JPS6124599A - 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体 - Google Patents

新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体

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JPS6124599A
JPS6124599A JP14395084A JP14395084A JPS6124599A JP S6124599 A JPS6124599 A JP S6124599A JP 14395084 A JP14395084 A JP 14395084A JP 14395084 A JP14395084 A JP 14395084A JP S6124599 A JPS6124599 A JP S6124599A
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JP
Japan
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amino acids
ifn
polypeptide
human interferon
cys
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Application number
JP14395084A
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English (en)
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Seiga Itou
伊藤　菁莪
Yasutoshi Takechi
武市　康利
Moriyuki Sato
盛幸 佐藤
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明のヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
は抗腫瘍、抗ウィルスなどの生理活性を有し、医薬品と
しての用途が期待される。
従来の技術 インターフェロン（以下ＩＦＮと略記する）は、大別し
てＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩ　ＦＮ−Ｔの３種類
が知られており、主としてＩＦＮ−αは白血球細胞、Ｉ
ＦＮ−βは線維芽細胞、ＩＦＮ−γはＴ−リンパ球によ
り生産される。これらのＩＦＮは抗ウィルス作用のみな
らず、ナチュラルキラー細胞やマクロファージの活性化
作用、抗腫瘍作用など多くの生物活性を示す物質として
注目を集めている。
ＩＦＮ−ｒに関しては、動物細胞実験において他のＩＦ
Ｎより強い細胞増殖阻止作用を有することが示されＣＢ
、　Ｙ、　Ｒｕｂｉｎ　ａｎｄ　Ｓ、Ｌ、　Ｇｕｐｔａ
　：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、
　ＩＪＳＡ、　　亘、　５９２８〜５９３２（１９８０
）］　、最近、ＩＦＮ−ｒ　　ｃＤＮＡを大腸菌にクロ
ーン化し、その塩基配列を決めたことが報告されている
［　Ｐ、　Ｗ、Ｇｒａｙ　ら：Ｎａｔｕｒｅ　２９５．
５０３（１９Ｂ２）、　　　Ｒ，Ｄｅｖｏｓ　　ら　：
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
且、　２４８７　（１９８２）　］。
本発明者らも独立にＬ　Ｆ　Ｎ−ｒをコードするＤＮＡ
をクローン化し、その塩基配列が第１表に示したように
Ｄｅｖｏｓらが報告した成熟ＩＦＮ−γと９番目のアミ
ノ酸がリジン（Ｌｙｓ）（ＡＡＡ＞からグルタミン（Ｇ
　］　ｎ）（ＣＡＡ）に置換した新規ＩＦＮ−ｒをコー
ドするクローンを得た。さらに本ＩＦＮ−ｒ遺伝子をト
リプトファンプロモーターをもつベクターｐＫＹＰ−１
０（特開昭５８−１１０６００）に組込んで大腸菌で大
量生産することにも成功した。
次いで、本発明者らは第１表に示したＩＦＮ−γ遺伝子
を出発材料にして、ＩＦＮ−γポリペプチドの誘導体を
製造することを試みた。
ＩＦＮ−αの誘導体についてはＣ末端より１１個のアミ
ノ酸を欠失させた場合、比活性が１７３に低下する例が
報告されているＩ：　Ａ、　Ｂ、Ｐｒａｎｋｅ　ら：Ｄ
Ｎ／’１１−１２２３−２３０　（１９８２）］　、一
方Ｎ末端に１８個のアミノ酸を付加したＩＦＮ−α誘導
体では比活性に変化が見られなかった［　Ｒ，Ｍ、　Ｋ
ｉｎｇら：Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４　１８１
５−１８１８　（１９８３）　］。
ＩＦＮ−βの誘導体についてはＮ末端より５個のアミノ
酸を欠失させた場合、比活性が約１／１００に低下する
こと［Ｔ、　Ｎ１５ｈｉ　ら＝ＤＮΔ　２２６５−２７
３．　　（１９８３）　］　、Ｎ末端に７個のアミノ酸
を付加した場合は、比活性が約１／１０に低下すること
［Ｓ、Ｉｔｏｈら：　Ｄ　Ｎ　Ａ　　３　１５７−１６
５　（１９８４）　３を本発明者らが見出している。
ＩＦＮ−ｒの誘導体については、本発明者らは第１表に
示したＩＦＮ−γの３番目のアミノ酸であるシスティン
（Ｃｙｓ）をチロシン（Ｔｙ、ｒ）に置換した誘導体（
以下３−Ｔｙｒ＝ＩＦＮ−ｒと呼ぶ）をつくり、比活性
かもとのＩＬＮ−ｒよリ２〜４倍強いことを見出し、さ
らに１番目のＣｙｓをセリン（Ｓｅｒ）に置換したもの
（１−３ｅｒ−ＩＦＮ−ｒ）、３番目のＣｙｓをＳｅｒ
に置換したもの（３−３ｅｒ−ＩＦＮ−ｒ）、１番目と
３番目のＣｙｓをＳｅｒに置換したもの（１，３−３ｅ
ｒ−ＩＦＮ−ｒ）および第１表のＩ　Ｆ　Ｎ　−ｒのＮ
末端のアミノ酸を欠失させた誘導体も造成し、これらの
誘導体すべてにもとのＩＦＮ〜Ｔと同等もしくはそれ以
上のインターフェロン活性を検出している。
一方、ネズミの成熟ＩＦＮ−ｒは１３６個のアミノ酸か
らなりヒトＩＦＮ−ｒよりアミノ酸が１０個少ないが、
ヒ）ＩＦＮ−ｒより熱安定性が高いことが知られている
。ネズミＩＦＮ−ｒには１番目と３番目のほかに１３６
番目にもＣｙｓが存在し、これらが分子内でジスルフィ
ド結合を形成しており、これがＩＦＮ分子の安定性に寄
与している可能性が考えられる。［Ｄ、Ｇｏｅｄｄｅｌ
　ら：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ　８０５８４２−５８４６　（１９８４）］発明
が解決しようとする問題点 本発明者らは、生物活性が高く、化学的性質が優れたＩ
ＦＮ−γの誘導体を得るべく研究を行った。
問題を解決するだめの手段 本発明者らは、ＩＦＮ−ｒの分子モデルを作成し、その
結果Ｎ末端から１３５〜１３８番目、とくに１３７番目
にＣｙｓを導入すると、ヒトＩＦＮ−Ｔにおいても分子
内ジスルフィド結合形成の可能性があると考えた。ＩＦ
Ｎ−ｒのＣ末端側のアミノ酸を欠失させ１３７番目のＭ
ｅｔをＣｙｓに置換したいくつかの誘導体を造成したと
ころ、これらの誘導体は、熱安定性が増大しておりまた
比活性においても上昇していた。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、新規なヒ）ＩＦＮ−ｒ誘導体をコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを
含む微生物、該微生物を用いる新規なヒ）ＩＦＮ−ｒポ
リペプチド誘導体の製造法ならびに該ヒトＩＦＮ−ｒポ
リペプチド誘導体自体を提供することを目的とする。
本発明の組換え体プラスミドの造成はＩ　ＦＮ−Ｔをコ
ードするメツセンジャーＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で
得られるｃＤＮΔまたはＩＦＮ−ｒをコードする染色体
ＤＮＡなどを出発物質として行われる。
ヒトＩＦＮ−ｒｃＤＮＡとしては、いかなるものも用い
ることができるが、具体的にはｐｌＦＮｒ−Ｇ／Ｉを用
いることができる。ｐＩＦＮｒ−０４は大腸菌に挿入さ
れ、ΔＴＣＣ３９１２３として米国アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託されている。
ｐｌＦＮｒ−Ｇ４中のＩＦＮ−ＴＤＮＡはマキザム・ギ
ルバート法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、。
′！Ａ３６０　（１９７７）　〕により決定された第１
表に示す塩基配列を有している。
−Ｒ７′ ←　　　ロ　　コ←　　ａく　　（９）＜　　　ＣＡｃ
ｐ■　　　←　　ω←　　（９）−−←　　とく←　　
　ト　　−リ　　φ←　　−＜−＜ｐＩＦＮｒ−０４中
のヒトＩＦＮ−ｒｃ、ＤＮＡを公知のＩＦＮ−ｒｃＤＮ
Ａ　［Ｒ，Ｄｅｖｏｓ　ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　１０２４８７　（１９８２
）］と比較すると成熟ヒ）ＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ
末端より９番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）をコードしている
最初の塩基であるアデニン（Ａ）　　ＣＲ，Ｄｅｖｏｓ
ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、　１０２４８７　（１９８２）］がｐＩＦＮγ−Ｇ４
ｃＤＮΔにおいては対応塩基がシトシン（Ｃ）となって
いるので、このような遺伝子がコードするヒ）　ＩＦＮ
−ｒポリペプチドのＮ末端より９＠目のアミノ酸はＬｙ
ｓではなくＧｉｎに置換することになる。従ってＩ）Ｉ
ＦＮ７−０４は新規なヒトＩＦＮ−γポリペブチ゛ドを
コードしていることは明白である。
従って、第１表に示したＩＦＮ−γから一部のアミノ酸
の欠失または置換によって得られるＩＦＮ−Ｔ誘導体も
新規なＩＦＮ−ｒ誘導体である。
ＩＦＮ−ｒ誘導体をコードするＤＮＡを組み込むプラス
ミドとしては、大腸菌中で該ＤＮＡが発現できるものな
らどのプラスミドでも使うことができる。好ましくは、
適当なプロモーター、例えばｔｒｐ系、ｌａｃ系λファ
ージのＰｔ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入
することができ、しかもシャイン−ダルガノ配列（以下
ＳＤ配列と略記する）と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適
当な距離、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミド
を用いることができる。具体的に好的なプラスミドとし
ては、本発明者らによって造成されたｐＫＹＰｌｏ、ｐ
ＫＹＰｌ　１．ｐＫＹＰｌ２（特開昭５８−１１０６０
０＞などがあげられる。
第１図に示したようにしてｐＧＢＤｌ　（参考例１）を
ＢａｍＨＩで切断し、ついでＴａｑｌで切断後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法［Ａ、　Ｍ。
Ｍａｘａｎら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４５６０（１９７７）　］によっ
て約３１０塩基対（以下ｂｐと略記する）のＤＮＡ断片
を精製する。
次にｐＧＫＡ’２　（参考例２）を）ｌｉｎｄｌｌｌと
Ｈｉｎｆｌで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって、ＩＦＮ−ｒの構造遺伝子の大部分を含む約
４００ｂｐのＤＮＡ断片を得る。
また、ｐＫＹＰｌ９（特開昭５８−１１０６００）をＨ
ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、トリプトフ
ァンプロモーターを含む約４．３　Ｋ　ｂのＤＮＡ切断
を得る。一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−４ポリペプチドの１３
７番目のアミノ酸であるＭｅｔをＣｙｓに変換し、１３
８番目〜１４６番目のアミノ酸を欠失させたＩＦＮ−ｒ
誘導体をつくる目的で、以下のようなりＮＡリンカ−を
合成した。
１１ｉｎｆ１　１３５　　１３６　　１３７　　　　８
ｇｌ　ＩＩ　　　　　Ｔａｑ　１以上の精製ＤＮＡ断片
と合成りＮＡＩＪンカーを−Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
し、第１図に示した組換えプラスミドｐｃｖ’ｒ　１３
７を得る。本プラスミドは１３７番目のアミノ酸として
Ｃｙｓを掠ち１３８番〜１４６番目のアミノ酸を欠失し
たＩＦＮ−Ｔ誘導体［１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ　（
Δ１３８−１４６））をコードする。
次に、１−３ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−Ｔ（△１
３８−１４６）なる誘導体をコードする組換え体ｐＧＮ
Ｃ５を造成するためにはｐＧＶＬｌｏ（参考例４）をＨ
ｉｎｄＩＩＩとＴａｑｌで切断し、約３００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を得る。別に実施例１により得られるｐＧＶＴｌ
　３７ＤＮＡをＢｇＪ２■とＴａｑ　ＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩとＢ、ｇ　Ａ　Ｉ［で切断し、それぞれ約１３０
ｂｐ、約４．６　Ｋ　［］のＤＮＡ断片を得る。上記の
ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで結合し、第２図に
示した組換え体プラスミドｐＧＮＣ５を得る。
３−３ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ’　（Δ１３
８−１４６）をコードする組換え体プラスミドｐＧＮＢ
４および１．３−３ｅｒ−１３７＝Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ
（Δ１３８−１４６＞をコードする組換え体プラスミド
ｐＧＮＡ３を造成するためにはＩＦＮ−ｒのＮ末端側を
コードするＤＮＡの供給源としてそれぞれプラスミドｐ
ＧＶＭ　１０１（第３図）、ｐＧＶＫｌａ　（第４図）
を用イルξと以外、上と同様１′こして造成することが
できる。
′」二記組換え技法における反応の条件は、一般的に下
記のとおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１−２０
μｇのＤＮＡを２−２２−２Ｏ０好ましくは１０〜／ｌ
ｏｍＭ）のトリス−ＨＣｌ１（ｐＨ６，０〜９．５好ま
しくはｐ　）ｌ　７．０〜８．０）、０〜２００ｍＭの
ＮａＣｊ！、２−２２−２Ｏ好ましくは５〜１０ｍＭ）
のＭｇＣβ２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜１０
０単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位
）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素に
より異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反応
の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱する
ことによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネ
ートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用い
ることができる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法［Ｌ、　Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｒ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　９８．３’０５　（１９７９）以下ＬＧＴ法という
］やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって行
う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のＴｒｌｓ−ＨＣ１’（ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０　）’、２−
２’ＯｍＭ（好ましくは５−１０ｍＭ）のＭｇＣＲ２，
０，１−Ｉ　ＱｍＭ　（好ましくは０．５〜２、０　ｍ
　Ｍ　）のＡＴＰ、１−５０ｍＭ　（好ましくは５〜１
０ｍＭ）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ０．３〜１０単位を用い、１−Ｊ’ａ７
℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好
ましくは２〜２０時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法［Ｓ。
Ｎ、　　Ｃｏｈｅｎ　ら　：　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　口ＳＡ　　６９゜２
１１０　（１９７２）　］によって、大腸菌に導入する
。
組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはＢｉ
ｒｎｂｏｉｍ　らの方法ＣＨ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍら
：Ｎｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１
３　（１９７９）などを用いて行う。
プラスミドＤ、Ｎ　Ａを１〜１０種類の制限酵素で消化
後ｒガロ−スゲルミ気泳動あるいはポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により切断部位を調べる。
更にＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキサ
ム・ギルバード法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、。
７４、５６０　（１９７７）］によって決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。
本発明のＩＦＮ−ｒポリペプチド誘導体は以下のとおり
に製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐＧＶＡ４）を用いて大
腸菌に−１２ＨＢ１０１を形質転換させ、アンピシリン
耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐＧＶＡ４
を有する大腸菌を選びだす。
ｐＧＶＡ４を有する大腸菌を培地に培養することにより
培養物中にＩＦＮ−ｒポリペプチド誘導体を生成させる
ことができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにＩＦＮ
−ｒポリペプチド誘導体の生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース。
ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ，Ｃ１゜−（ＮＨ＋Ｌ
　Ｓ　ＣＬ　、カザミノ酸、酵母エキス３ポリペプトン
、肉エキス、ハタトドリプトン、コーン・スティーブリ
カーフエどが、その他の栄養源としては、Ｋ２ＨＰ○＝
　　、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣＲ。
Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４、ビタミンＢ＋　　、　Ｍ　ｇ　Ｃｆ
１２などが使用できる。
培養はｐＨ５，５〜ｇ、５．温度１８−４０ｔで通気攪
拌培養により行われる。
培養５〜９０時間で培養菌体中にヒ）ＩＦＮ−Ｔポリペ
プチド誘導体が蓄積するので、培養物から菌体を集菌し
、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰返して菌体
を破砕し、遠心して得られる上清から通常のポリペプチ
ドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。
ＬトＩＦＮ−ｒ活性の定量はアームストロングの方法Ｃ
Ｊ、Ａ、　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ら：　Ａｐｐｌ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ。
■、　７２３−７２５　（１９７１）］に従って行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜ １３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ　（△１３８−１４６）を
コードする組換え体プラスミドｐＧＶＴ１３７の造成： 参考例１により得られたｐＧＢＤＩ　　ＤＮＡ１０μｇ
を２０ｍＭ）リス−ＨＣβ（ｐＨ７，５）。
１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ　、ｌ　Ｏｒｎ’；チオスレイ）
−ルおよび１１００１ｎ　　ＮａＣＲ（以下”Ｙ−１０
０緩衝液”と略記する）を含む全量５０μβの溶液に溶
かし、制限酵素ＢａｍＨＩ（全酒造社製、以下特記しな
い限り制限酵素は全酒造社製を用いた。）２０単位加え
、３７℃で３時間消化反応を行った。
つづいて、制限酵素Ｔａｑｌを２０単位加え、６５℃で
２時間消化反応を行った。この反応液から、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって３′側非翻訳領域を含
む約３１０ｂｐのＤＮＡ断片約０．５μｇ−ｔ−得た。
別に、参考例２により得られたｐＧＫΔ２Ｉ）ＮＡ１０
μｇを￥−１００緩衝液を含む、全量５０μｐの溶液に
溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉと１−１　ｉ　ｎ　ｆ
　Ｉを各々２０単位加え、３７℃で３時間消化反応を行
った。この反応液から、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法によって、ＩＦＮ−ｒの構造遺伝子の大部分を含む
約４００ｂｐの断片を得た。また、特開昭５８−１１０
６００公報記載の方法で調製したｐＫＹＰ’ｌ（ｌのＤ
ＮＡ　　３μｇをＹ−１００緩衝液を含む全量４０μｌ
の溶液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄｌＩｒとＢａｍＨＩ
を各々６単位加え、３７℃で゛３時間消化反応を行った
。
この反応液から、ＬＧＴ法により、トリプトファンプＴ
ｌｌ］％−ター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．３　Ｋ　ｂの
ＤＮＡ断片１．８μｇを得た。一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−
Ｔポリペプチドの１３７番目のアミノ酸であるＭｅｔを
Ｃｙｓに置換し、さらに、発現の終止に必要な停止コド
ン（ＴＡＡ＞を１３７番目のＣ，ｙｓの直後に付与する
目的で、下記のようなりＮＡ　ＩＪンカーを合成した。
まず一本領ＤＮΔ、　　１８−ｍｅｒと１７−ｍａｒを
通常のトリｘステル法［Ｒ，Ｃｒｅａ　ら：　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、、　？５．５７６５　（１９７Ｂ
）３により合成した。
１８−ｍｅｒおよび１７−ｍａｒの各々２μｇを５０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩＩ　（ｐＨ７，５＞、１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＬ　。
５ｍＭジチオスレイトール、　０．１　ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量４０μｌの溶液に
とかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位（全酒
造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行
った。
次に、上記で得たｐＧＢＤＩ由来のＴａｑＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片（約３１０　ｂｐ）０．５μｇ、ｐＧＫＡ２由来
のＨｉｎｄＩＩＩ−）１ｉｎｆ　Ｉ断片（約４００ｂ　
ｐ　）　０．５μｇおよび発現ベクターｐＫＹＰ１０の
Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｒ断片（約４．３　Ｋ　ｂ
　）１．０μｇをＴ４１Ｊガーゼ緩衝液２５μ！に溶か
し、７　この混合液に上記Ｉ）ＮＡ　ＩＪ７カーを約０
．１μ！加えた。この混合液にさらにＴ４ＤＮＡＩＪガ
ーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
１３１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得た。
このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し、
第１図に示したｐＧＶＴ１３７を得た。ｐＧＶＴ１３７
の構造は、ＥｃｏＲＩ。
ＣβａＩ、ＢｇβＩＩ、ＢａｍＨＩで消化後、アガロー
スゲル電気泳動により確認した。ｐＧＶＴ１３７のｌ−
１ｉ　ｎ　ｆ　Ｉ−Ｔａｑ　Ｉ付近の塩基配列は、であ
ることを、マキサム・ギルバートの方法〔八。
Ｍ、　　Ｍａｘａｍ　ら　；Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　［ＩＳＡ、、　　７４
゜５６０　（１９７７）］で確認した。
ｐＧｖＴ１３７のコードするヒトＩＦＮ−γポリペプチ
ド誘導体〔本誘導体を１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒｃ△
１３８−１４６）と呼ぶ〕は成熟型ヒトＩＦＮ−ｒの１
３７番目のＭｅｔがＣｙｓに置換し、かつ、Ｃ末端の１
３８番目のＬｅｕから、１４６番目のＧｌｎまで９つの
アミノ酸が欠失している点で公知のものとは明らかに異
なる。
プラスミドｐｃｖ’ｒｌ　３７をもつ大腸菌はＢＢＣｔ
１６ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　ＩＧＶＴ１３７　（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−５４７）として工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に寄託されている。
実施例２． １−３ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ　（△１３８
−１４６）をコードする組換え体プラスミドｐＧＮｃ５
の造成： 参考例４により得られたｐＧＶＬｌｏ　　ＤＮＡ１０μ
ｇをｙ−ｉｏｏ緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩを２０単位加え、３７℃で３時間消化反応を
行った。つづいて、制限酵素Ｔａｑ■を２０単位加え、
６５℃で２時間消化反応を行った。この反応溶液から、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、ＩＦＮ−
γ構造遺伝子５′末端側領域を含む約３００ｂｐのＤＮ
’Ａ断片約０．５μｇを得た。
別に、実施例１により得られたｐＧＶＴ１３７ＤＮＡ　
１０μｇを、Ｙ−１００緩衝液５０μｌに溶かし、制限
酵素ＢｇＡｎを２０単位加え、３７℃で３時間消化反応
を行った。つづいて、制限酵素ＴａｑＩを２０単位加え
、６５℃で２時間消化反応を行った。この反応液から、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、ＩＦＮ−
ｒ構造遺伝子３′末端側領域を含む約１３０ｂｐのＤＮ
Ａ断片約０．４μｇを得た。
さらに、同プラスミドｐＧＶＴ１３７　　ＤＮＡ５μｇ
をＹ−１００緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素１−１
　ｉ　ｎ　ｄ　ＩｌｒとＢｉ’ｔｉ■を各々１０単位加
え、３７℃で３時間消化反応を行った。
この反応液からＬＧＴ法により、３′側非翻訳領域およ
び、Ｐｔｒｐを含む約４．６　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片約２
．０μｇを得た。
次に、上記で得たｐＧＶＬ１０由来のＨｉｎｄＩＩＩ−
ＴａｑＩ断片（約３００　ｂｐ）　０．４ｔｔｇ。
ｐＧＶＴ１３７由来のＢｇｌｌＴｌ−Ｔａｑ　Ｉ断片（
約１３０ｂｐ）０．５μｇおよび同プラスミド由来のＨ
ｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇｊ！ＩＩ断片（約４．６　Ｋ　ｂ　
）１．０μｇをＴ４リガーゼ緩衡液２５μｌに溶かし、
Ｔ４ｒ）ＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結
合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、ΔｐＲのコロニーを得た。
このコロニーの培養液がら、プラスミドＤＮＡを回収し
、第２図に示したｐＧＮＣ５を得た。
ｐＧＮＣ５の構造は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ。
Ｂ’ｇＡＩＩ、Ｃｊ！ａ　Ｉ、ＢａｍＨＩで消化後、ア
ガロースゲル電気泳動により確認した。ｐＧＮＣ５のＨ
ｉｎｄｌｌｌ−３ｉｎｌ付近の塩基配列は、であり、さ
らに、Ｈｉｎｆｌ−Ｔａｑｌ付近の塩基配列は、 であることを、マキサム・ギルバートの方法で、確認し
た。
ｐＧＮＣ５のコードするヒトＩＦＮ−γポリペプチド誘
導体〔本誘導体を、１−５ｅｒ−１３７Ｃｙｓ−ＩＦＮ
−ｒ　（△１３Ｌ−１，４６）と呼ぶ〕は成熟型ヒ）Ｉ
ＦＮ−γの１番目のＣｙｓがＳｅｔに、１３７番目のＭ
ｅｔがＣｙｓに置換し、さらに、Ｃ末端の１３８番目の
Ｌｅｕから、１４６番目のＧｌｎまで９つのアミノ酸が
欠失している点で、公知のものとは明らかに異なる。プ
ラスミドｐ　Ｇ　Ｎ　Ｃ５をもつ大腸菌は［Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＩＧＮＣ５（ＦＦ、ＲＭ　　Ｂ
Ｐ−５５０）として微工研に寄託されている。
実施例３゜ ３−３ｅｔ−１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ　（△１３８
−１４６）をコードする組換え体プラスミド・ｐＧＮＢ
４の造成： 参考例５により得られたｐＧＶＭｌｏｌ　　ＤＮＡ１０
μｇをＹ−１００緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｈ
ｉ’ｎ　ｄ　ＩＩＩを２０単位加え、３７℃で３時間消
化反応を行った。つづいて、制限酵素ＴａｑＩを２０単
位加え、６５℃で２時間消化反応を行った。この反応溶
液から、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、
ＩＦＮ−γ構造遺伝子５′末端側領域を含む約３ｏｏｂ
ｐのＤＮＡ断片約０．５μｇを得た。
別に、実施例１により得られたｐＧＶＴ１３７ＤＮＡＩ
Ｏμｇをｙ−ｉ　ｏ　ｏ緩衝液５０μｌに溶かし、制限
酵素ＢｇＡｎを２０単位加え、３７℃で３時間消化反応
を行った。つづいて、制限酵素ＴａｑＩを２０単位加え
、６５℃で２時間消化反応を行った。この反応液から、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、ＩＦＮ−
ｒ構造遺伝子３′末端側領域を含む約１３０ｂｐのＤＮ
Ａ断片約０．４μｇを得た。
さらに、同ブラスミ′ドｐＧＶＴ１３７　　ＤＮΔ５μ
ｇをＹ−１００緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｈ４
ｎｄ１１１とＢｇｌ’ｉｌを各々１０単位加え、３７℃
で３時間消化反応を行った。− この反応液から、ＬＧＴ法により、３′側非翻訳領域お
よび、Ｐｔｒｐを含む約４．６　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片約
２．０μｇを得た。
次に、上記で得たｐＧＶＭ　１０１由来のＨｉ　ｎ　ｄ
ＩＩ−Ｔａｑｌ断片（約３００　ｂｐ）　０．４μｇ。
ｐＧＶＴ１３７由来のＢｇｌＵ−Ｔａｑｒ断片（約１３
０ｂｐ）０．５μｇｚよび同プラスミド由来のＨｉｎｄ
ｌＩＩ−ＢｇＡ］Ｉ断片（約４．６　Ｋ　ｂ　）１．０
μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２５μβに溶かし、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行
った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得た。
このコロニーの培養液から、プラスミドＤＮＡを回収し
、第３図に示したｐＧＮＢ４を得た。
ｐＧＮＢ４の構造は、Ｈｉｎｄｌｆｆ、ＥｃｏＲＩ。
ＢｇＡＩｌ、Ｃｊ２ａＴ、ＢａｍＨＩで消化後、アガロ
ースゲル電気泳動により確認した。ｐＧＮＢ３のＨｉｎ
ｄＴＩＩ−３ｉｎｌ付近の塩基配列は、であり、さらに
、Ｈｉｎｆｌ−Ｔａｑｌ付近の塩基配列は、 であることをマキサム・ギルバートの方法で、確認した
。
ｐＧＮＢ４のコードするヒトＩＦＮ−γポリペプチド誘
導体〔本誘導体を３−９ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−ｒＦＮ
−ｒ　（Δ１３８−１４６）と呼ぶ］は成熟型ヒトＩＦ
Ｎ−７の３番目の□ｙｓがＳｅｔに、１３７番目のＭｅ
ｔがＣｙｓに置換し、さらに、Ｃ末端の１３８番目のＬ
ｅｕ力）ら、１４６番目のＧｌｎまで９つのアミノ酸が
欠失している点で、公知のものと明らかに異なる。プラ
スミドｐＧＮＢ４をもつ大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉＩＧＮＢ４　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５４９
）として微工研に寄託されている。
実施例４゜ １．３−３ｅ　ｔ−１３７−Ｃｙｓ　−ＩＦＮ−ｒ（△
１３１１１４６）のコードする組換え体プラスミドｐＧ
Ｎへ−３の造成： 参考例６により得られたｐＧＶＫｌ３　　ＤＮＡ１０μ
ｇをＹ−１００緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｈｉ
ｎｄ１１１を２０単位加え、３７℃で３時間消化反応を
行った。つづいて、制限酵素ＴａｑＩを２０単位加え、
６５℃で２時間消化反応を行った。この反応溶液から、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、ＩＦＮ−
ｒｔａ造遺伝子５′末端側領域を含む、約３００ｂｐの
ＤＮＡ断片約０、５μｇを（尋Ｉこ。
別に参考例６により得られたｐＧＶＫｌ　３ＤＮＡ１０
μｇをＹ−１００緩衝液５０μｐに溶かし、制限酵素Ｂ
ｇβ■を２０単位加え、３７℃で３時間消化反応を行っ
た。つづいて、制限酵素ＴａｑＩを２０単位加え、６５
℃で２時間消化反応を行った。この反応液から、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法によって、ＩＦＮ−ｒ構造
遺伝子３′末端側領域を含む約１３０ｂｐのＤＮＡ断片
０．４μｇを得た。
さらに、同プ５スミＦｐＧＶＴ１３７ＤＮＡ５、μｇを
Ｙ−１００緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｈｊ　ｎ
　ｄ　ｍとＢｇＩｌｎを各々１０単位加え、３７℃で３
時間消化反応を行った。
この反応液からＬＧＴ法により、３′側非翻訳領域およ
び、Ｐ　ｔ　ｒ、　ｐを含む約４．６　Ｋ　ｂの断片的
２．０μとを得た。
次に、上記で得たｐＧＶＫ１３由来のＨｉｎｄＩＩＩ−
Ｔａｑｌ断片（約３００ｂｐ）０．４μｇ。
ｐＧＶＴ１３７由来のＢｇＩＩＩ−Ｔａｑｌ断片（約１
３０ｂｐ）０．５μｇＪよび同プラスミド由来のＨｉｎ
ｄｌ［−ＢｇｎｌＩ断片（約４．６Ｋｂ）１．０μｇを
Ｔ４リガーゼ緩衝液２５μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮΔリガ
ーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
）（８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得た
。
このコロニーの培養液から、プラスミドＤＮＡを回収し
、第４図に示したｐＧＮＡ３を碍た。
ｐＧＮＡ３の構造は、ＨｉｎｄｌＩ［、ＥｃｏＲＩ。
Ｂｇｊ２１１．Ｃｌ１ａＩ、ＢａｍＨＩで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動法により確認した。ｐＧＮＡ３のＨ
ｊｎｄＩ［ｌ−３ｊｎＩ付近の塩基配列は、であり、さ
らに、）ｌｉｎｆＩ−ＴａｑＩ付近の塩基配列は、 であることを、マキサム・ギルバートの方法で確言忍し
た。
ｐＧＮＡ３のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチド誘
導体〔本誘導体を１．３−３ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−Ｉ
ＦＮ−ｒ　（Δ１３８−１４６）と呼ぶ〕は成熟型ヒ）
ＩＦＮ−ｒの１番目と３番目のＣｙｓがＳｅｒに、１３
７番目のＭ　ｅ　ｔがＣｙｓに置換し、さらに、Ｃ末端
の１３８番目のＬｅｕから、１４６番目のＧｉｎまで９
つのアミノ酸が欠失している点で公知のものと明らかに
異なる。
プラスミドｐＧＮＡ３をもつ大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ　　ＩＧＮＡ３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５
４８）として微工研に寄託されている。
実施例５゜ ｐＧＶＴ１３７．ｐＧＮＣ５，ｐＧＮＢ４゜ｐＧＮＡ３
を保有する大腸菌によるＩＦＮ−ｒ誘導体の生産。
実施例１〜４で（、すた組換え体プラスミドｐＧＶＴｌ
　３７．ｐＧＮＣ５，ｐＧＮＢ４．ｐＧＮＡ３をもつ大
１抛菌ＨＢＩＯＩ株（それぞれをＩＧＶＴ１３７、ＩＧ
ＮＣ５，ＩＧＮＢ４およびＩＧＮΔ３と命名）をＬＧ培
地〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ！’
５ｇ、グルコース２ｇを水１１にとかし、ＮａＯＨにて
、ｐ　Ｈを７．０とする。〕で３７℃、１８時間培養し
２、この培養液０．２ｍｌを１０ｍ１のＭＣＧ培地ＣＮ
ａ２ＨＰ０．０．６％。
ＫＨ２ＰＯ４０，３％、ＮａＣｊ！０．５％、　ＮＨ４
（１０，１％、グルコース０．５％、カザミノ酸０．５
％。
Ｍｇ５Ｏｎ　　１ｍＭ、ビタミンＢ＋　　４　ｔ−ｘ　
ｇ　／ｍ＋　。
ｐ　１４７．２　〕に接種し、３０℃で４〜８時間培養
後、トリプトファンのインデューサーであるインドール
アクリル酸（以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍ１加え
、さらに、２〜１２時間培養を続けた。培養液を８．０
００ｒｐｍ、１０分間遠心して、集菌し、３０ｍＭ　　
ＮａＣｊ！、３０ｍＭ　　　）リス−ＨＣｊ２　（ｐＨ
７，５）緩衝液で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液１ｍ
ｌに懸濁し、２００μｇのリゾチームおよび０．２５Ｍ
　　ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含む液
５μｌを加えた。３０分間０℃に放置した後、凍結・融
解を３回繰り返して菌体をこわした。これを１５．００
Ｏｒｐｍ、３０分間遠心して上清を得、上清中のインタ
ーフェロン量ヲアームストロングの方法〔アームストロ
ング（Ｊ、　Ａ、　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　）らニアプラ
イト・マイクロバイオロジー（八ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、　）　２１巻７２３−７２５頁（１９７］）
）に従って定量した。
但し、ウィルスとしては５ｉｎｄｖｉｓ　ｖｉｒｕｓ、
動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来のエフエル・セル（
ＦＬ　Ｃｅ１ｌ）を用イタ。
結果を第２表に示す。
第　　　　２　　　　表 １ＧＫＡ２は、ＩＦＮ−ｒをコードするプラスミドＰＧ
Ｋへ２を含む。
実施例６゜ ＩＦＮ−ｒ誘導体、１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ　−Ｔ（Δ
１３８−１４６）、１−３ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−ＩＦ
Ｎ−Ｔ（Δ１３８−１４６）、３−８ｃｒ−１３７−Ｃ
ｙｓ−ＩＦＮ−ｒ　（△１３８−１４６　＞および１．
３−３ｅｒ−１３７−Ｃｙｓ−ＩＦＮ−ｒ（△１３８−
１４６）の熱安定性の検討： 実施例１〜４で得た組換え体プラスミドｐＧＶＴ１３７
、ｐＧＮＣ５，ｐＧＮＢ４およびｐＧＮΔ３をもつ大腸
菌ＨＢＩＯＩ株ＩＧＶＴ１３７゜ＩＧＮＣ５，ＩＧＮＢ
４およびＩ’ＧＮＡ３）をＬＧ培地で３７℃１８時間培
養し、この培養液０．２ｍｌを１０ｍ１のＭＣＧ培地に
接種し、３０℃で４〜８時間培養後、ＩＡＡを１０μｇ
　／ｍｌ加え、さらに、２〜１２時間培養を続けた。培
養液を８．００　Ｏｒｐｍ、。
１０分間遠心して、集菌し、３０ｍＭ　　Ｎａ（、ｌ！
を含む３０ｍＭ　　）リスートＩ（１（ｐＨ７，５）緩
衝液で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液１ｍｌに懸濁し
、２００μｇのリゾチームおよび０．２５　ＭＥＤＴＡ
を含む液５μｌ加えて、３０分分間上に放置した後、凍
結・融解を３回繰り返して菌体をこわした。これを１５
．００Ｏｒｐｍ、３０分間遠心して上清を得た。
この抽出液を、５０℃で１時間熱処理をした後に、イン
ターフェロンの抗ウィルス活性を、了−ムストロングの
方法に従って定量し、残存活性（％）を算出した。
結果を第３表に示す。
第　　　　３　　　　表 参考例１゜ 発現ベクターｐＫＹＰ１１へのヒトＩＦＮ−ｒＤＮΔの
組み込みニ プラスミドｐ　Ｉ　ＦＮｒ−Ｇ　４　（３，６Ｋｂ）　
６μｇを２０ｍＭ　　）リス−Ｈ（１（ｐ）（７，５）
、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスレイトー
ルおよび５０ｍＭ　　ＮａＣｊ’を含む全量５０μβの
溶液に溶かし、制限酵素ｐｖｕＩＩ　１２単位とＨｉｎ
ｄＩｌｌ　１２単位を加え、３７℃で４時間消化反応を
行った。反応液を６５℃、７分間加熱処理して酵素を失
活させ、ＬＧＴ法にて精製し、Ｌ、　３　Ｋ　ｂのヒト
ＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮＡ断片１．２μｇを得た。
別にｐＫＹＰ、１１のｄμｇを２０ｍＭ）リス−１−Ｉ
ＣＡ　　　（ｐＨ７，５）　　　、　　　１　０ｍＭ　
　　　ＭｇＣｊ！　　２　　、　　１　０ｍＭジチオス
レイトールおよび５０ｍＭ　　ＮａＣｊｌ！を含む全量
４０μｌの溶液に溶かし、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩを８単位加
え、３７℃で３時間消化反応を行った。
反応液を６５℃、５分間加熱して酵素を失活させた。こ
れにｄΔＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐを各々３０μＭになるように加え、さら
に８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏ
ｗ断片、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社
製、ｌμＩｌ）を加えて１５℃で１時間埋め込み反応さ
せた。ＤＮＡポリメラーゼ■を失活させるため６８℃で
１５分１１Ｊ加熱処理後、Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［Ｉ　１０
単位を加え３７℃でさらに３時間消化反応してから、再
び、６５℃で５分間加熱し、ＨｉｎｄＩＩ［を失活させ
た。このようにして得たプラスミドｐＫ’ＹＰ１１の消
化反応液よりＬＧＴ法にて精製し、Ｐｔｒｐを含む約４
．７ＫｂのＤＮＡ断片約２．５μｇを得た。
ヒトＩＦＮ−γＤＮＡを含むＤＮＡ断片（１，３Ｋｂ）
０．５μｇとプラスミドｐＫＹＰ　１１より得たＰｔｒ
ｐを含む約４．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片１．０　μｇを
２０ｍＭ　　）リス−ＨＣＡ　　（ｐＨ７，５）、６ｍ
ＭＭｇＣＬ　、５ｍＭジチオスレイトールおよび５００
μＭＡＴＰを含む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリ
ガー＋！４単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行っ
た。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて常法
通り大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａｐｌのコロニ
ーを得た。このコロ、ニーの培養液よりプラスミドを分
離し、ｐＧＣ７をｆＧた。ｐＧＣ７の構造は、）ｌｉｎ
ｄｌＩＩ、）ｌｐａｌ、５ａＡＩ、ＥｃｏＲＩおよびＣ
＃ａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。
ｐｃｃ７を含む大腸菌菌株は微工研にＢｓｃｈｅｒ＋ｃ
ｈｉａｃｏｌｉ　　ＩＧＣ？（ＦＥＲＭ’ＢＰ−４９７
）として寄託されている。
参考例２゜ 組換え体プラスミドｐＧＫＡ２の造成：参考例１により
得られたｐＧＣ？ＤＮＡ６μｇを２０ｍＭ　　）リス−
ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ１
２．１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭ　　Ｎ
ａＣＲを含む全量５０μβの溶液に溶かし、制限酵素Ｂ
　ｓ　ｔ　Ｎ　Ｉ　（Ｎｅｗ　［ｉｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ社製）１２単位を加え、６０℃で３時間反応さ
せた後、６５℃で５分間加熱してＢ　ｓ　ｔ’Ｎ　Ｉを
失活させた。次いでＮａＣ１を１５０ｍＭとなるように
加え、Ｓａｊ！　Ｉ　８単位を加えて３７℃でさらに３
時間消化反応を行った。再び６５℃で５分間加熱してＳ
ａｄ　Ｉを失活させ、ＬＧＴ法にて精製し、ヒ）　ＩＦ
Ｎ−ｒＤＮＡの大部分を含む約］、　１２５　ｂ　ｐの
ＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。
別にｐＫＹＰｌｏの３ｔｔｇを２０ｍＭ　　）リス−Ｈ
Ｃｌ１　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ　。
１０ｍＭジチオスレイトールおよび１００ｍＭＮａＣｊ
！を含む全量４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素１−１
　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩとＳａｊ！Ｉを各々６単位ずつ加
え、３７℃で３時間消化反応を行った。６５℃で５分間
加熱してＨｉｎｄＩＩＩと５ａＩｌ■を失活させた。こ
の消化反応液をＬＧＴ法にて精製し、Ｐｔｒｐを含む約
４゜ＩＫｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを得た。
一方、成熟ヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末端はＣｙ
ｓであるので、成熟ＩＦＮ−ｒＤＮＡを発現させるため
には、５′末端のＴＧＴ　（Ｃｙｓ）の直前に開始コド
ン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰｔｒｐ
の下流のＳＤ−配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐ
の間の適当な長さが必要であることなどの理由から、下
記のＤＮＡリンカ−を合成した。
まず、１本領ＤＮＡ、１８−ｍａ　ｒと１５−ｍａｒを
通常のトリエステル法により合成した。１８−ｍａｒお
よび１５−ｍｅｒの各々２ｐｇを５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｊ！　　（ｐＨ７，５＞、１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ２２゜
５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ　　ＥＤＴΔお
よび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量２０μｌの溶液に溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）３０単位を加えて、３７℃で６０分間リ
ン酸化反応を行った。
リン酸化した１８−ｍａｒと１５−ｍａｒを２μｇずつ
混合し、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリ
ングを行うことにより上記構造を有するＤＮＡリンカ−
を得た。
上記で得たｐｃｃ７由来のＢｓｔＮＩ−５ａ７■断片（
１１２５ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐＫＹＰ　１
０をＨｉｎｄＩＩＩとＳａ［Ｉで消化して得たＤＮＡ断
片（４，ＩＫｂ）１．０μｇを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
１　（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　　ＭｇＣＲ，。
５ｍＭジチオスレイトールおよび５００μＭ　ＡＴＰを
含む全量２５μｍの溶液に溶かし、この混合溶液に上記
ＤＮＡＩＪンカーを約０．１μｇ加えた。この混合液に
さらに−Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ６単位を加え
、４℃で１７時間結合反応を行った。得られた組換え体
プラスミドの混合物を用いて、常法通り、大腸菌８８１
０１株を形質転換し、ＡｐＨのコロニーを得た。このコ
ロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第１図に示し
たｐＧＫＡ２を得た。
ｐＧＫＡ２の構造は、ＥｃｏＲＩ’、ＣｆｆａＩ。
Ｈｉｎｄｌｌｒ、ＢｓｔＮＩ、’Ｓａｊ！Ｉで消化後、
アガロースゲル電気泳動により確認した。プラスミドｐ
ＧＫＡ２のＳＤ−配列（ＡΔＧＧ）から開始コドン（Ａ
、、’ｌ’Ｇ）までの塩基配列はＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧ
ＡＴＡΔＧ’ＣＴ乳Ｎ工旦であることを、マキサム・ギ
ルバートの方法で確認した。
ｐＧＫΔ２を含む大腸菌は微工研にＢｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ　　ＩＧＫΔ２（ＦＥ、ＲＭ　　ＢＰ−４
９６）として寄託されている。
参考例３゜ ＩＦＮ−ｒ遺伝子の下流にＢａｍＨＩ切断部位を有する
プラスミドｐＧＢＤｌの造成ニブラスミドｐ　ＩＦＮｒ
−Ｇ４　（３，６Ｋｂ）２μｇを２０ｍＭ　　）リス−
Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ’７．５）、１０ｍＭ’　ＭｇＣＲ２
，ｌ　０ｍＭジチオスレイトールおよび５０ｍＭ　　Ｎ
ａ（１！を含む全量５０ｕｊ！（Ｄ溶液（以下“’Ｙ−
５０緩衝液”と略記する）に溶かし、制限酵素Ｐｖｕｎ
４単位を加えて、３７℃で２時間消化反応を行なった。
ＬＧＴ法にて精製し、３．６　Ｋ　ｂのｐ　ＩＦＮｒ−
Ｇ４ＤＮＡ断片１μ８ｇを得た。このＤＮＡ断片０．１
μｇを５ピコモルの５′−リン酸化ＢａｍＨＩりンカー
（５’−ｐＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’；コラボレイテ
ィブ社製）の存在下Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μβ中２単
位のＴ’４　Ｕガーゼを加え、４℃、１８時間反応を行
った。
このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌８８１０１株［Ｂｏｌ　１ｖｅｒ　ら：　Ｇ１３
ＮＢ２．７５　（１９７７）］をＣｏｈｅｎ　らの方法
［Ｓ、　Ｎ。
Ｃｏｈｅｎ　　ら　：Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、６９゜２１１’０　
（１９７２））により形質転換し、アンピシリン耐性（
Ａｐ”、以下同じ）のコロニーを得た。この形質転換株
よりプラスミドＤＮＡを公知の方法ＣＨ，Ｃ，Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍら；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＳＲｅｓ。
ユ、１５１３　（１９７９）］に従って分離精製し、該
プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ等の制限酵素で消化する
ことによりプラスミドの構造解析を行った結果、ｐＩＦ
Ｎ７−Ｇ４のｐｖｕ１１部位にＢａｍＨ■リンカ−が挿
入された組換え体プラスミドｐＧＢＤ１を得た。プラス
ミドｐＧＢＤ１をもっ大腸菌は［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ　　ＩＧＢＤＩ（ＦＥＲＭＢ　Ｐ〜＝：ｌ　！
ｌ　／Ｉ　）として微工研に寄託されている。。
参考例４゜ ］−３ｅｒ−ＩＦＮ−γをコードする組換え体プラスミ
ドｐＧＶＬ１０の造成： 参考例３により得られたｐＧＢＤＩＤＮＡ　　６μｇを
Ｙ−５０緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｓｉ、ｎｌ
　　１０単位を加え、３７℃で３時間消化反応を行った
。次いで、ＮａＣｊｌ！をａｍ度１００ｍＭとなるよう
に加え、Ｂａｍｔ７１ｒ　　１０単位を加え、３７℃で
さらに３時間消化反応を行゛った。
この反応液からＬＧＴ法により、ヒトＩＦＮ−γＤＮＡ
の大部分を含む、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片０．８μｇ
を得た。
別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　ＤＮＡ　　３μｇをＹ−５０緩
衝液（全量４０μｍ）に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄｌＩ
およびＢａｍＨＩをそれぞれ５単位ずつ加え、３７℃で
３時間消化反応を行った。
この反応液から、ＬＧＴ法により、トリプトファンプロ
モーター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．３　Ｋ　ｂのＤＮＡ
断片約１．８μｇを得た。
一方、成熟ヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドは、Ｎ末端から
、ＣｙＳ−Ｔｙｓ−Ｃ，ｙｓ−の構造を有するが、この
１番目のＣｙｓをＳｅ口ご置換し、かつ、発現に必要な
開始コドン（ＡＴＧ）を最初のＳｅｒの直前に付与する
目的で、下記のような。
ＤＮＡリンカ−を合成した。
まず、１本ｔＮＤＮＡ、　２０−ｍ　ａ　ｒと１９−ｍ
ａｒを通常のトリエステル法により合成した。２〇−ｍ
ｅｒおよび１９−ｍｅｒの各々２ｔｔｇを５０ｍＭトリ
ス−ＮＣＲ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２２
゜５ｍＭジチ；（−スレイトール、０．１ｍ’Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量４０μｌに溶
かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位を加えて
、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＧＢＤＩ由来の５ｉｎＩ−Ｂ’ａｍＨ
Ｉ断片（約８５０ｂｐ）０．５／ｊｇと発現ベクターｐ
ＫＹＰ　１０のＨｉ　ｎｄＩ［Ｉ−ＢａｍＨ１断片（約
４．３Ｋｂ）１．０μｇとをＴ４リガーゼ緩衝液２５μ
ｌに溶かし、上記ＤＮＡ！Ｊンカーを約０．１μｇ加え
た。この混合液に、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を
加え、４℃で１７時間結合反応を行った。
１１１、られた組換本体プラスミドの混合物を用いて、
大腸菌ＦＩＢＩＯＩ株を形質転換し、Ａｐｌのコロニー
を得た。このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを
回収し、第２図に示したｐＧＶＬ　１０を得た。ｐＧＶ
Ｌ　１０の構造は、ＥｃｏＲＩ。
Ｃ１１ａ　Ｉ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩで消化後、
アガロースゲル電気泳動により確認した。
ｐＧＶＬｌｏの）ｌｉｎｄＩＩＩ部位から５ｉｎＩ部位
までの塩基配列は、 であることを、マキサム・ギルバートの方法で確δ忍し
た。
ｐＧＶＬｌｏのコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチド
〔本誘導体を１−３ｅｒ−ＩＦＮ−ｒと呼ぶ〕は成熟ヒ
）ＩＦＮ−γの１番目のＣｙｓがＳｅｒに置換しでいる
点で公知のものと明らかに異なる。プラスミドｐＧＶＬ
１０をもつ大腸菌は［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
　　ＩＧＶＬＩＯ（ＦＥ、ＲＭ　　ＢＰ−５４４）とし
て微工研に寄託されている。
参考例５゜ ３−３ｅ　ｒ−ＩＦＮ−ｒをコードする組換え体プラス
ミドｐＧＶＭ　１０１の造成。
参考例３により得られたｐＧＢＤＩ　　ＤＮＡ６μｇを
Ｙ−５０緩衝液５０μ矛に溶かし、制限酵素５ｉｎ１　
１０単位を加え、３７℃で３時間消化反応を行った。次
いでＮａＣｌ１を終濃度１００ｍＭとなるように加え、
Ｂａｍ）１１　１０単位を加え、３７℃でさらに３時間
消化反応を行った。
この反応液からＬＧＴ法により、ヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡ
の大部分を含む約８５０ｂｐのＤＮＡ断片０．８μｇを
得た。
別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　ＤＮＡ　　３μｇをＹ−５０緩
衝液（全量４０μβ）に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
［およびＢａｍＨＩをそれぞれ５単位ずつ加え、３７℃
で３時間消化反応を行った。
この反応液から、ＬＧＴ法により、トリプトファンブＯ
モーター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．３　Ｋ　ｂのＤＮＡ
断片約１．８μｇを得た。
一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−ｒポリペプチドは、Ｎ末端から
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この３番
目のＣｙｓをＳｅｒに置換し、かつ、発現に必要な開始
コドン（ＡＴＧ）を最初のＣｙｓの直１１１１に付与す
る目的で、１・記のようなりＮＡクリンカを合成した。
ｉｎｄ ・′ト まず、１木ｇｌＤＮＡ、２０−ｍａｒと１．９−ｍａｒ
を通常のトリエステル法により合成した。２〇−ｍ　〔
；　ｒおよび１９−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍＭトリ
ス−１−１ｃＲ（ｐＨ７，５）、］ＯｍＭ　　ＭｇＣｌ
１２゜５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量４０μｍに溶か
し、１゛４ポリヌクレオチドキナ一ゼ３０単位を加えて
、３７℃で６０分間りン酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＧ、ＢＤ１由来のＳｉｎｌ−ＢａｍＨ
Ｉ断片（約８５０ｂｐ）０．５／ｊｇと発現ベクターｐ
ＫＹＰ１０のＨｊｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片（約４．
３Ｋｂ）１．０μｇとをＴ４リガーゼ緩衝液２５μｌに
溶かし、上記ＤＮＡを約０．１μｇ得た。この混合液に
、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１７
時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
８８１０１株を形質転換し、ＡｐＨのコロニーを得た。
このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し、
第３図に系したｐＧＶＭ　１０１を得た。ｐＧＶＭ　１
０１の構造は、ＥｃｏＲＩ。
ＣＲａ１．ＨｉｎｄＩ［Ｉ、ＢａｍＨＩで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。
ｐｃｖＭｌ　０１のＨｉｎｄｌｌＩ部位からＳｉｎｌ部
位までの塩基配列は、 であることを、マキサム・ギルバートの方法で確認した
。
ｐＧＶＭｌ　０１のコードするヒトＩＦＮ−γポリペプ
チド〔本誘導体を３−３ｅｒ−ＩＦＮ−ｒと呼ぶ〕は成
熟型ヒ）ＩＦＮ−７の３番目のＣｙｓがＳｅｒに置換し
ている点で公知のものと、明らかに異なる。プラスミド
ｐＧＶＭ１０１をもつ大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ　　Ｉ　ＧＶＭ　１０１　（Ｆ　ＥＲＭＢＰ
−５４５）として微工研に寄託されている。
参考例６゜ ｌ、３−３ｅｒ−ＩＦＮ−ｒをコードする組換え体プラ
スミドｐＧＶＫ１３の造成： 参考例３により得られたｐＧＢＤＩ　　ＤＮＡ６μｇを
Ｙ−５０緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素Ｓ　ｉ　ｎ
　ｌ　（Ｂｉｏ　Ｔｃｃ社製）１０単位を加え、３７℃
で３時間消化反応を行った。
次いでＮａＣ１！を終濃度１００ｍＭとなるように加え
、ＢａｍＨ１１０単位を加え、３７℃でさらに３時間消
化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりヒ）Ｉ
ＦＮ−ｒＤＮΔの大部分を含む約８５０ｂｐのＤＮＡ断
片約０．８μｇを得た。
別にｐＫＹＰｌ　０の３μｇをＹ−１００緩衝液を含む
全量４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ
とＢａｍＨＩそれぞれ５単位ずつを加え３７℃で３時間
消化反応を行った。この反応液からＬ　Ｇ　ｌ’法によ
りＰｔｒｐを含む約４．３　ｋ　ｂのＤ　ＮＡ断片約１
．８μｇを得た。
一方、成熟ヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドはＮ末端からＣ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この１番目
と３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換し、かつ、発現に必要
な開始コドン（ＡＴＧ）を最初のＳｅｒの直前に付与す
る目的で、下記のようなりＮＡクリンカを合成した。
まず−末鎖ＤＮＡ、２０−ｍａｒと１９−ｍａｒ’を通
常のトリエステル法により合成した。２０−ｍｅｒおよ
び１９−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍＭトリス−ＨＣＲ
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！□。
５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡお
よび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量４０μｌの溶液に溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位を加えて、
３７℃で６０分間リン酸化反応を行なった゛。
次に上記で得たｐＧＢＤ１由来のＳｉｎｌ−ＢａｍＨＩ
断片（約８５０ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐＫｙ
ｐｔ、ｏのＨｉ　ｎ　ｄ−ＩＩＩ−Ｂａ　ｍＨ１断片（
約４．３ｋｂ）１．０μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２５μ
！に溶かし、この混合液に上記Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪンカー
を約０．１μｇ加えた。この混合液にさらにＴ４ＤＮＡ
リガーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行な
った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ’　１０１株を形質転換し、ΔｐＲのコロニーを得た
。このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し
、第４図に示したｐＧＶＫ　１３を得た。ｐＧＶＫ１３
の構造はＥｃｏＲＩ、　Ｈ，ｉ　ｎｄｍ、ＣＡａＩ、Ｂ
ａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により確認
した。ｐＧＶＫ１３のＨｉｎｄＩＩＩ部位からＳｉｎｌ
部位までの塩基配列は であることをマキサム・ギルバートの方法で確認した。
ｐＧＶＫ１３のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチド
〔本誘導体を１．３−５ｅｒ　−ＩＦＮ−Ｔと呼ぶ〕は
成熟型ヒ）ＩＦＮ−ｒのＬ番目と３番目のＣｙｓがＳｅ
ｔに置換している点で公知のものとは明らかに異なる。
プラスミドｐ　Ｇ　Ｖ　Ｋ　］、　３をもつ大腸菌は微
工研にＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　Ｉ　Ｇ　
Ｖ　Ｋ１．３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４，３２）として寄
託されている。
発明の効果 本発明によれば、ＩＦＮ−γ活性の高い新規インターフ
ェロン−Ｔポリペプチド誘導体が供給され、これは抗ウ
ィルス、抗腫瘍剤などの医薬としての用途が期待される
。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＧＶＴ１３７造成のフローシー
トを示す。Ｈｉｎｆ　１．ＴａｑＩ部位は造成に用いた
部分のみを表示した。 第２図は、プラスミドｐＧＮＣ５造成のフローシートを
示す。Ｔａｑ１部位は造成に用いた部分のみを表示した
。 第３図は、プラスミドｐＧＮＢ４造成の７０−ンートを
示す。ＴａｑＩ部位は造成に用いた部分のみを表示した
。 第４図は、プラスミドｐＧＮＡ３造成のフローシートを
示す。ＴａｑＩ部位は造成に用いた部分のみを表示した
。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ヒトインターフェロン−γポリペプチドから一部
    のアミノ酸が除去され、かつ該アミノ酸以外の一部のア
    ミノ酸が他のアミノ酸に置換された新規ヒトインターフ
    ェロン−γポリペプチド誘導体。
  2. （２）ヒトインターフェロン−γポリペプチドが第１表
    に示されたアミノ酸配列を有するものであることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド誘導体
    。
  3. （３）アミノ酸の除去がＮ末端および／またはＣ末端か
    らのアミノ酸の除去であり、アミノ酸の置換がＮ末端か
    ら１番目、３番目または１３５〜１３８番目に位置する
    システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン
    （Ｇｌｎ）、メチオニン（Ｍｅｔ）およびロイシン（Ｌ
    ｅｕ）の１個以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のポリ
    ペプチド誘導体。
  4. （４）Ｃｙｓを置換するアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）
    またはＳｅｒであり、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＭｅｔおよびＬ
    ｅｕを置換するアミノ酸がＣｙｓであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第３項記載のポリペプチド誘導体。
  5. （５）ヒトインターフェロン−γポリペプチドから一部
    のアミノ酸が除去され、かつ該アミノ酸以外の一部のア
    ミノ酸が置換された新規ヒトインターフェロン−γポリ
    ペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた
    組換え体プラスミド。
  6. （６）該ＤＮＡ断片が、第１表の塩基配列のうち［１］
    ８番目のＧのＡへの変換または４０２番目〜４１４番目
    に位置するＡＧＴ、ＣＡＧ、ＡＴＧおよびＣＴＧのうち
    いずれか一組のコドンのＴＡＣへの変換と［２］１〜１
    ２番目および／または４０２〜４３８番目の塩基の欠失
    とを行った塩基配列を有する特許請求の範囲第５項記載
    の組換え体プラスミド。
  7. （７）ｐＧＶＴ１３７、ｐＧＮＣ５、ｐＧＮＢ４、ｐＧ
    ＮＡ３と称する特許請求の範囲第６項記載の組換え体プ
    ラスミド。
  8. （８）ヒトインターフェロン−γポリペプチドから一部
    のアミノ酸が除去され、かつ該アミノ酸以外の一部のア
    ミノ酸が置換されたヒトインターフェロン−γポリペプ
    チド誘導体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換
    え体プラスミドを用い形質転換した微生物を培地に培養
    し、培養物中にヒトインターフェロン−γポリペプチド
    誘導体を蓄積させ、培養物からヒトインターフェロン−
    γポリペプチド誘導体を採取することを特徴とするヒト
    インターフェロン−γポリペプチド誘導体の製造法。
  9. （９）アミノ酸の除去がＮ末端および／またはＣ末端か
    らのアミノ酸の除去であり、アミノ酸の置換がＮ末端か
    ら１番目、３番目または１３５〜１３８番目に位置する
    Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＭｅｔおよびＬｅｕの１個以
    上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換であることを特徴
    とする特許請求の範囲第８項記載の製造法。
  10. （１０）微生物が大腸菌に属することを特徴とする特許
    請求が範囲第８項記載の製造法。
  11. （１１）ヒトインターフェロン−γポリペプチドから一
    部のアミノ酸が除去され、かつ該アミノ酸以外の一部の
    アミノ酸が置換されたヒトインターフェロン−γポリペ
    プチド誘導体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組
    換え体プラスミドを含む微生物。
  12. （１２）アミノ酸の除去がＮ末端および／またはＣ末端
    からのアミノ酸の除去であり、アミノ酸の置換がＮ末端
    から１番目、３番目または１３５〜１３８番目に位置す
    るＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＭｅｔおよびＬｅｕの１個
    以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１１項記載の微生物。
  13. （１３）微生物が大腸菌に属することを特徴とする特許
    請求の範囲第１１項記載の微生物。
  14. （１４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＶＴ
    １３７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
    ｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＮＣ５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５５
    ０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＮＢ４
    （ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４９）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
    ｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＮＡ３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４８
    ）から選ばれる特許請求の範囲第１１項の微生物。
JP14395084A 1984-07-11 1984-07-11 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体 Pending JPS6124599A (ja)

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