteoma doorganismo. Mais tipicamente, as proteínas de pelo menos 20%, 30%, 40%,60%, 80% ou 90% das proteínas no proteoma da célula hospedeira são se-paradas e analisadas através de técnicas como tingimento de proteínas e/ouespectrometria de massa.

O processo da invenção pode também incluir analisar o perfil deproteoma usando um microarranjo. Nesta modalidade, o microarranjo podeincluir os pares de ligação para pelo menos uma porção das proteínas ex-pressas pela célula hospedeira sob condições de crescimento apropriadas, etipicamente inclui os pares de ligação para proteínas de pelo menos 5% doproteoma do organismo. Mais tipicamente, o microarranjo inclui os pares deligação para proteínas de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 60%, 80% ou90% das proteínas no proteoma da célula hospedeira. Os pares de ligaçãopodem ser anticorpos que podem ser fragmentos de anticorpo como frag-mentos de anticorpo de cadeia simples. Os pares de ligação podem tambémincluir aptâmeros que são moléculas incluindo ácidos nucléicos que ligam àsproteínas específicas ou porções de proteínas. Em uma modalidade separada,o microarranjo pode incluir pares de ligação para um subconjunto selecionadode proteínas do proteoma, incluindo, por exemplo, proteínas de proteaseputativas ou moduladores de dobramento putativos. O microarranjo podetipicamente também incluir um conjunto de pares de ligação para proteínasque são usadas como controles. O perfil genético pode ser analisado medindoa ligação das proteínas da célula hospedeira que expressa a proteína oupeptídeo recombinante aos pares de ligação no microarranjo.

O formato de arranjo de proteína mais simples em geral consisteem um número grande de reagentes de captura de proteína ligados àsmanchas definidas em um material de suporte planar. Este arranjo é depoisexposto a uma amostra de proteína complexa. A ligação das proteínas deanalito específicas às manchas individuais pode depois ser monitorada u-sando métodos diferentes. Em casos onde os analitos foram pré-marcadoscom uma tintura fluorescente, a ligação pode ser diretamente monitoradausando um escâner de fluorescência. Freqüentemente o anticorpo no formatodo tipo sanduíche clássico é usado em que dois reagentes de ligação deproteína simultaneamente ligam ao mesmo antígeno: um anticorpo é imobi-lizado sobre a superfície, e o outro é fluorescentemente marcado ou conju-gado com uma enzima que pode produzir um produto fluorescente, lumi-nescente ou colorido quando fornecido com o substrato apropriado.

Anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação de antí-geno são correntemente uma escolha para agentes de captura devido a suaespecificidade alta, afinidade e estabilidade. Eles foram usados em uma va-riedade de ensaios de perfilação de proteína de analito simples clássicoscomo ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA) desde os anossetenta. Adicionalmente, bibliotecas de exibição de fago dos fragmentos deanticorpo oferecem o potencial para produção de anticorpo em escalas pro-teômicas. Estas bibliotecas podem ser usadas para isolar os agentes de li-gação de afinidade alta contra proteína identificada em um prazo significati-vamente mais curto que é possível com processos com base em imunização.Exibição de ribossoma e exibição de mRNA são processos adicionais, com-pletamente in vitro, que contam ligação física das proteínas de biblioteca asuas seqüências de mRNA de codificação. Tais processos têm sido usadoscom sucesso para selecionar reagentes de ligação de afinidade alta paraproteínas identificadas (Wilson, DS, et al. (2001) The use of mRNA display toselect high-affinity protein-binding peptides Proc Nat I Acad Sei USA98:3750-3755). Vários grupos tomaram um método diferente para desen-volver reagentes de captura de proteína de afinidade alta para biofatias deproteína. Por exemplo, os aptâmeros foram usados, que são moléculas deRNA ou DNA unifilamentares que originam de experimentos de seleção invitro (denominados SELEX: evolução sistemática de ligandos por enrique-cimento exponencial) com afinidades altas para proteínas. Um outro desen-volvimento em tecnologias de aptâmero é assim-chamado fotoaptâmeros.

Estas moléculas têm um atributo adicional que intensifica sua utilidade comoreagentes de captura de proteína. Elas carregam o grupo de reticulação fo-toativável 5'-bromodeoxiuridina que, quando ativado por luz UV, pode causarreticulação covalente com as proteínas identificadas ligadas (Petach, H &Gold, L (2002) Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in proteinmicroarrays Curr Opin Biotechnol 13:309-314). O evento de foto-reticulaçãofornece uma segunda dimensão de especificidade similar à ligação de umanticorpo de detecção secundário em um imunoensaio em sanduíche.

Uma ampla variedade de substratos de superfície e químicas deligação foi avaliada pela imobilização de agentes de captura em microarranjode proteína. Um modo para imobilizar as proteínas em um suporte sólidoconta com interações não-covalentes com base em hidrofóbico ou interaçõesde van der Waals, ligação de hidrogênio ou forças eletrostáticas. Exemplos deimobilização eletrostática incluem o uso de materiais como lâminas de vidrorevestidas com nitrocelulose e polilisina ou aminopropil silano. Microarranjosde proteína foram também fabricados por meio de adsorção física sobre assuperfícies de plástico de placas de 96 cavidades. Um exemplo de ligaçãocovalente de proteínas à superfície foi descrito por MacBeath e Schreiber(MacBeath, G & Schreiber, SL(2000) Printing proteins as microarrays for hi-gh-throughput function determination Science 289:1760-1763). Devido à afi-nidade muito alta de estreptavidina para biotina, a imobilização de proteínasbiotiniladas sobre as superfícies de estreptavidina pode ser consideradaquase covalente (Peluso, P et al. (2003) Optimizing antibody immobilizationstrategies for the construction of protein microarrays Anal Biochem312:113-124). Outras estratégias foram descritas (X-ray photoelectron spec-troscopy and radiometry studies of biotin-derivatized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) monolayers on metal oxides (Langmuir) 7313-7322;

Ruiz-Taylor, LA et al. (2001) Monolayers of derivatized poly(L-lysine)-graftedpoly(ethylene glycol) on metal oxides as a class of biomolecular interfacesProc NatlAcad Sei USA 2001, 98:852-857; Espejo A, Bedford MT. (2004)Protein-domain microarrays Processes Mol Biol. 264:173-81; Zhu, H. et al.(2001) Global analysis of protein activities using proteome chips. ScienceExpress).

As amostras no perfil genético podem ser analisadas individual-mente ou agrupados em agrupamentos. Os agrupamentos podem tipica-mente ser agrupados por similaridade em expressão de gene. Em uma mo-dalidade, os agrupamentos podem ser individualmente agrupados comoproteínas que são reguladas a uma extensão similar em uma célula hospe-deira. Os agrupamentos podem também incluir grupos de proteínas que sãoreguladas a uma extensão similar em uma célula hospedeira recombinante,por exemplo, que é sobre-regulado ou sub-regulado a uma extensão similarcomparada a uma célula hospedeira ou uma célula modificada ou uma inal-terada. Os agrupamentos podem também incluir grupos relacionados porestrutura de proteína, função ou processamento. Grupos de pares de ligaçãode proteína em um arranjo, ou grupos de proteínas analisados em um ensaiodiferente como eletroforese bidimensional, podem ser selecionados de, masnão são limitados a: proteases putativas ou conhecidas, co-fatores de pro-teases ou proteínas similares à protease; moduladores de dobramentos,co-fatores de moduladores de dobramentos ou proteínas que poderiam me-lhorar o dobramento ou solubilidade da proteína; fatores de transcrição; pro-teínas envolvida na estabilidade de ácido nucléico ou iniciação translacional;cinases; receptores extracelulares ou intracelulares; enzimas metabólicas;co-fatores metabólicos; proteínas de envelope; e genes de manutenção.

METABOLOMA

Processos de análise proteômica permitem determinar a abun-dância e distribuição de muitas proteínas simultaneamente. Porém, as con-seqüências funcionais de alterações para o proteoma são relatadas apenasindiretamente. Outro método é medir os níveis destas moléculas pequenas,ou metabólitos. Um perfil genético analisado no processo da invenção podedesse modo incluir um perfil metabolômico. Processos para analisar o me-taboloma de um hospedeiro específico incluem cromatografia de gás, cro-matografia líquida de pressão alta e eletroforese capilar para separar meta-bólitos de acordo com várias propriedades química e físicas. As moléculaspodem depois ser identificadas usando processos como espectrometria demassa.

DETECÇÃO/ANÁLISE

O processo inclui analisar um perfil genético para identificar umgene ou produto de gene compensatório que é expressado a um nível maisalto na célula recombinante. Em geral, esta etapa inclui o monitoramento daexpressão (por exemplo detecção e ou quantificação da expressão) de umamultidão de genes ou produtos de gene. A expressão é em geral monitoradadetectando a ligação dos produtos de gene de célula hospedeira para umperfil de transcriptoma, proteoma ou de metaboloma como descrito acima. Aanálise da ligação pode envolver uma comparação da ligação entre uma cé-lula hospedeira recombinante que expressa proteína ou peptídeo recombi-nante e uma célula hospedeira pura ou uma célula hospedeira recombinanteque não expressa a proteína ou peptídeo.

DETECÇÃO

Esta etapa inclui o monitoramento da expressão (por exemplodetecção e ou quantificação da expressão) de uma multidão de genes ouprodutos de gene. A expressão é em geral monitorada detectando a ligaçãodos produtos de gene de célula hospedeira a um perfil de transcriptoma,proteoma ou metaboloma como descrito acima. Tipicamente, pelo menoscerca de 10 genes, ou pelo menos cerca de 100, ou pelo menos cerca de1000 e ou pelo menos cerca de 10.000 genes diferentes podem ser ensaiadosde uma vez. O processo pode envolver fornecer um fundo geral de ácidosnucleicos identificados compreendendo transcrições de RNA de um ou maisdos ditos genes, ou ácidos nucleicos derivados das transcrições de RNA;hibridar o fundo geral de ácidos nucleicos com um arranjo de sondas de oli-gonucleotídeo imobilizadas em uma superfície onde o arranjo compreendemais de 100 oligonucleotídeos diferentes e cada oligonucleotídeo diferenteestá localizado em uma região predeterminada da dita superfície, cada oli-gonucleotídeo diferente é ligado à superfície através de pelo menos umaligação covalente, e as sondas de oligonucleotídeo são complementares àstranscrições de RNA ou ácidos nucleicos derivados das transcrições de RNA;e quantificar os ácidos nucleicos hibridados no arranjo. Uma representaçãopictórica de uma técnica para monitorar a expressão de um produto de geneentre duas amostras é descrita na Figura 12.

O processo pode também envolver fornecer um fundo geral deproteínas celulares. Estes podem ser derivados de lisados celulares que sãofeitos através de células de lise usando detergentes ou tensoativos; usar liseosmótica; usar alterações térmicas, como ciclos de congelamento-desconge-lamento; usar dispositivos mecânicos ou usar alterações de pressão. Tipi-camente as químicas são incluídas no processo de lise de uma célula ousistema de células que inibem certas proteínas, como proteases, particular-mente proteases não-específicas, para limitar a degradação das proteínas.Além disso, lisados de célula são tipicamente mantidos em ou abaixo de 4°C,e podem ser mantidos em ou abaixo de 0°C ou em ou abaixo de 20°C duranteo processamento. Os lisados de célula podem ser separados antes de outroprocessamento, por exemplo por cromatografia de exclusão de tamanho,permuta de íons ou cromatografia de matriz de afinidade como usando HPLC.

Tipicamente, o produto genético identificado, mRNA, cDNA,proteína ou metabólito é marcado com um marcador ou sonda detectável. Omarcador ou sonda pode ser uma ou mais moléculas fluorescentes ou fluo-róforos. Estes podem incluir moléculas comercialmente disponíveis como Cy3e Cy5 ligados, por exemplo, a nucleotídeos particulares que podem ser in-corporados em um cDNA transcritos reverso para fornecer moléculas detec-táveis para triagem. Em uma modalidade, uns primeiros fluoróforos são in-corporados em uma amostra do hospedeiro e um segundo fluoróforo é in-corporado em uma amostra de um hospedeiro expressando proteína oupeptídeo recombinante. Em uma modalidade, o primeiro fluoróforo e segundofluoróforo emitem diferentes comprimentos de onda de luz. Nesta modalidade,a ligação das amostras do hospedeiro e do hospedeiro expressando proteínarecombinante pode ser monitorada no mesmo ensaio. Em outra modalidade,os fluoróforos são excitados com diferentes comprimentos de onda de luz. Emoutra modalidade, o primeiro e segundo fluoróforo é excitado ou emite luz nomesmo comprimento de onda. Nesta modalidade, as amostras do hospedeiroe da proteína recombinante expressando hospedeiro são tipicamente moni-toradas em ensaios diferentes.

O processo pode adicionalmente incluir uma etapa de quantificara hibridização dos ácidos nucléicos ou proteínas ou metabólitos químicosidentificados. A quantificação pode incluir medição dos níveis de transcriçãode um ou mais genes. Tipicamente o fundo geral de ácidos nucléicos identi-ficados é, por exemplo, um em que a concentração dos ácidos nucléicosidentificados (transcrições de pré-mRNA, transcrições de mRNA ou ácidosnucléicos derivados das transcrições de RNA) é proporcional aos níveis deexpressão de genes que codificam aqueles ácidos nucléicos identificados.

Para análise de transcriptoma, o fundo geral de ácidos nucléicospode ser marcado antes, durante ou após hibridização, embora os ácidosnucléicos sejam tipicamente marcados antes da hibridização. Marcações defluorescência são tipicamente usadas, freqüentemente com um fluoróforosimples, e, onde marcação de fluorescência for usada, quantificação dosácidos nucléicos hibridados pode ser por quantificação de fluorescência doácido nucléico hibridado fluorescentemente marcado. Tal quantificação éfacilitada pelo uso de um escâner a laser confocal ou microscópio de fluo-rescência, como um microscópio de fluorescência confocal que pode serequipado com um estágio automatizado para permitir varredura automática doarranjo e que pode ser equipado com um sistema de aquisição de dados pararegistro de medição automatizado e processamento subseqüente da infor-mação de intensidade de fluorescência. Dispositivos para ler tais arranjosincluem os módulos de CloneTracker®, ImaGene®, GeneSight® e a base dedados de GeneDirector®, disponível de Biodiscovery, Inc., El Segundo, Calif.,ou a leitora GeneChip®, disponível de Affymetrix, Santa Clara Inc., Calif. Emuma modalidade, hibridização ocorre em severidade baixa (por exemplo cercade 20°C a cerca de 50°C, ou cerca de 30°C a cerca de 40°C, ou cerca de37°C). Hibridização pode incluir lavagens subseqüentes em severidade pro-gressivamente crescente até um nível desejado de especificidade de hibri-dização ser alcançado.

Quantificação do sinal de hibridização pode ser por quaisquerdispositivos conhecidos a alguém versado na técnica. Porém, em uma mo-dalidade, quantificação é alcançada pelo uso de um escâner de fluorescênciaconfocal. Dados são tipicamente avaliados calculando a diferença em inten-sidade de sinal de hibridização entre cada sonda de oligonucleotídeo e suasonda de controle de disparidade correspondente. Tipicamente, esta dife-rença pode ser calculada e avaliada para cada gene. Certos processos ana-líticos são fornecidos aqui.

Técnicas foram desenvolvidas para preparar sondas de hibridi-zação bacterianas apropriadas (ver, por exemplo Choi et al. (2003) App. Envir.Microbic. 69:4737-4742). Por exemplo, as células podem ser armazenadasem um agente estabilizante de RNA como RNAIater (Ambion, Austin, TX).RNA é em geral purificada em três etapas: (1) isolamento do RNA total, (2)remoção do DNA contaminante e (3) limpeza total do RNA total. RNA totalpode ser isolado e depois misturado com iniciadores de hexâmero aleatórios etranscriptase reversa para fazer o cDNA. Tipicamente pelo menos uma sondafluorescente é incorporada no cDNA. Em uma modalidade, uma sonda fluo-rescente é incorporada, em outra modalidade mais de uma sonda, por e-xemplo 2, 3, 4, 5 ou mais sondas fluorescentes são incorporadas nas mesmasamostras de cDNA ou diferentes. Em um hospedeiro eucariótico, o fundogeral dos ácidos nucléicos identificados pode também ser o mRNA de poliA+total isolado de uma amostra biológica, ou cDNA feito por transcrição reversado RNA ou cDNA de segundo filamento ou RNA transcrita do intermediário decDNA bifilamentar.

Corantes fluorescentes são tipicamente incorporados em molé-culas de cDNA durante a reação de transcrição reversa. Devido à estrutura demRNA diferente entre procariotes (bactérias) e eucariotes (levedura, célulasmamíferas, etc), iniciadores diferentes podem ser usados, porém iniciadoresaleatórios podem ser usados em ambos os casos, e iniciadores de oligo-dTpodem ser usados em eucariotes que tem caudas de poliA. Um processoalternativo é marcação de amino-alila para aumentar a intensidade de sinal.Este processo incorpora análogos de nucleotídeo caracterizando um grupoquimicamente reativo ao qual um corante fluorescente pode ser ligado após areação de transcrição reversa (Manduchi, E., et al. (2002) Comparison ofdifferent labeling processes for two-channel high-density micro array experi-ments. Physiol Genomics 10:169-79).

O fundo geral de ácidos nucléicos identificados pode ser tratadopara reduzira complexidade da amostra e assim reduzir o sinal de base obtidona hibridização. Os termos "base" ou "sinal de base" referem-se aos sinais dehibridização resultantes da ligação não-específica, ou outras interações, entreos ácidos nucléicos identificados marcados e os componentes do arranjo deoligonucleotídeos (por exemplo, as sondas de oligonucleotídeo, sondas decontrole, o substrato de arranjo, etc). Em um método, um fundo geral demRNAs, derivado de uma amostra biológica, é hibridado com um fundo geralde oligonucleotídeos compreendendo as sondas de oligonucleotídeo pre-sentes no arranjo. O fundo geral de ácidos nucléicos hibridado é depois tra-tado com RNase A que digere as regiões unifilamentares. Os complexos dehibridização bifilamentares restantes são depois desnaturados e as sondas deoligonucleotídeo são removidas, deixando um fundo geral de mRNAs inten-sificado para aqueles mRNAs complementares às sondas de oligonucleotídeono arranjo.

Em outro método para redução de base, um fundo geral demRNAs derivado de uma amostra biológica é hibridado com oligonucleotídeosidentificados emparelhados específicos onde os oligonucleotídeos identifi-cados emparelhados específicos são complementares às regiões flanque-ando as subseqüências dos mRNAs complementares às sondas de oligonu-cleotídeo no arranjo. O fundo geral de ácidos nucléicos hibridado é tratadocom RNase H que digere as seqüências de ácido nucléico hibridadas (bifi-lamentares). As seqüências de ácido nucléico unifilamentares restantes quetêm um comprimento cerca de equivalente à região flanqueada pelos oligo-nucleotídeos identificado emparelhados específicos são depois isoladas (porexemplo através de eletroforese) e usadas como o fundo geral de ácidosnucléicos para monitorar a expressão de gene.

Um terceiro método para redução de base envolve eliminar oureduzir a representação no fundo geral de mensagens de mRNA identificadaspré-selecionadas particulares (por exemplo, mensagens que são sobre-ex-pressadas caracteristicamente na amostra). Este processo envolve hibridarcom uma sonda de oligonucleotídeo que é complementar à mensagempré-selecionada identificada de mRNA ao fundo geral de mRNAs de poliA+derivados de uma amostra biológica. A sonda de oligonucleotídeo híbrida como mRNA de poliA+ pré-selecionado particular ao qual é complementar. Ofundo geral de ácidos nucléicos hibridado é tratado com RNase H que digere aregião bifilamentar (hibridada) assim separando a mensagem de sua caudade poliA+. Isolamento ou amplificação (por exemplo, usando uma coluna deoligo dT) do mRNA de poliA+ no fundo geral depois fornece um fundo geralque tem uma representação reduzida ou nenhuma da mensagem de mRNApré-selecionada identificada.

ANÁLISE

O gene identificado é tipicamente identificado comparando umperfil genético da célula hospedeira que expressa a proteína ou peptídeorecombinante a um perfil genético da célula hospedeira que não expressa aproteína ou peptídeo recombinante. Em modalidades iterativas, o gene iden-tificado a ser modificado é identificado comparando um perfil genético dacélula que será modificada (a segunda célula) à célula da qual foi modificada(a primeira célula). O gene identificado é identificado comparando um perfilgenético da segunda célula a um perfil genético da primeira célula e identifi-cando um ou mais genes da expressão da qual é aumentado na segundacélula.

Microarranjos de cDNA medem a abundância de mRNA relativaentre duas amostras. Uma série de amostra de ponto de tempo depós-indução pode ser comparada à amostra de pré-indução para a mesmacepa (perfil de expressão temporal), ou as amostras de pós-indução podemser comparadas com as cepas diferentes no mesmo ponto de tempo. Acomparação pode ser através do uso de um programa de computação, comoGeneSight®. Por exemplo, quando usar um microarranjo usando um mar-cador fluorescente, uma intensidade de mancha pode ser medida para cadaamostra ligada ao arranjo (por exemplo uma seqüência de DNA). A intensi-dade de mancha pode depois ser corrigida para base e a razão da intensidadepara as amostras do hospedeiro versus o hospedeiro expressando a proteínaou peptídeo recombinante, ou para o hospedeiro expressando a proteína oupeptídeo recombinante comparado ao hospedeiro modificado que expressa aproteína ou peptídeo recombinante, pode ser medido. A razão fornece umamedida para identificar os genes que são sobre-regulados ou a expressão daqual é aumentado sob expressão da proteína ou peptídeo recombinante, ousob modificação da célula hospedeira para permitir identificação de um geneidentificado.

Para identificar se um gene é sobre-regulado, uma razão padrãoou "corte' é estabelecida. A razão de corte pode ser projetada para superar osefeitos de ruído de base associados a um ensaio particular. Em geral, qual-quer razão de mais que 1 entre as medições pode designar um gene so-bre-regulado. Porém, variação entre os ensaios pode requerer uma razãomais alta que 1, por exemplo 1,5, ou mais que 2, ou mais que 2,5, ou mais que3, ou mais que 3,5 ou mais que 4 ou mais que 4,5, ou mais que 5 ou mais que6, ou mais que 7, ou mais que 8, ou mais que 9 ou mais que 10. O padrãopode ser estabelecido antes do processo, contando com padrão conhecidosna técnica, ou pode ser estabelecido durante as medições comparando asrazões de níveis de genes ou produtos de gene de controle, como genes demanutenção.

ETAPA III: EXPRESSÃO VARIÁVEL DO GENE OU PRODUTO DE GENECOMPENSATÓRIO IDENTIFICADO GENETICAMENTE MODIFICANDO ACÉLULA PARA FORNECER UMA CÉLULA RECOMBINANTE MODIFICADAQUE ALCANÇA UM AUMENTO NA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOM-BINANTE. ATIVIDADE OU SOLUBILIDADE.GENES COMPENSATÓRIOS IDENTIFICADOS

Os genes ou produtos de gene compensatórios que são identifi-cados na etapa ii), ou análogos homólogos, co-fatores ou subunidades destes,são usados para projetar estratégias para geneticamente modificara célula ouaumentar, diminuir, knock-in ou knock-out a expressão de um ou mais genesidentificados. As seqüências de gene identificadas podem ser usadas embases de dados públicos para projetar estratégias, particularmente projetarconstructos para modular expressão de um gene através das técnicas des-critas acima. Tais técnicas são bem conhecidas.

Em uma modalidade, o gene ou genes identificados são pelomenos uma protease putativa, uma proteína similar à protease, um co-fatorousubunidade de uma protease. Em outras modalidades, o gene ou genes i-dentificados são pelo menos um modulador de dobramento, modulador dedobramento putativo, co-fator ou subunidade de um modulador de dobra-mento. Em certas modalidades, um gene identificado é uma subunidade deuma protease. Em uma modalidade, o gene ou genes identificados podem seruma serina, treonina, cisteína, aspártico ou metalo peptidase. Em uma mo-dalidade, o gene ou genes identificados podem ser selecionados de hslV,hsIU, cIpA, dpB e dpX. O gene identificado pode também ser um co-fator deuma protease. Em outra modalidade, o gene ou genes identificados são ummodulador de dobramento. Em algumas modalidades, o gene ou genes i-dentificados podem ser selecionados de uma proteína de chaperona, umafoldase, uma peptidil prolil isomerase e uma isomerase de ligação de dissul-feto. Em algumas modalidades, o gene ou genes identificados podem serselecionados de htpG, cbpA, dnaJ, dnaK e fkbP.

Genes bacterianos são organizados em operons que são agru-pamentos de gene que codificam as proteínas necessárias para executar afunção coordenada como biossíntese de um aminoacido dado. Portanto, emuma modalidade, o gene identificado faz parte de um operon. Em uma mo-dalidade particular, o gene identificado é um operon que codifica para uma oumais proteínas com atividade de protease sozinho ou em combinação, ou éum operon que codifica para uma ou mais proteínas com atividade modula-dora de dobramento, incluindo foldases, chaperonas, e isomerases.

PROTEASES

Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira é modifi-cada reduzindo a expressão, inibindo ou removendo pelo menos uma prote-ase do genoma. A modificação pode também ser mais de uma protease emalgumas modalidades. Em uma modalidade relacionada, a célula é modifi-cada reduzindo a expressão de um co-fator de protease ou proteína de pro-tease. Em outra modalidade, a célula hospedeira é modificada por inibição deum promotor para uma protease ou proteína relacionada que pode ser umpromotor nativo. A modificação de gene pode ser para modular uma proteínahomóloga ao gene identificado.

Na base de dados de MEROPS, peptidases são agrupadas emclãs e famílias. As famílias são grupos de peptidases funcionalmente similaresestritamente relacionadas. Famílias são agrupadas por seu tipo catalítico: S,serina; T, treonina; C, cisteína; A, aspártico; M, metalo e U, desconhecido.Mais de 20 famílias (denotadas S1 - S27) de serina protease foram identifi-cadas, estas são agrupadas em 6 clãs (SA, SB, SC, SE, SF e SG) em base desimilaridade estrutural e outra evidência funcional. Estruturas são conhecidaspor quatro dos clãs (SA, SB, SC e SE). Treonina peptidases são caracteri-zadas por um nucleófilo de treonina no término N da enzima madura. O e-xemplo de tipo para este clã é o componente beta de proteasoma arqueanode Thermoplasma acidophilum. Cisteína peptidases têm topologias molecu-lares características e são peptidases em que o nucleófilo é o grupo sulfidrilade um resíduo de cisteína. Cisteína proteases são divididas em clãs (proteí-nas que são evolutivas relacionadas), e também sub-divididas em famílias,em base da arquitetura de seu díade ou tríade catalítico:

Clã CA contém as famílias de papaína (C1), calpaína (C2), es-treptopaína (C10) e as peptidases ubiquitina-específicas (C12, C19), comotambém muitas famílias de endopeptidases de cisteína viral.

Clã CD contém as famílias de clostripaína (C11), gingipaína R(C25), legumaína (C13), caspase-1 (C14) e separina (C50). Estas enzimastêm especificidades dominadas pelas interações do sub-sítio 51.

Clã CE contém as famílias de adenaína (C5) de adenovírus, aUlp1 protease eucariótica (C48) e as YopJ proteases bacterianas (C55).

Clã CF contém apenas piroglutamil peptidase I (C15).

Clã PA contém as picornaínas (C3), que provavelmente evoluíramdas serina peptidases e que formam a maior parte das enzimas neste clã.Clãs PB e CH contêm as cisteína peptidases autolíticas.

Endopeptidases aspárticas de origem vertebrada, fúngica e re-troviral foram caracterizadas. Aspartato peptidases são assim nomeadasporque os resíduos de Asp são os ligantes da molécula de água ativada emtodos os exemplos onde os resíduos catalíticos foram identificados, emborapelo menos uma enzima viral seja acreditada ter como Asp e uma Asn comosua díade catalítica. Todas ou a maioria das aspartato peptidases são en-dopeptidases. Estas enzimas foram atribuídas em clãs (proteínas que sãoevolutivas relacionadas), e também sub-divididas em famílias, em grandeparte em base de sua estrutura terciária.

Metaloproteases são as mais diversas dos quatro tipos principaisde protease, com mais de 30 famílias identificadas até agora. Nestas enzimas,um cátion divalente, usualmente zinco, ativa a molécula de água. O íon demetal é mantido no lugar por ligantes de aminoácido, usualmente três emnúmero. Os ligantes de metal conhecidos são His, Glu, Asp ou Lys e pelomenos um outro resíduo é requerido para catalise que pode representar umpapel eletrofílico. Das metaloproteases conhecidas, quase a metade contémum motivo de HEXXH que foi mostrado em estudos cristalográficos fazerparte do sítio de ligação de metal. O motivo de HEXXH é relativamente co-mum, mas pode ser mais estritamente definidos para metaloproteases comoabXHEbbHbc onde 'a' é mais freqüentemente valina ou treonina e faz parte dosub-sítio do S1 em termolisina e neprilisina, 'b' é um resíduo descarregado, e'c' um resíduo hidrofóbico. Prolina nunca é encontrada neste sítio, possivel-mente porque quebraria a estrutura helicoidal adotada por este motivo emmetaloproteases.

As peptidases associadas ao clã U têm um mecanismo catalíticodesconhecido como a dobra de proteína do domínio de sítio ativo e os resí-duos de sítio ativo não foram relatados.

Certas proteases (por exemplo OmpT) podem adsorver na su-perfície dos corpos de inclusão e podem degradar a proteína desejada en-quanto estiver sendo redobrada. Portanto, certas proteínas identificadas po-dem ser proteases ou proteínas de protease que aderem aos corpos de in-clusão e estes podem ser modificados, por exemplo, para reduzir a ligação.

Proteases ou proteínas de protease podem também ser classifi-cadas como Aminopeptidases; Dipeptidases; Dipeptidil-peptidases e tripepti-dil peptidases; Peptidil-dipeptidases; Carboxipeptidases do tipo serina-tipo;Metalocarboxipeptidases; Carboxipeptidases do tipo cisteína; Omegapepti-dases; Serina proteinases; Cisteína proteinases; Aspártico proteinases; Me-talo proteinases; ou Proteinases de mecanismo desconhecido.

Aminopeptidases incluem citosol aminopeptidase (leucil amino-peptidase), alanil aminopeptidase de membrana, cistinil aminopeptidase,tripeptídeo aminopeptidase, prolil aminopeptidase, arginil aminopeptidase,glutamil aminopeptidase, x-pro aminopeptidase, leucil aminopeptidase bacte-riana, aminopeptidase termofílica, clostridial aminopeptidase, citosol alanilaminopeptidase, lisil aminopeptidase, x-trp aminopeptidase, triptofanil ami-nopeptidase, metionil aminopeptidas, aminopeptidase d-estereospecífica,aminopeptidase ey. Dipeptidases incluem x-his dipeptidase, x-arg dipeptidase,x-metil-his dipeptidase, cis-gli dipeptidase, glu-glu dipeptidase, pro-x dipep-tidase, x-pro dipeptidase, met-x dipeptidase, dipeptidase não-estereoespecí-fica, citosol dipeptidase não-específica, dipeptidase de membrana, be-ta-ala-his dipeptidase. Dipeptidil-peptidases e tripeptidil peptidases incluemdipeptidil-peptidase i, dipeptidil-peptidase ii, dipeptidil peptidase iii, dipepti-dil-peptidase iv, dipeptidil-dipeptidase, tripeptidil-peptidase I, tripepti-dil-peptidase II. Peptidil-dipeptidases incluem peptidil-dipeptidase a e pepti-dil-dipeptidase b. Carboxipeptidases do tipo serina incluem pro-x carboxipep-tidase lisossomal, D-ala-D-ala carboxipeptidase do tipo serina, carboxipepti-dase C, carboxipeptidase D. Metalocarboxipeptidases incluem carboxipepti-dase a, carboxipeptidase B, lisina(arginina) carboxipeptidase, gly-X carboxi-peptidase, alanina carboxipeptidase, muramoilpentapeptídeo carboxipepti-dase, carboxipeptidase h, glutamato carboxipeptidase, carboxipeptidase M,muramoiltetrapeptídeo carboxipeptidase, zinco d-ala-d-ala carboxipeptidase,carboxipeptidase A2, pro-x carboxipeptidase de membrana, tubulinil-tir car-boxipeptidase, carboxipeptidase t. Omegapeptidases incluem acilaminoa-cil-peptidase, peptidil-glicinamidase, piroglutamil-peptidase I, beta-aspar-til-peptidase, piroglutamil-peptidase II, n-formilmetionil-peptidase, pteroilpo-li-[gama]-g luta mato carboxipeptidase, gama-glu-X carboxipeptidase, aciimu-ramoil-ala peptidase. Serina proteinases incluem quimiotripsina, quimiotrip-sina c, metridina, tripsina, trombina, Fator Xa de coagulação, plasmina, en-teropeptidase, acrosina, protease alfa-lítica, glutamila, endopeptidase, ca-tepsina G, fator de coagulação viia, fator de coagulação ixa, cucumisi, proliloligopeptidase, fator de coagulação xia, braquiurina, calicreína de plasma,calicreína de tecido, elastase pancreática, elastase de leucócito, fator decoagulação xiia, quimase, componente de complemento c1r55, componentede complemento c1s55, convertase c3/c5 da via de complemento clássico,fator de complemento I, fator de complemento D, convertase c3/c5 da via decomplemento alternativa, cerevisina, hipodermina C, lisil endopeptidase,endopeptidase 1a, gama-reni, venombin ab, leucil endopeptidase, triptase,escutelarina, quexina, subtilisina, orizina, endopeptidase k, termomicolina,termitase, endopeptidase SO, ativador de plasminogênio T, proteína C, en-dopeptidase pancreática E, elastase pancreática ii, serina endopeptidaseIGA-específica, U-plasminogênio, ativador, venombina A, furina, mieloblastina,semenogelase, granzima A ou proteinase de linfócito T citotóxico 1, granzimaB ou proteinase de linfócito T citotóxico 2, estreptogrisina A, treptogrisina B,glutamil endopeptidase II, oligopeptidase B, fator de coagulação de límulo c,fator de coagulação de límulo, enzima de coagulação de límulo, omptina,repressor lexa, peptidase líder bacteriana I, togavirina, flavirina. Cisteínaproteinases incluem catepsina B, papaína, ficina, quimiopapaína, asclepaína,clostripaína, estreptopaína, actinídeo, catepsina 1, catepsina H, calpaína,catepsina t, glicila, endopeptidase, pró-coagulante de câncer, catepsina S,picornaína 3C, picornaína 2A, caricaína, ananaína, bromelaína de talo, bro-melaína de fruta, legumaína, histolisaína, enzima de conversão de interleu-cina 1-beta. Aspártico proteinases incluem pepsina A, pepsina B, gastricsina,quimiosina, catepsina D, neopentesina, renina, retropepsina, enzima deconversão de pró-opiomelanocortina, aspergilopepsina I, aspergilopepsina II,penicilopepsina, rizopuspepsina, endotiapepsina, mucoropepsina, candida-pepsina, sacaropepsina, rodotorulapepsina, fisaropepsina, acrocilindropep-sina, poliporopepsina, picnoporopepsina, escitalidopepsina a, escitalidopep-sina b, xantomonapepsina, catepsina e pepsina de barreira, peptidase líderbacteriana I, pseudomonapepsina, plasmepsina. Metalo proteinases incluematrolisina a, colagenase microbiana, leucolisina, colagenase intersticial, ne-prilisina, envelisina, metaloendopeptidase iga-específica, procolágenoN-endopeptidase, timet oligopeptidase, neurolisina, estromelisina 1, meprinaA, procolágeno C-endopeptidase, peptidil-lis metaloendopeptidase, astacina,estromelisina, 2, matrilisina gelatinase, aeromonolisina, pseudolisina, termo-lisina, bacilolisina, aureolisina, cocolisina, micolisina, metaloendopeptidasebeta-lítica, peptidil-asp metaloendopeptidase, neutrófilo colagenase, gelati-nase B, leishmanolisina, sacarolisina, autolisina, deuterolisina, serralisina,atrolisina B, atrolisina C, atroxase, atrolisina E, atrolisina F, adamalisina, hor-rilisina, ruberlisina, botropasina, botrolisina, ofiolisina, trimerelisina I, trimere-lisina II, mucrolisina, pitrilisina, insulisina, O-sialoglicoproteína endopeptidase,russelisina, mitocondrial, intermediário, peptidase, dactilisina, nardilisina,magnolisina, meprina B, peptidase de processamento mitocondrial, elastasede macrófago, coriolisina, toxilisina. Proteinases de mecanismo desconhecidoincluem termopsina e complexo de endopeptidase multicatalítica.

Certas proteases de P. fluorescens são listadas na Tabela A.

TABELA A

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MODULADORES DE DOBRAMENTOS

Os genes ou produtos de gene sobre-regulados identificadospodem ser um ou mais moduladores de dobramento. Moduladores de do-bramento podem por exemplo ser proteínas de HSP70, proteínas deHSP110/SSE, proteínas de HSP40 (relacionadas a DNAJ), proteínas simila-res a GRPE, proteínas de HSP90, proteínas de CPN60 e de CPN10, chape-roninas citosólicas, proteínas de HSP100, HSPs Pequena, Calnexina e cal-reticulina, PDI e proteínas relacionadas a tiorredoxina, Peptidil-prolil isome-rases, Ciclofilina PPIases, proteínas de ligação de FK-506, Parvulina PPIases,chaperoninas individuais, chaperonas proteína-específicas ou chaperonasintramoleculares. Moduladores de dobramentos são em geral descritos em"Guidebook to Molecular Chaperones and Protein-Folding Catalysts" (1997)ed. M. Gething, Universidade de Melbourne, Austrália.

As chaperonas molecular mais bem caracterizadas no citoplasmade E. coli são sistemas dependentes de DnaK-DnaJ-GrpE ATP- e de Gro-EL-GroES. Com base em estudos in vitro e considerações de homologia,várias proteínas citoplasmicas adicionais foram propostas para funcionaremcomo chaperonas moleculares em E. coli. Estas incluem CIpB, HtpG e IbpA/Bque, como DnaK-DnaJ-GrpE e GroEL-GroES, são proteínas de choque tér-mico (Hsps) pertencendo ao regulon de tensão. A conformação trans de li-gações Pro é energicamente favorecida em cadeias de proteína nascentes;porém, -5% de todas as ligações de prolil peptídeo são encontrados em umaconformação eis nas proteínas nativas. A isomerização de trans para eis deligações de X-Pro é limitativa em taxa no dobramento de muitos polipeptídeose é catalisada in vivo através de peptidil prolil cis/trans isomerases (PPIases).

Três PPIases citoplasmicas, SlyD, SlpA e fator desencadeador (TF), foramidentificadas até agora em E. coli. TF, uma proteína de 48 kDa associada àssubunidades ribossômicas de 50 S que foram postuladas cooperar com aschaperonas em E. coli para garantir dobramento apropriado das proteínasrecentemente sintetizadas. Pelo menos cinco proteínas (tiorredoxinas 1 e 2, eglutarredoxinas 1, 2 e 3, os produtos dos genes de trxA, trxC, grxA, grxB egrxC, respectivamente) estão envolvidos na redução de ligação em pontes dedissulfeto que transientemente surgem nas enzimas citoplasmicas. Dessemodo, genes identificados podem ser proteínas ou chaperonas de formaçãode ligação de dissulfeto que permitem formação de ligação de dissulfeto a-propriada.

Certos moduladores de dobramento em O. fluorescens são lis-tados na Tabela D.<table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table>MANIPULAÇÃO GENÉTICA

Na etapa iii), o processo inclui alterar expressão do gene ouproduto de gene compensatório identificado na célula recombinante atravésde modificação genética para fornecer uma célula recombinante modificada.

Após identificação de um ou mais genes sobre-regulados, proteínas ou pro-cessos metabolicos, o genoma do hospedeiro pode ser modificado. Certosgenes ou produtos de gene, embora identificados como sobre-regulados,podem não estar disponíveis para modulação porque eles são essenciais àcélula ou são conhecidos afetar outros processos que podem ser essenciais àcélula ou organismo.

O genoma pode ser modificado incluindo um gene exógeno ouelemento de promotor no genoma ou no hospedeiro com um vetor de ex-pressão, intensificando a capacidade de um gene identificado para produzirmRNA ou proteína, ou deletando ou rompendo um gene ou elemento depromotor, ou reduzindo a capacidade de um gene para produzir mRNA ouproteína. O código genético pode ser alterado, assim afetando a transcriçãoe/ou translação de um gene, por exemplo através de técnicas de substituição,deleção ("knock-out"), co-expressão ou de inserção ("knock-in"). Genes adi-cionais para uma proteína desejada ou seqüência reguladora que modula atranscrição de uma seqüência existente podem também ser inseridos.

RECOMBI NAÇÃO

O genoma da célula hospedeira que expressa proteína ou pep-tídeo recombinante pode ser modificado por meio de um evento alvejantegenético que pode ser por inserção ou recombinação por exemplo recombi-nação homóloga. Recombinação homóloga refere-se ao processo de re-combinação de DNA com base em homologia de seqüência. Recombinaçãohomóloga permite modificações sítio-específicas em genes endógenos edesse modo novas alterações podem ser criadas em um genoma. Uma etapaem recombinação homóloga é permuta de filamento de DNA, que envolve umemparelhamento de um dúplex de DNA de pelo menos um filamento de DNAque contém uma seqüência complementar para formar uma estrutura de re-combinação intermediária contendo DNA de heterodúplex (ver, por exemploRadding, C. M. (1982) Ann. Rev. Genet. 16: 405; Pat. U.S. N° 4.888.274). ODNA de heterodúplex pode ter várias formas, incluindo um filamento de trêsDNA contendo forma triplex em que um filamento complementar simples in-vade o dúplex de DNA (Hsieh, et al., Genes and Development 4:1951 (1990);Rao, et al., (1991) PNAS 88:2984)) e, quando dois filamentos de DNA com-plementares emparelham com um dúplex de DNA, uma junção de recombi-nação de Holliday clássica ou estrutura qui (Holliday, R., Genet. Res. 5: 282(1964)) pode formar, ou uma alça D dobrada ("Diagnostic Applications ofDouble-D Loop Formation" U.S. N° 07/755.462, depositada em 4 de set, 1991).

Uma vez formada, uma estrutura de heterodúplex pode ser solucionada a-través de rompimento e permuta de filamento, de forma que toda ou umaporção de um filamento de DNA invasor é encaixada em um dúplex de DNArecipiente, adicionando ou substituindo um segmento do dúplex de DNA re-cipiente. Alternativamente, uma estrutura de heterodúplex pode resultar emconversão do gene, em que uma seqüência de um filamento invasor étransferida para um dúplex de DNA recipiente mediante reparo das basesdesemparelhadas usando o filamento invasor como um modelo (Genes, 3a Ed.(1987) Lewina, B., John Wiley, Nova Iorque, N. I.; Lopez, et al., Nucleic AcidsRes. 15: 5643(1987)). Seja pelo mecanismo de rompimento e rejunção oupelo(s) mecanismo(s) de conversão de gene, formação de DNA de hetero-dúplex nas juntas homologamente emparelhadas pode servir para transferirinformação de seqüência genética de uma molécula de DNA para outra.

Em recombinação homóloga, o DNA entrante interage e integraem um sítio no genoma que contém uma seqüência de DNA substancialmentehomóloga. Em integração não-homóloga ("aleatória" ou "ilícita"), o DNA en-trante não integra com uma seqüência homóloga no genoma mas em outrolugar, em uma de um número grande de localizações potenciais. Vários do-cumentos descrevem o uso de recombinação homóloga em células mamífe-ras.

Vários constructos podem ser preparados para recombinaçãohomóloga em um lócus identificado. Usualmente, a construção pode incluirpelo menos 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 70 bp, 100 bp, 500 bp, Ikbp, 2kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, ou 50 kbp de seqüência homólogocom o lócus identificado. Podem ser envolvidas várias considerações deter-minando a extensão de homologia de seqüências de DNA identificadas, como,por exemplo, o tamanho do lócus identificado, disponibilidade de seqüências,eficiência relativa dos eventos de dupla troca no lócus identificado e a simila-ridade da seqüência identificada com outras seqüências.

O DNA alvo pode incluir uma seqüência em que o DNA substan-cialmente isogênico flanqueia as modificações de seqüência desejadas comuma seqüência identificada correspondente no genoma a ser modificado. Aseqüência substancialmente isogência pode ser pelo menos cerca de 95%,97-98%, 99,0-99,5%, 99,6-99,9% ou 100% idêntica à seqüência identificadacorrespondente (com exceção das modificações de seqüência desejadas). ODNA alvo e o DNA identificado podem compartilhar extensões de DNA de pelomenos cerca de 10, 20, 30, 50, 75, 150 ou 500 pares de base que são 100%idênticos.

Os constructos de DNA podem ser projetados para modificar oproduto de gene endógeno, identificado. A seqüência homóloga para identi-ficar o constructo pode ter uma ou mais deleções, inserções, substituições oucombinações destas, projetadas para romper a função do produto de generesultante. Em uma modalidade, a alteração pode ser a inserção de um genemarcador selecionável fundido na estrutura de leitura com a seqüência amontante do gene identificado.

O genoma pode também ser modificado usando deleção inser-cional. Nesta modalidade, o genoma é modificado recombinando uma se-qüência no gene que inibe a formação do produto de gene. Esta inserção oupode romper o gene inserindo um elemento separado, ou remover uma por-ção essencial do gene. Em uma modalidade, a deleção insercional inclui in-serção de um gene que codifica para resistência a um estressor particular,como um antibiótico, ou para crescimento em um meio particular, por exemplopara a produção de um aminoácido essencial.

O genoma pode também ser modificado pelo uso de transposons,que são elementos genéticos capazes de inserir em sítios em genomasprocariotes por mecanismos independentes de recombinação homóloga.Transposons podem incluir, por exemplo, Tn7 em E. coli, Tn554 em S. aureus,IS900 em M. paratuberculosis, IS492 de Pseudomonas atlântica, IS116 deStreptomyces e IS900 de M. paratuberculosis. Etapas acreditadas estar en-volvidas em transposição incluem clivagem da terminação do transposon pararender 3' OH; transferência do filamento, em que transposase reúne a ter-minação de 3'OH exposta do transposon e a seqüência identificada; e umareação de transesterificação de etapa simples para render uma ligação co-valente do transposon ao DNA identificado. A reação fundamental executadapor transposase é em geral julgada ser corte ou permuta de filamento, o restodo processo é feito através de enzimas hospedeiro.

Em uma modalidade, um processo é fornecido para aumentar onível de um gene identificado ou homólogo deste incorporando uma seqüên-cia genética que codifica o gene ou homólogo no genoma através de recom-binação. Em outra modalidade, um promotor é inserido no genoma para in-tensificar a expressão do gene identificado ou homólogo. Em uma modalidadeseparada, um processo é fornecido para diminuir a expressão de um geneidentificado ou homólogo deste por recombinação com um gene inativo. Emoutra modalidade, uma seqüência que codifica um gene diferente, que podeter uma função separada na célula ou pode ser um gene repórter como ummarcador de resistência ou um gene marcador do contrário detectável podeser inserido em um genoma através de recombinação. Em ainda outra mo-dalidade, uma cópia de pelo menos uma porção do gene identificado que foimutado para uma ou mais localizações é inserida no genoma através de re-combinação. A versão mutada do gene identificado não pode codificar umaproteína, ou a proteína codificada pelo gene mutado pode ser dada inativa, aatividade pode ser modulada (aumentada ou diminuída), ou a proteína mu-tante pode ter uma atividade diferente quando comparada à proteína nativa.

Há estratégias para knock-out genes em bactérias, que foram emgeral exemplificadas em E. coli. Uma via é clonar um fragmento de DNA in-terno no gene em um vetor contendo um gene de resistência antibiótico (porexemplo ampicilina). Antes de as células serem transformadas por meio detransferência conjugativa, transformação química ou eletroporação (Puehler,et al. (1984) Advanced Molecular Genetics Nova Iorque, Heidelberg, Berlim,Tóquio, Springer Verlag), uma origem de replicação, como a replicação deplasmídeo vegetativo (o lócus de oriV), é excisada e o fragmento de DNArestante é re-ligado e purificado (Sambrook, et al. (2000) Molecular cloning: Alaboratory manual, terceira edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, ColdSpring Harbor Laboratory Press). Alternativamente, plasmídeos resistentes aantibióticos tendo uma origem de replicação de DNA podem ser usados. Apóstransformação, as células foram banhadas por exemplo em placas de ágar LBcontendo os antibióticos apropriados (por exemplo 200 ug/ml de ampicilina).

As colônias que crescem nas placas contendo os antibióticos presumivel-mente sofreram um evento de recombinação simples (Snyder, L, W.Champness, et al. (1997) Molecular Genetics of Bactéria Washington DC,ASM Press) que leva à integração do fragmento de DNA inteiro no genoma nolócus homólogo. Análise adicional das células resistentes a antibióticos paraverificar que o knock-out de gene desejado ocorreu no lócus desejado é porexemplo por PCR diagnostica (McPherson, M. J., P. Quirke, etal. (1991) PCR:

A Practical Approach Nova Iorque, Oxford University Press). Aqui, pelo menosdois iniciadores de PCR são projetados: um que híbrida fora da região de DNAque foi usado para a construção do knock-out do gene; e um que hibridardentro da cadeia principal de plasmídeo restante. Amplificação de PCR comsucesso do fragmento de DNA com o tamanho correto seguido por análise deseqüência de DNA verificará que o knock-out do gene ocorreu na localizaçãocorreta no cromossomo bacteriano. O fenótipo da cepa mutante recentementeconstruída pode depois ser analisado por por exemplo eletroforese em gel depoliacrilamida de SDS (Simpson, R., J. (2003) Proteins and Proteomics - ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Cold Spring HarborLaboratory Press).

Uma via alternativa para gerar um knock-out de gene é pelo usode um replicon sensível à temperatura, como o replicon de pSC101 para fa-cilitar a substituição do gene (Hamilton, et al. (1989) New process for gen-eration deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bac-teriology 171(9): 4617-22). O processo prossegue através de recombinaçãohomóloga entre um gene em um cromossomo e seqüências homólogas rea-lizadas em uma temperatura de plasmídeo sensível à replicação de DNA.

Transformação do plasmídeo no hospedeiro apropriado foi possível selecio-nar para integração do plasmídeo no cromossomo a 44°C. Crescimentosubseqüente destes cointegrates a 30°C leva a um segundo evento de re-combinação, resultando em sua resolução. Dependendo de onde o segundoevento de recombinação ocorre, o cromossomo ou terá sofrido uma substi-tuição de gene ou terá retido a cópia original do gene.

Outras estratégias para inibir expressão de produtos de geneparticulares foram desenvolvidas. Por exemplo, interferência de RNA (RNAi),particularmente usando interferência de RNA pequena (siRNA), foi desen-volvida para extensivamente reduzir ou mesmo eliminar a expressão de umproduto de gene particular. siRNAs são moléculas de RNA curtas, bi-filamen-tares que podem alvejar mRNAs complementares para degradação. RNAi é ofenômeno em que a introdução de um RNA bifilamentar suprime a expressãodo gene homólogo. Moléculas de dsRNA são reduzidas in vivo para siRNAsde 21-23 nt que são os mediadores do efeito de RNAi. Sob introdução, osRNAs bifilamentares são processados em siRNAs de 20-25 nucleotídeos poruma enzima similar à RNase III chamada Dicer (etapa de iniciação). Depois,os siRNAs rearranjam-se em complexos contendo endorribonuclease co-nhecidos como complexos de silenciamento induzido por RNA (RISCs), de-senrolando no processo. Os filamentos de siRNA subseqüentemente guiamos RISCs para as moléculas de RNA complementares onde eles clivam edestroem o RNA cognato (etapa efeturadora). Clivagem de RNA cognatoocorre próxima do meio da região ligada pelo filamento de siRNA. RNAi foi deforma bem sucedida usado para reduzir a expressão de gene em uma vari-edade de organismos incluindo peixe-zebra, nematódeos (C. elegans), inse-tos (Drosophila melanogaster), planaria, cnidária, tripanossomas, camun-dongos e células mamíferas.

MUTAÇÃO

O genoma pode também ser modificado mediante mutação de umou mais nucleotídeos em uma estrutura de leitura aberta que codifica um geneidentificado, particularmente uma protease identificada. Técnicas para mu-tação genética, por exemplo mutagenese loco-dirigida, são bem conhecidasna técnica. Alguns métodos focalizam na geração de mutações aleatórias emDNA cromossômico como aqueles induzidos por raios X e químicas. Muta-genese alvejada para uma região definida de DNA inclui muitas técnicas, maispopular que outras. Métodos in vitro para mutagenese dirigida podem ser emgeral agrupados em três categorias: i) processos que reestruturam os frag-mentos de DNA, como mutagenese de cassete; ii) mutagenese aleatória lo-calizada; e iii) mutagenese oligonucleotídeo-direcionada.

Mutagenese oligonucleotídeo-direcionada é com base no con-ceito que um oligonucleotídeo que codifica uma(s) mutação(ões) desejada(s)é anelado em um filamento do DNA de interesse e serve como um iniciadorpara iniciação da síntese de DNA. Desta maneira, o oligonucleotídeo muta-gênico é incorporado no filamento recentemente sintetizado. Oligonucleotí-deos mutagênicos incorporam pelo menos uma alteração de base mas podemser projetados para gerar múltiplas substituições, inserções ou deleções.

Exemplos incluem processos com base em PCR e praticamente todos osprocessos não baseados em PCR em uso hoje. Estas técnicas incluem se-leção antibiótica positiva (Lewis, M. K. e Thompson, D. V. (1990) Nucl. AcidsRes. 18, 3439; Bohnsack, R. N. (1996) Meth. Mol. Biol. 57, 1; Vavra, S. eBrondyk, W. H. (1996) Promega Notes 58, 30; Altered Sites® II in vitro Mu-tagenesis Systems Technical Manual #TM001, Promega Corporation), sele-ção de sítio de restrição único (Deng, W. P. e Nickoloff, J. A. (1992) Anal.Biochem. 200, 81), incorporação de uracila (Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 82, 488; Kunkel, T. A., Roberts, J. D. e Zakour, R. A. (1987)Meth. Enzymol. 154, 367) e incorporação de fosforotioato (Taylor, J. W., Ott, J.e Ecksteina, F., (1985) Nucl. Acids Res. 13, 8764; Nakamaye, K. e Ecksteina,F., (1986) Nucl. Acids Res. 14, 9679). Oligonucleotídeos podem tambémcodificar uma biblioteca de mutações randomizando a composição de basenos sítios durante a síntese química resultando em oligonucleotídeos dege-nerados ou "dopados". A habilidade para localizar e especificar mutações égrandemente intensificada pelo uso de oligonucleotídeos sintéticos hibridadoscom vetor de plasmídeo contendo inserção de DNA.

O formato geral para mutagênese dirigida é: desnaturação deplasmídeo DNA que contém o modelo de interesse (cDNA, promotor, etc.)para produzir regiões unifilamentares; anelamento de um oligonucleotídeomutante sintético no filamento identificado; síntese de um filamento com-plementar novo usando, por exemplo, T4 DNA polimerase; e vedação do corteresultante entre a terminação do filamento novo e do oligonucleotídeo, porexemplo usando T4 DNA Ligase. O heterodúplex resultante é propagadoatravés de transformação, por exemplo, em E. coli. Processos de seleção eenriquecimento foram incorporados nos processos de mutagênese paragrandemente melhorar a eficiência de recuperação do filamento mutante etaxas que chegam a 80-90% são possíveis. Numerosos processos existempara gerar tipos diferentes de mutações e intensificar a seleção do mutante.

Exemplos de processos para intensificar a seleção do mutante incluem se-leção antibiótica positiva do filamento mutante, uso de um filamento de DNAcontendo uracila, que pode ser seletivamente degradado in vivo e incorpo-ração de análogo de dNTP, que pode dar um filamento de DNA de hetero-dúplex impérvio para digestão. Alguns métodos podem ser combinados, comomutagênese de cassete e o uso de oligonucleotídeos "dopados" para criaruma biblioteca de mutações aleatórias em uma região pequena, definida.

Uma extensão dos assim-chamados processos "padrão" de mu-tagênese dirigida inclui aqueles que contam com amplificação de DNA, es-pecificamente a reação em cadeia de polimerase (PCR). O ponto comumprincipal em mutagênese dirigida é o uso de um oligonucleotídeo mutagênico.

O oligonucleotídeo mutagênico deveria hibridar eficazmente com o modelo.

Para hibridização eficiente, pode haver, por exemplo, 100% de emparelha-mento de base em qualquer terminação da seqüência identificada sem for-mação de estrutura secundária, mas pode também ser menor que 100% deidentidade, como 98%, 95%, 92%, 90%, 85%, 80%, 70% ou apenas umaporção da seqüência pode ser idêntica. Para substituições pequenas, 10-15bases que hibridam com qualquer um dos lados da disparidade são usual-mente suficientes. A composição da terminação 3' do iniciador é particular-mente importante visto que as polimerases tipicamente não se estendem deuma terminação 3' desemparelhada ou fracamente hibridada.

A base para mutagênese dirigida através de seleção antibióticapositiva é que um oligonucleotídeo ou oligonucleotídeos de seleção são a-nelados simultaneamente, com o oligonucleotídeo mutagênico, para repararum gene de resistência a antibióticos (10-13). Seleção pelo filamento mutanteé permitida mediante resistência a antibióticos do DNA mutado e sensibilidadegerar um número indefinido das mutações desejadas com pouco tempo emmãos.

Mutagênese sítio-direcionada pelo uso de um sítio de restriçãoúnico é com base nos processos de Deng e Nickoloff (Deng, W. P. e Nickoloff,J. A. (1992) Anal. Biochem. 200, 81). Neste método, um oligonucleotídeo deseleção que contém uma seqüência mutada para um sítio de restrição único éanelado simultaneamente com o oligonucleotídeo mutagênico. O oligonucle-otídeo de seleção transmite o sítio não-essencial imune para restrição pelaenzima correspondente. Seleção pelo filamento mutante é intensificada dige-rindo o fundo geral resultante de plasmídeos com a enzima de restrição única.

A digestão lineariza o plasmideo parental assim eficazmente diminuindo suahabilidade para transformar bactérias.

Mutagênese sítio-direcionada através de incorporação de deoxi-uridina contam com a habilidade de uma cepa hospedeira para degradar oDNA modelo contendo uracila (U) no lugar de timidina (T). Um número pe-queno de dUTPs está incorporado no filamento modelo no lugar de dTTP emum hospedeiro que carece de atividades de dUTPase (dut-) e de uracilN-deglicosidase (ung-). (Uracila per se não é mutagênica e seus pares debase com adenina.) Normalmente, dUTPase degrada deoxiuridina e uracilN-deglicosidase remove qualquer uracila incorporada. Replicação depós-mutação em uma cepa de dut+ ung+ é usada depois para degradar ofilamento de DNA não-identificado. Este método requer que o DNA unifila-mentado seja usado de forma que apenas um filamento contenha os Us quesão suscetíveis à degradação.

O método de incorporação de fosforotioato para mutagênese di-rigida conta com a habilidade de um análogo de dNTP que contém um grupotiol de dar DNA de heterodúplex resistente à digestão da enzima de restrição.

O filamento de mutante é estendido do oligonucleotídeo mutagênico e sinte-tizado na presença de dCTPalphaS. DNA modelo não-usado é removidoatravés de digestão com uma exonuclease. Teoricamente, apenas DNA cir-cular, heterodúplex permanece. O heterodúplex é depois entalhado, mas nãocortado, no(s) sítio(s) de restrição. Exonuclease III é usada para digerir ofilamento entalhado e o fragmento restante depois age como um iniciadorpara repolimerização, criando um homodúplex mutante.

No método com base em reação em cadeia de polimerase (PCR)para gerar uma mutação em DNA, um modelo é amplificado usando umconjunto de iniciadores de oligonucleotídeo gene-específicos exceto que umoligonucleotídeo, ou mais nos protocolos que usam amplificações múltiplas,contenha a mutação desejada. Variações incluem alterar o sítio de hibridi-zação dos oligonucleotídeos para produzir múltiplos fragmentos de PCR desobreposição com a mutação na sobreposição e o método de "me-ga-iniciador", que usa três oligonucleotídeos e duas rodadas de amplificaçãoem que um filamento do produto da primeira amplificação serve como uminiciador na segunda amplificação.

No método de extensão de sobreposição, iniciadores de oligo-deoxirribonucleotídeo complementares (oligo) são usados e a reação emcadeia de polimerase para gerar dois fragmentos de DNA tendo terminaçõesde sobreposição. Estes fragmentos são combinados em uma reação de 'fu-são' subseqüente em que as terminações de sobreposição anelam-se, per-mitindo a sobreposição de 3' de cada filamento servir como um iniciador paraa extensão de 3' do filamento complementar. O produto de fusão resultante éamplificado também por PCR. Alterações específicas na seqüência de nu-cleotídeo (nt) podem ser introduzidas incorporando alterações de nucleotídeonos iniciadores de oligo de sobreposição.CONSTRUCTQS DE VETOR

Em uma modalidade separada, a célula hospedeira é modificadaincluindo um ou mais vetores que codificam um gene identificado, tipicamenteum modulador de dobramento ou um co-fator de um modulador de dobra-mento. Em outra modalidade, a célula hospedeira é modificada intensificandoum promotor para um modulador de dobramento ou um co-fator para ummodulador de dobramento, incluindo acrescentar um promotor exógeno aogenoma de célula hospedeira.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é modificada incluindoum ou mais vetores que codificam um inibidor de um gene compensatórioidentificado, como um inibidor de protease. Um tal inibidor pode ser umamolécula anti-sentido que limita a expressão do gene compensatório identi-ficado, um co-fator do gene identificado ou um homólogo do gene identificado.

Anti-sentido é em geral usado para referir-se a uma molécula de ácido nu-cléico com uma seqüência complementar para pelo menos uma porção dogene identificado. Além disso, o inibidor pode ser um RNA de interferência ouum gene que codifica um RNA de interferência. Em organismos eucarióticos,um tal RNA de interferência pode ser um RNA de interferência pequena ouuma ribozima, como descrito, por exemplo, em Bum, A. et al. ( 1998) Nature391:806-11, Elbashir et al. (2001) Genes & Development 15(2): 188-200, El-bashir et al. (2001) Nature 411(6836):494-8, Patentes U.S. N°s 6.506.559 deCarnegie Institute, 6.573.099 de Benitec, Pedidos de Patente U.S. N°s2003/0108923 de Whitehead Inst. e 2003/0114409, Publicações do PCT N°sWO03/006477, WO03/012052, WO03/023015, WO 03/056022, WO03/064621 e WO 03/070966. O inibidor pode também ser outra proteína oupeptídeo. O inibidor pode, por exemplo, ser um peptídeo com uma seqüênciade consenso para a protease ou proteína de protease. O inibidor pode tam-bém ser uma proteína ou peptídeo que pode produzir uma molécula inibidoradireta ou indireta para a protease ou proteína de protease no hospedeiro.

Inibidores de protease podem incluir Amastatina, E-64, Antipaína, Elastatinal,APMSF, Leupeptina, Bestatina, Pepstatina, Benzamidina, 1,10-Fenantrolina,Quimiostatina, Fosforamidon, 3,4-dicloroisocumarina, TLCK, DFP, TPCK.Mais de 100 inibidores de protease de proteína de ocorrência natural foramidentificados até agora. Eles foram isolados em uma variedade de organismosde bactérias para animais e plantas. Eles se comportam como inibidores deligação firme reversíveis ou pseudo-irreversíveis de proteases impedindoacesso do substrato ao sítio ativo através de obstáculo estérico. Seu tamanhoé também extremamente variável de 50 resíduos (por exemplo BPTI: Inibidorde Tripsina Pancreático Bovino) até 400 resíduos (por exemplo alfa-1 PI: Ini-bidor de Proteinase alfa-1). Eles são estritamente classe-específicos excetoas proteínas da família de alfa-macroglobulina (por exemplo alfa-2 macro-globulina) que liga e inibe a maioria das proteases através de um mecanismode captura molecular.

Um constructo vetor ou DNA exógena pode ser transfeccionadoou transformado na célula hospedeira. Técnicas para transfeccionar e trans-formar células eucarióticas e procarióticas respectivamente com ácidos nu-cléicos exógenos são bem conhecidas na técnica. Estas podem incluir ab-sorção mediada por vesícula de lipídio, transfecção mediada por fosfato decálcio (co-precipitação de fosfato de cálcio/DNA), infecção viral, particular-mente usando vírus modificados como, por exemplo, adenovírus modificados,microinjeção e eletroporação. Para transformação procariótica, as técnicaspodem incluir absorção mediada por choque térmico, fusão de protoplastobacteriano com células intactas, microinjeção e eletroporação. Técnicas paratransformação de planta incluem transferência mediada por Agrobacterium,como por A. tumefaciens, microprojéteis de tungstênio ou ouro rapidamenteimpelidos, eletroporação, microinjeção e absorção mediada por polietilenoglicol. O DNA pode ser DNA uni ou bifilamentar, linear ou circular, relaxado ousuper-enrolado. Para várias técnicas para transfeccionar células mamíferas,ver, por exemplo, Keown et al. (1990) Processes in Enzymology Vol. 185,págs. 527-537.

Para eventos de recombinação, os constructos podem incluir umaou mais seqüências de inserção que podem inserir ou transpor uma ou maisseqüência de ácido nucléico em uma seqüência diferente. Porém, a cons-trução pode ser projetada para expressão exógena de um gene compensa-tório identificado ou homólogo deste sem incorporação no DNA/genoma ce-lular existente.

Os constructos podem conter um, ou mais que um, sítio de en-trada de ribossoma interno (IRES). O constructo pode também conter umpromotor operavelmente ligado à seqüência de ácido nucléico que codificapelo menos uma porção do gene identificado, ou um co-fator do gene identi-ficado, uma versão mutante de pelo menos uma porção do gene compensa-tório identificado, ou no caso de proteases, um inibidor do gene identificado.

Alternativamente, o constructo pode ser sem promotor. Em casos em que oconstructo não é projetado para incorporar no DNA/genoma celular, o vetortipicamente contém pelo menos um elemento promotor. Além das seqüênciasde ácido nucléico, o vetor de expressão pode conter seqüências de marcadorselecionáveis. Os constructos de expressão pode também conter sítios parainiciação, terminação de transcrição e/ou sítios de ligação de ribossoma. Osconstructos identificados podem ser inseridos e expressados em qualquercélula procariótica ou eucariótica, incluindo, mas não limitada às célulasbacterianas, como P. fluorescens ou E. coli, células de levedura, célulasmamíferas, como células de CHO, ou células de planta.

Vetores de clonagem podem incluir por exemplo plasmídeo p-BR322 (Bolivar, Rodriguez et al. 1977), a série de pUC dos plasmídeos (Vieirae Messing 1982), pBluescript (Short, Fernandez et al. 1988), pACYC177 epACYC184 (Chang e Cohen 1978). Promotores exógenos para o uso em taisconstructos, incluem, mas não são limitados a, o promotor de PL de fagolambda, promotores lac de E. coli, trp de E. coli, phoA de E. coli, tac de E. coli,SV40 tardia, LTRs de SV40 tardia, retroviral, genes de PGKI, GALI, de GALIO,CYCI, PH05, TRPI, ADHI, ADH2, forglimaldeídeo fosfato desidrogenase,hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofructocinase, triose fosfato isome-rase, fosfoglucose isomerase, feromônio de fator de emparelhamento deglucocinase alfa, promotor de PRBI, GUT2, de GPDI, promotor de metaloti-oneína e/ou promotores virais mamíferos, como aqueles derivados de ade-novírus e vírus de vaccínia. Outros promotores serão conhecidos a alguémversado na técnica.Promotores para vetores exógenos, ou promotores exógenosprojetados para ser inseridos no genoma pode ser com base em elementos deresposta específicos em uma célula. Por exemplo, os promotores podem serresponsivos aos compostos químicos, por exemplo a antranilato ou benzoato,como descritos na Publicação do PCT N° WO 2004/005221. Os constructospodem incluir um ou mais promotores. Estes podem ser independentes, oupodem estar em tandem. Por exemplo os promotores podem ser projetadosde forma que um gene compensatório identificado seja sobre ou sub-reguladoem um prazo particular com a proteína ou peptídeo recombinante. Por e-xemplo, em um caso em que o gene identificado é um modulador de dobra-mento, o modulador ou co-fator de dobramento pode ser induzido logo antesda indução da proteína ou peptídeo recombinante. Promotores podem incluir,mas não são limitados aos seguintes:

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Constructos podem incluir marcadores de seleção para identificarcélulas modificadas. Genes marcadores selecionáveis adequados incluem,mas não são limitados a: genes que conferem a habilidade para crescer emcertos substratos de meios, como o gene tk (timidina cinase) ou o gene hprt(hipoxantina fosforibosiltransferase) que confere a habilidade para crescer emmeio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina); o gene gpt bacteriano(guanine/xantina fosforibosiltransferase) que permite crescimento em meioMAX (ácido micofenólico, adenina e xantina). Ver, por exemplo, Song, K-Y., etal. (1987) Proc. Nat'l Acad. Sei. U. S. A. 84:6820-6824; Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo-ratory, Cold Spring Harbor, N.I., Capítulo 16. Outros exemplos de marcadoresselecionáveis incluem: genes que conferem resistência a compostos comoantibióticos, genes que conferem a habilidade para crescer em substratosselecionados, genes que codificam proteínas que produzem sinais detectá-veis como luminescência, como proteína fluorescente verde, proteína fluo-rescente verde intensificada (eGFP). Uma ampla variedade de tais marca-dores é conhecida e disponível, incluindo, por exemplo, genes de resistênciaa antibióticos como o gene de resistência à neomicina (neo) (Southern, P. e P.Berg, (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341); e o gene de resistência à hi-gromicina (hyg) ((1983) NucleicAcids Research 11.6895-6911, e Te Riele, H.,et al. (1990) Nature 348:649-651). Outros genes marcadores selecionáveisincluem: ácido acetoidróxi sintase (AHAS), fosfatase alcalina (AP), galacto-sidase beta (LacZ), glucoronidase beta (GUS), cloranfenicol acetiltransferase(CAT), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha(RFP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana(CFP), peroxidase de raiz-forte (HRP), luciferase (Luc), nopalina sintase(NOS), octopina sintase (OCS) e derivados destes. Marcadores selecionáveismúltiplos estão disponíveis que confere resistência a ampicilina, bleomicina,cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato,fosfinotricina, puromicina e tetraciclina. Genes marcadores selecionáveisadicionais úteis nesta invenção, por exemplo, são descritos nas patentes U. S.Nos: 6.319.669; 6.316.181; 6.303.373; 6.291.177; 6.284.519; 6.284.496;6.280.934; 6.274.354; 6.270.958; 6.268.201; 6.265.548; 6.261.760; 6.255.5586.255.071; 6.251.677; 6.251.602; 6.251.582; 6.251.384; 6.248.558; 6.248.5506.248.543; 6.232.107; 6.228.639; 6.225.082; 6.221.612; 6.218.185; 6.214.5676.214.563; 6.210.922; 6.210.910; 6.203.986; 6.197.928; 6.180.343; 6.172.1886.153.409; 6.150.176; 6.146.826; 6.140.132; 6.136.539; 6.136.538; 6.133.4296.130.313; 6.124.128; 6.110.711; 6.096.865; 6.096.717; 6.093.808; 6.090.9196.083.690; 6.077.707; 6.066.476; 6.060.247; 6.054.321; 6.037.133; 6.027.8816.025.192; 6.020.192; 6.013.447; 6.001.557; 5.994.077; 5.994.071; 5.993.7785.989.808; 5.985.577; 5.968.773; 5.968.738; 5.958.713; 5.952.236; 5.948.8895.948.681; 5.942.387; 5.932.435; 5.922.576; 5.919.445; e 5.914.233.

Deleções podem ser pelo menos cerca de 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30bp, 40 bp ou 50 bp, comumente pelo menos cerca de 100 bp, e em geral nãomais que cerca de 20 kbp, onde a deleção normalmente pode incluir pelomenos uma porção da região de codificação incluindo uma porção de ou umou mais éxons, uma porção de ou um ou mais íntrons, e pode ou não podeincluir uma porção das regiões de não-codificação de flanqueamento, parti-cularmente a região de não-codificação de 5' (região reguladora transcrip-cional). Desse modo, a região homóloga pode estender-se além da região decodificação na região de não-codificação de 5' ou alternativamente na regiãode não-codificação de 3'. Inserções podem em geral não exceder a 10 kbp,usualmente não exceder a 5 kbp, em geral sendo pelo menos 50 bp, maisusualmente pelo menos 200 bp.

A(s) região(ões) de homologia pode(m) incluir mutações onde asmutações podem também inativar o gene identificado, fornecendo um des-locamento de estrutura, ou alterando um aminoácido fundamental, ou a mu-tação pode corrigir um alelo disfuncional, etc. Usualmente, a mutação podeser uma alteração sutil, não excedendo cerca de 5% das seqüências deflanqueamento homólogas.

O constructo pode ser preparado de acordo com os processosconhecidos na técnica, vários fragmentos podem ser reunidos, introduzidosem vetores apropriados, clonados, analisados e depois manipulados tambématé que o constructo desejado tenha sido alcançado (ver, por exemplo Figuras5-11). Várias modificações podem ser feitas à seqüência, para permitir análisede restrição, excisão, identificação de sondas, etc. Mutações silenciosaspodem ser introduzidas, como desejado. Em vários estágios, análise de res-trição, seqüenciação, amplificação com a reação em cadeia de polimerase,reparo de iniciador, mutagênese in vitro, etc. podem ser empregados. Pro-cessos para a incorporação de genes de resistência a antibióticos e fatores deseleção negativos são familiarizados àqueles de habilidade usual na técnica(ver, por exemplo, WO 99/15650; patente U.S. N° 6.080.576; patente U.S. N°6.136.566; Niwa, et al., J. Biochem. 113:343-349 (1993); e Yoshida, et al.,Transgenic Research, 4:277-287 (1995)).

O constructo pode ser preparado usando um vetor bacteriano,incluindo um sistema de replicação procariótico, por exemplo uma origemreconhecível por uma célula procariótica como P. fluorescens ou E. coli. Ummarcador, igual ou diferente do marcador a ser usado para inserção, pode serempregado que pode ser removido antes da introdução na célula identificada.

Uma vez o vetor contendo o constructo foi completado, ele pode ser tambémmanipulado, como por deleção de certas seqüências, linearização, ou intro-duzindo mutações, deleções ou outras seqüências na seqüência homóloga.Após manipulação final, o constructo pode ser introduzido na célula.

O processo pode ser iterativo. Em uma modalidade, após modi-ficação do hospedeiro e da expressão da proteína recombinante no hospe-deiro modificado, um perfil genético da célula hospedeira modificada é ana-lisado para identificar um ou mais outros genes identificados na expressãoque é alterada na célula hospedeira modificada. Em particular, genes com-pensatórios podem ser aqueles que mostram expressão aumentada nohospedeiro modificado expressando proteína recombinante quando compa-rada a uma célula hospedeira modificada que não expressa a proteína oupeptídeo recombinante, ou quando comparada a uma célula hospedeira i-nalterada. O processo também inclui alterar a expressão do gene ou outrosgenes identificados e expressar a proteína ou peptídeo na célula duplamentemodificada. Estas etapas podem ser iteradas para melhorar a expressão deproteína e podem ser repetidas uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito,nove, ou pelo menos dez vezes.

PRODUÇÃO DE PROTEÍNA

O processo da invenção otimamente leva à produção aumentadade proteína ou peptídeo recombinante em uma célula hospedeira. A produçãoaumentada pode incluir uma quantidade aumentada de proteína por grama deproteína do hospedeiro em uma quantidade dada de tempo, ou pode incluirum aumento no comprimento de tempo que a célula hospedeira está produ-zindo proteína ou peptídeo recombinante. A produção aumentada podetambém incluir uma melhoria nos requerimentos para crescimento da célulahospedeira recombinante. A produção aumentada pode ser uma produçãoaumentada de proteína ou peptídeo de comprimento total. Se a melhoria forem níveis aumentados de proteína, a proteína ou peptídeo pode ser produzidoem um ou mais corpos de inclusão em uma célula hospedeira.

A produção aumentada pode ser alternativamente um nível au-mentado de proteína ou peptídeo ativo por grama de proteína produzida, oupor grama de proteína do hospedeiro. A produção aumentada pode tambémser um nível aumentado de proteína ou peptídeo recuperável, como proteínasolúvel, produzida por grama de recombinante ou por grama de proteína decélula hospedeira. A produção aumentada pode também ser qualquer com-binação de nível total aumentado e nível de ativo ou solúvel aumentado deproteína.

Produção aumentada é tipicamente medida comparando o nívelde produção após um certo período de indução em uma célula modificadapara a mesma indução na célula inalterada.

SOLÚVEL/INSQLÚVEL

A expressão melhorada de proteína recombinante pode ser umaumento na solubilidade da proteína. A proteína ou peptídeo recombinantepode ser produzido e restabelecido do citoplasma, periplasma ou meio ex-tracelular da célula hospedeira. A proteína ou peptídeo pode ser insolúvel ousolúvel. A proteína ou peptídeo pode incluir uma ou mais seqüências alvos ouseqüências para ajudar a purificação.

Em certas modalidades, a invenção fornece um processo paramelhorar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo recombinante em umacélula hospedeira. O termo "solúvel" como aqui usado significa que a proteínanão é precipitada através de centrifugação entre cerca de 5.000 e 20.000 xgravidade quando girado durante 10-30 minutos em um tampão sob condi-ções fisiológicas. Proteínas solúveis, ativas são capazes de exibir a função, enão fazem parte de um corpo de inclusão ou outra massa precipitada.

A invenção pode também melhorar a recuperação das proteínasou peptídeos recombinantes ativos. Por exemplo, a interação entre um poli-peptídeo identificado e um de origem, polipeptídeo variante, polipeptídeosegmento-substituído e/ou polipeptídeo resíduo-substituído pode ser medidapor qualquer ensaio conveniente in vitro ou in vivo. Desse modo, ensaios invitro podem ser usados para determinar qualquer interação detectável entreum polipeptídeo identificado e, por exemplo entre enzima e substrato, entrehormônio e receptor de hormônio, entre anticorpo e antígeno, etc. Tal de-tecção pode incluir a medição das alterações colorimétricas, alterações naradioatividade, alterações na solubilidade, alterações no peso molecularquando medido por eletroforese em gel e/ou processos de exclusão em gel,etc. Ensaios in vivo incluem, mas não são limitados a, ensaios para detectarefeitos fisiológicos, por exemplo ganho de peso, alteração no equilíbrio deeletrólito, alteração no tempo de coágulo sangüíneo, alterações na dissoluçãode coágulo e a indução de resposta antigênica. Em geral, qualquer ensaio invivo pode ser usado desde que um parâmetro variável exista para detectaruma alteração na interação entre o polipeptídeo identificado e o de interesse.Ver, por exemplo, patente US N° 5.834.250.

CITOPLÁSMICO/PERIPLÁSMICO/SECRETADO

Em certas modalidades, a proteína pode também ser segregadano periplasma se fundida em uma seqüência de secreção de sinal apropriada.Em uma modalidade, a seqüência sinal pode ser uma proteína de ligação defosfato, um peptídeo sinal de secreção de proteína de ligação de Lys-Arg-Orn(LAObp ou KRObp), um peptídeo de sinal de secreção de Porina de Mem-brana Externa E (OprE), um peptídeo de sinal de secreção de azurina, umpeptídeo de sinal de secreção de proteína de ligação de ferro (III) [Fe(lll)bp]ou um peptídeo de sinal de secreção de lipoproteína B (LprB).

Em uma modalidade, nenhuma condição ou agente de promoçãode ligação de dissulfeto adicional é requerido para restabelecer o polipeptídeocontendo ligação de dissulfeto identificado na forma ativa, solúvel da célulahospedeira modificada ou célula duplamente ou múltipla modificada. Em umamodalidade, o peptídeo, polipeptídeo, proteína transgênica(o) ou fragmentodeste tem uma conformação intramolecular dobrada em seu estado ativo. Foiobservado que as proteínas mamíferas complexas solúveis no citoplasmapodem configurar-se apropriadamente ao posicionamento apropriado dosgrupos tiol para formação de ligação de dissulfeto posterior no periplasma. Emuma modalidade, o peptídeo, polipeptídeo, proteína transgênica(o) ou frag-mento contém pelo menos uma ligação de dissulfeto intramolecular em seuestado ativo; e talvez até 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 ou mais ligaçõesde dissulfeto.

Em uma modalidade, mais que 50% do peptídeo, polipeptídeo,proteína transgênica(o) ou fragmento deste expresso produzido será produ-zido como peptídeos, polipeptídeos, proteínas simples funcionais, ou frag-mentos destes em forma solúvel, ativa ou forma insolúvel facilmente renatu-rada no citoplasma ou periplasma. Em outra modalidade cerca de 60%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 95% da proteína expressa são obtidos ou facilmenterenaturados em forma ativa.

EXEMPLOS

As cepas bacterianas usadas no estudo atual estão listadas na

TABELA 1. Cepas de P. fluorescens foram crescidas em frascos de agitação a30°C. OD575 foi registrada para cada cepa em vários pontos de tempo.

TABELA 1. VISÃO GERAL DAS CEPAS BACTERIANAS

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Os plasmídeos usados nos experimentos a seguir estão listadosna Tabela 2.TABELA 2: VISÃO GERAL DOS PLASMÍDEOS

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COLETÂNEA DE AMOSTRA E ISOLAMENTO DE RNA

Todas as amostras foram colhidas de uns experimentos defrascos de agitação de 250 ml padrão. As amostras foram tiradas em pontosde tempo diferentes como indicados nas figuras. A cada ponto de tempo, 10ml de cultura de célula dos frascos de agitação foram colhidos e misturadoscom 10 ml de reagente RNA/ater (Ambion, Austina, TX) para estabilizar oRNA.

HIBRIDIZAÇÀO DE MICROARRANJO E ANÁLISE DE DADOS

Para cada amostra de RNA, os nucleotídeos fluorescentesCy3-dUTP ou Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) foram in-corporados no cDNA em uma reação de transcrição reversa (RT) usandoiniciador de hexâmero aleatório (Amersham). Os dois fundos gerais de cDNAmarcados foram combinados e aplicados a uma lâmina de microarranjo. Aslâminas de microarranjo contêm oligodeoxirribonucleotídeos amino-modifica-dos de 50 mer (oligos) representandos cada um por ORF de P. fluorescens.Cada oligo foi impresso duas vezes para manchas em duplicata em locali-zação diferente usando o robô SDDC-2 (Virtek, Toronto, Canadá - agora dis-tribuído através de Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e pinos de SMP3(TeleChem Internacional Inc., Sunnyvale, CA). As lâminas de microscópiousadas foram revestidas com uma resina epóxi positivamente carregada paraligação de DNA eficiente (MWG Inc, Alameda, CA). Após imprimir, as lâminasforam pós-processadas de acordo com as especificações de MWG. Um pa-cote de software de BioDiscovery Inc. (El Segundo, CA) foi usado para facilitara análise de dados. Este pacote consiste em módulos CloneTracker®, Ima-Gene®, GeneSight® e a base de dados de GeneDirector®. Cada lâmina hi-bridada foi varrida usando ScanArray 5000 (Packard BioScience, Billerica, MA)para medir a fluorescência do cDNA Cy3- e Cy5-marcado ligado ao microar-ranjo. As imagens adquiridas foram quantificadas em ImaGene® e os dadosbrutos foram processados em GeneSight®. Durante a preparação dos dados,a intensidade das manchas para cada gene foi corrigida com a base; o sinalpara o canal de Cy5 foi normalizado ao canal de Cy3 usando a intensidade desinal total para o arranjo inteiro; a razão normalizada de Cy5 para Cy3 paracada gene foi transformada de log2, e as réplicas foram combinadas.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA ATRAVÉS DE SDS-PAGE

Alíquotas de cultura foram colhidas em vários pontos de tempoapós indução de IPTG, normalizada para OD6oo de 10. Os lisados de célulaforam separados em frações solúveis e insoluveis através de centrifugação a11000 g durante 5 minutos. As alíquotas de 2,5 ul foram combinadas com 5 ulde tampão de amostra de 2X NuPAGE LDS (Invitrogen, San Diego, CA), 50uM de DTT e H20 para 10 ul, depois aquecidas para 95°C durante 5 minutos.

As proteínas foram separadas e visualizadas em 12% de géis de Nupagetingidos com Coomassie Blue usando Simply Blue Safestain (Invitrogen, SanDiego, CA).

MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE FLUORESCÊNCIA

Rendimento da proteína foi também medido por atividade de flu-orescência da fusão de proteína de fluorescência verde (COP) e hormônio decrescimento humano (hGH). O constructo de fusão de hgh::COP foi trans-formado nas cepas do tipo selvagem ou mutantes de hsIU e selecionadas naplaca de ágarde glicose M9 sem uracila. A cultura de célula induzida por IPTGfoi normalizada para OD60o de cinco. Atividade de fluorescência relativa (RF)foi medida usando o espectrofluorímetro de microplaca de Spectramax Ge-mini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) sob o ajuste apropriado (Ex485, filtrode passagem de banda Em538530).EXEMPLO 1: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE GENE DE CEPAS QUEPRODUZEM PROTEÍNAS CITOPLÁSMICAS E PERIPLÁSMICAS - COM-PARAÇÃO DE DIFERENTES PNOTOS DE TEMPO

Para estudo dos FMs e expressão de gene de protease durante aprodução de proteína heteróloga, cepas de P. fluorescens DC206, 280, 240 e271 foram usadas nos experimentos de microarranjo iniciais. DC206 é a cepahospedeira e foi usada como um controle para crescimento de célula; DC280tem um plasmídeo apenas de vetor e foi usado como um controle para oexperimento de microarranjo; DC240 é DC206 com uma enzima citoplásmicade nitrilase de codificação de plasmídeo que é solúvel; DC271 é DC206 comum plasmídeo que codifica o hormônio de crescimento humano periplásmico(pbp::hGH) que é parcialmente insolúvel. Cepas foram crescidas em 200 mlde meio de frasco de agitação e crescimento das células foi monitorado me-dindo a OD575. Indução de IPTG foi executada 24 h após inoculação. Todas ascepas cresceram similarmente e as amostras de cultura foram tiradas logoantes (0 h) e 4 h após a indução para isolamento de RNA e perfilação trans-cripcional (TxP) usando microarranjo de DNA (Figura 1).

Os perfis genéticos, isto é, perfis transcripcionais foram com basena comparação da amostra de ponto de tempo de indução de 4 h com aqueleda amostra de 0 h, as duas amostras foram rotuladas com corantes fluores-centes, Cy3-dUTP ou Cy5-dUTP, e co-hibridadas na mesma lâmina para cadacepa. Cada hibridização foi duplicada com experimentos de troca de corante(isto é, amostras foram marcadas com Cy3-dUTP ou Cy5-dUTP) (Tabela 3,lâminas 1 a 6). As lâminas hibridadas foram varridas usando um escâner alaser confocal. Intensidade de sinal para cada gene foi determinada e pro-cessada usando o pacote de software de microarranjo de Biodiscovery (ElSegundo, CA). A razão de expressão dos dois pontos de tempo para cadagene foi calculada e as razões para todos os genes ao longo das cepas foramagrupadas com base no valor da razão e tendência entre as três cepas(DC280, DC240 e DC271) (Figura 2).TABELA 3. Sumário dos experimentos de microarranjo executados nosExemplos 1-3

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Para focalizar em FM e expressão de gene de protease em P.fluorescens sob a tensão imposta pela produção de proteína recombinante denível alto, uma lista de FM e genes de protease foi comparada à análise deagrupamento. Após análise de agrupamento hierárquica de todos os genes deDC280, DC240 e DC271, FMs e proteases foram identificadas em dois a-grupamentos (linhas nos agrupamentos 6 e 7; Figura 2).

Quatro genes no agrupamento 7 mostram expressão mais altasignificativa em DC271 que expressa principalmente hormônio de cresci-mento humano periplásmico insolúvel quando comparado a DC240 queproduz nitrilase citoplásmica solúvel ou DC280 que não superproduz ne-nhuma proteína. Os quatro genes são HslV de codificação de rxf01961, HsIUde codificação de rxf01957, CbpA de codificação de rxf03987 e HtpG de co-dificação de rxf05455. O HslV de E. coli (CIpQ) e HsIU (CIpY) juntos formamuma protease citoplásmica. A subunidade pequena, HslV, é uma peptidaserelacionada às a-subunidades proteassomais de eucariotes. A subunidadegrande, HsIU, é um ATPase com homologia para outra família de ATPases deClp como CIpA e CIpX. CbpA de E. coli é um análogo da co-chaperona bemcaracterizada DnaJ como julgado de não só sua estrutura mas também suafunção. O fenótipo de lesões em DnaJ, como sensibilidade de temperaturapara crescimento, é restabelecido sob introdução do gene de cbpA em umplasmídeo de multicópias. HtpG de E. coli funciona como uma chaperonamolecular ATP-independente in vitro. Ela reconhece e transientemente ligaintermediários de dobramentos estranhos, reduzindo sua concentração livrena solução e desse modo impedindo a agregação não específica.

Os genes foram agrupados no agrupamento 6 da Figura 2 no-vamente usando agrupamento hierárquico para identificar efeitos menospronunciados. Figura 3 mostra que FMs e proteases foram identificados emdois agrupamentos principais (linhas no agrupamento 6 e 8). Os dois FMs noagrupamento 8 são DnaK e DnaJ, duas chaperonas principais que são bemconhecidas trabalhar juntas para dobrar numerosas proteínas. Outra análisedos valores de expressão de genes do agrupamento 6 identificou um FMadicional, CIpX que é mais alta expressa em DC271 produzindo pbp::hGHquando comparada a DC240 produzindo nitrilase ou DC280 que não super-produz nenhuma proteína. A proteína de choque térmico de CIpX de E. coli éhomóloga aos membros da família de ATPases de HSP100/Clp procarióticose eucarióticos. CIpX de E. coli foi isolado como um componente específico dasproteases de Clp ATP-dependentes, que mantêm certos polipeptídeos emuma forma competente para proteólise pela subunidade de protease de CIpP.CIpX pode agir como uma chaperona molecular, na ausência de CIpP, ati-vando as proteínas de iniciação envolvidas na replicação de DNA. FMs eproteases identificados importantes para produção de hGH periplásmico es-tão listadas na TABELA 4.

TABELA 4. Lista de FM e genes de protease cujos níveis de razão de mRNAde estado constante são mais altos em DC271 quando comparado a DC240 eDC280. Os valores listados são a razão de 4 h após indução de IPTG por 0 h.

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* Para dnaK, duas sondas estão presentes na fatia de microarranjo e dessemodo são fornecidos dois valores de expressão de gene.

EXEMPLO 2 - ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE GENE DE CEPAS QUEPRODUZEM PROTEÍNAS CITOPLÁSMICAS E PERIPLÁSMICAS - COM-PARAÇÃO DIRETA DE CEPAS DIFERENTES

Para confirmar os resultados obtidos acima, experimentos demicroarranjo adicionais foram executados por comparação direta das duascepas DC271 e DC240 (lâminas 7 a 10 na Tabela 3). A comparação das duascepas em 4 h após ponto de tempo de indução confirmou que um conjuntoquase idêntico de FM e genes de protease foi sobre-regulado em células queexpressam pbp::hGH parcialmente solúveis (Tabela 5). Todos os genes lis-tados na Tabela 5 são significativamente (isto é > 2 vezes) mais alto ex-pressos nas cepas que produzem hGH parcialmente insolúvel quando com-parado às células que produzem nitrilase completamente solúvel. Na com-paração direta de DC271 a DC240, algumas proteínas adicionais foram i-dentificadas quando comparadas à comparação de ponto de tempo (ver Ta-bela 4) que mostrou valores de expressão de gene significativamente maisaltos durante a produção de hGH parcialmente insolúvel. Aqueles genes in-cluíram CIpB de codificação de rxf08347, CIpA de codificação de rxf04587 eFkbP de codificação de rxf05753. O homólogo de CIpB de E. coli está envol-vido na reativação dos corpos de inclusão juntos com DnaKJ-GrpE. CIpA de E.coli tem uma função de chaperona ou, quando junto com CIpP, degrada asproteínas. Em E. coli, FkbP funciona como uma peptidil-prolil isomerase.

TABELA 5. Lista de FM e genes de protease cujos níveis de mRNA de estadoconstante são mais altos em DC271 quando comparados a DC240. Os va-lores listados são a razão de DC271 para DC240 em 4 h após indução de IPTG.

<table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table>

*Para dnaK, duas sondas estão presentes na fatia de microarranjo e dessemodo dois valores de expressão de gene são fornecidos.

EXEMPLO 3: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE GENE DE UMA CEPA QUEPRODUZ UMA PROTEÍNA CITOPLÁSMICA INSOLÚVEL

Uma vez que DC271 parcialmente expressa hormônio de cres-cimento humano periplásmico (pbp::hGH), ele foi investigado se FMs e genesde protease similares ou diferentes fossem sobre-regulados em uma cepaque principalmente expressa hGH citoplásmico insolúvel. DC369 foi usadoneste experimento. As 4 h após indução, a amostra foi comparada à amostrade ponto de tempo 0 h, e experimentos de microarranjo foram executadoscomo mostrado na Tabela 3 (lâminas 11 e 12). Novamente, FM e genes deprotease similares foram observados ser sobre-regulados indicando que osgenes identificados estão envolvidos em dobramento citoplásmico ao invésperiplásmico e degradação de proteína (Tabela 6). Um resumo de quais ge-nes que foram identificados em qual experimento junto com a sobre-regulaçãode dobramento é mostrado no diagrama de Venn da Figura 4.

TABELA 6. Lista de FM e genes de protease cujos níveis de mRNA de estadoconstante foram mais altos em DC369 em 4 h após indução quando compa-rados a zero no tempo. Os valores listados são a razão de 4 h após induçãode IPTG para 0 h (logo antes da indução).

<table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>

* Para dnaK, duas sondas estão presentes na fatia de microarranjo e dessemodo são fornecidos dois valores de expressão de gene.

EXEMPLO 4: GERAÇÃO DE UMA CEPA MUTANTE DE hsIU EM PC206 DEP. fluorescens

O dois genes hsIU foram encontrados estar entre os genes iden-tificados mais altamente sobre-regulados. HsIU é uma ATPase citoplásmica.

A proteína homóloga em E. coli pode agir em combinação com uma segundaproteína para promover degradação de proteína energia-dependente em E.coli. HsIU interage com HslV, uma proteína com homologia para asa-subunidades de proteasoma. Os homólogos de HsIVU de E. coli foramrelatados estar envolvidos em proteólise geral das proteínas desdobradas emMissiakas, D., et al. (1996) Identification and characterzation of HslV HsIU(CIpQ CIpY) proteins involved in overall proteolysis of misfolded proteins inEscherichia coli. Embo J15:6899-909. análise de seqüência de DNA sugeriuque os genes de hsIVU de P. fluorescens são prováveis de fazer parte de umoperon bicistrônico (Figura 5).

Para verificar se HsIVU estão de fato envolvidos na degradaçãode hGH, um cepa knock-out de hsIU foi construída. Uma tal cepa foi geradapor inativação insercional de hsIU (Figura 6). Um fragmento de DNA internode cerca de 550 bp para hslUfol clonado no vetor de pCR2.1-TOPO resistenteà canamicina. Uma vez que este vetor tem uma origem de replicação (ColE1)que é funcional em E. coli mas não em P. fluorescens, os plasmídeos cons-truídos integrarão no cromossomo de DC206 através de recombinação ho-móloga para conferir resistência à canamicina. O sítio de inserção corretopara as colônias resistentes à canamicina foi confirmado através de PCR dediagnóstico de colônia usando iniciadores que hibridam fora da região origi-nalmente amplificada e dentro da cadeia principal de plasmídeo (Tabela 3). Acepa mutante de hsIU construída foi designada DC370.

Os iniciadores foram projetados que amplificariam uma regiãointerna de -550 bp do gene de hsIU (Tabela 7). O fragmento interno foi am-plificado usando Taq Polimerase (Promega), purificado e clonado em vetor depCR2.1-TOPO (Invitrogen, San Diego, CA). Os plasmídeos foram transfor-mados em DC206 de P. fluorescens competente e selecionados nas placasde ágar de glicose de M9 suplementada com 250 ug/ml de uracila e 50 ug/mlde canamicina.

TABELA 7. INICIADORES

<table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table>

COMPARAÇÃO DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA POR ANÁLISE DESDS-PAGE

Para estudar o efeito do knockout do gene de hsIU, duas ex-pressões de proteína exógena foram comparadas entre a cepa de origemDC206 e a cepa mutante recentemente construída DC370. Os plasmídeosabrigando o gene codificando pbp::hGH (pDOW1323) e hGH (pDOW1426)foram cada um transformados em células de DC370 competentes e resulta-ram em cepas DC373 e DC372, respectivamente. Os experimentos de cres-cimento padrão em frasco de agitação foram executados com as quatro cepas.

Figura 7 mostra que as cepas do tipo selvagem e mutantes têm taxas decrescimento similares. As amostras foram operadas em géis de SDS-PAGE(Figura 8 e 9). Os resultados sugerem que o mutante produziu quantidadesmais altas de proteínas devido à deleção da subunidade de protease HsIU.

COMPARAÇÃO DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA POR ATIVIDADE DEFLUORESCÊNCIAUma vez que o efeito observado da falta de HsIU no rendimentode hGH é difícil para quantificar usando análises de SDS-PAGE, o perfiltemporal de produção de proteína foi monitorado pela fluorescência de umaproteína de fusão entre proteína fluorescente verde COP e hGH. Um plas-mídeo contendo uma fusão de hGH::COP foi construído e transformado nacepa de origem DC206 e na cepa de deleção de gene de hsIU DC370 resul-tando em cepas HJ104 e HJ105 (Tabela 1). Os experimentos de frasco deagitação padrão foram executados e as amostras tiradas em vários pontos detempo para medições da fluorescência (Figura 10). As leituras do fluorímetroclaramente mostraram que a cepa mutante de protease de hsIU teve níveis deexpressão de proteína significativamente mais altos comparados aos da cepaparental (Figura 11). Esta descoberta confirma os resultados obtidos por a-nálise de SDS-PAGE. Comparando à cepa de tipo selvagem, o mutante dehslil aumentou 33,05% da fluorescência relativa em 24 h após indução (verinserção na Figura 11).

EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO DE UMA CEPA KNOCKOUT LIMPA DE hslUVA protease de Hsl consiste em duas subunidades: uma subuni-dade de ligação de ATP codificada por hslil e uma subunidade de proteasecodificada por hsIV. A cepa knock-out de protease de Hsl previamente cons-truída é uma inativação insercional do gene de hslil. Para remover a preo-cupação que HsIV poderia ainda funcionar como uma protease podendoacoplar a uma subunidade de ligação de ATP de outra protease, uma cepa dedeleção foi construída que teve os genes de hslil e hsIV removidos do cro-mossomo.

Como mostrado na Figura 13, plasmídeo pDOW2050 foi cons-truído por amplificação de PCR de dois fragmentos de DNA flanqueando aregião de hsliN, os dois fragmentos foram subseqüentemente fundidos u-sando o método de PCR de Encaixe através de Extensão de Sobreposição(SOE) (ver Ho, S. N. (1991) Method for gene splicing by overlap extensionusing the polymerase chain reaction. Pedido: Patente US 89-3920955023171).Os fragmentos de DNA fundidos foram depois ligados no sítio de Srft de vetorpDOW1261-2. O plasmídeo de deleção foi nomeado pDOW2050 após a in-serção ter sido confirmada através de seqüenciação de DNA.

Plasmídeo pDOW2050 foi eletroporado em DC206 e banhadosobre placas de ágar de M9 suplementadas com 1 % de glicose e 15 pg/ml detetraciclina. Resistência à tetraciclina é devido a um evento de integração querecombina o plasmídeo inteiro no cromossomo com uma das duas regiõeshomólogas dentro do genoma (Figura 13). Para selecionar as células que têmuma deleção dos genes de hsliN, que resulta de uma segunda recombinaçãohomóloga entre o plasmídeo integrado e a região de DNA homóloga nocromossomo, as colônias resistentes à tetraciclina foram crescidas para faseestacionaria em meio de LB suplementado com 250 pg/ml de uracila. As cé-lulas são depois banhadas sobre placas de ágar de LB suplementadas com500 pg/ml de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA). As células que perderam oplasmídeo integrado por um segundo evento de recombinação também per-deram o gene de pyrF e desse modo são resistentes a 5-FOA, resultando nacepa de deleção de hsILN cromossômico desejada, chamada DC417.

ANÁLISE FENOTÍPICA DA CEPA DE DELEÇÃO DE hsILNAnálise de SDS-PAGE da cepa de deleção de hsILN expressandoa proteína de hGH (cepa HJ115) mostrou rendimento de proteína muito maisalto que a cepa do tipo selvagem DC369, similar ao que foi observado maiscedo usando a cepa mutante insercional de hsIU DC372 (dados não mos-trados).

Rendimento da proteína foi também medido por atividade de flu-orescência da fusão de hGH::COP usando o mesmo método descrito maiscedo. Plasmídeo pDOW1349 contendo a fusão de hGH::COP foi transfor-mado nas cepas do tipo selvagem e mutante que resultam em cepas HJ104 eHJ117, respectivamente. Experimentos de frasco de agitação padrão foramexecutados e as amostras foram tiradas em vários pontos de tempo paramedições de fluorescência relativa (Figura 14). As leituras do fluorímetro in-dicaram que a cepa de deleção de protease de hsILN teve níveis de ex-pressão de proteínas significativamente mais altos (cerca de 50% de aumentode rendimento) quando comparada aos da cepa do tipo selvagem. Este re-sultado é similar ao que foi previamente observado com a cepa knock-out dehsIU.

EXEMPLO 6: IDENTIFICAÇÃO DE ALVO ITERATIVO USANDO TECNO-LOGIA DE MICROARRANJO DE DNA

Para investigar se um conjunto novo de proteases é so-bre-regulado na cepa de deleção de protease de hsILN, experimentos demicroarranjo de DNA foram conduzidos. Experimentos de frasco de agitaçãopadrão foram executados usando a cepa do tipo selvagem (DC369) e mutante(HJ115) para expressar hGH. Para cada cepa, as 4 h após as amostras deindução term sido comparadas à amostra de ponto de tempo 0 h (logo antesda indução de proteína heteróloga) os experimentos de microarranjo de DNAforam executados. Comparando a razão de dois pontos de tempo entre ascepas do tipo selvagem e mutante, uma lista nova de genes de protease quesão sobre-regulados na cepa de deleção de protesase de hslUV foi identifi-cada (Tabela 8). Estes genes recentemente identificados codificando prote-ases podem agora ser os alvos para uma segunda rodada de eventos dedeleção de gene para também melhorar o rendimento de produção de pro-teína heteróloga.

TABELA 8: Genes de protease cujos níveis de mRNA de estado constantesão mais altos na cepa de deleção de protease de hsILA/ (HJ115) quandocomparados aos da cepa do tipo selvagem (DC369), com base na razão de4 h após indução de IPTG para 0 h (logo antes da indução).

<table>table see original document page 139</column></row><table><table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table>EXEMPLO 7: CO-SOBRE-EXPRESSÃO DE MODULADORES DE DO-BRAMENTO AUMENTA A SQLUBILIDADE DA PROTEÍNA ALVO HGH

Com base nos dados de perfilação transcripcional mostrados naFigura 4, expressão de moduladores de dobramentos (FMs) DnaK e DnaJ foiaumentada em cepas que produzem proteína recombinante comparadas àscepas de controle (ver Tabelas 4 e 5). Uma cepa que co-superproduziu GrpE,DnaK e DnaJ junto com hGH foi produzida e testada para identificar se istoresultou na acumulação de níveis aumentados de hGH solúvel.

CONSTRUCTO DE PLASMÍDEO CONTENDO grpE-dnaKJ PARACO-SOBRE-EXPRESSÃO COM hGH

Os genes de grpE-dnaKJ de P. fluorescens foram amplificadosusando o DNA cromossômico isolado de MB214 (DNeasy; Qiagen, Valença,CA) como um modelo, RC199 (5'-ATATACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCTGACGAACAGACGCA-3') e RC200 (5'-ATATTCTAGATTACAGGTCGCCGAAGAAGC-3') como iniciadores, PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, CA) foi usadoseguindo as recomendações do fabricante. O produto de PCR resultante (4 kb)foi digerido com Spel e Xòal (sítios de restrição sublinhados acima nos ini-ciadores) e ligado a pDOW2236 para criar pDOW2240 contendo os genes degrpE-dnaKJ sob o controle do promotor de tac. Plasmídeo pDOW2240 foidigerido com Spel e Hind\\\ e o fragmento de 4,0 kb contendo grpE-dnaKJresultante foi purificado em gel usando Qiaquick (Qiagen) e ligado apDOW2247 também digerido com Spel e Hind\\\. O plasmídeo resultante,pDOW3501, contendo grpE-dnaKJ sob o controle do promotor de manitol, foitransformado em DC388 mediante seleção em placas de glicose de M9 su-plementadas com 250 ug/ml de uracila. Por fim, pDOW1426 foi eletroporadona cepa acima (DC462) e selecionado em placas de glicose de M9, resultandoem cepa DC463 com dois plasmídeos induzíveis: 1) pDOW1426 carregandoPtac hGH e 2) pDOW3501 carregando Pmts grpE-dnaKJ.

FERMENTAÇÃO EM FRASCO DE AGITAÇÃO, COLETA DE AMOSTRA EANÁLISE

Culturas em duplicata de DC463 foram crescidas em frascos deagitação. Indução de proteína foi realizada pela adição de 0,1 mM de IPTGpara hGH e 0,5% de manitol para GrpE-DnaKJ em 24 hs após inoculação. Asamostras foram colhidas a 0, 4, 8, 24 e 48 horas após indução. Em cada pontode tempo, 20 células de OD6oo normalizada em 1 ml foram colhidas, lisadasusando Easylyse® (Epicentro, Madison, Wl) e separadas em frações solúveise insolúveis mediante centrifugação a 14000 rpm durante 30 minutos. Volu-mes iguais das amostras foram combinados com BioRad (Hercules, CA) 2xtampão de Laemmli, aquecidos para 95°C durante 5 minutos com 30 uLcarregados em um gel de Criterion a 15% de Tris HCI de BioRad usandotampão de operação de SDS de 1x Tris Glicina corrente (BioRad). As prote-ínas foram visualizadas com Simply Blue Safestain (Invitrogen, Carlsbad, CA)como mostrado na Figura 15. Os géis tingidos com Coomassie resultantesforam varridos usando um Densitômetro Pessoal de Molecular Devices (Mo-lecular Devices, Sunnyvale, CA) com análises executadas usando Image-Quant e Excel. Como mostrado na Figura 15, a co-sobre-expressão de GrpE,DnaKJ significativamente aumentou a solubilidade de hGH, convertendoquase 100% da proteína alvo na fração solúvel, embora a um rendimento deproteína total inferior. Experimentos adicionais repetindo crescimento e in-dução de DC463 usando a adição simultânea de IPTG e manitol de formabem próxima imitaram os resultados mostrados aqui, embora com um grauvariado de solubilidade de hGH (entre 50-100%; dados não mostrados),quando GrpE DnaKJ foram co-superproduzidos. Estas descobertas tambémdemonstram que engenharia de cepa alvejada com base em perfilamentotranscripcional pode levar a um projeto de cepa racional para aumentar asolubilidade e/ou rendimento de uma proteína recombinante.

A invenção foi descrita com referência a certas modalidades eexemplos não-limitativos. Estará claro a alguém de habilidade na técnica queoutras modalidades da invenção são também possíveis.

Claims (53)

1. Processo para melhorar a expressão de uma proteína ou pep-tídeo recombinante em uma célula ou organismo hospedeiro, compreen-dendo:i) expressar a proteína ou peptídeo recombinante na célula ouorganismo recombinante hospedeiro;ii) analisar um perfil genético da célula recombinante para identi-ficar um ou mais genes ou produtos de gene compensatórios que são ex-pressos a um nível mais alto na célula recombinante que em ou uma célulahospedeira que não foi modificada para expressar a proteína recombinante ouuma célula recombinante que não está expressando a proteína recombinante;eiii) alterar a expressão do gene ou produto de gene compensatórioidentificado na célula recombinante através de modificação genética parafornecer uma célula recombinante modificada que alcança um aumento emexpressão, atividade ou solubilidade da proteína recombinante.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen-dendo expressara proteína ou peptídeo na célula recombinante modificada.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen-dendo:(a) expressar a proteína ou peptídeo recombinante na célula re-combinante modificada;(b) analisar um perfil genético da célula recombinante modificadapara identificar pelo menos um/uns segundo(s) gene(s) ou produto(s) de geneque é/são diferencialmente expresso(s) na célula recombinante modificada;(c) alterar a expressão do segundo produto de gene identificadona célula recombinante modificada para fornecer uma célula duplamentemodificada; e(d) expressar a proteína ou peptídeo na célula recombinante du-piamente modificada.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, ainda compreen-dendo repetir as etapas a) a d).

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, compreendendorepetir as etapas a) a d) até a viabilidade da célula ser afetada alterando aexpressão do(s) gene(s) ou produto(s) de gene modificado(s).

6. Processo de acordo com a reivindicação 4, compreendendorepetir as etapas a) a d) até a expressão da proteína ou peptídeo recombi-nante alcançar um ponto terminal alvejado.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que um perfilgenético é analisado comparando um perfil genético da célula recombinante aum segundo perfil genético da célula hospedeira.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o perfilgenético é um perfil de transcriptoma.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que o perfil detranscriptoma é determinado por um microarranjo.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o perfilgenético é um perfil de proteoma.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que o perfil deproteoma é determinado por eletroforese em gel bidimensional, ICAT ouLC/MS.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que o perfil deproteoma é determinado por um arranjo de peptídeo.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o arranjode peptídeo é um arranjo de anticorpo.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o produtode gene identificado é uma protease, uma subunidade de uma protease, umco-fator de uma protease, um modulador celular ou um genético que afeta aexpressão de uma protease.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produtode gene identificado é uma protease.

16. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produtode gene identificado é uma subunidade de uma protease.

17. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produtode gene identificado é um co-fator de uma protease.

18. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produtode gene identificado é um modulador celular ou genético que afeta a ex-pressão de uma protease.

19. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produtode gene identificado é selecionado do grupo que consiste em D-alanil-me-so-diaminopimelato endopeptidase, zinco protease, dipeptidase microssomal,precursor de metaloprotease extracelular, proteína de divisão de célula ftsH eprodutos de gene derivados dos genes hslV, hslil, dpX, cIpA e dpB.

20. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o nível derRNA do produto de gene identificado é sobre-regulado quando a proteína oupeptídeo recombinante for expressado na célula hospedeira.

21. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o produtode gene identificado é removido de um genoma de célula hospedeira.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que o produtode gene identificado é removido através de recombinação homóloga.

23. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o produtode gene identificado é um modulador de dobra, uma subunidade de um mo-dulador de dobra, um co-fator de um modulador de dobra ou um moduladorcelular ou genético que afeta a expressão de um modulador de dobra.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produtode gene identificado é um modulador de dobra.

25. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produtode gene identificado é uma subunidade de um modulador de dobra.

26. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produtode gene identificado é um co-fator de um modulador de dobra.

27. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produtode gene identificado é um modulador celular ou genético que afeta a ex-pressão de um modulador de dobra.

28. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o mo-dulador de dobra é uma proteína de chaperona.

29. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o mo-dulador de dobra é selecionado do grupo que consiste em produtos de genedos genes cbpA, htpG, dnak, dnaJ, fkbP2, groES e groEL.

30. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que a ex-pressão do produto de gene identificado é alterada aumentando a expressãodo gene identificado, um co-fator de um gene identificado ou um moduladorcelular ou genético do gene identificado.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que a ex-pressão aumentada é por inclusão de um DNA que codifica o produto de geneidentificado.

32. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que a ex-pressão aumentada é por inserção de um promotor em um genoma da célulahospedeira.

33. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que a ex-pressão aumentada é por inclusão de um vetor exógeno na célula hospedeira.

34. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a célulahospedeira é uma célula microbiana.

35. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a célulahospedeira é uma Pseudomonada.

36. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a célulahospedeira é uma célula de P. fluorescens.

37. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a célulahospedeira é uma célula de E. coli.

38. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a célulahospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula de inseto,uma célula mamífera, uma célula de levedura, uma célula fúngica e uma cé-lula de planta.

39. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o micro-arranjo compreende amostras de pares de ligação para pelo menos 50% deum genoma da célula hospedeira.

40. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a técnicade microarranjo compreende amostras de pares de ligação para pelo menos-80% de um genoma da célula hospedeira.

41. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o micro-arranjo compreende amostras de pares de ligação para pelo menos 90% deum genoma da célula hospedeira.

42. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o micro-arranjo compreende amostras de pares de ligação para pelo menos 95% deum genoma da célula hospedeira.

43. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a ex-pressão melhorada é um aumento na quantidade de proteína ou peptídeorecombinante.

44. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a ex-pressão melhorada é uma solubilidade aumentada da proteína ou peptídeorecombinante.

45. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a ex-pressão melhorada é uma atividade aumentada da proteína ou peptídeo re-combinante.

46. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o perfilgenético é um perfil de genes em uma família de gene.

47. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o perfilcompreende proteases e moduladores de dobra.

48. Processo de acordo com a reivindicação 46, em que o perfilconsiste essencialmente em proteases.

49. Célula ou organismo hospedeiro, em que expressa uma pro-teína recombinante que foi geneticamente modificada para reduzir a ex-pressão de pelo menos duas proteases.

50. Célula ou organismo hospedeiro, em que expressa uma pro-teína recombinante que foi geneticamente modificada para reduzir a ex-pressão de pelo menos uma protease selecionada do grupo que consiste emD-alanil-meso-diaminopimelato endopeptidase, zinco protease, dipeptidasemicrossomal, precursor de metaloprotease extracelular, proteína de divisãode célula ftsH e produtos de gene derivados dos genes hslV, hslil, dpX, cIpAe dpB.

51. Célula ou organismo hospedeiro, em que expressa uma pro-teína derivada mamífera recombinante que foi geneticamente modificada parareduzir a expressão de pelo menos uma protease.

52. Célula ou organismo hospedeiro de acordo com a reivindi-cação 52, em que a proteína recombinante é hormônio de crescimento hu-mano.

53. Célula ou organismo hospedeiro, em que expressa uma pro-teína recombinante que foi geneticamente modificada para aumentar a ex-pressão de pelo menos dois moduladores de dobra que não sejam subuni-dades de modulador de dobra.