KR20020065517A - 인터페론 감마 접합체 - Google Patents

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KR20020065517A
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안네 담 젠센
김 빌보르 안데르센
크리스티안 칼스텐 한센
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Abstract

본 발명의 접합체는 IFNG 활성을 나타내고 IFNG 폴리펩티드에 공유적으로 부착된 적어도 한 개의 비-폴리펩티드 부분으로 구성된 접합체에 있어서, 폴리펩티드는 모체 IFNG 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열로 구성되는데, 상이한 점은 비-폴리펩티드 부분에 부착기로 구성된 적어도 한 개의 도입 또는 한 개의 삽입 아미노산 잔기를 가지는 것을 특징으로 한다. 이 접합체는 다양한 질병 치료에 이용될 수 있다.

Description

인터페론 감마 접합체{INTERFERON GAMMA CONJUGATES}
인터페론-감마(IFNG)는 T-임파세포 및 자연 킬러 세포에 의해 생성되는 사이토킨으로써, 비공유적으로 결합된 두 개 폴리펩티드 소단위로 된 동종이량체로 존재한다. 각 이량체의 완성형은 143개 아미노산 잔기(SEQ ID NO 2 참고)로 구성되고, 이의 전구체형에는 시그날 서열을 포함하는 166개의 아미노산 잔기 서열로 구성된다(SEQ ID NO 1 참고).
각 소단위는 25 및 97 위치에 두 개의 N-글리코실화반응이 가능한 부위를 포함한다(Aggarwal et al., Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992). 글리코실화반응 정도에 따라, 이량체 형의 IFNG 분자량 범위는 34-50kDa(Farrar et al., Ann, Rev. Immunol, 1993, 11:571-611)가 된다.
Gary et al.(Nature 298:859-863, 1982), Taya et al.(EMBO J. 1:953-958, 1982), Devos et. al.(Nucleic Acids Res. 10:2487-2501, 1982), Rinderknecht et al. (J. Bol. Chem. 259:6790-6797, 1984) 및 EP 77670, EP 89676, EP 110044에서야생형 사람 IFNG(huIFNG)의 1차 서열에 대해 보고된 바 있다. huIFNG의 3D 구조는 Ealick et al.(Science 252:698-702, 1991)에 의해 보고된 바 있다.
다양한 자연 발생 또는 돌연변이된 IFNG 소단위 폴리펩티드형에 대해서도 보고된 바 있는데, 예를 들면, SEQ ID NO 2에 대해 위치 (-3)~(-1)에 Cys-Tyr-Cys N-말단 아미노산 서열을 포함하는 것; SEQ ID NO 2에 대해 위치(-1)에 N-말단 메티오닌이 포함된 경우; 127-134개 아미노산 잔기로 구성된 다양한 C-말단 절두형 등이 포함된다. IFNG 분자의 활성에 변화를 주지 않고, C-말단으로부터 1-15개 아미노산 잔기를 제거할 수도 있는 것으로 알려진 바 있다. 또한, huIFNG C-말단의 이형성에 대해서도 Pan et al.(Eur. J. Biochem. 166:145-149, 1987)에서 설명된 바 있다.
Slodowski et al.,(Eur. J. Biochem. 202:1133-1140, 1991), Luk et al.,(J. Biol. Chem. 265:13314-13319, 1990), Seelig et al.,(Biochemistry 27:1981-1987, 1988), Trousdale et al.,(Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 26:1244-1251, 1985), EP 146354 등은 HuIFNG 뮤테인에 대해 보고한 바 있다. Nishi et al.,(J. Biochem. 97:153-159, 1985)은 자연 huIFNG 변이체에 대해 보고한 바 있다.
US 6,046,034에서는 이황화 결합을 형성할 수 있도록 하는 시스테인을 최고 4쌍 삽입시키면, 이량체형 IFNG 변이체를 안정화시켜, 열에 안정한 재조합 huIFNG(rhuIFNG) 변이체에 대해 설명하였다.
WO 92/08737에서는 야생형 사람 IFNG의 전체(잔기 1-143) 또는 일부(1-132)의 N-말단에 메티오닌을 추가하는 것으로 구성된 IFNG 변이체에 대해 설명하였다.EP 219 781에서는 SEQ ID NO 2의 아미노산 잔기 3-123로 구성된 부분적인 huIFNG 서열에 대해 설명하였다. US 4,832,959에서는 SEQ ID NO 2와 비교하였을 때 세 개 추가 N-말단 아미노산 잔기(CYC)를 가지는 아미노산 서열 1-127, 5-146, 5,127 잔기로 구성된 부분적인 huIFNG 서열에 대해 설명하였다. US 5,004,689에서는 3개 N-말단 아미노산 잔기 CYC가 없는 huIFNG를 인코드하는 DNA 서열에 대해 설명하고,E. coli에서 이를 발현시키는 것에 대해서도 보고한 바 있다. EP446582에서는E. coli가 N-말단 메티오닌이 없는 rhuIFNG를 생산한다고 설명한 바 있다. US 6,120,762에서는 SEQ ID NO 2에 대해 이의 아미노산 잔기 95-134로 구성된 huIFNG의 펩티드 단편에 대해 설명하였다.
Wang et al.(Sci.Sin. B 24:1076-1084, 1994)은 다량으로 발현되는 rhuIFNG에 대해 보고한 바 있다.
Curling et al.(Biochem. J. 272:333-337, 1990), Hooker et al.,(J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18:287-295)은 rhuIFNG에서 글리코실화반응 변이에 대해 보고한 바 있다.
Kita et al.(Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990) 및 EP 236987, US 5109120에서는 rhuIFNG의 폴리머-변형에 대해 보고한 바 있다.
WO 92/22310는 인터페론의 아시알로 당단백질 접합체 유도체인 인터알리아(interalia) huIFNG에 대해 설명한 바 있다.
IFNG 융합 단백질에 대해서도 설명된 바 있다. 예를 들면, EP 237019에서는 인터페론 β활성을 가지는 부분과 IFNG 활성을 가지는 부분으로 된 단일 쇄 폴리펩티드에 대해 설명하였다. EP 158 198에서는 IFNG 활성을 나타내는 부분 및 IL-2 활성을 나타내는 부분으로 구성된 단일 쇄 폴리펩티드에 대해 설명하였다. 몇몇 문헌에서는(예를 들면, Landar et al.(J. Mol. Biol., 2000, 299:169-179)) 단일 쇄 이량체 IFNG 단백질에 대해 설명하고 있다.
WO 99/02710에서는 이들중 한 예로써 IFNG 단일 쇄 폴리펩티드에 대해 설명하고 있다. WO 99/03887에서는 생장 호르몬 슈퍼패밀리에 속하는 PEG화된 폴리펩티드 변이체에 대해 설명하고 있는데, 이때 폴리펩티드의 특정 부분에 위치한 비-필수 아미노산 잔기는 시스테인 잔기로 치환되었다. 생장 호르몬 슈퍼패밀리 구성원의 한 예로써 IFNG가 언급된 바 있으나, IFNG의 변형에 대해서 상세히 언급된 바 없다.
Ziesche et al.(N. Engl. J. Med. 341:1264-1269, 1999 and Chest 110:Suppl:255, 1996) 및 EP 795332에서는 IFNG를 간질성 폐 질환(간질성 폐 섬유증으로도 알려짐(IPF))의 치료에 이용할 수 있다고 제안한 바 있는데, 이 목적으로 프레드니졸렌(prednisolone)과 함께 이용될 수 있다. IPF에 추가하여, 육아종증(Bolinger et al, Clinical Pharmacy, 1992, 11:834-850), 특정 미코박테리아 감염(N. Engl. J. Med. 330:1348-1355, 1994), 신장 암(J. Urol. 152:841-845, 1994), 골다공증(N. Engl. J. Med. 332:1594-1599, 1995), 피부 경화증(J. Rheurnatol. 23:654-658, 1996), 간염 B(Hepatogastroenterology 45:2282-2294, 1998), 간염 C(Int. Hopatol. Communic. 6:264-273, 1997), 폐혈증 쇼크(Nature Medicine 3:678-681, 1997), 류마티스 관절염등을 IFNG을 이용하여 치료할 수도 있다.
일부 바이러스 감염 및 종양에 대해 제약학적 화합물로써 rhuIFNG을 성공적으로 이용하였기 때문에, 비경구적으로 적절하게는, 피하 주사를 통하여 rhuIFNG를이용할 수 있다. 몇 시간 후에는 최대 혈장 농도에 도달하는데, 혈장에서의 반감기는 iv 투여후 30분 정도가 된다. 이와 같은 이유로 rhuIFNG를 이용하여 효과적으로 치료하기 위해서는 빈번하게 주사를 해야 한다. 주요 부작용은 열, 오한, 발한, 두통, 근육통 및 졸음등이 있다. 이와 같은 부작용은 rhuIFNG 주사와 연관이 있는데, 주사후에 처음 몇시간내에 관찰되는 증상이다. 드문 증상으로는 국소 통증, 홍반, 간 효소의 상승, 가역적인 과립구감소증 및 트롬빈 감소증 및 심장독등이 있다.
huIFNG 또는 rhuIFNG와 비교하였을 때, 약물 동력학, 균질성, 면역성 및 다른 부작용에 대해 개선된 성질을 가지는 IFNG-활성을 가지는 새로운 분자를 제공하는 것이 바람직하다.
발명의 간단한 설명
본 출원은 상기에서 언급된 한 가지 이상의 바람직한 장점을 제공하는 개선된 IFNG 형 분자에 대해 설명한다. 첫 번째 측면에서, 본 발명은 IFNG 활성을 나타내는 접합체에 관한 것으로, 접합체는 비-폴리펩티드 부분과 폴리펩티드 부분으로 구성되는데, 제 1 비-폴리펩티드 부분은 IFNG 폴리펩티드에 공유적으로 결합되고, 폴리펩티드 부분은 모체 IFNG 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열로 구성되는데, 이때 상이한 부분은 비-폴리펩티드 부분에 부착용 기로 구성된 적어도 한 개의 도입된 또는 제거된 아미노산 잔기로 구성된다는 것이다. 접합체는 huIFNG 및 rhuIFNG와 비교하였을 때in vivo에서 반감기가 연장되었고, 선택적으로는 rhuIFNG와 비교하였을 때, 감소된 면역 반응을 일으킬 수도 있다. 선택적으로 분자는 상동성 분자 생산에 있어서 추가 개선된 성질을 가지고, 단백질 분해작용에 대해 안정성이 증가되고 생체 이용성이 개선된 성질을 추가로 가질 수 있다.
결과적으로, 본 발명의 접합체는 현재 이용할 수 있는 IFNG 분자에 비하여 여러 가지 장점을 제공하는데, 예를 들면, 주사 주기(또는 다른 투여 수단과의 주기)를 더 연장시킬 수 있으며, 부작용을 줄이고, 항체가 감소하기 때문에 치료효율이 증가되는 것 등이 있다. 또한, 활성 단백질의 약량이 증가되어, 본 발명의 접합체를 이용하면, 좀더 효과적인 치료 반응을 얻을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IFNG 활성을 가지는 접합체에 관한 것으로, 이 접합체의 구성은 적어도 한 개의 N-말단 PEG화된 IFNG 폴리펩티드로 구성된다. IFNG 폴리펩티드는 huIFNG 또는 여기에서 설명하는 IFNG 폴리펩티드중 임의의 것이 될 수도 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체, 이의 뉴클레오티드 서열, 이의 발현 백터 및 폴리펩티드 또는 접합체를 준비하는 방법 및 수단에 관계한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 접합체로 구성된 치료요법적 조성물, 치료요법에 이용할 수 있는 본 발명의 접합체 또는 조성물, 치료요법에 이를 이용하는 방법, 질병 치료용 약물의 제조 방법에 관계한다.
마지막으로, 본 발명은 약물, 제약학적 조성물을 조제하기 위해 특정 IFNG 접합체를 이용하는 것, 간질성 폐 질환, 암, 감염 및 염증성 질환 치료용 키트, 간질성 폐질환의 경우에 선택적으로 글루코코티코이드와 복합하여 이용할 수 있다는 것에 관계한다.
본 발명은 인터페론-감마형 활성을 가지는 접합체, 이를 준비하는 방법, 이 분자로 구성된 제약학적 조성물 및 질병을 치료하는데 이와 같은 제약학적 조성물을 이용하는 것에 관한다.
정의
본 출원 및 발명에서 다음의 정의를 적용할 수 있다;
접합체("conjugate") 또는 접합된 폴리펩티드는 이형성(조성 및 키메라 의미에서) 분자로써, 한 개이상의 비-폴리펩티드 부분에 한 가지 이상의 폴리펩티드를 공유적으로 부착시켜 만들 수 있다. 공유적으로 부착시킨다는 의미는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분을 직접적으로 서로 공유결합시키거나 중개 부분 예를 들면, 연결 다리, 스페이스 또는 연결 부분등을 통하여 간접 공유결합으로 서로 연합된다는 것을 의미한다. 바람직하게는 접합체는 관련 농도 및 조건하에서 가용성을 띄는데, 예를 들면, 혈액과 같은 생리적인 유체에서 가용성이다. 본 발명의 접합된 폴리펩티드의 예로는 글리코실화된 또는 PEG화된 폴리펩티드가 포함된다. "비-접합된 폴리펩티드"란 접합체의 폴리펩티드 부분을 말하는 것이다.
"비-폴리펩티드 부분"은 IFNG 폴리펩티드의 부착기에 결합할 수 있는 분자를 나타내는 것으로써, 이와 같은 분자로는 예를 들면, 폴리머 분자, 친지성 분자, 당 부분 또는 유기적 유도화된 물질등이 포함될 수 있다. 본 발명의 접합체 설명에 이용되는 경우에는 비-폴리펩티드 부분은 폴리펩티드의 부착기를 통하여 접합체의폴리펩티드 부분에 연결된 것으로 이해하면 된다.
"폴리머 분자"는 두 개 이상의 단량체가 공유 결합되어 형성된 분자를 말하는 것으로 이때 단량체는 아미노산 잔기는 아니지만, 예외적으로 폴리머가 사람의 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질인 경우에는 아미노산 잔기가 될 수도 있다. "폴리머"는 "폴리머 분자"와 서로 혼용할 수 있다. "당 부분"은in vivo및in vitro글리코실화반응 예를 들면, N- 또는 O- 글리코실화반응에 의해 부착된 탄수화물 분자를 말하는 것이다. 접합체에서 폴리머 분자와 같은 비-폴리펩티드 부분의 숫자가 분명히 명시된 경우를 제외하고는 본 발명에서 언급하는 접합체에 포함된 "비-폴리펩티드 부분"은 한 개 또는 그이상의 비-폴리펩티드 부분이 되는 것으로 이해하면 된다.
"부착기"는 고분자 부분 또는 당 부분과 같은 관련된 비-폴리펩티드 부분에 결합할 수 있는 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 유용한 부착기 및 이와 짝을 이루는 비-폴리펩티드 부분은 다음의 표에서 분명하게 파악할 수 있을 것이다.
부착기 아미노산 비-폴리펩티드부분의 예시 접합 방법/dPEG 활성화 참고문헌
-NH2 N-말단, Lys 고분자,- PEG mPEG-SPATresylatedmPEG Shearwater IncDelgado et al.,Critical reviewsin TherapeuticDurg CarrierSystems9(3,4):249-304(1992)
-CHOOH C-말단, Asp,Glu 고분자,- PEG당 부분 mPEG-HzIn vitro결합 Shearwater Inc
-SH Cys 고분자, -PEG,당 부분 PEGvinylsulphonePEG-maleimidein vitro결합 Shearwater IncDelgado et al,critical reviewsin TherapeuticDurg CarrierSystem9(3,4):249-304(1992)
-OH Ser,Thr, OH-Lys 당 부분 in vivo O-연결된 글리코실화반응
-CONH2 N-글리코실화반응의 일부분으로 Asn 당 부분 in vivo글리코실화 반응
방향족 기 Phe, Tyr, Trp 당 부분 in vitro결합
-CONH2 Gln 당 부분 in vitro결합 Yan and Wold,Biochemistry,1984,Jul 31;23(16):3759-65
알데히드(Aldehyde)케톤(Ketone) 산화된 카르보하이드레이트 고분자- PEG.PEG-하이드라지드 PEG화반응 Andresz et al.,1978, Makromol.Chem.179:302;WO 92/16555WO 00/23114
구아니디노(Guanidino) Arg 당 부분 in vitro결합 Lundblad andNoyes, ChimicalReagents forProteinModification,CRE Press Inc.Boca Raton, FI
Imidazole ring His 당 부분 in vitro결합
in vivo글리코실화반응의 경우에, "부착기"는 N-글르코실화된 부위를 구성하는 아미노산 잔기를 나타내기 위해 자유로운 방식으로 이용되는데(서열 N-X'-S/T/C-X"의 경우에, X'는 프롤린을 제외한 임의 아미노산 잔기를 나타내고, X"는 X'와 동일하거나 다른 임의 아미노산 잔기를 나타내는데, 바람직하게는 프롤린과는 다르며, N은 아스파라진, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인을 나타내고, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌을, 가장 바람직하게는 트레오닌이 된다. N-글리코실화 부분의 아스파라진 잔기는 글리코실화반응 동안 당 부분에 부착되는 것이나, N-글리코실화반응의 다른 아미노산 잔기가 존재해야만 이와 같은 부착이 이루어질 수 있다. 따라서, 비-폴리펩티드 부분이 당 부분이고, 접합체가 N-글리코실화반응에 의해 얻어지는 경우에, 모체 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형과 관련하여 이용된 경우에 "비-폴리펩티드 부분에 부착용기로 구성된 아미노산 잔기"는 기능을 하는 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열내로 도입되거나 제거될 수 있도록 N-글리코실화반응 부분을 구성하는 아미노산 잔기중 한 개, 두 개 또는 모두 변경된다는 것으로 이해해야 한다.
본 발명에서, 아미노산 이름 및 원자 이름(가령, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C)는 Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)에서 정의한 것을 이용하고 있는데, 이는 IUPAC 명명법(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(residue names, atom narnes etc.) 및 Eur. J. Biochem. 138, 9-37(1984)과 이의 교정본(Eur. J. Biochem. 152, 1(1985))을 기초로 한 것이다. 가끔, CA는 Cα로, CB는 Cβ로 언급되기도 한다. "아미노산 잔기"는 다음에 속하는 아미노산잔기를 언급하기 위한 것이다; 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파라틱산(Asp 또는 D), 글루타민산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(Gly 또는 G), 시스티딘(His 또는 H), 이소루이신(Ile 또는 I), 리신(Lys 또는 K), 루이신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라진(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Glu 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Vla 또 는 V), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y). 이 문헌에서 아미노산 잔기의 번호는 시그날 펩티드(SEQ ID NO 2)없이, huIFNG의 N-말단부터 헤아린다. 아미노산 위치 및 치환체를 확인하는데 이용되는 용어는 다음과 같이 설명할 수 있다; N25(SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 서열에 있는 아스파라진이 차지하는 위치 #25를 나타냄); N25C(위치 25의 Asp 잔기가 Cys으로 치환된 것을 나타냄). 다중 치환체는 "+"로 나타내는데, 예를 들면 Q1N+P3T/S는 위치 1의 글루타민이 아스파라진으로 치환되었고, 3번 위치에 있는 Pro이 Thr 또는 Ser로 치환되었는데, 적절하게는 Thr로 치환되었다는 것을 말한다.
"뉴클레오티드 서열"은 두 개 이상의 뉴클레오티드 분자의 연속 범위를 나타내는 것이다. 뉴클레오티드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 오리진 또는 이들의 임의 복합 부분이 될 수도 있다.
"폴리메라제 사슬 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 일반적으로in vitro에서 원하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는데 이용되는 방법을 말하는 것으로써, US 4,683,195에서도 설명하고 있다. 일반적으로, PCR 방법은 주형 핵산에 선호적으로 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 프라이머 연장 합성 과정을 반복하는 것이다.
"세포", "숙주세포", "세포주", "세포 배양물"은 서로 상호 혼용할 수 있으며, 이들 용어는 세포의 생장 또는 배양으로 인하여 생성된 후손이 포함되는 것으로 이해해야 한다. "형질변환" 또는 "트렌스펙션"은 세포안으로 DNA를 도입하는 공정을 말하는 것으로 혼용하여 사용한다.
"작용할 수 있도록 연결된"이란 효소에 의해 두 개 또는 그이상의 뉴클레오티드 서열이 공유적으로 결합하는 것으로, 이때 서로에 대해 서열이 정상적으로 기능 할 수 있도록 연결된 것을 말한다. 예를 들면, 프리-서열(presequence) 또는 분비-리더(secretory leader)를 인코드하는 뉴클레오티드가 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 "작용할 수 있도록 연결"되었다는 것은 폴리펩티드 분비에 참여하는 프리-프로테인으로 발현될 수 있다는 것을 말하는 것이다; 프로모터 또는 인헨서가 코딩 서열에 작용할 수 있도록 연결되었다는 것은 서열의 전사에 영향을 줄 수 있다는 것을 말하고; 리보솜 결합 부위에 코딩 서열이 작용할 수 있도록 연결되었다는 것은 해독을 실행할 수 있도록 위치하였다는 것을 의미한다. 일반적으로 "작용할 수 있도록 연결된"이란 연결된 뉴클레오티드 서열이 접촉성이라는 것을 말하고, 분비 리더의 경우에는 리딩상에서 접촉성이라는 것을 말한다. 통상의 제한효소 부분에서 결찰에 의해 연결이 이루어진다. 이와 같은 부위가 존재하지 않는 경우에는 표준 재조합 DNA 방법과 병행하여, 합성된 올리고뉴클레오티드 어뎁터 또는 링커가 이용될 수 있다.
"도입하다"란 기존의 아미노산 잔기를 치환한다는 것을 의미하나, 추가 아미노산 잔기를 삽입한다는 의미가 될 수도 있다. "제거하다"는 또다른 아미노산 잔기와 제거될 아미노산 잔기의 치환을 의미하나, 제거될 아미노산 잔기의 결손(치환없이)을 의미할 수도 있다.
"비-폴리펩티드 부분 부착용으로 구성된 아미노산 잔기"는 아미노산 잔기가 비-폴리펩티드 부분에 결합하거나(도입된 아미노산 잔기의 경우) 또는 결합된(제거된 아미노산 잔기의 경우) 경우를 말한다.
"한가지 차이" 또는 "다르다"는 의미는 여기에서 설명하는 IFNG 폴리펩티드의 아미노산 서열을 설명하는데 이용되는 것으로, 차이가 나는 부분이 추가로 존재한다는 것을 말하는 것이다. 따라서, 명시된 아미노산 차이에 추가하여, 명시된 아미노산 잔기이외에 다른 아미노산 잔기가 돌연변이 될 수도 있다는 것을 의미한다.
"in vivo기능상 반감기"는 통상적인 의미로는 접합체 분자의 50%가 제거되기 전에 혈장 또는 혈류내 순환하는 시간을 의미하거나 접합체의 주어진 기능의 50%가 유지되는 시간을 말한다. 폴리펩티드 또는 접합체는 정상적으로는 망상내피세포시스템(RES), 신장, 비장 또는 간중 한가지 이상의 작용에 의해 또는 특정한 또는 불특정 단백질분해에 의해 제거된다. 정상적으로는 제거되는 정도는 크기(사구체 여과에의한 걸러지는 범위에 따라), 전하, 부착된 탄수화물 사슬 및 단백질에 대한 세포 수용체 존재여부에 따라 달라진다. 보유되는 기능성이란 항-바이러스, 항증식성, 면역 조절 또는 IFNG 수용체 결합 활성중에서 선택될 수 있다.in vivo기능상 반감기는 "방법" 단락에서 설명하게 될 당 분야에 공지된 임의 방법에 의해결정할 수 있다.
"in vivo상에서 기능상 반감기의 증가"는 접합체의in vivo기능상 반감기가 기준 분자 가령, huIFNG의 반감기, 선택적으로는 글리코실화된 형태와 비교하여(필적할 수 있는 조건하에서 측정하였을 때), 비-접합된 huIFNG 또는 rhuIFNG에 비하여 통계학적으로 유의성이 있는 수준에서 기능상 반감기가 증가된 것을 말한다.
주어진 물질과 연관하여 "면역원성"이란 용어는 사람 면역계로부터 반응을 유도할 수 있는 물질의 능력을 말하는 것이다. 면역 반응은 세포 또는 항체 중개된 반응(면역원성에 대한 추가 정의는 Roitt: Essential Immunology(8thEdition, Blackwell)를 참고한다)에 의한 것이다.
"감소된 면역원성"은 본 발명의 접합체가 필적할 수 있는 조건하에서 측정하였을 때, huIFNG 및 rhuIFNG와 같은 기준 분자보다 상당히 낮은 면역 반응을 일으키는 것을 말하는 것이다.
"IFNG 활성을 나타낸다"란 폴리펩티드가 IFNG의 한 가지 이상의 고유 기능을 가진다는 것을 말하는 것으로, 특히 huIFNG 또는 rhuIFNG가 IFNG 수용체에 결합할 수 있는 능력과in vitro또는in vivo(in vitroorin vivo생활성)에서 측정하였을 경우에, 수용체가 huIFNG 결합시에 변환되는 시그날 변환의 원인이 되는 기능등이 포함된다. IFNG 수용체는 Agues. et. al.(Cell 55:273-280, 1988) 및 Calderon et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4837-4841, 1988)에서 설명하고 있다."IFNG 폴리펩티드"는 IFNG 활성을 나타내는 폴리펩티드로써, 이는 단량체 또는 이량체형의 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 특정 치환이 있는 경우에, 이들은 정상적으로 IFNG 폴리펩티드 단량체에 관한 것이다. 본 발명의 접합체의 IFNG 부분을 말하는 경우에, 통상 이량체형(따라서, 여기에서 설명하는 변형된 두 개 IFNG 폴리펩티드 단량체로 구성된다)이다. 이량체형 IFNG 폴리펩티드는 두 개 단량체가 통상적으로 연합되거나 단일 쇄 이량체형 IFNG 폴리펩티드를 만드는 경우를 말한다.
여기에서 설명하는 IFNG는 huIFNG 또는 rhuIFNG와 동일한in vivo또는in vitro활성을 가지거나 이보다 낮거나 높을 수도 있는데, 예를 들면, 동일한 조건하에서 측정하였을 경우에, huIFNG 또는 rhuIFNG와 비교하였을 때, 1~100%in vivo또는in vitro활성을 가진다; 예를 들면, huIFNG 또는 rhuIFNG 활성의 1-25% 또는 1-50% 또는 25-100% 또는 50-100% 활성을 가진다는 것이다.
"모체 IFNG"는 본 발명에 따라 변형되어야 할 분자를 말하는 것이다. 정상적으로 뉴클레오티드에 의해 인코드되는 모체 IFNG는 본 발명 접합체의 폴리펩티드 부분을 인코드하기 위해 본 발명의 방법에 따라 변형된다. 모체 IFNG는 보통 huIFNG 또는 rhuIFNG 또는 이의 변이체 또는 단편이 된다. "변이체"는 모체 폴리펩티드 서열에서 한 개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드를 말하는데, 보통, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기가 다르다. 단편은 IFNG 활성을 나타내는 전장 huIFNG의 일부분으로 C-말단 또는 N-말단 절두된 것을 말하는 것이다.
"기능을 하는 부위"는 IFNG의 기능 또는 작업에 관여하는 필수적인 한 개 이상의 아미노산 잔기를 말하는 것이다. 이와 같은 아미노산 잔기가 기능을 하는 부위에 "위치"한다. 기능을 하는 부위는 당분야에 공지된 방법으로 찾을 수 있는데, 바람직하게는 IFNG 수용체와 같은 관련 수용체와 복합된 폴리펩티드의 구조를 분석하여 확인할 수 있다.
본 발명의 접합체
상기에서 언급한 바와 같이, 제 1 측면에서 본 발명은 IFNG 활성을 나타내는 접합체에 관한 것으로, 접합체는 IFNG에 공유적으로 부착되는 적어도 한 개의 비-폴리펩티드 부분과 모체 IFNG 폴리펩티드와는 다른 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드로 이루어지는데, 이때, 모체와 다르다는 의미는 비-폴리펩티드 부분에 부착을 위한 부착기를 포함하는 적어도 한 개의 도입된 아미노산 잔기가 있거나 아미노산 잔기가 제거되었다는 것을 말한다.
선택된 비-폴리펩티드 부분에 더 잘 접합할 수 있도록 분자를 만들고, 접합 패턴(가령, IFNG 폴리펩티드 표면상에 비-폴리펩티드 부분을 최적 분포시키기 위한)을 최적화시켜, 현재 이용할 수 있는 huIFNG 또는 rhuIFNG와 비교하였을 때, IFGN 활성을 가지면서 동시에 한가지 이상의 개선된 성질을 가지는 새로운 접합체 분자를 얻기 위해, 비-폴리펩티드 부분 부착용기로 구성된 아미노산 잔기를 제거하거나 도입함으로써, 폴리펩티드를 특이적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 부착기를 도입함으로써, IFNG 폴리펩티드를 부스터시키거나 관련 비-폴리펩티드 부분에 결합되는 특정 아미노산 잔기의 내용물을 변경시킴으로써, 좀더 효과적이고 특이적인 강한 접합체를 얻을 수 있다. 한 개 이상의 부착기를 제거함으로써, 폴리펩티드의 일부분에 비-폴리펩티드 부분이 접합되는 것을 피할 수도 있는데 이때, 폴리펩티드의 기능 부분에 위치한 또는 인접한 아미노산 잔기에 비-폴리펩티드 부분이 부착하는 경우는 바람직하지 못한데 그 이유는 이와 같은 부위에서 접합이 일으나는 경우에 수용체 인자가 손상됨으로써 생성된 접합체의 IFNG 활성이 없어지거나 감소되는 결과를 초래할 수 있기 때문이다. 또한, 이와 같은 부착기에 이형성 접합이 일어나지 않도록 하기 위해 또 다른 부착기에 근접해 있는 부착기를 제거하는 것도 유익한 방법이 될 수 있다. 적절한 구체예에서는 IFNG 폴리펩티드의 한 개 이상의 아미노산 잔기를 변경시키는데, 이와 같은 변경에는 선택된 비-폴리펩티드 부분에 부착하기 위한 부분으로 구성된 아미노산 잔기 제거 뿐만 아니라 도입도 포함된다. 이와 같은 구체예는 비-폴리펩티드 부분이 최적 상태로 접합될 수 있도록 IFNG 폴리펩티드를 특별히 디자인할 수 있다는 가능성이 포함되어 특별히 주목을 받고 있다.
아미노산 잔기의 제거 또는 도입하는 것 이외에, 폴리펩티드는 비-폴리펩티드 부분에 부착용 기로 구성된 도입 또는 제거용 아미노산 잔기와는 연관이 없는 다른 치환체로 구성될 수 있다.
본 발명에 따라 변형될 모체 폴리펩티드는 IFNG 활성을 가지는 폴리펩티드일 수 있고, 따라서, 사람 포유류 기원이 아닌 임의 기원으로부터 유도될 수 있으나, 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO 2에서 나타낸 아미노산 서열을 가지는 huIFNG이 바람직하고, 또는 이의 변이체 또는 단편이 되는 것이 바람직하다. huIFNG의 변이체를예로 들면 상기 본 발명의 배경 부분에서 설명한 바 있는데, N-말단에 CYC를 가지는 huIFNG, US 4,046,034에서 설명하는 시스테인 변형된 변이체등이 포함된다. 단편의 특정 예로는 상기 본 발명의 배경 부분에서 설명된 것과 같이, 1-15개 아미노산 잔기를 가지는(예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 아미노산 잔기를 가지는) huIFNG C-말단 절두형이 포함되고, 1~3개 아미노산 잔기를 가지는 N-말단 절두형이 포함된다.
모체 IFNG 폴리펩티드는 huIFNG의 변이체 또는 단편으로 이와 같은 모체에서 준비된 변형 IFNG 폴리펩티드는 모체의 돌연변이 또는 절두형으로 구성된다는 것을 알 수 있을 것이다.
또한, 모체 IFNG 폴리펩티드는 IFNG 폴리펩티드 단량체와 하이브리드 분자에 도입된 한 개 또는 그이상의 추가 치환체를 선택적으로 포함하는 다른 상동성 폴리펩티드사이에 하이브리드 분자가 될 수 있다. 이와 같은 하이브리드는 상기 본 발명의 배경 부분에서 설명하였다. 이와 같은 하이브리드에는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 서열과는 10개 이상의 아미노산 잔기 또는 15개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명에 이용할 수 있도록 하기 위해서는 하이브리드 분자는 IFNG 활성을 보유해야 한다.
사람에서 기인된 것이 아닌 모체 IFNG는 여기에서 설명한 것과 유사한 방식으로 변형될 수 있은데, 예를 들면, 사람에서 기인된 것이 아닌 모체 IFNG의 상응하는 부위를 여기에서 설명하는 위치로 변형(huIFNG와 비-인체 IFNG의 아미노산 서열 또는 3D 구조를 배열하여 결정할 수 있음)할 수 있다.
비-폴리펩티드 부분 부착용으로 구성된 아미노산 잔기(도입 또는 제거용)는 선택된 비-폴리펩티드 부분의 성질에 근거하여 선택되는데, 대부분의 경우에, 사용되는 접합 방법에 근거하여 선택한다. 예를 들면, 비-폴리펩티드 부분이 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥시드 유도된 분자와 같은 고분자인 경우에, 부착기로써 기능을 할 수 있는 아미노산 잔기는 시스테인, 리신, 아스프라트산, 글루타민산 및 아르기닌에서 선택될 수 있다. 비-폴리펩티드 부분이 당부분인 경우에는 부착기는in vivo글리코실화반응 부위, 적절하게는 N-글리코실화반응 부위가 된다.
비-폴리펩티드 부착용 부착기가 본 발명에 따라 IFNG 폴리펩티드에 도입되거나 제거될 경우에, 변형될 폴리펩티드 위치는 다음과 같이 편리하게 선택할 수 있다;
IFNG 폴리펩티드의 표면에 위치하는 것이 바람직한데, 좀더 적절하게는 용매에 노출된 측쇄의 25%이상을 가지는 아미노산 잔기가 차지하거나, 좀더 바람직하게는 용매에 노출된 측쇄의 50%이상을 가지는 아미노산 잔기가 차지하고 있는 것이 좋다(이량체형의 IFNG 3D 또는 모델을 기초하여 결정할 수 있고, 구조 또는 모델은 한 개 또는 두 개의 IFNG 수용체 분자로 구성될 수 있다). 이와 같은 위치(예를 들면 수용체 분자 유무와 상관없이 25%이상 또는 50%이상의 표면 노출을 나타내는)는 본 발명의 재료 및 방법 단락에서 언급하고 있다.
또한, 흥미로운 것은 모체 IFNG의 23개 C-말단 아미노산 잔기중 임의의 것을 변형시키는 것인데(비-폴리펩티드 부분 부착용 기로 구성된 아미노산 잔기를 도입하거나 제거함으로써 변형시킬 수 있음), 그 이유는 IFNG 폴리펩티드의 표면에 이와 같은 잔기가 위치하는 것으로 보여지기 때문이다.
또한, 본 발명의 접합체 IFNG 폴리펩티드 부분에서, IFNG의 수용체-결합 부위에 위치한 부착기를 제거할 수 있으며, 바람직하게는 이와 같은 부착기로 구성된 아미노산 잔기로 치환시켜 제거할 수도 있다. IFNG 수용체 결합 부위의 아미노산 잔기는 하기에서 설명하는 재료 및 방법 단락에서 확인할 수 있다. 단일 쇄 IFNG 폴리펩티드의 경우에, 단량체중 하나에서 수용체-결합 부위에 있는 부착기를 제거하여, 활성이 있는 수용체 결합 부분과 활성이 없는 부위를 가지는 단일 쇄 IFNG 폴리펩티드 접합체를 얻는 것으로도 충분하다.
부착기의 최적 분포를 결정하기 위해, IFNG 이량체 폴리펩티드의 3D 구조에 기초하여 IFNG 폴리펩티드의 표면상에 위치한 아미노산 잔기간에 거리를 계산할 수 있다. 좀더 구체적으로, 이와 같은 부착기로 구성된 아미노산 잔기의 CB간에 거리 또는 아미노산 잔기의 기능기(리신의 경우 NZ, 아스파르트산의 경우에는 CG, 글루타민산의 경우 CD, 시스테인의 경우 SG)와 부착기로 구성된 또 다른 아미노산 잔기의 CB간에 거리를 측정하였다. 글리신의 경우에, CA는 CB 대신에 사용된다. 본 발명 접합체의 일부 IFNG 폴리펩티드에서, 거리가 8Å이상, 특히 10Å은 되어야 이형성 접합을 피하거나 줄일 수 있다.
또한, IFNG 폴리펩티드의 아미노산 서열은 모체 IFNG 폴리펩티드와는 다를 수 있는데, 이때, 에피토프를 파괴하거나 불활성화시키기 위해, 비-폴리펩티드 부분 부착용기로 구성된 아미노산에 치환시킴으로써, 에피토프의 일부를 구성하는 한 개 이상의 아미노산 잔기를 제거할 수 있다. huIFNG 또는 rhuIFNG의 에피토프는당분야에 에피토프 메핑과 같은 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다(Romagnoli et. al., Biol Chem, 1999, 380(5):553-9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11-20, Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3):229-35, Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77-81, and Land DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71). 한 가지 방법은 9개 아미노산 잔기의 무작위 올리고펩티드를 발현시키는 파아지 디스플레이 라이브러리를 만드는 것이다. huIFNG 또는 rhuIFNG에 대한 특이적인 항혈청으로부터 면역침전법을 이용하여, IgGl 항체를 정제하고, 활성 파아지는 면역블랏팅을 이용하여 확인하였다. 정제된 반응 파아지의 DNA를 서열화시킴으로써, IFNG의 3D 구조를 배치시켜 올리고펩티드의 서열을 결정할 수 있다. 구조상에 확인된 부분은 에피토프를 구성하고, 비-폴리펩티드 부분 부착용 기를 도입하기 위한 표적 부분으로 선택될 수도 있다.
모체 IFNG 분자의 구조 및 기능이 너무 많이 파괴되는 것을 피하기 위해, 본 발명에 따라 변경될 아미노산 잔기의 총 수가 15를 넘지 않도록 한다(SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 서열과 비교하였을 때). 바람직하게는, IFNG 폴리펩티드는 아미노산 서열로 구성되는데, 이는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 서열과는 1~15개 아미노산 서열이 상이한 것으로 예를 들면, SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 잔기의 1~8 개 또는 2~8개 또는 1~5개 또는 2~5개가 다르다. 따라서, 정상적으로는 IFNG 폴리펩티드는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 서열 고유 부분과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 아미노산 잔기가 차이가 나는 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 숫자는 관련된비-폴리펩티드 부분 부착용 기로 구성된 아미노산 잔기(도입된 또는 제거된) 전체 수를 나타내거나 이와 같은 기로 구성된 도입될 또는 제거될 아미노산 잔기의 총 수를 나타낸다.
이량체형의 IFNG 폴리펩티드에 있는 그리고 접합에 이용할 수 있는 부착기의 정확한 숫자는 접합에 의해 수득될 원하는 효과에 따라 달라진다. 수득될 효과는 접합의 특징 및 정도에 따라 달라진다(예를 들면, 비-폴리펩티드 부분의 본질, 폴리펩티드에 접합될 가능성이 있는 또는 접합되기를 원하는 비-폴리펩티드 부분의 숫자 즉, 접합되어야 하는 부분의 수 또는 접합되지 않아야 하는 부분의 수).
본 발명의 접합체의 IFNG 폴리펩티드 부분은 절두형이 될 수도 있는데, 예를 들면, 모체 IFNG 폴리펩티드와 연결하여 상기에서 설명한 것과 같이 1~15개 C-말단 아미노 잔기에서 절두되거나 또는 1~3개 N-말단 아미노산 잔기에서 절두된다.
in vivo기능상 반감기는 접합체의 분자량 및 증가된 반감기를 제공하는데 필요한 부착기의 수에 따라 달라지고, 즉 문제의 비-폴리펩티드 부분의 분자량에 따라 달라진다. 한 구체예에서, 본 발명의 접합체는 적어도 분자량이 67kDa이 되고, 특히 70kDa을 가진다(Laemmli, U.K. Nature Vol 227(1970), p680-85.이 설명하는 SDS-PAGE를 이용하여 분자량을 측정). IFNG는 약 35-50kDa 범위의 분자량(Mw)을 가지는데, 따라서, 원하는 효과를 얻기 위해서는 추가 약 20-40kDa이 필요하다. 이는 2-4개의 10kDa PEG 분자를 제공하거나 여기에서 설명하는 다른 방법으로 제공될 수 있다.
본 발명의 접합체에서, 모든 접합가능한 부착기의 적어도 50%, 바람직하게는80% 내지 모든 부착기는 관련 비-폴리펩티드 부분이 차지하고 있다. 따라서, 적절한 구체예에서, 본 발명의 접합체는 1~10개 범위의 비-폴리펩티드 부분(예를 들면, 2~8개 또는 3~6개 정도 범위)으로 구성된다.
상기에서 언급한 것과 같이, 생리적인 조건하에서, IFNG는 이량체 폴리펩티드로 존재한다. 본 발명에 따르면, 본 발명 접합체의 IFNG 폴리펩티드 일부분은 정상적으로는 이량체 형이다(여기에서 설명하는 것과 같이 준비된 두 개 IFNG 폴리펩티드 분자의 연합으로 만들 수 있음). 그러나, 원하는 경우, 본 발명 접합체의 IFNG 폴리펩티드 부분은 단일 쇄 형으로 제공될 수도 있는데, 이때 두 개의 IFNG 폴리펩티드 단령체는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커를 통하여 연결된다. 단일 쇄 형태의 IFNG 폴리펩티드를 제공하는 경우에는 두개 구성 IFNG 폴리펩티드가 상이할 수 있기 때문에, 폴리펩티드의 비대칭 돌연변이를 가능하게 하는 장점이 있다. 예를 들면, 단량체들중 한 개에서 수용체 결합 부위에 PEG화 부위를 제거할 수도 있으며 다른 부분은 보유시킬 수도 있다. 따라서, PEG반응후에, 한 개 단량체는 고유의 수용체-결합 부위를 가지나 다른 하나는 완전한 PEG부위를 가지기 때문에, 상당히 증가된 분자량을 가질 수 있다.
적절하게는 본 발명의 접합체는 다음의 개선된 성질을 한 가지 이상 가진다; 1)huIFNG 또는 rhuIFNG와 비교하였을 때in vivo기능성 반감기가 증가, 가령, 적어도 5배증가(약 10배 또는 더 이상 증가); 2) huIFNG 또는 rhuIFNG와 비교하였을 때, 면역원성이 감소, 가령, 적어도 25%, 50%, 좀더 바람직하게는 적어도 75% 증가.
비-폴리펩티드가 당 부분인 본 발명의 접합체
본 발명 접합체의 적절한 구체예에서, 제1 비-폴리펩티드 부분은 당 부분으로, O-연결된 또는 N-연결된 당 부분이 되고, IFNG 폴리펩티드는 적어도 한 개의 제거된 또는 도입된in vivo글리코실화반응 부위로 구성된다.
예를 들면,in vivo글리코실화반응 부위는 폴리펩티드의 표면에 노출된 아미노산 잔기들이 차지하는 모체 IFNG 폴리펩티드의 위치로 도입되는데, 적절하게는 용매에 노출된 측쇄의 25%이상, 좀더 적절하게는 용매에 노출된 측쇄의 50%이상이 된다(이와 같은 위치는 여기에서 설명하고 있는 방법 단락에서 설명하고 있다). N-글리코실화반응 부위는 그 부위의 N 잔기가 이 위치에 있도록 도입된다. 유사하게, O-글리코실화반응 반응 부위는 이와 같은 부위를 구성하는 S 또는 T 잔기가 이 위치에 있도록 도입된다. 또한, 효과적인 글리코실화반응을 확보하기 위해,in vivo글리코실화반응 부위 특히, N-글리코실화반응 부위의 N-잔기 또는 O-글리코실화반응 부위의 S 또는 T 잔기가 IFNG 폴리펩티드의 118개 N-말단 아미노산 잔기내에 위치하도록 하고, 더욱 바람직하게는 93개 N-말단 아미노산 잔기내에 위치하도록 한다. 좀더 적절하게는,in vivo글리코실화반응 부위는 이와 같은 부위를 만들기 위해 오직 한 개의 돌연변이가 요구되는 위치에 도입된다(예를 들면, 기능적인 글리코실화반응 부위를 만드는데 요구되는 임의 다른 아미노산 잔기가 이미 분자내에 있는 경우).
예를 들면, IFNG 폴리펩티드의 표면에 노출된 그리고 표면에 노출된 측쇄의 25%이상을 가지는 아미노산 잔기들이 차지하는 위치에 추가 N-글리코실화반응 부위도입을 유도하는데 이용되는 치환체는 다음과 같다; Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N, R140N+S142T. 이와 같은 치환체는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산을 가지는 huIFNG에 대해 나타낸 것이다. S/T는 세린 또는 트레오닌 잔기 적절하게는 트레오닌 잔기 치환체를 나타내는 말이다.
표면에 노출된 측쇄의 50%이상을 가지는 IFNG 폴리펩티드 표면 노출된 위치에 추가 N-글리코실화반응 부위 도입을 유도하는 치환체는 다음과 같다; P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, G18S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T,G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40S/T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, D62N+Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N, R140N+S142T. 이와 같은 치환체는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산을 가지는 huIFNG에 대해 나타낸 것이다.
N-글리코실화반응 부위내로 도입시키는데 오직 한 가지 아미노산 돌연변이만을 요구하는 치환체에는 다음이 포함된다; K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T, F82N, N85S/T, K87S/T, K94N, S99N, Q106S/T, E119N, A124N, K130N, R140N, 특히 K12S/T, G18N, G18S/T, K37S/T, E38N, K61S/T, D63N, Q67N, K80S/T, N85S/T, K94N, S99N, Q106S/T, A124N, K130N, R104N(수용체 분자가 없는 구조에서 표면에 노출된 측쇄의 25%이상을 가지는 위치) 또는 더욱 바람직하게는 G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N, A124N, K130N, R140N(수용체 분자가 없는 구조에서 표면에 노출된 측쇄의 50%이상을 가지는 위치).
상기 치환체 리스트에서, 118개 N-말단 아미노산 잔기내에 위치한 치환체를선택하는 것이 바람직하고, 특히, 93개 N-말단 아미노산 잔기내에 위치한 치환체를 선택하는 것이 바람직하다.
상기에서 지적한 바와 같이, 한 개 이상의 도입된 글리코실화반응 부위에 추가하여, 기존에 글리코실화반응 부위를 IFNG 폴리펩티드에서 제거할 수도 있다. 예를 들면, 상기 나열한 치환체중 글리코실화반응 부위를 도입하기 위해, huIFNG의 두 가지 자연적인 N-글리코실화반응 부위중 임의의 것을 제거하는 치환체와 복합시킬 수도 있다. 예를 들면, IFNG 폴리펩티드는 N25 및/또는 N97 치환체로 구성될 수 있는데, 예를 들면, 본 발명의 접합체가 부착기로 K, C, D, E를 가지는 비-폴리펩티드로 구성된 경우에, 치환체는 N25K/C/D/E 및/또는 N97K/C/D/E중의 하나가 된다.
본 발명의 접합체의 IFNG 폴리펩티드 일부에는 단량체당 한 개의in vivo글리코실화반응 부위를 포함할 수도 있다. 그러나,in vivo기능상 반감기를 증가시키기에 충분한 크기가 되기 위해서는 폴리펩티드는 한 개이상의in vivo글리코실화반응 부위, 특히, 2~7개in vivo글리코실화반응 부위 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개의in vivo글리코실화반응 부위로 구성되는 것이 바람직하다. 따라서, IFNG 폴리펩티드에는 단량체당 한 개의 추가 글리코실화반응 부위를 포함할 수 있고, 또는 도입된, 적절하게는 상기 목록에서 설명하고 있는 한 개 또는 그이상의 치환체에 의해 도입된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 그 이상의 글리코실화반응 부위로 구성될 수도 있다.
다음 단락에서 설명하는 것과 같이 고분자 부착 부위를 도입 또는 제거하기위해 IFNG 폴리펩티드 변형시에in vitro글리코실화반응 부위를 제거 또는 도입시킬 수 있다.
본 단락에서 설명하는 적어도 한 개의 글리코실화반응 부위가 도입된 또는 제거된 글리코실화된 IFNG 폴리펩티드중 임의의 것을 두 번째 비-폴리펩티드 부분에 추가 접합시킬 수도 있다. 예를 들면, 제2 비-폴리펩티드 부분은 PEG와 같은 고분자 또는 임의 다른 비-폴리펩티드 부분이 될 수 있다. 이를 위해, 접합은 IFNG 폴리펩티드에 존재하는 부착기를 이용할 수도 있고 또는 부착기를 도입 또는 제거할 수도 있는데, 특히 총 1-6개의 예를 들면, 3-4개 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개의 부착기를 접합에 이용할 수도 있다. 적절하게는 본 발명의 접합체에서(IFNG 폴리펩티드는 두 개의 글리코실화반응 부위로 구성되는데, 비-폴리펩티드 부분에 의해 추가되는 분자량의 범위가 20-40kDa 적절하게는 20kDa 또는 30kDa이 되도록 비-폴리펩티드 부분의 수와 분자량을 선택한다.
특히, 글리코실화된 IFNG 폴리펩티드는 부착기로 시스테인을 가지는 고분자에 접합될 수도 있다. 이를 위해, 한 개 이상의 시스테인 잔기를 IFNG 폴리펩티드에 삽입시킬 수 있는데, 이는 "본 발명의 접합체 부분 즉, 부착기로 시스테인을 가지는 비-폴리펩티드 분자에 대한 부분"에서 설명하고 있다.
택일적으로 또는 추가로, 글리코실화된 IFNG 폴리펩티드는 부착기로 리신을 가지는 고분자에 접합될 수도 있다. 이를 위해, 한 개 이상의 리신 잔기를 제거할 수 있는데, 이는 "본 발명의 접합체 부분 즉, 부착기로 리신을 가지는 비-폴리펩티드 분자에 대한 부분"에서 설명하고 있는 임의 치환체를 이용하여 제거할 수 있다.택일적으로 또는 추가로, 리신 잔기를 이 단락에서 언급하고 있는 임의 치환체를 이용하여 도입시킬 수도 있다.
리신 또는 시스테인을 통하여 고분자 접합하는 것에 다른 방법 즉 "산성 기에 결합할 수 있는 또는 임의 다른 적절한 기를 통하여 산성기에 결합할 수 있는 비-폴리펩티드 부분을 가지는 본 발명의 접합체" 부분에서 설명하는 것과 같이 산성 기를 통하여, 접합시킬 수가 있다.
제1 비-폴리펩티드 부분이 고분자인 본 발명의 접합체
또 다른 구체예에서, 제 1 비-폴리펩티드 부분이 고분자, 즉 "고분자에 접합"이란 단락에서 설명하는 것들 중에 한가지 고분자는 특히, 선형 또는 분지쇄형 PEG 분자(시스테인, 리신, 아스파르트산, 글루타민산을 부착기로 가지는)가 된다. 이와 같은 고분자용 부착기를 도입시키거나 제거하는 것은 다음 단락에서 설명하고 있다. 이와 같은 구체예에 따라 접합체의 IFNG 폴리펩티드 일부분은 예를 들면, huIFNG의 자연 N-글리코실화반응 부위중 하나 또는 둘 다를 이용하거나 또는 바로 앞 단락에서 설명한 것과 같은 도입된 글리코실화 부위를 이용한 글리코실화된 폴리펩티드가 된다.
비-폴리펩티드 부분이 부착기로 시스테인을 가지는 분자인 경우에 본 발명의 접합체
적절한 구체예에서, 제 1 비-폴리펩티드 부분은 부착기로 시스테인을 가지고, 적어도 한 개의 시스테인 잔기는 야생형 사람 IFNG에서 아미노산 잔기에 노출된 표면이 차지하고 있는 IFNG 폴리펩티드 위치내로 도입된다. 적절하게는 시스테인 잔기는 "본 발명의 접합체"라는 단락에서 주어진 비-폴리펩티드 부분용 부착기의 도입 또는 제거를 전반적으로 고려하여 도입된다. 예를 들면, IFNG 폴리펩티드는 다음에서 선택된 적어도 한가지 치환체로 구성된다; P3C, K6C, N10C, K13C, N16C, D21C, N25C, G26C, G31C, K34C, K37C, E38C, E39C, K55C, K58C, N59C, D62C, Q64C, S65C, K68C, E71C, E75C, N83C, S84C, K86C, K87C, K94C, N97C, S99C, T101C, D102C, L103C, N104C(수용체를 가지는 구조에서 표면에 노출된 측쇄의 50%이상을 가지는 아미노산 잔기가 차지하는 위치에 시스테인이 도입). N25C 및 N97C 치환체가 주목을 받고, 특히 N25C+N97C는 IFNG 폴리펩티드가E. coli와 같은 글리코실화되지 않는 숙주에서 발현되는 경우에, huIFNG의 고유 글리코실화반응 부위 일부를 N25 및 N97가 구성하기 때문에, 관심을 끈다.
또한, 이와 같은 구체예에 따른 IFNG 폴리펩티드는 huIFNG의 아미노산 잔기 121-143중 임의의 것들이 차지하고 있는 위치내에 적어도 한 개의 시스테인이 도입된 것으로 구성될 수도 있다.
적절하게는 이와 같은 측면에 따른 접합체의 IFNG 폴리펩티드는 단량체당 총 1~8개 예를 들면 2-6개 Cys, 적절하게는 1-3개 Cys으로 구성될 수도 있다.
"고분자에 접합" 단락에서 설명하는 것과 같이, 이 단락에서 언급하는 단계적인 방법으로 또는 단일 단계 방법을 이용하여, 폴리펩티드와 고분자사이를 접합시킬 수 있다. 접합체는 두 개 또는 그이상의 제1 비-폴리펩티드 부분으로 구성되는 경우에, 이들 각각은 정상적으로는 5 또는 10kDa분자량을 가진다. 적절한 고분자는 VS-PEG가 된다.
비-폴리펩티드 부분이 부착기로 리신을 가지는 분자인 경우에 본 발명의 접합체
이와 같은 구체예에서, 부착기로 리신을 가지는 고분자가 비-폴리펩티드 부분인 경우에, 적어도 한 개의 리신 잔기가 제거될 수 있도록 IFNG 폴리펩티드를 변형시키는데, 리신 잔기는 다음에서 선택될 수 있다; K6, K12, K13, K34, K37, K43, K55, K61, K68, K74, K80, K86, K87, K88, K94, K108, K125, K128, K130(번호는 SEQ ID NO 2를 기준으로 붙여진 것이다). 좀더 바람직하게는 K12, K34, K37, K108, K128, K130에서 선택된 적어도 한 개의 리신이 제거될 수 있다. 따라서, 이와 같은 잔기들의 접합을 피할 수 있다. 리신 잔기는 임의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으나, 바람직하게는 아르기닌 또는 글루타민으로 대체되는 것이 좋다.
또한, IFNG 폴리펩티드를 변형시켜, 아미노산 잔기가 노출된 표면이 차지하고 있는 huIFNG 위치로 한 개 또는 그 이상의 리신 잔기를 도입시킨다. 적절하게는 리신 잔기는 "본 발명의 접합체" 단락에서 제공되는 비-폴리펩티드 부분용 부착기의 도입 또는 제거를 위한 일반적인 고려에 따라 도입되는데, 특히 적어도 25%, 적절하게는 측쇄의 50%가 표면에 노출된 아미노산 잔기가 차지하는 위치로 도입되는데, 이와 같은 위치는 "재료 및 방법" 단락에서 설명하는 방법으로 확인이 가능하다. 또한, 적어도 한 개의 리신은 SEQ ID NO 2의 아미노산 잔기 121-143중 임의의 것으로 치환되어 도입될 수 있다. 또는 IFNG 폴리펩티드는 다음에서 선택된 적어도 한 개 위치에 있는 리신으로 구성된다; SEQ ID NO 2의 D2, E7, E9, D21, D24, N25, E38, E39, D41, R42, D62, D63, E71, E75, D76, R89, D90, D91, E93, N97,R107, H111, E112, E119, R129, R131, R137, R139, R140(huIFNG의 N, R, D, E, H가 차지하는 위치).
구체예에 따라서, IFNG 폴리펩티드는 상기 한 개 또는 그 이상의 위치에 있는 치환체로 구성되는데, 특히, 단량체당 1-15 위치 예를 들면, 1-8 또는 2-8 위치에 치환체를 가진다. 예를 들면, IFNG 폴리펩티드는 상기 위치중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15위치에 치환체를 가지는 것으로 구성된다.
N25K 및 N97K 치환체가 주목을 받고, 특히 N25K+N97K는 IFNG 폴리펩티드가E. coli와 같은 글리코실화되지 않는 숙주에서 발현되는 경우에, huIFNG의 고유 글리코실화반응 부위 일부를 N25 및 N97가 구성하기 때문에, 관심을 끈다.
예를 들면, 이와 같은 구체예에 따른 접합체의 IFNG 폴리펩티드는 상기에서 정의한 것과 같은 리신 잔기를 제거하는 적어도 한 개의 치환체와 복합하여 리신 잔기를 도입하기 위한 상기 치환체중 적어도 한 개로 구성된다(적절하게는 R 또는 Q로의 치환). 예를 들면, IFNG 폴리펩티드는 K128R, K128Q, K130R, K130Q의 적어도 한 개와 복합하여, N25K 및 N97K중 하나로 구성될 수 있다. 좀더 구체적으로는, IFNG 폴리펩티드는 치환체 K25K+K128R, N25K+K130R, N25K+K128R+K130R, N97K+K128R, N97K+K130R, N97K+K128R+K130R, N25K+N97K+K128R+K130R, N25K+N97K+K128R, N25K+N97K+K130R으로 구성된다.
본 발명의 측면에 따르면, 주어진 접합 방법을 이용하였을 때, 접합체의 비-폴리펩티드 부분은 부착기(당부분, 친지질기 또는 유기 유도된 물질)로 리신을 가지는 임의 분자일 수도 있지만, 비-폴리펩티드 부분은 고분자가 되는 것이 바람직하다. 고분자는 "고분자에 접합"단락에서 설명하는 임의 분자가 될 수는 있지만, 바람직하게는 직쇄 또는 분지쇄 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥시드에서 선택되는 것이 좋다. 가장 적절하게는 고분자는 SS-PEG, NPC-PEG, 알데히드-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC(Shearwater Polymers Inc.,) SC-PEG(Enzon Inc.), 트레실화된 mPEG(US 5,880,255), 옥시카르보닐-옥시-N-디카르복시이미드-PEG(US 5,122, 614)가 된다. 정상적으로는 리신 잔기에 접합을 위해서는 비-폴리펩티드 부분은 5 또는 10kDa정도의 분자량을 가져야 한다.
비-폴리펩티드 부분이 산성기에 결합하는 경우에 본 발명의 접합체
또 다른 구체예에서, 본 발명 접합체의 비-폴리펩티드 부분은 부착기로써 산성기를 가지는데, IFNG 폴리펩티드는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열로 구성되는데, 이때 상이한 점은 아미노산 잔기가 노출된 적어도 한 개 표면은 "본 발명 접합체" 단락에서 제공하는 일반적인 고려사항에 따라 아스파르트산 또는 글루타민산으로 치환되었다. 또는, Asp 또는 Glu 잔기는 K, R, Q, N이 차지하는 모체 IFNG 폴리펩티드 위치내에 도입될 수 있다. 예를 들면, N25, N97, K125, K128, R129, K130, R131 좀더 바람직하게는 N25 또는 N97, 가장 적절하게는 N25+N97가 Asp 또는 Glu로 치환될 수 있다.
전단락에서 설명하는 것과 유사하게, 비-폴리펩티드 부분이 이와 같은 잔기들에 결합하는 것인 경우에, 한 개 이상의 Asp, Glu 잔기들을 수용체 결합 부위로부터 제거할 수 있다.
본 발명 측면에 따라 접합체의 비-폴리펩티드 부분이 부착기로 산성기를 가지는 경우에, 이와 같은 성질을 가지는 비-폴리펩티드 부분이 될 수는 있지만, 비-폴리펩티드 부분은 고분자 또는 유기 유도된 물질이 되는 것이 바람직하고, 특히 고분자가 되는 것이 좋으며, 접합체는 Sakane and Pardridge, Pharmaceutical Research, Vol. 14, No. 8, 1997, pp 1085-1091에서 설명하는 것과 같이 준비될 수 있다.
본 발명 접합체의 비-폴리펩티드 부분
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명 접합체의 비-폴리펩티드 부분은 적절하게는 고분자, 친지성 화합물, 당 부분(in vivo글리코실화반응을 통하여), 유기 유도된 물질에서 선택된다. 이와 같은 모든 물질은 접합체의 폴리펩티드 부분에 바람직한 성질을 부여하는데, 특히in vivo기능적인 반감기의 증가 또는 면역원성 감소등의 성질을 부여한다. 접합체의 폴리펩티드 부분은 정상적으로는 두가지 또는 그 이상의 상이한 형태의 비-폴리펩티드 부분 예를 들면, 고분자 및 당 부분; 친지성 기와 당 부분; 유기 유도화된 물질 및 당 부분; 친지성 부분 및 고분자등이 될 수 있다. 두가지 또는 그 이상의 비-폴리펩티드 부분에 동시에 또는 연속적으로 접합이 일어날 수 있다.
본 발명 접합체를 준비하는 방법
"친지성 화합물에 접합" , "고분자에 접합", "당 부분에 접합", "유기 유도화된 물질에 접합" 단락에서 특정 형태의 비-폴리펩티드 부분에 접합하는 것을 설명한다.
친지성 화합물에 접합
폴리펩티드와 친지성 화합물이 직접 또는 링커를 통하여 서로 접합될 수 있다. 친지성 화합물은 포화된 또는 불포화된 지방산, 지방산 디케톤, 테르펜, 프로스타글란딘, 비타민, 카로테노이드, 스테로이드와 같은 천연 화합물 또는 합성 화합물 가령, 한 개 또는 그 이상의 알킬, 아릴, 알케닐, 다른 다중 불포화 화합물을 가지는 탄산, 알코올, 아민, 설폰산등이 될 수도 있다. 폴리펩티드 및 친지성 화합물간의 접합(선택적으로 링커를 통하여 이루어질 수도 있는 접합)은 당분야에 공지의 방법 예를 들면, Bodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 및 WO 96/12505에서 설명하는 방법으로 실시할 수 있다.
고분자에 접합
폴리펩티드에 결합할 수 있는 고분자는 임의 적절한 고분자 예를 들면, 천연 또는 합성 동종-고분자 또는 이형-고분자로 일반적으로 분자량의 범위가 300-100,000Da, 구체적으로는 300-20,000Da, 좀더 적절하게는 500-100,000Da 범위, 가장 적절하게는 500-5000Da범위의 고분자가 된다.
동종-고분자로는, 폴리올(poly-OH), 폴리아민(폴리-NH2), 폴리카르볼실산(poly-COOH)등이 포함된다. 이형-고분자는 한 개 또는 그이상의 상이한 결합기 예를 들면 하이드록실 기 및 아민기와 같은 기로 구성된다.
적절한 고분자는 폴리알킬렌 옥시드(PAO), 폴리알킬렌 글리콜(PAG)- 예를 들면, 폴리에킬렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 분지쇄 PEGs-, 폴리-비닐 알코올(PVA), 폴리-카르복실레이드, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리에틸렌-co-말레산무수물, 폴리스트렌-co-말레산 무수물, 덱스트란-예를 들면, 카르복실메틸-덱스트란-, 또는 면역원성을 감소시키거나in vivo기능적 반감기를 증가시키거나 혈청 반감기를 증가시키는데 적절한 다른 생-고분자에서 선택된다. 고분자의 또 다른 예를 들면, 사람의 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질이 될 수 있다. 일반적으로, 폴리알킬렌 글리콜-유도된 고분자는 생체 적합성이고, 비-독성이며, 항원을 일으키지 않으면서, 비-면역원성이고, 다양한 수용성 성질을 가지고, 살아있는 유기체로부터 용이하게 분비되는 성질을 가진다.
PEG가 이용할 수 있는 적절한 고분자가 되는데, 그 이유는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드등과 비교하였을 때, 교차-연결이 가능한 반응기가 상당이 적기 때문이다. 특히, 단가기능기 PEG, 예를 들면 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이 적절한데, 그 이유는 이의 결합 화학이 상대적으로 간단하기 때문이다(폴리펩티드상에 부착기와 접합하는데 이용할 수 있는 것은 한 개 반응기 뿐이다). 결과적으로, 교차-연결 위험이 없어지고, 생성된 폴리펩티드는 상당한 동질성을 가지고, 고분자와 폴리펩티드의 반응을 조절하기가 더 용이하다.
폴리펩티드에 고분자를 공유적으로 결합시키기 위해서는, 고분자의 하이드록시 말단기가 활성을 가진 상태로 제공되어야 하는데, 예를 들면, 반응 기능기로 1차 아미노 기, 하이드라지드(HZ), 티올, 숙시네이트(SUC), 숙시니미딜 숙시네이트(SS), 숙시니미딜 숙신아미드(SSA), 숙시니미딜 프로피오네이트(SPA), 숙시니미딜 카르복시메틸레이트(SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트(BTC), N-하이드록시숙시니미드(NHS), 알데이드, 니트로페닐카르보네이트(NPC),트레실레이트(TRES)등이 제공되어야 한다. 적절하게 활성화된 고분자는 시판되는 것을 이용할 수 있는데, 예를 들면, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA에서 공급하는 것을 이용할 수 있다. 또는, 고분자는 당분야에 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있는데, 예를 들면, WO 90/13540에서 설명하는 방법을 이용한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 활성화된 선형 또는 분지형 고분자의 특정 예는 Sharwater Polymers, Inc. 1997 and 2000 Catalogs (Functionalized Biocompatible Plymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, incorporated herein by reference)에서 설명한다. 활성화된 PEG 고분자의 예로는 다음의 것이 포함된다; 선형 PEG로는 NHS-PEG(즉, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG and SCM-PEG), NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, MAL-PEG등이 있고, PEG2-NHS와 같은 분지형 PEG도 있다(US 5,932,462 및 US 5,643,575에서 설명). 또한, 다음의 공개문헌에서는 유용한 고분자 또는 PEG화반응 화학에 대해서 설명하고 있다: US5,824,778, US5,476,653, WO97/32607, EP229108, EP402378, US4,902,502, US5,281,698, US5,122,614, US5,219,564, WO92/16555, WO94/04193, WO94/14758, WO94/17039, WO94/18247, WO94/2804, WO95/00162, WO95/11924, WO95/13090, WO95/33490, WO96/00080, WO97/18832, WO98/41562, WO98/48837, WO99/32134, WO99/32139, WO99/32140, WO96/40791, WO98/32466, WO95/06058, EP439508, WO97/03106, WO96/21469, WO95/13312, EP921131, US5,736,625, WO98/05363, EP809996, US5,629,384, WO96/41813,WO96/07670, US5,473,034, US5,516,673, EP605963, US5,382,657, EP510356, EP400472, EP183503, EP154316.
폴리펩티드와 활성화된 고분자 접합시에는 통상적인 방법이 이용되는데, 다음의 문헌에서 설명하는 방법들이 이용된다(또한 고분자 활성화를 위한 적절한 방법도 설명하고 있다);Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington;R.F. Taylor(1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S.Wong(1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). 당업자는 고분자의 기능기(예를 들면, 아미노, 하이드록실, 카르복실, 알데히드 또는 설파하이드릴) 및 IFNG 폴리펩티드의 부착기에 따라서 활성화 방법 및 접합 화학이 달라질 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 폴리펩티드 상에 모든 이용가능한 부착기(예를 들면 폴리펩티드의 표면에 노출된 부착기 등)에 접합시키는데 이용되거나 특정 부착기 예를 들면 N-말단 아미노 기(US 5,985,265)에 접합시키는데 PEG화 반응을 이용할 수 있다. 또한, 접합은 한단계 또는 단계별 반응으로 이루어질 수 있다(WO99/55377에서 설명).
PEG화 반응은 부착된 PEG 분자의 수, 분자의 크기 및 형태(예를 들면 이들이 선형인지 분지형인지) 그리고, 폴리펩티드에서 이와 같은 분자가 어디에 부착되는 지등에 대해 최적의 분자를 생산할 수 있도록 고안된 것이다. 예를 들면, 이용될고분자의 분자량은 수득될 원하는 효과를 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 접합의 1차 목적이 고분자량을 가지는 접합체를 얻는 것이라면(신장에서 제거되는 비율을 줄이기 위해), 원하는 분자량을 얻기 위해 약간 높은 분자량을 가지는 고분자에 가능한 접합시켜야 할 것이다. 에피토프 차단 정도를 높이고자 할 경우에는, 폴리펩티드의 모든 또는 대부분의 에피토프를 효과적으로 차단시키기 위해서 분자량이 낮은 고분자(예를 들면, 5,000Da)를 상당 수 이용하면 될 것이다. 예를 들면, 2~8개 가령, 3~6개의 고분자를 이용할 수 있다.
단백질상에 단일 부착기에만 접합시키고자 하는 경우에(US 5,985,265에서 설명하는 것과 같이), 선형 또는 분지형 고분자는 약 20kDa의 높은 분자량을 가지는 것이 유리하다.
정상적으로, 고분자 접합은 이용할 수 있는 모든 고분자 부착기가 고분자와 반응할 수 있는 것을 목표로 하는 조건하에서 실행한다. 일반적으로, 폴리펩티드에 대해 활성화된 고분자 부착 몰비는 1000-1, 특히, 200-1, 적절하게는 100-1 예를 들면, 10-1 또는 5-1로 만들어, 최적의 반응을 얻을 수 있다. 그러나, 등가몰비를 이용할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 링커를 통하여 폴리펩티드에 고분자를 결합시키는 것도 고려할 수 있는데, 적절한 링커는 당업자에 공지되어 있다. 적절한 예로는 염화 시아누르가 된다(Abuchowski et al.,(1997), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al.,(1986), J.Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
당분야에 공지된 방법에 따라, 접합에 어어서 잔류 활성화된 고분자를 차단시킬 수 있는데, 예를 들면, 반응 혼합물에 1차 아민을 첨가하여 블락킹시키고, 생성된 비활성화된 분자는 적절한 방법을 이용하여 제거하면 된다.
당 부분에 결합
in vivo또는in vitro에서 당 부분에 결합시킬 수 있다. IFNG 활성을 가지는 폴리펩티드(한가지 이상의in vivo글리코실화반응 부위를 도입시키기 위해 이미 변형됨)의in vivo글리코실화반응을 얻기 위해, 접합체의 폴리펩티드 부분을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 글리코실화된 진핵 발현 숙주에 삽입해야 한다. 곰팡이(필라멘트성 곰팡이 또는 이스트), 곤충, 동물 세포, 유전자변이 식물 세포에서 발현 숙주 세포를 선택할 수 있다. 또한, 유전자 치료시에 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명 접합체의 폴리펩티드 일부분을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 이용하면 인체에서 글리코실화반응을 얻을 수 있다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, BHK 또는 HEK 세포(HEK293)와 같은 포유류 세포 또는 SF9 세포와 같은 곤충 세포 또는Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris와 같은 효모 세포 또는 임의 다른 적절한 글리코실화반응 숙주(하기에서 추가 설명)가 될 수 있다. 선택적으로,in vivo글리코실화반응에 의해 IFNG 폴리펩티드에 부착된 당 부분은 글리코실트랜스퍼라제를 이용하여 추가 변형시킬 수 있는데, 예를 들면, Neose, Horsham, PA, USA 시판하는 glycoAdvanceTM을 이용할 수 있다. 따라서, CHO 세포에 의해 발현 및in vivo글리코실화반응에 이어서, 글리코실화된 IFNG 폴리펩티드의시알린화를 증가시킬 수도 있다.
IFNG의 아미노산 잔기에 글리코시드를in vitro상태에서 공유적으로 결합시키는 것을 이용하여, 탄수화물 치환체의 수 또는 프로파일을 변형 또는 증가시킬 수 있다. 이용된 결합 방식에 따라, a)아르기닌 및 히스티딘; b)자유 카르복실기; c)시스테인에 있는 것과 같은 자유 설파하이드릴기; d)세린, 트레오닌, 티로신, 하이드록시프롤린에 있는 것과 같은 자유 하이드록실기; e)페닐알라닌 또는 트립토판에 있는 것과 같은 방향족 잔기; f)글루타민의 아미드기에 당을 부착시킬 수 있다. 이와 같은 아미노산 잔기는 본 발명 접합체의 IFNG 폴리펩티드에서 제거되거나 삽입될 수 있는 당 부분에 부착용 기로 구성된다.in vitro결합을 위한 적절한 방법은 WO 87/05330 및 Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp 259-306, 1981에서 설명하고 있다. 단백질 및 펩티드-결합된 Gln-잔기에 당 부분 또는 PEG를in vitro결합시키는데에는 트랜스글루타미나아제(TGases)를 이용할 수 있다(Sato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072-13080; EP 725145).
유기 유도화된 물질에 결합
유기 유도화된 물질에 폴리펩티드의 부착기를 반응시켜, IFNG 폴리펩티드를 공유적으로 변형시킬 수 있다. 적절한 유도화 물질 및 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 가장 흔히 이용되는 시스테닐 잔기는 α-할로아세테이트(및 이에 상응하는 아민) 예를 들면, 클로로아세트산 또는 클로로아세타아미드와 반응시켜, 카르복실메틸 또는 카르복실아미도메틸을 제공한다. 브로모트리를로로아세돈, α-브로모-β-(4-이미도조일)프로피오닌산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬멜레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딘 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜, 시스테닐 잔기를 유도할 수 있다. 히스티딜 잔기는 디에틸피로카르보네이트 pH 5.5-7.0와 반응시켜 유도할 수 있는데, 그 이유는 이 물질이 히스티딜 측쇄에 대해 상대적으로 특이성을 가지기 때문이다. 파라-브로모페놀아실 브로마이드도 유용하다; 이 반응은 0.1M 카코딜레이트 나트륨(sodium cacodylate, pH 6.0)에서 실행된다. 리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응하였다. 이들 물질을 이용한 유도화 반응은 리신 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 가지고 있다. α-아미노를 포함하는 잔기를 유도하기 위한 다른 적절한 시약에는 메틸 피코리니이미데이트와 같은 이미도에스테르; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸리소우레아; 2,4-펜다네디온; 글리옥실레이트와 트렌스아미나제-촉매된 반응을 포함한다. 아르기닌 잔기는 한 개 또는 몇 개의 통상적인 시약으로 반응시켜 변형시키는데, 그중에서, 페닐글리옥살, 2,3-부타네디온, 1,2-사이클로헥사네디온, 닌하이드릴등과 반응시킨다. 아르기닌 잔기의 유도화 반응은 알카리 조건하에서 실행해야하는데, 그 이유는 구아니딘 기능기의 pKa가 높기 때문이다. 또한, 이와 같은 시약들은 리신기뿐만 아니라 아르기닌 구아니디노기와도 반응을 할 수 있다. 카르복실 측기(아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보이미드(R-N=C=N-R')와 반응시켜 선택적으로 변형시킬 수 있다; 이때, R 및 R'는 서로 다른 알킬기 가령, 1-사이클로헥실-3-(2-몰포리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸페닐)카르보디이미드가 된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모니움 이온과 반응시켜 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킨다.
과도하게 고분자를 접합시키는 경우에 고분자가 접합되는 폴리펩티드의 활성을 상실할 수도 있다고 보고된 바 있다. 기능을 하는 부분에 위치한 부착기를 제거하거나 접합전에 기능기를 차단시키면, 이와 같은 문제를 해결할 수 있다. 이와 같은 전략이 본 발명의 구체예에 포함된다(제 1 전략의 한 가지 예로써 기능기에 근접 위치한 리신 잔기를 제거하는 것이다). 좀더 구체적으로는, 두 번째 전략에 따르면, 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분사이에 접합은 폴리펩티드의 기능기에 결합할 수 있는 헬퍼 분자로 IFNG 폴리펩티드의 기능기를 차단시킬 수 있는 조건하에서 실시되도록 한다는 것이다. 적절하게는, 헬퍼 분자가 리포터와 같은 폴리펩티드의 기능부위를 특이적으로 인지하는 것이다. 또는, 헬퍼 분자가 항체가 될 수도 있는데, 특히, IFNG 활성을 나타내는 폴리펩티드를 인지하는 단클론항체가 될 수도 있다. 특히, 헬퍼 분자는 중화 단클론 항체가 될 수 있다.
접합을 하기 전에 헬퍼 분자와 폴리펩티드는 상호작용하게 된다. 이는 폴리펩티드의 기능 부위가 차단되거나 보호되어, 결과적으로 고분자와 같은 비-폴리펩티드 부분에 의한 유도화반응에 이용될 수 없게 된다. 헬퍼 분자로부터 용출된 후에, 비-폴리펩티드 부분과 폴리펩티드사이에 접합이 회복될 수 있는데, 적어도 부분적으로 보존된 기능기를 가진다
차단된 기능 부위를 가지는 폴리펩티드를 고분자, 친지성 화합물, 당 부분, 유기 유도화된 물질 또는 다른 임의 화합물에 연속하여 접합을 시킬 수 있다(통상적인 방법을 이용하여).
추가 구체예에서, 헬퍼 분자는 컬럼 패킹 물질 예를 들면, Sephadex 또는 아가로즈 비드와 같은 고형상에 또는 반응 용기와 같은 표면에 우선 공유 결합시킨다. 연속하여, 폴리펩티드를 헬퍼 분자가 있는 컬럼 물질위에 적하시키고, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 접합을 실행하였다. 이와 같은 과정에서 용출을 이용하여, 헬퍼 분자로부터 폴리펩티드 접합체를 유리시킬 수 있다. 폴리펩티드 접합체를 물리화학적인 조건하에서 통상의 기술을 이용하여 용출시키는데, 이때 조건은 폴리펩티드 접합체가 연속하여 분해가 일으나지 않도록 하는 조건이어야 한다. 폴리펩티드 접합체를 포함하는 유동상을 고형상으로부터 분리하는데, 이때 고형상에는 헬퍼 분자가 공유적으로 결합되어 남아 있다. 다른 방법으로도 분리할 수도 있다; 예를 들면, 헬퍼 분자를 특정 결합체(스트렙타아비딘)가 인지할 수 있는 제 2 분자(바이오틴)로 유도시키고, 특정 결합제를 고형상에 연결시켜, 제 1 헬퍼-고형상 컬럼을 통과시켜, 용출시에, 헬퍼 분자-제2 분자 복합체가 컬럼상에 보유되면서, 폴리펩티드 접합체는 용출시키도록 하여, 헬퍼-분자-제2분자 복합체로부터 폴리펩티드 접합체를 분리할 수 있다. 임의 적절한 방식으로 헬퍼 분자로부터 폴리펩티드 접합체를 방출시킬 수 있다. IFNG의 기능을 가진 부위로부터 헬퍼 분자가 해리될 수 있도록 만든 조건하에서 탈-보호 반응을 얻을 수 있다. 예를 들면, pH를 산성에서 알카리성 pH로 조절하여 고분자가 접합된 항체와 항-이디오타입 항체간의 복합체를 해리시킬 수도 있다.
태그된 폴리펩티드 접합체
또 다른 구체예에서, IFNG 폴리펩티드는 태그를 가지는 융합 단백질로 발현될 수 있는데, 이때 "태그"란 일반적으로 1-30개 예를 들면 1-20개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열 또는 펩티드가 된다. 신속하고 용이한 정제를 위해서, 태그된 IFNG 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분사이를 접합시키는 편리한 도구로 태그가 이용된다. 특히, 태그를 이용하여 미량적정 플레이트 또는 다른 운반체 예를 들면, 파라마그네틱 막대에 접합시키는데 태그가 이용되는데, 이때 태그를 통하여 태그된 폴리펩티드가 표면에 고정된다. 미량적정판내에 태그된 IFNG 폴리펩티드에 접합시키는 경우에는 태그된 폴리펩티드는 배양액으로부터 직접 미량적정판에 고정될 수 있어(추가 정제가 필요없음), 접합시키면 된다. 따라서, 전체 공정 단계 수(발현부터 접합까지)를 줄일 수 있다. 또한, 태그는 접합될 고정된 폴리펩티드에 접근성을 개선시키는 스페이스 분자로도 기능을 할 수 있다. 여기에서 설명하는 비-폴리펩티드 부분 예를 들면 PEG와 같은 고분자에 태그된 폴리펩티드를 이용하여 접합을 실행할 수 있다.
이용될 수 있는 특정 태그의 본질은 폴리펩티드와 함께 발현되고, 적절한 표면 또는 운반체 물질상에서 고정될 수 있다면 그리 중요한 것이 아니다. 적절한 태그는 시판되는 것을 이용할 수 있다(Unizyme Laboratories, Denmark). 예를 들면, 태그는 다음의 서열로 이루어질 수 있다;
His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
(모두 Unizyme Laboratories, Denmark의 제품)
또는
EQKLI SEEDL(Mol. Cell. Biol. 5:3610-16, 1985에서 설명하는 C-말단 태그)
DYKDDDDK(C- 또는 N-말단 태그)
YPYDVPDYA
ADI, Aves Lab, Research Diagnostics에서 구할 수 있는 상기 태그에 대한 항체.
PEG 반응에 태그된 폴리펩티드를 이용하는 통상의 방법은 다음의 재료 및 방법에서 제공한다.
시판되는 효소를 이용하여 폴리펩티드에서 태그를 연속하여 절단할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드
본 발명의 추가 다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명하는 전반적으로 신규한 IFNG 폴리펩티드에 관계한다. 신규한 폴리펩티드는 본 발명의 접합체를 만드는데 있어서, 중요한 중간 화합물이다. 또한, 폴리펩티드 자체는 흥미로운 성질을 가지고 있다.
예를 들면, 신규한 IFNG 폴리펩티드는 출원 전반부에서 상세히 설명하는 것과 같이, 아미노산 잔기가 노출된 표면의 K, R, D, E, C, S, T, N에 적어도 한 개의 치환체로 구성된다.
IFNG 폴리펩티드를 준비하는 방법
IFNG 폴리펩티드, 선택적으로는 글리코실화된 형은 당분야에 공지된 임의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 이와 같은 방법에는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 작제하고, 적절하게 변화된 또는 트랜스펙션된 숙주내에서 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드는 화학적인 합성 또는 재조합 DNA 기술 및 이의 복합 방법으로 생산될 수 있다(다소 효율이 떨어짐).
IFNG 폴리펩티드(단량체 또는 단일 쇄 형태)를 인코드하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO 2의 아미노산 서열을 가지는 huIFNG와 같은 모체 IFNG를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 분리 또는 합성시키고, 합성된 뉴클레오티드 서열을 변형시켜, 관련 아미노산 잔기의 도입(삽입 또는 치환) 또는 제거(삭제 또는 치환)시켜 만든다.
당분야에 공지된 방법에 따라, 부위-직접적인 돌연변이 형성을 통하여 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 수 있다(Mark et al., "Site-specific Mutagonesis of the Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66(1984); and US 4,588,585).
또는, 뉴클레오티드 서열은 화학적인 합성 방법에 의해 만들 수 있는데, 예를 들면 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하는데, 이때 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 고안되고, 적절하게는 재조합된 폴리펩티드가 만들어지는 숙주세포에서 선호하는 코드를 선별하여 작제한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇 가지 작은 올리고뉴클레오티드를 합성하고, PCR, 결찰 또는 결찰 사슬 반응(LCR)을 이용하여 어셈블리한다. 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상보적인 어셈블리를 위해서는 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 포함하고 있다.
일단, 어셈블리되면(합성, 부위-직접적인 돌연변이 형성 또는 또 다른 방법), 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 재조합 벡터에 삽입시키고, 원하는 형질변환된 숙주 세포내에서 IFNG를 발현시키는데 필수적인 조절 서열에 작용가능하도록 연결한다.
물론, 인지해야 할 것은 모든 벡터 및 발현 조절 서열이 여기에서 설명하고 있는 IFNG 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 동일하게 작용을 하지는 않는다는 것이다. 모든 숙주가 동일한 백터 시스템에 대해 균등하게 기능을 하는 것도 아니다. 그러나, 당업자는 과도한 실험없이도 이와 같은 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 벡터를 선택하는데 있어서, 벡터가 숙주내에서 복제하거나 염색체안으로 삽입되어야 하기 때문에 숙주를 반드시 고려해야 한다. 벡터의 복제 수, 복제수를 조절하는 능력, 벡터에 의해 인코드된 임의 다른 단백질의 발현, 예를 들면, 항생제 표식의 발현 등도 고려해야 할 부분이다. 발현 조절 서열을 선택하는데 있어서, 다양한 인자들을 고려해야 한다. 여기에는 서열의 상대적인 강도, 조절능력, 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열과의 적합성, 특히, 2차 구조등이 포함된다. 선택된 벡터와의 적합성, 뉴클레오티드 서열에 의해 코드된 생성물의 독성, 이들 분비상 특징, 정확하게 폴리펩티드로 폴드되는 능력, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드되는 생성물의 정제 난이도등을 고려하여, 숙주를 선택해야 한다.
재조합 백터는 자생 복제 백터가 될 수도 있는데, 이 벡터는 플라스미드와 같이 엑스트라크로모좀으로 존재할 수 있는데, 이의 복제는 염색체 복제와는 별개이다. 또는 벡터가 숙주 세포내로 도입되었을 때, 숙주 세포 게놈안으로 통합되어, 통합된 염색체로 복제될 수도 있다.
벡터는 발현 벡터가 바람직한데, 이때, 뉴클레오티드 서열 전사를 위해 IFNG 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 필요한 추가 단편에 작동가능하도록 연결한다. 이와 같은 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스성 DNA가 된다. 여기에서 언급하는 숙주 세포내에서 발현시키는데 적절한 발현 벡터는 시판하는 것을 이용하는 것이다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 SV40, 소과 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스의 발현 조절 서열로 구성된 벡터등을 포함한다. 특정 벡터로는 pCDNA3.1(+)＼Hyg(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 pCI-neo(Stratagene, LA Jola, CA, USA)등이 있다. 박테리아 숙주에 적합한 유용한 발현 벡터에는 공지의 박테리아 플라스미드 예를 들면,E. Coli의 플라스미드 즉, pBR322, pET3a, pET12a(Novagen Inc., WI, USA) 및 RP4와 같은 다양한 범위의 숙주 플라스미드, phage DNAs(다양한 파아지 람다 유도체) 즉, NM989 및 다른 DNA 파아지 예를 들면, M13 및 필라멘트성 단일 가닥 DNA 파아지등이 포함된다. 이스트 세포용 유용한 벡터에는 2μ플라스미드 및 이의 유도체, POT1 벡터(US 4,931,373), pJSO37 벡터(Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996), pPICZ A, B , C(Invitrogen)등이 포함된다. 곤충 세포에 유용한 벡터에는 pVL941, pBG31l(Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for MullerianInhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986), pBluebac 4.5, pMelbac(Invitrogen)등이 포함된다.
본 발명에서 이용할 수 있는 다른 벡터에는 IFNG 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 복제될 수 있도록 하는 벡터도 포함된다. 이와 같은 증폭을 가능하게 하는 벡터도 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, DHFR 증폭을 이용한 증폭 벡터(Kaufman, U.S. Pat. No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, "Construction OF A Modular Dihydrafolate Reductaso cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982))와 글루타민 합성효소("GS") 증폭을 이용한 증폭 벡터(US 5,122,464 and EP 388,841)가 포함된다.
재조합 벡터에는 문제의 숙주 세포내에서 벡터가 복제할 수 있도록 하는 DNA 서열이 추가 포함된다. 이와 같은 서열(이때, 숙주 세포는 포유류 세포이다)의 예로는 SV40 복제 오리진이 될 수 있다. 숙주 세포가 이스트 세포인 경우에, 벡터를 복제시킬 수 있는 적절한 서열은 이스트 플라스미드 2μ복제 유전자 REP 1-3 및 복제 오리진이 된다.
벡터는 선택성 표식으로 유전자 예를 들면, 특정 유전자의 생성물이 숙주 세포에 결함을 보완할 수 있는 유전자, 즉 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코드하는 유전자 또는Schizosaccaromyces pombeTPI 유전자(described by P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130) 또는 약물 가령, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 하이그로마이신, 메토트렉세이트에 대한저항성을 부여하는 유전자을 가질 수 있다. 필라멘트성 곰팡이의 경우에, 선택성 표식에는amdS, pyrG,arcB,niaD,sC등이 포함된다.
여기에서 "조절 서열"이란 IFNG 폴리펩티드의 발현에 필요한 또는 이를 도와주는 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각 조절 서열은 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열에 고유한 서열 또는 외래에서 도입된 서열이 될 수 있다. 이와 같은 조절 서열에는 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 인헨서 또는 상류 활성화 서열, 시그날 펩티드 서열 및 전사 종료물질 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 최소한, 조절 서열에는 프로모터가 포함된다.
본 발명에서 다양한 범위의 발현 조절 서열이 이용될 수 있다. 전술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연합한 발현 조절 서열뿐만 아니라 원핵 또는 진핵세포, 이들의 바이러스 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 임의 서열 또는 이의 다양한 복합체가 유용한 발현 조절 서열에 포함된다.
포유류 세포에서 전사를 지시하는 적절한 조절 서열을 예로 들면, SV40와 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, 즉, 아데노바이러스 2개 주요 후기 프로모터, MT-1(메탈로티오닌 유전자) 프로모터, 사람의 사이토메갈로바이러스 초 전기 유전자 프로모터(CMV), 사람의 연장 인자 1α(EF-1α) 프로모터, 초파리Drosophila최소 열 쇼크 단백질 70 프로모터, 라우스 살코마 바이러스(RSV) 프로모터, 사람의 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터, 사람의 생장 호르몬 종료인자, SV40 또는 아데노바이러스 Elb 부분 폴리아데닐화 반응 시그날 및 Kozak 콘센선스 서열(Kozak, M. J. Mol. Biol. 1987 Aug 20; 196(4):947-50)등이 있다.
포유류 세포내에서 발현을 개선시키기 위해서, IFNG 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 5' 해독안된 부분에 합성 인트론을 삽입시킬 수 있다. 합성 인트론을 예를 들면, 플라스미드 pCI-Neo(Promega Corporation, WI, USA)에서 얻은 합성 인트론 등이 있다.
곤충 세포에서 전사를 지시하는데 이용되는 적절한 조절 서열에는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터,Autographa californica폴리헤드로시스 바이러스 기초 단백질 프로모터, 베큘로바이러스 초 전기 유전자 1 프로모터, 베큘로바이러스 39K 지연된-초기 유전가 프로모터, SV40 폴리아데닐화반응 서열등이 포함된다.
숙주 세포에서 이용할 수 있는 적절한 조절 서열을 예를 들면, 이스트 α-메이팅 시스템의 프로모터, 이스트 트리오즈 포스페이트 이소메라제(TP1) 프로모터, 이스트 글로코리틱 유전자 또는 알코올 디하이드로게나제 유전자의 프로모터, ADH2-4c 프로모터 및 유도성 GAL 프로모터등이 포함된다.
필라멘트성 곰팡이 숙주 세포에 이용할 수 있는 적절한 조절 서열을 예로 들면 ADH3 프로모터 및 종료물질,Aspergillus oryzaeTAKA 아밀라제 트리오즈 포스페이트 이소메라제 또는 알칼린 프로테아제,A. nigerα-아밀라제,A. niger또는A. nidulans글리코아밀라제,A. nidulans아세타미다제,Rhizomucor miehei아스파르틱 프로데나제 또는 리파제, TPI1 종료물질, ADH3 종료물질을 인코드하는 유전자에서 유도된 프로모터등이 포함된다.
세균성 숙주 세포에 이용할 수 있는 적절한 조절 서열을 예로 들면,lac시스템,trp시스템,TAC또는TRC시스템의 프로모터 및 파아지 람다의 주요 프로모터 부분 등이 포함된다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열(부위-직접적인 돌연변이 형성, 합성 및 다른 방법등에 의해 준비됨)은 시그날 펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도, 가지지 않을 수도 있다. 폴리펩티드가 발현되는 세포에서 분비될 때, 시그날 펩티드가 나타나는 것이다. 시그날 펩티드가 존재한다면, 이와 같은 시그날 펩티드는 폴리펩티드 발현을 위해 선택된 세포가 인지할 수 있는 것이어야 한다. 시그날 펩티드가 폴리펩티드에 대해 상동성(가령 huIFNG와 정상적으로 연합되는) 또는 이형성(huIFNG이외의 다른 원으로부터 얻음)일 수도 있고, 숙주 세포에 상동성 또는 이형성 다시말하면, 시그날 펩티드가 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 시그날 펩티드(상동성인 경우)이거나 숙주 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 펩티드(이형성인 경우)일 수도 있다. 따라서, 시그날 펩티드는E. coli와 같은 박테리아에서 유도된 원핵세포성 펩티드이거나, 포유류 또는 곤충 또는 이스트 세포에서 유도된 진핵 세포성 펩티드일 수도 있다.
폴리펩티드를 생산하는데 이용되는 발현 숙주 세포, 발현될 단백질(세포내 단백질인지 또는 세포간 단백질인지), 분비를 하는 것이 바람직한 것인지에 따라, 시그날 펩티드의 유무가 달라질 수 있다. 필라멘트성 곰팡이에 이용되는 경우에,Asperhillus sp. 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 인코드하는 유전자 또는Rhizomucor miehei리파제 또는 프로테아제를 인코드하는 유전자 또는Humicola lanuginosa리파제를 인코드하는 유전자로부터 시그날 펩티드는 통상적으로 유도된다. 시그날 펩티드는A. oryzaeTAKA 아밀라제,A. niger중성 α-아밀라제,A.niger산-안정 아밀라제,A. niger글루코아밀라제를 인코드하는 유전자로부터 유도되는 것이 바람직하다. 곤충 세포에 사용하기 위해서는, 곤충 유전자(WO90/05783)로부터 유도하는 것이 편리한데, 예를 들면lepidopteran Manduca sexta아디포카이네틱 호르몬 전구물질(US 5,023,328), 꿀벌 멜리틴(Invitrogen), 엑티스테로이드 UDP 글루로실트란스퍼라제(egt)(Murphy et. al. Protein Expression and Purification 4,349-357(1993) 또는 사람의 췌장 리파제(hpl)(Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997)에서 시그날 펩티드를 유도할 수 있다.
포유류 세포에 이용할 수 있는 적절한 시그날 펩티드는 huIFNG 또는 뮤린 Ig 카파 경쇄 시그날 펩티드(Coloma, M(1992) J. Imm. Methods 152:89-104)이다. 이스트 세포에 이용하기 위해서는 적절한S. cereviciae의 α-인자 시그날 펩티드(US 4,870,008), 생쥐 타액 아밀라제의 시그날 펩티드(O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646), 변형된 카르복시펩티다제 시그날 펩티드(L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), 이스트BARl시그날 펩티드(WO 87/02670), 이스트 아스파르트 프로테아제 3(YAP3) 시그날 펩티드(M. Egel-Mitani et al., Yeast, 6, 1990, pp. 127-137)에서 적절한 시그날 펩티드가 발견하였다.
IFNG 폴리펩티드를 생산하는데 이용되는 임의 적절한 숙주에는 박테리아, 곰팡이(이스트 포함), 식물, 곤충, 포유류 또는 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주뿐만 아니라 유전자전이 동물 또는 식물이 포함된다. 박테리아성 숙주 세포를 예를 들면,Bacillus균주(즉,B. brevls, B. subtilis)Pseudomonas또는Streptomyces와 같은 그램 양성 박테리아;E. Coli와 같은 그램 음성 박테리아등이 있다. 원형질 형질변환(Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 컴피턴트 세포를 이용(Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221); 전기천공(Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751); 컨쥬게이션(Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278)등이 박테리아 세포내로 벡터를 도입시키는데 이용되는 방법이다.
필라멘트성 곰팡이 세포로는 예를 들면,Aspergillus균주(A. oryzae, A. niger, A. nidulane),Fusarium또는Trichoderma등이 포함된다. 곰팡이 세포는 공지의 방법으로 원형질 형성, 원형질의 형질변환, 세포벽의 재생등 일련의 공정에 의해 형질변환될 수 있다.Aspergillus숙주 세포의 적절한 형질변환 과정은 EP 238 023 및 US 5,679,543에서 설명하고 있다.Fusarium종을 형질변환시키는 방법은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 및 WO 96/0787에서 설명하고 있다. Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., edlitors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920에서 설명하는 공정을 이용하여, 이스트를 형질변환시킨다.
적절한 이스트 세포에는Saccharomyces종(S. cerevisiae, Schizosaccharomyces),Kluyvsromyces, Plchia(P. pastoris, P. methanolica),Hansenula(H. Polymorpha) 또는Yarrowia종이 포함된다. 이형 DNA로 이스트 세포를 형질변환시켜, 이스트로부터 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법은 Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA USA (YeastmakerTMYeast Tranformation System Kit의 프로토콜) 및 Reeves et. al., FEMS Microbiology Letters 99(1992) 193-198, Manivasakam and Schies시, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415 및 Geneva et al., FEMS Microbiology Letters 121(1994) 159-164에서 설명하고 있다.
적절한 곤총 숙주 세포를 예를 들면,Lepidoptora세포 주 가령,Spodoptera frugiperda(Sf9 또는 Sf21),Trichoplusioa ni세포(High Five)(US 5,077,214)등이 포함된다. 곤충 세포의 형질변환 및 여기에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 것은 Invitrogen에서 설명하는 것과 같이 시행하면 된다.
적절한 포유류 숙주 세포의 예를 들면 차이니즈 햄스트 오바리(CHO) 세포주(CHOㆍK1; ATCC CCL-61), 녹색 원숭이 세포주(COS)(COS 1(ATCC CRL-1650), COS 7(ATCC CRL-1651)); 생쥐 세포(NS/O), Baby Hamster Kindney (BHK) 세포주(ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-10), 사람 세포(HEK 293(ATCC CRL-1573)) 및 조직 배양물에 있는 식물 세포등이 있다. 또 다른 적절한 세포주는 당분야에 공지되어 있고, 이는 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland와 같은공공 기탁기관으로부터 분양받을 수 있다. 또한, CHO 세포와 같은 포유류 세포를 변형시켜, 시아릴트란스퍼라제 가령, 1,6-시아릴트란스퍼라제(US 5,047,335)를 발현시켜, IFNG 폴리펩티드의 글리코실화반응을 개선시킨다.
인산 칼슘-중개된 트랜스펙션, 전기천공, DEAE-덱스트란 중개된 트랜스펙션, 리포좀-중개된 트랜스펙션, 바이러스성 벡터, Life Technologies Ltd, Paisley, UK using Lipofectamin 2000에서 설명하는 방법등이 외생 DNA를 포유류 숙주 세포로 도입시키는데 이용되는 방법이다. 이와 같은 방법들은 당분야에 이미 공지된 것이고, Ausber et. al.(eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA에서도 설명하고 있다. 포유류 세포의 배양은 정립된 방법 예를 들면, Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jorsey, USA and Harrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997에서 설명하는 방법에 따라 실행하였다.
글리코실화된 폴리펩티드를 생산하기 위해서, 진핵 숙주 세포 예를 들면, 상기에서 언급하는 세포를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 생산 방법에서, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 폴리펩티드를 생산하는데 적절한 영양 배지에서 세포를 배양하였다. 예를 들면, 플라스크 진탕배양, 소규모 또는 대규모 배양(연속 발효, 배치, 피드-배취, 고형상 발효등 포함)을 이용하여, 폴리펩티드가 발현 또는 분리될 수 있는 조건하에, 적절한 배지에서 실험실 규모 또는 산업 규모로 세포를 배양할 수 있다. 당분야에 공지된 방법을이용하여 탄소, 질소원, 무기염으로 구성된 적절한 영양 배지에서 배양한다. 적절한 배지는 공급업자로부터 얻거나 공지된 조성에 따라 조제할 수 있다(American Typer Culture Collection 카타로그 참고). 폴리펩티드가 영양 배지로 분비되면, 배지로부터 폴리펩티드를 바로 회수할 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않으면, 세포 용해물질로부터 회수할 수 있다.
생성된 폴리펩티드를 당분야에 임의 공지된 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드를 원심분리, 여과, 추출, 스프레이 건조, 증발, 침전등을 포함하나 이에 국한되지 않는 통상의 과정을 이용하여 영양 배지로부터 회수할 수 있다.
폴리펩티드는 당분야에 공지된 여러 가지 방법을 이용하여 정제할 수 있는데, 예를 들면, 크로마토그래피(이온 교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피. 소수성 크로마토그래피, 등전점 포커스 크크로마토그래피), 전기적인 공정(예비 등전점 포커스), 차등 용해도 이용(가령, 암모니움 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출(Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)등이 포함되나 이에 국한되지 않는 방법을 이용하여 정제할 수 있다. IFNG 활성을 나타내는 폴리펩티드를 정제하는 특정 방법은 EP 110044에서 설명하고, 일본 특허 출원 186995/84(심사받지 않은 상태)에서도 설명하고 있다.
IFNG 폴리펩티드의 생물학적 활성은 당분야에 공지된 임의 적절한 방법으로 검사할 수 있다. 이와 같은 검사에는 항-바이러스성 활성의 항체 중화반응, 단백질 카이나제 유도, 올리고아데닐레이트 2,5-A 합성효소 또는 포스포디에스테라제 활성(EP 41313 B1)등이 포함된다. 이와 같은 검사에는 면역조절 검사(US 4,753,795), 생장 저해 검사, 인터페론 수용체를 발현시키는 세포에 결합하는 정도등을 측정하는 것이 포함된다. 특정 검사는 본 명세서 재료 및 방법 단락에서 설명하고 있다.
또한, 본 발명은 간질성 폐 질환, 육아종증 질환, 암, 감염, 골 질환(골 대사 질환 예를 들면 악성 골다공증), 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환등 치료 방법을 개선하는 것에 관계하는데, 주요 잇점은 관입성 투여 빈도를 줄이면서 효과적인 치료를 하고, 치료요법적 활성 성분에 대해 면역 반응 위험을 줄이는 것이다.
본 발명의 접합체는 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제와 같은 조성물에 포함시켜 투여하는 것이 바람직하다. "제약학적으로 수용가능한"은 조성물을 투여 받는 환자에서 부작용을 일으키지 않는 담체 또는 부형제를 의미한다. 이와 같은 제약학적으로 수용가능한 담체 및 부형제는 당분야에 공지되어 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, s. Frokjaer and K. Hovgaard, Eds., Taylor % Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
본 발명의 접합체는 원형 및 염의 형으로 이용될 수 있다. 적절한 염에는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 아연 염등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 염 또는 복합체는 결정 또는 무정형 구조로 존재한다.
본 발명의 접합체는 공지의 시판되는 IFNG, Actimmune 또는 EP 795332에서 언급하는 것과 같이, 치료에 이용되는 것과 비슷한 약량으로 투여될 수 있다. 투여될 정확한 약량은 환경에 따라 달라진다. 정상적으로는 약량은 치료하고자 하는 질환의 악화를 방지하거나 증상을 완화시킬 수 있어야 한다. 본 발명 접합체 또는 조성물의 효과적인 양은 질병, 약량, 투여 일정에 따라 달라지고, 또한 폴리펩티드를 단독으로 투여하는지 또는 다른 치료제와 병행 투여되는지에 따라, 그리고 조성물의 혈청 반감기 및 환자의 전반적인 건강상태에 따라 달라진다.
본 발명은 또한, a)IFNG 폴리펩티드에 공유적으로 결합하는 적어도 한가지 비-폴리펩티드 부분으로 구성된 접합체, 이때 IFNG 폴리펩티드는 huIFNG, rhuIFNG 또는 여기에서 설명하는 IFNG 폴리펩티드(본 발명의 접합체); b)질병을 치료하기 위한 제약학적 조성물, 예로 들면, 간질성 폐 질환, 암, 감염, 골 질환(골 대사 질환 예로 들면, 악성 골다공증), 염증 질환 특히, 간질성 폐 질환, 대부분의 경우 특발성 폐 섬유증등이 치료용 제약학적 조성물 또는 치료 키트에 관계한다. 프레디니손과 같은 글루코코르티코이드도 포함될 수 있다. 적절한 약량은 환자의 체중당 1~4㎍/㎏ 폴리펩티드, 좀더 적절하게는 2~3㎍/㎏ 폴리펩티드가 된다. 좀더 적절한 약량으로는 100-350㎍/㎏ 글루코코르티코이드, 좀더 적절하게는 100-150㎍/㎏ 글루코코르티코이드가 된다.
글루코코르티코이드를 선택적으로 포함하는 분자 또는 조제물을 운반하는 개선된 수단에 대해서도 설명하고 있다.
본 발명은 또한, 간절성 폐 질환을 치료하는데 적절한 키트를 제공하는데, 키트는 a)활성 성분으로 구성된 제 1 제약학적 조성물 b) 상기 언급한 또는 적어도 한 가지 글루코코르티코이드를 포함하는 제 2 제약학적 조성물로 구성된다. 이때 각 성분은 제약학적 수용가능한 담체 또는 부형제와 선택적으로 제공된다.
본 발명의 접합체는 공지의 방법을 이용하여 제약학적 조성물로 조제된다. 적절한 조제 방법은 Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin) 및 US 5,183,746에서 설명하고 있다.
제약학적 조성물은 다양한 형태로 조제될 수 있는데, 예를 들면, 액상, 겔, 냉동 건조형, 분말, 압착 고형 또는 다른 임의 적절한 영으로 조제될 수 있다. 적절한 형태는 치료되어야 할 질병에 따라 달라지나 이는 당업자가 분명하게 인지할 수 있는 것이다.
제약학적 조성물은 구강, 피하, 정맥, 뇌, 비강, 경피, 복막, 근육, 폐, 질, 직장, 안구 등으로 또는 다른 임의 적절한 방법 예를 들면, PowderJect 또는 ProLease 기술을 이용하여, 투여될 수 있다. 조성물은 주입을 통하여 연속적으로 투여될 수 있으나, 당분야에 공지된 방법(펌프 또는 이식)을 이용하여 환약 주입도 가능하다. 일부 경우에, 조성물을 용액 또는 분무액으로 바로 제공할 수 있다. 적절한 투여 형태는 치료할 특정 질병에 따라 달라지지만, 이는 당분야에 공지된 것이다.
본 발명의 제약학적 조성물은 다른 치료제와 복합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 물질은 동일한 제약학적 조성물의 일부에 포함시키거나 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체와는 별개로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 제약학적 조성물은 다른 치료법에 어쥬번트로 이용될 수 있다. 특히, EP 795332에서 설명하는 것과 같은 글루코코르티코이드와 복합하는 것도 고려할 수 있다.
비경구(장관외) 투여
제약학적 조성물로 예를 들면, 장관외 투여를 목적으로 하는 용액이 될 수 있다. 대부분의 경우에, 제약학적 용액상 조성물은 바로 이용할 수 있는 적절하게는 액상형이 될 수 있으며, 이와 같은 장관외 조성물은 냉동 또는 동결건조된 형으로 제공될 수 있다. 전술한 경우에, 조성물은 사용하기 전에 해동시킨다. 후자 경우는 다양한 저장 조건에서 조성물에 포함된 활성 화합물의 안정성을 강화시키고자 하는 경우에 이용되는데, 동결건조된 조제물은 일반적으로 액상보다는 더 안정적이라는 것을 당업자는 인지할 것이다. 이와 같은 동결건조된 조제물은 한가지 또는 그이상의 적절한 제약학적 수용가능한 희석제 예를 들면, 주사용 멸균 수 또는 멸균된 생리적인 염 용액을 첨가하여 재구성시킨다.
장관외 투여의 경우에, 저장용으로 동결건조된 조성물 또는 수용성 용액으로 조제하는데 있어서, 원하는 순도를 가지는 폴리펩티드를 한 가지 이상의 제약학적 수용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(당분야에서 이용되는 모든 것을 통칭하여 "부형제"라고 함)와 혼합하여 만드는데, 부형제로는 완충제, 안정화제, 보존제, 등장액, 비-이온성 계면활성제, 항산화제 또는 다른 기타 첨가제등이 포함된다.
생리학적 조건에 근접하는 범위내로 pH를 조절하는데 도움을 주는 것이 완충제이다. 이는 일반적으로 2mM 내지 50mM 농도 범위를 가진다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적절한 완충액에는 유기 및 무기산 및 이의 염이 있는데, 예를 들면, 시트레이트 완충액(가령, 구연산 일나트륨, 구연산 이나트륨 혼합물, 구연산-구연산 삼나트륨혼합물, 구연산-구연산 일나트륨 혼합물), 숙신산 완충액(가령, 숙신산-구연산 일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산 이나트륨 혼합물등), 주석산염 완충액(가령, 주석산-주석산 나트륨 혼합물, 주석산-주석산 칼륨 주석산염 혼합물, 주석산염-수산화나트륨 혼합물등), 푸마르산 완충액(가령, 푸마르산-푸마르산 일나트륨 푸마르산염 혼합물, 푸마르산-푸마르산 이나트륨 혼합물, 푸마르산 일나트륨-푸마르산 이나트륨 혼합물등), 글루코네이트 완충액(글루코닌산-글리코네이트 혼합물, 글루코닌산-수산화나트륨 혼합물, 글루코닌산-글루코네이트 혼합물등), 옥살레이트 완충액(가령, 옥살산-옥살산 나트륨염 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산 칼륨 혼합물등), 락테이트 완충액(가령, 젖산-젖산 나트륨염 혼합물, 젖산-수산화나트륨 혼합물, 젖산-젖산 칼륨 혼합물등), 아세테이트 완충액(가령, 아세트산-아세트산 나트륨 혼합물, 아세트산-수산화 나트륨 혼합물등)등이 있다. 인산염 완충액, 히스티딘 완충액, Tris와 같은 트리메틸아민 염등도 가능하다.
보존제는 미생물의 생장을 지연시키기 위해 첨가되는데, 일반적으로 0.2%~1%(w/v)정도로 첨가된다. 본 발명에서 이용되는 적절한 보존제에는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥테데실디메틸벤질 염화암모니움, 할로겐화 벤잘코니움(가령, 염화 벤잘코니움, 브롬화 벤잘코니움, 요오드화 벤잘코니움), 염화헥사메토니움, 알킬 파라벤 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로핵사놀 및 3-펜타놀등이 포함된다.
등장화액은 액상 조성물의 등장성을 위해 첨가되는데, 폴리히드릭 슈가 알코올 적절하게는 트리히드릭 또는 고차 슈가 알코올 예를 들면, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자이레톨, 솔비톨, 만니톨등이 포함된다. 폴리히드릭 알코올은 0.1% 내지 25wt%, 일반적으로 다른 성분들의 상대적인 양을 고려하여 1% 내지 5%정도가 포함된다.
안정화제는 주로 팽창제부터 치료제를 용해시키는 첨가제로의 기능을 하거나 변성 방지를 도와주거나 용기벽에 부착되지 않도록 도와주는 등의 기능을 하는 광범위한 부형제를 말하는 것으로써, 일반적으로 안정화제는 폴리히드릭 슈카 알코올(상기에서 언급); 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 알라닌, 오미틴, L-루이신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌등의 아미노산; 락토즈, 트레할로즈, 스타키오즈, 만디톨, 솔비톨, 자이레톨, 미오이노시톨, 갈락티톨, 글리세롤과 같은 유기 슈가 또는 슈가 알코올; 이노시톨과 같은 사이클리톨과 같은 슈가 알오콜 유사물질; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 고분자; 황을 포함하는 환원 물질 예를 들면 요소, 글루타티온, 트오틱산, 티오글리콜레이트 나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오설페이트 나트륨; 저분자량 폴리펩티드(가령 10개 미만의 아미노산 잔기); 사람의 혈청 알부민, 소의 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 자이로즈, 만노즈, 프락토즈, 글루코즈와 같은 모노사카라이드; 락토즈, 말토즈, 슈크로즈와 같은 디사카라이드; 라피노즈와 같은 트리사카라이드; 덱스트란과 같은 폴리사카라이드등이 된다. 일반적으로 안정화제는 활성 단백질 중량을 기초하여 0.1 내지 10,000중량부 범위로 존재한다.
비-이온성 계면활성제 또는 계면활성제(습윤제로도 알려짐)는 치료제의 용해를 돕고, 교반-이로써 조성물은 폴리펩티드의 변형을 유발하지 않으면서 전단 표면 스트레스에 노출되게됨-에 의해 유도되는 응집으로부터 폴리펩티드를 보호하기 위해 첨가될 수 있다. 적절한 비-이온성 계면활성제는 폴리오르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 ), Pluronic?폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(Tween?-20, Tween?-80 등)이 있다.
기타 추가 부형제에는 팽창제 또는 충진제(가령, 전분), 킬레이트제(EDTA), 항산화제(아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 공용매등이 포함된다. 활성 성분은 또한, 코아세르베이션 기술 또는 인터페이셜 중합반응을 이용하여 만든 마이크로캡슐(예를 들면 하이드록시메틸셀룰로즈, 젤라틴, 폴리-(메틸메타아크릴레이트)마이크로캡슐); 콜로이드성 약물 운반 시스템(리포좀, 알부민 소포, 마이크로에멸젼, 나노입자, 나노캡슐) 및 마크로에멸젼 내에 포집시킬 수도 있다. 이와 같은 기술은 Remingtons' Pharmaceutical Science를 참고하면 된다.
in vivo로 투여하기 위해 이용되는 장관외 조성물은 멸균을 해야 한다. 이는 멸균용 여과 막을 통한 여과를 통하여 멸균을 할 수 있다.
지연 방출 조제물
지연 방출 조제물의 적절한 예로는 접합체를 포함하는 고형 소수성 고분자로된 반투성 매트릭스, 필름 또는 마이크로캡슐형과 같은 적절한 형을 가지는 매트릭스등이 포함된다. 지연 방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(가령, 폴리(2-하이드록시에틸-메타아크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루타민산 및 에틸-L-글루타메이트 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체 가령, Prolease?technology 또는 Lupron Depot?(젖산-글리콜산 공중합체 및 로이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부틸산 등이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 고분자는 최고 100일 또는 그 이상의 긴 시간동안 분자를 방출시킬 수 있으나, 특정 하이드로겔은 이보다 짧은 기간동안 단백질을 방출한다. 포집된 폴리펩티드는 신체에 오랜 시간동안 남아있는데, 이들은 37℃ 수분에 노출되어 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 상실하게 되고, 면역원성이 변화되기도 한다. 관련 기작에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략을 고안해야 한다. 예를 들면, 티오-디설파이드 상호작용을 통하여 분자간 S-S 결합이 형성되는 응집 기작이 발견된 경우에 설파하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 이용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 고분자 매트릭스 조성물을 개발하여, 안정화를 이룰 수 있다.
경구 투여
경구 투여를 위해서는, 제약학적 조성물이 고형 또는 액상형이어야 하는데, 예를 들면 캡슐, 정제, 현탁액, 에멸젼 또는 용액 형태가 될 수 있다. 제약학적 조성물은 적절하게는 주어진 양의 활성 성분을 포함하는 단위 약형으로 조제되는 것이 바람직하다. 사람 또는 다른 포유류에 이용할 수 있는 적절한 매일 약량은 환자의 상태 및 다른 요인에 따라 아주 다양하게 적용할 수 있으나, 통상의 방법을 이용하여 당업자가 결정할 수 있을 것이다.
경구 투여용 고형 약형에는 캡슐, 정제, 좌약, 분말, 과립등이 포함된다. 이와 같은 고형 약형에서, 활성 화합물은 적어도 한가지 비활성 희석제, 예를 들면 슈크로즈, 락토즈, 전분등과 혼합시킬 수 있다. 이와 같은 약형은 스테아레이트 마그네슘과 같은 윤활제등의 추가 물질로 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 알약의 경우에 약형은 완충제도 포함한다. 정제 및 알약은 장용피로 코팅될 수도 있다.
접합제는 어쥬번트와 혼합될 수 있는데, 예를 들면, 락토즈, 슈크로즈, 전분 분말, 알카노익산 셀룰로오즈 에스테르, 스테아린산, 활석, 스테아레이트 마그네슘, 산화 마그네슘, 인산 및 황산 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 알지네이트 나트륨, 폴리비닐-피롤리돈 또는 폴리비닐 알코올이 혼합될 수 있고, 통상적인 투여를 위해, 정제로 만들거나 캡슐에 넣는다. 또는, 염, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 오일(옥수수 오일, 땅콩 오일, 목화씨오일, 참깨오일), 트라카탄 검 또는 다양한 완충액에 용해시킬 수도 있다. 운반체 또는 희석액에는 시간 지연 물질 예를 들면 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트가 포함되는데, 이를 단독으로 이용하거나 왁스 또는 공지의 다른 물질과 혼합하여 이용할 수도 있다.
제약학적 조성물은 안정화반응과 같은 통상의 제약학적 작업을 거치게 되는데, 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멸젼화제, 완충제, 충진제등같은 통상의 어쥬번트를 포함할 수도 있다.
경구 투여를 위한 액상 약형에는 본 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 비활성 희석제 즉, 물을 포함하는 제약학적으로 수용가능한 에멸젼, 용액, 현탁액, 시럽, 연금약액이 포함된다. 이와 같은 조성물은 또한 습윤제, 감미제, 향료 및 방향제등과 같은 어쥬번트로 포함할 수 있다.
국소 투여
국소 투여용 조제물에는 피부를 침투할 수 있는 또는 눈, 귀, 코로 투여하는데 적절한 액체 또는 반-액상 조제물(가령, 바르는 약, 로션, 연고, 크림, 고약)을 포함한다.
폐로 수송
제트 또는 초음파를 이용한 네블라이져를 사용하는데 적절한 조성물은 물에 용액 ㎖당 약 0.01 내지 25㎎/㎖ 농도로 용해된 폴리펩티드 또는 접합체로 구성된다. 이때, 적절한 농도는 약 0.1 내지 10㎎/㎖이 된다. 조성물에는 완충액, 단순한 당(예를 들면, 단백질을 안정화시키고, 삼투압을 조절하기 위한 당), 0.1 내지 10㎎/㎖의 사람 혈청 알부민이 포함될 수도 있다. 이용될 수 있는 완충액으로는 아세테이트 나트륨, 구연산염 및 글리신들이 있다. 적절하게는 완충액도 조성물로써 용액의 pH를 3 내지 9 범위 조절하는데 적합한 몰농도를 가진다. 일반적으로1mM 내지 50mM 몰범위의 완충액이 이와 같은 목적에 적합하다. 안정화에 이용될 수 있는 당으로는 말토즈, 락토즈, 만니톨, 솔비톨, 트레할로즈, 자이로즈등이 있고, 조성물 중량당 1% 내지 10% 범위의 양이 된다.
네블라이져 조성물에는 에어로졸을 형성하는데 용액의 원자화에 따른 단백질이 표면 응집되는 것을 감소시키거나 이를 예방하기 위한 계면활성제도 포함될 수 있다. 통상 다양한 계면활성제가 이용될 수도 있는데, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 알코올 그리고 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 그 양은 일반적으로 조성물 중량의 0.001% 내지 4% 범위가 된다. 본 발명의 목적에 특히 적합한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트이다.
본 발명의 적절한 액체 입자 분산액을 만드는 방법과 특정 조성물은 WO94/20069, US5,915,378, US5,960,792, US5,957,124, US5,934,272, US 5,915,378, US 5,855,564, US 5,826,570, US 5,522,385에서 설명하고 있다.
정해진 약량의 흡입 장치에 사용할 수 있는 조성물은 일반적으로 미세하게 분리된 분말로 구성된다. 이와 같은 분말은 동결건조시킨 후, 액상 접합체 조성물을 분쇄하여 만들 수 있는데, 사람의 혈청 알부민(HSA)과 같은 안정화제를 포함할 수도 있다. 일반적으로 0.5%(w/w)이상의 HSA를 첨가한다. 또한, 한 가지 이상의 당 또는 당 알코올이 필요에 따라 조제물에 첨가된다. 당 또는 당 알코올로는 락토즈, 말토즈, 만니톨, 솔비톨, 솔비토즈, 트레할로즈, 자이리톨, 자일로즈등이 포함된다. 조성물에 첨가되는 양은 0.01 내지 200%(w/w), 적절하게는 존재하는 접합체의 약 1 내지 50% 범위가 된다. 이와 같은 조제물을 동결건조시키고, 원하는 입자 크기로 분쇄한다.
그 다음 적절한 크기 입자를 계면활성제의 도움을 받아, 추진제에 현탁시킨다. 추진제는 이와 같은 목적을 위해 이용되는 임의 통상적인 물질이 되는데, 예를 들면, 클로로플로오르카본, 하이드로클로로플로오로카본, 하이드로플로오로카본 또는 트리클로로플로오로메탄, 디클로로디플로오르메탄, 디클로로테트라플로오르에탄올, 1,1,1,2-테트라플로오르에탄 또는 이의 복합물을 포함하는 하이드로카본등이 있다. 적절한 계면활성제에는 소르비탄 트레올레이트, 콩 레시틴등이 포함된다. 올레산이 계면활성제로 유용할 수도 있다. 그 다음, 이와 같은 혼합물을 운반장치에 적하한다. 본 발명의 목적에 이용할 수 있는 상업적으로 이용할 수 있는 적절한 일정 약량을 제공하는 흡입기로는 Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.가 공급하는 Ventolin있다.
분말 흡입기용 조제물에는 접합체를 포함하는 미세하게 분쇄된 건분말이 포함되는데, 팽창제 가령, 락토즈, 솔비톨, 슈크로즈 또는 만니톨이 장치로부터 분말을 분산시킬 수 있을 정도의 양 가령, 중량의 50% 내지 90%가 포함된다. 분말 입자들은 평균 직경이 약 10㎛, 적절하게는 0.5 내지 5㎛, 가장 적절하게는 1.5 내지 3.5㎛를 가지고, 밀도가 1g/㎠인 입자에 상응하는 운동성을 폐에서 가질 수가 있다. 여기에서 설명하는 기술에 따라 이용할 수 있는 분말 흡입기로는 Fisons Corp., Bedford, Mass.가 제공하는 Spinhaler가 있다.
이와 같은 장치용 분말은 US5,997,848, US5,993,783, US5,985,248,US5,976,574, US5,922,354, US5,785,049, US 5,654,007에서 설명하는 방법으로 만들고, 운반할 수 있다.
치료요법적 산물을 폐로 운반하도록 고안된 기계적인 장치에는 네블라이져, 정해진 약량 흡입기, 분말 흡입기등이 포함되나 이에 국한시키지 않고, 이들 모두는 당업자가 잘 알고 있는 것들이다. 본 발명을 실행하는데 적절한 시판되는 장치로는 Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri.가 공급하는 Ultravent 네블라이져; Marquest Medical Procucts, Englewood, Colorado가 공급하는 Acorn Ⅱ 네블라이져; Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina가 공급하는 Ventolin 정량 흡입기; Fision Corp., Bedfor, Massachusetts가 공급하는 Spinhaler 분말 흡입기; Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, California가 공급하는 "standing cloud"; Alkermes, Cambridge, Massachusetts기 공급하는 AIR 흡입기; Aradigm Corporation, Hayward, California가 공급하는 AERx 폐로 약물을 운반하는 시스템등이 있다.
본 발명은 세균성, 바이러스성 감염, 암, 종양, 간질성 폐질환 가령 특발성 폐 섬유증, 육아종증 질병, 골 질환(예를 들면, 골 대사 질환 가령, 악성 골다공증), 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환 치료용 조성물과 그 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 huIFNG 또는 rhuIFNG에 대한 순환 항체를 가지는 포유류를 치료하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 IFNG 생활성을 가지고, 이와 같은 항체와는 반응을 하지 않는 화합물을 투여하는 것으로 구성된다. 화합물은 적절하게는 여기에서 설명하는 접합체이고, 포유류는 사람이 된다. 치료될 포유류는 질병을 가지고 있는데, 이 질병에 유용한 치료물질이 IFNG이다. 이때, IFNG 생활성을 가지나, 이의 항체와는 반응을 하지 않는 화합물이 주사용 또는 다른 임의 적절한 형태의 조제물로 만들어진다. "순환하는 항체"란 상업적으로 이용할 수 있는 IFNG 조제물로 처리하였을 때 이에 반응하여 포유류내에서 형성된 자가항체를 말한다.
또한 유전자 요법에 이용시에, 본 발명의 IFNG 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드를 이용하는 것도 고려해볼 수 있다. 특히, 관심을 끄는 것은 "추가 글리코실화반응 부위에 결합시키기 위해 변형된 본 발명의 글리코실화된 폴리펩티드" 단락에서 설명하고 있는 IFNG 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드를 이용하는 것이다. 따라서, 폴리펩티드의 글리코실화반응은 유전자 치료과정동안에 얻을 수 있는데, 즉, 사람의 신체내에서 뉴클레오티드 서열이 발현된 뒤에 얻을 수 있다는 것이다.
고려해야할 유전자 치료법에는 상기 질병을 치료하는 것이 포함되는데, 이때 폴리펩티드가 효과적인 치료법을 제공할 것으로 기대된다.
유전자 치료법을 이용하여 국소로 IFNG를 운반함으로써 표적부위에 치료요법제를 제공하고, 불-특정 투여와 연관하여 나타나는 잠재적인 독성 문제를 피할 수 있다.
in vitro및in vivo유전자 치료용으로 고려하였다.
한정된 세포군에 잠재적 치료요법적 유전자를 운반하는 몇가지 방법이 공지되어 있다. 참고문헌으로는 Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy",Science, 260, pp. 926-31(1993)이 있고, 이들 방법에는 다음이 포함된다:
직접 유전자를 전달하는 방법-Wolff et al., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In vivo", Science 247, pp. 1465-68(1990)에서 설명하는 것과 같은 방법;
리포좀-중개된 DNA를 전달하는 방법-Caplen et al., "Liposomemediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis" Nature Med., 3, pp. 39-46(1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med., 1, pp. 15-17(1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells" Biochem. Biophys Res. Comm., 179, pp. 280-85(1991)에서 설명하는 방법;
레트로바이러스-중개된 DNA 전달방법-Kay et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophills B: Sustained Partial Correction In Factor Ⅸ-Deficient Dogs", Science, 262, pp. 117-19(1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, pp.808-13(1992)에서 설명하는 방법; 그리고
DNA 바이러스-중개된 DNA를 전달하는 방법. 이와 같은 DNA 바이러스에는 아데노바이러스(적절하게는 Ad-2 또는 Ad-5계 벡터), 허피스 바이러스(적절하게는 하피스 심플렉스계 벡터), 파르보바이러스(적절하게는 "결손" 또는 비-자발성 파르보바이러스계 벡터, 좀더 적절하게는 아데노-연합된 바이러스계 벡터, 가장 적절하게는 AAV-2계 벡터)(Ali et al., "The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, pp. 367-84(1994); US 4,797,368, and US 5,139,941)등이 포함된다.
본 발명은 다음의 실시예에서 추가 설명된다. 실시예는 어떠한 방식으로든 간에 본 명세서 및 청구범위의 개론을 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
재료 및 방법
검사
인터페론 검사의 개요
이미 공개된 바와 같이, IFNG는 HeLa 세포상에서 IFNG 수용체와 상호작용하여 수용체를 활성화시킨다. 결과적으로, 인터페론으로 자극된 반응 원소(ISRE)를 포함하는 프로모터에서 전사가 활성화된다. 따라서, HeLa 세포에 위치한 ISRE 결합된 루시페라제 리포터 유전자(ISRE-luc)를 이용하여 인터페론 수용체의 작용물질에 대한 스크린이 가능하다.
1차 검사
HeLa 세포는 ISRE-Luc 및 pCDNA 3.1/hygro로 공동 형질변환되고, 하이그로마이신 B를 포함하는 DMEM 배지에서 선별하여 형질변환된 세포 클론을 얻을 수 있다. IFNG 존재하에서 그리고 IFNG 없는 상태에서 루시페라제 활성을 이용하여 세포 클론을 스크린 할 수 있다. 자극을 받지 않은 루시페라제 활성에 비해 자극을 받은 루시페라제 활성비가 가장 큰 세포 클론을 추가 시험에 이용하였다.
뮤테인을 선별하기 위해, 96웰 배양 플레이트상에 웰당 15,000세포를 접종하고, DMEM 배지에서 하룻밤동안 배양하였다. 그 다음날 뮤테인 뿐만 아니라 표준을다양한 농도로 세포에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2대기 하에서 37℃, 6시간동안 배양시켰다. 연속하여 LucLite 기질(Packard Bioscience, Groningen The Netherlands)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 봉하고, TopCount 루미노메터(Packard)상에서, SPC 방식(단일 광자 카운트 방식)으로 발광을 측정하였다. 개별 플레이트에는 자극을 받은 기준으로써 IFNG를 포함하는 웰과 자극을 받지 않은 기준으로써 정상 배지를 포함하는 웰이 있다. 자극을 받은 루시페라제 활성과 자극을 받지 않은 루시페라제 활성사이에 비율은 뮤테인 활성과 실험간 변이에 대한 내부 기준으로 이용한다.
in vivo 상에서 IFNG 접합체의 기능상 반감기
생물학적 반감기를 측정하는 방법은 문헌에서 설명하는 여러 가지 방식으로 실행할 수 있다. Rutenfranz et al.(J. Interferon Res. 1990, Vol. 10, p.337-341)에서 설명하는 한 방법은 8주령된 C57BL/6 생쥐에 IFNG를 정맥 및 근육 주사한 것을 이용하는 것이다. Hep-2 세포 및 소포 구내염 바이러스(VVS)를 이용하여, 뮤린 혈청에서 IFNG 역가를 결정하는 생물학적 검사를 이용하여, 생물학적 반감기를 측정하였다. 또 다른 방법으로는, 혈청에서 IFNG를 감지하기 위해 ELISA를 이용하였다.
또 다른 방법으로, 방사능이 있는 라벨된 IFNG을 이용하여 IFNG의 피하 흡착 및 국소 분포를 연구한다. Croos and Roberts(J. Pharm., 1993, vol. 45, p.606-609)는 마취한 암컷 Spraque-Dawley 쥐에서125IFNG 연구하였다. 피하 투여 후에,혈액 및 조직 샘플을 수집하여, 감마-카운팅으로 IFNG 양을 측정하였다.
IFNG의 PEG화반응
US5,109,120의 실시예 2에서 설명하는 방식으로 PEG화된 rhuIFNG를 준비하였다. 유사하게, 여기에서 설명하는 뮤테인 N25K을 가지는 변형된 IFNG 폴리펩티드도 PEG화하였다. 생성된 PEG-IFNG-N25K 접합체는 rhuIFNG 접합체와 비교하였을 때, 추가 부착된 PEG분자를 가지고 있다.
제약학적 조성물의 준비
당분야에 공지된 과정에 따라 주사용 조성물에 관련된 정제된 접합체를 조제하여 간질성 폐 질환 치료용 제약학적 조성물을 만들 수 있는데, 각 바이알에는 rhuIFNG 또는 IFNG-N25K와 같은 접합체가 50㎍, 100㎍, 200㎍, 300㎍, 400㎍, 500㎍ 양이 포함된다.
표면 노출된 아미노산 잔기의 확인
구조
Ealick et.al. Science 252:698-702(1991)는 X-선 결정학에 의해 확인된 huIFNG의 실험적인 3D 구조에 대해 보고한 바 있는데, IFNG 동종이량체의 C-알파 트레이스에 대한 것이었다. Walter et. al. Nature 376:230-235(1995)는 또한, 가용성 형태의 IFNG 수용체 2개 분자를 가지는 IFNG 동종이량체 구조에 대해 보고한 바 있다. 이와 같은 구조 좌표는 이미 공지된 것이다. Thiel at al., Structure 8:927-937(2000)에서는 구조에서 IFNG 동종이량체와 상호작용을 가지 않는 제3의 수용체 분자를 가지는 IFNG 가용성 수용체 두 분자와 함께 복합체를 이루는 IFNG동종이량체 구조에 대해 보도한 바 있다.
방법
접근가능한 표면 지역(ASA)
컴퓨터 프로그램 Access(B. Lee and F.M.Richards, J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)) 버전 2(Copyright(c) 1983 Yale University)를 이용하여 구조에서 개별 원자의 접근가능한 표면 지역(ASA)을 계산하였다. 이 방법은 일반적으로 1.4Å크기의 프로브를 이용하고, 프로브 중심에 의해 지역이 형성되어, 접근가능한 표면 지역을 규정짓는다. 이와 같은 계산을 실행하기 전에, 단백질에 직접 관련이 안된 모든 물 분자, 수소 원자 및 다른 원자를 좌표로부터 제거한다.
측쇄의 단편 ASA
측쇄의 단편 ASA는 측쇄에 있는 원자들의 ASA 합을 연장된 ALA-x-ALA 삼가펩티드에서 각 잔기형의 측쇄 원자의 ASA를 나타내는 값으로 나누어 계산할 수 있다(Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol.: 220,507-530). 예를 들면, CA 원자는 글리신 잔기의 측쇄의 일부분이나 나머지 잔기의 일부분이 아닌 것으로 간주한다. 다음의 표는 측쇄에 대해 100% ASA 기준으로 이용한다;
Ala 69.23Å2
Arg 200.35Å2
Asn 106.25Å2
Asp 102.06Å2
Cys 96.69Å2
Gln 104.58Å2
Glu 134.61Å
Gly 32.28Å
His 147.00Å
Ile 137.91Å
Leu 140.76Å
Lys 162.50Å
Met 156.08Å
Phe 163.90Å
Pro 119.65Å
Ser 78.16Å
Thr 101.67Å
Trp 210.89Å
Tyr 176.61Å
Val 114.14Å
구조에서 감지되지 않은 잔기는 유연성 있는 부분에 거주하기 때문에 100% 노출되는 것으로 규정짓는다.
원자간에 거리 측정
InsightⅡ v. 98.0, MSI INC.의 분자 그래픽 소프트웨어를 이용하여, 원자간의 거리를 계산한다.
수용체 결합 부위 결정
수용체-결합 부위는 수용체 결합시에 전하를 띄는 접근가능한 표면을 가지는 모든 잔기로 구성된 것으로 규정하였다. 이는 적어도 2가지 ASA 계산으로 결정하는데, 하나는 리간드/수용체 복합체에 있는 분리된 리간드상에서 계산하는 것이고, 다른 하나는 완전한 리간드/수용체 복합체상에서 계산된 것이다.
결과
이용된 X-선 구조는 Thiel at al., Structure 8:927-937(2000)에서는 구조에서 IFNG 동종이량체와 상호작용을 가지 않는 구조에서 제3의 분자를 가지는 IFNG 가용성 수용체 두 분자와 함께 복합체를 이루는 IFNG 동종이량체의 구조이다. 이 구조는 IFNG 동종이량체로 구성되는데, 이때, 두 분자는 A와 B로 라벨한다. 작제 목적으로, MO로 라벨된 IFNG 앞에 추가 메티오닌이 위치하는데, 서열은 10개 잔기로 C-말단이 절두된 것이다(Q33이 절두된 분자의 최종 잔기이다). 실시예의 모든 계산시 구조에서 MO를 뺀다. 두 개 IFNG 단령체 구조는 잔기 120 다음에는 매우 약한 전자 밀도를 가지는데, 잔기 T126전까지만 모형을 만들었다. 따라서, 이 실시예에서 계산이전에 구조로부터 잔기 S121-T126를 제거한다. C와 D로 라벨된 두 개 수용체 단편을 IFNG 동종이량체와 바로 상호작용하도록 하고, E로 라벨된 제 3 수용체 분자는 IFNG 동종이량체와는 접촉을 하지 않기 때문에, 이 계산에서 제외되었다.
표면 노출
두 개 분자 A와 B에서 M0 및 S121-T126을 제외하고, 분자의 동종이량체상에 단편적인 ASA 계산을 실행하면 적어도 한 개의 단량체에서 표면에 노출된 이들 측쇄의 25%이상을 가지는 잔기는 다음과 같다; Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K12, K13, Y14, N16, G18, H19, S20, D21, A23, D24, N25, G26, T27, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59, K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104, H111, Q115, A118, E119.
다음의 잔기는 적어도 한 개의 단량체에서 표면에 노출된 측쇄의 50%이상을 가지는 잔기이다; Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K13, N16, G18, H19, S20, D21, A23, D24, N25, G26, T27, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104, Q115, A118, E119.
수용체 분자 C와 D를 포함하고, 두 개 분자 A와 B에서 M0 및 S121-T126을 제외하고, 분자의 동종이량체상에 단편적인 ASA 계산을 실행하면, 적어도 한 개의 단량체에서 표면에 노출된 이들 측쇄의 25%이상을 가지는 잔기는 다음과 같다; Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K13, Y14, N16, G18, H19, D21, N25, G26, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59, K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97,S99, T101, D102, L103, N104, E110. 다음의 잔기는 적어도 한 개의 단량체에서 표면에 노출된 아미노산 측쇄의 50%를 가지는 잔기이다; P3, K6, N10, K13, N16, D21, N25, G26, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104.
상기 모든 위치는 본 발명에 따른 변형의 표적이 된다.
두 개 리스트를 비교해보면, 수용체 결합시에 25%이상의 측쇄 ASA 리스트에서 K12, S20, A23, D24, T27, H111, Q115, A118이 제거되고, 수용체 결합시에 50%이상의 측쇄 ASA 리스트에서 Q1, D2, E9, G18, H19, S20, A23, D24, T27, Q115, A118, E119가 제거된다.
구조상에서 결정되지 않은 잔기는 잔기 S121, P122, A123, A124, K125, T126, G127, K128, R129, K130, R131, S132, Q133, M134, L135, F136, R137, G138, R139, R140, A141, S142, Q143과 같이 완전히 표면 노출된 것으로 처리하였다. 이들 잔기들은 또한 본 발명에 따라 부착기들을 도입시키기 위한 별도 표적을 구성한다(또는 표면 노출된 아미노산 잔기에 있는 기에 속하는 것으로 보여지는데, 가령 25%이상 또는 50%이상의 노출된 측쇄를 가진다).
수용체 결합 부위
상기에서 설명한 것과 같이 ASA 계산을 실시하면, 분리형 이량체에서 계산한 것과 같과 비교하였을 때, 복합체에 적어도 한 개 단량체에서 IFNG 분자중 다음의 잔기에서 ASA가 감소되었다; Q1, D2, Y4, V5, E9, K12, G18, H19, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K34, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119.
실시예 1
이스트와 CHO 세포에서 IFNG를 발현시키기 위한 발현 카세트의 고안
이스트 세포에서 상당수준으로 발현시키기 위해, 고유 시그날 펩티드없이, 완전한 huIFNG를 인코드하는 전장 cDNA를 포함한 DNA 서열(GenBank 발현 번호 X13274)을 변형시켰다. 우선, MATa 시그날 펩티드를 IFNG 대신에 도입시켜, 이스트 배지로 분비되도록 하였다. 둘째, huIFNG 뉴클레오티드의 코돈은 이스트에서 빈번하게 이용되는 코돈 쪽으로 이용하도록 코돈 사용을 편향되도록 변형시켰다. 결과적으로, DNA 제한 효소를 위한 제한효소 인지 부위를 도입시키기 위해, 서열에서 특정 뉴클레오티드를 다른 것으로 치환시켰다. 유전자가 합성될 수 있도록 프라이머를 고안하였다. 플라티늄Pfx키트(Life Technologies)를 이용한 1단계 PCR과 PCR 사이클링 파라메터를 이용하여, 프라이머를 합성된 유전자로 어셈블리하였다. 동일한 조건을 이용한 PCR로 어셈블리된 유전자를 증폭시키고, 유전자는 SEQ ID NO 3에 있는 서열을 가진다. 합성된 유전자를 pJSO37-lip(Okkels, J.S.(1996) Rec. DNA Biotech. Ⅲ, vol 782, 202-207) 5'말단의HindⅢ부위와 3'말단의XbaI부위에 클론시켜, pIGY-1를 얻는다.
공유적으로 연결된 단량체 IFNG 폴리펩티드를 포함하는 측쇄 구조를 만들기 위해, 다음의 세 개 작제물을 만들었다;
Ⅰ) 구조 1 ; 사람의 IgA1 힌지 부분을 모델로 한 두 개의 완전한 전장 huIFNG 폴리펩티드(Lunn CA et.al., J. Biol. Chem., 267, 17920-17924, 1992), 이때 이 두 개 폴리펩티드는 19mer 링커 펩티드로 연결됨. 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR을 한다
ADJ0025'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3'(SEQ ID NO 4)
ADJ0035'-GCGGCCCTCTAGATTACT-3'(SEQ ID NO 5)
ADJ0045'-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGA
AAGAA-3'(SEQ ID NO 6)
ADJ0075'-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGC
GGAGTAGAAGGAACCGCTGTTTTAGCAGCTGGAGACAATT-3'(SEQ ID NO 7)
PCR 단편을 SphI(링커 부분에 도입된)에서 단량체를 어셈블리시킨 pIGY-1의 5'단부ClaI위치와 3'단부 XbaI사이에 클론시켰다. 이 구조를 pIGY-2라고 한다.
Ⅱ). 구조체 2; 링커없이 두 개의 단령체로 된 완전한 전장 huIFNG 폴리펩티드를 포함하는 구조. 다음의 프라이머를 PCR에 이용한다.
ADJ0025'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3'(SEQ ID NO 8)
ADJ0035'-GCGGCCCTCTAGATTACT-3'(SEQ ID NO 9)
ADJ0065'-TTTAGAGGTAGAAGAGCTTCTCAGCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT
-3'(SEQ ID NO 10)
ADJ0095'-AGCTTCTTTCACATATGGATCTTGCTGAGAAGCTCTTCTAGGTCTAAA-3'
(SEQ ID NO 11)
PCR 단편은 2 단계 PCR을 이용하여 어셈블리시켜, pIGY-1의 5'단부의ClaI위치와 3'단부의XbaI 사이에 클론시키고, 이를 pIGY-3이라고 한다.
Ⅲ). 구조체 3. 상기에서 설명하는 19-mer 링커를 통하여 공유적으로 연결된 두 개의 C-말단 절두된(적어도 11개의 아미노산) 단량체형 IFNG 폴리펩티드. 다음의 폴리펩티드를 이용한다.
ADJ0015'-TGCTCTAGACATCTGAGATCGTTTTCTCTTTCC-3'(SEQ ID NO 2)
ADJ0025'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3'(SEQ ID NO 13)
ADJ0045'-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3'
(SEQ ID NO 14)
ADJ0055'-ATTCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTT
GGCGGAGTAGAAGGAACCGGCATCTGAGATCTTTTTCTCC-3'(SEQ ID NO 15)
PCR 단편은 SphI(링커 부분에 도입된)에서 단량체를 어셈블리시킨 pIGY-1의 5'단부ClaI위치와 3'단부 XbaI사이에 클론시켰다. 이 구조를 pIGY-4라고 한다.
CHO 세포에서 발현을 위한 작제
CHO 세포에서 IFNG를 발현시키기 위해, 시그날 펩티드를 포함하는 IFNG를 pcDNA3.1/hygro(Invitrogen)으로 클론시킬 수 있도록, 다음의 올리고뉴클레오티드를 합성시킨다.
ADJ012
5'-CGCGGATCCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTT
GGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3'(SEQ ID NO 16)
이 발현 벡터에 IFNG를 클론시키기 위해, ADJ012 및 ADJ003를 이용하고, 주형으로는 pIGY-1을 이용하여, PCR 증폭시키면, pcDNA3.1/hygro의 5'단부BamHI와 3'단부XbaI 사이 위치에 클론될 수 있는 450bp 단편이 만들어지는데, 클론 생성물은 pIGY-5라고 한다.
IFNG에 글리코실화반응 부위를 도입시키기 위해, 올리고뉴클레오티드를 디자인하여, 전통적인 2단계 PCR 반응과 5'단부BamHI와 3'단부XbaI 사이 위치에 PCR 단편을 클론시켜, PCR로 인한 변화가 발현 벡터(pIGY03)내에 도입될 수 있도록 올리고뉴클레오티드를 고안하였다.
따라서, 두 개 벡터 프라이머는 특정 돌연변이 프라이머를 이용하도록 고안되었다; ADJ0135'-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3'(SEQ ID NO 17)
ADJ1045'-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3'(SEQ ID NO 18)
상이한 돌연변이를 만들기 위해, 다음의 프라이머를 고안하였다;
K12T
ADJ0155'-AGCATTAAAATACTTCGTCAAGTTTTCAGC-3'(SEQ ID NO 19)
ADJ0165'-GCTGAAAACTTGACGAAGTATTTTAATGCT-3'(SEQ IN NO 20)
G18T
ADJ0175'-CACATCAGAATGAGTAGCATTAAAATA-3'(SEQ ID NO 21)
ADJ0185'-TATTTTAATGCTACTCATTCTGATGTG-3'(SEQ ID NO 22)
E38N
ADJ0195'-CATAATTTTTCGATCGGATTCGTTTTTCCAATTCTT-3'(SEQ ID NO23)
ADJ0205'-AAGAATTGGAAAAACGAATCCGATCGAAAAATTATG-3'(SEQ ID NO 24)
K61T
ADJ021 5'-AATAGACTGATCGTCTGTAAAGTTTTTAAA-3'(SEQ ID NO 25)
ADJ0225'-TTTAAAAACTTTACAGACGATCAGTCTATT-3'(SEQ ID NO 26)
N85T
ADJ0235'-TCTTTTCTTTTTAGTACTATTGAAAAACTT-3'(SEQ ID NO 27)
ADJ0245'-AAGTTTTTCAATAGTACTAAAAAGAAAAGA-3'(SEQ ID NO 28)
K94N
ADJ0255'-ATAATTAGTCAAATTTTCGAAGTCATG-3'(SEQ ID NO 29)
ADJ0265'-GATGACTTCGAAAATTTGACTAATTAT-3'(SEQ ID NO 30)
299N
ADJ0275'-AATCAAGTCAGTAACGTTATAATTAGTCAA-3'(SEQ ID NO 31)
ADJ0285'-TTGACTAATTATAACGTTACTGACTTGAAT-3'(SEQ ID NO 32)
Q106T
ADJ0295'-ATGAATAGCTTTACTAGTCACATTCAAGTC-3'(SEQ ID NO 33)
ADJ0305'-GACTTGAATGTGACTAGTAAAGCTATTCAT-3'(SEQ ID NO 34)
2단계 PCR과 이들 프라이머 쌍을 각각BamHI 및XbaI으로 절단하면, pIGY-5에 클론될 수 있는 447bp 단편을 얻을 수 있다.
CHO 세포에서 인터페론gamma발현
CHO K1 세포주(ATCC#CCL-61)로 상기 언급한 구조물이 트랜스팩션되는데, 이때 이용되는 트랜스팩션 물질로는 Lipofectamine 2000(Life Technologies, USA)을 이용한다. 24시간 후에, 배양 배지를 수득하고, 인터페론 gamma 활성 및 농도에 대해 검사하였다.

Claims (35)

  1. IFNG 활성을 나타내고 IFNG 폴리펩티드에 공유적으로 부착된 적어도 한 개의 비-폴리펩티드 부분으로 구성된 접합체에 있어서, 폴리펩티드는 모체 IFNG 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열로 구성되는데, 상이한 점은 비-폴리펩티드 부분용 부착기로 구성된 적어도 한 개의 도입 또는 한 개의 삽입 아미노산 잔기를 가지는 것을 특징으로 하는 접합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 모체 IFNG 폴리펩티드는 야생형 사람 IFNG(huIFNG) 또는 이의 변이체 또는 이의 단편이 되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제 1 비-폴리펩티드 부분은 고분자, 친지성 화합물, 당 부분, 유기 유도화된 물질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제 1~3항에 있어서, 비-폴리펩티드 부분용 부착기로 구성된 아미노산 잔기는 표면 노출된 아미노산 잔기가 차지하는 huIFNG 내에 있는 위치로 도입되거나 제거되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제 4 항에 있어서, 비-폴리펩티드 부분용 부착기로 구성된 아미노산 잔기는 아미노산 측쇄의 적어도 25%가 표면 노출된 것으로 이루어진 아미노산 잔기가 차지하는 huIFNG 내에 있는 위치로 도입되거나 제거되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 제 4 항에 있어서, 비-폴리펩티드 부분용 부착기로 구성된 아미노산 잔기는 아미노산 측쇄의 적어도 50%가 표면 노출된 것으로 이루어진 아미노산 잔기가 차지하는 huIFNG 내에 있는 위치로 도입되거나 제거되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  7. 제 3~6 항중 어느 한 항에 있어서, 제 1 비-폴리펩티드 부분이 당 부분인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 당 부분은 N-연결된 당 부분이고, 모체 폴리펩티드와 비교하였을 때, IFNG 폴리펩티드는 적어도 한 개가 제거된 또는 도입된 N-글리코실화된 부위로 구성된 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제 8 항에 있어서, IFNG 폴리펩티드는 다음에서 선택된 적어도 한 개의 돌연변이로 구성된 것을 특징으로 하는 접합체.
    Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T,E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N, R140N+S142T.
    이때, 치환체는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산을 가지는 huIFNG에 대해 나타낸 것이다.
  10. 제 9 항에 있어서, IFNG 폴리펩티드는 다음에서 선택된 적어도 한 개의 치환체로 구성된 것을 특징으로 하는 접합체.
    P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T,N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N, R140N+S142T.
    이때, 치환체는 SEQ ID NO 2에서 볼 수 있는 아미노산을 가지는 huIFNG에 대해 나타낸 것이다.
  11. 제 8~10항중 어느 한 항에 있어서, IFNG 폴리펩티드는 다음에서 선택된 적어도 한 개의 치환체로 구성된 것을 특징으로 하는 접합체.
    K12S/T, G18S/T, E38N, K61S/T, N85S/T, K94N, S99N, Q106S/T, A124N, K130N, R140N, 특히 E38N, K94N, S99N, A124N, K130N, R104N.
  12. 제 7~11 항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 한 개의 제 2 비-폴리펩티드 부분으로 구성된 것을 특징으로 하는 접합체.
  13. 제 12 항에 있어서, 제 2 비-폴리펩티드 부분은 고분자인 것을 특징으로 하는 접합체.
  14. 제 12 또는 13항에 있어서, 폴리펩티드는 모체 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열을 가지는데, 즉, 제 2 비-폴리펩티드 부분용 부착기로 구성된 적어도 한 개의 도입 또는 삭제된 아미노산 잔기가 차이가 나는 것을 특징으로 하는 접합체.
  15. 제 1~6항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 비-폴리펩티드 부분은 고분자인 것을 특징으로 하는 접합체.
  16. 제 13~15항 중 어느 한 항에 있어서, 고분자는 직쇄 또는 분지쇄 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 접합체.
  17. 제 12~16항중 어느 한 항에 있어서, 고분자에 부착용 기로 구성된 아미노산 잔기는 시스테인, 리신, 아스파르트산 및 글루타민산으로 구성된 것을 특징으로 하는 접합체.
  18. 제 15~17항중 어느 한 항에 있어서, 비-폴리펩티드는 부착기로 시스테인을 가지고, 이때 적어도 한 개의 시스테인 잔기는 표면에 노출된 아미노산 잔기가 차지하고 있는 huIFNG 내 위치로 도입된 것을 특징으로 하는 접합체.
  19. 제 15~17항중 어느 한 항에 있어서, 비-폴리펩티드는 부착기로 리신을 가지고, 이때 적어도 한 개의 리신 잔기가 제거되고, 리신 잔기는 K6, K12, K13, K34, K37, K43, K55, K61, K68, K74, K80, K86, K87, K88, K94, K108, K125, K128, K130(번호는 SEQ ID NO 2를 기준으로 붙여진 것이다)에서 선택된 치환체로 치환되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  20. 제 19 항에 있어서, 제거될 리신은 K12, K34, K37, K108, K128, K130인 것을 특징으로 하는 접합체.
  21. 제 1~20항중 어느 한 항에 있어서, IFNG 폴리펩티드는 C-말단 단부가 절두된 것을 특징으로 하는 접합체.
  22. 제 1~21항중 어느 한 항에 있어서, IFNG 폴리펩티드는 단일 쇄 IFNG 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 접합체.
  23. 적어도 한 개의 N-말단 PEG화된 IFNG 폴리펩티드로 구성된 IFNG 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 접합체.
  24. 제 23 항에 있어서, IFNG 폴리펩티드는 huIFNG 또는 이의 변이체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 접합체.
  25. 전술한 어느 한 항에 있어서, huIFNG와 비교하였을 때,in vivo기능상 반감기가 증가된 것을 특징으로 하는 접합체.
  26. 제 1~25항중 어느 한 항에 따른 접합체의 폴리펩티드 부분을 인코드하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드.
  27. 제26항에 따른 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  28. 제 26 항에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 제 27항에 따른 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  29. 제 28 항에 있어서, 숙주는 이스트,E. coli, CHO, BHK, HEK293, SF9 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  30. IFNG 폴리펩티드의in vivo기능상 반감기를 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 모체 IFNG 폴리펩티드 위치로 비-폴리펩티드 부분용 부착기를 구성하는 아미노산 잔기를 도입시키거나 또는 제거하고; 이때 도입되는 위치는 부착 기를 포함하지 않는 표면 노출된 아미노산 잔기로 구성되고;
    생성된 변형 폴리펩티드는 부착기로 제거된 또는 도입된 아미노산 잔기를 가지는 비-폴리펩티드 부분과 접합시키게 되는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 비-폴리펩티드 부분은 고분자, 당 부분, 친지성 기, 유기 유도화된 물질에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1~25항중 어느 한 항에 따른 접합체를 준비하는 방법에 있어서, 접합체의 폴리펩티드 부분은 접합이 일어날 수 있는 조건 하에서 접합될 분자와 반응하도록 하고, 형성된 접합체를 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1~25항중 어느 한 항에 따른 접합체와 제약학적으로 수용가능한 희석제, 담체 또는 어쥬번트로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  34. 질환 치료 특히, 간질성 폐질환, 좀더 구체적으로는 특발성 폐 섬유증을 치료하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 제 1~25항중 어느 한 항에 따른 접합체와 제약학적으로 수용가능한 희석제, 담체 또는 어쥬번트로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  35. 질환 치료 특히, 간질성 폐질환, 좀더 구체적으로는 특발성 폐 섬유증을 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 제 1~25항중 어느 한 항에 따른 접합체 또는 제 34항에 따른 제약학적 조성물.
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