KR101340708B1 - 균주 조작에 의한 개선된 단백질 발현 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 단백질 또는 펩티드의 생산 수준을 개선시키거나 또는 숙주 세포에서 발현되는 활성 재조합 단백질 또는 펩티드의 수준을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 세포의 2개의 유전자 프로파일을 비교하고, 세포를 변형시켜, 재조합 단백질 발현에 반응하여 상향조절되는 유전자 생성물의 발현을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 예를 들어, 재조합 단백질의 용해도를 증가시킴으로써, 단백질 생산을 개선시킬 수 있거나 또는 단백질 품질을 개선시킬 수 있다.
유전자 프로파일, 트랜스크립톰, 프로테옴, 재조합 단백질, 프로테아제, 폴딩 조정인자, 인간 성장 호르몬

Description

균주 조작에 의한 개선된 단백질 발현 방법{PROCESS FOR IMPROVED PROTEIN EXPRESSION BY STRAIN ENGINEERING}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 특허 가출원번호 제60/591,489호 (2004년 7월 26일 출원)를 우선권으로 청구한다.
본 발명은 단백질 생산 분야에 속하고, 특히 재조합 단백질 또는 펩티드의 생산 수준을 개선시키거나 숙주 세포에서 발현되는 활성 재조합 단백질 또는 펩티드의 수준을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
155종을 초과하는 재조합 생산된 단백질 및 펩티드가 미국 식품 의약 안정청 (FDA)에 의해 생물공학 약물 및 백신으로서의 용도에 대해 승인되었고, 또다른 370종이 임상 시험 중이다. 화학 합성을 통해 생산된 소형 분자와 달리, 단백질 및 펩티드는 살아 있는 세포에서 가장 효율적으로 생산된다. 많은 경우에, 세포 또는 생물을 유전자 변형시켜, 단백질을 생산하거나 단백질 생산을 증가시킨다.
다량의 표적 단백질을 생산하도록 세포가 변형된 경우, 세포는 스트레스를 받게되고, 다른 단백질을 유도 또는 억제함으로써 종종 반응한다. 재조합 단백질의 생산 동안 숙주 세포가 겪는 스트레스는, 예를 들어, 특정 단백질 또는 보조인자의 발현을 증가시켜 과발현된 재조합 단백질의 분해를 야기할 수 있다. 보상 단백질의 증가된 발현은 높은 수준의 활성 전장(全長) 재조합 단백질을 발현시키는 목표에 역효과일 수 있다. 또다른 단백질의 감소된 발현 또는 충분한 발현의 부족은 재조합 단백질의 미스폴딩(misfolding) 및 응집을 야기할 수 있다. 스트레스 하의 세포가 이의 단백질 발현 프로파일을 변화시킬 것이라는 것이 공지되어 있지만, 어떤 특정 단백질이 상향조절 또는 하향조절될지는 어떠한 주어진 예에서도 공지되어 있지 않다.
마이크로어레이
마이크로어레이 기술을 사용하여 단일 분석으로 다수의 폴리뉴클레오티드의 존재 및 발현 수준을 확인할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,040,138호 (1995년 9월 15일 출원), 미국 특허 제6,344,316호 (1997년 6월 25일 출원), 미국 특허 제6,261,776호 (1999년 4월 15일 출원), 미국 특허 제6,403,957호 (2000년 10월 16일 출원), 미국 특허 제6,451,536호 (2000년 9월 27일 출원), 미국 특허 제6,532,462호 (2001년 8월 27일 출원), 미국 특허 제6,551,784호 (2001년 5월 9일 출원), 미국 특허 제6,420,108호 (1998년 2월 9일 출원), 미국 특허 제6,410,229호 (1998년 12월 14일 출원), 미국 특허 제6,576,424호 (2001년 1월 25일 출원), 미국 특허 제6,687,692호 (2000년 11월 2일 출원), 미국 특허 제6,600,031호 (1998년 4월 21일 출원), 및 미국 특허 제6,567,540호 (2001년 4월 16일 출원) 참조 (모두 모두 Affymetrix, Inc. 명의).
미국 특허 제6,607,885호 (E. I. duPont de Nemours and Co.)에는 박테리아 세포를 발현 변경 조건에 적용한 후 1차 마이크로어레이 측정과 2차 마이크로어레이 측정을 비교함으로써 유전자 발현 변화를 프로파일링 및 확인하는 방법이 기술되어 있다.
Wei 등은 마이크로어레이 분석을 사용하여 lac 유전자 유도로 대장균의 유전자 발현 프로파일을 조사하였다 ([Wei Y., et al. (2001), High-density microarray-mediated gene expression profiling of Escherichia coli. J Bacteriol. 183(2):545-56]). 또다른 그룹이 내인성 유전자의 돌연변이 또는 조절 유전자의 결실 후에 조절된 전사 프로파일을 또한 조사하였다 ([Sabina, J. et al (2003), Interfering with Different Steps of Protein Synthesis Explored by Transcriptional Profiling of Escherichia coli K-12 J Bacteriol. 185:6158-6170]; [Lee JH (2003), Global analyses of transcriptomes and proteomes of a parent strain and an L-threonine-overproducing mutant strain. J Bacteriol. 185(18):5442-51]; [Kabir MM, et al. (2003), Gene expression patterns for metabolic pathway in pgi knockout Escherichia coli with and without phb genes based on RT-PCR J Biotechnol. 105(1-2):11-31]; [Eymann C, et al. (2002), Bacillus subtilis functional genomics: global characterization of the stringent response by proteome and transcriptome analysis. J Bacteriol. 184(9):2500-20]).
Gill 등은 재조합 클로르암페니콜 아세틸트랜스페라제 융합 단백질의 발현 후 대장균에서 스트레스 관련 유전자의 발현 변화를 확인하기 위한 마이크로어레이 기술의 용도를 개시하였다 ([Gill et al. (2001), Genomic Analysis of High-Cell-Density Recombinant Escherichia coli Fermentation and "Cell Conditioning" for Improved Recombinant Protein Yield Biotech. Bioengin. 72:85-95]). 높은 세포 밀도에서, 전체 게놈의 16％만을 포함하는 스트레스 유전자 전사 프로파일을 사용하여, 재조합 단백질 과발현 전에 샤페론(chaperone), 프로테아제, 및 기타 세포내 단백질의 수준을 변경시키기 위한 "세포 컨디셔닝(conditioning)" 전략을 평가하였다. "컨디셔닝"을 위한 전략에는 디티오트레이톨 및 에탄올 처리를 통한 조작을 포함하는 세포의 약리학적인 조작이 수반되었다.
Asai 등은 세포 스트레스 후에 전형적으로 유도되는 특정 시그마 인자의 과발현에 의해 활성화된 표적 유전자를 확인하기 위한 마이크로어레이 분석의 용도를 기술하였다 ([Asai K., et al. (2003), DNA microarray analysis of Bacillus subtilis sigma factors of extracytoplasmic function family. FEMS Microbiol. Lett. 220(1):155-60]). 시그마 인자뿐만 아니라 시그마 인자 프로모터에 연결된 리포터(reporter) 유전자를 과발현하는 세포를 사용하여 스트레스에 의해 조절되는 유전자 유도를 나타냈다.
Choi 등은 인간 인슐린 유사 성장 인자 융합 단백질 (IGF-If)을 발현하는 대장균의 고밀도 뱃치(batch) 배양에서 하향조절되는 대사 유전자의 분석 및 상향조절을 기술하였다 ([Choi et al. (2003), Enhanced Production of Insulin-Like Growth Factor I Fusion Protein in Escherichia coli by Coexpression of the Down-Regulated Genes Identified by Transcriptome Profiling App. Envir. Microbio. 69:4737-4742]). 이러한 연구는 단백질 유도 후 고밀도 조건 동안 발생하는 대사 변화에 초점이 맞춰졌다. 고밀도 성장 조건 동안 재조합 단백질 생산의 유도 후 하향 조절된 유전자를 확인하고, 하향 조절된 특정 대사 유전자를 재조합 IGF-If를 생산하는 세포에서 발현시켰다. 이러한 연구는 특정 뉴클레오티드 염기 및 아미노산의 대사 생산의 증가가 단백질 생산을 증가시킬 수 있다는 것과 하향 조절된 대사 전달체 분자의 발현을 증가시킴으로써 성장 속도가 변형될 수 있다는 것을 나타냈다. 이러한 전략들은 일반적으로 단백질 생산과 또는 고밀도 배양과 관련된 대사 스트레스를 감소시키기 위해 세포 환경을 변경하도록 고안되었다.
단백질 분해
재조합 단백질의 원치 않는 분해는 특정 발현 시스템의 효율적인 사용에 장애가 된다. 외인성 단백질의 발현은 숙주 세포에서 종종 스트레스 반응을 유도하고, 이는 예를 들어, 제한된 탄소원에 대한 천연 방어일 수 있다. 모든 세포는 분해성 단백질을 생산할 수 있는 다수의 유전자를 함유한다. 특정 재조합 단백질의 발현에 반응하여 소정의 숙주에 의해 어떤 프로테아제가 조절될지를 예측하는 것은 불가능하다. 예를 들어, 박테리아 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)는 200종 이하의 프로테아제 및 프로테아제 관련 단백질을 함유한다.
대장균의 세포질에서, 일군의 프로테아제 및 보조인자 분자에 의해 단백질분해가 일반적으로 수행된다. 대부분의 초기 분해 단계는 5개의 ATP-의존성 Hsp에 의해 수행된다: Lon/La, FtsH/HflB, ClpAP, ClpXP 및 ClpYQ/HslUV ([Gottesman S (1996), Proteases and their targets in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 30:465-506]). FtsH (활성 부위가 세포질을 향하는 내부 막-회합 프로테아제)와 함께, ClpAP 및 ClpXP는 비-극성 불안정화 꼬리인 AANDENYALAA의 부가에 의해 카르복실 말단에서 변형된 단백질의 분해를 담당한다 ([Gottesman S, et al. (1998), The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxyl-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev. 12:1338-1347]; [Herman C, et al. (1998), Degradation of carboxy-terminal-tagged cytoplasmic proteins by the Escherichia coli protease HflB (FtsH). Genes Dev. 12:1348-1355]).
재조합 단백질 생산 동안 분해를 방지하기 위해 여러 접근법들이 취해졌다. 한 접근법은 프로테아제 유전자 내에 돌연변이를 갖는 숙주 균주를 생산하는 것이다. 예를 들어, Baneyx 및 Georgiou는 프로테아제-결핍 균주를 사용하여 단백질 A-β-락타마제 융합 단백질의 수율을 개선시켰다 ([Baneyx F, Georgiou G. (1991), Construction and characterization of Escherichia coli strains deficient in multiple secreted proteases: protease III degrades high-molecular-weight substrates in vivo. J Bacteriol 173: 2696-2703]). Park 등은 유사한 돌연변이성 접근법을 사용하여 재조합 단백질 활성을 부모 대장균 균주와 비교하여 30％ 개선시켰다 ([Park S. et al. (1999), Secretory production of recombinant protein by a high cell density culture of a protease negative mutant Escherichia coli strain. Biotechnol. Progr. 15:164-167]). 미국 특허 제5,264,365호 및 제5,264,365호에는 단백질분해에 민감한 폴리펩티드를 생산하기 위한 프로테아제-결핍 대장균, 특히 다중 프로테아제 결핍 균주가 기술되어 있다. PCT 공개공보 WO 90/03438에는 프로테아제 결핍 균주 또는 프로테아제 억제제를 포함하는 균주가 포함되는 대장균 균주의 생산이 기술되어 있다. 유사하게, PCT 공개공보 WO 02/48376에는 프로테아제 DegP 및 Prc가 결핍된 대장균 균주가 기술되어 있다.
단백질 폴딩( folding )
숙주 세포에서 재조합 단백질을 생산하는 것의 또다른 주요 장애는 종종 세포가 가용성 또는 활성 단백질을 생산하도록 충분하게 채비되지 않는다는 것이다. 단백질의 1차 구조는 이의 아미노산 서열에 의해 정해지지만, 2차 구조는 알파 나선 또는 베타 시트에 의해 정해지고, 3차 구조는 인접한 단백질 신축물 간의 공유 결합, 예컨대 디술피드 결합에 의해 정해진다. 특히 대규모 생산에서, 재조합 단백질을 발현시킬 때, 단백질 자체의 2차 및 3차 구조는 임계적으로 중요하다. 단백질 구조에서의 모든 현저한 변화로 기능적으로 비활성인 분자, 또는 생물학적 활성이 현저하게 감소된 단백질이 산출될 수 있다. 많은 경우에, 숙주 세포는 활성 재조합 단백질의 적합한 생산에 필요한 폴딩 조정인자 (FM)를 발현한다. 그러나, 유용한, 경제적으로 만족스러운 생물공학 생성물의 생산에 일반적으로 필요한 높은 수준의 발현에서, 종종 세포가 충분한 천연 폴딩 조정인자 또는 재조합 단백질을 프로세싱하는 조정인자를 생산할 수 없다.
특정 발현 시스템에서, 외인성 단백질의 생산과잉에는 이의 미스폴딩 및 불용성 응집체 내로의 격리가 동반될 수 있다. 박테리아 세포에서, 이러한 응집체들은 봉입체로 공지되어 있다. 대장균에서, 폴딩 조정인자/샤페론의 네트워크는 Hsp70 족을 포함한다. 주요 Hsp70 샤페론인 DnaK는 효율적으로 단백질 응집을 예방하고, 손상된 단백질의 리폴딩(refolding)을 지지한다. 단백질 응집체 내로의 열 충격 단백질의 혼입은 응집체분해를 촉진할 수 있다. 그러나, 봉입체로 프로세싱된 단백질을, 특정 경우에, 불용성 분획의 추가적인 프로세싱을 통해 회수할 수 있다. 봉입체에서 발견된 단백질들은 변성 및 탈변성을 포함하여 여러 단계를 통해 전형적으로 정제되어야 한다. 봉입체를 표적으로 하는 단백질에 대한 전형적인 탈변성 프로세스에는 농축된 변성제에서 응집체를 용해하고 이어서 희석에 의해 변성제를 제거하려는 시도가 수반된다. 이러한 단계에서 응집체가 빈번하게 다시 형성된다. 추가적인 프로세싱은 비용을 부가하고, 시험관내 리폴딩으로 생물학적으로 활성인 생성물이 산출될 것이라는 것이 보장되지 않으며, 회수된 단백질이 다량의 단편 불순물을 포함할 수 있다.
단백질 응집을 감소시키기 위한 한 접근법은, 가장 통상적으로는 배양 온도를 감소시킴으로써, 발효 조작에 의한 것이다 ([Baneyx F (1999), In vivo folding of recombinant proteins in Escherichia coli. In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Ed. Davies et al. Washington, DC: American Society for Microbiology ed. 2:551-565] 및 이의 참고문헌 참조). 폴딩 중간체와의 일시적으로 상호작용에 의해 다른 폴리펩티드의 적합한 이성화 및 세포 표적화를 촉진하는 분자성 샤페론에 의해서, 그리고 폴딩 경로를 따라 속도-제한 단계를 가속화시키는 폴딩효소(foldase)에 의해서 생체내 단백질 폴딩이 보조된다는 더 욱 최근의 이해는 봉입체 형성의 문제에 대항하는 추가적인 접근법을 제공하였다 (예를 들어, [Thomas JG et al. (1997), Molecular chaperones, folding catalysts and the recovery of active recombinant proteins from E. coli: to fold or to refold. Appl Biochem Biotechnol, 66:197-238] 참조).
특정한 경우에, 샤페론의 과발현이 응집하기 쉬운 단백질의 가용성 수율을 증가시키는 것으로 발견되었다 ([Baneyx, F. (1999), Recombinant Protein Expression in E. coli Curr. Opin. Biotech. 10:411-421] 및 이의 참고문헌 참조). 이 프로세스는 미리 형성된 재조합 봉입체의 용해를 수반하는 것으로 나타나지 않았지만, 새롭게 합성된 단백질 사슬의 개선된 폴딩에 관련된다. 예를 들어, Nishihara 등은 groESL 및 dnaJK/grpE를 세포질에서 동시발현시켜 재조합 Cryj2 (일본 삼나무 꽃가루의 알레르겐)의 안정성 및 축적을 개선시켰다 ([Nishihara K, Kanemori M, Kitagawa M, Yanagi H, Yura T. 1998. Chaperone coexpression plasmids: differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding of an allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2, in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64:1694). Lee 및 Olins 또한 GroESL 및 DnaK를 동시발현시켰고, 인간 프로콜라게나제의 축적이 10배 증가되었다 ([Lee S, Olins P. 1992. Effect of overproduction of heat shock chaperones GroESL and DnaK on human procollagenase production in Escherichia coli. JBC 267:2849-2852]). 이러한 샤페론의 세포내 농도 증가와 관련된 이로운 효과는 과잉생산된 단백질의 성질에 고도로 의존적인 것으로 여겨지고, 성공은 결코 보장되지 않는다.
제작 비용을 감소시키고 활성 생성물의 수율을 증가시키기 위해 개선된 재조합 단백질 또는 펩티드 생산, 활성 또는 용해도를 나타내는 숙주 균주의 개발을 위한 프로세스가 요구된다.
따라서, 본 발명의 목표는 숙주에서의 재조합 단백질 발현을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목표는 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포에서의 발현 수준을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목표는 재조합 발현 시스템에서 제조된 가용성 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목표는 재조합 발현 시스템에서 제조된 활성 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
i) 재조합 단백질 또는 펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
ii) 세포의 유전자 프로파일(genetic profile)을 분석하고, 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현 또는 과발현 시 상향 조절되는 1개 이상의 내인성 유전자 생성물을 확인하는 단계; 및
iii) 1개 이상의 확인된 내인성 유전자 생성물의 발현을 세포의 유전자 변형으로 변화시키는 단계
를 포함하는 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 개선시키는 방법이 제공된다.
이 방법은 개선된 단백질 수율에 의해 측정되는 바와 같은 개선된 발현을 제공할 수 있거나, 또는, 예를 들어 발현된 재조합 단백질 또는 관련 단백질 또는 펩티드의 용해도를 증가시킴으로써, 활성 단백질의 회수를 개선시킬 수 있다.
이러한 방법을 사용하여, 다수의 단백질 중 어느 것이 외래 재조합 단백질의 발현을 보상하도록 세포에 의해 "선택"되는지를 결정할 수 있고, 이러한 정보는 더욱 효과적인 단백질 발현 시스템의 개발에 이르게 할 수 있다. 예를 들어, 전형적으로, 과발현된 재조합 단백질을 분해시키기 위해 세포가 1개 이상의 프로테아제를 선택적으로 상향조절할 것이라는 것이 공지되어 있다. 그러나, 임의의 주어진 재조합 단백질에 의해 야기되는 스트레스를 보상하기 위해 어떤 프로테아제(들)을 세포가 상향조절할지는 미리 예측할 수 없다. 마이크로어레이 또는 등가(等價)의 기술에 의한 세포의 유전자 프로파일의 분석으로 외인성 단백질 생산에 반응하여 주어진 세포에서 어떤 프로테아제가 상향조절되는지를 확인할 수 있다. 그 후, 이러한 정보를 사용하여 세포를 유전자 변형시켜, 세포 항상성에 유용하거나 심지어는 필요한 다른 단백질은 보존시키면서 이러한 특정 프로테아제의 발현을 감소시킬 수 있다.
또다른 예로서, 세포는 1개 이상의 폴딩 조정인자 또는 보조인자를 선택적으로 상향조절하여, 재조합 단백질의 폴딩 능력 또는 용해도를 증가시킬 수 있다. 다시, 특정 재조합 단백질의 프로세싱을 보조하기 위해 어떤 폴딩 조정인자 또는 보조인자가 주어진 시스템에서 선택될지를 미리 예측할 수 없다. 마이크로어레이 또는 등가의 기술에 의한 유전자 프로파일의 분석은 상향조절된 폴딩 조정인자 또 는 보조인자를 확인할 수 있도록 한다. 이러한 정보를 기초로, 세포를 유전자 변형시켜, 주어진 재조합 단백질에 대해 세포가 선호하는 폴딩 조정인자 또는 보조인자의 발현을 증가시킨다. 이러한 변형은, 세포 항상성에 대한 불리한 영향을 최소화시키면서, 회수된 활성 단백질의 백분율을 증가시킬 수 있다.
따라서, 세포의 전체적인 기타의 이로운 메카니즘은 내버려 두고 선택적인 방식으로 보상 단백질 (즉, 소정의 세포 스트레스에 반응하여 상향조절된 단백질)의 발현을 증가 또는 감소시켜 숙주 생물을 변형시킴으로써 재조합 단백질의 수율 및/또는 활성 및/또는 용해도가 증가될 수 있다.
이 방법은 활성 재조합 단백질의 발현이 최적화될 때까지 반복적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 방법을 사용하여, 1개 이상의 확인된 보상 단백질을 상향조절, 하향조절, 녹인(knock-in) 또는 녹아웃(knock-out)하도록 숙주 세포 또는 생물을 유전자 변형시킬 수 있다. 그 후 이렇게 변형된 숙주 세포 또는 생물을 배양하여, 재조합 단백질, 또는 관련 단백질 또는 펩티드, 및 마이크로어레이 또는 등가의 분석법을 통해 확인되는 추가적인 보상 단백질을 발현시킬 수 있다. 그 후 변형된 숙주 세포 또는 생물을 다시 유전자 변형시켜, 추가적인 선택된 보상 단백질을 상향조절, 하향조절, 녹인 또는 녹아웃시킨다. 숙주 생물 또는 세포의 과도한 약화 없이 활성 및/또는 가용성 단백질의 최대 발현을 나타내는 숙주 세포 또는 생물이 수득될 때까지 이러한 방법을 반복할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단계들을 예를 들어 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 이상 반복할 수 있다.
또다른 실시 양태에서, 이 방법은 iv) 재조합 단백질 또는 펩티드를 유전자 변형된 세포에서 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 v) 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 유전자 변형된 세포의 제2의 유전자 프로파일을 분석하고, 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 변형된 세포에서 차별적으로 발현되는 1개 이상의 추가적인 유전자 생성물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 이 방법은 vi) 1개 이상의 확인된 추가적인 유전자 생성물의 발현을 변화시켜 이중 변형된 세포를 제공하는 단계를 추가적으로 포함한다. 임의로, 재조합 단백질 또는 펩티드, 또는 관련 단백질 또는 펩티드가 이중 변형된 세포에서 발현될 수 있다. 변형된 세포에서 확인된, 차별적으로 조절된 유전자 생성물은 숙주 세포와 비교하여 또는 이 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 변형된 세포와 비교하여 상향- 또는 하향-조절될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 이 방법은 iv) 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 유전자 변형된 세포의 제2의 유전자 프로파일을 분석하고, 이 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 변형된 세포에서 차별적으로 발현되는 1개 이상의 추가적인 유전자 생성물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 이 방법은 v) 변형된 세포에서 1개 이상의 추가적인 확인된 유전자 생성물의 발현을 변화시켜 이중 변형된 세포를 제공하는 단계를 추가적으로 포함한다. 변형된 세포에서 확인된, 차별적으로 조절된 유전자 생성물은 숙주 세포 또는 생물과 비교하여 또는 이 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 변형된 세포와 비교하여 상향- 또는 하향-조절될 수 있다.
한 특정 실시양태에서, i) 재조합 단백질 또는 펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계; ii) 세포의 유전자 프로파일을 분석하고, 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현 시 상향 조절되는 1개 이상의 프로테아제를 확인하는 단계; 및 iii) 확인된 프로테아제의 발현을 숙주 세포 또는 생물의 유전자 변형으로 변화시켜, 상향조절된 프로테아제의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 개선시키는 방법이 제공된다. 추가적인 실시양태에서, 이 방법은 변형된 세포에서 적어도 제2의 확인된 프로테아제의 발현을 변화시켜 이중으로 프로테아제가 변형된 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 iv) 재조합 단백질 또는 펩티드, 또는 관련 단백질 또는 펩티드를 프로테아제가 변형된 세포에서 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 프로테아제가 변형된 세포의 제2의 유전자 프로파일을 분석하여, 변형된 세포에서 차별적으로 발현되는 1개 이상의 추가적인 유전자 생성물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
또다른 실시양태에서, i) 재조합 단백질 또는 펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계; ii) 세포의 유전자 프로파일을 분석하고, 재조합 단백질 또는 펩티드의 과발현 후 상향 조절되는 1개 이상의 상향 조절된 폴딩 조정인자 (FM)를 확인하는 단계; 및 iii) 1개 이상의 확인된 폴딩 조정인자의 발현을 세포의 유전자 변형으로 변화시켜, FM이 변형된 세포를 제공하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 개선시키는 방법이 제공된다. 추가적인 실시양태에서, 이 방법은 변형된 세포에서 적어도 제2의 확인된 폴딩 조정인자의 발현을 변형시켜 이중으로 FM이 변형된 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 iv) 재조합 단백질 또는 펩티드, 또는 관련 단백질 또는 펩티드를 FM이 변형된 세포에서 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 FM이 변형된 세포의 제2의 유전자 프로파일을 분석하여 변형된 세포에서 차별적으로 발현되는 1개 이상의 추가적인 유전자 생성물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "유전자 프로파일"은 게놈 내의 유전자, 게놈 내의 유전자로부터 전사된 mRNA (또는 등가의 cDNA), 세포에 의해 변형된 전사 생성물 예컨대 진핵생물 시스템에서의 유전자의 스플라이스 변이체, 또는 세포에 의해 변형되거나 또는 게놈으로부터 번역된 mRNA의 스플라이스 변이체로부터 번역된 단백질을 포함하여, 게놈 내의 유전자로부터 번역된 단백질 또는 펩티드의 분석을 포함하는 것을 의미한다. 유전자 프로파일은 1개를 초과하는 유전자 또는 유전자 생성물을 포함하는 것을 의미하고, 전형적으로 적어도 5, 10, 50, 100 개 이상의 분석되는 유전자 또는 유전자 생성물의 군을 포함한다.
한 실시양태에서, 분석된 유전자 프로파일은 트랜스크립톰(transcriptome) 프로파일, 즉, 게놈으로부터의 유전자의 전사 생성물의 프로파일일 수 있다. 마이크로어레이 또는 등가의 기술을 사용하여 트랜스크립톰 프로파일을 분석하는 것이 방법에 포함될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 마이크로어레이는 숙주 세포의 트랜스크립톰의 적어도 일부에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있고, 전형적으로 생물의 게놈의 적어도 50％의 유전자 생성물에 대한 결합 파트너로부터의 샘플을 포함한다. 더욱 전형적으로, 마이크로어레이는 숙주 세포의 게놈 내의 유전자 생성물 에 대한 적어도 80％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 결합 파트너로부터의 샘플을 포함한다.
별도의 실시양태에서, 마이크로어레이는 재조합 단백질 발현에 영향을 받는 생성물의 부류를 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물에 대한 결합 파트너의 선택된 서브세트(subset)를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로는 추정 또는 공지된 프로테아제, 프로테아제 또는 프로테아제-유사 단백질의 보조인자; 폴딩 조정인자, 폴딩 조정인자의 보조인자, 또는 단백질 폴딩 또는 용해도를 개선시킬 수 있는 단백질; 전사 인자; 핵산 안정성 또는 번역 개시에 수반되는 단백질; 키나제; 세포외 또는 세포내 수용체; 대사 효소; 대사 보조인자; 외피 단백질; 시그마 인자; 막 결합 단백질; 막횡단 단백질; 막 회합 단백질 및 하우스키핑(housekeeping) 유전자가 포함된다. 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 발현된 유전자가 마이크로어레이에 결합하는 것을 측정함으로써 유전자 프로파일을 분석할 수 있다. 비-마이크로어레이 분석법 예컨대 노던 블롯(blot) 분석법이 포함되는 블롯 분석법 또는 결합 파트너로 코팅된 컬럼을 사용하여 트랜스크립톰 프로파일을 또한 분석할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 분석된 유전자 프로파일은 프로테옴(proteome) 프로파일, 즉 주어진 생물 내의 유전자로부터 생산된 단백질의 프로파일일 수 있다. 2차원 전기영동을 예를 들어 사용하여 프로테옴 프로파일을 분석하는 것이 방법에 포함될 수 있다. 2차원 겔 전기영동 또는 다차원 액체 크로마토그래피와 같은 분리 도구와 조합된 질량 분광법과 같은 기술이 방법에서 또한 사용될 수 있다. 2차원 전기영동에서, 분리된 단백질은 생물의 프로테옴의 적어도 10％로부터의 단백질을 포함할 수 있다. 더욱 전형적으로, 숙주 세포의 프로테옴 내의 단백질의 적어도 20％, 30％, 40％, 60％, 80％ 또는 90％로부터의 단백질이 단백질의 염색 및/또는 질량 분광법과 같은 기술에 의해 분리 및 분석된다.
추가적인 실시양태에서, 질량 분광법을 이용하여 프로테옴 프로파일을 분석한다. 질량 분광법 (MS) 및 직렬 질량분광법 (MS/MS)과 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC)를 사용하여 단백질들을 확인하고 이의 상대 존재비를 측정하는 여러 관련된 기술들이 존재한다. 종종, 한 샘플을 화학적 성질을 변화시키지 않으면서 또다른 샘플에 대한 비교를 고려하여 무거운 동위원소 택으로 표지시킨다. 예를 들어, 한 샘플에서 아미노산 시스테인을 8개의 수소 원자를 함유하는 택으로 표지시킬 수 있다. 또다른 샘플은 그 대신에 8개의 중수소 ("무거운") 원자를 함유하는 택으로 표지시킨다 (+8 달톤). MS 데이타를 사용하여 8달톤 떨어진 펩티드의 쌍을 확인하고, 차이를 정량할 수 있다. 동일한 펩티드로부터의 MS/MS 데이타는 1차 서열의 근사값, 및 단백질 신원을 제공한다. 또다른 실험은 세포를 "무거운" 아미노산과 함께 성장시킴으로써 생체 내에서 단백질을 표지시킨다. 이러한 유형의 기술을 사용하여 수천개의 단백질을 단일 실험에서 확인할 수 있고, 양 샘플에 존재하는 경우 상대 존재비를 추정할 수 있다 ([Goodlett DR and Aebersold RH (2001). Mass Spectrometry in Proteomics. Chem Rev101:269-295] 참조). ICAT는 MS/MS 유형이고, 동위원소 코딩 친화력 택 (Isotope Coded Affinity Tags)을 가리킨다 ([Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, GeIb MH, and Aebersold RH (1999). Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech 17:994-999] 참조).
또다른 실시양태에서, 마이크로어레이를 예를 들어 사용하여 프로테옴 프로파일을 분석하는 단계가 방법에 포함될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 어레이는 적합한 성장 조건 하에 숙주 세포에 의해 발현된 단백질의 적어도 일부에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있고, 전형적으로 생물의 프로테옴의 적어도 10％로부터의 단백질에 대한 결합 파트너를 포함한다. 더욱 전형적으로, 마이크로어레이는 숙주 세포의 프로테옴 내의 단백질의 적어도 20％, 30％, 40％, 60％, 80％ 또는 90％로부터의 단백질에 대한 결합 파트너를 포함한다. 결합 파트너는 항체일 수 있고, 이는 단일쇄 항체 단편과 같은 항체 단편일 수 있다. 별도의 실시양태에서, 마이크로어레이는, 추정 프로테아제 단백질 또는 추정 폴딩 조정인자를 예를 들어 포함하는, 프로테옴으로부터의 선택된 서브세트의 단백질에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있다. 마이크로어레이는 대조군으로 사용되는 단백질에 대한 결합 파트너 세트를 전형적으로 또한 포함할 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 단백질이 마이크로어레이 상의 결합 파트너에 결합하는 것을 측정함으로써 유전자 프로파일을 분석할 수 있다. 표준 분석 포맷, 예컨대 ELISA 분석 또는 표준 웨스턴 블롯 분석으로 프로테옴 프로파일을 또한 분석할 수 있다.
유전자 프로파일에서의 샘플을 개별적으로 분석하거나 또는 클러스터(cluster)로 그룹화할 수 있다. 클러스터는 유전자 발현에서의 유사성에 의해 전형적으로 그룹화된다. 특정 실시양태에서, 클러스터를 유사한 정도로 상향조절되 는 유전자로서 또는 유사한 정도로 하향조절되는 유전자로서 그룹화할 수 있다.
확인된 상향조절된 유전자는 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 유전자 프로파일을 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 숙주 세포의 유전자 프로파일과 비교함으로써 전형적으로 확인된다. 추가적인 실시양태에서, 제1 재조합 단백질과 상동성인 단백질을 발현하는 숙주 세포가 분석된다.
재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 게놈을 재조합, 예를 들어 상동 재조합 또는 이종 재조합에 의해 변형시킬 수 있다. 유전자, 특히 확인된 프로테아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내의 1개 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이에 의해 게놈을 또한 변형시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자 생성물의 억제제, 예컨대 프로테아제 억제제를 코딩하는 1개 이상의 벡터를 포함함으로써 숙주 세포가 변형된다. 또다른 실시양태에서, 천연 프로모터일 수 있는 프로모터의 억제에 의해 숙주 세포가 변형된다. 별도의 실시양태에서, 유전자, 전형적으로 폴딩 조정인자 또는 폴딩 조정인자의 보조인자를 코딩하는 1개 이상의 벡터를 포함함으로써 숙주 세포가 변형된다. 또다른 실시양태에서, 외인성 프로모터를 숙주 세포 게놈에 부가하는 것을 포함하여, 확인된 폴딩 조정인자 또는 폴딩 조정인자의 보조인자에 대한 프로모터를 증강시킴으로써 숙주 세포가 변형된다.
숙주 세포는 재조합 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물, 예컨대 에쉐리키아(Escherichia) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 포함되지만 이에 한정되지 않는 박테리아 세포이다. 숙주 세포는 슈도모나드(Pseudomonad) 세포 예컨대 슈도모나스 플루오레센스 세포일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 스포돕테라(Spodoptera), 트리코플루시아 드로소필라 (Trichoplusia Drosophila) 또는 에스티그메네(Estigmene) 종으로부터의 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는 곤충 세포, 또는 마우스 세포, 햄스터 세포, 원숭이, 유인원 또는 인간 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는 포유동물 세포이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 담배 세포, 옥수수, 아라비돕시스(Arabidopsis) 종으로부터의 세포, 감자 또는 쌀 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는 식물 세포이다. 또다른 실시양태에서, 트랜스제닉 생물이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 전체 생물이 본 방법에서 분석된다.
한 실시양태에서, 확인된 상향조절된 보상 유전자 또는 유전자 생성물은 1개 이상의 프로테아제 및/또는 1개 이상의 폴딩 조정인자이다. 특정 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자 생성물은 또한 프로테아제 또는 폴딩 조정인자 또는 프로테아제의 보조인자 또는 폴딩 조정인자의 보조인자의 서브유닛일 수 있다. 한 실시양태에서, 확인된 유전자는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파르타산 또는 메탈로 펩티다제(peptidase)로부터 선택될 수 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자 생성물은 hsIV, hsIU, clpA, clpB 및 clpX로부터 선택될 수 있다. 확인된 유전자 또는 유전자 생성물은 또한 프로테아제의 보조인자일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자 생성물은 폴딩 조정인자이다. 특정 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자 생성물은 샤페론 단백질, 폴딩효소, 펩티딜 프롤릴 이성화효소 및 디술피드 결합 이성화효소로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자 생성물은 htpG, cbpA, dnaJ, dnaK 및 fkbP로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 확인된 상향조절된 유전자와 상동성인 유전자 또는 유전자 생성물이 숙주의 게놈에서 변형된다.
예를 들어, 정해진 양의 시간 내에 숙주 단백질 (전체 세포 단백질) 그램 당 단백질의 양을 증가시킴으로써, 또는 세포 또는 생물이 재조합 단백질을 생산하는 시간 길이의 양을 증가시킴으로써, 본 발명의 방법으로 숙주 세포에서의 재조합 단백질 또는 펩티드 생산이 증가될 수 있다. 증가된 생산은, 예를 들어, 에너지 소비를 감소시킴으로써, 이용가능한 자원의 사용을 증가시킴으로써, 또는 성장 배지 내의 성장 보충물에 대한 요구조건을 감소시킴으로써, 세포 또는 생물의 효율을 최적화시킬 수 있다. 또한 증가된 생산으로 재조합물 그램 당 또는 숙주 세포 단백질 그램 당 생산된 회수가능한 단백질 또는 펩티드, 예컨대 가용성 단백질의 수준이 증가될 수 있다.
본 발명은 청구된 방법에 의해 생산된 개선된 재조합 숙주 세포를 또한 포함한다.
도 1은 슈도모나스 플루오레센스의 여러 균주의 성장 비교 그래프 (시간에 따른 광학 밀도)이다. 접종 24시간 후에 세포를 0.3M의 IPTG로 유도하였다. 균주는 하기와 같다: 빈 벡터 pDOW1339를 지니는 DC280, 가용성 세포질 니트릴라제 효소를 생산하는 DC240, 및 부분적으로 불용성인 원형질막주위공간 hGH를 생산하는 DC271. DC280, DC240 및 DC271의 부모 균주인 DC206이 대조군으로 포함되었다. 화살표로 표시되는 바와 같이, RNA 단리 및 유전자 발현 프로파일링을 위해 샘플을 IPTG 유도 0시간 및 4시간 후에 취하였다.
도 2는 0시 IPTG와 비교했을 때 IPTG 4시간 후의 슈도모나스 플루오레센스 균주 DC280, DC240 및 DC271로부터의 모든 유전자의 12개의 클러스터로의 계층적 클러스터링(clustering)의 그래프이다 (도면 하단부에 표시됨). 값 및 경향을 기초로, Spotfire DecisionSite로부터의 계층적 클러스터링 알고리즘을 사용하여 유전자들을 클러스터링하고 그룹화하였다. 점선은 불량한 스폿 품질 또는 낮은 수준의 발현으로 인해 걸러진 데이타 포인트를 가리킨다. x축은 각 균주의 비교를 나타낸다; y축은 IPTG 유도 전과 비교하여 4시간 후의 상대적인 발현 값을 나타낸다. 모든 확인된 FM들은 강조된다. 클러스터 7은 원형질막주위공간 hGH 단백질을 과잉생산하는 균주 DC271에서 고도로 발현된 2개의 FM 및 2개의 프로테아제 서브유닛 유전자를 나타낸다. 나머지 FM 유전자들은 클러스터 6으로 분류된다.
도 3은 도 2로부터의 클러스터 6의 계층적 클러스터 분석이다. 새로운 클러스터 8에서, 2개의 폴딩 조정인자, DnaK 및 DnaJ가 확인되었고, 이 둘 모두 앞서 확인된 HslVU, CbpA, 및 HtpG와 유사하게 원형질막주위공간 재조합 단백질 생산에 대해 더 높은 발현 수준을 나타냈다. 클러스터 6은 나머지 FM들이 분류되는 곳을 나타낸다.
도 4는 표 5, 6 및 7의 3세트의 실험으로부터의 상향조절된 프로테아제 및 FM을 나타내는 벤 다이아그램(Venn diagram)이다. 표 5, 6 및 7에 요약된 바와 같 이, 유전자들의 목록을 벤 다이아그램으로 구성하여, 코너에 표시된 3세트의 실험 중에서 유전자 목록의 겹침을 강조하였다. 각각의 유전자에 대해, 각 실험의 비율은 2를 컷오프(cut off)로 하여 제시되었다.
도 5는 Artemis에 의해 생성된 슈도모나스 플루오레센스로부터의 hslV (RXF01961) 및 hslU (RXF01957) 유전자의 서열 분석 그래프이다. 코돈 사용 플롯 (상부 패널)은 유전자 경계가 정확함을 가리킨다. 이는 RXF01961 및 RXF01957의 유전자 아래에 지시된 바와 같은 슈도노마스 아에루기노사(P. aeruginosa)에 대한 HslV 및 HslU 단백질 서열의 가장 양호한 상동체에 의해 보강된다. Phrap 품질 스코어 플롯은 서열 품질이 양호하다는 것을 나타내고, 즉 스코어 라인이 10kb 내의 1개의 에러보다 양호한 품질을 가리키는 수평선의 위쪽에 있다 (중간 패널). 유전자 아래의 열린 백색 화살표 박스는 DNA 마이크로어레이 실험에서 사용하기 위해 생성된 프로브들의 위치를 나타낸다.
도 6은 hslU의 약 550 bp의 PCR 생성물 (밝은 청색 박스)가 TOPO TA2.1 클로닝 벡터 (원) 내로 결찰된 hslU 돌연변이체 구축의 개요도이다. 생성된 플라스미드를 수용성(competent) 슈도모나스 플루오레센스 세포 내로 형질전환시키고, 카나마이신 (kan)-저항성 콜로니를 진단용 PCR에서 분석하여, hslU 유전자에서의 삽입 돌연변이의 구축을 확인하였다.
도 7은 진탕 플라스크 생산 배지에서 hGH 또는 pbp::hGH를 과잉생산하는 hslU 돌연변이체 균주와 야생형을 비교하는 성장 곡선 분석법의 그래프이다. 화살표는 샘플을 취한 시점을 가리킨다.
도 8은 pbp::hGH를 발현하는 균주 DC271 및 DC373의 SDS-PAGE 분석법의 이미지이다. 샘플을 DC271 (야생형, W) 및 DC373 (hslU 돌연변이체, M)로부터 단백질 유도 직전 (0시), 및 IPTG 첨가 4시간 후, 8시간 후, 24시간 후 및 30시간 후에 취하였다. 가용성 (S) 및 불용성 (I) 분획을 각각의 분석된 샘플에 대해 제조하였다. 프로세싱되지 않은 hGH 및 프로세싱된 hGH의 생산이 화살표에 의해 지시된다. 분자량 (MW) 마커 (Ma)가 겔의 오른쪽 손 측면 상에 제시된다.
도 9는 세포질 내에 hGH를 발현하는 균주 DC369 및 DC372의 SDS-PAGE 분석법의 이미지이다. 샘플을 DC369 (야생형, W) 및 DC372 (hslU 돌연변이체, M)로부터 단백질 유도 직전 (0시), 및 IPTG 첨가 4시간 후, 8시간 후, 24시간 후, 30시간 후 및 50시간 후에 취하였다. 가용성 (S) 및 불용성 (I) 분획을 각각의 분석된 샘플에 대해 제조하였다. hGH의 생산이 화살표에 의해 지시된다. 분자량 (MW) 마커 (Ma)가 겔의 오른쪽 손 측면 상에 제시된다.
도 10은 hGH::COP 융합 단백질을 발현하는 균주의 성장 곡선 그래프이다. 균주에는 음성 대조군으로서의, (COP에 융합되지 않은) hGH만을 발현하는 DC369; hGH::COP를 발현하는 야생형인 HJ104; hGH::COP를 발현하는 hslU 돌연변이체인 HJ105가 포함된다.
도 11은 형광계를 사용하여 hGH::COP 융합 단백질을 발현하는 균주에 대해 녹색 형광 활성을 측정한 것의 그래프이다. IPTG 유도 후 여러 시점에 hGH 또는 hGH::COP이 있는 각각의 균주에 대해 세포 배양물의 OD600 5개를 샘플링하였다. 테스트된 균주에는 음성 대조군으로서의, (COP에 융합되지 않은) hGH만을 발현하는 DC369; hGH::COP를 발현하는 야생형인 HJ104; hGH::COP를 발현하는 hslU 돌연변이체인 HJ105가 포함된다. 삽입된 표는 IPTG 유도 후 여러 시점에서 야생형과 비교하여 hslU 돌연변이체에서 상대적인 형광의 백분율 증가를 나타낸다.
도 12는 두 샘플 간의 mRNA의 상대 존재비를 측정하는 방법을 도면으로 설명한 것이다.
도 13은 pyrF-음성 균주에서의 hslUV 유전자의 염색체 결실의 구축을 설명한다. A. 플라스미드 pDOW2050은 hslUV 유전자에 플랭킹(flanking)된 505bp 및 634 bp DNA 단편을 함유한다. 자살 플라스미드 pDOW2050은 슈도모나스 플루오레센스에서 복제될 수 없기 때문에, 전체 플라스미드가 게놈 내로 통합되는 상동성 영역 중 하나에서의 단일 재조합 이벤트 후에 테트라사이클린-저항성 세포만이 생성될 것이다. B. 테트라사이클린-저항성 세포는 게놈 내로 통합된 전체 플라스미드를 함유한다. 이러한 세포는 플라스미드로부터 코딩된 pyrF 유전자를 또한 함유한다. pyrF-양성 군주에서 독성 화합물로 전환되는 FOA가 보충된 한천 플레이트 상에 세포를 플레이팅함으로써 두번째 재조합 이벤트가 있는 세포들을 선별하였다. C. 염색체 결실 균주를 서열분석에 의해 확인하였다.
도 14는 형광계를 사용하여 hGH::COP 융합 단백질을 발현하는 균주에 대해 녹색 형광 활성을 측정한 것의 경시적인 상대적 형광도의 그래프이다. 야생형 (HJ104) 및 hslUV 결실 균주 (HJ117) 모두에 대해 복제물을 사용하였다.
도 15는 폴딩 조정인자 GrpE-DnakJ 존재 하에 또는 부재 하에 hGH를 발현하는 균주의 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 샘플을 IPTG에 의한 유도 후 다양한 시간 (0, 4, 8, 24 및 48시)에 샘플을 제거하고, 20의 OD600에 대해 표준화시키고, EasyLyse를 사용하여 용해시켰다. 가용성 (S) 및 불용성 (I) 분획을 BioRad 기준 15％ 트리스 HCl SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 쿠마시(Coomassie)로 염색하였다.
i) 재조합 단백질 또는 펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계; ii) 세포의 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현 시 상향 조절되는 1개 이상의 프로테아제 또는 폴딩 조정인자를 포함하여 상향 조절된 1개 이상의 내인성 유전자 생성물을 확인하는 단계; 및 iii) 1개 이상의 확인된 유전자 생성물의 발현을 세포의 유전자 변형으로 변화시키는 단계를 포함하는 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 개선시키는 방법이 제공된다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 유전자 변형된 세포에서 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 유전자 변형된 세포의 제2의 유전자 프로파일을 분석하여, 변형된 세포에서 차별적으로 발현되는 1개 이상의 추가적인 유전자 생성물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 이 방법은 변형된 세포에서 적어도 제2의 확인된 유전자 생성물의 발현을 변화시켜, 이중 변형된 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법은 개선된 단백질 수율에 의해 측정되는 바와 같은 개선된 발현을 제공할 수 있거나, 또는, 예를 들어 발현된 재조합 단백질의 용해도를 증가시킴으로써, 활성 단백질의 회수를 개선시킬 수 있다.
더욱 일반적으로, 본 발명은
i) 재조합 단백질 또는 펩티드를 재조합 숙주 세포 또는 생물에서 발현시키는 단계;
ii) 재조합 세포의 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 단백질을 발현하도록 변형되지 않은 숙주세포 또는 이 재조합 단백질을 발현하지 않는 재조합 세포 중 하나에서보다 더 높은 수준으로 재조합 세포에서 발현되는 보상 유전자 또는 유전자 생성물을 확인하는 단계; 및
iii) 확인된 보상 유전자 또는 유전자 생성물의 재조합 세포에서의 발현을 유전자 변형으로 변화시켜, 재조합 단백질 발현, 활성 또는 용해도에서의 증가를 달성하는 변형된 재조합 세포를 제공하는 단계
를 포함하는 숙주 세포 또는 생물에서의 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 개선시키는 방법을 제공한다.
명세서 전반에 걸쳐, 범위가 제공될 때, 구성요소가 독립적인 것으로 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1-6의 범위는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 의미한다.
방법의 단계들이 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
단계 I: 숙주 세포에서 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현시키기 위한 숙주 세포 또는 생물의 유전자 변형
방법의 첫번째 단계에서, 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 능력을 갖도록 숙주 세포가 변형된다. 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 숙주 세포를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질을 세포의 게놈에 외인성이고 세포 내로 형질감염 또는 형질전환된 발현 벡터로부터 발현시킬 수 있다. 발현 벡터의 구축, 뿐만 아니라 형질감염 또는 형질전환이 하기에 기술된다. 또한 하기에 기술되는 바와 같이 게놈성 삽입물로부터 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 숙주 세포를 변형시킬 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자를 숙주 세포 또는 생물의 게놈 내로 상동 재조합 또는 이종 재조합과 같은 기술에 의해 삽입할 수 있다. 이러한 기술이 하기에 기술된다.
재조합 단백질 또는 펩티드는 세포의 추가적인 조작을 필요로 하는 요소의 제어 하에 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드 발현의 개시 또는 증강을 위해 세포의 화학적 처리가 필요할 수 있다. 숙주 세포에서의 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 좌우하는 프로모터 및 리프레서(repressor) 요소가 하기에 기술되고, 이들은 당업계에 주지되어 있다. 이들은 IPTG에 반응성인 "tac" 프로모터를 기초로 하는 프로모터 요소를 포함할 수 있다.
숙주 세포 또는 생물의 선별
본 발명의 방법은 진핵생물 또는 원핵생물 기원을 포함하여 임의의 주어진 숙주 시스템에서 사용될 수 있다. 본 방법은 확인된 유전자를 확인하기 위한 유전자 프로파일의 분석을 위한 충분한 유전 정보의 이용가능성에 의해서만 일반적으로 제한된다. 게놈의 높은 백분율로부터의 대표적인 서열, 예를 들어, 게놈, 트랜스크립톰 또는 프로테옴에서 발현 또는 확인된 서열의 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％가 이용가능하다는 것이 일반적으로 전형적이지만, 게놈, 트랜스크립톰 또는 프로테옴 내의 서열의 일부만을 사용하여 본 발명을 실행할 수 있다. 특히, 예를 들어 이용가능한 정보에 일군의 관련된 서열, 예컨대 대사적으로 연관된 군에 대한 정보가 포함되는 경우, 게놈으로부터의 단지 적은 부분의 대표적인 서열을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 또한, 방법의 주요 양상은 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현 시 숙주 세포에서 발생하는 세포성 변화를 확인하고 당업계에 공지된 절차를 사용하여 숙주 세포를 변형시키기 위한 기술을 기초로 발현 시스템을 합리적으로, 그리고 반복적으로 디자인하는 능력이기 때문에, 방법은 발현될 특정 재조합 단백질에 한정되지 않는다.
숙주 세포는 재조합 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 미생물 세포, 즉 박테리아, 진균류, 효모 또는 기타 단세포성 진핵생물, 원핵생물 및 바이러스로부터의 세포이다. 재조합 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위한 가장 통상적으로 사용된 시스템에는 특정 박테리아 세포, 특히 대장균이 포함되는데, 이들의 비교적 저렴한 성장 요건 및 대형 뱃치(batch) 배양에서 단백질을 생산하는 잠재적인 능력 때문이다. 효모 또한 생물학적으로 관련된 단백질 및 펩티드를 발현하기 위해, 특히 연구 목적으로 사용된다. 시스템은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 이러한 시스템들은 잘 특성화되어 있고, 일반적으로 허용가능한 수준의 전체 단백질 발현을 제공하며, 비교적 빠르고 저비용이다. 곤충 세포 발현 시스템이 또한 생물학적으로 활성인 형태의 재조합 단백질을 발현시키기 위한 대안으로 밝혀졌다. 일부 경우에, 번역 후에 변형된 정확하게 폴딩된 단백질이 생산될 수 있다. 포유류 세포 발현 시스템, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포가 또한 재조합 단백질의 발현을 위해 사용되었다. 작은 규모인 경우, 이들 발현 시스템들은 종종 효과적이다. 특정 생물제제가, 특히 동물 또는 인간 건강 용도에서, 포유류 단백질로부터 유도될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 담배 세포, 옥수수, 아라비돕시스(Arabidopsis) 종으로부터의 세포, 감자 또는 쌀 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는 식물 세포이다. 또다른 실시양태에서, 트랜스제닉 생물이 포함되지만 이에 한정되지는 않는 다세포 생물이 본 방법에서 분석 또는 변형된다. 다세포 생물을 분석하고/하거나 변형시키기 위한 기술은 하기에 기술된 세포를 변형시키기 위해 기술된 기술을 일반적으로 기초로 한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 에쉐리키아 또는 슈도모나스 종이 포함되지만 이에 한정되지는 않는 박테리아 세포와 같은 원핵생물일 수 있다. 전형적인 박테리아 세포는, 예를 들어, 미국 아리조나의 에스트렐라 마운틴 커뮤니티 대학(Estrella Mountain Community College)의 MJ Farabee 박사가 URL: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_2.html에서 제공하는 온라인 생물학 저서의 ["Biological Diversity: Bacteria and Archaeans"] 챕터에 기술된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나드 세포일 수 있고, 전형적으로 슈도모나스 플루오레센스 세포일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 또한 대장균 세포일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 스포돕테라, 트리코플루시아 드로소필라 또는 에스티그멘 종으로부터의 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는 곤충 세포, 또는 마우스 세포, 햄스터 세포, 원숭이, 영장류 또는 인간 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는 포유류 세포일 수 있다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나드 세포이고, 예를 들어 슈도모나스 플루오레센스 생물일 수 있다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 임의의 박테리아 분류군의 구성원일 수 있다. 세포는, 예를 들어, 유박테리아(eubacteria)의 임의의 종의 구성원일 수 있다. 숙주는 임의의 하기 분류군 중 하나의 구성원일 수 있다: 애시도박테리아(Acidobacteria), 액티노박테리아(Actinobacteira), 애퀴피케(Aquificae), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 클로로비(Chlorobi), 클라미디에(Chlamydiae), 코로플렉시(Choroflexi), 크리시오제네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 데이노코커스(Deinococcus), 딕티요글로미(Dictyoglomi), 피브로박테레스(Fibrobacteres), 피르미쿠테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 겜마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 렌티스페레(Lentisphaerae), 니트로스피래(Nitrospirae), 플랑크토미세테스(Planctomycetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로캐테스(Spirochaetes), 테르모데술포박테리아(Thermodesulfobacteria), 테르모마이크로비아(Thermomicrobia), 테르모토개(Thermotogae), 테르무스(Thermus) (테르말레스(Theamales)), 또는 베루코미크로비아(Verrucomicrobia). 유박테리아 숙주 세포의 한 실시양태에서, 세포는 시아노박테리아(Cyanobacteria)를 제외한 유박테리아의 임의의 종의 구성원일 수 있다.
또한 박테리아 숙주는 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 임의의 종의 구성원일 수 있다. 프로테오박테리아 숙주 세포는 분류군 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria), 또는 입실론프로테오박테리아(Epsilonproteobacteria) 중 임의의 하나의 구성원일 수 있다. 또한, 숙주는 분류군 알파프로테오박테리아, 베타프로테오박테리아, 또는 감마프로테오박테리아 중 임의의 하나의 구성원, 및 감마프로테오박테리아의 임의의 종의 구성원일 수 있다.
감마프로테오박테리아 숙주의 한 실시양태에서, 숙주는 분류군 에어로모나달레스(Aeromonadales), 알테로모나달레스(Alteromonadales), 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales), 슈도모나달레스(Pseudomonadales), 또는 잔토모나달레스(Xanthomonadales) 중 임의의 하나의 구성원; 또는 엔테로박테리알레스 또는 슈도모나달레스 중 임의의 종의 구성원일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 엔테로박테리알레스 목일 수 있고, 숙주 세포는 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원, 또는 에르위니아(Erwinia) 속, 에쉐리키아 속, 또는 세라티아(Serratia) 속 중 임의의 하나의 구성원; 또는 에쉐리키아 속의 구성원일 것이다. 슈도모나달레스 목의 숙주 세포의 한 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae) 과의 구성원, 심지어는 슈도모나스 속의 구성원일 것이다. 감마 프로테오박테리아 숙주에는 대장균 종의 구성원 및 슈도모나스 플루오레센스 종의 구성원이 포함된다.
다른 슈도모나스 생물이 또한 유용할 수 있다. 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 종들은 그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1을 포함하고, 이는 [R.E. Buchanan and N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, USA)] (이하, ["Bergey (1974)")]에 의해 "그람-음성 호기성 간균 및 구균"으로 기술된 과 및/또는 속에 속하는 프로테오박테리아의 그룹을 포함한다. 하기의 표는 이러한 과 및 속의 생물들을 나타낸다.
"그람-음성 호기성 간균 및 구균" ([Bergey (1974)]) 부분에 열거된 과 및 속
과 I. 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae) 글루코노박터(Gluconobacter)
슈도모나스
잔토모나스(Xanthomonas)
주글로에(Zoogloea)
과 II. 아조토박테라시에(Azotobacteraceae) 아조모나스(Azomonas)
아조토박터(Azotobacter)
베이제린키아(Beijerinckia)
데륵시아(Derxia)
과 III. 리조비아시에(Rhizobiaceae) 아그로박테리움(Agrobacterium)
리조비움(Rhizobium)
과 IV. 메틸로모나다시에(Methylomonadaceae) 메틸로코쿠스(Methylococcus)
메틸로모나스(Methylomonas)
과 V. 할로박테리아시에(Halobacteriaceae) 할로박테리움(Halobacterium)
할로코쿠스(Halococcus)
다른 속 아세토박터(Acetobacter)
알칼리게네스(Alcaligenes)
보르데텔라(Bordetella)
브루셀라(Brucella)
프란시셀라(Francisella)
테르무스(Thermus)
"그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1"은 분류에 사용된 기준에 따라 이러한 제목으로 분류되는 프로테오박테리아를 또한 포함한다. 상기 제목은 또한 종전에는 이 섹션으로 분류되었지만 더 이상은 아닌 그룹, 예컨대 애시도보락스(Acidovorax) 속, 브레분디모나스(Brevundimonas) 속, 부르크홀데리아(Burkholderia) 속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga) 속, 오세아니모나스(Oceanimonas)) 속, 랄스토니아(Ralstonia) 속 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속; 잔토모나스(Xanthomonas) 속에 속하는 (그리고 종전에는 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 종으로 칭해진) 생물을 재분류하여 생성된 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 (및 이로부터 유래된 블라스토모나스(Blastomonas) 속); [Bergey (1974)]에 정의된 아세토박터 속에 속하는 생물을 재분류하여 생성된 애시도모나스(Acidomonas ) 속을 포함한다. 또한, 숙주는 슈도모나스 속인 슈도모나스 에날리아(Pseudomonas enalia) (ATCC 14393), 슈도모나스 니그리파시엔스(Pseudomonas nigrifaciens) (ATCC 19375), 및 슈도모나스 푸트레파시엔스(Pseudomonas putrefaciens) (ATCC 8071)로부터의 세포를 포함할 수 있고, 이들은 각각 알테로모나스 할로플랑크티스(Alteromonas haloplanktis), 알테로모나스 니그리파시엔스(Alteromonas nigrifaciens) 및 알테로모나스 푸트레파시엔스(Alteromonas putrefaciens)로 재분류되었다. 유사하게, 예를 들어, 슈도모나스 애시도보란스(Pseudomonas acidovorans) (ATCC 15668) 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni) (ATCC 11996)은 각각 코마모나스 애시도보란스(Comamonas acidovorans) 및 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)로 재분류되었고; 슈도모나스 니그리파시엔스 (ATCC 19375) 및 슈도모나스 피시시다(Pseudomonas piscicida) (ATCC 15057)은 각각 슈도알테로모나스 니그리파시엔스(Pseudoalteromonas nigrifaciens) 및 슈도알테로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida)로 재분류되었다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1"은 임의의 하기 과에 속하는 것으로 분류된 프로토박테리아를 또한 포함한다: 슈도모나다시에, 아조토박테라시에 (현재 슈도모나다시에의 "아조토박터 그룹"이라는 동의어로 종종 칭해짐), 리조비아시에, 및 메틸로모나다시에 (현재 "메틸로코카시에(Methylococcaceae)"라는 동의어로 종종 칭해짐). 따라서, 본원에 다르게 기술된 속들에 더하여, "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1"에 속하는 추가적인 프로테오박테리아 속은: 1) 아조리조필루스(Azorhizophilus ) 속의 아조토박터 그룹 박테리아; 2) 셀비브리오(Cellvibrio) 속, 올리겔라(Oligella) 속 및 테레디니박터(Teredinibacter) 속의 슈도모나다시에 과 박테리아; 3) 켈라토박터(Chelatobacter) 속, 엔시퍼(Ensifer) 속, 리버리박터(Liberibacter) 속 ("칸디다투스 리베리박터(Candidatus Liberibacter)"로 또한 칭해짐), 및 시노리조비움(Sinorhizobium) 속의 리조비아시에 과 박테리아; 및 4) 메틸로박터(Methylobacter) 속, 메틸로칼덤(Methylocaldum) 속, 메틸로마이크로비움(Methylomicrobium) 속, 메틸로사르시나(Methylosarcina) 속 및 메틸로스파에라(Methylosphaera) 속의 메틸로코카시에 과 박테리아를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 2"로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 2"는 하기 속의 프로테오박테리아의 그룹으로 정의된다 (카탈로그-열거된, 공개적으로 입수가능한, 기탁된 균주의 총 수가 괄호 안에 지시되고, 달리 지적되지 않는 한 모두 ATCC에 기탁됨): 애시도모나스 (2); 아세토박터 (93); 글루코노박터 (37); 브레분디모나스 (23); 베이제린키아 (13); 데륵시아 (2); 브루셀라 (4); 아그로박테리움 (79); 켈라토박터 (2); 엔시퍼 (3); 리조비움 (144); 시노리조비움 (24); 블라스토모나스 (1); 스핑고모나스 (27); 알칼리게네스 (88); 보르데텔라 (43); 부르크홀데리아 (73); 랄스토니아 (33); 애시도보락스 (20); 히드로게노파가 (9); 주글로에 (9); 메틸로박터 (2); 메틸로칼덤 (1, NCIMB); 메틸로코커스 (2); 메틸로마이크로비움 (2); 메틸로모나스 (9); 메틸로사르시나 (1); 메틸로스파에라; 아조모나스 (9); 아조리조필루스 (5); 아조토박터 (64); 셀비브리오 (3); 올리겔라 (5); 슈도모나스 (1139); 프란시셀라 (4); 잔토모나스 (229); 스테노트로포모나스 (50); 및 오세아니모나스 (4).
"그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 2"의 예시적인 숙주 세포 종에는 하기의 박테리아가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호가 괄호 안에 제시됨): 애시도모나스 메타놀리카(Acidomonas methanolica) (ATCC 43581); 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti) (ATCC 15973); 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) (ATCC 19357); 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta) (ATCC 11568); 베이제린키아 인디카(Beijerinckia indica) (ATCC 9039 및 ATCC 19361); 데륵시아 굼모사(Derxia gummosa) (ATCC 15994); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis) (ATCC 23456), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) (ATCC 23448); 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) (ATCC 23308), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) (ATCC 19358), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) (ATCC 11325); 켈라토박터 헤인치이(Chelatobacter heintzii) (ATCC 29600); 엔시퍼 아드하에렌스(Ensifer adhaerens) (ATCC 33212); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) (ATCC 10004); 시노리조비움 프레디(Sinorhizobium fredii) (ATCC 35423); 블라스토모나스 나타토리아(Blastomonas natatoria) (ATCC 35951); 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) (ATCC 29837); 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis) (ATCC 8750); 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) (ATCC 9797); 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) (ATCC 25416); 랄스토니아 피케티이(Ralstonia pickettii) (ATCC 27511); 애시도보락스 파실리스(Acidovorax facilis) (ATCC 11228); 히드로게노파가 플라바(Hydrogenophaga flava) (ATCC 33667); 주글로에 라미게라(Zoogloea ramigera ) ( ATCC 19544); 메틸로박터 루테우스(Methylobacter luteus) (ATCC 49878); 메틸로칼덤 그라실레(Methylocaldum gracile)(NCIMB 11912); 메실로코커스 캅술라투스(Methylococcus capsulatus) (ATCC 19069); 메틸로마이크로비움 아길레(Methylomicrobium agile) (ATCC 35068); 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica) (ATCC 35067); 메틸로사르시나 피브라타(Methylosarcina fibrata) (ATCC 700909); 메틸로스파에라 한소니이(Methylosphaera hansonii)(ACAM 549); 아조모나스 아길리스(Azomonas agilis) (ATCC 7494); 아조리조필루스 파스팔리(Azorhizophilus paspali) (ATCC 23833); 아조토박터 크로오코쿰(Azotobacter chroococcum) (ATCC 9043); 셀비브리오 믹스투스(Cellvibrio mixtus) (UQM 2601); 올리겔라 우레트랄리스(Oligella urethralis) (ATCC 17960); 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (ATCC 10145), 슈도모나스 플루오레센스 (ATCC 35858); 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) (ATCC 6223); 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) (ATCC 13637); 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) (ATCC 33913); 및 오세아니모나스 도우도로피(Oceanimonas doudoroffii) (ATCC 27123).
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 3"으로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 3"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 브레분디모나스; 아그로박테리움; 시노리조비움; 블라스토모나스; 스핑고모나스; 알칼리게네스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 애시도보락스; 히드로게노파가; 메틸로박터; 메틸로칼덤; 메틸로코커스; 메틸로마이크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 4"로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 4"는 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핑고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 애시도보락스; 히드로게노파가; 메틸로박터; 메틸로칼덤; 메틸로코커스; 메틸로마이크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 5"로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 5"는 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 메틸로박터; 메틸로칼덤; 메틸로코커스; 메틸로마이크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 6"으로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 6"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핑고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 애시도보락스; 히드로게노파가; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 7"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 7"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 8"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 8"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핑고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 애시도보락스; 히드로게노파가; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 9"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 9"는 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 브레분디모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 애시도보락스; 히드로게노파가; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 10"으로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 10"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 및 잔토모난스.
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 11"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 11"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 및 잔토모나스. 숙주세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 12"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 12"는 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스. 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 13"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 13"은 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스; 및 잔토모나스. 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 14"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 14"는 하기 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 슈도모나스 및 잔토모나스. 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 15"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 15"는 슈도모나스 속의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다.
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 16"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 16"은 하기의 슈도모나스 종의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호가 괄호 안에 제시됨): 슈도모나스 아비에타니필라(Pseudomonas abietaniphila) (ATCC 700689); 슈도모나스 아에루지노사(Peudomonas aeruginosa) (ATCC 10145); 슈도모나스 알칼리게네스(Peudomonas alcaligenes) (ATCC 14909); 슈도모나스 안귈리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica) (ATCC 33660); 슈도모나스 시트로넬로리스(Pseudomonas citronellolis) (ATCC 13674); 슈도모나스 플라베센스(Pseudomonas flavescens) (ATCC 51555); 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) (ATCC 25411); 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) (ATCC 33634); 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) (ATCC 8062); 슈도모나스 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes) (ATCC 17440); 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans) (ATCC 14235); 슈도모나스 스트라미네아(Pseudomonas straminea) (ATCC 33636); 슈도모나스 아가리치(Pseudomonas agarici) (ATCC 25941); 슈도모나스 알칼리필라(Pseudomonas alcaliphila); 슈도모나스 알기노보라(Pseudomonas alginovora); 슈도모나스 안데르소니이(Pseudomonas andersonii); 슈도모나스 아스플레니이(Pseudomonas asplenii) (ATCC 23835); 슈도모나스 아젤라이카(Pseudomonas azelaica) (ATCC 27162); 슈도모나스 베이제린키이(Pseudomonas beijerinckii) (ATCC 19372); 슈도모나스 보레알리스(Pseudomonas borealis); 슈도모나스 보레오폴리스(Pseudomonas boreopolis) (ATCC 33662); 슈도모나스 브라시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum); 슈도모나스 부타노보라(Pseudomonas butanovora) (ATCC 43655); 슈도모나스 셀룰로사(Pseudomonas cellulosa) (ATCC 55703); 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca) (ATCC 33663); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis) (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi) (ATCC 4973); 슈도모나스 룬덴시스(Pseudomonas lundensis) (ATCC 49968); 슈도모나스 타에트롤렌스(Pseudomonas taetrolens) (ATCC 4683); 슈도모나스 시스시콜라(Pseudomonas cissicola) (ATCC 33616); 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens); 슈도모나스 디테르페니필라(Pseudomonas diterpeniphila); 슈도모나스 엘롱가타(Pseudomonas elongata) (ATCC 10144); 슈도모나스 플렉텐스(Pseudomonas flectens) (ATCC 12775); 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브렌네리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 세드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata) (ATCC 29736); 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스 (ATCC 35858); 슈도모나스 게사르디이(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii) (ATCC 700871); 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis) (ATCC 10844); 슈도모나스 미굴래(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 무시돌렌스(Pseudomonas mucidolens) (ATCC 4685); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시애(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신산타(Pseudomonas synxantha) (ATCC 9890); 슈도모나스 톨라아시이(Pseudomonas tolaasii) (ATCC 33618); 슈도모나스 베로니이(Pseudomonas veronii) (ATCC 700474); 슈도모나스 프레데릭스베르겐시스(Pseudomonas frederiksbergensis); 슈도모나스 게니쿨라타(Pseudomonas geniculata) (ATCC 19374); 슈도모나스 진제리(Pseudomonas gingeri); 슈도모나스 그라미니스( Pseudomonas graminis); 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii); 슈도모나스 할로데니트리피칸스(Pseudomonas halodenitrificans); 슈도모나스 할로필라(Pseudomonas halophila); 슈도모나스 히비스시콜라(Pseudomonas hibiscicola) (ATCC 19867); 슈도모나스 후티엔시스(Pseudomonas huttiensis) (ATCC 14670); 슈도모나스 히드로게노보라(Pseudomonas hydrogenovora); 슈도모나스 제세니이( Pseudomonas jessenii) (ATCC 700870); 슈도모나스 킬로넨시스(Pseudomonas kilonensis); 슈도모나스 란세올라타(Pseudomonas lanceolata) (ATCC 14669); 슈도모나스 리니(Pseudomonas lini); 슈도모나스 마르기나타(Pseudomonas marginata) (ATCC 25417); 슈도모나스 메피티카(Pseudomonas mephitica) (ATCC 33665); 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans) (ATCC 19244); 슈도모나스 페르투치노게나(Pseudomonas pertucinogena) (ATCC 190); 슈도모나스 픽토룸(Pseudomonas pictorum) (ATCC 23328); 슈도모나스 사이크로필라(Pseudomonas psychrophila); 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva) (ATCC 31418); 슈도모나스 몬테일리이(Pseudomonas monteilii) (ATCC 700476); 슈도모나스 모셀리이(Pseudomonas mosselii); 슈도모나스 오리지하비탄스(Pseudomonas oryzihabitans) (ATCC 43272); 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) (ATCC 700383); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) (ATCC 12633); 슈도모나스 레악탄스(Pseudomonas reactans); 슈도모나스 스피노사(Pseudomonas spinosa) (ATCC 14606); 슈도모나스 발레아리카(Pseudomonas balearica); 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola) (ATCC 43273); 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri) (ATCC 17588); 슈도모나스 아미그달리(Pseudomonas amygdali) (ATCC 33614); 슈도모나스 아벨라내(Pseudomonas avellanae) (ATCC 700331); 슈도모나스 카리카파파예(Pseudomonas caricapapayae) (ATCC 33615); 슈도모나스 시초리이(Pseudomonas cichorii) (ATCC 10857); 슈도모나스 피쿠세렉태(Pseudomonas ficuserectae) (ATCC 35104); 슈도모나스 푸스코바기내(Pseudomonas fuscovaginae); 슈도모나스 멜리애(Pseudomonas meliae) (ATCC 33050); 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) (ATCC 19310); 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava) (ATCC 13223); 슈도모나스 테르모카르복시도보란스(Pseudomonas thermocarboxydovorans) (ATCC 35961); 슈도모나스 테르모톨레란스(Pseudomonas thermotolerans); 슈도모나스 티베르발렌시스(Pseudomonas thivervalensis); 슈도모나스 반코우베렌시스(Pseudomonas vancouverensis) (ATCC 700688); 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis); 및 슈도모나스 시아메넨시스(Pseudomonas xiamenensis).
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 17"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 17"은 하기의 슈도모나스 종에 예를 들어 속하는 것들을 포함하여 "형광성 슈도모나드"로 당업계에 공지된 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 슈도모나스 아조토포르만스; 슈도모나스 브렌네리; 슈도모나스 세드렐라; 슈도모나스 코루가타; 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스; 슈도모나스 플루오레센스; 슈도모나스 게사르디이; 슈도모나스 리바넨시스; 슈도모나스 만델리이; 슈도모나스 마르지날리스; 슈도모나스 미굴래; 슈도모나스 무시돌렌스; 슈도모나스 오리엔탈리스; 슈도모나스 로데시애; 슈도모나스 신산타; 슈도모나스 톨라아시; 및 슈도모나스 베로니이.
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 18"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 18"은 예를 들어 하기의 것들에 속하는 것들을 포함하여 슈도모나스 플루오레센스 종의 모든 아종, 변종, 균주 및 기타 하위-특정 유닛의 그룹으로 정의된다 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호가 괄호 안에 제시됨): 슈도모나스 플루오레센스 생물형 A (생물변이형(biovar) 1 또는 생물변이형 I로도 칭해짐) (ATCC 13525); 슈도모나스 플루오레센스 생물형 B (생물변이형 2 또는 생물변이형 II로도 칭해짐) (ATCC 17816); 슈도모나스 플루오레센스 생물형 C (생물변이형 3 또는 생물변이형 III으로도 칭해짐) (ATCC 17400); 슈도모나스 플루오레센스 생물형 F (생물변이형 4 또는 생물변이형 IV로도 칭해짐) (ATCC 12983); 슈도모나스 플루오레센스 생물형 G (생물변이형 5 또는 생물변이형 V로도 칭해짐) (ATCC 17518); 슈도모나스 플루오레센스 생물변이형 VI; 슈도모나스 플루오레센스 Pf0-1; 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5 (ATCC BAA-477); 슈도모나스 플루오레센스 SBW25; 및 슈도모나스 플루오레센스 아종 셀룰로사 (NCIMB 10462).
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 19"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 19"는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 A의 모든 균주의 그룹으로 정의된다. 이러한 생물형의 전형적인 균주는 슈도모나스 플루오레센스 균주 MB101 (미국 특허 제5,169,760호 (Wilcox) 참조), 및 이의 유도체이다. 이의 유도체의 예는 MB101 염색체 asd (아스파르테이트 탈수소효소 유전자) 유전자좌 내로 천연 대장균 PlacI-lacI-lacZYA 구축물 (즉, PlacZ가 결실됨)을 삽입하여 구축된 슈도모나스 플루오레센스 균주 MB214이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 추가적인 슈도모나스 플루오레센스 균주는 하기의 ATTC 명칭을 갖는 슈도모나스 플루오레센스 미굴라(Migula) 및 슈도모나스 플루오레센스 로이토키토크(Loitokitok)를 포함한다: [NCIB 8286]; NRRL B-1244; NCB 8865 균주 CO1; NCIB 8866 균주 CO2; 1291 [ATCC 17458; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1864; 피롤리딘; PW2 [ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899]; 13475; NCTC 10038; NRRL B-1603 [6; IFO 15840]; 52-1C; CCEB 488-A [BU 140]; CCEB 553 [IEM 15/47]; IAM 1008 [AHH-27]; IAM 1055 [AHH-23]; 1 [IFO 15842]; 12 [ATCC 25323; NIH 11; den Dooren de Jong 216]; 18 [IFO 15833; WRRL P-7]; 93 [TR-1O]; 108 [52-22; IFO 15832]; 143 [IFO 15836; PL]; 149 [2-40-40; IFO 15838]; 182 [IFO 3081; PJ 73]; 184 [IFO 15830]; 185 [W2 L-1]; 186 [IFO 15829; PJ 79]; 187 [NCPPB 263]; 188 [NCPPB 316]; 189 [PJ227; 1208]; 191 [IFO 15834; PJ 236; 22/1]; 194 [Klinge R-60; PJ 253]; 196 [PJ 288]; 197 [PJ 290]; 198 [PJ 302]; 201 [PJ 368]; 202 [PJ 372]; 203 [PJ 376]; 204 [IFO 15835; PJ 682]; 205 [PJ 686]; 206 [PJ 692]; 207 [PJ 693]; 208 [PJ 722]; 212 [PJ 832]; 215 [PJ 849]; 216 [PJ 885]; 267 [B-9]; 271 [B-1612]; 401 [C71A; IFO 15831; PJ 187]; NRRL B-3178 [4; IFO 15841]; KY 8521; 3081; 30-21; [IFO 3081]; N; PYR; PW; D946-B83 [BU 2183; FERM-P 3328]; P-2563 [FERM-P 2894; IFO 13658]; IAM-1126 [43F]; M-1; A506 [A5-06]; A505 [A5-O5-1]; A526 [A5-26]; B69; 72; NRRL B-4290; PMW6 [NCIB 11615]; SC 12936; A1 [IFO 15839]; F 1847 [CDC-EB]; F 1848 [CDC 93]; NCIB 10586; P17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02; 6519E01; N1; SC15208; BNL-WVC; NCTC 2583 [NCIB 8194]; H13; 1013 [ATCC 11251; CCEB 295]; IFO 3903; 1062; 또는 Pf-5.
다른 적절한 숙주는 그람 양성 프로테오박테리아와 같이 참고문헌의 다른 부분에 분류된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균이다. 대장균의 게놈 서열은 대장균 MG1655에 대해 확립되어 있고 ([Blattner, et al. (1997), The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science 277(5331): 1453-74]), 대장균 K12에 대한 DNA 마이크로어레이가 시판된다 (MWG Inc (High Point, NC)). 대장균을 1% 글루코스와 같은 적절한 탄소 공급원과 함께 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) (10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ NaCl, 5 g/ℓ 효모 추출물)와 같은 영양 배지 또는 M9 (6 g/ℓ Na2HPO4, 3 g/ℓ KH2PO4, 1 g/ℓ NH4Cl, 0.5 g/ℓ NaCl, pH 7.4)와 같은 한정된 최소 배지에서 배양할 수 있다. 통상적으로, 대장균 세포의 하룻밤 배양액을 희석하여, 진탕 플라스크 또는 발효기 내의 신선한 영양 또는 최소 배지에 접종하고, 37 ℃에서 성장시킨다.
숙주는 임의의 인간 또는 비-인간 포유동물이 포함되는 포유동물로부터 유래된 세포와 같이, 포유류 기원일 수 있다. 포유류에는 영장류, 원숭이, 돼지(porcine), 양, 소, 설치류, 유제류, 돼지(pig), 돼지(swine), 면양(sheep), 양(lamb), 염소, 소(cattle), 사슴, 노새, 말, 원숭이, 영장류(apes), 개, 고양이, 래트, 및 마우스가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
숙주 세포는 또한 식물 기원일 수도 있다. 유전자 및 조절 서열의 확인을 위해 임의의 식물이 선택될 수 있다. 유전자 및 조절 서열의 단리를 위한 적절한 식물 표적의 예로는 알파파, 사과, 살구, 애기장대, 아티초크, 아루굴라, 아스파라거스, 아보카도, 바나나, 보리, 콩, 비트, 블랙베리, 블루베리, 브로콜리, 방울양배추, 양배추, 카놀라, 칸탈로프, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 체리, 치커리, 고수, 감귤류, 클레멘타인, 토끼풀, 코코넛, 커피, 옥수수, 목화, 크랜베리, 오이, 미송, 가지, 꽃상추, 에스캐롤(escarole), 유칼리나무, 회향, 무화과, 마늘, 호리병박, 포도, 그레이프프루트, 감로멜론, 지카마(jicama), 키위, 양상추, 부추, 레몬, 라임, 테다소나무, 아마인, 망고, 멜론, 버섯, 승도 복숭아, 견과류, 귀리, 기름야자나무, 유채, 오크라, 올리브, 양파, 오렌지, 장식용 식물, 야자, 파파야, 파슬리, 파스닙, 완두콩, 복숭아, 땅콩, 배, 후추, 감, 솔, 파인애플, 질경이, 서양자두, 석류, 포플러, 감자, 호박, 모과, 라디아타 파인(radiata pine), 래디스치오(radiscchio), 무, 평지씨, 나무딸기, 쌀, 호밀, 사탕수수(sorghum), 남부소나무, 대두, 시금치, 호박(squash), 딸기, 사탕무, 사탕수수(sugarcane), 해바라기, 고구마, 소합향, 탄제린, 찻잎, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 순무, 포도나무, 수박, 밀, 얌 및 주키니가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 방법에 유용한 식물은 애기장대, 옥수수, 밀, 대두, 및 목화이다.
재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 위해, 또는 확인된 보상 유전자의 조절을 위해, 임의의 식물 프로모터를 사용할 수 있다. 프로모터는 식물 RNA 중합효소 II 프로모터일 수 있다. 식물 프로모터에 포함된 요소는 전사 개시 부위에서 약 25 내지 35 염기쌍 상류 (5')에 전형적으로 위치하는 TATA 박스 또는 골드버그-호그네스(Goldberg-Hogness) 박스, 및 70 내지 100 염기쌍 상류에 위치하는 CCAAT 박스일 수 있다. 식물에서, CCAAT 박스는 포유류 프로모터의 기능적으로 유사한 서열과 상이한 컨센서스(concensus) 서열을 가질 수 있다 ([Messing et al., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211-227, 1983]). 또한, 실제로 모든 프로모터는 전사 개시 부위에서 약 -100 bp 내지-1,000 bp 이상 상류까지 연장된 추가적인 상류의 활성화 서열 또는 인핸서를 포함한다 ([Benoist and Chambon, Nature 290:304-310, 1981]; [Gruss et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:943-947, 1981]; 및 [Khoury and Gruss, Cell 27:313-314, 1983]).
재조합 단백질 또는 펩티드의 발현
하기에 기술되는 바와 같이, 표준 기술을 사용하여 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 숙주 세포 또는 생물을 조작할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질이 벡터로부터 또는 숙주의 게놈 내로 삽입된 외인성 유전자로부터 발현될 수 있다. 외인성 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 벡터는 당업계에 주지되어 있고, 하기에 기술된다. 하기에 기술하는 바와 같이, 상동 재조합 또는 이종 재조합과 같은 기술을 사용하여 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현시키기 위한 유전자를 또한 게놈 내로 삽입할 수 있다.
재조합 단백질 또는 펩티드는 화학 화합물로의 유도 후에 또는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 시에 발현될 수 있다. 또한 재조합 단백질은 숙주 세포가 특정 환경에 놓일 때 발현될 수 있다. 특정 프로모터 요소가 하기에 기술된다. 이에는 세포를 IPTG, 벤조에이트 또는 안트라닐레이트와 같은 화학물질로 처리했을 때 유도될 수 있는 프로모터가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
재조합 단백질/펩티드
숙주 세포를 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 디자인하였다. 이들은 임의의 종 및 임의의 크기일 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 재조합 단백질 또는 펩티드는 치료적으로 유용한 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시양태에서는, 단백질이 포유류 단백질, 예를 들어 인간 단백질일 수 있고, 예를 들어, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인 또는 혈액 단백질일 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드는 숙주 세포에서 비활성 형태로 우선 발현될 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 단백질 또는 펩티드는 크기가 100 kD 미만, 50 kD 미만, 또는 30 kD 미만이다. 특정 실시양태에서, 재조합 단백질 또는 펩티드는 아미노산이 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개인 펩티드이다.
대장균에서의 재조합 단백질 생산을 가능하게 하는 발현 벡터가 존재한다. 모든 이러한 단백질 발현 시스템에 대해, 이전에 기술된 바와 같은 통상적인 클로닝 절차를 따를 수 있다 ([Sambrook, et al. (2000), Molecular cloning: A laboratory manual, third edition Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press]).
ChampionTM pET 발현 시스템은 높은 수준의 단백질 생산을 제공한다. 발현은 강력한 T7lac 프로모터로부터 유도된다. 이러한 시스템은 당해 유전자의 높은 수준의 전사를 위해 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 높은 활성 및 특이성의 장점을 취한다. 프로모터 영역에 위치한 lac 오퍼레이터는 전통적인 T7계 벡터보다 엄격한 조절을 제공하여, 플라스미드 안정성 및 세포 생존력을 개선시킨다 ([Studier, F. W. and B. A. Moffatt (1986), Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, Journal of Molecular Biology 189(1):113-30]; [Rosenberg, et al. (1987), Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase, Gene 56(1):125-35]). T7 발현 시스템은 당해 유전자의 높은 수준의 전사를 위해 T7 프로모터 및 T7 RNA 중합효소 (T7 RNAP)를 사용한다. T7 RNAP가 천연 대장균 RNAP보다 더 진행성(processive)이고 당해 유전자의 전사에 전념하기 때문에, 높은 수준의 발현이 T7 발현 시스템 내에서 달성된다. 확인된 유전자의 발현은 숙주 세포 내에 T7 RNAP의 공급원을 제공함으로써 유도된다. 이는 T7 RNAP 유전자의 염색체 카피를 함유하는 BL21 대장균 숙주를 사용함으로써 달성된다. T7 RNAP 유전자는 IPTG에 의해 유도될 수 있는 lacUV5 프로모터의 제어 하에 있다. 유도 시 T7 RNAP가 발현되고, 이에 의해 당해 유전자가 전사된다.
pBAD 발현 시스템은 특정 탄소 공급원 예컨대 글루코스, 글리세롤 및 아라비노스의 존재를 통해 재조합 단백질의 발현이 엄격하게 제어되고 적정가능하도록 한다 ([Guzman, et al. (1995), Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promote, Journal of Bacteriology 177(14):4121-30]). pBAD 벡터는 발현 수준에 대한 정밀한 제어를 제공하도록 독특하게 디자인된다. pBAD 벡터로부터의 이종 유전자 발현은 araBAD 프로모터에서 개시된다. 프로모터는 araC 유전자의 생성물에 의해 양성적으로 및 음성적으로 조절된다. AraC는 L-아라비노스와 복합체를 형성하는 전사 조절인자이다. L-아라비노스가 없는 경우, AraC 이량체는 전사를 차단한다. 최대의 전사 활성화를 위해, 2개의 이벤트가 요구된다: (i) L-아라비노스가 AraC에 결합하여 전사가 시작되게 함, (ii) cAMP 활성인자 단백질 (CAP)-cAMP 복합체가 DNA에 결합하고, AraC가 프로모터 영역의 정확한 위치에 결합하는 것을 자극함.
trc 발현 시스템은 trc 프로모터로부터의 대장균에서의 높은 수준의 조절된 발현을 허용한다. trc 발현 벡터는 대장균에서의 진핵생물 유전자의 발현에 대해 최적화되어 왔다. trc 프로모터는 트립토판 (trp) 및 락토스 (lac) 프로모터로부터 유래된 강력한 하이브리드 프로모터이다. 이는 lacO 오퍼레이터 및 lacI Q 유전자 생성물에 의해 조절된다 ([Brosius, J. (1984), Toxicity of an overproduced foreign gene product in Escherichia coli and its use in plasmid vectors for the selection of transcription terminators, Gene 27(2):161-72]).
본 발명은 청구된 방법에 의해 생산된 개선된 재조합 숙주 세포를 또한 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 기술된 방법에 의해 생산된 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 프로테아제의 발현이 감소되도록 유전자 조작된, 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 또는 생물을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 hslV, hslU, clpX, clpA 및 clpB 유전자의 생성물로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 프로테아제의 발현이 감소되도록 유전자 조작된, 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 또는 생물을 포함하고, 특정 하위 실시양태에서, 세포 또는 생물은 HslV 또는 HslU의 발현이 감소되도록 변형된 것이다. 특정 실시양태에서, 변형된 숙주 세포 또는 생물은 포유류에서 유래된 재조합 단백질을 발현하고, 인간 성장 호르몬일 수 있는, 인간에서 유래된 재조합 단백질을 발현할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해, 예를 들어 1개 이상의 프로테아제 유전자가 게놈에서 녹아웃되는 기술에 의해, 또는 1개 이상의 프로테아제 유전자를 돌연변이시켜 프로테아제의 발현을 감소시킴으로써, 또는 1개 이상의 프로테아제 유전자의 1개 이상의 프로모터를 변경시켜 프로테아제의 발현을 감소시킴으로써, 세포를 변형시킬 수 있다.
또다른 실시양태에서, 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 폴딩 조정인자의 발현이 증가되도록 유전자 변형된, 재조합 단백질을 발현하는 숙주 또는 생물이 제시된다. 특정 하위 실시양태에서, 폴딩 조정인자는 폴딩 조정인자 서브유닛이 아니다. 폴딩 조정인자는 cbpA, htpG, dnaK, dnaJ, fkbP2, groES 및 groEL 유전자의 생성물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 특정 하위 실시양태에서는 htpG 또는cbpA일 수 있다. 숙주 세포 또는 생물은, 비제한적인 예에서, 포유류 단백질, 예컨대 인간 단백질을 발현할 수 있다. 단백질은 인간 성장 호르몬일 수 있다. 폴딩 조정인자 또는 조정인자들은, 예를 들어, 세포 내에 본원에 기술된 바와 같은 발현 벡터를 포함함으로써 증가될 수 있다. 또한 폴딩 조정인자 발현은, 예를 들어, 폴딩 조정인자 또는 폴딩 조정인자 서브유닛의 프로모터를 돌연변이시킴으로써 증가될 수 있다. 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 또는 생물을 또한 유전자 변형해서 1개 이상의 폴딩 조정인자의 발현이 증가되고 1개 이상의 프로테아제 또는 프로테아제 단백질의 발현이 감소되도록 할 수 있다. 기술된 방법에 의해 생산된 1개 이상의 세포를 포함하는 생물이 또한 본 발명에 포함된다.
단계 II : 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 보상 유전자 또는 유전자 생성물을 확인함
본 발명의 방법은 재조합 세포의 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 단백질을 발현하도록 조작되지 않은 숙주 세포 또는 이 재조합 단백질을 발현하지 않는 재조합 세포에서보다 더 높은 수준으로 재조합 세포에서 발현되는 보상 유전자 또는 유전자 생성물을 확인하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 "유전자 프로파일"은 게놈 내의 유전자, 게놈 내의 유전자로부터 전사된 mRNA, 또는 게놈 내의 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 유래된 cDNA를 포함할 수 있다. 유전자 프로파일은 세포에 의해 변형된 전사 생성물 예컨대 진핵생물 시스템에서의 유전자의 스플라이스 변이체, 또는 세포에 의해 변형되거나 또는 게놈으로부터 번역된 mRNA의 스플라이스 변이체로부터 번역된 단백질을 포함하여, 게놈 내의 유전자로부터 번역된 단백질을 또한 포함할 수 있다. 유전자 프로파일은 패킹(packing)에 부착된 다중 결합 파트너를 사용하는 다중 동시 블롯 분석 또는 컬럼 크로마토그래피를 포함하여, 예컨대 어레이 또는 기타 멀티플렉스(multiplex) 시스템에서, 다중 실재(實在)를 동시에 분석하는 것만을 지칭하는 것을 의미한다. 본 발명에 따라, 적어도 5, 10, 25, 50, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물이 동시에 분석된다.
트랜스크립톰
한 실시양태에서, 분석된 유전자 프로파일은 트랜스크립톰 프로파일이다. 완전한 트랜스크립톰은 임의의 한 시점에 게놈에 의해 생산된 mRNA 전사물의 완전한 세트를 지칭한다. 게놈과 달리, 트랜스크립톰은 역동적이고, 상이한 패턴의 유전자 발현으로 인해 상이한 환경에서 상당히 바뀐다. 트랜스크립톰을 연구하는 트랜스크립토믹스(transcriptomics)는 유전자 발현 패턴을 확인하는 포괄적인 수단이다. 분석된 트랜스크립톰은 전사된 유전자의 완전한 공지된 세트, 즉 숙주 세포 또는 숙주 생물의 mRNA 내용물 또는 상응하는 cDNA를 포함할 수 있다. cDNA는 뉴클레오티드의 사슬, 단리된 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 핵산 분자, 또는 재조합에 의해 또는 합성에 의해 유래된 이의 임의의 단편 또는 상보물일 수 있고, 이중-가닥 또는 단일-가닥이거나, 코딩 및/또는 비-코딩 영역이거나, 게놈 DNA 분자의 엑손 또는 인트론이거나, 또는 탄수화물, 지질, 단백질 또는 무기 요소 또는 물질과 조합될 수 있다. 뉴클레오티드 사슬은 적어도 5, 10, 15, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 또한 트랜스크립톰은 유전자 전사물의 공지된 세트의 오직 일부만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 트랜스크립톰은 숙주 내의 공지된 전사물의 98％, 95, 90, 85, 80, 70, 60, 또는 50％ 미만을 포함할 수 있다. 또한 트랜스크립톰은 특정 세트의 유전자에 표적화될 수 있다.
한 실시양태에서, 스크리닝 방법은 유전자 프로파일을 확인하기 위해 어레이 또는 마이크로어레이를 사용하여 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 노던 블롯과 같은 블롯 분석법에서의 혼성화와 같은 공지된 방법을 사용함으로써 트랜스크립톰 프로파일을 분석할 수 있다. 또다른 실시양태에서, PCR을 기초로 하는 방법, 예컨대 특정 세트의 유전자의 발현을 정량할 수 있는 RT-PCR이 방법에 포함될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 확인된 유전자, 예를 들어 폴딩 조정인자 단백질 (FM) 또는 프로테아제 단백질, 즉, 프로테아제, 펩티다제 또는 회합된 폴리펩티드 또는 보조인자가 고처리량 스크리닝 방법에 의해 확인된다.
마이크로어레이 또는 등가의 기술을 사용하여 트랜스크립톰 프로파일을 분석하는 것이 방법에 포함될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 마이크로어레이는 숙주 세포의 전사된 게놈의 적어도 일부를 포함할 수 있고, 생물의 전사된 유전자의 적어도 50％의 유전자로부터의 샘플에 대한 결합 파트너를 전형적으로 포함한다. 더욱 전형적으로, 마이크로어레이 또는 등가의 기술은 숙주 세포의 게놈 내의 전사된 유전자의 적어도 80％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％로부터의 샘플에 대한 결합 파트너를 포함한다. 그러나, 별도의 실시양태에서, 마이크로어레이는 추정 프로테아제 유전자 또는 추정 폴딩 조정인자 유전자가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 게놈으로부터의 유전자의 선별된 부분집합에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있다. 마이크로어레이 또는 등가의 기술은 대조군으로 사용되는 유전자의 세트, 예컨대 하우스키핑 유전자에 대한 결합 파트너를 또한 전형적으로 포함한다. 마이크로어레이 또는 등가의 기술은 분해성 단백질, 폴딩 조정인자 및 보조인자, 대사성 단백질 예컨대 글루코스 대사 또는 아미노산 또는 핵염기 합성에 수반되는 단백질, 전사 인자, 핵산 안정 인자, 세포외 신호 조절 유전자 예컨대 키나제 및 수용체 또는 스캐폴딩(scaffolding) 단백질을 코딩하는 유전자와 같이 그룹으로 클러스터링된 유전자를 또한 포함할 수 있다.
마이크로어레이는 폴리뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), 화학물질, 항체 또는 기타 단백질 또는 펩티드가 포함될 수 있는 다수의 분리된 결합 파트너들을 마이크로칩, 유리 슬라이드 등과 같은 고체 지지체에 한정된 패턴으로 연결시킴으로써 일반적으로 형성된다. 마이크로어레이를 당해 세포로부터 수득된 샘플과 접촉시키고, 칩 상의 서열에 혼성화하는, 세포에서 발현된 결합 파트너의 결합을 검출함으로써, 혼성화 폴리뉴클레오티드에 의해 형성된 패턴으로 세포에서 발현된 유전자 또는 유전자의 클러스터가 확인된다. 또한, 고체 지지체에 연결된 각각의 구성원이 공지된 경우, 핵산 샘플로부터의 혼성화 파트너의 신원이 확인될 수 있다. 마이크로어레이 기술의 한 강점은 혼성화 패턴을 비교하는 것에 의해 간단하게 차별적인 유전자 발현이 확인된다는 것이다.
고처리량 스크리닝 방법의 예로는 숙주 세포 mRNA 또는 실질적으로 상응하는 cDNA가 혼성화가능한 어레이(들) 또는 마이크로어레이(들)에 혼성화되는 것이 포함된다. 어레이 또는 마이크로어레이는 핵산 또는 핵산 유사 올리고머 또는 중합체의 1개 이상의 어레이(들)일 수 있다. 한 실시양태에서, 어레이(들) 또는 마이크로어레이(들)은, 독립적으로 또는 총괄적으로, 숙주 세포 균주 내의 FM을 코딩하는 것으로 공지되었거나 이를 코딩할 것으로 예상되는 모든 유전자 또는 숙주 세포 균주 내의 프로테아제 또는 프로테아제 단백질을 코딩하는 것으로 공지되었거나 이를 코딩할 것으로 예상되는 모든 유전자의 대표적인 부분에 뉴클레오티드 서열이 혼성화가능한 핵산 또는 핵산 유사 올리고머 또는 중합체의 집단을 함유하는, 숙주 세포-게놈-와이드(wide) 어레이(들) 또는 마이크로어레이(들)일 것이다. 게놈-와이드 마이크로어레이는 예컨대 숙주의 mRNA 또는 상응하는 cDNA로부터의 공지된 또는 예상된 오픈 리딩 프레임 (ORF) 서열 모두의 대표적인 부분에 결합하는 서열을 포함한다.
어레이 내의 올리고뉴클레오티드 서열 또는 유사체는 숙주 세포로부터의 mRNA 또는 상응하는 cDNA 서열에 전형적으로 혼성화하고, 숙주 mRNA 또는 cDNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 숙주 mRNA 또는 cDNA 서열에 상동성인 서열을 전형적으로 포함한다. 상보성 서열을 갖는 단일 DNA 가닥들은 서로 쌍을 이루어 이중-가닥 분자를 형성할 수 있다. 마이크로어레이에는 고도로 평행한 포맷으로의 혼성화 원리가 일반적으로 적용된다. 확인된 것 하나 대신에, 수천개의 상이한 잠재적인 확인된 것들을 미니어쳐 고체 지지체 상에 어레이시킬 수 있다. 독특한 표지된 DNA 프로브 대신에, 특정 세포 유형 또는 조직의 RNA로부터 제조된, 표지된 DNA 분자의 복합 혼합물이 사용된다. 이러한 복합 프로브 내의 개별적인 표지된 DNA 분자가 풍부한 것은 상응하는 유전자의 발현 수준을 전형적으로 반영한다. 단순화된 방법에서, 어레이에 혼성화될 때, 풍부한 서열에서는 강한 신호를 발생하고, 희박한 서열에서는 약한 신호를 발생할 것이다. 신호의 세기는 원래의 샘플 내의 유전자 발현 수준을 나타낼 수 있다.
한 실시양태에서, 게놈-와이드 어레이 또는 마이크로어레이가 사용될 것이다. 한 실시양태에서, 어레이는 숙주의 게놈 내의 오픈 리딩 프레임의 50％ 초과, 또는 게놈 내의 공지된 오픈 리딩 프레임의 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 초과를 나타낸다. 어레이는 숙주 세포 내의 단백질을 코딩하는 것으로 공지된 서열의 적어도 50％의 적어도 일부를 또한 나타낼 수 있다. 별도의 실시양태에서, 어레이는 숙주 세포의 유전자 또는 추정 유전자의 50％ 초과, 또는 공지된 유전자 또는 추정 유전자의 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 초과를 나타낸다. 한 실시양태에서, 1개를 초과하는 올리고뉴클레오티드 또는 유사체가 각각의 유전자 또는 추정 유전자 서열 또는 오픈 리딩 프레임에 대해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 다중 올리고뉴클레오티드 또는 유사체는 공지된 유전자 또는 추정 유전자 서열의 상이한 부분들을 나타낸다. 각각의 유전자 또는 추정 유전자 서열에 대해, 약 1 내지 약 10000개 또는 약 1 내지 약 100개 또는 약 1 내지 약 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10개 이하의 올리고뉴클레오티드 또는 유사체가 어레이 상에 존재할 수 있다.
마이크로어레이, 또는 완전한 게놈-와이드 어레이 또는 마이크로어레이는 숙주 세포 게놈의 서열(들) 또는 게놈 내의 제안된 코딩 서열에 대한 지식을 기초로, 또는 숙주 세포 또는 숙주 생물 내의 발현된 mRNA 서열의 지식을 기초로, 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있다.
상이한 유형의 숙주 세포에 대해, 동일한 유형의 마이크로어레이를 적용할 수 있다. 마이크로어레이의 유형에는 상보성 DNA (cDNA) 마이크로어레이 ([Schena, M. et al. (1995), Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270:467-70]) 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 ([Lockhart, et al. (1996), Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 14:1675-80])가 포함된다. cDNA 마이크로어레이를 위해서, 부분적 또는 전체 오픈 리딩 프레임의 DNA 단편을 슬라이드 상에 프린트한다. 분자의 상이한 부분이 상이한 위치에 프린트될 수 있기 때문에, 혼성화 특성은 슬라이드 전반에 걸쳐 상이할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 어레이를 위해, 20량체 내지 80량체의 올리고머를 원위치에서 (온-칩(on-chip)), 또는 통상적인 합성 후 온-칩 고정에 의해 합성할 수 있지만, 일반적으로 모든 프로브들은 혼성화 온도 및 결합 친화력과 관련하여 유사하도록 디자인된다 ([Butte, A. (2002), The use and analysis of microarray data. Nat Rev Drug Discov 1:951-60]).
트랜스크립톰 프로파일의 분석에서, 핵산 또는 핵산 유사 올리고머 또는 중합체는 RNA, DNA, 또는 RNA 또는 DNA의 유사체일 수 있다. 이같은 핵산 유사체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 하기의 것들이 포함된다: 펩티드 핵산 (PNA); 아라비노스 핵산; 알트리톨 핵산; 가교 핵산 (BNA), 예를 들어, 2'-O,4'-C-에틸렌 가교 핵산, 및 2'-O,4'-C-메틸렌 가교 핵산; 시클로헥세닐 핵산; 2',5'-연결 뉴클레오티드계 핵산; 모르폴리노 핵산 (핵염기-치환 모르폴리노 유닛이 예를 들어 포스포로디아미데이트 연결에 의해 연결됨); 골격-치환 핵산 유사체, 예를 들어, 올리고- 또는 폴리-사카라이드-유형 핵산 또는 유사체의 2' 탄소 원자 중 1개 이상이, 예를 들어, 할로, 티오, 아미노, 지방족, 옥시지방족, 티오지방족 또는 아미노지방족 기 (식중 지방족은 전형적으로 C1-C10 지방족이다) 중 임의의 것으로 독립적으로 치환된 2'-치환 핵산.
어레이 내의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 균일한 크기일 수 있고, 한 실시양태에서, 길이는 약 10 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 1000개, 20 내지 약 500개, 20 내지 약 100개, 약 20개, 약 25개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개 또는 약 100개의 뉴클레오티드일 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이는 약 100개를 초과하는, 또는 약 1,000개 이상을 초과하는 여러 올리고뉴클레오티드 프로브들을 포함하는 고밀도 어레이일 수 있다. 이같은 고밀도 어레이는 프로브 밀도가 ㎠ 당 약 60개 초과, 더욱 일반적으로는 약 100개 초과, 가장 일반적으로는 약 600개 초과, 종종 약 1000개 초과, 더욱 종종 약 5,000개 초과, 가장 종종 약 10,000개 초과, 전형적으로는 약 40,000개 초과, 더욱 전형적으로는 약 100,000개 초과, 그리고 특정 예에서는 약 400,000개 초과의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다 (이때 상이한 올리고뉴클레오티드는 상이한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭함). 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 약 5 내지 약 500개, 또는 약 5 내지 50개, 또는 약 5 내지 약 45개의 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 가장 전형적으로는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오티드 범위이다. 특정 어레이는 길이가 약 20 내지 약 25개의 올리고뉴클레오티드인 프로브를 함유한다. 어레이는 각각의 확인된 유전자에 대해 특이적인 10개 초과, 또는 50개 초과, 또는 100개 초과, 전형적으로는 1000개 초과의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 어레이는 각각의 유전자에 대해 적어도 10개의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 어레이는 각각의 유전자에 대해 상보적인 20개 이하의 올리고뉴클레오티드를 갖는다. 평면 어레이 표면이 전형적이지만, 어레이는 사실상 임의 형상의 표면 상에 또는 심지어 다중 표면 상에 제작될 수 있다.
어레이는 미스매치(mismatch) 대조군 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 이같은 미스매치 대조군이 존재하는 경우, 정량 단계는 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브와 이의 상응하는 미스매치 대조군 프로브 간의 혼성화 신호 강도에서의 차이를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 정량은 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브와 각각의 유전자에 대한 이의 상응하는 미스매치 대조군 프로브 간의 혼성화 신호 강도에서의 평균 차이를 계산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 분석법 포맷에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 구속될 수 있고, 즉 공유 부착에 의해 구속될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 평행한 고정된 중합체 합성 방법에 의해 또는 광-지시 중합체 합성 방법에 의해, 예를 들어 폴리-L-라이신 기판 예컨대 슬라이드 상에 화학적으로 합성될 수 있다. 클로닝, 핵산 증폭 단계 또는 효소적 합성이 프로브 제조에 필요하지 않다는 점에서, 화학적으로 합성된 어레이가 유리하다. 어레이는 발현이 검출될 유전자 (또는 mRNA 또는 상응하는 안티센스 cRNA) 중 하나의 하위서열에 상보적인 서열을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브인 테스트 프로브를 포함한다. 또한, 어레이는 본원에 기술된 바와 같은 표준화 대조군, 미스매치 대조군 및 발현 수준 대조군을 함유할 수 있다.
게놈 내의 공지된 유전자 당 1개의 혼성화 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 어레이를 디자인할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 등가의 결합 파트너는 5'-아미노 변형되어 에폭시-코딩 슬라이드에의 공유 결합을 지지할 수 있다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드 간의 서열 동일성을 25％ 미만으로 감소시킴으로써, 교차-혼성화가 감소되도록 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 일반적으로, 어레이 디자인 전에 올리고뉴클레오티드의 융점을 분석하여, 일관된 GC 함량 및 Tm을 확실하게 하고, 올리고뉴클레오티드 결합 파트너의 2차 구조를 최적화시킨다. 트랜스크립톰 프로파일링을 위해, 2차 구조는 전형적으로 최소화된다. 한 실시양태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드를 슬라이드 상의 2개 이상의 상이한 위치에 프린트하여, 정확성을 증가시킨다. 숙주 세포 또는 생물과 상이한 종들로부터의 서열을 기초로 대조군 올리고뉴클레오티드를 또한 디자인하여, 배경 결합을 나타낼 수 있다.
유전자 프로파일에서의 샘플을 개별적으로 분석할 수 있거나, 또는 클러스터로 그룹화할 수 있다. 클러스터는 유전자 발현에서의 유사성에 의해 전형적으로 그룹화될 수 있다. 한 실시양태에서, 클러스터는 숙주 세포에서 유사한 정도로 조절되는 유전자로서 개별적으로 그룹화될 수 있다. 또한 클러스터는 재조합 숙주 세포에서 유사한 정도로 조절되는 유전자, 예를 들어 숙주 세포 또는 변형된 또는 변형되지 않은 세포와 비교하여 유사한 정도로 상향 조절 또는 하향 조절되는 유전자의 그룹을 포함할 수 있다. 클러스터는 유전자 또는 단백질 구조, 기능에 의해 관련된, 또는, 트랜스크립톰 어레이의 경우, 숙주의 게놈 내의 유전자에 대한 결합 파트너의 배치 또는 그룹화에 의해 관련된 그룹을 또한 포함할 수 있다. 결합 파트너의 그룹 또는 분석된 유전자 또는 단백질의 그룹은 추정 또는 공지된 프로테아제를 코딩하기 위한 유전자, 프로테아제의 보조 인자 또는 프로테아제-유사 단백질; 폴딩 조정인자, 폴딩 조정인자의 보조 인자 또는 단백질 폴딩 또는 용해도를 개선시킬 수 있는 단백질; 전사 인자; 핵산 안정성 또는 번역 개시에 수반되는 단백질; 키나제; 세포외 또는 세포내 수용체; 대사 효소; 대사 보조인자; 껍질 단백질; 시그마 인자; 막 결합 단백질; 막횡단 단백질; 막 회합 단백질 및 하우스키핑 유전자로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는 유전자를 포함할 수 있다.
프로테옴
또다른 실시양태에서, 분석된 유전자 프로파일은 프로테옴 프로파일이다. 숙주의 프로테옴은 임의의 한 시점에 게놈에 의해 생산된 단백질의 완전한 세트이다. 각각의 단백질이 합성 후 화학적으로 변형될 수 있기 때문에 프로테옴은 게놈 또는 트랜스크립톰보다 일반적으로 훨씬 더 복합적이다. 숙주 세포에 따라, 많은 단백질들이 생산 동안 절단되거나, 인산화되거나, 아세틸화되거나, 메틸화되거나, 또는 탄수화물 기가 이에 부가된다. 프로테옴은 또한 매우 역동적이다. 프로테옴을 연구하는 프로테오믹스(proteomics)는 단백질 구조, 단백질 발현 및 기능의 다수의 상이한 양상을 다룰 수 있다. 프로테옴 분석용 기술은 트랜스크립토믹스에서 사용되는 것들만큼 수월하지 않다. 그러나, 프로테오믹스의 장점은 세포의 기능성 분자가 연구된다는 것이다.
방법은 단백질 발현 수준, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-소형 분자 상호작용 또는 효소적 활성을 측정하는 기술을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 전형적으로 질량 분광법을 사용하여, 특정 단백질의 크기를 측정하는 것을 포함하는 스크리닝 방법을 사용하여 프로테옴을 분석한다. 한 실시양태에서, 프로테옴 프로파일을 분석하기 위한 기술은 항체가 당해 단백질에 혼성화되는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법은 당업계에 공지된 바와 같은 웨스턴 블롯 프로세스를 포함할 수 있거나, 또는 컬럼 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 또한 방법은 당업계에 공지된 ELISA 스크리닝과 같은 표준 방법을 포함할 수 있다. 또한 방법은 핵산 변형된 결합 파트너의 결합을 포함할 수 있고, 이들은 앱타머 또는 프로테옴 내의 단백질 또는 펩티드 단편에 대한 단백질 또는 화학적 결합 파트너일 수 있으며, 스크리닝 방법은 핵산의 증폭을 포함할 수 있다. 또한 방법은 프로테옴 내의 단백질 또는 단백질 단편에 결합하는 화학적 화합물을 포함할 수 있고, 방법은 화학적 수단에 의한 결합의 측정을 포함할 수 있다. 측정은 화학 반응에서의 반응 생성물의 측정 또는 형광단의 활성화에 의한 측정을 또한 포함할 수 있다. 2차원 겔 전기영동 또는 다차원 액체 크로마토그래피와 같은 분리 도구와 조합된 질량 분광법과 같은 기술을 또한 방법에서 사용할 수 있다. 전형적으로, 방법은 고처리량 스크리닝 기술을 포함한다.
본 발명의 방법은, 예를 들어, 2차원 전기영동을 사용하여 프로테옴 프로파일을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 이는 서로 직각으로 배향된 2차원 배치에 의해 샘플 내 단백질을 분리 및 확인하기 위한 방법이다. 이는 샘플이 더 큰 면적에 걸쳐 분리되도록 하여, 각 성분의 해상도를 증가시킨다. 첫번째 차원은 특정 분자의 전하를 전형적으로 기초로 하고, 두번째 차원은 분자의 크기를 기초로 할 수 있다. 첫번째 차원에서, 고정된 pH 구배 전기영동 (IPGE), 등전 포커싱(focusing) (IEF), 또는 비-평형 pH 구배 전기영동을 사용하여 단백질을 이의 등전점에 따라 해상시킨다. 표준 조건의 온도 및 요소 농도 하에, 대다수의 단백질의 관측된 초점은 단백질의 아미노산 조성으로부터 계산된 예상 등전점에 거의 근접한다. 일반적으로, 숙주 샘플 제조 후의 첫번째 단계는 등전 포커싱으로 공지된 프로세스인, 샘플을 pH 구배에 대해 러닝(running)시키는 것을 포함한다. pH 구배는 양성전해질을 아크릴아미드 겔에 첨가함으로써 생성될 수 있다. 이는 다양한 pI 값들의 양성 종들의 혼합물이다. 또한 pH 구배는 이모빌린(Immobiline)을 첨가함으로써 생성될 수 있고, 이는 양성전해질과 유사하지만 폴리아크릴아미드 겔 내에 고정되어 예비-포커싱될 필요가 없는 고정된 pH 구배가 생산된다.
2차원 전기영동에서의 두번째 차원은 단백질의 크기에 의한 분리일 수 있다. 소듐 도데실 술페이트 폴리-아크릴아미드-전기영동 (SDS-PAGE)을 사용하여 단백질을 이의 대략적인 분자량에 따라 분리시킬 수 있다. 이 기술은 당업계에서 널리 사용되고 공지되어 있다. 기본 아이디어는 단백질을 세제 (SDS)로 코팅하는 것이고, 이는 샘플 내의 모든 단백질을 코팅하여 이들을 음성 전하를 띠게 한다. 그 후, 단백질을 겔 전기영동에 적용한다. 겔은 전형적으로 아크릴아미드 겔일 수 있고, 밀도 구배 상태일 수 있다. 겔 상에 놓인 전하는 단백질을 크기를 기초로 겔을 통해 밀어낸다. 2차원 전기영동에서, 분리된 단백질은 생물의 프로테옴의 적어도 10％로부터의 단백질을 포함할 수 있다. 더욱 전형적으로, 숙주 세포의 프로테옴 내의 단백질의 적어도 20％, 30％, 40％, 60％, 80％ 또는 90％로부터의 단백질이 단백질의 염색 및/또는 질량 분광법과 같은 기술에 의해 분리 및 분석된다.
본 발명의 방법은 마이크로어레이를 사용하여 프로테옴 프로파일을 분석하는 것을 또한 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 마이크로어레이는 적절한 성장 조건 하에 숙주 세포에 의해 발현되는 단백질의 적어도 일부에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있고, 전형적으로 생물의 프로테옴의 적어도 5％로부터의 단백질에 대한 결합 파트너를 포함한다. 더욱 전형적으로, 마이크로어레이는 숙주 세포의 프로테옴 내의 단백질의 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 60％, 80％ 또는 90％로부터의 단백질에 대한 결합 파트너를 포함한다. 결합 파트너는 항체일 수 있고, 이는 단일쇄 항체 단편과 같은 항체 단편일 수 있다. 또한 결합 파트너는 특정 단백질 또는 단백질의 일부에 결합하는 핵산을 포함하는 분자인 앱타머를 포함할 수 있다. 별도의 실시양태에서, 마이크로어레이는 추정 프로테아제 단백질 또는 추정 폴딩 조정인자가 예를 들어 포함되는, 프로테옴으로부터의 단백질의 선택된 부분집합에 대한 결합 파트너를 포함할 수 있다. 또한 마이크로어레이는 대조군으로 사용되는 단백질에 대한 결합 파트너의 세트를 전형적으로 포함할 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 단백질이 마이크로어레이 상의 결합 파트너에 결합하는 것을 측정함으로써 유전자 프로파일을 분석할 수 있다
가장 단순한 단백질 어레이 포맷은 평면 지지체 재료 상의 한정된 스팟에 결합된 다수의 단백질 포획 시약으로 일반적으로 구성된다. 그 후, 이러한 어레이를 복합 단백질 샘플에 노출시킨다. 그 후, 특정 분석물 단백질이 개별적인 스팟에 결합하는 것을 여러 접근법들을 사용하여 모니터링할 수 있다. 분석물이 형광 염료로 예비-표지된 경우, 형광 스캐너를 사용하여 직접적으로 결합을 모니터링할 수 있다. 종종 전통적인 항체 샌드위치 유형 포맷이 사용되고, 이때 한 항체는 표면 상에 고정되고, 다른 하나는 형광 표지되거나, 또는 적합한 기질이 제공되는 경우 형광, 발광 또는 착색 생성물을 생산할 수 있는 효소에 접합된 2종의 단백질 결합 시약이 동일한 항원에 동시에 결합한다.
모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이들의 높은 특이성, 친화력 및 안정성으로 인해 포획제에 대한 현재의 한가지 선택이다. 이들은 다양한 전통적인 단일 분석물 단백질 프로파일링 분석법 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에서 70년대부터 사용되어 왔다. 추가적으로, 항체 단편의 파지-디스플레이 라이브러리는 프로테옴성 규모로의 항체 생산에 대한 가능성을 제공한다. 이러한 라이브러리를 사용하여 면역을 기초로 하는 프로세스로 가능한 것보다 현저하게 더 짧은 시간 내에 확인된 단백질에 대한 고친화력의 결합제를 단리할 수 있다. 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이는 라이브러리 단백질을 이들의 코딩 mRNA 서열에 물리적으로 연결시키는 것에 의존하는 완전히 시험관내에서 수행되는 추가적인 프로세스이다. 이같은 프로세스는 확인된 단백질에 대한 고친화력의 결합 시약을 선별하는데 성공적으로 사용되어 왔다 ([Wilson, DS, et al. (2001), The use of mRNA display to select high-affinity protein-binding peptides, Proc Natl Acad Sci USA 98:3750-3755]). 단백질 바이오칩(biochip)을 위해 고친화력의 단백질 포획 시약을 개발하기 위한 상이한 접근법이 여러 그룹에서 이루어졌다. 예를 들어, 단백질에 대한 친화력이 높은, 시험관내 선별 실험 (SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment: 기하급수적인 강화에 의한 리간드의 계통적 진화)로 명명됨)으로부터 유래된 단일 가닥 RNA 또는 DNA인 앱타머가 사용되어 왔다. 앱타머 기술에서의 추가적인 발달은 소위 포토앱타머(photoaptamer)이다. 이러한 분자는 단백질 포획 시약으로서의 유용성을 증강시키는 추가적인 속성을 갖는다. 이는 광(光)에 의해 활성화가능한 가교 기 5'-브로모데옥시유리딘을 갖고, 이는 UV 광에 의해 활성화될 때 결합된 확인된 단백질과의 공유 가교를 야기할 수 있다 ([Petach, H & Gold, L (2002), Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in protein microarrays, Curr Opin Biotechnol 13:309-314]). 광-가교 이벤트는 샌드위치 면역분석법에서의 2차 검출 항체의 결합과 유사한 특이성의 두번째 차원을 제공한다.
광범위한 표면 기판 및 부착 화학이 포획제를 단백질 마이크로어레이 상에 고정시키기 위해 평가되었다. 단백질을 고체 지지체 상에 고정시키는 한 방법은 소수성 또는 반데르발스(van der Waals) 상호작용, 수소 결합 또는 정전기력을 기초로 하는 비-공유 상호작용에 의존한다. 정전기 고정의 예로는 니트로셀룰로스 및 폴리-라이신- 또는 아미노프로필 실란-코팅 유리 슬라이드와 같은 재료를 사용하는 것이 포함된다. 96-웰 플레이트의 플라스틱 표면 상에의 물리적 흡착에 의해 단백질 마이크로어레이가 또한 제작되었다. 단백질을 표면에 공유 부착시키는 것의 예는 [MacBeath, G & Schreiber, SL (2000), Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination, Science 289:1760-1763]에 MacBeath 및 Schreiber에 의해 기술되었다. 비오틴에 대한 스트렙타비딘의 매우 높은 친화력으로 인해, 비오틴화 단백질을 스트렙타비딘 표면 상에 고정시키는 것은 공유와 유사하게 간주될 수 있다 ([Peluso, P et al. (2003), Optimizing antibody immobilization strategies for the construction of protein microarrays, Anal Biochem 312:113-124]). 추가적인 전략들이 기술되어 있다 ([Ruiz-Taylor, LA, et al (2001), X-ray photoelectron spectroscopy and radiometry studies of biotin-derivatized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) monolayers on metal oxides (Langmuir) 7313-7322]; [Ruiz-Taylor, LA et al. (2001), Monolayers of derivatized poly(L-lysine)-grafted poly(ethylene glycol) on metal oxides as a class of biomolecular interfaces, Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:852-857]; [Espejo A, Bedford MT. (2004), Protein-domain microarrays Processes, Mol Biol. 264:173-81]; [Zhu, H. et al. (2001) Global analysis of protein activities using proteome chips, Science Express]).
유전자 프로파일에서의 샘플을 개별적으로 분석할 수 있거나, 또는 클러스터로 그룹화할 수 있다. 클러스터는 유전자 발현에서의 유사성에 의해 전형적으로 그룹화될 수 있다. 한 실시양태에서, 클러스터는 숙주 세포에서 유사한 정도로 조절되는 단백질로서 개별적으로 그룹화될 수 있다. 또한 클러스터는 재조합 숙주 세포에서 유사한 정도로 조절되는 단백질, 예를 들어 숙주 세포 또는 변형된 또는 변형되지 않은 세포와 비교하여 유사한 정도로 상향 조절 또는 하향 조절되는 단백질의 그룹을 포함할 수 있다. 클러스터는 단백질 구조, 기능 또는 프로세싱에 의해 관련된 그룹을 또한 포함할 수 있다. 어레이 내의 단백질 결합 파트너의 그룹, 또는 2차원 전기영동과 같은 다른 분석법에서 분석된 단백질의 그룹은 추정 또는 공지된 프로테아제, 프로테아제의 보조 인자 또는 프로테아제-유사 단백질; 폴딩 조정인자, 폴딩 조정인자의 보조 인자 또는 단백질 폴딩 또는 용해도를 개선시킬 수 있는 단백질; 전사 인자; 핵산 안정성 또는 번역 개시에 수반되는 단백질; 키나제; 세포외 또는 세포내 수용체; 대사 효소; 대사 보조인자; 껍질 단백질; 및 하우스키핑 유전자로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
메타볼롬( metabolome )
프로테옴 분석 프로세스는 많은 단백질의 존재비 및 분포가 동시에 결정되도록 한다. 그러나, 프로테옴에 대한 변화의 기능적인 결과는 간접적으로만 보고된다. 또다른 접근법은 이러한 소형 분자 또는 대사산물의 수준을 측정하는 것이다. 본 발명의 방법에 의해 분석된 유전자 프로파일은 따라서 메타볼롬 프로파일을 포함할 수 있다. 특정 숙주의 메타볼롬을 분석하는 방법은 다양한 화학적 및 물리적 성질에 따라 대사산물을 분리하기 위한 기체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동을 포함한다. 그 후, 질량 분광법과 같은 프로세스를 사용하여 분자들을 확인할 수 있다.
검출/분석
본 발명의 방법은 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 보상 유전자 또는 유전자 생성물을 확인하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 단계는 다수의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 모니터링 (예를 들어, 발현을 검출 또는 정량)하는 것을 포함한다. 상기 기술된 바와 같은 트랜스크립톰, 프로테옴 또는 메타볼롬 프로파일에 숙주 세포 유전자 생성물이 결합하는 것을 검출함으로써 일반적으로 발현을 모니터링한다. 결합의 분석은 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포와 천연 숙주 세포 또는 이 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 재조합 숙주 세포 간의 결합을 비교하는 것을 수반할 수 있다.
검출
이러한 단계는 다수의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 모니터링 (예를 들어, 발현을 검출 또는 정량)하는 것을 포함한다. 상기 기술된 바와 같은 트랜스크립톰, 프로테옴 또는 메타볼롬 프로파일에 숙주 세포 유전자 생성물이 결합하는 것을 검출함으로써 일반적으로 발현을 모니터링한다. 전형적으로, 적어도 약 10개의 유전자, 또는 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 1000 개, 또는 적어도 약 10,000개의 상이한 유전자들을 한번에 분석할 수 있다. 1개 이상의 상기 유전자의 RNA 전사물을 포함하는 확인된 핵산, 또는 RNA 전사물로부터 유래된 핵산의 풀을 제공하는 단계; 핵산의 풀을 표면 상에 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이에 혼성화시키고, 이때 어레이는 100개를 초과하는 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 상이한 올리고뉴클레오티드는 상기 표면의 미리 정해진 영역에 국소화되고, 각각의 상이한 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 공유 결합을 통해 표면에 부착되고, 올리고뉴클레오티드 프로브는 RNA 전사물 또는 RNA 전사물로부터 유래된 핵산에 상보적인 단계; 및 어레이 내의 혼성화된 핵산을 정량하는 단계가 방법에 수반될 수 있다. 2개의 샘플 간의 유전자 생성물의 발현을 모니터링하기 위한 한 기술의 도해도가 도 12에 묘사된다.
세포성 단백질의 풀을 제공하는 단계가 방법에 또한 수반될 수 있다. 이는 세제 또는 계면활성제를 사용하여; 삼투압 용해를 사용하여; 열 변화, 예컨대 동결-해동 사이클을 사용하여; 기계적 수단을 사용하여 또는 압력 변화를 사용하여 세포를 용해시킴으로써 제조된 세포성 용해물로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 특정 단백질, 예컨대 프로테아제, 특히 비-특이적 프로테아제를 억제하여 단백질의 분해를 제한하는 화학물질이 세포 또는 세포 시스템의 용해 프로세스에 포함된다. 또한, 세포 용해물은 전형적으로 4℃ 이하에서 유지되고, 프로세싱 동안 0℃ 이하 또는 20℃ 이하에서 유지될 수 있다. 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 또는 친화성 매트릭스 크로마토그래피에 의해, 예컨대 HPLC를 사용함으로써, 추가적인 프로세싱 전에 세포 용해물을 분리할 수 있다
전형적으로, 확인된 유전자 생성물인 mRNA, cDNA, 단백질 또는 대사산물을 검출가능한 마커 또는 프로브로 표지한다. 마커 또는 프로브는 1개 이상의 형광 분자 또는 형광단일 수 있다. 이는 스크리닝용의 검출가능한 분자를 제공하기 위해 역전사된 cDNA 내로 혼입될 수 있는 특정 뉴클레오티드에 예를 들어 연결된 Cy3 및 Cy5와 같이 시판되는 분자를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1형광단이 숙주로부터의 샘플 내로 혼입되고, 제2형광단이 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주로부터의 샘플 내로 혼입된다. 한 실시양태에서, 제1형광단 및 제2형광단이 상이한 파장의 빛을 방출한다. 이러한 실시양태에서, 숙주 및 재조합 단백질을 발현하는 숙주로부터의 샘플의 결합을 동일한 분석법으로 모니터링할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 형광단은 상이한 파장의 빛에서 여기된다. 또다른 실시양태에서, 제1형광단 및 제2형광단은 동일한 파장에서 여기되거나 빛을 방출한다. 이러한 실시양태에서, 숙주 및 재조합 단백질을 발현하는 숙주로부터의 샘플은 상이한 분석법으로 전형적으로 모니터링된다.
확인된 핵산 또는 단백질 또는 화학적 대사산물의 혼성화를 정량하는 단계가 방법에 추가적으로 포함될 수 있다. 정량은 1개 이상의 유전자의 전사 수준의 측정을 포함할 수 있다. 전형적으로, 확인된 핵산의 풀은, 예를 들어, 확인된 핵산 (프리(pre)-mRNA 전사물, mRNA 전사물 또는 RNA 전사물로부터 유래된 핵산)의 농도가 이러한 확인된 핵산을 코딩하는 유전자의 발현 수준에 비례하는 것이다.
트랜스크립톰 분석을 위해, 핵산의 풀을 혼성화 전, 도중 또는 후에 표지시킬 수 있고, 전형적으로는 핵산은 혼성화 전에 표지된다. 형광 표지가 종종 단일 형광단과 함께 전형적으로 사용되고, 형광 표지화가 사용되는 경우, 혼성화된 핵산의 정량은 혼성화된 형광 표지된 핵산으로부터의 형광의 정량에 의한 것일 수 있다. 이같은 정량은 동일초점 레이저 스캐너 또는 형광 현미경, 예컨대 동일초점 형광 현미경의 사용에 의해 용이해지고, 여기에 어레이의 자동 스캐닝을 허용하는 자동화된 단계가 갖춰질 수 있고, 자동화된 측정 기록 및 형광 강도 정보의 후속 프로세싱을 위한 데이타 취득 시스템이 갖춰질 수 있다. 이같은 어레이를 판독하기 위한 설비에는 CloneTracker™, ImaGene™, GeneSight™ 모듈 및 GeneDirector™ 데이타베이스 (Biodiscovery, Inc. (El Segundo, Calif.)), 또는 GeneChip™ 판독기 (Affymetrix, Inc. (Santa Clara, Calif.))가 포함된다. 한 실시양태에서, 혼성화는 낮은 엄격도 (예를 들어 약 2O℃ 내지 약 5O℃, 또는 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 37 ℃)에서 일어난다. 혼성화는 원하는 수준의 혼성화 특이성에 도달할 때까지 점진적으로 증가하는 엄격도에서의 후속 세정을 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 수단을 사용하여 혼성화 신호를 정량할 수 있다. 그러나, 한 실시양태에서, 동일초점 형광 스캐너를 사용하여 정량을 달성한다. 각 올리고뉴클레오티드 프로브와 이의 상응하는 미스매치 대조군 프로브 간의 혼성화 신호 강도에서의 차이를 계산함으로써 데이타를 전형적으로 평가한다. 전형적으로, 이러한 차이를 각각의 유전자에 대해 계산 및 평가할 수 있다. 특정 분석 프로세스가 본원에서 제공된다.
적합한 박테리아 혼성화 프로브를 제조하기 위한 기술이 개발되었다 (예를 들어, [Choi et al. (2003), App. Envir. Microbio. 69:4737-4742] 참조). 예를 들어, 세포를 RNA 안정화제 예컨대 RNAlater (Ambion (Austin, TX)) 내에 저장할 수 있다. RNA를 일반적으로 3단계로 정제한다: (1) 전체 RNA의 단리, (2) 오염성 DNA의 제거, 및 (3) 전체 RNA의 정화. 전체 RNA를 단리한 후, 무작위 6량체 프라이머 및 역전사효소와 혼합하여 cDNA를 제조할 수 있다. 전형적으로, 1개 이상의 형광 프로브가 cDNA 내로 혼입된다. 한 실시양태에서는 1개의 형광 프로브가 혼입되고, 또다른 실시양태에서는 1개를 초과하는 프로브, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 형광 프로브가 cDNA의 동일한 또는 상이한 샘플 내로 혼입된다. 진핵생물 숙주에서, 확인된 핵산의 풀은 또한 생물학적 샘플로부터 단리된 전체 폴리A+ mRNA, 또는 RNA의 역전사에 의해 제조된 cDNA 또는 이중 가닥 cDNA 중간체로부터 전사된 2차 가닥 cDNA 또는 RNA일 수 있다.
역전사 반응 동안 cDNA 분자 내로 형광 염료가 전형적으로 혼입된다. 원핵생물 (박테리아)와 진핵생물 (효모, 포유류 세포 등) 간의 상이한 mRNA 구조로 인해, 상이한 프라이머를 사용할 수 있지만, 양쪽 모두의 경우에 무작위 프라이머를 사용할 수 있고, 올리고-dT 프라이머가 진핵생물에서 사용될 수 있으며, 이는 폴리A 꼬리를 갖는다. 별법적인 프로세스는 신호 강도를 증가시키는 아미노-알릴 표지이다. 이러한 프로세스는 역전사 반응 후 형광 염료가 부착될 수 있는 화학적으로 반응성인 기를 특징으로 하는 뉴클레오티드 유사체를 혼입시킨다 ([Manduchi, E. et al. (2002), Comparison of different labeling processes for two-channel high-density microarray experiments. Physiol Genomics 10:169-79]).
샘플의 복합성을 감소시키고, 따라서 혼성화에서 수득된 배경 신호를 감소시키기 위해, 확인된 핵산의 풀을 처리할 수 있다. 용어 "배경" 또는 "배경 신호"는 표지된 확인된 핵산과 올리고뉴클레오티드 어레이의 성분 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브, 대조군 프로브, 어레이 기판 등) 간의 비-특이적 결합 또는 기타 상호작용으로부터 야기된 혼성화 신호를 지칭한다. 한 접근법에서, 생물학적 샘플로부터 유래된 mRNA의 풀이 어레이 내에 존재하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 풀과 혼성화된다. 그 후, 혼성화된 핵산의 풀을 단일 가닥 영역을 소화하는 RNA 분해효소 A로 처리한다. 그 후, 나머지 이중 가닥 혼성화 복합체를 변성시키고, 올리고뉴클레오티드 프로브를 제거하면, 어레이 내의 올리고뉴클레오티드 프로브에 상보적인 mRNA에 대해 증강된 mRNA의 풀이 남게 된다.
배경을 감소시키기 위한 또다른 접근법에서는, 생물학적 샘플로부터 유래된 mRNA의 풀을, 어레이 내의 올리고뉴클레오티드 프로브에 상보적인 mRNA의 부분서열에 플랭킹된 영역에 상보적인, 쌍을 이룬 확인된 특정 올리고뉴클레오티드와 혼성화시킨다. 혼성화된 핵산의 풀을 혼성화된 (이중 가닥) 핵산 서열을 소화시키는 RNA분해효소 H로 처리한다. 그 후, 쌍을 이룬 확인된 특정 올리고뉴클레오티드가 플랭킹된 영역과 거의 등가의 길이인 나머지 단일 가닥 핵산 서열을 단리하고 (예를 들어, 전기영동에 의해), 유전자 발현을 모니터링하기 위한 핵산의 풀로서 사용한다.
배경 감소를 위한 세번째 접근법은 특정한 미리 선택된 확인된 mRNA 메세지 (예를 들어, 샘플에서 특징적으로 과발현되는 메세지)의 풀에서의 표시를 제거하거나 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 프로세스는 미리 선택된 확인된 mRNA 메세지에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 생물학적 샘플로부터 유래된 폴리A+ mRNA의 풀에 혼성화시키는 것을 수반한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 상보적인, 특정한 미리 선택된 폴리A+ mRNA에 혼성화한다. 혼성화된 핵산의 풀을 이중 가닥 (혼성화된) 영역을 소화시키는 RNA분해효소 H로 처리함으로써, 메세지를 이의 폴리A+ 꼬리로부터 분리시킨다. 그 후, 풀 내의 폴리A+ mRNA의 단리 또는 증폭 (예를 들어, 올리고dT 컬럼을 사용함)으로 미리 선택된 확인된 mRNA 메세지의 표시가 감소되었거나 없는 폴이 제공된다.
분석
재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 유전자 프로파일을 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 숙주 세포의 유전자 프로파일과 비교함으로써, 확인된 유전자가 전형적으로 확인된다. 별법적인 실시양태에서는, 변형될 세포 (제2세포)의 유전자 프로파일을 이로부터 변형되는 세포 (제1세포)와 비교함으로써, 변형될 확인된 유전자가 확인된다. 제2세포의 유전자 프로파일을 제1세포의 유전자 프로파일과 비교하고, 제2세포에서 발현이 증가된 1개 이상의 유전자를 확인함으로써, 확인된 유전자가 확인된다.
cDNA 마이크로어레이는 두 샘플 간의 상대적인 mRNA 존재비를 측정한다. 일련의 유도후 시점 샘플들을 동일한 균주에 대한 유도전 샘플과 비교할 수 있거나 (일시적인 발현 프로파일), 또는 유도후 샘플을 상이한 균주와 동일한 시점에 비교할 수 있다. GeneSight™과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 비교할 수 있다. 예를 들어, 형광 택을 사용하는 마이크로어레이를 사용하는 경우, 스팟 강도를 어레이에 부착된 각 샘플 (예를 들어 DNA 서열)에 대해 측정할 수 있다. 그 후, 스팟 강도를 배경에 대해 정정할 수 있고, 숙주로부터의 샘플 대 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주에 대한, 또는 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 변형된 숙주와 비교된 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주에 대한 강도의 비율을 측정할 수 있다. 이 비율은 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현 시, 또는 확인된 유전자가 확인되도록 하는 숙주 세포의 변형 시 상향 조절되거나 발현이 증가되는 유전자를 확인하는 척도를 제공한다.
유전자가 상향조절되는지 여부를 확인하기 위해, 표준값 또는 "컷오프(cut off)" 비율을 설정한다. 특정 분석법과 관련된 배경 노이즈의 효과를 극복하도록 컷오프 비율을 디자인할 수 있다. 일반적으로, 측정치 간의 1을 초과하는 임의 비율은 상향 조절된 유전자를 가리킬 수 있다. 그러나, 분석법 간의 편차는 1보다 높은 비율, 예를 들어 1.5, 또는 2 초과, 또는 2.5 초과, 또는 3 초과, 또는 3.5 초과, 또는 4 초과, 또는 4.5 초과, 또는 5 초과, 또는 6 초과, 또는 7초과, 또는 8 초과, 또는 9 초과, 또는 10 초과를 요구할 수 있다. 당업계에 공지된 표준값들에 의존적으로 프로세스 전에 표준값을 설정할 수 있거나, 또는 대조군 유전자 또는 유전자 생성물, 예컨대 하우스키핑 유전자의 수준의 비율을 비교함으로써 측정 도중에 표준값을 설정할 수 있다.
단계 III : 확인된 보상 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 세포의 유전자 변형으로 변화시켜, 재조합 단백질 발현, 활성 또는 용해도에서의 증가가 달성되는 변형된 재조합 세포를 제공함
확인된 보상 유전자
단계 ii)에서 확인된 보상 유전자 또는 유전자 생성물, 또는 이의 상동성 유사체, 보조인자 또는 서브유닛을 사용하여, 1개 이상의 확인된 유전자의 발현 증가, 감소, 녹인 또는 녹아웃되도록 세포를 유전자 변형시키기 위한 전략을 디자인한다. 공공 데이타베이스에서 확인된 유전자 서열을 사용하여 전략을 디자인할 수 있고, 특히 상기 기술된 기술에 의해 유전자의 발현을 조정하기 위한 구축물을 디자인할 수 있다. 이같은 기술은 주지되어 있다.
한 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 1개 이상의 추정 프로테아제, 프로테아제-유사 단백질, 프로테아제의 보조인자 또는 서브유닛이다. 또다른 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 1개 이상의 폴딩 조정인자, 추정 폴딩 조정인자, 폴딩 조정인자의 보조인자 또는 서브유닛이다. 특정 실시양태에서, 확인된 유전자는 프로테아제의 서브유닛이다. 한 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파르틱 또는 메탈로 펩티다제일 수 있다. 한 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 hslV, hslU, clpA, clpB 및 clpX로부터 선택될 수 있다. 또한 확인된 유전자는 프로테아제의 보조인자일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 폴딩 조정인자이다. 일부 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 샤페론 단백질, 폴딩효소, 펩티딜 프롤릴 이성화효소 및 디술피드 결합 이성화효소로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확인된 유전자 또는 유전자들은 htpG, cbpA, dnaJ, dnaK 및 fkbP로부터 선택될 수 있다.
박테리아 유전자는 조화된(coordinated) 기능, 예컨대 소정의 아미노산의 생합성을 수행하는데 필요한 단백질들을 코딩하는 유전자 클러스터인 오페론 내로 조직화된다. 따라서, 한 실시양태에서, 확인된 유전자는 오페론의 일부이다. 특정 실시양태에서, 확인된 유전자는 단독으로 또는 조합되어 프로테아제 활성을 갖는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 오페론이거나, 또는 폴딩효소, 샤페론 및 이성화효소를 포함하여 폴딩 조정인자 활성을 갖는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 오페론이다.
프로테아제
본 발명의 한 실시양태에서, 게놈으로부터 1개 이상의 프로테아제의 발현을 감소시키거나, 이를 억제하거나, 이를 제거함으로써 숙주 세포가 변형된다. 일부 실시양태에서, 1개를 초과하는 프로테아제가 또한 변형될 수 있다. 관련된 실시양태에서, 프로테아제 보조인자 또는 프로테아제 단백질의 발현을 감소시킴으로써 세포가 변형된다. 또다른 실시양태에서, 천연 프로모터일 수 있는, 프로테아제 또는 관련 단백질의 프로모터의 억제에 의해, 숙주 세포가 변형된다. 확인된 유전자에 상동성인 단백질이 조정되도록 유전자가 변형될 수 있다.
MEROPS 데이타베이스에서, 펩티다제는 클랜(clan) 및 족으로 그룹화된다. 족은 밀접하게 관련된 기능적으로 유사한 펩티다제의 군이다. 족은 이들의 촉매작용 유형에 따라 그룹화된다: S, 세린; T, 트레오닌; C, 시스테인; A, 아스파르틱; M, 메탈로 및 U, 미지(未知). 세린 프로테아제의 20개를 초과하는 족 (S1-S27로 표시됨)이 확인되었고, 이들은 구조적 유사성 및 기타 기능적 근거를 기초로 6개의 클랜으로 그룹화된다 (SA, SB, SC, SE, SF 및 SG). 4개의 클랜 (SA, SB, SC 및 SE)에 대해 구조가 공지되어 있다. 트레오닌 펩티다제는 성숙형 효소의 N 말단의 트레오닌 친핵체를 특징으로 한다. 이러한 클랜에 대한 유형 예는 테르모플라즈마 애시도필룸(Thermoplasma acidophilum)의 원시 프로테아좀(proteasome) 베타 성분이다. 시스테인 펩티다제는 특징적인 분자 위상학을 갖고, 친핵체가 시스테인 잔기의 술프히드릴 기인 펩티다제이다. 이의 촉매작용 다이애드(dyad) 또는 트라이애드(triad)의 구조를 기초로, 시스테인 프로테아제는 클랜 (진화적으로 관련된 단백질들)으로 분류되고, 추가로 족으로 하위-분류된다.
클랜 CA는 파파인(papain) (C1), 칼파인(calpain) (C2), 스트렙토파인(streptopain) (C1O) 및 유비퀴틴-특이적 펩티다제 (C12, C19)의 족, 뿐만 아니라 바이러스성 시스테인 엔도펩티다제의 많은 족을 함유한다.
클랜 CD는 클로스트리파인(clostripain) (C11), 진지파인(gingipain) R (C25), 레구마인(legumain) (C13), 카스파제(caspase)-1 (C14) 및 세파린(separin) (C50)의 족을 함유한다. 이러한 효소들은 S1 서브사이트의 상호작용이 우세한 특이성을 갖는다.
클랜 CE는 아데노바이러스로부터의 아데나인 (C5), 진핵생물성 Ulp1 프로테아제 (C48) 및 박테리아성 YopJ 프로테아제 (C55)의 족을 함유한다.
클랜 CF는 피로글루타밀 펩티다제 I (C15)만을 함유한다.
클랜 PA는 아마도 세린 펩티다제로부터 진화되었고, 이러한 클랜 내의 효소의 대다수를 형성하는 피코르나인(picornain) (C3)을 함유한다.
클랜 PB 및 CH는 자가용해성 시스테인 펩티다제를 함유한다.
척추동물, 진균류 및 레트로바이러스 기원의 아스파르틱 엔도펩티다제가 특징화되었다. 아스파르테이트 펩티다제는 촉매작용 잔기가 확인된 모든 예에서 Asp 잔기가 활성화된 물 분자의 리간드이기 때문에 이렇게 명명되었지만, 하나 이상의 바이러스 효소는 이의 촉매작용 다이애드로서 Asp 및 Asn을 가질 것으로 여겨진다. 모든 또는 대부분의 아스파르테이트 펩티다제는 엔도펩티다제이다. 주로 3차 구조를 기초로, 이러한 효소들은 클랜 (진화적으로 관련된 단백질)으로 할당되었고, 족으로 추가로 하위-분류되었다.
메탈로프로테아제는 4가지 주요 유형의 프로테아제 중에서 가장 다양하고, 현재까지 30가지를 초과하는 족이 확인되었다. 이러한 효소에서는, 2가 양이온, 일반적으로 아연이 수 분자를 활성화시킨다. 금속 이온은 아미노산 리간드 (일반적으로 3개)에 의해 원위치에서 유지된다. 공지된 금속 리간드는 His, Glu, Asp 또는 Lys이고, 1개 이상의 기타 잔기가 촉매작용에 필요하고, 이는 친전자성 역할을 수행할 수 있다. 공지된 메탈로프로테아제 중에서, 약 절반은 HEXXH 모티프를 함유하고, 이는 결정학적 연구에서 금속-결합 부위의 일부를 형성하는 것으로 나타났다. HEXXH 모티프는 비교적 공통적이지만, 메탈로프로테아제에 대해 abXHEbbHbc [식중, 'a'는 가장 빈번하게 발린 또는 트레오닌이고, 써모라이신(thermolysin) 및 네프리라이신(neprilysin) 내의 S1' 서브사이트의 일부를 형성하고, 'b'는 전하를 띠지 않는 잔기이고, 'c'는 소수성 잔기이다]로 더욱 엄격하게 정의될 수 있다. 프롤린은 이러한 부위에서 결코 발견되지 않는데, 아마도 메탈로프로테아제에서 이러한 모티프에 의해 채택된 나선형 구조를 파괴할 것이기 때문이다.
활성 부위 도메인 및 활성 부위 잔기의 단백질 폴드가 보고되지 않았기 때문에, 클랜 U-와 관련된 펩티다제는 미지의 촉매작용 메카니즘을 갖는다
특정 프로테아제 (예를 들어 OmpT)는 봉입체의 표면에 흡착될 수 있고, 원하는 단백질을 이것이 리폴딩되는 동안 분해할 수 있다. 따라서, 특정한 확인된 단백질은 봉입체에 접착되는 프로테아제 또는 프로테아제 단백질일 수 있고, 이들은, 예를 들어, 부착이 감소되도록 변형될 수 있다.
프로테아제 또는 프로테아제 단백질은 또한 아미노펩티다제; 디펩티다제; 디펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜 펩티다제; 펩티딜-디펩티다제; 세린-유형 카르복시펩티다제; 메탈로카르복시펩티다제; 시스테인-유형 카르복시펩티다제; 오메가펩티다제; 세린 단백질분해효소; 시스테인 단백질분해효소; 아스파르틱 단백질분해효소; 메탈로 단백질분해효소; 또는 미지의 메카니즘의 단백질분해효소로 분류될 수 있다.
아미노펩티다제에는 세포질 아미노펩티다제 (류실 아미노펩티다제), 막 알라닐 아미노펩티다제, 시스티닐 아미노펩티다제, 트리펩티드 아미노펩티다제, 프롤릴 아미노펩티다제, 아르기닐 아미노펩티다제, 글루타밀 아미노펩티다제, x-프로 아미노펩티다제, 박테리아성 류실 아미노펩티다제, 호열성 아미노펩티다제, 클로스트리디알 아미노펩티다제, 세포질 알라닐 아미노펩티다제, 라이실 아미노펩티다제, x-trp 아미노펩티다제, 트립토파닐 아미노펩티다제, 메티오닐 아미노펩티다제, d-입체특이적 아미노펩티다제, 아미노펩티다제 ey가 포함된다. 디펩티다제에는 x-his 디펩티다제, x-arg 디펩티다제, x-메틸-his 디펩티다제, cys-gly 디펩티다제, glu-glu 디펩티다제, pro-x 디펩티다제, x-pro 디펩티다제, met-x 디펩티다제, 비-입체특이적 디펩티다제, 비-특이적 세포질 디펩티다제, 막 디펩티다제, 베타-ala-his 디펩티다제가 포함된다. 디펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜-펩티다제에는 디펩티딜-펩티다제 i, 디펩티딜-펩티다제 ii, 디펩티딜 펩티다제 iii, 디펩티딜-펩티다제 iv, 디펩티딜-디펩티다제, 트리펩티딜-펩티다제 I, 트리펩티딜-펩티다제 II가 포함된다. 펩티딜-디펩티다제에는 펩티딜-디펩티다제 a 및 펩티딜-디펩티다제 b가 포함된다. 세린-유형 카르복시펩티다제에는 라이소좀 pro-x 카르복시펩티다제, 세린-유형 D-ala-D-ala 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 C, 카르복시펩티다제 D가 포함된다. 메탈로카르복시펩티다제에는 카르복시펩티다제 a, 카르복시펩티다제 B, 라이신(아르기닌) 카르복시펩티다제, gly-X 카르복시펩티다제, 알라닌 카르복시펩티다제, 뮤라모일펜타펩티드 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 h, 글루타메이트 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 M, 뮤라모일테트라펩티드 카르복시펩티다제, 아연 d-ala-d-ala 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 A2, 막 pro-x 카르복시펩티다제, 튜불리닐-tyr 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 t가 포함된다. 오메가펩티다제에는 아실아미노아실-펩티다제, 펩티딜-글리신아미다제, 피로글루타밀-펩티다제 I, 베타-아스파르틸-펩티다제, 피로글루타밀-펩티다제 II, n-포르밀메티오닐-펩티다제, 프테로일폴리-[감마]-글루타메이트 카르복시펩티다제, 감마-glu-X 카르복시펩티다제, 아실뮤라모일-ala 펩티다제가 포함된다. 세린 단백질분해효소에는 키모트립신, 키모트립신 c, 메트리딘(metridin), 트립신, 트롬빈, 응고 인자 Xa, 플라스민, 엔테로펩티다제, 아크로신, 알파-용해성 프로테아제, 글루타밀, 엔도펩티다제, 카텝신(cathepsin) G, 응고 인자 viia, 응고 인자 ixa, 쿠쿠미시(cucumisi), 프롤릴 올리고펩티다제, 응고 인자 xia, 브라치우린(brachyurin), 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 췌장 엘라스타제(elastase), 백혈구 엘라스타제, 응고 인자 xiia, 치마제(chymase), 보체 성분 clr55, 보체 성분 cls55, 전통적인 보체 경로 c3/c5 전환효소, 보체 인자 I, 보체 인자 D, 별법적인 보체 경로 c3/c5 전환효소, 세레비신(cerevisin), 하이포데르민(hypodermin) C, 라이실 엔도펩티다제, 엔도펩티다제 Ia, 감마-레니(gamma-reni), 베놈빈(venombin) ab, 류실 엔도펩티다제, 트립타제(tryptase), 스쿠텔라린(scutelarin), 켁신(kexin), 서브틸리신, 오리진(oryzin), 엔도펩티다제 k, 테르모마이콜린(thermomycolin), 테르미타제(thermitase), 엔도펩티다제 SO, T-플라스미노겐 활성화제, 단백질 C, 췌장 엔도펩티다제 E, 췌장 엘라스타제 ii, IGA-특이적 세린 엔도펩티다제, U-플라스미노겐, 활성화제, 베놈빈 A, 푸린(furin), 미엘로블리스틴(myeloblastin), 세메노겔라제(semenogelase), 그란자임(granzyme) A 또는 세포독성 T-림프구 단백질분해효소 1, 그란자임 B 또는 세포독성 T-림프구 단백질분해효소 2, 스트렙토그리신(streptogrisin) A, 스트렙토그리신 B, 글루타밀 엔도펩티다제 II, 올리고펩티다제 B, 리물러스(limulus) 응고 인자 c, 리물러스 응고 인자, 리물러스 응고 효소, 옴프틴(omptin), 리프레서 lexa, 박테리아성 리더 펩티다제 I, 토가비린(togavirin), 플라비린(flavirin)이 포함된다. 시스테인 단백질분해효소에는 카텝신 B, 파파인, 피신(ficin), 키모파파인(chymopapain), 아스클레파인(asclepain), 클로스트리파인, 스트렙토파인, 아크티니드(actinide), 카텝신 1, 카텝신 H, 칼파인, 카텝신 t, 글리실, 엔도펩티다제, 암 응고전구체(procoagulant), 카텝신 S, 피코르나인 3C, 피코르나인 2A, 카리카인(caricain), 아나나인(ananain), 줄기 브로멜라인(bromelain), 과일 브로멜라인, 레구마인, 히스토라이사인(histolysain), 인터류킨 1-베타 전환 효소가 포함된다. 아스파르트 단백질분해효소에는 펩신 A, 펩신 B, 개스트리신(gastricsin), 카이모신(chymosin), 카텝신 D, 네오펜테신(neopenthesin), 레닌, 레트로펩신, 프로-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin) 전환 효소, 아스페르길로펩신(aspergillopepsin) I, 아스페르길로펩신 II, 페니실로펩신(penicillopepsin), 리조푸스펩신(rhizopuspepsin), 엔도티아펩신(endothiapepsin), 무코로펩신(mucoropepsin), 카디다펩신(candidapepsin), 사르카로펩신(saccharopepsin), 로도토룰라펩신(rhodotorulapepsin), 파이사로펩신(physaropepsin), 아크로실린드로펩신(acrocylindropepsin), 폴리포로펩신(polyporopepsin), 파이크노포로펩신(pycnoporopepsin), 사이탈리도펩신(scytalidopepsin) a, 사이탈리도펩신 b, 잔토모나펩신(xanthomonapepsin), 카텝신 e, 바리에르펩신(barrierpepsin), 박테리아성 리더 펩티다제 I, 슈도모나펩신, 플라스멥신(plasmepsin)이 포함된다. 메탈로 단백질분해효소에는 아트로라이신(atrolysin) a, 미생물 콜라게나제, 류코라이신(leucolysin), 간질 콜라게나제, 네프릴라이신(neprilysin), 엔벨라이신(envelysin), iga-특이적 메탈로엔도펩티다제, 프로콜라겐(procollagen) N-엔도펩티다제, 티멧(thimet) 올리고펩티다제, 뉴로라이신(neurolysin), 스트로멜라이신(stromelysin) 1, 메프린(meprin) A, 프로콜라겐 C-엔도펩티다제, 펩티딜-lys 메탈로엔도펩티다제, 아스타신(astacin), 스트로멜라신(stromelysin) 2, 마트릴라이신(matrilysin) 젤라틴분해효소, 애로모노라이신(aeromonolysin), 슈도라이신(pseudolysin), 써모라이신, 바실로라이신(bacillolysin), 아우레오라이신(aureolysin), 코코라이신(coccolysin), 마이코라이신(mycolysin), 베타-용해성 메탈로엔도펩티다제, 펩티딜-asp 메탈로엔도펩티다제, 호중구 콜라겐분해효소, 젤라틴분해효소 B, 레이쉬마노라이신(leishmanolysin), 사카로라이신(saccharolysin), 오토라이신(autolysin), 듀테로라이신(deuterolysin), 세라라이신(serralysin), 아트로라이신(atrolysin) B, 아트로라이신 C, 아트록사제(atroxase), 아트로라이신 E, 아트로라이신 F, 아다마라이신(adamalysin), 호릴라이신(horrilysin), 루베르라이신(ruberlysin), 보트로파신(bothropasin), 보트로라이신(bothrolysin), 오피오라이신(ophiolysin), 트리메레라이신(trimerelysin) I, 트리메레라이신 II, 뮤크로라이신(mucrolysin), 피트릴라이신(pitrilysin), 인슐라이신(insulysin), O-시알로당단백질 엔도펩티다제, 루셀라이신(russellysin), 미토콘트리아, 중간체, 펩티다제, 닥틸라이신(dactylysin), 나르딜라이신(nardilysin), 마그노라이신(magnolysin), 메프린 B, 미토콘드리아 프로세싱 펩티다제, 대식세포 엘라스타제, 코리오라이신(choriolysin), 톡실라이신(toxilysin)이 포함된다. 미지의 메카니즘의 단백질분해효소로는 써몹신(thermopsin) 및 다촉매작용성 엔도펩티다제 복합체가 포함된다.
슈도모나스 플루오레센스의 특정 프로테아제가 표 A에 열거된다.
클래스 족 RXF 담당 기능 유전자 생리학
MEROPS 상동체
아스파르틱 펩티다제
A8 (신호 펩티다제 II 족)
RXF05383 지질단백질 신호
펩티다제
(ec 3.4.23.36)		 수많은 박테리아성의 분비된
지질단백질의 프로세싱
A24 (유형 IV 프레필린 펩티다제 족)
RXF05379 유형 IV 프레필린
펩티다제 pild
(ec 3.4.99.-)		 이러한 막-결합 펩티다제는 많은 박테리아 종으로부터의 분비 동안 유형 4 프레필린으로부터 특수화된 리더 펩티드를 절단한다. 일단 분비되면, 프로세싱된 단백질이 유형 4 섬모 형성, 독소 및 기타 효소 분비, 유전자 전달, 및 바이오필름 형성이 포함되는 기능에 필요하다.
시스테인 펩티다제
C15 (피로글루타밀 펩티다제 I 족)
RXF02161 피롤리돈-카르복실레이트 펩티다제
(ec 3.4.19.3)		 단백질 대사에서 펩티드로부터
피로글루타밀 기의 제거
C40
RXF01968 침입-관련 단백질,
P60
RXF04920 침입-관련 단백질,
P60
RXF04923 포스파타제-관련
단백질 papq
C56 (PfpI 엔도펩티다제 족)
RXF01816 프로테아제 I
(ec 3.4.-.-)
메탈로펩티다제
M1
RXF08773 막 알라닌
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.2)
M3
RXF00561 올리고펩티다제 A
(ec 3.4.24.70)		 prlC 지질단백질 신호 펩티드 및 기타 세포내 올리고펩티드의 분해. 박테리오파지 P22 gp7 전구체의 성숙에서의 역할
RXF04631 Zn-의존성
올리고펩티다제
M4 (써모라이신 족)
RXF05113 세포외
메탈로프로테아제
전구체
(ec 3.4.24.-)
M41 (FtsH 엔도펩티다제 족)
RXF05400 세포 분열 단백질 ftsH (ec 3.4.24.-) 효모에서, 조절 분자 및 막 단백질의 단백질용해성 품질 제어에서의 역할이 제안됨.
M10
RXF04304 세라라이신
(ec 3.4.24.40)
RXF04500 세라라이신
(ec 3.4.24.40)
RXF01590 세라라이신
(ec 3.4.24.40)
RXF04495 세라라이신
(ec 3.4.24.40)
RXF02796 세라라이신
(ec 3.4.24.40)
M14 (카르복시펩티다제 A 족)
RXF09091 아연-카르복시펩티다제 전구체
(ec 3.4.17.-)
M16 (피트릴라이신 족)
RXF03441 보조효소 pqq
합성 단백질 F
(ec 3.4.99.-)
RXF01918 아연 프로테아제
(ec 3.4.99.-)
RXF01919 아연 프로테아제
(ec 3.4.99.-)
RXF03699 프로세싱 펩티다제
(ec 3.4.24.64)
M17 (류실 아미노펩티다제 족)
RXF00285 세포질
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.1)		 박테리아 영양에 기여
M18
RXF07879 아스파르틸
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.21)
M20
RXF00811 숙시닐-
디아미노피멜레이트
데숙시닐라제
(ec 3.5.1.18)		 dapE
RXF04052 Xaa-His 디펩티다제
(ec 3.4.14.3)
RXF01822 카르복시펩티다제 G2 전구체
(ec 3.4.17.11)
RXF04892 N-아실-L-아미노산
아미도히드롤라제
(ec 3.5.1.14)
M28 (아미노펩티다제 Y 족)
RXF03488 알칼리성 포스파타제 동종효소 전환 단백질 전구체
(ec 3.4.11.-)
M42 (글루타밀 아미노펩티다제 족)
RXF05615 디블로킹
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.-)
M22
RXF05817 O-시알로당단백질
엔도펩티다제
(ec 3.4.24.57)
RXF03065 당단백질분해효소 단백질 족
M23
RXF01291 세포벽
엔도펩티다제,
족 M23/M37
RXF03916 메탈로엔도펩티다제에 관련된
막 단백질
RXF09147 세포벽
엔도펩티다제,
족 M23/M37
M24
RXF04693 메티오닌
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.18)		 번역과 동시의 N-말단 메티오닌 제거에서의 역할이 예상됨
RXF03364 메티오닌
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.18)		 번역과 동시의 N-말단 메티오닌 제거에서의 역할이 예상됨
RXF02980 Xaa-Pro
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.9)		 박테리아에서, 세포내 단백질 턴오버에 수반됨
RXF06564 Xaa-Pro
아미노펩티다제
(ec 3.4.11.9)
M48 (Ste24 엔도펩티다제 족)
RXF05137 열 충격 단백질
HtpX
RXF05081 아연
메탈로프로테아제
(ec 3.4.24.-)
M50 (S2P 프로테아제 족)
RXF04692 막
메탈로프로테아제
세린 펩티다제
S1 (키모트립신 족)
RXF01250 프로테아제 do
(ec 3.4.21.-)
RXF07210 프로테아제 do
(ec 3.4.21.-)
S8 (서브틸리신 족)
RXF06755 세린 프로테아제
(ec 3.4.21.-)
RXF08517 세린 프로테아제
(ec 3.4.21.-)
RXF08627 세포외 세린
프로테아제
(ec 3.4.21.-)
RXF06281 세포외 세린
프로테아제 전구체
(ec 3.4.21.-)
RXF08978 세포외 세린
프로테아제
(ec 3.4.21.-)
RXF06451 세린 프로테아제
(ec 3.4.21.-)
S9 (프롤릴 올리고펩티다제 족)
RXF02003 프로테아제 ii
(ec 3.4.21.83)
RXF00458 가수분해효소
S11 (D-Ala-D-Ala 카르복시펩티다제
A 족)
RXF04657 D-알라닐-D-알라닌-
엔도펩티다제
(ec 3.4.99.-)
RXF00670 D-알라닐-D-알라닌-
카르복시펩티다제
(ec 3.4.16.4)
S13 (D-Ala-D-Ala 펩티다제 C 족)
RXF00133 D-알라닐-메소-
디아미노피멜레이트
엔도펩티다제
(ec 3.4.-.-)		 박테리아 세포벽의 합성 및 리모델링에서 작용함
RXF04960 D-알라닐-메소-
디아미노피멜레이트
엔도펩티다제
(ec 3.4.-.-)
S14 (ClpP 엔도펩티다제 족)
RXF04567 atp-의존성 Clp
프로테아제 단백질용해성 서브유닛
(ec 3.4.21.92)		 clpP 열 충격에서 손상된 단백질의 제거에 기여하는 것으로 생각됨
RXF04663 atp-의존성 Clp
프로테아제 단백질용해성 서브유닛
(ec 3.4.21.92)		 clpP 열 충격에서 손상된 단백질의 제거에 기여하는 것으로 생각됨
S16 (이온 프로테아제 족)
RXF04653 atp-의존성
프로테아제 La
(ec 3.4.21.53)		 열 충격에서 손상된 단백질의 제거에 기여하는 것으로 생각됨
RXF08653 atp-의존성
프로테아제 La
(ec 3.4.21.53)
RXF05943 atp-의존성
프로테아제 La
(ec 3.4.21.53)
S24 (LexA 족)
RXF00449 LexA 리프레서
(ec 3.4.21.88)
RXF03397 LexA 리프레서
(ec 3.4.21.88)
S26 (신호 펩티다제 I 족)
RXF01181 신호 펩티다제 I
(ec 3.4.21.89)		 분비된 단백질로부터 신호 펩티드를 절단함
S33
RXF05236 프롤린
이미노펩티다제
(ec 3.4.11.5)		 pip3
RXF04802 프롤린
이미노펩티다제
(ec 3.4.11.5)		 pip1
RXF04808 프롤린
이미노펩티다제
(ec 3.4.11.5)		 pip2
S41 (C-말단 프로세싱 펩티다제 족)
RXF06586 꼬리-특이적
프로테아제
(ec 3.4.21.-)
RXF01037 꼬리-특이적
프로테아제
(ec 3.4.21.-)
S45
RXF07170 페니실린
아크릴라제
(ec 3.5.1.11)		 pacB2
RXF06399 페니실린
아크릴라제 ii
(ec 3.5.1.11)		 pacB1
S49 (프로테아제 IV 족)
RXF06993 가능한 프로테아제 sohb
(ec 3.4.-.-)
RXF01418 프로테아제 iv
(ec 3.4.-.-)
S58 (DmpA 아미노펩티다제 족)
RXF06308 D-아미노펩티다제
(ec 3.4.11.19)
트레오닌 펩티다제
T1 (프로테아좀 족)
RXF01961 atp-의존성
프로테아제 hslV
(ec 3.4.25.-)		 hslV 열 충격에서 손상된 단백질의 제거에 기여하는 것으로 생각됨
T3 (감마-글루타밀트랜스퍼라제 족)
RXF02342 감마-글루타밀
트랜스펩티다제
(ec 2.3.2.2)		 ggt1
RXF04424 감마-글루타밀
트랜스펩티다제
(ec 2.3.2.2)		 ggt2
미분류된 펩티다제
U32
RXF00428 프로테아제
(ec 3.4.-.-)
RXF02151 프로테아제
(ec 3.4.-.-)
U61
RXF04715 뮤라모일테트라펩티드 카르복시펩티다제
(ec 3.4.17.13)
U62
RXF04971 PmbA 단백질 pmbA PmbA 유전자 ({대장균(E.coli)})의 생성물은, N-말단의 아미노산 26개의 리더 펩티드를 제거하면서, 항생제 펩티드 마이크로신 B17의 분비를 용이하게 한다 ([Madison et al., 1997])
RXF04968 TldD 단백질
비-MEROPS
프로테아제
RXF00325 리프레서 단백질 C2
RXF02689 미생물성
디펩티다제
(ec 3.4.13.19)
RXF02739 막 디펩티다제
(3.4.13.19)
RXF03329 가설 세포질 단백질
RXF02492 Xaa-Pro 디펩티다제
(ec 3.4.13.9)
RXF04047 caax 아미노 말단
프로테아제 족
RXF08136 프로테아제
(트랜스글루타미나제
-유사 단백질)
RXF09487 아연
메탈로프로테아제
(ec 3.4.24.-)
대장균으로부터의 특정 프로테아제가 표 B에 열거된다.
클래스 족 코드 펩티다제 또는 상동체 (서브타입) 유전자
아스파르틱
펩티다제		 A8 A08.001 신호 펩티다제 II lspA
A24A A24.001 유형 IV 프레필린 펩티다제 1
(EtpN 단백질 (플라스미드 p0157))		 etpN
A24.001 유형 IV 프레필린 펩티다제 1
(CofP 단백질)		 cofP
A24.001 유형 IV 프레필린 펩티다제 1
(HofD 단백질)		 hofD / hopD / hopO
A24.003 유형 IV 프레필린 펩티다제 2
(HopD 단백질)		 hopD / ECs4188
A24
미할당		 A24A 족 미할당 펩티다제
(ORF_F310 단백질)		 pppA / ORF _F310
A24
미할당		 A24A 족 미할당 펩티다제
(PilU 단백질 (플라스미드 R721))		 pilU
A24
미할당		 A24A 족 미할당 펩티다제
(BfpP 단백질 (플라스미드 pMAR2))		 bfpP / bfpG
A24
미할당		 A24A 족 미할당 펩티다제
(PilU 단백질)		 PILU
A26 A26.001 옴프틴 ompT / ECS1633 /B0565
A26.005 단백질분해효소 SopA sopA
시스테인
펩티다제		 C26 C26
미할당		 C26 족 미할당 펩티다제 YCJL / Z2490 / ECS1875
C40 C40.004 spr g.p. (에쉐리키아-유형)
(spr 단백질)		 spr
C40
미할당		 C40 족 미할당 펩티다제
(NlpC 단백질)		 nlpC / C2104 / Z2737 /
ECS2415
C40
미할당		 C40 족 미할당 펩티다제
(YafL 단백질)		 YafL
C40
미할당		 C40 족 미할당 펩티다제
(키티나제 3)
C40
미할당		 C40 족 미할당 펩티다제
(YdhO 단백질)		 ydhO
C39 C39.005 콜리신 V 프로세싱 펩티다제
(CvaB 단백질)		 cvaB
C39.005 콜리신 V 프로세싱 펩티다제
(MtfB 단백질)		 mtfB
C39
미할당		 C39 족 미할당 펩티다제
(마이크로신 H47 분비 단백질 MchF)		 mchF / MCLB
C56 C56
미할당		 C56 족 미할당 펩티다제
(YhbO 단백질)		 yhbo
C56
미할당		 C56 족 미할당 펩티다제
(c4536 단백질)		 c4536
메탈로
펩티다제		 M1 M01.005 알라닐 아미노펩티다제
(프로테오박테리아)		 pepN
M3A M03.004 올리고펩티다제 A prlC/opdA
M03.005 펩티딜-디펩티다제 Dcp dcp/Z2160/ECS2147
M03.005 펩티딜-디펩티다제 Dcp dcp
M41 M41.001 FtsH 엔도펩티다제 hflB/ftsH/ECS4057
M66 M66.001 StcE 프로테아제 stcE
M15D M15
미할당		 M15D 아족 미할당 펩티다제
(VanX 단백질)		 ddpX/vanX/B1488/
Z2222/ECS2092
M16A M16.001 피트릴라이신 ptr/ECs3678
M16B M16
미할당		 M16 아족 미할당 펩티다제
(PqqL 단백질)		 pqqL/yddC
M17 M17.003 아미노펩티다제 A (박테리아) pepA/xerB
M17.004 PepB 아미노펩티다제 pepB/Z3790/ECS3389
M24A M24.001 메티오닐 아미노펩티다제 1 map
M24B M24.003 X-Pro 디펩티다제 (박테리아) pepQ/ECs4775
M24.004 아미노펩티다제 P (박테리아) pepP
M24
미할당		 M24B 아족 미할당 펩티다제
(YqhT 단백질)		 yqhT/ypdF/B2385/
c2924
M20A M20.010 DapE 펩티다제 (숙시닐-
디아미노피멜레이트 데숙시닐라제)		 dapE/msgB/C2999
M20
미할당		 M20A 아족 미할당 펩티다제
(YgeY 단백질)		 ygey
M20B M20.003 펩티다제 T pepT/Z1832/ECS1572
M20C M20.007 X-His 디펩티다제 pepD/pepH/ECs0264
M20D M20
미할당		 M20D 족 미할당 펩티다제
(YdaJ 단백질)		 ydaJ/ECs1922
M28A M28
미할당		 M28A 아족 미할당 펩티다제
(YfbL 단백질)		 yfbL
M28C M28.005 IAP 아미노펩티다제 iap
M42 M42
미할당		 M42 족 미할당 펩티다제
(YjHO 단백질)		 yjhO
M42
미할당		 M42 족 미할당 펩티다제
(FrvX 단백질)		 frvX
M42
미할당		 M42 족 미할당 펩티다제
(FrvX 단백질)		 frvX/b2384/ypdE
M38 M38.001 베타-아스파르틸 디펩티다제 idaA
M22 M22.001 O-시알로당단백질 엔도펩티다제 ygjD
M22.002 yeaZ 단백질 yeaZ/C2211/Z2850/
ECS2516
M23B M23.006 YibP 펩티다제 (YibP 단백질) yibP
M23
미할당		 M23B 아족 미할당 펩티다제
(YebA 단백질)		 yebA
M48B M48.002 HtpX 엔도펩티다제 HtpX
M48
미할당		 M48B 아족 미할당 펩티다제 YGGG/C3521
M48
미할당		 M48B 아족 미할당 펩티다제 YFGC/C3011
M48
미할당		 M48B 아족 미할당 펩티다제
(YggG 단백질)		 YggG/Z4280/ECS3811
M48
미할당		 M48B 아족 미할당 펩티다제
(YcaL 단백질)		 ycaL/C1047/Z1255/
ECS0992
M50A M50.004 YaeL 프로테아제 (YAEL 단백질) ecfE/YAEL/B0176/
Z0187/ECS0178/C0213
M52 M52.001 HybD 엔도펩티다제 (HybD 단백질) hybD/ECS3878
M52.002 HyaD 엔도펩티다제 (HyaD 단백질) hyaD
M52.003 HycI 엔도펩티다제 (HycI 단백질) hycI/C3277
세린
프로테아제		 S1B S01.260 B1598 엔도펩티다제 b1598
S1C S01.273 프로테아제 Do htrA/degP
S01.274 DegQ hhoA/degQ/ECS4107
/Z4593
S01.275 DegS hhoB/degS
S6 S06.002 EspP g.p. (대장균) espP/pssA
S06.003 Tsh 펩티다제 (대장균) (Tsh 단백질) tsh/hbp
S06.003 Tsh 펩티다제 (대장균) c0393
S06.004 Pet 엔도펩티다제 sat
S06.004 Pet 엔도펩티다제
S06.005 Pic 엔도펩티다제
(시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri))		 she/pic
S06
미할당		 S6 족 미할당 펩티다제
(eatA 단백질)		 eatA
S06
미할당		 S6 족 미할당 펩티다제
(c0350 단백질)		 c0350
S06
미할당		 S6 족 미할당 펩티다제
(EspC 단백질)		 espC
S06
미할당		 S6 족 미할당 펩티다제
(epeA 단백질)		 epeA
S06
미할당		 S6 족 미할당 펩티다제
S8A S8
미할당		 S8A 아족 미할당 펩티다제
S9A S09.010 올리고펩티다제 B ptrB
S09.010 올리고펩티다제 B ptrB/C2255
S9X S9
미할당		 S9 족 미할당 펩티다제 YFHR/C3060/b2534
/Z3802
S11 S11.002 뮤레인-DD-엔도펩티다제 pbpG
S11.003 페니실린-결합 단백질 6 dacC/Z1066/ECS0919
S11.003 페니실린-결합 단백질 6
(페니실린-결합 단백질 pbp-6B)		 dacD/phsE/ECs2812
S11.003 페니실린-결합 단백질 6 dacA
S12 S12
미할당		 S12 족 미할당 펩티다제
(c2452 단백질)		 c2452
S12
미할당		 S12 족 미할당 펩티다제
(YaiH 단백질)		 yaiH/C0480
S13 S13.001 D-Ala-D-Ala 펩티다제 C dacB/ECs4061
S14 S14.001 엔도펩티다제 Clp (유형 1) clpP/lopP/ECS0491
S14
미할당		 S14 족 미할당 펩티다제
(ECs0829 단백질)		 Z0967/ECS0829
S14
미할당		 S14 족 미할당 펩티다제
(ECs2960 단백질)		 H0022/Z2112/ECS2960
/L34
S16 S16.001 lon 프로테아제 lon/deg/ECs0493
S16
미할당		 S16 족 미할당 펩티다제
(ECS1039 단백질)		 lonB/Z1305/ECS1039
S16
미할당		 S16 족 미할당 펩티다제
(c1091 단백질)		 c1091
S24 S24.001 리프레서 LexA (LexA 단백질) lexA/exrA
S24.003 UmuD 단백질
S24.003 UmuD 단백질 umuD/C1631
S26 S26A S26.001 신호 펩티다제 I
S26.014 traF 플라스미드-전달 단백질
(TraF 단백질)		 traF
S33 S33
미할당		 S33 족 미할당 펩티다제
(BioH 단백질)		 bioH/C4189/Z4767/
ECS4255
S41A S41.001 C-말단 프로세싱 프로테아제-1 prc/tsp/ECS2540/
Z2877/C2239
S45 S45.001 페니실린 G 아크릴라제 전구체 pac
S49 S49.001 프로테아제 IV sppA/ECs2472/C2170
S49.002 sohB 엔도펩티다제 sohB/ECS1844/Z2538
/C1737
S51 S51.001 디펩티다제 E pepE
S54 S54
미할당		 S54 족 미할당 펩티다제
(c0741 단백질)		 c0741
S54
미할당		 S54 족 미할당 펩티다제
(글리세로포스페이트 탈수소효소)		 glpG/C4201/Z4784
/ECS4267
트레오닌
펩티다제		 T1B T01.006 HslUV 펩티다제의 HslV 성분 hslV
T2 T02.002 아스파라기나제 ybiK/Z1051m/C0913
T3 T03.001 감마-글루타밀트랜스페라제 1 (박테리아) ggt/C4236
S41A S41.001 C-말단 프로세싱 프로테아제-1 prc/tsp/ECS2540/
Z2877/C2239
미분류
펩티다제		 U6 U06.001 뮤레인 엔도펩티다제 mepA/ECs3212/C2874
U32 U32 미할당 U32 족
미할당 펩티다제
(YdcP 단백질)
U32
미할당		 U32 족 미할당 펩티다제
(YegQ 단백질)		 yegQ/C2611
U32
미할당		 U32 족 미할당 펩티다제
(YhbU 단백질)		 YHBU/C3911/Z4519
/ECS4039
U35 U35 미할당 U35 족
미할당 펩티다제
U35
미할당		 U35 족 미할당 펩티다제
(ECs4973 단백질)		 ECs4973
U49 U49.001 Lit 프로테아제
(대장균)
U61 U61.001 뮤라모일-
테트라펩티드
카르복시펩티다제
U61
미할당		 U61 족 미할당 펩티다제
(MccF 단백질)		 mccF
U62 U62.001 마이크로신-프로세싱
펩티다제 1
U62.002 마이크로신-프로세싱 펩티다제 2 tldD/ECs4117
M9G.035 엔도펩티다제 ECP 32 (대장균)
사카로마이세스 세레비지애 기원의 특정 프로테아제가 표 C에 열거된다.
클래스 족 코드 펩티다제 또는 상동체 (서브타입) 유전자
아스파르틱
펩티다제		 A1 A01.015 바리에르펩신 bar1
A01.018 사카로펩신(saccharopepsin) pep4/pho9
A01.030 얍신(yapsin) 1 yap3
A01.031 얍신 2 mkc7
A01.035 얍신 3 YPS3
A01.UPW A1 족 미할당 펩티다제 YPS7/D9476.8/
YDR349C
A01.UPW A1 족 미할당 펩티다제
(YIR039C 단백질)		 YIR039C
A2D A02.022 Ty3 트랜스포존(transposon)
(사카로마이세스 세레비지애)
엔도펩티다제 (레트로트랜스포존 Ty3-1)		 POL3/TY3-2 orfB/
TY3B
A11B A11.003 Ty1 트랜스포존 (사카로마이세스
세레비지애) 엔도펩티다제 (트랜스포존
Ty1-17 단백질 B)		 TylB
A11.003 Ty1 트랜스포존 (사카로마이세스
세레비지애) 엔도펩티다제 (트랜스포존
Ty1 단백질 B)		 TylB
A11.003 Ty1 트랜스포존 (사카로마이세스
세레비지애) 엔도펩티다제 (트랜스포존
Ty1 단백질 B)		 TylB
A11X A11.UPW A11 족 미할당 펩티다제
(레트로트랜스포존 Ty4)
A22B A22.008 YKL100c 단백질
(사카로마이세스 세레비지애)		 YKL100c
시스테인
펩티다제		 C1B C01.085 블레오마이신 가수분해효소 (효모) GAL6/YCP1/LAP3
C2 C02.008 칼파인-7 YMR154C/Cpl1/Rim13
C12 C12.002 유비퀴티닐 가수분해효소 YUH1 yuh1
C13 C13.005 글리코실포스파티딜이노시톨:단백질
트랜스아미다제		 D9798.2
C19 C19.002 Ubp1 유비퀴틴 펩티다제 ubp1
C19.003 Ubp2 유비퀴틴 펩티다제 ubp2
C19.004 Ubp3 유비퀴틴 펩티다제 ubp3
C19.005 Doa4 유비퀴틴 펩티다제 DOA4
C19.006 Ubp5 유비퀴틴 펩티다제 ubp5
C19.079 UBP6 (사카로마이세스 세레비지애)
(YFR010W 단백질)		 yfr010w
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(YNL186W 단백질)		 YNL186W
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(UBP9)		 ubp9
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(YBL067C 단백질)		 YBL067C
C19.UPW
 C19 족 미할당 펩티다제
(YBR058C 단백질)		 UBP12/YBR058C
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(유비퀴틴 카르복시-말단 가수분해효소
16)		 UBP16/YPL072W/
LPF12W
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(YMR304W 단백질)		 YMR304W/ym9952.06
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(YMR223W 단백질)		 YMR223W/ym9959.05
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(UBP7)		 ubp7
C19.UPW C19 족 미할당 펩티다제
(UBP13)		 ubp13
C44 C44.971 글루코사민-프룩토스-6-포스페이트
아미노트랜스페라제
C44.971 글루코사민-프룩토스-6-포스페이트
아미노트랜스페라제 (글루코사민-프룩토스-6-포스페이트 아미노트랜스페라제)		 gfa1
C48 C48.001 Ulp1 엔도펩티다제 YPL020c
C48.005 Ulp2 엔도펩티다제 (Smt4p 단백질) SMT4
C50 C50.001 세퍼라제(separase) ESP1/YGR098C
C54 C54.001 ATG4 펩티다제 (사카로마이세스
세레비지애)		 Apg4/Aut2
C56 C56.004 YDR533C g.p. (사카로마이세스
세레비지애)		 YDR533C/D9719.36
C56.UPW C56 족 미할당 펩티다제
(YPL280W 단백질)		 YPL280W
C56.UPW C56 족 미할당 펩티다제
(YOR391C 단백질)		 YOR391C
I34 I34.001 사카로펩신 억제제 PAI3/YMR174C/YM8010
메탈로
펩티다제		 M1 M01.006 Ape2 아미노펩티다제 lap1/ape2
M01.007 Aap1' 아미노펩티다제 AAP1
M01.007 Aap1'아미노펩티다제
M01.017 Yin7 g.p. (사카로마이세스 세레비지애) yil137C
M01.UPW M1 족 미할당 펩티다제
(ynl045w 단백질)		 ynl045w
M3A M03.003 사카로라이신 prd1
M03.006 미토콘드리아 중간체 펩티다제 MIP1
M16A M16.007 Axl1 펩티다제 axl1
M16.008 Ste23 펩티다제 ste23
M16.UPA M16A 아족 미할당 펩티다제
(orf1 단백질)		 orf1
M16B M16.003 미토콘드리아 프로세싱 펩티다제
베타-서브유닛 (베타)		 mas1/mif1
M16C M16.UPC M16C 아족 미할당 펩티다제
(YDR430C 단백질)		 YDR430C
M16.UPC M16C 아족 미할당 펩티다제
(YOL098C 단백질)		 YOL098C
M16X M16.971 미토콘드리아 프로세싱 펩티다제
비-펩티다제 알파 서브유닛 (알파)		 mas2/mif2

M16.974 UCR2_HUMAN (유비퀴놀-사이토크롬 c
환원효소 코어 단백질 2)		 ucr2/cor2/qcr2
M18 M18.001 아미노펩티다제 I ape1/lap4
M18.UPW M18 족 미할당 펩티다제
(YHR113W 단백질)		 YHR113W
M20A M20.005 세포질 비특이적 디펩티다제 YFR044C
M20E M20.002 Gly-X 카르복시펩티다제 cps1/cps
M20.002 Gly-X 카르복시펩티다제 (유사유전자:
MEROPS에 의해 뉴클레오티드 서열로부터 추정됨		 AOE110, AOE264,
AOE130
M22 M22.003 메르네임(Mername)-AA017 펩티다제
(YKR038C 단백질)		 YKR038C
M22.UPW M22 족 미할당 펩티다제
(QRI7 단백질)		 QRI7
M24A M24.001 메티오닐 아미노펩티다제 1 map1
M24.002 메티오닐 아미노펩티다제 2 ybl091c
M24B M24.009 아미노펩티다제 P1 YLL029w
M24.026 아미노펩티다제 P 상동체
(YER078C 단백질)		 YER078C
M24.UPB M24B 아족 미할당 펩티다제
(YFR006W 단백질)		 yfr006w
M28A M28.001 아미노펩티다제 Y ape3
M28E M28.006 메르네임-AA063 펩티다제
(YDR415c 단백질)		 YDR415c
M28X M28.974 글루타미닐 사이클라제(cyclase) YFR018C
M28.UPW M28 족 미할당 펩티다제
(YBR074W 단백질)		 YBR074W
M41 M41.002 Afg3 g.p. (사카로마이세스 세레비지애)
(AGF3 단백질)		 agf3/yta10
M41.003 m-AAA 프로테아제 (RCA1 단백질) rca1/yta12
M41.004 i-AAA 프로테아제 yme1/yta11/osd1
M48A M48.001 Ste24 엔도펩티다제 STE24
M48B M48.018 Oma1 엔도펩티다제 (사카로마이세스
세레비지애) (YKR087C 단백질)		 YKR087C/YKR407
M49 M49.001 디펩티딜-펩티다제 III YOL057W
M49.UPW M49 족 미할당 펩티다제
M67A M67.001 Poh1 펩티다제 RPN11/MPR1/
YFR004W
M67.002 Jab1/MPN 도메인 메탈로효소 YDL216c/D0888
M67.973 26S 프로테아좀 비-ATP분해효소
조절 서브유닛 7		 RPN8/YOR261C
세린
펩티다제		 S1C S01.434 Nma111 엔도펩티다제
(사카로마이세스 세레비지애)
(YNL 123W 단백질)		 ynl123w
S8A S08.052 세레비신 prb1
S08.UPA S8A 아족 미할당 펩티다제
(YSP3 단백질)		 YSP3
S08.UPA S8A 아족 미할당 펩티다제
(YCR54C 단백질)		 YCR54C
S8B S08.070 켁신 kex2
S9B S09.005 디펩티딜 아미노펩티다제 A ste13/yci1
S09.006 디펩티딜 아미노펩티다제 B (진균) dap2
S9X S09.UPW S9 족 미할당 펩티다제
(Ynl320w 단백질)		 YNL320W
S10 S10.001 카르복시펩티다제 Y prc1
S10.007 kex 카르복시펩티다제 kex1
S10.UPW S10 족 미할당 펩티다제
(YBR139W 단백질)		 ybr139W
S16 S16.002 PIM1 엔도펩티다제 lon / pim1
S26A S26.002 미토콘드리아 내부 막 프로테아제 1 (1) imp1
S26.012 미토콘드리아 내부 막 프로테아제 2 (2) imp2
S26B S26.010 시그날라제(signalase) (진핵생물)
21kDa 성분		 sec1
S33.UPW S33 족 미할당 펩티다제 ECM18 / YDR125C
S33.UPW S33 족 미할당 펩티다제 ECM18 / YDR125C
S54 S54.007 Pcp1 단백질 (사카로마이세스
세레비지애) (YGR101W 단백질)		 YGR101W
S59 S59.001 뉴클레오포린(nucleoporin) 145 Nup145
트레오닌
펩티다제		 T1A T01.010 프로테오좀 촉매작용 서브유닛 1 pre3
T01.011 프로테오좀 촉매작용 서브유닛 2 pup1
T01.012 프로테오좀 촉매작용 서브유닛 3 pre2 / prg1
T01.983 프로테오좀 서브유닛 베타 3 pup3
T01.984 프로테오좀 서브유닛 베타 2 pre1
T01.986 프로테오좀 서브유닛 베타 1 pre7 / prs3
T01.987 프로테오좀 서브유닛 베타 4 pre4
T1X T01.971 프로테오좀 서브유닛 알파 6 prs2 / prc2
T01.972 프로테오좀 서브유닛 알파 2 pre8 / prs4
T01.973 프로테오좀 서브유닛 알파 4 pre9 / prs5
T01.974 프로테오좀 서브유닛 알파 7 pre6
T01.975 프로테오좀 서브유닛 알파 5 pup2
T01.976 프로테오좀 서브유닛 알파 1 pre5
T01.977 프로테오좀 서브유닛 알파 3 pre10 / prs1 / prc1
T3 T03.012 감마-글루타밀트랜스퍼라제
(사카로마이세스) (YLR299w 단백질)		 L8003 .4
T5 T05.001 오르니틴 아세틸트랜스페라제 전구체 arg7 / emc40 / YMR062C
미분류
펩티다제		 U48 U48.001 프레닐 프로테아제 2 rce1
폴딩 조정인자(modulators)
확인된 상향조절된 유전자 또는 유전자 생성물은 1개 이상의 폴딩 조정인자일 수 있다. 폴딩 조정인자는, 예를 들어, HSP70 단백질, HSP110/SSE 단백질, HSP40 (DNAJ-관련) 단백질, GRPE-유사 단백질, HSP90 단백질, CPN60 및 CPNlO 단백질, 세포질 샤페로닌(chaperonin), HSPlOO 단백질, 소형 HSP, 칼넥신(Calnexin) 및 칼레티쿨린(calreticulin), PDI 및 티오레독신(thioredoxin)-관련 단백질, 펩티딜-프롤릴 이성화효소, 사이클로필린(Cyclophilin) PPI효소, FK-506 결합 단백질, 파르불린(Parvulin) PPI효소, 개별적인 샤페로닌, 단백질 특이적 샤페론, 또는 분자내 샤페론일 수 있다. 폴딩 조정인자는 ["Guidebook to Molecular Chaperones and Protein-Folding Catalysts" (1997), ed. M. Gething, Melbourne University, Australia]에 일반적으로 기술되어 있다.
대장균의 세포질 내의 가장 잘 특징화된 분자성 샤페론은 ATP-의존성 DnaK-DnaJ-GrpE 및 GroEL-GroES 시스템이다. 시험관내 연구 및 상동성 고려사항을 기초로, 다수의 추가적인 세포질 단백질이 대장균에서 분자성 샤페론으로 기능하는 것으로 제안되었다. 여기에는 ClpB, HtpG 및 IbpA/B가 포함되고, 이들은, DnaK-DnaJ-GrpE 및 GroEL-GroES와 마찬가지로, 스트레스 레귤론(regulon)에 속하는 열-충격 단백질 (Hsp)이다. X-Pro 결합의 트랜스(trans) 입체형태가 신생 단백질 사슬에서 에너지적인 측면에서 선호된다; 그러나, 모든 프롤릴 펩티드 결합의 약 5％가 천연 단백질에서 시스(cis) 입체형태로 발견된다. X-Pro 결합의 트랜스에서 시스로의 이성화는 많은 폴리펩티드의 폴딩에서 속도 제한성이고, 생체 내에서 펩티딜 프롤릴 시스/트랜스 이성화효소 이성화효소 (PPI효소)에 의해 촉매된다. 현재까지 3가지 세포질 PPI효소인 SlyD, SlpA 및 촉발 인자 (TF: trigger factor)가 대장균에서 확인되었다. 5OS 리보솜 서브유닛과 회합된 48 kDa 단백질인 TF는 대장균에서 샤페론과 협력하여 새롭게 합성된 단백질의 적절한 폴딩을 보장하는 것으로 가정되었다. 5개 이상의 단백질 (각각 trxA, trxC, grxA, grxB 및 grxC 유전자의 생성물인, 티오레독신 1 및 2, 및 글루타레독신(glutaredoxin) 1, 2 및 3)이 세포질 효소에서 일시적으로 발생하는 디술피드 다리의 환원에 수반된다. 따라서, 확인된 유전자는 적절한 디술피드 결합이 형성되도록 하는 디술피드 결합 형성 단백질 또는 샤페론일 수 있다.
슈도모나스 플루오레센스에서의 특정 폴딩 조정인자가 표 D에 열거된다.
RXF 유전자 기능 족
GroES/EL
rxf02095 groES 샤페론 Hsp10
rxf06767::
rxf02090		 groEL 샤페론 Hsp60
RXF01748 ibpA 소형 열-충격 단백질 (sHSP) IbpA PA3126;
GroESL 폴딩에 대한 홀더(holder)로 작용함		 Hsp20
RXF03385 hscB 샤페론 단백질 hscB Hsp20
Hsp70 (DnaK/J)
rxf05399 dnaK 샤페론 Hsp70
RXF06954 dnaK 샤페론 Hsp70
RXF03376 hscA 샤페론 Hsp70
RXF03987 cbpA 곡선형 dna-결합 단백질, dnaJ 유사 활성 Hsp40
RXF05406 dnaJ 샤페론 단백질 dnaJ Hsp40
RXF03346 dnaJ 분자성 샤페론 (DnaJ 족) Hsp40
Hsp100 (Clp/Hsl)
RXF04587 clpA atp-의존성 clp 프로테아제 atp-결합
서브유닛 clpA		 Hsp100
RXF08347 clpB ClpB 단백질 Hsp100
RXF04654 clpX atp-의존성 clp 프로테아제 atp-결합
서브유닛 clpX		 Hsp100
RXF01957 hslU atp-의존성 hsl 프로테아제 atp-결합
서브유닛 hslU		 Hsp100
RXF01961 hslV atp-의존성 hsl 프로테아제 atp-결합
서브유닛 hslV		 Hsp100
Hsp33
RXF04254 yrfI 33kDa 샤페로닌 (열 충격 단백질 33 상동체)
(HSP 33)		 Hsp33
Hsp90
RXF05455 htpG 샤페론 단백질 htpG Hsp90
SecB
RXF02231 secB 분비 특이적 샤페론 SecB SecB
디술피드 결합 이성화효소
RXF07017 dsbA 디술피드 이성화효소 DSBA 산화환원효소
RXF08657 dsbA/
dsbC/
dsbG/
fernA 		디술피드 이성화효소 DSBA 산화환원효소
rxf01002 dsbA/
dsbC 		디술피드 이성화효소 DSBA 산화환원효소/
티오레독신
rxf03307 dsbC 디술피드 이성화효소 글루타레독신/
티오레독신
rxf04890 dsbG 디술피드 이성화효소 글루타레독신/
티오레독신
펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소
RXF03768 ppiA 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 A
(ec 5.2.1.8)		 PPI효소:
시클로필린 유형
RXF05345 ppiB 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 B PPI효소:
시클로필린 유형
RXF06034 fklB 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 FklB PPI효소: FKBP 유형
RXF06591 fklB/
fkbP 		fk506 결합 단백질 펩티딜-프롤릴
시스-트랜스 이성화효소 (EC 5.2.1.8)		 PPI효소: FKBP 유형
RXF05753 fklB;
fkbP 		펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소
(ec 5.2.1.8)		 PPI효소: FKBP 유형
RXF01833 slyD 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 SlyD PPI효소:FKBP 유형
RXF04655 tig 촉발 인자, PPI효소 (ec 5.2.1.8) PPI효소: FKBP 유형
RXF05385 yaad 가능한 FKBP-유형 16 kDa 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 (EC 5.2.1.8)
(PPI효소) (로타마제(Rotamase))		 PPI효소: FKBP 유형
RXF00271 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소
(ec 5.2.1.8)		 PPI효소: FKBP 유형
섬모 어셈블리 샤페론 (papD 유사)
RXF06068 cup 샤페론 단백질 cup 섬모 어셈블리 papD
RXF05719 ecpD 샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF03406 ecpD;
csuC 		샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF04296 ecpD;
cup 		샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF04553 ecpD;
cup 		샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF04554 ecpD;
cup 		샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF05310 ecpD;
cup 		샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF05304 ecpD;
cup 		샤페론 단백질 ecpD 섬모 어셈블리 papD
RXF05073 gltF 그람-음성 섬모 어셈블리 샤페론
원형질막주위공간 기능		 섬모 어셈블리 papD
대장균에서의 특정 폴딩 조정인자가 표 E에 열거된다.
Uniprot
접속 번호		 Uniprot ID 주석 족
GroES/EL
P05380 CH10_ECOLI 10 kDa 샤페로닌 Hsp10
P06139 CH60_ECOLI 60 kDa 샤페로닌 Hsp60
Hsp70 (DnaK/J)
P04475 DNAK_ECOLI 샤페론 단백질 dnaK Hsp70
P77319 HSCC_ECOLI 샤페론 단백질 hscC Hsp70
P36659 CBPA_ECOLI 곡선형 DNA-결합 단백질 cpbA Hsp40
P31680 DJLA_ECOLI DnaJ-유사 단백질 djlA, rscG Hsp40
P08622 DNAJ_ECOLI 샤페론 단백질 dnaJ Hsp40
P29131 FTSN_ECOLI 세포 분열 단백질 ftsN Hsp40
P09372 GRPE_ECOLI GrpE 단백질 GrpE
P31658 HCHA_ECOLI 샤페론 단백질 hcHA Hsp31
Hsp100 (Clp/Hsl)
P15716 CLPA_ECOLI ATP-의존성 Clp 프로테아제 ATP-결합
서브유닛 clpA		 Hsp100
P03815 CLPB_ECOLI ClpB 단백질 Hsp100
P33138 CLPX_ECOLI ATP-의존성 Clp 프로테아제 ATP-결합
서브유닛 clpX		 Hsp100
P32168 HSLU_ECOLI ATP-의존성 hsl 프로테아제 ATP-결합
서브유닛 hslU, clpY		 Hsp100
소형 열 충격 단백질
P29209 IBPA_ECOLI 16 kDa 열 충격 단백질 A Hsp16
P29210 IBPB_ECOLI 16 kDa 열 충격 단백질 B Hsp16
대형 그룹의 Not 부분
P36662 TORD_ECOLI 샤페론 단백질 torD TorD
P15040 SECB_ECOLI 단백질-외수송 단백질 secB SecB
P45803 HSLO_ECOLI 33 kDa 샤페로닌 Hsp33
P10413 HTPG_ECOLI 샤페론 단백질 htpG Hsp90
HscAB
P36541 HSCA_ECOLI 샤페론 단백질 hscA Hsp66
P36540 HSCB-ECOLI 동시-샤페론 단백질 hscB Hsp20
지질단백질 캐리어 단백질
P61316 LOLA-ECOLI 외부막 지질단백질 캐리어 단백질
전구체		 LolA
P61320 LOLB-ECOLI 외부막 지질단백질 lolB 전구체 LolB
디술피드 결합 이성화효소
P24991 DSBA_ECOLI 티올:디술피드 상호교환 단백질 dsbA
전구체
P30018 DSBB_ECOLI 디술피드 결합 형성 단백질 B 디술피드 결합
산화환원효소
P21892 DSBC_ECOLI 티올:디술피드 상호교관 단백질 dsbC
전구체
P36655 DSBD_ECOLI 티올:디술피드 상호교환 단백질 dsbD
전구체 (EC 1.8.1.8)
(단백질-디술피드 환원효소)
P33926 DSBE_ECOLI 티올:디술피드 상호교환 단백질 dsbE
(사이토크롬 c 생합성 단백질 ccmG)
P77202 DSBG_ECOLI 티올:디술피드 상호교환 단백질 dsbG
전구체		 디술피드 결합
산화환원효소
펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소
P22257 TIG_ECOLI 촉발 인자 PPI효소: FKBP 유형
P45523 FKBA_ECOLI FKBP-유형 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 fkpA 전구체 PPI효소: FKBP 유형
P39311 FKBB_ECOLI FKBP-유형 22 kDa 펩티딜-프롤릴
시스-트랜스 이성화효소		 PPI효소: FKBP 유형
P22563 FKBX_ECOLI FKBP-유형 16 kDa 펩티딜-프롤릴
시스-트랜스 이성화효소		 PPI효소: FKBP 유형
P30856 SLYD_ECOLI FKBP-유형 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 slyD PPI효소: FKBP 유형
P20752 PPIA_ECOLI 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 A 전구체 PPI효소:
시클로필린 유형
P23869 PPIB_ECOLI 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 B PPI효소:
시클로필린 유형
P39159 PPIC_ECOLI 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 C PPI효소: PPIC 유형
P77241 PPID_ECOLI 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 D PPI효소: PPIC 유형
P21202 SURA_ECOLI 생존 단백질 surA 전구체 PPI효소:
파르불린 유형
섬모 어셈블리 샤페론 (papD 유사)
P53516 AFAB_ECOLI 샤페론 단백질 afaB 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P33128 ECPD_ECOLI 샤페론 단백질 ecpD 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P31697 FIMC_ECOLI 샤페론 단백질 fimC 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P77249 SFMC_ECOLI 샤페론 단백질 sfmC 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P75749 YBGP_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 ybgP 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P40876 YCBF_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 ycbF 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P75856 YCBR_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 ycbR 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P33342 YEHC_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 yehC 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P77599 YFCS_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 yfcS 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P28722 YHCA_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 yhcA 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P77616 YQIH_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 yqiH 전구체 섬모 어셈블리 PapD
P42914 YRAI_ECOLI 가설 섬모상 샤페론 yraI 전구체 섬모 어셈블리 PapD
사카로마이세스 세레비지애의 특정 폴딩 조정인자가 표 F에 제시된다.
Uniprot
접속 번호		 Uniprot ID GO 공급원 주석 족
GroES/EL
P19882 HS60_YEAST GOA:interpro 열 충격 단백질 60,
미토콘드리아 전구체		 Hsp60
P38228 TC62_YEST GOA:interpro 미토콘드리아 샤페론 TCM62 Hsp60
P38910 CH10_YEAST GOA:interpro 10 kDa 열 충격 단백질,
미토콘드리아		 Hsp10
Hsp70 (DnaK/J)
P25491 MAS5_YEAST GOA:interpro 미토콘드리아 단백질 내수송
단백질 MAS5, Ydj1		 Hsp40
P10591 HS71_YEAST PMID:9789005 열 충격 단백질 SSA1 Hsp70
P10592 HS72_YEAST PMID:9448096 열 충격 단백질 SSA2 Hsp70
P11484 HS75_YEAST 열 충격 단백질 SSB1 Hsp70
P40150 HS76_YEAST 열 충격 단백질 SSB2 Hsp70
P09435 HS73_YEAST PMID:7867784 열 충격 단백질 SSA3 Hsp70
P22202 HS74_YEAST 열 충격 단백질 SSA4 Hsp70
P25294 SIS1_YEAST GOA:interpro SIS1 단백질 Hsp40
P32527 ZUO1_YEAST GO:0003754 쥬오틴(Zuotin) Hsp40
P35191 MDJ1_YEAST GOA:interpro MDJ1 단백질,
미토콘드리아 전구체		 Hsp40
P12398 HS77_YEAST PMID:8654364 열 충격 단백질 SSC1,
미토콘드리아 전구체		 Hsp70
P38523 GRPE_YEAST GOA:interpro GrpE 단백질 상동체,
미토콘드리아 전구체, MGE1		 GrpE
P14906 SC63_YEAST GOA:spkw 전위 단백질 SEC63 Hsp40
P16474 GR78_YEAST GRP 78, BIP, Kar2 Hsp70
P25303 SCJ1_YEAST GOA:interpro DnaJ-관련 단백질 SCJ1 Hsp40
P39101 CAJ1_YEAST GOA:interpro CAJ1 단백질 Hsp40
P48353 HLJ1_YEAST GOA:interpro HLJ1 단백질 Hsp40
P39102 XDJ1-YEAST GOA:interpro XDJ1 단백질 Hsp40
P52868 YGM8_YEAST GOA:interpro CEG1-SOH1 유전자간 영역 내의 가설 41.0 kDa 단백질 Hsp40
P53940 YNH7_YEAST GOA:interpro TPM1-MKS1 유전자간 영역 내의 가설 58.9 kDa 단백질 Hsp40
P38353 SSH1_YEAST Sec 61 단백질 상동체 Hsp70
P36016 LHS1_YEAST GOA:spkw 열 충격 단백질 70 상동체
LHS1, SSI1		 Hsp70
P38788 YHM4_YEAST PMID:11054575 열 충격 단백질 70 상동체
YHR064C		 Hsp70
Hsp110/Sse
P32589 HS78_YEAST PMID:10480867 열 충격 단백질 상동체 SSE1 SSE
P32590 HS79_YEAST 열 충격 단백질 상동체 SSE2 SSE
Hsp100 (Clp/Hsl)
P31539 H104_YEAST GOA:interpro 열 충격 단백질 104 Hsp100
P33416 HSP7_YEAST GOA:spkw 열 충격 단백질 78,
미토콘드리아 전구체		 Hsp100
P38323 MCX1_YEAST GOA:interpro 미토콘드리아 clpX-유사
샤페론 MCX1		 Hsp100
소형 열 충격 단백질
P15992 HS26_YEAST PMID:10581247 열 충격 단백질 26 소형 Hsp
프레폴딘(prefoldin)
P48363 PFD3_YEAST GOA:interpro 가능한 프레폴딘 서브유닛 3 프레폴딘
Q04493 PFD5_YEAST GOA:interpro 프레폴딘 서브유닛 5 프레폴딘
P43573 YFC3-YEAST GOA:interpro STE2-FRS2 유전자간 영역 내의 가설 91.4 kDa 단백질 프레폴딘
P46988 PFD1-YEAST GOA:spkw 프레폴딘 서브유닛 1 KE2
P40005 PFD2-YEAST GOA:spkw 프레폴딘 서브유닛 2 KE2
P53900 PFD4-YEAST GOA:spkw 프레폴딘 서브유닛 4 KE2
P52553 PFD6-YEAST GOA:spkw 프레폴딘 서브유닛 6 KE2
Hsp90
P02829 HS82_YEAST GOA:interpro 열 충격 단백질 HSP82 Hsp90
P15108 HS83_YEAST GOA:interpro 열 충격 동족 단백질 HSC82 Hsp90
P06101 CC37_YEAST GOA:spkw Hsp90 동시-샤페론 Cdc37 Cdc37
P33313 CNS1_YEAST GOA:spkw 시클로필린 7 억제인자 1 CNS1
P15705 STI1_YEAST PMID:8972212 열 충격 단백질 STI1
칼넥신
P27825 CALX_YEAST GOA:spkw 칼넥신 상동체 전구체 칼넥신
세포질 샤페로닌 T-복합체
P12612 TCPA_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
알파 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P39076 TCPB_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
베타 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P39078 TCPD_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
델타 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P40413 TCPE_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
엡실론 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P39077 TCPG_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
감마 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P42943 TCPH_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
에타 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P47079 TCPQ_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
쎄타 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
P39079 TCPZ_YEAST GOA:interpro T-복합체 단백질 1,
제타 서브유닛		 TCP-1, Hsp60
단백질 특이적
P48606 TBCA_YEAST GOA:spkw 튜불린(tubulin)-특이적
샤페론 A		 단백질 특이적
P53904 TBCB_YEAST GOA:spkw 튜불린-특이적 샤페론 B 단백질 특이적
P46670 CIN2_YEAST GOA:spkw 튜불린-폴딩 보조인자 C Cin2 단백질 특이적
P40987 CIN1_YEAST 튜불린-폴딩 보조인자 D Cin1 단백질 특이적
P39937 PAC2_YEAST GOA:spkw 튜불린-폴딩 보조인자 E PAC2 단백질 특이적
P21560 CBP3_YEAST GOA:spkw CBP3 단백질,
미토콘드리아 전구체		 단백질 특이적
Q12287 COXS_YEAST GOA:spkw 사이토크롬 c 산화효소 구리
샤페론		 단백질 특이적
P40202 LYS7_YEAST GOA:interpro 과산화물 디스뮤타제 1 구리
샤페론
Q02774 SHR3_YEAST PMID:10564255 분비 성분 단백질 SHR3 단백질 특이적
P38293 UMP1_YEAST GOA:spkw 프로테오좀 성숙 인자 UMP1 단백질 특이적
P38784 VM22_YEAST PMID:7673216 공포성(空胞性) ATP분해효소
어셈블리 단백질 VMA22		 단백질 특이적
P38072 SCO2_YEAST GOA:spkw SCO2 단백질,
미토콘드리아 전구체		 단백질 특이적
P53266 SHY1_YEAST PMID:11389896 SHY1 단백질 단백질 특이적
P40046 VTC1_YEAST GOA:spkw 공포성 트랜스포터 샤페론 1 단백질 특이적
P38958 PT00_YEAST PMID:11498004 PET100 단백질,
미토콘드리아 전구체		 단백질 특이적
디술피드 결합 이성화효소
P17967 PDI_YEAST PMID:11157982 단백질 디술피드 이성화효소
전구체		 디술피드 결합
산화환원효소
P32474 EUG1_YEAST PMID:11157982 단백질 디술피드 이성화효소
EUG1 전구체		 디술피드 결합
산화환원효소
Q12404 MPD1_YEAST PMID:11157982 디술피드 이성화효소 MPD1
전구체		 디술피드 결합
산화환원효소
Q99316 MPD2_YEAST PMID:11157982 단백질 디술피드 이성화효소
MPD2 전구체 (EC 5.3.4.1)		 디술피드 결합
산화환원효소
Q03103 ERO1_YEAST PMID:9659913 내형질 옥시도리덕틴 1 전구체
(EC 1.8.4.-)
(내형질 산화환원효소
단백질 1)		 디술피드 결합
산화환원효소
P38866 FMO1_YEAST PMID:10077572 티올-특이적 모노옥시게나제
(EC 1.14.13.-) (플라빈-
의존성 모노옥시게나제)		 디술피드 결합
산화환원효소
펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소
P14832 CYPH_YEAST GOA:interpro 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 시클로필린 A/
Cpr1/Cyp1/CPH1/Scc1		 PPI효소:
시클로필린 유형
P23285 CYPB_YEAST GOA:interpro 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 시클로필린 B/
Cpr2/Cyp2		 PPI효소:
시클로필린 유형
P25719 CYPC_YEAST GOA:interpro 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 C/CYP3/CPR3,
미토콘드리아		 PPI효소:
시클로필린 유형
P25334 CYPR_YEAST GOA:interpro 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 CPR4/Scc3		 PPI효소:
시클로필린 유형
P35176 CYPD_YEAST GOA:interpro 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 D CypD/Cpr5		 PPI효소:
시클로필린 유형
P53691 CYP6_YEAST PMID:10942767 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 CPR6		 PPI효소:
시클로필린 유형
P47103 CTO7_YEAST PMID:10942767 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 CYP7		 PPI효소:
시클로필린 유형
P53728 CYP8_YEAST GOA:interpro 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스
이성화효소 CYP8		 PPI효소:
시클로필린 유형
Q02770 Q02770 GOA:interpro Ypl064cp PPI효소:
시클로필린 유형
P20081 FKBP_YEAST GOA:interpro FK506-결합 단백질 1
FKB1/RPB1		 PPI효소:
FKBP 유형
P32472 FKB2_YEAST GOA:interpro FK506-결합 단백질 2,
FKBP-13/FKBP-15/FKB2, FPR2		 PPI효소:
FKBP 유형
P38911 FKB3_YEAST GOA:interpro FK506-결합 핵 단백질
FKBP-70/Npi46/Fpr3		 PPI효소:
FKBP 유형
Q06205 FKB4_YEAST GOA:interpro FK506-결합 단백질 4 FPR4 PPI효소:
FKBP 유형
P22696 ESS1_YEAST GOA:spkw ESS1 단백질 PPI효소:
파르불린 유형
특징이 잘 규명되지 않은 기타
P27697 ABC1_YEAST GOA:spkw ABC1 단백질,
미토콘드리아 전구체		 ABC1
P53193 YGB8_YEAST GOA:interpro CKB1-ATE1 유전자간 영역 내의 가설 21.8 kDa 단백질 Hsp20
P28707 YKL7_YEAST PMID:9632755 VMA12-APN1 유전자간 영역 내의 24.1 kDa 단백질 p23/wos2
P38932 VP45_YEAST PMID:11432826 공포성 단백질 분류-관련
단백질 45		 SEC1 유사
Q12019 MDN1_YEAST GOA:spkw 미다신(midasin)
유전자 조작
단계 iii)에서, 확인된 보상 유전자 또는 유전자 생성물의 재조합 세포에서의 발현을 유전자 변형으로 변화시켜 변형된 재조합 세포를 제공하는 단계가 방법에 포함된다. 1개 이상의 상향 조절된 유전자, 단백질 또는 대사 프로세스의 확인 후, 숙주 세포의 게놈을 변형시킬 수 있다. 상향 조절된 것으로 확인되었어도, 특정 유전자 또는 유전자 생성물은 세포에 필수적이거나, 또는 세포 또는 생물에 필수적일 수 있는 다른 프로세스에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있기 때문에, 변형시킬 수 없을 수 있다.
외인성 유전자 또는 프로모터 요소를 게놈 내에 또는 숙주 내에 발현 벡터와 함께 포함시킴으로써, mRNA 또는 단백질을 생산하는 확인된 유전자의 능력을 증강시킴으로써, 또는 유전자 또는 프로모터 요소를 결실 또는 파괴시킴으로써, 또는 mRNA 또는 단백질을 생산하는 유전자의 능력을 감소시킴으로써, 게놈을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 치환, 결실 ("녹아웃"), 동시 발현 또는 삽입 ("녹인") 기술을 통해, 유전자 코드가 바뀜으로써, 유전자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 원하는 단백질에 대한 부가적인 유전자 또는 현존하는 서열의 전사를 조정하는 조절 서열이 또한 삽입될 수 있다.
재조합
재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하는 숙주 세포의 게놈을 유전자 표적화 이벤트를 통해 변형시킬 수 있고, 이는 삽입 또는 재조합, 예를 들어 상동 재조합에 의한 것일 수 있다. 상동 재조합은 서열 상동성을 기초로 하는 DNA 재조합 프로세스를 지칭한다. 상동 재조합은 내인성 유전자에서의 부위-특이적 변형을 허용하고, 따라서 신규 교체가 게놈 내로 조작될 수 있다. 상동 재조합에서의 한 단계는 DNA 가닥 교환이고, 여기에는 헤테로듀플렉스(heteroduplex) DNA를 함유하는 중간체 재조합 구조를 형성하기 위해 상보적인 서열을 함유하는 1개 이상의 DNA 가닥과 DNA 듀플렉스(duplex)가 쌍을 이루는 것이 수반된다 (예를 들어 [Radding, C. M. (1982), Ann. Rev. Genet. 16:405]; 미국 특허 제4,888,274호 참조). 헤테로듀플렉스 DNA는 상보적인 단일 가닥이 DNA 듀플렉스를 침범한 트리플렉스(triplex) 형태를 함유하는 3개의 DNA 가닥을 포함하여 여러 형태를 취할 수 있고 ([Hsieh, et al., Genes and Development 4:1951 (1990)]; [Rao, et al., (1991) PNAS 88:2984]), 2개의 상보적인 DNA 가닥이 DNA 듀플렉스와 쌍을 이루는 경우, 전통적인 홀리데이 재조합 조인트 또는 카이 구조 ([Holliday, R., Genet. Res. 5:282 (1964)]) 또는 이중-D 루프 ("Diagnostic Applications of Double-D Loop Formation", 미국 특허 일련번호 07/755,462 (1991년 9월 4일 출원))가 형성될 수 있다. 일단 형성되면, 헤테로듀플렉스 구조가 가닥 파손 및 교환에 의해 분해될 수 있어, 침범 DNA 가닥 전체 또는 일부가 수용체 DNA 듀플렉스 내로 스플라싱되어, 수용체 DNA 듀플렉스의 절편을 부가하거나 대체한다. 별법적으로, 헤테로듀플렉스 구조의 결과로 침범 가닥을 주형으로 사용하는 미스매치된 염기의 복구에 의해 수용체 DNA 듀플렉스로 침범 가닥의 서열이 전달되는 유전자 변환이 일어날 수 있다 ([Genes, 3rd Ed. (1987) Lewin, B., John Wiley, New York, N. Y.]; [Lopez, et al., Nucleic Acids Res. 15:5643(1987)]). 파손 및 재연결 메카니즘에 의해서 또는 유전자 변환의 메카니즘(들)에 의해서, 상동적으로 쌍을 이룬 조인트에서의 헤테로듀플렉스 DNA의 형성은 유전자 서열 정보를 한 DNA 분자에서 또다른 분자로 전달하는 역할을 할 수 있다.
상동 재조합에서, 들어오는 DNA는 실질적으로 상동성인 DNA 서열을 함유하는 게놈 내의 부위와 상호작용하여 이 부위 내로 통합된다. 비-상동 ("무작위" 또는 "불법") 통합에서는, 들어오는 DNA가 게놈 내의 상동성 서열에서가 아니라, 다수의 잠재적인 위치 중 하나에서 통합된다. 다수의 논문에 포유류 세포에서의 상동 재조합의 사용이 기술되어 있다.
확인된 유전자좌에서의 상동 재조합을 위해 다양한 구축물들을 제조할 수 있다. 일반적으로, 구축물은 확인된 유전자좌와 상동성인 서열을 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 70 bp, 100 bp, 500 bp, 1 kbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, 또는 50 kbp 포함할 수 있다. 예를 들어, 확인된 유전자좌의 크기, 서열의 이용가능성, 확인된 유전자좌에서의 이중 교차 이벤트의 상대적 효율, 및 다른 서열과의 확인된 서열의 유사성과 같은 다양한 고려사항이 확인된 DNA 서열의 상동성 정도를 결정하는데 있어서 수반될 수 있다.
표적화 DNA는 실질적으로 동유전자형(isogenic)인 DNA가 변형될 게놈 내의 상응하는 확인된 서열을 갖는 원하는 서열 변형에 플랭킹된 서열을 포함할 수 있다. 실질적으로 동유전자형인 서열은 상응하는 확인된 서열과 적어도 약 95％, 97-98％, 99.0-99.5％, 99.6-99.9％, 또는 100％ 동일할 수 있다 (원하는 서열 변형 제외). 표적화 DNA 및 확인된 DNA는 100％ 동일한 적어도 약 10, 20, 30, 50, 75, 150 또는 500개의 염기쌍의 DNA 신축물을 공유할 수 있다.
내인성의 확인된 유전자 생성물이 변형되도록 DNA 구축물을 디자인할 수 있다. 생성된 유전자 생성물의 기능을 파괴시키기 위해 고안된 1개 이상의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합이 구축물을 확인하기 위한 상동성 서열에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 변경은 확인된 유전자의 상류 서열과 리딩 프레임에서 융합된 선별가능한 마커 유전자의 삽입일 수 있다.
삽입성 결실을 사용하여 게놈을 또한 변형시킬 수 있다. 이러한 실시양태에서, 유전자 생성물 형성을 억제하는 유전자 내의 서열을 재조합시킴으로써 게놈을 변형시킨다. 이러한 삽입은 별도의 요소를 삽입함으로써 유전자를 파괴시킬 수 있거나, 또는 유전자의 필수적인 부분을 제거할 수 있다. 한 실시양태에서, 삽입성 결실에는 특정 스트레스인자, 예컨대 항생제에 대한 저항성, 또는 특정 배지에서의 성장, 예를 들어 필수 아미노산의 생산을 코딩하는 유전자의 삽입이 포함된다.
상동 재조합에 독립적인 메카니즘에 의해 원핵생물 게놈 내의 부위에서 삽입될 수 있는 유전자 요소인 트랜스포존을 사용하여 게놈을 또한 변형시킬 수 있다. 트랜스포존에는, 예를 들어, 대장균의 Tn7, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 Tn554, 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis)의 IS900, 슈도모나스 아틀란티카(Pseudomonas atlantica)로부터의 IS492, 스트렙토마이세스로부터의 IS116 및 파라투베르쿨로시스로부터의 IS900이 포함될 수 있다. 전위에 수반되는 것으로 여겨지는 단계들에는 3' OH가 생성되는 트랜스포존 말단의 절단; 유전자전위효소가 트랜스포존의 3'OH 노출 말단과 확인된 서열을 접합시키는 가닥 전달; 및 트랜스포존이 확인된 DNA에 공유 결합되는 단일 단계 에스테르교환 반응이 포함된다. 유전자전위효소에 의해 수행된 주요 반응은 닉킹(nicking) 또는 가닥 교환인 것으로 일반적으로 생각되고, 나머지 프로세스는 숙주 효소에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 유전자 또는 상동체를 코딩하는 유전자 서열을 재조합에 의해 게놈 내로 혼입시킴으로써 확인된 유전자 또는 이의 상동체의 수준을 증가시키는 방법이 제공된다. 또다른 실시양태에서, 프로모터가 게놈 내로 삽입되어 확인된 유전자 또는 상동체의 발현이 증강된다. 별도의 실시양태에서, 비활성 유전자와의 재조합에 의해 확인된 유전자 또는 이의 상동체의 발현을 감소시키는 방법이 제공된다. 또다른 실시양태에서, 세포 내에서 별도의 기능을 할 수 있거나 리포터 유전자 예컨대 저항성 유전자 또는 다른 검출가능한 마커 유전자일 수 있는, 상이한 유전자를 코딩하는 서열이 재조합을 통해 게놈 내로 삽입될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 지점에서 돌연변이된 확인된 유전자의 적어도 일부의 카피가 재조합을 통해 게놈 내로 삽입될 수 있다. 돌연변이된 버젼의 확인된 유전자는 단백질을 코딩할 수 없거나, 또는 돌연변이된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 비활성이게 될 수 있거나, 활성이 조정될 수 있거나 (증가 또는 감소), 또는 돌연변이체 단백질은 천연 단백질과 비교했을 때 상이한 활성을 가질 수 있다.
박테리아에서 유전자를 녹아웃시키는 전략이 있고, 일반적으로 대장균에서 예시되었다. 한 경로는 유전자-내부 DNA 단편을 항생제 저항성 유전자 (예를 들어 앰피실린)을 함유하는 벡터 내로 클로닝시키는 것이다. 접합성 전달, 화학적 형질전환 또는 전기영동 ([Puehler, et al. (1984), Advanced Molecular Genetics, New York, Heidelberg, Berlin, Tokyo, Springer Verlag])을 통해 세포를 형질전환시키기 전에, 복제 오리진, 예컨대 증식성 플라스미드 복제 오리진 (oriV 유전자좌)을 절단하고, 나머지 DNA 단편을 재결찰시키고 정제한다 ([Sambrook, et al. (2000) Molecular cloning: A laboratory manual, third edition, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press]). 별법적으로, DNA 복제 오리진을 갖는 항생제-저항성 플라스미드를 사용할 수 있다. 형질전환 후, 세포를 예를 들어 적합한 항생제 (예를 들어 200 ㎍/㎖ 앰피실린)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 항체제를 함유하는 플레이트 상에서 성장하는 콜로니에는 전체 DNA 단편이 상동성 유전자좌에서 게놈 내로 통합되도록 하는 단일 재조합 이벤트가 진행되었을 것이다 ([Snyder, L., W. Champness, et al. (1997), Molecular Genetics of Bacteria, Washington DC, ASM Press]). 원하는 유전자 녹아웃이 원하는 유전자좌에서 발생하였는지를 확인하기 위한 항생제-저항성 세포의 추가적인 분석은, 예를 들어, 진단용 PCR에 의해 이루어질 수 있다 ([McPherson, M. J., P. Quirke, et al. (1991), PCR: A Practical Approach, New York, Oxford University Press]). 여기서, 2개 이상의 PCR 프라이머가 고안된다: 유전자 녹아웃의 구축에 사용된 DNA 영역 외부에 혼성화하는 것; 및 나머지 플라스미드 골격 내에 혼성화하는 것. 정확한 크기의 DNA 단편의 성공적인 PCR 증폭 및 이어지는 DNA 서열 분석으로 유전자 녹아웃이 박테리아 염색체 내의 정확한 위치에서 발생한 것이 확인될 것이다. 그 후, 새롭게 구축된 돌연변이 균주의 표현형을 예를 들어 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분석할 수 있다 ([Simpson, R. J. (2003), Proteins and Proteomics - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press]).
유전자 녹아웃을 생성시키기 위한 별법적인 경로는 온도-민감성 레플리콘(replicon), 예컨대 pSC1Ol 레플리콘을 사용하여 유전자 교환을 용이하게 하는 것이다 ([Hamilton, et al. (1989), New process for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 171(9): 4617-22]). 이 방법은 염색체 상의 유전자와 DNA 복제에 대해 온도 민감성인 플라스미드 상에 담지된 상동성 서열 간의 상동 재조합에 의해 진행된다. 적합한 숙주 내로의 플라스미드의 형질전환 후, 44℃에서 염색체 내로의 플라스미드의 통합을 선별할 수 있다. 이어서 이러한 통합체(cointegrate)를 30℃에서 성장시키면 2차 재조합 이벤트가 일어나서, 이들이 분석된다. 2차 재조합 이벤트가 발생한 장소에 따라, 염색체에 유전자 교환이 일어나거나 또는 유전자의 원래의 카피가 유지된다.
특정 유전자 생성물의 발현을 억제하기 위한 또다른 전략이 개발되어 왔다. 특정 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 심지어 제거하기 위해, 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 특히 소형 간섭 RNA (siRNA)를 사용하는 것이 광범위하게 개발되었다. siRNA는 분해를 위해 상보적인 mRNA를 표적으로 할 수 있는 짧은 이중 가닥 RNA 분자이다. RNAi는 이중 가닥 RNA의 도입이 상동성 유전자의 발현을 억제하는 현상이다. 생체내에서 dsRNA 분자는 RNAi 효과의 매개물인 뉴클레오티드 21-23개의 siRNA로 감소된다. 도입 시, 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)로 칭해지는 RNA분해효소 III-유사 효소에 의해 뉴클레오티드 20-25개의 siRNA로 프로세싱된다 (개시 단계). 그 후, siRNA가 RNA-유도 사일런싱 복합체 (RISC: RNA-induced silencing complex)로 공지된 엔도리보뉴클리아제-함유 복합체 내로 어셈블링되어, 프로세스에서 풀리게된다. 이어서 siRNA 가닥이 RISC을 상보적인 RNA 분자로 안내하고, 여기서 동족 RNA를 절단 및 파괴한다 (이펙터 단계). 동족 RNA의 절단은 siRNA 가닥에 의해 결합된 영역의 중간 근처에서 발생한다. RNAi는 제브라피시, 선충 (꼬마선충(C. elegans)), 곤충 (드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster)), 플라나리아, 자포동물, 파동편모충(trypanosome), 마우스 및 포유류 세포를 포함하여 다양한 생물에서 유전자 발현을 감소시키는데 성공적으로 사용되었다.
돌연변이
확인된 유전자, 특히 확인된 프로테아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 내의 1개 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이에 의해 게놈을 또한 변형시킬 수 있다. 유전자 돌연변이를 위한 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발은 당업계에 공지되어 있다. 일부 접근법은 X선 및 화학물질에 의해 유도되는 것들과 같이 염색체 DNA에서의 무작위 돌연변이의 생성에 초점을 맞춘다. 한정된 영역의 DNA에 표적화된 돌연변이유발에는 많은 기술이 포함되고, 일부 기술은 다른 기술들보다 통속적이다. 부위 지정 돌연변이유발에 대한 시험관내 접근법은 일반적으로 3개의 카테고리로 그룹화될 수 있다: i) DNA의 단편을 재구성시키는 프로세스, 예컨대 카세트 돌연변이유발; ii) 국소화된 무작위 돌연변이유발; 및 iii) 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발.
올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발은 원하는 돌연변이(들)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드가 당해 DNA의 한 가닥에 어닐링되어 DNA 합성 개시를 위한 프라이머로 작용하는 개념을 기초로 한다. 이러한 방식으로, 돌연변이성 올리고뉴클레오티드가 새롭게 합성된 가닥 내로 혼입된다. 돌연변이성 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 염기 변화를 혼입시키지만, 다중 치환, 삽입 또는 결실이 생성되도록 디자인될 수 있다. 예로는 PCR을 기초로 하는 프로세스 및 실질적으로 모든, PCR을 기초로 하지 않는 현재 사용되는 프로세스가 포함된다. 이러한 기술에는 양성 항생제 선별 ([Lewis, M.K. and Thompson, D.V. (1990), Nucl. Acids Res. 18, 3439]; [Bohnsack, R.N. (1996), Meth. Mol. Biol. 57, 1]; [Vavra, S. and Brondyk, W.H. (1996), Promega Notes 58, 30]; [Altered Sites® II in vitro Mutagenesis Systems Technical Manual #TM001, Promega Corporation]), 특정 제한 부위 선별 ([Deng, W.P. and Nickoloff, J.A. (1992), Anal. Biochem. 200, 81]), 우라실 혼입 ([Kunkel, T.A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488]; [Kunkel, T.A., Roberts, J.D. and Zakour, R.A. (1987), Meth. Enzymol. 154, 367]), 및 포스포로티오에이트 혼입 ([Taylor, J.W., Ott, J. and Eckstein, F. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 8764]; [Nakamaye, K. and Eckstein, F. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 9679])이 포함된다. 화학적 합성 동안 부위에서의 염기 조성을 무작위화시켜 변성 또는 "도핑된(doped)" 올리고뉴클레오티드를 야기함으로써 올리고뉴클레오티드가 돌연변이의 라이브러리를 또한 코딩할 수 있다. 돌연변이를 국소화시키고 특정화시키는 능력은 DNA 삽입-함유 플라스미드 벡터에 혼성화된 합성 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 크게 증강된다
부위 지정 돌연변이유발의 일반적인 포맷은 하기와 같다: 당해 주형 (cDNA, 프로모터 등)을 함유하는 플라스미드 DNA를 변성시켜 단일 가닥 영역을 생산하고; 합성 돌연변이체 올리고뉴클레오티드를 확인된 가닥에 어닐링시키고; T4 DNA 중합효소를 예를 들어 사용하여 새로운 상보적인 가닥을 합성하고; 새로운 가닥의 말단과 올리고뉴클레오티드 간의 생성된 닉(nick)을 예를 들어 T4 DNA 결찰효소를 사용하여 실링(sealing)함. 생성된 헤테로듀플렉스를 예를 들어, 대장균에서 형질전환에 의해 증식시킨다. 선별 및 강화 프로세스가 돌연변이유발 프로세스에 혼입되어, 돌연변이체 가닥 복구 효율을 크게 개선시켰고, 약 80-90％의 비율이 가능하다. 상이한 유형의 돌연변이를 생성시키고 돌연변이체의 선별을 증강시키기 위한 수많은 프로세스가 존재한다. 돌연변이체의 선별을 증강시키는 프로세스의 예로는 돌연변이체 가닥의 양성 항생제 선별, 생체내에서 선별적으로 분해될 수 있는 우라실-함유 DNA 가닥을 사용하는 것, 및 헤테로듀플렉스 DNA의 한 가닥이 소화에 둔감하게 할 수 있는 dNTP 유사체 혼입이 포함된다. 카세트 돌연변이유발 및 "도핑된" 올리고뉴클레오티드의 사용과 같은 일부 접근법이 조합되어, 한정된 작은 영역 내의 무작위 돌연변이의 라이브러리가 생성될 수 있다.
부위 지정 돌연변이유발의 소위 "표준" 프로세스의 확장은 DNA 증폭, 특히 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의존하는 것들을 포함한다. 부위 지정 돌연변이유발의 주요 공통점은 돌연변이성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다. 돌연변이성 올리고뉴클레오티드는 주형에 효율적으로 혼성화되어야 한다. 효율적인 혼성화를 위해, 예를 들어 2차 구조 형성 없이 확인된 서열의 어느 한쪽 말단에서 100％ 염기쌍을 이룰 수 있지만, 또한 100％ 미만의 동일성, 98％, 95％, 92％, 90％, 85％, 80％, 70％ 또는 오직 일부의 서열만이 동일할 수 있다. 작은 치환을 위해서는, 미스매치의 어느 한쪽 측면에서 혼성화하는 10-15개의 염기가 일반적으로 충분하다. 미스매치된 또는 불량하게 혼성화된 3' 말단으로부터 중합효소가 전형적으로 확장되지 않기 때문에, 프라이머의 3' 말단의 조성이 특히 중요하다.
양성 항생제 선별에 의한 부위 지정 돌연변이유발을 위한 기초는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들의 선별이, 돌연변이성 올리고뉴클레오티드와 함께, 동시에 어닐링되어 항생제 저항성 유전자 (10-13)을 복구하는 것이다. 돌연변이된 DNA의 항생제 저항성 및 돌연변이되지 않은 가닥의 민감성에 의해 돌연변이체 가닥의 선별이 가능해진다. 이러한 접근법은 수동 시간을 적게 하면서 무한수의 원하는 돌연변이를 생성시키는 매우 효율적인 수단을 제공한다.
특정 제한 부위의 사용에 의한 부위 지정 돌연변이유발은 Deng 및 Nickoloff의 방법을 기초로 한다 ([Deng, W.P. and Nickoloff, J.A. (1992), Anal. Biochem. 200, 81]). 이러한 접근법에서는, 특정 제한 부위를 위한 돌연변이된 서열을 함유하는 선별 올리고뉴클레오티드가 돌연변이성 올리고뉴클레오티드와 동시에 어닐링된다. 선별 올리고뉴클레오티드는 비필수 부위가 상응하는 효소에 의한 제한에 대해 면역성이도록 한다. 돌연변이체 가닥의 선별은 생성된 플라스미드 풀을 특정 제한 효소로 소화시킴으로써 증강된다. 소화로 부모 플라스미드가 선형화되어, 박테리아를 형질전환시키는 능력이 효과적으로 감소된다.
데옥시유리딘 혼입에 의한 부위 지정 돌연변이유발은 티미딘 (T) 대신 우라실 (U)을 함유하는 주형 DNA을 분해하는 숙주의 능력에 의존한다. dUTP분해효소 (dut-) 및 우라실 N-데글리코시다제(deglycosidase) (ung -) 활성이 결여된 숙주에서 dTTP 대신 주형 가닥 내로 소수의 dUTP가 혼입된다 (우라실 자체는 돌연변이성이 아니고, 이는 아데닌과 염기쌍을 이룬다). 정상적으로, dUTP분해효소는 데옥시유리딘을 분해하고, 우라실 N-데글리코시다제는 임의의 혼입된 우라실을 제거한다. 그 후, dut + ung + 균주에서의 돌연변이 후의 복제를 사용하여, 확인되지 않은 가닥 DNA를 분해시킨다. 이러한 접근법은 분해에 감수성인 U를 1개의 가닥만이 함유하도록 단일 가닥 DNA를 사용하는 것을 필요로 한다.
부위 지정 돌연변이유발에 대한 포스포티오에이트 혼입 접근법은 헤테로듀플렉스 DNA가 제한 효소 소화에 저항성이도록 하는, 티올 기를 함유하는 dNTP 유사체의 능력을 기초로 한다. 돌연변이체 가닥이 돌연변이성 올리고뉴클레오티드로부터 확장되고 dCTP알파S의 존재 하에 합성된다. 사용되지 않은 주형 DNA를 엑소뉴클레아제(exonuclease)로의 소화에 의해 제거한다. 이론적으로, 원형의 헤테로듀플렉스 DNA만이 남게 된다. 그 후, 제한 부위(들)에서 헤테로듀플렉스가 닉킹되지만, 절단되지는 않는다. 엑소뉴클레아제 III을 사용하여 닉킹된 가닥을 소화시킨 후, 나머지 단편이 재중합용 프라이머로 작용하여, 돌연변이체 호모듀플렉스(homoduplex)가 생성된다.
DNA에서의 돌연변이를 생성시키기 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 기초로 하는 접근법에서는, 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트를 사용하여 주형을 증폭시키고, 단, 1개의 올리고뉴클레오티드, 또는 다중 증폭을 사용하는 프로토콜에서는 1개를 초과하는 올리고뉴클레오티드가 원하는 돌연변이를 함유한다. 변종은 오버랩(overlap) 내에 돌연변이를 갖는 다중의 오버랩핑(overlapping) PCR 단편을 생산하기 위해 올리고뉴클레오티드의 혼성화 부위를 변경시키는 것, 및 3개의 올리고뉴클레오티드 및 2회의 증폭 (첫번째 증폭으로부터의 생성물 가닥이 두번째 증폭에서 프라이머로 작용함)을 사용하는 "메가프라이머(megaprimer)" 접근법을 포함한다.
오버랩 확장 접근법에서는, 상보적인 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (올리고) 프라이머 및 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 오버랩핑된 말단을 갖는 2개의 DNA 단편을 생성시킨다. 이러한 단편들을 오버랩핑된 말단이 어닐링되는 후속 '융합' 반응에서 합쳐서, 각각의 가닥의 3' 오버랩이 상본적인 가닥의 3' 확장용 프라이머로 작용하도록 한다. 생성된 융합 생성물을 PCR에 의해 추가로 증폭시킨다. 뉴클레오티드 변화를 오버랩핑된 올리고 프라이머들 내로 혼입시킴으로써 뉴클레오티드 (nt) 서열에서의 특정 변경을 도입할 수 있다.
벡터 구축물
별도의 실시양태에서, 확인된 유전자, 전형적으로 폴딩 조정인자 또는 폴딩 조정인자의 보조인자를 코딩하는 1개 이상의 벡터를 포함함으로써 숙주 세포가 변형된다. 또다른 실시양태에서는, 외인성 프로모터를 숙주 세포 게놈에 부가시키는 것을 포함하여, 폴딩 조정인자 또는 폴딩 조정인자의 보조인자에 대한 프로모터를 증강시킴으로써, 숙주 세포가 변형된다.
또다른 실시양태에서, 확인된 보상 유전자의 억제제, 예컨대 프로테아제 억제제를 코딩하는 1개 이상의 벡터를 포함함으로써 숙주 세포가 변형된다. 이같은 억제제는 확인된 보상 유전자, 확인된 유전자의 보조인자 또는 확인된 유전자의 상동체의 발현을 제한하는 안티센스 분자일 수 있다. 안티센스는 확인된 유전자의 적어도 일부에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 일반적으로 사용된다. 또한, 억제제는 간섭 RNA, 또는 간섭 RNA를 코딩하는 유전자일 수 있다. 진핵생물에서, 이같은 간섭 RNA는, 예를 들어, [Fire, A. et al.(1998), Nature 391:806-11], [Elbashir et al. (2001) Genes & Development 15(2):188-200], [Elbashir et al. (2001), Nature 411(6836):494-8], 미국 특허 제6,506,559호 (Carnegie Institute), 제6,573,099호 (Benitec), 미국 특허 출원 제2003/0108923호 (Whitehead hist.), 및 제2003/0114409호, PCT 공개공보 WO03/006477, WO03/012052, WO03/023015, WO 03/056022, WO03/064621 및 WO03/070966에 기술된 바와 같이, 소형 간섭 RNA 또는 리보자임일 수 있다. 억제제는 또한 또다른 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 억제제는, 예를 들어, 프로테아제 또는 프로테아제 단백질에 대한 컨센서스 서열을 갖는 펩티드일 수 있다. 또한 억제제는 숙주에서 프로테아제 또는 프로테아제 단백질에 대한 직접적 또는 간접적 억제 분자를 생산할 수 있는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 프로테아제 억제제로는 아마스타틴(Amastatin), E-64, 안티파인(Antipain), 엘라스타티날(Elastatinal), APMSF, 류펩틴(Leupeptin), 베스타틴(Bestatin), 펩스타틴(Pepstatin), 벤즈아미딘(Benzamidine), 1,10-페난트롤린(Phenanthroline), 키모스타틴(Chymostatin), 포스포르아미돈(Phosphoramidon), 3,4-디클로로이소쿠마린, TLCK, DFP, TPCK가 포함될 수 있다. 100개를 초과하는 천연발생 단백질 프로테아제 억제제가 현재까지 확인되어 있다. 이들은 박테리아에서 동물 및 식물까지의 다양한 생물에서 단리되었다. 이들은 프로테아제의 가역성 또는 유사-비가역성 밀착-결합 억제제로 행동하여, 입체 장애를 통해 기질이 활성 부위에 접근하는 것을 방지한다. 잔기 50개 (예를 들어 BPTI: 소 췌장 트립신 억제제)에서 잔기 400개 (예를 들어 알파-1PI: 알파-1 단백질분해효소 억제제)까지 이들의 크기 또한 다양하다. 분자성 포획 메카니즘을 통해 대부분의 프로테아제에 결합하여 이를 억제하는 알파-마크로글로불린 족 (예를 들어, 알파-2 마크로글로불린)의 단백질을 제외하고는, 이들은 엄격하게 클래스-특이적이다.
외인성 벡터 또는 DNA 구축물을 숙주 세포 내로 형질감염 또는 형질전환시킬 수 있다. 외인성 핵산에 의한 각각의 진핵생물 및 원핵생물 세포의 형질감염 및 형질전환을 위한 기술은 당업계에 주지되어 있다. 이러한 기술에는 지질 소포 매개 흡수(uptake), 인산칼슘 매개 형질감염 (인산칼슘/DNA 동시 침전), 바이러스 감염, 특히 예를 들어 변형된 아데노바이러스와 같은 변형된 바이러스를 사용하는 감염, 미세주사 및 전기천공이 포함될 수 있다. 원핵생물 형질전환을 위해서는, 열 충격 매개 흡수, 무손상 세포로의 박테리아 원형질체 융합, 미세주사 및 전기천공이 기술에 포함될 수 있다. 식물 형질전환을 위한 기술에는 아그로박테리움 투메파시엔스와 같은 아그로박테리움에 의해 매개되는 전달, 급속하게 프로펠링된 텅스텐 또는 금 유전자총, 전기천공, 미세주사 및 폴리에틸렌 글리콜 매개 흡수가 포함된다. DNA는 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형, 이완 또는 초나선형 DNA일 수 있다. 포유류 세포를 형질감염시키기 위한 다양한 기술에 대해서는, 예를 들어, [Keown et al. (1990), Processes in Enzymology, Vol. 185, pp. 527-537] 참조.
재조합 이벤트를 위해, 1개 이상의 핵산 서열을 상이한 서열 내로 삽입 또는 전위시킬 수 있는, 1개 이상의 삽입 서열을 구축물이 포함할 수 있다. 그러나, 기존의 세포 DNA/게놈 내로의 혼입 없이, 확인된 보상 유전자 또는 이의 상동체의 외인성 발현용으로 구축물을 디자인할 수 있다.
구축물은 1개, 또는 1개를 초과하는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 함유할 수 있다. 확인된 유전자, 또는 확인된 유전자의 보조인자, 또는 확인된 보상 유전자의 적어도 일부의 돌연변이체 버젼, 또는 프로테아제의 경우 확인된 유전자의 억제제의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 구축물이 또한 함유할 수 있다. 별법적으로, 구축물에 프로모터가 없을 수 있다. 구축물이 세포 DNA/게놈 내로 혼입되도록 디자인되지 않은 경우, 벡터는 1개 이상의 프로모터 요소를 전형적으로 함유한다. 핵산 서열에 더하여, 발현 벡터는 선별가능한 마커 서열을 함유할 수 있다. 발현 구축물은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및/또는 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 수 있다. 확인된 구축물을 박테리아 세포, 예컨대 슈도모나스 플루오레센스 또는 대장균, 효모 세포, 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포, 또는 식물 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내로 삽입하여 발현시킬 수 있다.
클로닝 벡터로는, 예를 들어, 플라스미드 pBR322 ([Bolivar, Rodriguez et al., 1977]), pUC 시리즈의 플라스미드 ([Vieira and Messing, 1982]), pBluescript ([Short, Fernandez et al., 1988],), pACYC177 및 pACYC184 ([Chang and Cohen, 1978)가 포함될 수 있다. 이같은 구축물에서 사용하기 위한 외인성 프로모터로는 파지 람다 PL 프로모터, 대장균 lac, 대장균 trp, 대장균 phoA, 대장균 tac 프로모터, SV40 초기, SV40 후기, 레트로바이러스 LTR, PGKI, GALI, GALIO 유전자, CYCI, PH05, TRPI, ADHI, ADH2, 포글림알데하이드 포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 트리오스 포스페이트 이성화효소, 포스포글루코스 이성화효소, 글루코키나제 알파-메이팅 인자 페로몬, PRBI, GUT2, GPDI 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 및/또는 포유류 바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 및 우두 바이러스로부터 유래된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 기타 프로모터들이 당업자에게 주지되어 있다.
외인성 벡터용 프로모터, 또는 게놈 내로 삽입되도록 디자인된 외인성 프로모터는 세포 내의 특정 반응 요소를 기초로 할 수 있다. 예를 들어, PCT 공개공보 WO 2004/005221에 기술된 바와 같이, 프로모터는 화학 화합물, 예를 들어 안트라닐레이트 또는 벤조에이트에 반응성일 수 있다. 구축물은 1개 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 이들은 독립적일 수 있거나, 또는 연계될 수 있다. 예를 들어, 확인된 보상 유전자가 재조합 단백질 또는 펩티드와 함께 특정 시점에 상향 또는 하향 조절되도록 프로모터를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 확인된 유전자가 폴딩 조정인자인 경우, 폴딩 조정인자 또는 보조인자를 재조합 단백질 또는 펩티드의 유도 직전에 유도할 수 있다. 프로모터에는 하기의 것들이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다:
프로모터 공급원 조절 유도
lac 대장균(E. coli) lacI, lacIq IPTG
lacUV5 대장균 lacI, lacIq IPTG
tac (하이브리드) 대장균 lacI, lacIq IPTG
trc (하이브리드) 대장균 lacI, lacIq IPTG
Psyn (합성) 대장균 lacI, lacIq IPTG
trp 대장균 트립토판 기아
araBAD 대장균 araC 1-아리비노스
lppa 대장균 IPTG, 락토스
lpp-lac (하이브리드) 대장균 lacI IPTG
phoA 대장균 phoB (양성)
phoR (음성)		 포스페이트 기아
recA 대장균 lexA 날리딕산
proU 대장균 오스몰농도
cst-1 대장균 글루코스 기아
tetA 대장균 테트라사이클린
cadA 대장균 cadR pH
nar 대장균 fnr 혐기성 조건
pL λ λ cIts857 열 (42℃로 이동)
cspA 대장균 열 (20℃ 미만으로 이동)
T7 T7 λ cIts857 열
T7-lac 오퍼레이터 T7 lacIq IPTG
T3-lac 오퍼레이터 T3 lacIq IPTG
T5-lac 오퍼레이터 T5 lacI, lacIq IPTG
T4 유전자 32 T4 T4 감염
nprM-lac 오퍼레이터 바실루스 lacIq IPTG
VHb 비트레오실라
(Vitreoscilla)		 산소
단백질 A 스타필로코쿠스 아우레우스
구축물은 변형된 세포를 확인하기 위한 선별 마커를 포함할 수 있다. 적절한 선별가능 마커 유전자에는 하기의 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: 특정 배지 기질 상에서 성장하는 능력을 부여하는 유전자, 예컨대 HAT 배지 (하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 상에서 성장하는 능력을 부여하는 tk 유전자 (티미딘 키나제) 또는 hprt 유전자 (하이포잔틴 포스포리보실트랜스페라제); MAX 배지 (마이코페놀산, 아데닌 및 잔틴) 상에서 성장하도록 하는 박테리아 gpt 유전자 (구아닌/잔틴 포스포리보실트랜스페라제). 예를 들어, [Song, K-Y., et al. (1987), Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 84:6820-6824]; [Sambrook, J., et al. (1989), Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., Chapter 16] 참조. 선별가능한 마커의 기타 예로는 항생제와 같은 화합물에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 선택 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하는 유전자, 발광과 같은 검출가능한 신호를 생산하는 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질, 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 유전자가 포함된다. 예를 들어, 항생제 저항성 유전자 예컨대 네오마이신 저항성 유전자 (neo) ([Southern, P., and P. Berg, (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341]); 및 히그로마이신 저항성 유전자 (hyg) ([(1983) Nucleic Acids Research 11:6895-6911], 및 [Te Riele, H., et al. (1990) Nature 348:649-651])를 포함하여, 다양한 이같은 마커가 공지되어 있고, 이용가능하다. 기타 선별가능한 마커 유전자로는 아세토히드록시산 합성효소 (AHAS), 알칼리성 포스파타제 (AP), 베타 갈락토시다제 (LacZ), 베타 글루코로니다제 (GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 (CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 청색 형광 단백질 (CFP), 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 루시페라제 (Luc), 노팔린 합성효소 (NOS), 옥토핀 합성효소 (OCS), 및 이들의 유도체가 포함된다. 앰피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 리노코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 푸로마이신, 및 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하는 다양한 선별가능 마커가 이용가능하다. 본 발명에 유용한 추가적인 선별가능한 마커 유전자가, 예를 들어, 미국 특허 제6,319,669호; 제6,316,181호; 제6,303,373호; 제6,291,177호; 제6,284,519호; 제6,284,496호; 제6,280,934호; 제6,274,354호; 제6,270,958호; 제6,268,201호; 제6,265,548호; 제6,261,760호; 제6,255,558호; 제6,255,071호; 제6,251,677호; 제6,251,602호; 제6,251,582호; 제6,251,384호; 제6,248,558호; 제6,248,550호; 제6,248,543호; 제6,232,107호; 제6,228,639호; 제6,225,082호; 제6,221,612호; 제6,218,185호; 제6,214,567호; 제6,214,563호; 제6,210,922호; 제6,210,910호; 제6,203,986호; 제6,197,928호; 제6,180,343호; 제6,172,188호; 제6,153,409호; 제6,150,176호; 제6,146,826호; 제6,140,132호; 제6,136,539호; 제6,136,538호; 제6,133,429호; 제6,130,313호; 제6,124,128호; 제6,110,711호; 제6,096,865호; 제6,096,717호; 제6,093,808호; 제6,090,919호; 제6,083,690호; 제6,077,707호; 제6,066,476호; 제6,060,247호; 제6,054,321호; 제6,037,133호; 제6,027,881호; 제6,025,192호; 제6,020,192호; 제6,013,447호; 제6,001,557호; 제5,994,077호; 제5,994,071호; 제5,993,778호; 제5,989,808호; 제5,985,577호; 제5,968,773호; 제5,968,738호; 제5,958,713호; 제5,952,236호; 제5,948,889호; 제5,948,681호; 제5,942,387호; 제5,932,435호; 제5,922,576호; 제5,919,445호; 및 제5,914,233호에 기술되어 있다.
적어도 약 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp 또는 50 bp, 통상적으로 적어도 약 100 bp, 그리고 일반적으로 약 20 kbp 이하가 결실될 수 있고, 이때 결실은 엑손의 일부 또는 1개 이상의 엑손, 인트론의 일부 또는 1개 이상의 인트론을 포함하는 코딩 영역의 적어도 일부를 일반적으로 포함할 수 있고, 플랭킹된 비-코딩 영역의 일부, 특히 5'-비 코딩 영역 (전사 조절 영역)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 상동성 영역이 코딩 영역 너머로 5'-비-코딩 영역 내로, 또는 별법적으로 3'-비-코딩 영역 내로 확장될 수 있다. 삽입은 일반적으로 10 kbp를 초과하지 않을 수 있고, 보통 5 kbp를 초과하지 않으며, 일반적으로 적어도 50 bp, 더욱 일반적으로는 적어도 200 bp이다.
상동성 영역(들)은 돌연변이를 포함할 수 있고, 이때 돌연변이는, 프레임 이동을 제공하거나 주요 아미노산을 변화시키는데 있어서, 확인된 유전자를 추가로 비활성화시킬 수 있거나, 또는 돌연변이가 기능장애 대립유전자 등을 정정할 수 있다. 일반적으로, 돌연변이는 상동성 플랭킹 서열의 약 5를 초과하지 않는 미세한 변화일 수 있다.
당업계에 공지된 방법에 따라 구축물을 제조할 수 있고, 다양한 단편들이 모아져서, 적합한 벡터 내로 도입되고, 클로닝되고, 분석된 후, 원하는 구축물이 달성될 때까지 추가로 조작될 수 있다 (예를 들어, 도 5-11 참조). 제한 분석, 절단, 프로브의 확인 등을 위해 다양한 변형이 서열에 이루어질 수 있다. 원한다면, 침묵 돌연변이를 도입할 수 있다. 다양한 단계에서, 제한 분석, 서열분석, 중합효소 연쇄 반응으로의 증폭, 프라이머 복구, 시험관내 돌연변이유발 등이 사용될 수 있다. 항생제 저항성 유전자 및 음성 선별 인자의 혼입을 위한 프로세스는 당업자에게 친숙할 것이다 (예를 들어, WO 99/15650; 미국 특허 제6,080,576호; 미국 특허 제6.136,566호; [Niwa, et al, J. Biochem. 113:343-349 (1993)]; 및 [Yoshida, et al., Transgenic Research, 4:277-287 (1995)] 참조).
원핵생물 복제 시스템, 예를 들어, 슈도모나스 플루오레센스 또는 대장균과 같은 원핵생물 세포에 의해 인식가능한 오리진을 포함하여, 박테리아 벡터를 사용하여 구축물을 제조할 수 있다. 삽입에 사용되는 마커와 동일하거나 상이한 마커를 사용할 수 있고, 이는 확인된 세포 내로의 도입 전에 제거할 수 있다. 구축물을 함유하는 벡터가 일단 완성되면, 예컨대 특정 서열의 결실, 선형화, 또는 상동성 서열에 돌연변이, 결실 또는 기타 서열을 도입하는 것에 의해 이를 추가로 조작할 수 있다. 최종 조작 후, 구축물을 세포 내로 도입할 수 있다.
방법은 반복성일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주의 변형 및 변형된 숙주에서의 재조합 단백질의 발현 후, 변형된 숙주 세포의 유전자 프로파일을 분석하여, 변형된 숙주 세포에서 발현이 변화된 1개 이상의 추가적인 확인된 유전자를 확인한다. 특히, 보상 유전자는, 이 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하지 않는 변형된 숙주 세포와 비교했을 때, 또는 변형되지 않은 숙주 세포와 비교했을 때, 재조합 단백질을 발현하는 변형된 숙주 세포에서 증가된 발현을 나타내는 것일 수 있다. 추가적인 확인된 유전자 또는 유전자들의 발현을 변화시키고, 이중 변형된 세포에서 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 것이 추가로 방법에 포함될 수 있다. 단백질 발현을 개선시키기 위해 이러한 단계가 반복될 수 있고, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 이상 되풀이될 수 있다.
단백질의 생산
본 발명의 방법은 숙주 세포에서의 재조합 단백질 또는 펩티드의 증가된 생산에 최적으로 이른다. 증가된 생산은 정해진 양의 시간 내의 숙주 단백질 그램 당 단백질 양에서의 증가를 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포가 재조합 단백질 또는 펩티드를 생산하는 시간 길이에서의 증가를 포함할 수 있다. 증가된 생산은 재조합 숙주 세포의 성장을 위한 필요요건에서의 개선을 또한 포함할 수 있다. 증가된 생산은 전장 단백질 또는 펩티드의 증가된 생산일 수 있다. 개선이 증가된 단백질 수준인 경우, 단백질 또는 펩티드가 숙주 세포내에서 1개 이상의 봉입체에서 생산될 수 있다.
별법적으로, 증가된 생산은 생산된 단백질 그램 당 또는 숙주 단백질 그램 당 활성 단백질 또는 펩티드 수준의 증가일 수 있다. 또한 증가된 생산은 재조합 단백질 그램 당 또는 숙주 세포 단백질 그램 당 생산된, 회수성 단백질 또는 펩티드, 예컨대 가용성 단백질 수준의 증가일 수 있다. 또한 증가된 생산은 전체 수준 증가 및 활성 또는 가용성 단백질 수준의 증가의 임의의 조합일 수 있다.
변형된 세포에서 특정 기간의 유도 후의 생산 수준을 변형되지 않은 세포에서의 동일한 유도와 비교함으로써 증가된 생산을 전형적으로 측정한다.
가용성/불용성
재조합 단백질의 개선된 발현은 단백질 용해도에서의 증가일 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드가 숙주 세포의 세포질, 원형질막주위공간 또는 세포외 배지로부터 생산 및 회수될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 가용성 또는 불용성일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 1개 이상의 표적화 서열 또는 정제를 보조하는 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 재조합 단백질 또는 펩티드의 용해도를 개선시키는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "가용성"은 생리학적 조건 하에 버퍼 내에서 10 내지 30분 동안 스피닝되었을 때 단백질이 약 5,000 내지 20,000×g 사이에서의 원심분리에 의해 침전되지 않는다는 것을 의미한다. 가용성인 활성 단백질은 기능을 나타낼 수 있고, 봉입체 또는 기타 침전된 덩어리의 일부가 아니다.
본 발명은 활성 재조합 단백질 또는 펩티드의 회수를 또한 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 확인된 것과 부모 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 절편-치환 폴리펩티드 및/또는 잔기-치환 폴리펩티드 간의 상호작용을 임의의 통상적인 시험관내 또는 생체내 분석법에 의해 측정할 수 있다. 따라서, 시험관내 분석법을 사용하여 확인된 것과 폴리펩티드 간의 임의의 검출가능한 상호작용, 예를 들어, 효소와 기질 간의 상호작용, 호르몬과 호르몬 수용체 간의 상호작용, 항체와 항원 간의 상호작용 등을 결정할 수 있다. 이같은 검출은 발색 변화, 방사성 변화, 용해도 변화, 겔 전기영동 및/또는 겔 배제 프로세스에 의해 측정되는 분자량 변화 등의 측정을 포함할 수 있다. 생체내 분석법에는 생리학적 효과, 예를 들어, 중량 취득, 전해질 균형의 변화, 혈액 응고 시간의 변화, 혈괴 용해의 변화, 및 항원성 반응의 유도를 검출하는 분석법이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로, 확인된 것과 당해 폴리펩티드 간의 상호작용에서의 변화가 검출되도록 하는 다양한 파라메터가 존재하는 한 임의의 생체내 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,834,250호 참조.
세포질/원형질막주위공간/분비
특정 실시양태에서, 단백질은 적합한 신호 분비 서열에 융합되는 경우 원형질막주위공간 내로 또한 분비될 수 있다. 한 실시양태에서, 신호 서열은 포스페이트 결합 단백질, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 (LAObp 또는 KRObp) 분비 신호 펩티드, 외부 막 포린 E (OprE) 분비 신호 펩티드, 아주린 분리 신호 펩티드, 철(III) 결합 단백질 [Fe(III)bp] 분비 신호 펩티드, 또는 지질단백질 B (LprB) 분비 신호 펩티드일 수 있다.
한 실시양태에서, 변형된 숙주 세포 또는 이중 또는 다중 변형된 세포부터 활성인 가용성 형태로 디술피드-결합을 함유하는 확인된 폴리펩티드를 회수하기 위해 추가적인 디술피드-결합 촉진 조건 또는 작용제가 필요하지 않다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 단편은 이의 활성 상태에서 폴딩된 분자내 입체형태를 갖는다. 원형질막주위공간에서의 추후의 디술피드 결합 형성을 위한 티올기의 적합한 배치와 함께, 세포질에 가용성인 복합적인 포유류 단백질이 적절하게 배열될 수 있다는 것이 발견되었다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단편은 이의 활성 상태에서 1개 이상의 분자내 디술피드 결합을 함유하고; 아마도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개 이상의 디술피드 결합을 함유할 것이다.
한 실시양태에서, 생산된, 발현된 트랜스제닉 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 단편의 50％ 초과가 세포질 또는 원형질막주위공간 내에서 가용성의 활성 형태 또는 불용성의 쉽게 탈변성되는 형태의 단일한 기능성 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 단편으로 생산될 것이다. 또다른 실시양태에서, 약 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％의 발현된 단백질이 활성 형태로 수득되거나 활성 형태로 쉽게 탈변성된다.
본 연구에서 사용된 박테리아 균주가 표 1에 열거된다. 슈도모나스 플루오레센스 균주를 진탕 플라스크에서 30℃에서 성장시켰다. OD575를 각각의 균주에 대해 다양한 시점에 기록하였다.
Figure 112007016153726-pct00001
하기의 실험들에서 사용된 플라스미드가 표 2에 열거된다.
Figure 112007016153726-pct00002
샘플 수집 및 RNA 단리
모든 샘플을 200㎖ 표준 진탕 플라스크 실험으로부터 수집하였다. 도면에 지시된 바와 같은 여러 시점에 샘플들을 취하였다. 각각의 시점에, 진탕 플라스크로부터 10㎖의 세포 배양물을 수집하고, 10㎖의 RNAlater (Ambion (Austin, TX)) 시약과 혼합하여 RNA를 안정화시켰다.
마이크로어레이 혼성화 및 데이타 분석
각각의 RNA 샘플에 대해, 형광 뉴클레오티드 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia (Piscataway, NJ))를 6량체 프라이머 (Amersham)를 사용하는 역전사 (RT) 반응에서 cDNA 내로 혼입시켰다. 2개의 표지된 cDNA 풀을 합치고, 마이크로어레이 슬라이드에 적용하였다. 마이크로어레이 슬라이드는 슈도모나스 플루오레센스의 각각의 ORF를 나타내는 50량체 아미노-변형 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (올리고)를 함유한다. 각각의 올리고를 SDDC-2 로봇 (Virtek (Toronto, Canada) - 현재는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)가 공급) 및 SMP3 핀 (TeleChem International Inc. (Sunnyvale, CA))을 사용하여 상이한 위치에서의 이중 스폿을 위해 2회 프린트하였다. 사용된 현미경 슬라이드를 효율적인 DNA 결합을 위해 양성 전하를 띠는 에폭시 수지로 코팅하였다 (MWG Inc. (Alameda, CA)). 프린팅 후, 슬라이드를 MWG의 설명서에 따라 후처리하였다. BioDiscovery Inc. (El Segundo, CA)로부터의 소프트웨어 팩키지를 사용하여 데이타 분석을 용이하게 하였다. 이러한 팩키지는 CloneTracker™, ImaGene™, GeneSight™ 모듈 및 GeneDirector™ 데이타베이스로 구성된다. 각각의 혼성화된 슬라이드를 ScanArray 5000 (Packard BioScience (Billerica, MA))를 사용하여 스캐닝하여, 마이크로어레이에 결합된 Cy3- 및 Cy5-표지된 cDNA의 형광을 측정하였다. 수득된 이미지를 ImaGene™에서 정량하고, 원(原) 데이타를 GeneSight™에서 프로세싱하였다. 데이타 제조 동안, 각각의 유전자에 대한 스팟 강도의 배경값을 정정하였다; Cy5 채널에 대한 신호를 전체 어레이에 대한 전체 신호 강도를 사용하여 Cy3 채널에 대해 표준화하였다; 각각의 유전자에 대한 Cy5 대 Cy3의 표준화된 비율을 log2로 변환시키고, 반복물들을 합쳤다.
SDS - PAGE 에 의한 단백질 분석
IPTG 유도 후 배양물 분취량을 다양한 시점에 수확하고, OD600 10에 대해 표준화시켰다. 11000g에서 5분동안의 원심분리에 의해 세포 용해물을 가용성 및 불용성 분획으로 분리하였다. 2.5㎕의 분취량을 5㎕의 2X NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (Invitrogen (San Diego, CA)), 50 uM DTT, 및 10 ㎕가 되도록 H2O와 합친 후, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 단백질을 분리하고, Simply Blue Safestain (Invitrogen, (San Diego, CA))을 사용하여 쿠마시 블루로 염색된 12％ Nupage 겔 상에서 가시화시켰다
형광 활성 측정
녹색 형광 단백질 (COP)과 인간 성장 호르몬 (hGH)의 융합물의 형광 활성에 의해 단백질 수율을 또한 측정하였다. hgh::COP 융합 구축물을 야생형 또는 hslU 돌연변이 균주 내로 형질전환시키고, 우라실이 없는 M9 글루코스 한천 플레이트 상에서 선별하였다. IPTG-유도된 세포 배양물을 OD600 5에 대해 표준화시켰다. 상대적 형광 (RF) 활성을 Spectramax Gemini 마이크로플레이트 분광형광계 (Molecular Devices (Sunnyvale, CA))를 사용하여 적절한 설정 (Ex485, Em538530 밴드패스 필터) 하에 측정하였다.
실시예 1: 세포질 또는 원형질막주위공간 단백질을 생산하는 균주의 유전자 발현 분석 - 여러 시점의 비교
이종 단백질의 생산 동안의 FM 및 프로테아제 유전자 발현을 연구하기 위해, 슈도모나스 플루오레센스 균주 DC206, 280, 240 및 271을 초기 마이크로어레이 실험에서 사용하였다. DC206은 숙주 균주이고 세포 성장용 대조군으로 사용되었다; DC280은 벡터만 있는 플라스미드이고, 마이크로어레이 실험용 대조군으로 사용되었다; DC240은 가용성인 세포질 니트릴라제 효소를 코딩하는 플라스미드를 갖는 DC206이다; DC271은 부분적으로 불용성인 원형질막주위공간 인간 성장 호르몬 (pbp::hGH)을 코딩하는 플라스미드를 갖는 DC206이다. 균주들을 200㎖의 진탕 플라스크 배지에서 성장시키고, OD575를 측정함으로써 세포 성장을 모니터링하였다. 접종 24시간 후 IPTG 유도를 수행하였다. 모든 균주가 유사하게 성장하였고, DNA 마이크로어레이를 사용한 RNA 단리 및 전사 프로파일링 (TxP)을 위해 배양 샘플을 유도 직전 (0시) 및 유도 4시간 후에 취하였다 (도 1).
유전자 프로파일, 즉, 전사 프로파일은 유도 후 4시간 시점의 샘플과 0시 샘플의 비교를 기초로 하였고, 두 샘플을 형광 염료 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP으로 표시하여, 각각의 균주에 대해 동일한 슬라이드에 동시-혼성화시켰다. 각각의 혼성화를 염료-교환 실험으로 이중으로 하였다 (즉, 샘플들을 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP로 표시시켰다) (표 3, 슬라이드 1 내지 6). 혼성화된 슬라이드들을 동일초점 레이저 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다. Biodiscovery (El Segundo, CA)로부터의 마이크로어레이 소프트웨어 패키지를 사용하여 각각의 유전자에 대한 신호 강도를 결정하고 프로세싱하였다. 각각의 유전자에 대한 2개의 시점의 발현 비율을 계산하고, 균주 전반에 걸친 모든 유전자에 대한 비율을 3가지 균주 (DC280, DC240 및 DC271) 간의 비율 값 및 경향을 기초로 클러스터링하였다 (도 2).
Figure 112007016153726-pct00003
높은 수준의 재조합 단백질 생산에 의해 부과된 스트레스 하에 슈도모나스 플루오레센스에서의 FM 및 프로테아제 유전자 발현에 초점을 맞추기 위해, FM 및 프로테아제 유전자의 목록을 클러스터 분석과 비교하였다. DC280, DC240 및 DC271로부터의 모든 유전자의 계층적 클러스터링 분석 후에, FM 및 프로테아제가 2개의 클러스터에서 확인되었다 (클러스터 6 및 7의 선들; 도 2).
클러스터 7의 4개의 유전자는 가용성 세포질 니트릴라제를 생산하는 DC240 또는 어떠한 단백질도 과잉생산하지 않는 DC280과 비교하여 주로 불용성인 원형질막주위공간 인간 성장 호르몬을 발현하는 DC271에서 상당히 더 높은 발현을 나타낸다. 4개의 유전자는 HslV를 코딩하는 rxfO1961, HslU를 코딩하는 rxfO1957, CbpA를 코딩하는 rxfO3987 및 HtpG를 코딩하는 rxfO5455이다. 대장균 HslV (ClpQ) 및 HslU (ClpY)는 함께 세포질 프로테아제를 형성한다. 소형 서브유닛인 HslV는 진핵생물의 프로테아좀성 α-서브유닛에 관련된 펩티다제이다. 대형 서브유닛인 HslU는 다른 Clp 족 ATP분해효소 예컨대 ClpA 및 ClpX에 대한 상동성이 있는 ATP분해효소이다. 대장균의 CbpA는, 구조뿐만 아니라 기능 면에서 판단했을 때, 잘 규명된 동시-샤페론 DnaJ의 유사체이다. DnaJ에서의 손상의 표현형, 예컨대 성장에 대한 온도 민감성은 cbpA 유전자를 멀티카피 플라스미드에 도입했을 때 복구된다. 대장균의 HtpG는 시험관내에서 ATP-의존성 분자성 샤페론으로 기능한다. 이는 비-천연 폴딩 중간체를 인식하고 일시적으로 이에 결합하여, 용액 내의 이의 유리 농도를 감소시키고 따라서 비특이적 응집을 방지한다.
도 2의 클러스터 6의 유전자들을 계층적 클러스터링을 사용하여 다시 클러스터링하여, 덜 명백한 효과들을 확인하였다. 도 3은 FM 및 프로테아제가 2개의 주요 클러스터에서 확인된 것을 나타낸다 (클러스터 6 및 8의 선들). 클러스터 8 내의 2개의 FM은 함께 작용하여 수많은 단백질들을 폴딩시키는 것으로 잘 알려진 2개의 주요 샤페론인 DnaK 및 DnaJ이다. 클러스터 6으로부터의 유전자들의 발현값의 추가적인 분석으로 추가적인 FM인 ClpX가 확인되었고, 이는 니트릴라제를 생산하는 DC240 또는 어떠한 단백질도 과잉생산하지 않는 DC280과 비교하여 pbp::hGH를 생산하는 DC271에서 더 높게 발현된다. 대장균 ClpX 열 충격 단백질은 원핵생물 및 진핵생물 HSP100/Clp ATP분해효소 족의 구성원과 상동성이다. 대장균의 ClpX는 ClpP 프로테아제 서브유닛에 의한 단백질분해에 대해 수용성인 형태로 특정 폴리펩티드를 유지시키는 ATP-의존성 Clp 프로테아제의 특정 성분으로 단리되었다. DNA 복제에 수반되는 개시 단백질을 활성화시킴으로써, ClpX는 ClpP 부재하에 분자성 샤페론으로 작용할 수 있다. 원형질막주위공간 hGH 생산에 중요한 확인된 FM 및 프로테아제가 표 4에 열거된다.
Figure 112007016153726-pct00004
실시예 2 - 세포질 및 원형질막주위공간 단백질을 생산하는 균주의 유전자 발현 분석 - 여러 균주의 직접적인 비교
상기에서 수득된 결과를 확인하기 위해, 추가적인 마이크로어레이 실험을 2가지 균주 DC271 및 DC240의 직접적인 비교에 의해 수행하였다 (표 3의 슬라이드 7 내지 10). 유도 시점 4시간 후의 2가지 균주의 비교로 거의 동일한 세트의 FM 및 프로테아제 유전자가 부분적으로 가용성인 pbp::hGH를 발현하는 세포에서 상향 조절되었음이 확인되었다 (표 5). 표 5에 열거된 모든 유전자들은 완전히 가용성인 니트릴라제를 생산하는 세포와 비교하여 부분적으로 불용성인 hGH를 생산하는 균주에서 상당히 (즉, 2배 이상) 더 높게 발현된다. DC271과 DC240의 직접적인 비교에서, 시점 비교 (표 4 참조)와 비교하여, 부분적으로 불용성인 hGH 생산 동안 상당히 더 높은 유전자 발현값을 나타낸 약간의 추가적인 단백질들이 확인되었다. 이러한 유전자들에는 ClpB를 코딩하는 rxfO8347, ClpA를 코딩하는 rxfO4587, 및 FkbP를 코딩하는 rxfO5753이 포함된다. 대장균 ClpB 상동체는 DnaKJ-GrpE와 함께 봉입체의 재활성화에 수반된다. 대장균으로부터의 ClpA는 샤페론 기능을 갖거나, 또는 ClpP와 함께인 경우 단백질을 분해한다. 대장균에서, FkbP는 펩티딜-프롤릴 이성화효소로 기능한다.
Figure 112007016153726-pct00005
실시예 3: 불용성 세포질 단백질을 생산하는 균주의 유전자 발현 분석
DC271은 부분적으로 원형질막주위공간성인 인간 성장 호르몬 (pbp::hGH)을 발현하기 때문에, 유사한 또는 상이한 FM 및 프로테아제 유전자가 주로 불용성인 세포질 hGH를 발현하는 균주에서 상향조절되었는지를 조사하였다. DC369를 이러한 실험에서 사용하였다. 유도 4시간 후의 샘플을 0시 시점 샘플과 비교하였고, 마이크로어레이 실험을 표 3에 제시된 바와 같이 수행하였다 (슬라이드 11 및 12). 다시, 유사한 FM 및 프로테아제 유전자가 상향조절되는 것으로 확인되었고, 이는 확인된 유전자가 원형질막 주위공간성 보다는 세포질 폴딩 및 단백질 분해에 수반된다는 것을 가리킨다 (표 6). 배수 상향조절과 함께 어떤 실험에서 어떤 유전자가 확인되었는지의 요약이 도 4의 벤 다이아그램에서 제시된다.
Figure 112010048270242-pct00028
실시예 4: 슈도모나스 플루오레센스 DC206 에서의 hslU 돌연변이 균주의 생성
가장 고도로 상향조절된 확인된 유전자 사이에서 2개의 유전자 hslVU가 발견되었다. HslU는 세포질 ATP분해효소이다. 대장균에서의 상동성 단백질은 2차 단백질과 조합되어 대장균에서의 에너지 의존성 단백질 분해를 촉진하는 작용을 할 수 있다. HslU는 프로테오좀의 α 서브유닛과 상동성을 갖는 단백질인 HslV와 상호작용한다. [Missiakas, D., et al. (1996), Identification and characterization of HslV HslU (ClpQ ClpY) proteins involved in overall proteolysis of misfolded proteins in Escherichia coli. Embo J 15:6899-909]에서 대장균 HslVU 상동체는 미스폴딩된 단백질의 전반적인 단백질분해에 수반되는 것으로 보고되었다. DNA 서열 분석에서 슈도모나스 플루오레센스 hslVU 유전자가 바이시스트로닉(bicistronic) 오페론의 일부일 것이라는 것이 제안되었다 (도 5).
HslVU가 hGH의 분해에 실제로 수반된다는 것을 증명하기 위해, hslU 녹아웃 균주를 구축하였다. 이같은 균주는 hslU의 삽입성 비활성화에 의해 생성되었다 (도 6). hslU에 대해 내부인 약 550 bp의 DNA 단편을 카나마이신-저항성 pCR2.1-TOPO 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 벡터는 대장균에서는 기능성이지만 슈도모나스 플루오레센스에서는 기능성이지 않은 복제 오리진 (ColE1)을 갖기 때문에, 구축된 플라스미드는 카나마이신 저항성을 부여하기 위해 상동 재조합을 통해 DC206의 염색체 내로 통합될 것이다. 카나마이신 저항성 콜로니에 대한 정확한 삽입 부위를 원래의 증폭된 영역의 외부, 그리고 플라스미드 골격 내에 혼성화하는 프라이머를 사용하여 진단성 콜로니 PCR에 의해 확인하였다 (표 3). 구축된 hslU 돌연변이체를 DC370으로 명명하였다.
hslU 유전자의 약 550 bp의 내부 영역을 증폭시킬 프라이머를 디자인하였다 (표 7). 내부 단편을 Taq 중합효소 (Promega)를 사용하여 증폭시키고, 정제하고, pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen (San Diego, CA)) 내로 클로닝하였다. 플라스미드를 수용성 슈도모나스 플루오레센스 DC206 내로 형질전환시키고, 250 ㎍/㎖ 우라실 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 M9 글루코스 한천 플레이트상에서 선별하였다.
Figure 112007016153726-pct00007
SDS - PAGE 분석에 의한 단백질 발현 비교
hslU 유전자 녹아웃의 효과를 연구하기 위해, 2개의 외인성 단백질 발현을 부모 균주 DC206와 새롭게 구축된 돌연변이 균주 DC370 사이에서 비교하였다. pbp::hGH (pDOW1323), 및 hGH (pDOW1426)를 코딩하는 유전자를 갖는 플라스미드들을 각각 수용성 DC370 세포 내로 형질전환시켜, 균주 DC373 및 DC372가 각각 생성되었다. 표준 진탕 플라스크 성장 실험을 4개의 균주에 대해 수행하였다. 도 7은 야생형 및 돌연변이 균주의 성장 속도가 유사하다는 것을 나타낸다. 샘플들을 SDS-PAGE 겔 상에 러닝시켰다 (도 8 및 9). 결과는 돌연변이체가 프로테아제 서브유닛 HslU의 결실로 인해 더 높은 양의 단백질을 생산하였음을 시사한다.
형광 활성에 의한 단백질 발현 비교
hGH의 수율에 대한 HslU 결여의 관측된 효과를 SDS-PAG 분석을 사용하여 정량하기 어렵기 때문에, 단백질 생산의 시간적인 프로파일을 COP 녹색 형광 단백질과 hGH 간의 융합 단백질의 형광에 의해 모니터링하였다. hGH::COP 융합물을 함유하는 플라스미드를 구축하고, 부모 균주 DC206 및 hslU 유전자 결실 균주 DC370 내로 형질전환시켜, 균주 HJ104 및 HJ105가 생성되었다 (표 1). 표준 진탕 플라스크 실험을 수행하고, 형광 측정을 위해 다양한 시점에 샘플들을 취하였다 (도 10). 형광계로부터의 판독은 hslU 프로테아제 돌연변이 균주의 단백질 발현 수준이 부모 균주의 그것과 비교하여 상당히 높았음을 뚜렷하게 나타냈다 (도 11). 이러한 발견은 SDS-PAGE 분석에 의해 수득된 결과를 보강한다. 야생형 균주와 비교하여, hslU 돌연변이는 유도 24시간 후 상대적 형광도가 33.05％ 증가하였다 (도 11의 삽입물 참조).
실시예 5: hslUV 클린 녹아웃 균주의 구축
Hsl 프로테아제는 2개의 서브유닛으로 구성된다: hslU에 의해 코딩되는 ATP-결합 서브유닛, 및 hslV에 의해 코딩되는 프로테아제 서브유닛. 앞서 구축된 Hsl 프로테아제 녹아웃 균주는 hslU 유전자의 삽입성 비활성화이다. 또다른 프로테아제의 ATP-결합 서브유닛과 커플링할 수 있음으로써 HslV가 여전히 기능할 수 있다는 염려를 없애기 위해, 염색체로부터 hslU 및 hslV 유전자 모두가 제거된 결실 균주를 구축하였다.
도 13에 제시된 바와 같이, hslUV 영역에 플랭킹된 2개의 DNA 단편의 PCR 증폭에 의해 플라스미드 pDOW2050을 구축하였고, 이어서 SOE (Splicing by Overlap Extension: 오버랩 확장에 의한 스플라이싱) PCR 방법을 사용하여 2개의 단편을 융합시켰다 ([Ho, S.N. (1991), Method for gene splicing by overlap extension using the polymerase chain reaction. (미국 특허 출원 89-3920955023171) 참조). 그 후, 융합된 DNA 단편들을 벡터 pDOW1261-2의 SrfI 부위 내로 결찰시켰다. DNA 서열분석에 의해 삽입물을 확인한 후 결실 플라스미드를 pDOW2050으로 명명하였다.
플라스미드 pDOW2050을 DC206 내로 전기천공시키고, 1％ 글루코스 및 15 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 보충된 M9 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 테트라사이클린 저항성은 게놈 내의 2개의 상동성 영역 중 하나에서 염색체 내로 전체 플라스미드를 재조합시키는 통합 이벤트로 인한 것이다 (도 13). 염색체 내의 상동성 DNA 영역과 통합된 플라스미드 간의 제2의 상동 재조합으로부터 생성된 hslUV 유전자가 결실된 세포를 선별하기 위해, 테트라사이클린 저항성 콜로니를 250 ㎍/㎖ 우라실이 보충된 LB 배지에서 정지기(停止期)까지 성장시켰다. 그 후, 세포를 500 ㎍/㎖ 5-플루오로오로트산 (5-FOA)이 보충된 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 통합된 플라스미드가 제2의 재조합 이벤트에 의해 손실된 세포에서는 pyrF 유전자가 또한 손실되고, 따라서 5-FOA에 저항성이어서, 원하는 염색체 hslUV 결실 균주가 생성되고, 이는 DC417로 명명되었다.
hslUV 결실 균주의 표현형 분석
hslU 삽입형 돌연변이 균주 DC372를 사용하여 이전에 관측된 것과 유사하게, hGH를 발현하는 hslUV 결실 균주 (균주 HJ115)의 SDS-PAGE 분석은 야생형 균주 DC369보다 훨씬 더 높은 단백질 수율을 나타냈다 (데이타는 제시되지 않음).
앞서 기술된 동일한 방법을 사용하여 hGH::COP 융합물의 형광 활성에 의해 단백질 수율을 또한 측정하였다. hGH::COP 융합물을 함유하는 플라스미드 pDOW1349를 야생형 및 돌연변이 균주 내로 형질전환시켜 균주 HJ104 및 HJ117을 각각 생성시켰다. 표준 진탕 플라스크 실험을 수행하고, 상대 형광도 측정을 위해 다양한 시점에 샘플들을 취하였다 (도 14). 형광계로부터의 판독은 hslUV 프로테아제 결실 균주의 단백질 발현 수준이 야생형 균주와 비교하여 상당히 높았음 (약 50％ 수율 증가)을 가리켰다. 이러한 결과는 hslU 녹아웃 균주로 이전에 관측된 것과 유사하다.
실시예 6: DNA 마이크로어레이 기술을 사용하는 반복성 표적 확인
hslUV 프로테아제 결실 균주에서 새로운 세트의 프로테아제가 상향조절되는지를 조사하기 위해, DNA 마이크로어레이 실험을 구축하였다. 표준 진탕 플라스크 실험을 야생형 (DC369) 및 hGH를 발현하는 돌연변이 균주 (HJ115)를 사용하여 수행하였다. 각각의 균주에 대해, 유도 4시간 후의 샘플을 0시 시점 샘플 (이종형 단백질 유도 직전)과 비교하고, DNA 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 야생형과 돌연변이 군주 간의 2가지 시점의 비율을 비교하여, hslUV 프로테아제 결실 균주에서 상향조절되는 새로운 목록의 프로테아제 유전자를 확인하였다 (표 8). 이제, 프로테아제를 코딩하는 이러한 새롭게 확인된 유전자들이 이종형 단백질 생산 수율을 추가로 개선시키기 위한 두번째 라운드의 유전자 결실 이벤트에 대한 표적일 수 있다.
Figure 112010048270242-pct00029
Figure 112007016153726-pct00009
Figure 112007016153726-pct00010
실시예 7: 폴딩 조정인자의 동시-과발현이 표적 단백질 hGH 의 용해도를 증가시킴
도 4에 제시된 전사 프로파일링을 기초로, 폴딩 조정인자 (FM) DnaK 및 DnaJ의 발현이 대조군 균주와 비교하여 재조합 단백질을 생산하는 균주에서 증가되었다 (표 4 및 5 참조). hGH와 함께 GrpE, DnaK 및 DnaJ가 동시-과잉생산된 균주를 생산하고 테스트하여, 이의 결과로 가용성 hGH의 증가된 수준이 축적되는지를 확인하였다.
hGH 와의 동시-과발현을 위한 grpE - dnaKJ -함유 플라스미드의 구축
슈도모나스 플루오레센스 grpE-dnaKJ 유전자를 MB214 (DNeasy; Qiagen (Valencia, CA))로부터 단리된 염색체 DNA를 주형으로, RC199 (5'-ATATACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCTGACGAACAGACGCA-3') 및 RC200 (5'-ATATTCTAGATTACAGGTCGCCGAAGAAGC-3')을 프라이머로 사용하여 증폭시키고, PfuTurbo (Stratagene (La Jolla, CA))를 제조자의 권고사항에 따라 사용하였다. 생성된 PCR 생성물 (4 kb)을 SpeI 및 XbaI (상기에서 프라이머 내에 밑줄친 제한 부위)로 소화시키고, pDOW2236에 결찰시켜, tac 프로모터 제어 하의 grpE-dnaKJ 유전자를 함유하는 pDOW2240를 생성시켰다. 플라스미드 pDOW2240을 SpeI 및 HindIII로 소화시키고, 생성된 grpE dnaKJ-함유 4.0kb 단편을 Qiaquick (Qiagen)을 사용하여 겔-정제하고, SpeI 및 HindIII로 또한 소화된 pDOW2247에 결찰시켰다. 만니톨 프로모터 제어 하의 grpE - dnaKJ를 함유하는, 생성된 플라스미드 pDOW3501를 250 ㎍/㎖ 우라실이 보충된 M9 글루코스 플레이트 상에서의 선별에 의해 DC388 내로 형질전환시켰다. 마지막으로, pDOW1426을 상기 균주 (DC462) 내로 전기천공시키고, M9 글루코스 플레이트 상에서 선별하여, 2개의 유도성 플라스미드가 있는 균주 DC463이 생성되었다: 1) Ptac hGH를 보유하는 pDOW1426 및 2) Pmtl grpE - dnaKJ를 보유하는 pDOW3501.
진탕 플라스크 발효, 샘플 수집 및 분석
DC463의 이중 배양물을 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 접종 24시간 후 hGH에 대한 0.1 mM IPTG 및 GrpE-DnaKJ에 대한 0.5％ 만니톨의 첨가에 의해 단백질을 유도시켰다. 샘플을 유도 후 0, 4, 8, 24 및 48시에 수집하였다. 각각의 시점에 대해, 1㎖에 표준화된 OD600 세포 20개를 수확하고, EasyLyse™ (Epicentre (Madison, WI))를 사용하여 용해시키고, 14000rpm에서 30분 동안의 원심분리에 의해 가용성 및 불용성 분획으로 분리하였다. 동일한 부피의 샘플을 BioRad (Hercules, CA) 2× Laemmli 버퍼와 합치고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, 1× 트리스 글리신 SDS 러닝 버퍼 (BioRad)를 사용하여 BioRad 15％ 트리스 HCl 기준 겔 상에 30 ㎕를 로딩하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, Simply Blue Safestain (Invitrogen (Carlsbad, CA))을 사용하여 단백질을 가시화시켰다. 생성된 쿠마시-염색된 겔을 [Molecular Devices Personal Densitometer (Molecular Devices (Sunnyvale, CA))]를 사용하여 스크닝하고, ImageQuant 및 엑셀을 사용하여 분석하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, GrpE, DnaKJ의 동시-과잉발현은 hGH의 용해도를 상당히 증가시켜, 더 낮은 전체 단백질 수율에도 불구하고, 거의 100％의 표적 단백질을 가용성 분획으로 전환시켰다. GrpE DnaKJ가 동시-과잉생산되었을 때, hGH 용해도가 변하긴 했지만 (50-100％ 사이; 데이타는 제시되지 않음), IPTG와 만니톨의 동시 첨가를 사용하여 DC463의 성장 및 유도를 되풀이하는 추가적인 실험은 여기에 제시된 결과와 상당히 유사하였다. 이러한 발견은 전사 프로파일링을 기초로 하는 표적화된 균주 조작으로 재조합 단백질의 용해도 및/또는 수율을 증가시키기 위한 합리적인 균주 디자인에 이를 수 있다는 것을 추가로 나타낸다.
특정 실시양태 및 비-제한적 실시예를 참조로 본 발명이 기술되었다. 본 발명의 다른 실시양태들이 또한 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow Chemical Company <120> Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering <130> 00588.105011 <140> US 11/189,375 <141> 2005-07-26 <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sense primer HslU gene <400> 1 accgaagtcg gctatgtggg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Antisense primer hslU gene <400> 2 aatcgcgctg cacgccttcg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer hslF2 <400> 3 ttcatcaagg tcgaagcg 18 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer hslR2 <400> 4 tcagtcttga ccatgcc 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer M13R <400> 5 caggaaacag ctatgac 17 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer M13F <400> 6 taaaacgacg gccag 15 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> overlap extension primer hslUp <400> 7 gtggcagcca ccaaggctgc 20 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> overlap extension primer hsl middle up <400> 8 cccacattga gtgaggctta caaggggaga gtctccacg 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> overlap extension primer hsl middle down <400> 9 cgtggagact ctccccttgt aagcctcact caatgtggg 39 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> overlap extension primer hsl down <400> 10 ggccaatggt tggccacgcg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> overlap extension primer hsl up up <400> 11 tgccgacgcc acaggtgc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> overlap extension primer hsl down down <400> 12 gcctggtact gcgactcg 18 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer RC199 <400> 13 atatactagt aggaggtaac ttatggctga cgaacagacg ca 42 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer RC200 <400> 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agagccagca attgatcagc 780 gtgtgggagc cgacgcaact ggtggccaac ctgtttgagc aagccttggc gcagcagggc 840 atcaaggtgc tggggcgtcg ggtgatgggc ggggcaagtc ctgctggggt gacggtgctg 900 gccgagcacc aatcggcgcc gttgcaggag ctgatcgtgc cgctgctcaa gctctcgaac 960 aacgccatgt ccgaagccgt gctcaaggcc atgggccgcc agacggccag cagcggcacg 1020 gcggcggcgg gcgccgtggc ggtggccgac tttctcaagc gccaggggct ggacaccagc 1080 gctgtgagcc aagtggacgg ctccggcctg tcgcggcgta acctggtgtc gtcgcaaacc 1140 ctcaccgacc tgctgctggc ggccagcaaa caaccctggt tcgacgcctg gtacaacgcg 1200 ctgccggttg ccggcaatgc cgaccgtatg accggcggca gcctgggtta ccgcctgcgc 1260 ggcacggctg cggaaaataa cctgcatgcc aagaccggct ccatggccgg cgtgtcgtca 1320 ttgagcggtt acatcaccga tgctcacggg cgcaagctgg tgttcgcgat gttgaccaac 1380 aactatgtgg tcgctggcgc gcaggtaaaa gccgtggaaa accgcgtcgc cgtggccctg 1440 tcccacagcg aagactga 1458 <210> 16 <211> 1491 <212> DNA <213> pseudomonas fluorescens <400> 16 atgagtgatc gcaaaaacag ccgcctgatc ctgcccggcc tgatcgccgt caccctgatg 60 gcggccagcg ccgtttactt cttgcgcccc agcgagtcgg tcgccagcca ggccctggac 120 aaggctcaaa cggccagcac cctgcaatcc ctggcggaac tggatggcaa ggcaccgacc 180 aaccgcaagc tcgacgtaca aacctggacc accgccgaag gcgccaaggt gctgttcgtc 240 gaagcccatg agttgccgat gttcgacatg cgcctgctgt tcgccgccgg cagcagccag 300 gatggcgacg tgccaggcct ggcgctgatg accaacgcca tgctcaacga aggcgtgccg 360 ggcaaggacg tcagccagat cgccagtggc ttcgaaggcc tgggggccga ctttggcaac 420 ggcgcctacc gcgacatggc gctggtgacc ctgcgcagcc tgagcgacag cgccaagcgc 480 gacgccgccc tgtcactgtt caaccaggtg atcggccagc cgactttccc ggcagactca 540 ctggcacgca tcaagaacca gatcctggcc ggtttcgagt accagaagca gaaccccggc 600 aaactggcga gcatcgaact gttcaagcgc ctgtacggcg accaccctta cgcacacccg 660 agcgaaggca cccccgagag cgtgccgaag attaccctgg cgcagttgca ggcgttccac 720 gccaaggcct atgcagcggg taacgcggtg attgcagtgg tgggcgacct gacccgcgcc 780 gaagctgaag ccatgacggc caaggtgtcc gcgtcgctgc ccaaaggccc ggctatggcc 840 aagatcgccc agccgaccga gccaaaagcc ggcctgagcc gtatcgagtt cccgtccaag 900 caaacccacc tgctgtttgc gcagttgggc atcgaccgtg ccgacccgga ttacgcagcc 960 ttgtccctgg gtaaccagat cctcggcggc ggtggcttcg gcacccgctt gatgagcgaa 1020 gtgcgtgaaa agcgcggcct gacctacggc gtgtattccg gtttctcacc aatgcaggcg 1080 cgcggcccgt tcatgatcaa cctgcagacc cgcgccgaaa tgagcggtgg caccttgcgc 1140 ctggtggagg acgtactggc tgactacctc aagaccggcc cgacgcaaaa ggaactggat 1200 gacgccaagc gcgagctggc cggcagcttc ccgctgtcca ccgccagcaa cgccgatatc 1260 gtcgggcagt tgggcgccat gggtttctac aacctgccgc tgagctatct ggaagatttc 1320 atgaaacaat cccaggccct gaccgtcgat caggtcaagg ctgcaatgaa taaacacttg 1380 agcgccgaca agatggtcat cgtgaccgcc ggcccgacga ttgcgcaaaa gccactaccg 1440 ccccccactg ataaacctgc cgagcagccg ctcggggttc cggagcatta a 1491 <210> 17 <211> 1110 <212> DNA <213> pseudomonas fluorescens <400> 17 ttgtcgtgga ttgacgcttt cggcaattcc cctgtcgttt ttgcacccgg ctccgtcggt 60 gcctgggcat atgctggccc caaagcgccg gcagacgatt cggcgcatga atcgccaata 120 aggggacgcc tgatgagccc agccgagttg cacgccgaca gcatcgttat cgacggtctg 180 attattgcca agtggaaccg cgacctgttc gaagacatgc gcaaaggtgg cctcaccgcc 240 gccaattgca cggtgtcggt gtgggaaggc ttccaggcca cgatcaataa catcgttgcc 300 agccagaccc tgatccgcga aaacagcgac ctggtgatcc cggtgaaaac caccgccgac 360 atccgccgcg ccaaggagct gggcaagact ggcatcatct tcggcttcca gaatgcccat 420 gcctttgagg accagctcgg ctatgtcgag atcttcaagc agctcggcgt gggcgtggtg 480 cagatgtgct acaacaccca gaacctggtg ggcaccggtt gctacgagcg cgatggcggc 540 ctgtcgggtt tcgggcgtga gatcgtcggc gagatgaacc gcgtcggcat catgtgcgac 600 ctgtcccacg tgggctccaa gaccagcgaa gaggtcatcc tcgaatcgaa aaagccggtg 660 tgctactccc actgtctgcc gtccgggctt aaagagcacc cgcgcaacaa gtccgatgaa 720 gagctgaagt tcatcgccga ccatggcgga tttgtcggtg tgaccatgtt cgcgccgttt 780 ttggccaagg gcatcgactc gactatcgac gactatgccg aagccatcga atacaccatg 840 aacatcgtcg gcgaagacgc catcggcatc ggcaccgact tcacccaggg ccatggccag 900 gatttcttcg aaatgctcac ccatgacaag ggctacgccc gccgcctgac cagcttcggc 960 aagatcatca acccgctggg catccgcacc gtgggtgagt tccccaacct caccgagacc 1020 ctgctcaagc gcggccacag cgagcgcgtg gtgcgcaaga tcatgggcga gaactgggtc 1080 aacgtgctca aggacgtctg gggcgaataa 1110 <210> 18 <211> 1149 <212> DNA <213> pseudomonas fluorescens <400> 18 atgacaattt ggcccagggg gcgaacacag ggctatcctg aaaaccgtta cccggacgtt 60 caccacacgc caaaaaggag ccagctcatg tgtgttcgcc aaccgcgcaa cccgattttt 120 tgcctgatcc cgccgtacat gctcgaccag atcgcacgcc acggcgacaa agcccaacgg 180 gaagtcgcat tacgcacgcg tgccaaggac agcacgtttc gttcgttgcg catggtcgcg 240 gtacccgcca aggggccggc ccgcatggca ctggccgtgg gcgccgagaa gcaacgctcg 300 atctacagtg ccgaaaacac cgacagcctg cccggcaagc tgatccgcgg cgaagggcag 360 cccgccagtg gcgatgccgc ggtggacgaa gcctatgacg gcctgggcgc gaccttcgat 420 ttttttgacc aggtctttga tcgcaattcc atcgacgatg cgggcatggc gctggacgcc 480 acggtgcact tcggccagga ctacaacaat gcgttctgga attcgaccca gatggtgttc 540 ggcgatggcg accagcagtt gttcaaccgc tttaccgtgg cactcgacgt cattgggcat 600 gagttggccc atggcgtgac tgaggatgag gccaagctga tgtacttcaa ccagtccggt 660 gcgctgaacg agtcgttgtc ggacgtgttc ggttcgctga tcaagcagta cgcgttaaag 720 caaacggccg aggatgccga ctggttgatc ggcaaggggt tgtttaccaa aaagatcaag 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ccattgtagg tcgcgttgtg cctgagcatg accccgtcta caaagtgtcg 1320 atcattcctc gtggtcgggc actgggtgtg accatgttcc tgccggaaga agatcgctac 1380 agcctctcca agcgtgcgct gatcagccag atctgctcgc tgtatggcgg tcgtattgct 1440 gaggaaatga cccttggctt cgacggtgtg accactggtg cctccaatga catcatgcgt 1500 gccagccaga tcgcacgaaa catggtgacc aagtggggct tgtcggaaaa actcggccca 1560 ttgatgtacg ccgaagagga aggcgaagtg ttcctggggc gtggcggcgg tgggcaaagc 1620 gccagcttct cgggtgagac agccaagctg atcgactccg aagttcgcag catcattgac 1680 cagtgctatg gcacggccaa gcagattttg actgacaacc gtgacaagct ggacgccatg 1740 gctgatgcgt tgatgaagta cgaaaccatc gatgccgacc agatcgacga catcatggcg 1800 ggccgtacgc cgcgtgagcc gcgcgactgg gaaggtggtt cgggtacttc gggcactccg 1860 cctgtggtgc agaatgagcg ccctgaaacg cctatcggcg gcccggcagc tgatcactaa 1920

Claims (53)

  1. i) 재조합 단백질 또는 펩티드를 재조합 박테리아 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
    ii) 재조합 박테리아 숙주 세포의 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 단백질을 발현하도록 변형되지 않은 박테리아 숙주 세포 또는 이 재조합 단백질을 발현하지 않는 재조합 박테리아 숙주 세포에서보다 더 높은 수준으로 재조합 박테리아 숙주 세포에서 발현되는 프로테아제 또는 폴딩 조정인자 유전자를 확인하는 단계; 및
    iii) 유전자 변형에 의해, 상기 확인된 프로테아제 또는 폴딩 조정인자 유전자의 재조합 박테리아 숙주 세포에서의 발현을 변화시켜, 재조합 단백질의 발현, 활성 또는 용해도 증가를 달성하는 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계
    를 포함하는, 박테리아 숙주 세포에서의 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 개선시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포에서 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 단계;
    (b) 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포의 유전자 프로파일을 분석하여, 재조합 단백질을 발현하도록 변형되지 않은 박테리아 숙주 세포 또는 이 재조합 단백질을 발현하지 않는 재조합 박테리아 숙주 세포에서보다, 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 프로테아제 또는 폴딩 조정인자 유전자를 확인하는 단계;
    (c) 상기 확인된 프로테아제 또는 폴딩 조정인자 유전자의 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포에서의 발현을 변화시켜, 이중으로 변형된 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    (d) 이중으로 변형된 재조합 박테리아 숙주 세포에서 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 확인된 프로테아제 또는 폴딩 조정인자 유전자의 발현을 변화시켜 세포 생존력이 영향을 받을 때까지, 또는 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현이 최대 발현 수준에 도달할 때까지 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 것을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 박테리아 숙주 세포의 유전자 프로파일을 재조합 단백질을 발현하도록 변형되지 않은 박테리아 숙주 세포 또는 이 재조합 단백질을 발현하지 않는 재조합 박테리아 숙주 세포의 유전자 프로파일과 비교함으로써 유전자 프로파일을 분석하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 프로파일이 트랜스크립톰(transcriptome) 프로파일인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제가 프로테아제 자체, 프로테아제의 보조인자, 또는 프로테아제의 발현에 영향을 미치는 세포성 또는 유전적 조정인자(modulator)인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 프로테아제가 D-알라닐-메소-디아미노피멜레이트 엔도펩티다제, 아연 프로테아제, 미세소체 디펩티다제(microsomal dipeptidase), 세포외 메탈로프로테아제 전구체, 세포 분열 단백질 ftsH, 및 유전자 hslV, hslU, clpX, clpA 또는 clpB로부터 유래된 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 확인된 프로테아제 mRNA 수준이 재조합 단백질 또는 펩티드가 박테리아 숙주 세포에서 발현될 때 상향 조절되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 프로테아제에 상응하는 유전자가 박테리아 숙주 세포 게놈으로부터 제거되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴딩 조정인자가 폴딩 조정인자 자체, 폴딩 조정인자의 보조인자, 또는 폴딩 조정인자의 발현에 영향을 미치는 세포성 또는 유전적 조정인자인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 폴딩 조정인자가 샤페론(chaperone) 단백질인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 폴딩 조정인자가 유전자 cbpA, htpG, dnaK, dnaJ, fkbP2, groES 및 groEL의 유전자 생성물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 폴딩 조정인자의 발현이 확인된 유전자, 확인된 유전자의 보조인자, 또는 확인된 유전자의 세포성 또는 유전적 조정인자의 발현을 증가시킴으로써 변화되는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 발현이
    (i) 재조합 단백질 또는 펩티드 양의 증가;
    (ii) 재조합 단백질 또는 펩티드의 증가된 용해도; 또는
    (iii) 재조합 단백질 또는 펩티드의 증가된 활성
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  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 숙주 세포가 슈도모나드(Pseudomonad), 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 세포 또는 대장균(E. coli) 세포인 방법.
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