JPH062065B2 - 魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド - Google Patents

魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド

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JPH062065B2
JPH062065B2 JP60161429A JP16142985A JPH062065B2 JP H062065 B2 JPH062065 B2 JP H062065B2 JP 60161429 A JP60161429 A JP 60161429A JP 16142985 A JP16142985 A JP 16142985A JP H062065 B2 JPH062065 B2 JP H062065B2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡを含む微生物および該微生物を用いる魚類の
成長ホルモンポリペプチドの製造法に関する。魚類の成
長ホルモンは魚類の養殖産業分野において広い用途が期
待される。
従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産される
が、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえ
ば、ヒト成長ホルモンについては、ユー・ジェイ・レビ
ィス(U.J.Lewis)らによってジャーナル・オブ・アメリ
カン・ケミカル・ソサイエティ（J.Am.Chem.Soc.），8
0，4429(1958)に、エイ・エス・ハートリー(A.S.Hartae
e)によってバイオケミカル・ジャーナル(Biochem.J.)，
100，754(1966)に、シー・エイチ・リー(C.H.Li)らによ
ってアーチブス・オブ・バイオケミストリィ・アンド・
バイオフィジクス・（サプルメント）〔Arch.Biochem.B
iophys. (Suppl.)〕，1，327(1962)に報告されている。
魚類の成長ホルモンについては、単離された報告は下記
の例がある。
ティラピアよりの単離例：エス・ダブリュ・ファーマー
(S.W.Farmer)ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ
・エンドクリノロジィ(Gen. Comp. Endocrin.)，30，91
(1976). チョウザメよりの単離例：エス・ダブリュ・ファーマー
(S. W. Farmer)ら、エンドクリノロジィ(Endocrinolog
y)，108，377(1981). コイよりの単離例：エイ・エフ・クック(A. F. Cook)
ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリ
ノロジィ(Gen. Comp.Endocrin.)，50，335(1983)． シロサケよりの単離例：特開昭60-214798 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーグ(P.H. Se
eburg)ら：ネイチャー(Nature) 270 486(1977)〕，ウシ
およびブタの成長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シー
バーグ(P.H. See-burg)ら：ディー・エヌ・エイ（ＤＮ
Ａ），２，37(1983)〕、ヒト成長ホルモン遺伝子〔ジェ
イ・エイ・マーシャル(J.A. Martial)ら：サイエンス(S
cience), 205, 602(1974)〕などがすでに知られてお
り、魚類の成長ホルモン遺伝子についてもシロサケ成長
ホルモンの遺伝子が本発明者らにより既に単離されてい
る〔（特開昭61-15699)〕。
発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するの
で、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳
下垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類
の成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望
まれている。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、魚類
の成長ホルモンポリペプチドに相補的なＤＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮ
Ａを含む微生物の製造に成功した。即ちウナギ脳下垂体
からメッセンジャーＲＮＡ(mRNA)を抽出し、これと相補
的なＤＮＡ(cDNA)を合成し、次いでウナギの成長ホルモ
ンのＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプロー
ブを合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡ
を選択することにより、ウナギ成長ホルモン遺伝子をク
ローン化し、そのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。本
発明者らはさらに研究を進め、ウナギの成長ホルモンを
コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微
生物を培養することにより、培養物中にウナギ成長ホル
モンポリペプチドが著量蓄積することを見い出し、本発
明を完成するに至った。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組
換え体ＤＮＡを含む微生物および該微生物を用いる魚類
の成長ホルモンポリペプチドの製造法を提供する。
本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。
ウナギ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴｄ
Ｔセルロース(oligo dT cellulose)カラムを通すことに
よりポリアデニル酸を有するＲＮＡ〔ポリ（Ａ）ＲＮ
Ａ〕を分離する。このポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型とし、逆
転写酵素により二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試
験管内ＤＮＡ組換え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤ
ＮＡのようなベクターＤＮＡに該合成ＤＮＡを挿入して
得られる。
次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。
捕獲されたウナギより脳下垂体を摘出し、即座に液体窒
素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にチオシアン酸グ
アニジンを加え破砕し、可溶化する。次いでＬｉＣｌを
加えて、遠心後、沈殿物として全細胞質ＲＮＡを得る。
また、チオシアン酸グアニジン可溶化物をＣｓＣｌ溶液
層に重層し、超遠心後、沈殿物としてＲＮＡを得ること
もできる。
抽出したＲＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの高塩濃度（た
とえば0.5Ｍ）溶液に溶解し、オリゴ(dt)セルロースの
カラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡをカラム
に吸着させる。水、１０ｍＭトリスーＨＣｌ緩衝液のよ
うな低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（Ａ）を有する
ｍＲＮＡを単離する。
以下、オカヤマ−バーグ(Okayama-Berg)の方法〔オカヤ
マ・アンド・バーグ(Okayama & Berg)；モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol.Cell.Biol.)２，
161(1982)〕に従い、cDNAの合成および、そのベクター
への組み込みを行う。
まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐＣＤＶ１を適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（たとえばpH7.5, 10mM)，ＭｇＣｌ2（たと
えば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば１０ｍＭ）を含む溶
液中でＫｐｎＩで処理し、ｐＣＤＶ１のＫｐｎＩ部位を
切断する。このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえ
ばpH6.8, 30mM)，カコジル酸ナトリウム（たとえば１４
０ｍＭ），ＣｏＣｌ2（たとえば１ｍＭ），ジチオスレ
イトール（たとえば0.1ｍＭ）およびｄＴＴＰ（たとえ
ば0.25ｍＭ）中、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼとともに一定温度（たとえば３７℃）
で一定時間（たとえば２０分間）インキュベートし、ベ
クターＤＮＡの両3′末端に６０個前後のチミジル残基
を付加する。さらにこのＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液
（たとえばｐＨ7.5，10ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（たとえば６
ｍＭ），ＮａＣｌ（たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中
ＥｃｏＲＩで切断後、低融点アガロースゲル電気泳動法
〔ラルス・ウイスランダー(Lars Wieslander)，アナリ
ティカル・バイオケミストリィ (AnalyticaBiochemist
ry)98, 305(1979)，以下ＬＧＴ法という〕にて分画し、
約3.1キロベースの断片を回収する。次いで該ＤＮＡを
ＮａＣｌまたはＫＣｌの高塩濃度（たとえば0.5Ｍ）溶
液に溶解し、ポリ（ｄＡ）セルロースカラムに通塔して
ポリ（Ｔ）を有するベクタープライマー分子のみをカラ
ムに吸着させる。水、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液の
ような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（Ｔ）の付加
したベクタープライマー分子のみを単離する。
次にリンカーＤＮＡを合成する。たとえばｐＬ１ＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえ
ばｐＨ7.5，１０mM），ＭｇＣｌ2（たとえば６ｍＭ），
ＮａＣｌ（たとえば５０mM）を含む溶液中でＰｓｔＩで
処理し、ｐＬ１のＰｓｔＩ部位を切断する。このＤＮＡ
を、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加える以外はベクタ
ープライマー合成の場合と同様に処理し、１５個前後の
オリゴ(dG)鎖を付加する。該ＤＮＡを適当な溶液たとえ
ばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ7.5，１０ｍ
Ｍ），ＭｇＣｌ2（たとえば６ｍＭ），ＮａＣｌ（たと
えば６０ｍＭ）を含む溶液中ＨｉｎｄIIIにて切断す
る。アガロースゲル電気泳動にて約0.5キロベースのＤ
ＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパーにて回収する。こ
のようにしてリンカーＤＮＡを得る。
以上のようにして得たポリ(A)ＲＮＡ，ベクタープライ
マー，リンカーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行う。ポ
リ(A)ＲＮＡ，ベクタープライマーＤＮＡをトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（たとえばｐＨ8.3，５０ｍＭ），ＭｇＣ
ｌ2）たとえば８ｍＭ），ＫＣｌ（たとえば３０ｍ
Ｍ），ジチオスレイトール（たとえば0.3ｍＭ），ｄＡ
ＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（たとえば各々２
ｍＭ）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば
３７℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。
こうして得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の3′末端に、ｄＴ
ＴＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーに(d
T)鎖を付加した条件と同様の操作でオリゴ(dC)鎖を１５
個前後付加する。このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液
（たとえばｐＨ7.5，１０ｍＭ），ＭｇＣｌ2（たとえば
６mM，ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉ
ｎｄIIIで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリン
カーＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば
pH7.5，２０ｍＭ），ＭｇＣｌ2（たとえば４ｍＭ），
（ＮＨ4)2ＳＯ4（たとえば１０ｍＭ），ＫＣｌ（たとえ
ば0.1Ｍ），β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（β−NAD)（たとえば0.1ｍＭ）を含む溶液中、大腸
菌DNA リガーゼとともに一定時間（たとえば１６時
間）、一定温度（たとえば１２℃）でインキュベートす
る。こうしてｃＤＮＡとリンカーＤＮＡとの環状化が行
われる。この反応液にｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＣＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう加え、大腸
菌ＤＮＡリガーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼＩ、大腸菌
リボヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換
することにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプ
ラスミドを得る。
こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコット（Ｓｃｏ
ｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学 ２，616(198
3)〕により形質転換する。上記で得た組換え体プラスミ
ド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するため、形質
転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。以下の手法
はこれらインピシリン耐性（ＡｐR）菌株から魚類の成
長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を持つ新規組
換え体プラスミドＤＮＡを保育する菌株を選択するのに
一般的に用いられる。すなわち、上記で得られた形質転
換株をニトロセルロースフィルター上に固定し、既知の
ウナギ成長ホルモンのアミノ酸配列より予想されるＤＮ
Ａ配列を有する合成ＤＮＡプローブと会合させ、強く会
合するものを選択する〔グルンステイン−ホグネス(Gru
ns-tein-Hogness)の方法、プロシーデイング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc.Na
tl.Acad.Sci.), USA., 72, 3961(1975)〕。プローブＤ
ＮＡは通常のトリエステル法〔ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエテイ(J.Am. Chem. Soc.),
97,7327(1975)〕で合成される。合成ＤＮＡプローブに
よる選択はサザーン(Southern)らの方法〔ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジイ(J. Mol.Biol.), 9
8, 503(1975)〕によってさらに確実にでき、この方法で
ウナギ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有
する組換え体プラスミドＤＮＡを同定できる。
このようにして得られる組換え体プラスミドの一例がｐ
ＥＧＨ１５である。このプラスミドをウナギ成長ホルモ
ンをコードするＤＮＡの供給源として用いることができ
る。ウナギ成長ホルモンとしてＧＨ−Ｉ，ＧＨ−IIの２
種類があり、両者のアミノ酸配列を比較すると、ＧＨ−
IIはＧＨ−ＩのＮ末端からアミノ酸の３残基が欠けてい
る（特開昭62-12723）。
上記で得られたｐＥＧＨ１５は、ＧＨ−Ｉをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドである。従って、ｐＥＧＨ１５
からＧＨ−ＩをコードするＤＮＡを切り出し、組換えＤ
ＮＡ技法によりＮ末端のアミノ酸３残基に相当するＤＮ
Ａを削って、ＧＨ−IIをコードするＤＮＡを含むプラス
ミドを作製することもできる。
ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドから該ＤＮＡを切り出し、これをベクターＤＮＡに組
み込み、得られる組換え体ＤＮＡを微生物に導入し、得
られる形質転換体を培養することによってウナギ成長ホ
ルモンポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、これを
採取することによってウナギ成長ホルモンポリペプチド
を製造することができる。
ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドとしては、上記ｐＥＧＨ１５が好適な例としてあげら
れる。
ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができる。好ましくは、適当なプロモーター、
たとえばトリプトファン(trp)系、ラクトース(lac)系、
PL系などのプロモーターを持ち、その下流にＤＮＡを挿
入でき、しかも内在するシャインダルガーノ配列（以下
ＳＤ配列と略記する）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）との
間を適当な距離たとえば６〜１８塩基対に調節したベク
ターＤＮＡが用いられる。具体的に好適なベクターＤＮ
Ａとしては、プラスミドpGLM1をあげることができる。
ｐＧＬＭ１は第３図に示したプラスミドで、それを含む
大腸菌はEscheri-chia coli ＥＧＬＭ１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−８２３）として昭和６０年７月２日付で工業技術院
微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されている。ポ
リペプチドをコードするＤＮＡとベクターＤＮＡとの組
換えは、制限酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ手法を
用いて行うことができる。
具体例として示したｐＥＧＨ１５とｐＧＬＭ１の場合は
次のごとく造成を行う。すなわちpEGH15よりウナギ成長
ホルモン成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡ部分および
ベクター部分を含むＢａｎII−ＢａｍＨＩ消化断片を
得、ｐＧＬＭ１からはＰLプロモーターとｃ１８５７遺
伝子を含むＢａｍＨＩ−ＢａｎIII消化断片を得る。一
方、以下のような合成ＤＮＡリンカーを作製する。
上記両ＤＮＡ断片と合成ＤＮＡリンカーとをＴ４ＤＮＡ
リガーゼで結合し、第３図に示した組換え体プラスミド
ｐＵＰＡ１を得る。本プラスミドはＰLプロモーター下
流に、成熟ウナギ成長ホルモン（ＧＨ−Ｉ）をコードす
る領域が連結した形を有する。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常0.1〜２０μ
ｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍ
Ｍ）のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ6.0〜9.5好ましくはｐＨ7.
0〜8.0）、０〜２００ｍＭのＮａＣｌ、２〜３０ｍＭ
（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｌ2を含む反応液
中で、制限酵素0.1〜１００単位（好ましくは１μｇのD
NAに対して１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温
度は用いる制限酵素により異なる）において、１５分間
〜２４時間行う。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、
５〜３０分間加熱することによるが、フェノールまたは
ジエチルピロカーボネートなどの試薬により制限酵素を
失活させる方法も用いることができる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、ＬＧ
Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによって
行う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ6.1〜9.5、好
ましくはｐＨ7.0〜8.0）、２〜２０ｍＭ（好ましくは５
〜１０ｍＭ）のＭｇＣｌ2、0.1〜１０ｍＭ（好ましくは
0.5〜2.0ｍＭ）のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５
〜１０ｍＭ）のジチオスレイトールを含む反応液中で、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ0.3〜１０単位を用い、１〜３７℃
（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ま
しくは２〜２０時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりCohenらの形質転換法〔エス・エヌ・コーエ
ン(S.N. Cohen)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. A
cad. Sci. ), USA,69, 2110(1972)〕によって、大腸菌
に導入する。
組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、セシウム・クロライド−エチジウム・ブロミド
密度勾配超遠心法〔ディー・ビークレウェル(D.B.Clewe
ll)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.),USA,62, 1159(1969)〕あるいはバーンボイム(Birn-
boim)らの方法〔エイチ・シー・バーンボイム(H.C.Birn
boim)ら：ヌクレイック・アシド・リサーチ(Nucleic Ac
ids Res.)7, 1513(1979)〕などを用いて行う。
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基
配列を決定する必要がある時はマキサム・ギルバード法
〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.), 74,
560(1977)〕またはＭ13ファージを用いたサンガー(Sang
er)法〔サンガー(Sanger)ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Pro
c. Natl. Acad. Sci.), USA, 74, 5463(1977)；アマー
シャム(Amersham)社M13クローニング・アンド・シーク
エンシング・ハンドブック(cloning and sequencing ha
nd-book)〕によって決定する。
本発明のウナギ成長ホルモンポリペプチドは以下のとお
りに製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐＵＳＡ１）を用いて大
腸菌Ｋ−12 ｃ６００を形質転換させ、アンピシリン耐
性のコロニーの中からｐＵＳＡ１を有する大腸菌を選び
だす。ｐＵＳＡ１を有する大腸菌を培地に培養すること
により培養物中にウナギ成長ホルモンポリペプチドを生
成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにウナギ
成長ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならば合
成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース，フラクトース，ラクトー
ス，グリセロール，マンニトール，ソルビトールなど
が、窒素源としては、ＮＨ4Ｃｌ，（ＮＨ4)2ＳＯ4，カ
ザミノ酸，酵母エキス，ポリペプトン，肉エキス，バク
トトリプトン，コーン・スティープ・リカーなどが、そ
の他の栄養源としては、Ｋ2ＨＰＯ4，ＫＨ2ＰＯ4，Ｎａ
Ｃｌ，ＭｇＳＯ4，ビタミンＢ1，ＭｇＣｌ2などが使用
できる。
培養はｐＨ5.5〜8.5，温度１８〜４０℃で通気撹拌培養
により行われる。
培養５〜９０時間で培養菌体中にウナギ成長ホルモンポ
リペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌し、
菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰り返して菌体
を破砕し、遠心して得られる上清から通常のポリペプチ
ドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。
また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ(Lae
mmli)のサンプルバッファー〔レムリ(Laemmli)，ネイチ
ャー(Nature), 227, 680(1970)〕に加熱、溶解後、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル〔レムリ(Laemmli)の方
法：同上文献〕にかけ、ウェスタン・ブロッティング
〔トービン(Towbin)ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Nat
l. Acad. Sci.)，ＵＳＡ，76, 4350(1979)〕をした後、
ワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体〔ダコー
（ＤＡＫＯ）社製〕を用いた酵素抗体染色法〔田部一
史：細胞工学，２，1061(1983)〕により行った。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ ウナギ脳下垂体よりのポリ（Ａ）ＲＮＡの調
製 ウナギ脳下垂体よりチオシアン酸グアニジン−塩化リチ
ウム法〔カサラ(Cathala)ら、ディーエヌエイ（ＤＮ
Ａ），２，329(1983)〕に従いポリ（Ａ）を有するＲＮ
Ａを下記のごとく調製した。
ウナギの凍結脳下垂体0.5ｇ（約1000個体分）を５Ｍチ
オシアン酸グアニジン、１０mM ＥＤＴＡ、５０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７）および８％(V/V)β−メルカプト
エタノールからなる溶液１０ml中でテフロンホモゲナイ
ザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。この可溶化物
を遠心管に移し、４Ｍ ＬｉＣｌ溶液７０mlを加えて撹
拌した後、４℃２０時間静置した。Hitachi ＲＰＲ１
０ローターにて9,000ｒｐｍ、９０分間遠心後、ＲＮＡ
を沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および
２Ｍ塩化リチウムからなる溶液１００mlに懸濁し、Hita
chi ＲＰＲ１０ローターにて9,000ｒｐｍ、６０分間遠
心後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿
を0.1％ラウリル硫酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ、１
０mMトリス・ＨＣｌ（ｐＨ7.5）からなる溶液１０mlに
溶解し、フェノール−クロロホルムで抽出後、エタノー
ル沈殿により回収した。得られたＲＮＡ約１mgを10mMト
リス−ＨＣｌ（pH 8.0）および１mM ＥＤＴＡからなる
溶液１mlに溶かした。６５℃、５分間インキュベート
し、0.1mlの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ
（ｄＴ）セルロース・カラム〔ピー・エル・バイオケミ
カル（Ｐ−Ｌ Bio-chemical)社製〕クロマトグラフィ
ー（カラム体積0.5ml）にかけた。吸着したポリ（Ａ）
を有するｍＲＮＡを１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）
および１mM ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポリ
（Ａ）を有するｍＲＮＡ約７μgを得た。
実施例２ ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿
入： オカヤマ−バーグ(Okayama-Berg)の方法 〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ(Mo
l.Cell.Biol.)，２，161(1982)〕に従い、ｃＤＮＡの合
成とそれを組み込んだ組換え体プラスミドの造成を行っ
た。その工程の概略を第１図に示す。
ｐＣＤＶ１〔オカヤマ・アンド・バーグ(Okaya-ma & Be
rg）：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ
(Mol. Cell.Biol.)，３，280(1983)〕４００μｇを１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2お
よび10ｍＭＮａＣｌからなる溶液３００μに加え、さ
らに５００単位のＫｐｎＩ（宝酒造社製，以下特記しな
い限り制限酵素はすべて宝酒造社製）を加えて、３７
℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切
断した。フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿によりＤＮＡを回収した。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮ
Ａ約２００μｇを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ6.8），１ｍＭCoCl2および
0.1ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）
からなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴ
ＴＰを0.25ｍＭとなるよう加えた溶液200μｌに加え、
さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（以下TdTと略記する）（Ｐ−Ｌ Bio
chemicals社製）を加えて、３７℃、11分間反応させ
た。ここで、ｐＣＤＶ１のＫｐｎＩ切断部位の3′末端
にポリ(dT)鎖が約67個付加された。該溶液からフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ(d
T)鎖の付加したｐＣＤＶＤＮＡ約１００μｇを回収し
た。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH7.5)、６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，１００ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液
１５０μに加え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩを加
え、３７℃２時間反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処
理後、約3.1ＫｂのＤＮＡ断片を回収し、約60μｇのポ
リ(dT)鎖付加ｐＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ8.0）および１ｍＭ ＥＤＴＡから
なる溶液５００μlに溶解し、６５℃５分間インキュベ
ート後、氷冷して５０μlの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。
混合物をオリゴ(dA)セルロースカラム（コラボラティブ
リサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリ(dT)
鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これを１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ(pH8.0)および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる
溶液で溶出し、ポリ(dT)鎖の付加したｐＣＤＶ１（以下
ベクタープライマーと略記する）２７μｇを得た。
次にリンカーＤＮＡの調製を行った。
ｐＬ１〔オカヤマ・アンド・バーグ(Okayama & Berg)：
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ(Mol.
Cell.Biol.)，３，280(1983)〕約１４μｇを10ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5)，6mM ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ
ＮａＣｌからなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５
０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬ
１ＤＮＡ中のＰｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行
い、ＰｓｔＩで切断したｐＬ１ＤＮＡ約13μｇを回収し
た。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度0.25ｍ
ＭのｄＧＴＰを含む溶液50μｌに加え、さらにＴｄＴ(P
-L Biochemicals社製）５４単位を加えて37℃１３分間
インキュベートし、ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位３′末端
に(dG)鎖を約１４個付加した。フェノール−クロロホル
ム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮ
Ａを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2および６０mM ＮａＣｌからなる緩衝液１００
μｌに加え、さらに８０単位のHind IIIを加えて３７℃
３時間インキュベートし、ｐＬ１ＤＮＡのＨｉｎｄIII
部位で切断した。該反応物をアガロースゲル電気泳動に
て分画し、約0.5ＫｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー
法〔ドレツェン(Dretzen)ら、アナリティカル・バイオ
ケミストリイ(Anal. Biochem.), 112, 295(1981)〕にて
回収し、オリゴ(dG)鎖付きのリンカーＤＮＡ（以下単に
リンカーＤＮＡと略記する）を得た。
上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ，ベクタープ
ライマー約1.4μｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.
3）、８ｍＭ ＭｇＣｌ2，３０ｍＭ ＫＣｌ，0.3ｍＭ
ＤＴＴ，２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄ
ＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および１０単位のリボヌクレア
ーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）からな
る溶液22.3μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化
学工業社製）を加え、３７℃４０分間インキュベート
し、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成させた。該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマ
ーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭ ｄＣＴＰお
よび0.2μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液２０μｌに
溶かし、１４単位のＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Biochemicals社
製）を加えて３７℃８分間インキュベートし、ｃＤＮＡ
３′末端に１２個の(dC)鎖を付加した。該反応物をフェ
ノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により(d
C)鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを
回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.
5）、６ｍＭＭｇＣｌ2および６０ｍＭ ＮａＣｌからな
る液４００μｌに溶かし、２０単位のＨｉｎｄIIIを加
え、３７℃２時間インキュベートし、ＨｉｎｄIII部位
で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿して0.5 pmoleの(dC)鎖付加ｃＤＮ
Ａ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ0.０８
pmoleおよび前記のリンカーＤＮＡ0.１６pmoleを１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、0.1Ｍ ＮａＣｌおよび
１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに溶かし、６５
℃，４２℃，０℃でそれぞれ１０分，２５分，３０分間
インキュベートした。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.
5）、４mM MgＣｌ2，10mM (NH4)2SO4, 0.1Ｍ ＫＣｌお
よび0.1ｍＭ β−ＮＡＤの組成で、全量４００μｌと
なるよう反応液を調製した。該反応液に１０単位の大腸
菌ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs 社製）を加
え、１１℃一夜インキュベートした。該反応液を各４０
μＭのｄＮＴＰ，0.１５ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成
分を追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、７単
位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ(P-L Bio-chemicals社
製）および２単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ(P-L Bio
chemicals社製）を加え、12℃，２５℃で順次１時間ず
つインキュベートした。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組
換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ
部分がDNAに置換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプ
ラスミドが生成した。
実施例３ ウナギ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換えＤ
ＮＡの選択： 実施例２で得た組換えプラスミドを用い、大腸菌c600SF
8株〔カメロン(Cameron)：プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc. N
atl. Acad. Sci.)USA, 72, 3416(1975)〕をScottらの方
法〔重定勝哉：細胞工学，２，616(1983)〕に従い形質
転換した。得られた約2,400個のコロニーをニトロセル
ロース上に固定した。ウナギ成長ホルモンのＮ末端から
２７番目−３２番目のアミノ酸配列に対応する合成ＤＮ
Ａ、すなわち （３番目の塩基はＡ，Ｔ，Ｇのいずれか ６番目の塩基はＡまたはＧ、 ９番目の塩基はＴまたはＣ、 １２番目の塩基はＴまたはＣ、 １５番目の塩基はＡまたはＧであり、 組み合わせて４８通りの合成ＤＮＡの混合物となる。） を32Ｐで標識したプローブに３８℃で強く会合した３菌
株を選んだ〔グルンステイン・ホグネス(Grunstein-Hog
ness)の方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Prco. Natl. Acad.
Sci) USA, 72, 3961(1975)〕。得られた３菌株につい
てサザーン(Southern)の方法〔ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.) 98, 503, (19
75)〕により、上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ
酸配列に対応する合成ＤＮＡプローブ、すなわち （３番目の塩基はＴまたはＣ、 ６番目の塩基はＡまたはＧ、 ９番目の塩基はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、 １２番目の塩基はＡまたはＧであり、 組み合わせて３２通りの合成ＤＮＡの混合物となる。） とも会合が確認された。これらのプラスミドはｐＥＧＨ
８，９，１５と命名したが、いずれもウナギ成長ホルモ
ンのアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有するこ
とから、ウナギ成長ホルモンｃＤＮＡを含んでいるもの
と考えられた。
実施例４ プラスミドｐＥＧＨ１５の塩基配列： 上記で得られたプラスミド３種につき、種々の制限酵素
で消化し、ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。プラス
ミドｐＥＧＨ１５中のｃＤＮＡ制限酵素地図を第２図に
示す。
次に実施例３で行った合成ＤＮＡプローブと強い会合を
示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられるｐ
ＥＧＨ１５についてその翻訳領域の全ヌクレオチド配列
をＭ１３ファージを用いたサンガー(Sanger)法〔Sanger
ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.), US
A, 74, 5463 (1977)：アマーシャム(Amersham社）M13ク
ローニング・アンド・シークエンシングハンドブック(c
loning and sequencing handbook)〕に従って決定し
た。ヌクレオチド配列を第一表に示す。第一表中、塩基
数１−５７がシグナルペプチドを、５８−６２７がウナ
ギ成長ホルモンの成熟ペプチドをコードする。ｐＥＧＨ
１５に含まれるｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配
列は、天然のウナギ成長ホルモンから決定されているア
ミノ酸配列の一部と完全に一致し、該ｃＤＮＡはウナギ
成長ホルモン（ＧＨ−Ｉ）をコードしていることが確認
された。
ｐＥＧＨ１５を含む大腸菌は、Escherichia coliＥＥＧ
Ｈ１５（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２４）として微工研に昭和
６０年７月２日付で寄託してある。
実施例５ ウナギ成長ホルモン（ＧＨ−１）をコードす
る組換え体プラスミドｐＵＰＡ１の造成： ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＥＧＨ１５ ３μgを１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
7.5）、７mM ＭｇＣｌ2および１００mM ＮａＣｌを含
む溶液（以下Ｙ−１００緩衝液と略す）３０μlに溶か
し、制限酵素ＢａｎII（東洋紡績社製）８単位および制
限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）８単位を加え、３７
℃、２時間消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法に
より、ｐＥＧＨ１５でコードされる成熟ウナギ成長ホル
モン翻訳領域、3′−非翻訳領域およべペクター部分を
含む約８５０bpのＤＮＡ断片約0.1μgを得た。
別にｐＧＬＭ１ ２μgを３０μlのＹ−１００緩衝液に
溶かし、制限酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）８単位お
よび制限酵素ＢａｍＨＩ８単位を加え、３７℃、２時間
消化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法によりＰLプ
ロモーターおよびｃＩ８５７遺伝子を含む約4.0KbのＤ
ＮＡ断片約１μgを得た。
一方成熟ウナギ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発現
に必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベクタ
ーＤＮＡと上記ＤＮＡを連結する目的で下記のＤＮＡリ
ンカーを合成した。
まず一本鎖ＤＮＡ21merと15merを通常のトリエステル法
〔アール・クレア(R. Crea)ら：プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(P
roc. Natl. Acad. Sci.),USA, 75, 5765(1978)〕により
合成した。21merおよび15merの一本鎖ＤＮＡ各々30pmol
eを50mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5），１０mM ＭｇＣｌ
2，１０mM ＤＴＴおよび１mM ＡＴＰを含む溶液30μl
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）３単位を加え、３７℃、４０分間リン酸化反応を行
った。
上記で得たｐＥＧＨ１５のＢａｎII−ＢａｍＨＩ断片
（約８５０bP）0.03p mole、ｐＧＬＭ１のＢａｍＨＩ−
ＢａｎIII断片（約4.0Kb)0.006pmoleを５０mMトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、10mM ＭｇＣｌ2，１０mMＤＴＴお
よび１mM ＡＴＰを含む溶液３０μlに溶かし、これに
上記の合成ＤＮＡリン酸化反応液１μlを加えた。この
混合液にＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３単位を加
え、４℃、１８時間結合反応を行った。該反応液を用い
て大腸菌Ｋ２９４株を形質転換し、ＡｐRのコロニーを
得、このコロニーよりプラスミドＤＮＡを回収し、第３
図に示したｐＵＰＡ１を得た。ｐＵＰＡ１の構造は、Ｅ
ｃｏＲＩ，ＢａｎIII，ＨｉｎｄIII，ＢａｎII，Ｈｐａ
Ｉ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII，ＰｓｔＩ，ＸｈｏＩで切断
して、アガロースゲル電気泳動にて確認した。
実施例６ ｐＵＰＡ１を含む大腸菌によるウナギ成長ホ
ルモン（ＧＨ−Ｉ）ペプチドの生産 実施例５で得た組換え体プラスミドｐＵＰＡ１を用い常
法により大腸菌Ｃ６００株を形質転換した。得られたＡ
ｐRコロニーを１０mlのＭＣＧ培地〔0.6％ Na2HPO4,
0.3％ KH2PO4, 0.5％ NaCl, 0.1％ NH4Cl, 0.5％グ
ルコース，0.5％ カザミノ酸，1mM MgSO4, 4μg/mlビ
タミンＢ1，pH7.2〕に接種し、３０℃で７時間培養し
た。得られた培養液を５０mlのＭＣＧ培地に接種し、３
０℃で１８時間培養した。得られた培養液を１のＭＣ
Ｇ培地に接種し、３０℃で５時間培養後、４２℃で２時
間培養し、さらに３７℃で４１時間培養した。得られた
培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を回収
した。この菌体をレムリ(Laemmli)のサンプルバッファ
ーに懸濁後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、ウェスタンブロッティング〔トービン(Towbin)
ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci), US
A, 76, 4350(1979)〕後、ペルオキシダーゼ染色法〔田
部一史：細胞工学，２，1061(1983)〕により、分子量約
２6.０００の部位にポリペプチドバンドを検出した。こ
のバンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合
には存在しなかった。この結果、ｐＵＰＡ１を保有する
大腸菌はウナギ成長ホルモンポリペプチドを大量に生産
していることがわかった。
ｐＵＰＡ１を含む大腸菌は、Escherichia coliＥＵＰＡ
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２５）として、微工研に昭和６
０年７月２日付で寄託してある。
実施例７ 実施例６に従ってウナギ成長ホルモン生産菌
を培養後、8.０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、
３０mM ＮａＣｌおよび３０mMトリス−ＨＣｌを含む緩
衝液（ｐＨ7.5）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液５m
lに懸濁し、０℃で超音波破砕〔ブランソン・ソニック
・パワー・カンパニィ(Branson Sonic Power Company)
社、ソニファイアー・セル・ディスラプター(Sonifier
cell disruptor)200，アウトプットコントロール(out-p
ut control)２，10分間処理〕した。これを15,000ｒｐ
ｍ、３０分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残渣か
らマーストンらの方法〔エフ・エー・オー・マーストン
(F.A.O. Marston)ら：バイオテクノロジイ(Biotechnolo
gy) 2, 800(1984)〕によりウナギ成長ホルモンポリペプ
チドを抽出、精製、可溶化、再生を行い、以下の方法で
ウナギ成長ホルモンポリペプチドの成長促進活性を測定
した。
魚類成長ホルモン活性の測定 ニジマスの稚魚（平均体重１３ｇ）を一群１５尾ずつに
分け、水温１５℃の循環式タンクで飼育した。餌は配合
原料（ます４Ｃ、日本配合飼料社製）をはじめの９日間
は１日に体重の４％、その後は３％を２回に分けて与え
た。ウナギ成長ホルモンポリペプチドを少量の0.０１Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液で溶解後、0.9％塩化ナトリウ
ム水溶液を加えて１μg／５μlとなるようにした。これ
を体重１ｇあたり１μg腹腔内に注射した。対照群には
0.9％塩化ナトリウム水溶液のみを投与した。注射は５
日ごとに５回行い同時に体重を測定した。この結果、本
発明の成長ホルモンがニジマスの成長を促進することが
明らかになった。
実施例８ ウナギ成長ホルモン（ＧＨ−II）をコードす
る組換え体プラスミドｐＵＰＪ２４の造成 ＧＨ−IIをコードする組換え体プラスミドを以下のよう
に造成した。
実施例５で得られたウナギ成長ホルモン（ＧＨ−Ｉ）を
コードする組換え体プラスミドｐＵＰＡ１ ２μgを３
０μlのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｎII
（東洋紡績社製）６単位で３７℃、２時間消化反応を行
った。該反応液に、終濃度0.5ｍＭになるようにｄＡＴ
ＰおよびｄＴＴＰを加え、続いて大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（宝酒造社製）４単位を加え、１６℃、３０分間
反応を行った。この反応によりＢａｎII消化によって生
じた末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアー
ゼ活性によってさらに１塩基削られた平滑末端に変わ
り、ＧＨ−Ｉの４番目のＩｌｅ残基をコードするコドン
が露出する。フェノールおよびクロロホルム抽出とエタ
ノール沈殿の後、ＤＮＡ断片をＹ−１００緩衝液３０μ
lに溶解し、制限酵素ＰｓｔＩ６単位で３７℃、２時間
消化反応を行った。該反応液から、ＬＧＴ法により、成
熟ウナギ成長ホルモン翻訳領域、3′−非翻訳領域、大
腸菌リポプロテインターミネーターを含む約2.5Ｋｂの
断片約0.5μgを得た。
一方、ＰLプロモーターおよびリボソーム結合部位の下
流に翻訳開始信号ＡＴＧおよびＳｐｈＩ切断部位を有す
るプラスミドベクターｐＰＡＣ１（ｐＰＡＣ１の造成に
ついては参考例１を参照）２μgを３０μlのＹ−１００
緩衝液に溶かし、制限酵素ＳｐｈＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）６単位を加え、３７℃、２時間消化反応
を行った。該反応液に終濃度0.5ｍＭになるようにｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ加え、
続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・Klenow断片（宝酒
造社製）４単位を加えて１６℃、９０分間反応を行っ
た。この反応により、ＳｐｈＩ消化によって生じた3′
−突出末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩ・Klenow断片の持
つ3′→5′エキソヌクレアーゼ活性および5′−3′修復
合成活性により、削られて平滑末端に変わり、翻訳開始
信号ＡＴＧが末端に露出する。６５℃、２０分間の熱処
理によって、ＤＮＡポリメラーゼＩ・Klenow断片を失活
させた後、制限酵素ＰｓｔＩ６単位を加え、３７℃、２
時間消化反応を行った。該反応液から、ＬＧＴ法によ
り、ｃＩ８５７遺伝子、ＰLプロモーター、翻訳開始信
号ＡＴＧを含む約2.2Ｋｂの断片約0.5μgを得た。
このようにして得たこれらのＤＮＡ断片それぞれ0.2μg
ずつを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH7.5)、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、１０mMＤＴＴおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶
液３０μlに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）３０単位を加え、４℃、１６時間結合反応を行っ
た。該反応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換し、Ａ
ｐRのコロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤＮ
Ａを回収し、第４図に示したｐＵＰＪ２４を得た。ｐＵ
ＰＪ２４の構造は、制限酵素ＰｓｔＩ、ＢａｎIII、Ｎ
ｓｉＩ、ＢｇｌII、ＢａｍＨＩで切断して、アガロース
ゲル電気泳動にて確認した。また、ｐＵＰＪ24が翻訳開
始信号ＡＴＧの後にＧＨ−Ｉの４番目のアミノ酸残基以
降、すなわちＧＨ−IIをコードしていることは、Ｍ１３
ファージを用いたサンガー(Sanger)法、〔サンガー(San
ger)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i.), USA, 74, 5463(1977)；アマーシャム(Amersham)社
Ｍ１３クローニング・アンド・シークエンシング・ハン
ドブック(Cloning and sequencing handbook)〕によっ
て確認した。
実施例９ ｐＵＰＪ２４を含む大腸菌によるウナギ成長
ホルモン（ＧＨ−II）ペプチドの生産 実施例８で得た組換え体プラスミドｐＵＰＪ２４を用い
常法により大腸菌Ｋ２９４株を形質転換した。得られた
ＡＰRコロニーを５mlのＭＣＧ培地に接種し、３０℃で
１６時間培養した。得られた培養液のうち１００μlを
５mlのＭＣＧ培地に接種し、３０℃で２時間培養後、４
２℃で２時間培養した。得られた培養液を８０００rp
m，１０分間遠心して菌体を回収した。この菌体をレム
リ(Laemmli)のサンプルバッファーに懸濁後、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマジーブリ
リアントブルーにて染色して、分子量約25,000の部位に
ポリペプチドバンドを検出した。このバンドは該プラス
ミドを含まない大腸菌を用いた場合には存在しなかっ
た。また同様に、回収した菌体をレムリ(Laemmli)のサ
ンプルバッファーに懸濁後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、ウェスタンブロッティング〔ト
ービン(Towbin)ら；プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. A
cad. Sci.), USA 76, 4350(1979)〕後、ペルオキシダー
ゼ染色法〔田部一史：細胞工学，2 , 1061(1983)〕によ
り、やはり分子量約25,000の部位にポリペプチドバンド
を検出した。このバンドは該プラスミドを含まない大腸
菌を用いた場合には存在しなかった。この結果、ｐＵＰ
Ｊ２４を保有する大腸菌はウナギ成長ホルモンポリペプ
チドを大量に生産していることがわかった。
参考例１ ＰLプロモーターおよびリボソーム結合部位
の下流に翻訳開始信号ＡＴＧおよびＳｐｈＩ切断部位を
有するプラスミドベクタ−ｐＰＡＣ１の造成： 本発明に述べるウナギ成長ホモルン（ＧＨ−II）をコー
ドする組換え体プラスミドを造成するためにｐＰＡＣ１
を造成した。
ｔｒｐプロモーターおよびリボソーム結合部位の下流に
翻訳開始信号ＡＴＧおよびＳｐｈＩ切断部位を有するプ
ラスミドベクターｐＴｒＳ３（特開昭５９−６７２９
７）２μgを３０μlのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限
酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）４単位および制限酵素
ＰｓｔＩ４単位を加え、３７℃、２時間消化反応を行っ
た。該反応液からＬＧＴ法により翻訳開始信号ＡＴＧお
よびＳｐｈＩ切断部位を含む約2.9ＫｂのＤＮＡ断片約
１μgを得た。
一方、ｐＧＬＭ１ ２μgを３０μlのＹ−100緩衝液に
溶かし、制限酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）４単位お
よび制限酵素ＰｓｔＩ４単位を加え、３７℃、２時間消
化反応を行った。該反応液からＬＧＴ法によりＰLプロ
モーターおよびｃＩ８５７遺伝子を含む約4.0ＫｂのＤ
ＮＡ断片約１μgを得た。これらのＤＮＡ断片それぞれ
0.1μgずつを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ
ＡＴＰを含む溶液３０μlに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社製）30単位を加え、４℃、１６時間結合反
応を行った。該反応液を用いて大腸菌Ｋ２９４株を形質
転換し、ＡｐRのコロニーを得、このコロニーよりプラ
スミドＤＮＡを回収し、第５図に示したｐＰＡＣ１を得
た。ｐＰＡＣ１の構造はＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＢａｎII
I、ＳａｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動にて
確認した。
発明の効果 本発明によれば、ウナギの成長ホルモンポリペプチドを
コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらはウナギの成
長ホルモンポリペプチドの大量生産に利用することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
第１図(1)および(2)はオカヤマ・バーグ法によるｃＤＮ
Ａ合成とＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過程の
概略を示す。 第２図はｐＥＧＨ１５に含まれるウナギ成長ホルモンを
コードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第３図は組換え体プラスミドｐＵＰＡ１の造成過程を示
す。 第４図は組換え体プラスミドｐＵＰＪ２４の造成過程を
示す。 第５図は組換え体プラスミドｐＰＡＣ１の造成過程を示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＦＣ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 13/00 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のペプチド配列を有する条鰭類無足目
    に属する魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
    ＤＮＡを含むＤＮＡ。 ValGluProIleSerLeuTyrAsnLeuPheThrSerAlaValAsnArgAl
    aGlnHisLeu HisThrLeuAlaAlaGluIleTyrLysGluPheGluArgSerIleProPr
    oGluAlaHis ArgGlnLeuSerLysThrSerProLeuAlaGlyCysTyrSerAspSerIl
    eProThrPro ThrGlyLysAspGluThrGlnGluLysSerAspGlyTyrLeuLeuArgIl
    eSerSerAla LeuIleGlnSerTrpValTyrProLeuLysThrLeuSerAspAlaPheSe
    rAsnSerLeu MetPheGlyThrSerAspGlyIlePheAspLysLeuGluAspLeuAsnLy
    sGlyIleAsn GluLeuMetLysValValGlyAspGlyGlyIleTyrIleGluAspValAr
    gAsnLeuArg TyrGluAsnPheAspValHisLeuArgAsnAspAlaGlyLeuMetLysAs
    nTyrGlyLeu LeuAlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuLysVa
    lThrLysCys ArgArgPheValGluSerAsnCysThrLeu 【請求孔２】下記式（１）のペプチド配列または下記式
    （２）のペプチド配列を有する条鰭類無足目に属する魚
    類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤＮＡを組
    み込んだ組換え体ＤＮＡ。 式（１） ValGluProIleSerLeuTyrAsnLeuPheThrSerAlaValAsnArgAl
    aGlnHisLeu HisThrLeuAlaAlaGluIleTyrLysGluPheGluArgSerIleProPr
    oGluAlaHis ArgGlnLeuSerLysThrSerProLeuAlaGlyCysTyrSerAspSerIl
    eProThrPro ThrGlyLysAspGluThrGlnGluLysSerAspGlyTyrLeuLeuArgIl
    eSerSerAla LeuIleGlnSerTrpValTyrProLeuLysThrLeuSerAspAlaPheSe
    rAsnSerLeu MetPheGlyThrSerAspGlyIlePheAspLysLeuGluAspLeuAsnLy
    sGlyIleAsn GluLeuMetLysValValGlyAspGlyGlyIleTyrIleGluAspValAr
    gAsnLeuArg TyrGluAsnPheAspValHisLeuArgAsnAspAlaGlyLeuMetLysAs
    nTyrGlyLeu LeuAlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuLysVa
    lThrLysCys ArgArgPheValGluSerAsnCysThrLeu 式（２） MetAlaSerGlyPheLeuLeuTrpProValLeuLeuValSerPheSerVa
    lAsnAla ValGluProIleSerLeuTyrAsnLeuPheThrSerAlaValAsnArgAl
    aGlnHisLeu HisThrLeuAlaAlaGluIleTyrLysGluPheGluArgSerIleProPr
    oGluAlaHis ArgGlnLeuSerLysThrSerProLeuAlaGlyCysTyrSerAspSerIl
    eProThrPro ThrGlyLysAspGluThrGlnGluLysSerAspGlyTyrLeuLeuArgIl
    eSerSerAla LeuIleGlnSerTrpValTyrProLeuLysThrLeuSerAspAlaPheSe
    rAsnSerLeu MetPheGlyThrSerAspGlyIlePheAspLysLeuGluAspLeuAsnLy
    sGlyIleAsn GluLeuMetLysValValGlyAspGlyGlyIleTyrIleGluAspValAr
    gAsnLeuArg TyrGluAsnPheAspValHisLeuArgAsnAspAlaGlyLeuMetLysAs
    nTyrGlyLeu LeuAlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuLysVa
    lThrLysCys ArgArgPheValGluSerAsnCysThrLeu 【請求孔３】プラスミドｐＥＧＨ１５と名づけた特許請
    求の範囲第２項の組換え体ＤＮＡ。 【請求孔４】下記式（１）のペプチド配列または下記式
    （２）のペプチド配列を有する条鰭類無足目に属する魚
    類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤＮＡを組
    み込んだ組換え体ＤＮＡを含むエッシェリヒア・コリ。 式（１） ValGluProIleSerLeuTyrAsnLeuPheThrSerAlaValAsnArgAl
    aGlnHisLeu HisThrLeuAlaAlaGluIleTyrLysGluPheGluArgSerIleProPr
    oGluAlaHis ArgGlnLeuSerLysThrSerProLeuAlaGlyCysTyrSerAspSerIl
    eProThrPro ThrGlyLysAspGluThrGlnGluLysSerAspGlyTyrLeuLeuArgIl
    eSerSerAla LeuIleGlnSerTrpValTyrProLeuLysThrLeuSerAspAlaPheSe
    rAsnSerLeu MetPheGlyThrSerAspGlyIlePheAspLysLeuGluAspLeuAsnLy
    sGlyIleAsn GluLeuMetLysValValGlyAspGlyGlyIleTyrIleGluAspValAr
    gAsnLeuArg TyrGluAsnPheAspValHisLeuArgAsnAspAlaGlyLeuMetLysAs
    nTyrGlyLeu LeuAlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuLysVa
    lThrLysCys ArgArgPheValGluSerAsnCysThrLeu 式（２） MetAlaSerGlyPheLeuLeuTrpProValLeuLeuValSerPheSerVa
    lAsnAla ValGluProIleSerLeuTyrAsnLeuPheThrSerAlaValAsnArgAl
    aGlnHisLeu HisThrLeuAlaAlaGluIleTyrLysGluPheGluArgSerIleProPr
    oGluAlaHis ArgGlnLeuSerLysThrSerProLeuAlaGlyCysTyrSerAspSerIl
    eProThrPro ThrGlyLysAspGluThrGlnGluLysSerAspGlyTyrLeuLeuArgIl
    eSerSerAla LeuIleGlnSerTrpValTyrProLeuLysThrLeuSerAspAlaPheSe
    rAsnSerLeu MetPheGlyThrSerAspGlyIlePheAspLysLeuGluAspLeuAsnLy
    sGlyIleAsn GluLeuMetLysValValGlyAspGlyGlyIleTyrIleGluAspValAr
    gAsnLeuArg TyrGluAsnPheAspValHisLeuArgAsnAspAlaGlyLeuMetLysAs
    nTyrGlyLeu LeuAlaCysPheLysLysAspMetHisLysValGluThrTyrLeuLysVa
    lThrLysCys ArgArgPheValGluSerAsnCysThrLeu
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