JPH01104193A - 新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、細胞増殖促進作用を有する新規生理活性ポリ
ペプチドを提供する。本発明物質は、免疫賦活剤、抗癌
剤としての用途が期待される。

従来技術 従来細胞増殖促進作用を有する物質としては、下記のご
とき例が知られている。

（１）　　ＰＤＧＦ　（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖ
ｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）プロシイディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　ＵＳＡ、　７６、１８０９
　（１９７９）（２）　　ＴＧＦ　　（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　　ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストシイ（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、’　Ｃｈｅｍ、）　　２５７．５２２０　（１
９８２）（３）　　ＥＧＦ　（６ｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇ
ｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）アナリティカル・バイオケ
ミストシイ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）皿１９５
　（１９８１） （４）　　ＦＧＦ　（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗ
ｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　アニュアル・レビュ・バイオケ
ミストシイ　（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　４５．５３１　（１９７６）（５
）　　Ｆ　Ｓ　ＬＡ　（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｓｏｍ
ａｔｏｍｅｄｉｎ　１ｉｋｅａｃｔｉｖ＋ｔｙ）　ジャ
ーナル・オブ・セルラー・フィジオロジイ（Ｊ、Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）旦互（６）　　　
Ｉ　Ｇ　Ｆ　−Ｉ　　（Ｉｎｓｕｌｉｎ　　１ｉｋｅ　
　ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ）ジャーナル・オブ・
エンドクリノロシイ　（Ｊ。

εｎｄｏｃｒ、）　８５．’２６７　（１９８０）（７
）　　Ｉ　ＧＦ　−Ｕ　（Ｉｎｓｕｌｉｎ　１ｉｋｅ　
ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）デイ７ヘーツ（Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ）　３１．２８２３　（１９８２）（８）　　
ＭＳＡ　（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）ネイチ＋　−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２７２．７７６　（１９７８）これらのう
ちＮｏ、　１〜４，６および７の物質については一次構
造が明らかにされているが、本発明物質とはＮ末端構造
において明らかに異なる。他の物質については、培地成
分との分離が困難で物質の同定がなされて“おらず実用
的価値を有さない。

特開昭５９−１８１２９３には、骨髄性白血病細胞に５
６２−７１株が生産するＤＮＡ合成促進活性蛋白性物質
の開示があるが、分子量その他の性質から本発明物質と
は異なることが明らかである。

発明が解決しようとする問題点 に５６２−ＴＩ株は上記ＤＮＡ合成促進活性蛋白性物質
とは別に、動物細胞に対して細胞増殖促進作用を有する
蛋白性物質を生産する。この細胞増殖促進作用物質は有
用な免疫賦活剤、抗癌剤としての用途が期待される。し
かし、ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２−７１株を無蛋
白培地で培養し、培養上清中から細胞増殖促進物質を分
離・精製する製法では供給量が限られている。従って、
該細胞増殖促進作用を有する蛋白性物質を安価に大量に
供給する方法の開発が望まれている。

問題を解決するための手段 本発明者は、組換えＤＮＡ技法によりヒト骨髄性白血病
細胞株に５６２−ＴＩ株の産生ずる生理活性（細胞増殖
促進活性）ポリペプチドを製造する方法について研究を
行った。その結果、該生理活性ポリペプチド製造に使用
することのできる、該生理活性ポリペプチドに相補的な
りＮＡの採取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡ、微生
物および動物細胞の製造に成功した。即ちヒト骨髄性白
血病細胞株に５６２−７１株からメツセンジャーＲＮＡ
　（ｍＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なりＮＡ’（Ｃ
ＤＮＡ）を合成した。

他方、ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２−７１株の無蛋
白培養上清から該生理活性ポリペプチドを分離・精製し
、Ｎ末端側ポリペプチドの配列を３０アミノ酸まで決定
した。そこで、このアミノ酸配列に対応するＤＮＡプロ
ーブを合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮ
Ａを選択した。

次いで、該ｃＤＮＡをベクターに組み込み動物細胞で発
現させて該生理活性を示すｃＤＮＡを選んだ。

かくして、ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２−ＴＩ株の
産生ずる新規生理活性ポリペプチド遺伝子を含むｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａを得た。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決
定した。

次いで本発明者は、第２表、第３表および第６表に示さ
れた該生理活性ポリペプチドｃＤＮＡを改変し、これを
導入した大腸菌または動物細胞を培養することにより、
該生理活性ポリペプチドが製造できることを見出し、本
発明を完成するに至った。

本発明物質と類似する物質として修生胸腺より分画採取
したユビキチンがあげられる。本発明物質のうち第２表
および第３表で示される物質はＮ末端より３０番目まで
のアミノ酸配列がユビキチンとほぼ同じ配列を示す。ま
た第６表で示される物質はユビキチンモノマーが３個直
列に結合し、Ｃ末端にシスティン（Ｃｙｓ）が付加した
構造を有している。ユビキチンはナマルバ細胞に対して
増殖促進作用を示さないことから、本発明物質はユビキ
チンと異なる物質であることが明らかである。ユビキチ
ンにヒストン蛋白の付いた物質、ユビキチンの分子が連
なった前駆体などが知られている〔ネイチ＋　−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２２５．　４２３　（１９７５）　；ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ　Ｂ
Ｃ）　２５０．７１８２　（１９７５）　；ネイチャー
　（Ｎａｔｕｒｅ）３１２、６６３　（１９８４）　）
。これらの物質の生物活性は明らかにされていない。

最近、ヒトユビキチン前駆体遺伝子のクローン化が報告
されている〔ピー・ケー・ルンド（Ｐ、　Ｋ。

Ｌｕｎｄ）　　ら：ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２
６０．７６０９（１９８５）　；オー・ウィボルグ（０
，Ｗｉｂｏｒｇ）ら；ヂ・エンボ・ジャーナル（εＭＢ
ＯＪ、）　　４．７５５　（１９８５）　）。

ルンドらによりクローン化されたヒトユビキチン前駆体
はユビキチンモノマーが９個直列に結合した構造を有し
ており、本発明物質とは明らかに異なる。ウィボルグら
によりクローン化されたヒトユビキチン前駆体は、本発
明物質と比較するとＮ末端４アミノ酸に対する塩基配列
が欠失しており、それらに対応するアミノ酸をコードす
る塩基配列を含むものは採れていないことから本発明物
質とは明らかに異なる。

発明の詳細な説明 本発明は、第２表、第３表または第６表に示したペプチ
ド配列を有するポリペプチドを提供する。

該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて下記のご
とく製造することができる。

Ｋ５６２−Ｔ１株が生産する生理活性ポリペプチドのｍ
ＲＮＡを鋳型として用いて該ｍＲＮＡに相補性を示すＤ
ＮＡ　（’ｃＤＮＡ）を調製し、該ＣＤＮＡをベクター
プラスミドに組み込んだ組換え体プラスミドを調製する
。さらに、該組換え体プラスミドを宿主微生物または宿
主動物細胞に挿入する。該ＤＮＡおよび組換え体プラス
ミドは、とくにエッシェリヒア・コリのような細菌中で
該生理活性ポリペプチド遺伝子の増幅に使用することが
できる。

該生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込む
プラスミドとしては、大腸菌または動物細胞で該ＤＮＡ
が発現できるものならいかなるプラスミドも使う゛こと
ができる。該組換え体プラスミドを有する微生物は該生
理活性ポリペプチドを安価に大量に製造するために有用
である。

従って、本発明によれば、Ｋ５６２−Ｔ１株の産生ずる
生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微
生物または動物細胞、およびこれらの製造法がさらに提
供される。

本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。

Ｋ５６２−Ｔ１株より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセルｏ　−ｘ　（ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕｌ
ｏｓｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリ
Ａ）を有するＲＮＡ　（ポ！Ｊ　　（Ａ）ＲＮＡ）を分
離する。

このポ！Ｊ　（Ａ）ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素によ
り二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ
組換え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのような
ベクターＤＮＡに該二重鎮ＤＮＡを挿入して得られる。

該生理活性ポリペプチドｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ
を有する組換え体プラスミドを選択する。

次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。

Ｋ５６２−ＴＩ細胞懸濁液から遠心分離により細胞を集
め、チオシアン酸グアニジンを含む溶液に可溶化する。

次いでＣ５Ｃｊｉ！溶液層に重層し、超遠心分離後、沈
殿物として全細胞質ＲＮＡを得る。またチオシアン酸グ
アニジン可溶化物にＬｉＣｊ！を加えてＲＮ　Ａのみを
沈澱回収することもできる。

沈殿したＲＮＡをＮａＣｊ！またはＫＣｌ１の高塩濃度
（たとえば０．５Ｍ＞溶液に溶解し、オリゴ（ｄ　Ｔ）
セルロースのカラムに通塔してポリ　（Ａ）を有するｍ
ＲＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し
、ポ！Ｊ　（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。

以下、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法［：Ｏｋａｙａ
ｍａ　＆　Ｂｅｒｇ　；Ｊ、　！、ｌｏｌ、　Ｃｅ１ｌ
、　Ｂｉｏｌ、２．１６１　（１９８２）　〕に従い、
ｃＤＮＡの合成および、そのベクターへの組み込みを行
う。

まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐｃＤＶｌを適当な溶液、たとえばＴｒｉｓ−
ＨＣｊ！緩衝液（たとえばｐＨ７，５゜１０　ｍＭ）　
、　Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　２（たとえば６　ｍＭ）　、　　
Ｎ　ａ　ＣＡ’（たとえば１０ｍＭ）を含む溶液中でＫ
ｐｎＩで処理し、ｐｃＤＶｌのＫｐｎＩ部位を切断する
。

このＤＮＡを”［’　ｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！緩衝液（た
とえばｐＨ６，８，３０ｍＭ）、　カコジル酸ナトリウ
ム（たとえば１４０　ｍＭ）　、　Ｃｏ　Ｃ１２（たと
えば１ｍＭ）　、ジチオスレイトール（たとえば０．１
ｍＭ＞およびｄＴＴＰ　（たとえば０．２５ｍＭ）中、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
とともに一定温度（たとえば３７℃）で一定時間（たと
えば２０分間）インキュベートし、ベクターＤＮＡの両
３′末端に６０個前後のチミジル残基を付加する。さら
にこのＤＮＡをＴｒｉｓ−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ
７，５，１０ｍＭ＞、Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　２　（たとえば
６ｍＭ）、ＮａＣｊ！　（たとえば１００ｍＭ）を含む
溶液中ＥＣ０ＲＩで切断後、低融点アガロースゲル電気
泳動［Ｌａｒｓ　Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ：Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　９８．３０
５　（１９７９）。

以下ＬＧＴ法という〕にて分画し、約３．１キロベース
の断片を回収する。次いで該ＤＮＡをＮａＣ１またはＫ
Ｃｌの高塩濃度（たとえば０．５Ｍ）溶液に溶解し、ポ
リ　（ｄＡ）セルロースカラムに通塔してポリ　（Ｔ）
を有するベクタープライマー分子のみをカラムに吸着さ
せる。水、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＡ緩衡液の
ような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ　（Ｔ）の付
加したベクターブライマー分子のみを単離する。

次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（たと
えばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣ１＊（たとえば６
ｍＭ）、ＮａＣｊｉ！　（たとえば５０ｍＭ）を含む溶
液中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬｌのＰＳｔ■部位を切断
する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加
える以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処理
し、１５個前後のオリゴｄＧ鎮を付加する。該ＤＮＡを
適当な溶液たとえば’ｌ’　ｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！緩衝
液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣ１ｚ＜た
とえば６ｍＭ）。

ＮａＣｌ１　（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄｌＩＩにて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約
０．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペー
パーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得
る。

以上のようにして得たポ！Ｊ　　（Ａ）ＲＮＡ、ベクタ
ープライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を
行う。ポリ　（Ａ）ＲＮＡ、ベクタープライ？−ＤＮＡ
をＴｒｉｓ−ＨＣｊ！緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５
０ｍＭ）　、　Ｍｇ　ＣＡｘ　　（たとえば８ｍＭ）、
ＫＣｌ（たとえば３０ｍＭ）、、　　ジチオスレイトー
ル（たとえば０．３ｍ）、ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ　（たとえば各々２ｍＭ
）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴＴＰ
がｄＣ：ＴＰに変わる以外はベクターブライマーにｄＴ
鎮を付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５個
前後付加する。

このＤＮＡを７ｒｉｓ−ＨＣＡ’緩衝液（たとえばｐＨ
７，５，１０ｍＭ）１ＭｇＣｊ！２（たとえば５ｍＭ）
。

ＮａＣＡ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎｄｌ
ｌＩで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−
ＤＮＡを混合し、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ［［（りとえばｐＨ
７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣＬ（たとえば４ｍＭ＞　、
　（ＮＨ４）２Ｓ０４　（たとえば１０ｍＭ）、ＫＣｊ
！　（たとえば０．１Ｍ）、　β−ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たとえば０．１ｍ
Ｍ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに一定
時間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２℃
）でインキユベートする。こうしてｃＤＮＡとリンカ−
ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう
加え、大腸菌ＤＮＡ’Ｊガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ１、大腸菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを加
え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完全な
二重鎖ＣＤＮＡを含む組換えプラスミドを得る。

こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、例えば大
腸菌Ｃ６００ＳＦ３株（Ｃａｍｅｒｏｎ　ら：Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　ＵＳ
Ａ　　７２．　３４１６　　（１９７５）　　）を、た
とえば５ｃｏｔｔらの方法〔重定勝哉：細胞工学　２．
６１６　（１９８３）　）により形質転換する。

上記で得た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性
遺伝子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。

一方、該生理活性ポリペプチドは、参考例１に記載され
た方法で製造し、アミノ酸配列を決定することができる
。本発明に用いるヒト骨髄性白血病細胞は、本発明物質
を生産することができるものなら、いかなる細胞も用い
ることができる。好適な一例として、骨髄性白血病細胞
に５．６２−７１株を用いることができる。

Ｋ２Ｏ２−Ｔ１株は、Ｋ５６２株（Ａ　Ｔ　ＣＣＣＣＬ
２４３）を胎児子牛血清１０％を含有するハムＦＩＯ培
地から順次血清濃度を低下させ、約１年間の馴化期間を
経た後、得られた無蛋白培地馴化細胞である。Ｋ５６２
株は、プロシイディング・オプ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、　５ｃ−ｉ、）、　ＵＳＡ、亘。

１２９３　（１９７９）　、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、
並、　３２１　（１９７５）。

カフ　（ＧＡＮＮ）、　　７３．９７　（１９８２）な
どに記載されている公知の細胞株で一般的に人手可能な
細胞株である。

培°地としては、ノ１ムＦＩＯ培地、ノームＦ１２培地
（以上フローラボ社！り、ダルベツコＭＥＭ培地、ＭＥ
Ｍ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（以上日永製薬社製）
などの無蛋白培地およびそれらの混合培地が用いられる
。培地には、必要により、グルタミン０．５〜５ｍＭ、
抗生物質〔ベニシリ・ン（２５Ｕ／ｆｆ１ｌ）　、スト
レプトマイシン（２５ｇ／ｍｌ）など〕１重曹（０，’
０１％）などを適量加えてもよい。

培養には、種々の培養ビン、シャーレ、ローラボトル、
スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを用い
ることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１０’　
〜ｌＸｌ０’細胞／ｍｌとし、３０〜４０℃、２〜４日
間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培養液
中に生成する。たとえば、ｌＸｌ０’細胞／ｍｌの種細
胞密度、３７ｔ、　　２日間の培養では、培養液中に３
００単位／ｍ１の活性物質が生成する。

培養物からの生理活性ポリペプチドの採取は次のとおり
行う。すなわち、得られた培養液上清を、凍結乾燥、限
外濾過２強酸性イオン交換樹脂などを用いて濃縮する。

溶出には、弱塩基性の緩衝液または低濃度のアルカリ溶
液を用いる。

濃縮液中には、低分子の塩や不純物が多く含まれるので
、１％酢酸で透析する。これによって多くの不純蛋白が
沈澱として除かれる。凍結乾燥によって酢酸を除き、さ
らに濃縮し、粗精製物とする。粗精製物を陽イオン交換
樹脂に通塔する。活性物質は陽イオン交換樹脂に弱い相
互作用を有するのみで吸着せず溶離してくる。この活性
画分を集め、凍結乾燥などで濃縮後、さらにゲル濾過法
により、培地由来の低分子物質を除く。ゲル濾過剤とし
ては、セファデックス類（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル社製）、バイオゲル類（バイオラッド社製）、コ
ントロール・ボア・グラス（コーニング・グラス・ワー
クス社製）、）ヨパール（東洋曹達社！！りなどを用い
る。

Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ　−６０などを用いると、活性画分は
ボイドボリウム（Ｖｏ）と塩などの低分子物質との間に
位置する。

上記操作で得られる濃縮物は、さらに高速液体クロマト
グラフィーを行うことによって単一成分として精製する
ことができる。

かくして得られる生理活性ポリペプチドのアミノ酸配列
は、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製４７０＾型シーケ
ンサ−およびスペクトラ・フィジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｐｈｙｓｉｃｓ）社製高速液体クロマトグラフィーとの
組合せによって決定することができる。Ｎ末端側ポリペ
プチドの配列を３０アミノ酸まで決定したところ、該生
理活性ペプチドのＮ末端より３０番目までのアミノ酸配
列はヒトユビキチンとほぼ同じ配列を有することが示さ
れた。

アンピシリン耐性（Ａｐ’）菌株から該生理活性ポリペ
プチドｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を持つ新規組換え
体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を選択するのには一
般的に用いられている以下の手法を用いることができる
。すなわち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロ
ースフィルター上に固定し、既知のに５６２−Ｔｌ産生
生理活性蛋白質およびヒトユビキチンのアミノ酸配列よ
り予想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプロ　　　
　　−ブと会合させ、強く会合するものを選択するＣＧ
ｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法：Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、、　７２．３９６１　（１９７５
）　）。プローブＤＮＡは通常のトリエステル法［：Ｊ
、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、。

９７、７３２７　（１９７５）　）　９１ｉルル。合成
り　Ｎ　Ａ　ｉ：よる選択は５ｏｕｔｈｅｒｎ　らの方
法（Ｊ、　！Ｊｏｔ、　Ｂｉｏｌ。

９８、５０３　（１９７５））によってさらに確実にで
きる。

該生理活性ポリペプチドｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子
を有する組換え体プラスミドＤＮＡの同定は、動物細胞
例えばＣＯ３−１細胞ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０（フイ・
グ）Ｉｔ’７７ン（Ｙ、　Ｇｌｕｚｍａｎ）：　セル（
Ｃｅｌｌ）　２３．１７５　（１９８１）：ｌに、例え
ばＤＥＡＥ−デキストラン法〔エル・エム・ツムバイラ
ツク（Ｌ、　Ｍ、　Ｓｏ＋ｎｐａｙｒａｃ）ら：Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、、７８．７５７５　（１９８１）
　）によりプラスミドを導入し発現させ、細胞をテフロ
ンホモゲナイザーで破砕し、細胞抽出液をリン酸緩衝液
で透析した後、細胞増殖促進活性を測定することにより
行う。細胞増殖促進活性はヒトＢリンパ球系細胞、例え
ばヒトリンパ芽球細胞ナマルバ株（ＡＴＣＣＣＲＬ１４
３２）を用い、下記方法で測定することができる。

たとえば被検細胞株５〜ｌ０ＸＩＯ５細胞／ｍｌをＲＰ
ＭＩ−１６４０培地（日永製薬社製）にグルタミン（４
ｍＭ）”、ストレプトマイシン（２５Ａｇ／ｍｌ）　、
ペニシリン（’２５　Ｕ／ｍｌ）　、　ヘペス（１０ｍ
Ｍ）、重曹（０，０１％）および修生血清（１０％）を
加えた培地７５ｍ１で３７℃で４８特開培養する。培養
物を８００ｘｇ、５分間遠心して細胞を集め、上記の培
地から血清を除いた培地で３洗浄し、２４穴マルチデイ
ツシユプレートに分注し、Ｑ、９ｍｌの血清を含まない
培地と、Ｑ、１ｍｌの試料液を添加する。３７℃、ＣＯ
２インキュベーターで３日間培養後、細胞数を血球計算
板を用いて測定する。

該生理活性ポリペプチドの発現は、該生理活性ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ断片をＤＮＡの発現機能を持つ
適当なプラスミドに組み込むことにより行うことができ
る。

第２表、第３表および第６表に示される該生理活性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、該生理活性ポリ
ペプチドをコードするメツセンジャーＲＮＡから組換え
ＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡ　（該生理活
性ポリペプチドｃＤＮＡ）または染色体ＤＮＡから得ら
れる該生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡなどが
利用できる。

該生理活性ポリペプチドｃＤＮＡとしては、該生理活性
ポリペプチドをコードしているものであればいかなるも
のも用いることができるが、具体的にはｐＬＧＡ８．ｐ
ＬＧＢ１２およびｐＬＧＣ１５を用いることができる。

ｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２およびｐＬＧＣ１５は本発明
者らにより製造されたものであり、その製造法は実施例
に記載されている。ｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２およびｐ
ＬＧＣ１５中の該生理活性ポリペプチドＤＮＡは、Ｍ１
３ファージを用いたデイデオキシ・シーフェンス（ｄｉ
ｄｅｏｘｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）法〔ジェイ°メシング
（Ｊ、　！、Ｉｅｓｓｉｎｇ）　　ら：ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）　１９．２６９（１９８５）　）により決定された
第２表、第３表および第６表に示す塩基配列を有してい
る。

該生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込む
プラスミドとしては、大腸菌または動物細胞で該ＤＮＡ
が発現できるものならいかなるプラスミドも用いること
ができる。好ましくは、適当なプロモーター、例えば、
ｔｒｐ系、ｌ１ａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮ
Ａを挿入することができ、しかもシャインーダルガーノ
配列（以下ＳＤ配列と略記する）と開始コドン（ＡＴＧ
）の間を適当な距離、例えば６〜１８塩基対に調製した
プラスミドを用いることができる。具体的に好適なプラ
スミドとしては、本発明者らによって造成されたｐＫＹ
ＰｌＯ，ｐＫＹＰｌｌ、ｐＫＹＰ１２（特開昭５８−１
１０６００）などがあげられる。

該生理活性ポリペプチドｃＤＮＡとしてはｐＬＧＡ８．
　　ｐＬＧＢ１２およびｐｔ、ｃｃ１５を該ｃＤＮＡを
組み込むためのプラスミドとしてはｐＫＹＰｌｏをそれ
ぞれ用い該生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを
組み込んだ組換え体プラスミドを造成する例を以下に述
べる。

第３図に示したようにしてｐＬＧＢ１２をＨｐａ■とＢ
ａｍＨＩで切断しＬＧＴ法にて約４９０塩基対（以下ｂ
ｐと略記する）のＤＮＡ断片を精製する。また、ｐＫＹ
Ｐ　１０をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、ＬＧ
Ｔ法にて約４．４キロベース（以下Ｋｂと略記する）の
ＤＮＡ断片を精製する。このようにして得たＤＮＡ断片
と第３図に示した合成Ｉ）ＮＡ　Ｃ開始コドン（ＡＴＧ
）から９番目のアミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒ）を
コードするトリプレット　（ＡＣＣ）の２番目の塩基（
ＡＣ）までを含む〕をＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼによ
り結合しｐＬＧＢ−ａｌを得る。図中ＵＬ−Ｂは第３表
で示されるＤＮＡ領域である。

次いで、第４図に示したようにｐＬＧＢ−ａｌをＢａｎ
ＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、ＬＧＴ法にて約５３０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を精製する。また、ｐＧＥＬｌ　　（関
根ら：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
。

ＵＳＡ　８２．４３０６　（１９８５）　〕をＢａｎＩ
［［とＢａｍＨＩで切断し、ＬＧＴ法にて約２．７　Ｋ
　ｂのＤＮＡ断片を精製する。

このようにして得たＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
により結合し、ｐＬＧＢ−ｄ２を得る。次いで、第５図
に示したようにｐＬＧＢ−ｄ２をＰｖｕ［とＢａｍＨＩ
で切断した後、約２．８　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製す
る。また、ｐＬＧＡ８をＰｖｕＩＩとＢａｍＨＩで切断
した後、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。このよ
うにして得たＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼにより
結合し、ｐＬＧＡ−ｄ５を得る。さらに、第６図に示し
たようにｐＬＧＡ−ｄ５をＢａｎＩ［ＩとＰｓｔＬで切
断した後、約２．２　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製する。

一方、ｐＫＹＰ　１０をＢａｎｌＩｒとＰｓｔＩで切断
した後、約１．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製する。

このようにして得たＤＮＡ断片をＴ　４　ＤＮＡ　リガ
ーゼにより結合し、ｐＬＧＡ−ｅｌを得る。図中ＵＬ−
Ａは第２表で示されるＤＮＡ領域である。

次いで第７図に示したようにｐＬＧＣ１５をＸｈｏＩで
切断した後、ＬＧＴ法にて約１．３　Ｋ　ｂのＤＮＡ断
片を精製する。また、ｐＵｃ１９（シー舎ヤニッシ：Ｌ
−ペロン（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　）ら：
ジーン（Ｇｅｎｅ　）　３３．１０３　（１９８５））
をＳａｊ！　１で切断した後、ＬＧＴ法にて約２．７　
Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製する。このようにして得たＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐＬＧＣ
：５ａｌｌを得る。さらに第８図に示したように、ｐＬ
ＧＣ：５ｃｌｌをＢｇＩｍで部分分解し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ・クレノー断片（以下クレノー断片という）で
処理した後、ＢａｍＨＩで切断し、ＬＧＴ法にて約９５
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。また、ｐＧＥＬｌをＢ
ａｍＨＩ。

ＨｉｎｄｌｌｌおよびＰｓｔＩで切断し、ＬＧＴ法にて
約１．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製する。別に、ｐＫ
ＹＰｌ　０をＰｓｔＩとＢａｎ［［で切断し、ＬＧＴ法
にて約１．　ｌ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製する。

このようにして得たＤＮＡ断片と第８図に示した合成り
ＮＡ　（開始コドン（ＡＴＧ＞から２番目のアミノ酸で
あるグルタミン（Ｇｉｎ）をコードするトリブレラ）　
（ＣＡＧ）の２番目の塩基（ＣＡ）までを含む〕をＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼにより結合し、ｐＬＧＣ−Ｘｉを得る
。図中ＵＬ−Ｃは第６表で示されるＤＮＡ領域である。

上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０■
のＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ
）のＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ６，０〜９．５好
ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０＞、０〜２００ｍＭのＮ
ａＣＲ，２〜２０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）の
Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２を含む反応液中で、制限酵素０．１〜
１００単位（好ましくはＩＪｔｇのＤＮＡに対して１〜
３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限
酵素により異なる）において、１５分間〜２４時間行う
。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加
熱することによるが、フェノールまたはジエチルピロカ
ーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法
も用いることができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、前記
ＬＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによ
って行う。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，１〜９
．５、好ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０）２〜２０ｍＭ
（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇ　ＣＪ！２．０．１
〜１０　ｍＭ　（好ましくは０．５〜２．０ｍＭ）のＡ
ＴＰ、１〜５０ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のジ
チオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ０．３〜１００単位を用い、１〜３７℃（好ましくは
３〜２０℃）で１５分ＦＩｌｆｆ〜７２時間（好ましく
は２〜２０時間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コー
エン（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）ら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ｘ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）。

ＩＪｓＡ、、　６９．２１１０　（１９７２）　）　ｌ
：よッテ、大腸菌に導入する。

組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはバー
ンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム０１．
Ｃ３Ｂ　１ｒｎｂｏ　ｉｍ　）ら：ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　）ユ、　１５１３　（１９７９）　）などを用いて
行う。

プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で切断後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。

さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要があるときは、
デイデオキシ・シーフェンス法によって決定する。

以上のような条件で組換え体プラスミドＤ　Ｎ　Ａを製
造することができる。

本発明の該生理活性ポリペプチドは以下のとおりに製造
できる。すなわち、プラスミド（例えば、ｐＬＧＢ−ａ
ｌ）を用いて大腸菌Ｃ６００ＳＦ８を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性（Ａｐ’以下同じ）のコロニーの中から
ｐＬＧＢ−ａｌを有する大腸菌を選びだす。ｐＬＧＢ−
ａ・１を有する大腸菌を培地に培養することにより培養
物中に該生理活性ポリペプチドを生成させることができ
る。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに該生理
活性ポリペプチドの生産に好適なものならば合成培地、
天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース。

ラクトース、クリセロ−ルウマンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ，Ｃ１゜（Ｎ　Ｈ４）
　２　Ｓ　０４．　　カザミノ酸、酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・ステイ
ープ・リカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ２Ｈ
Ｐ　０４．　ＫＨ２Ｐ　０４．　Ｎ　ａ　Ｃｊ！。

Ｍｇ５Ｏ１，ビタミンＢ、、ＭｇＣｊ２２などが使用で
きる。

培養はＩ）　８５．５〜８，５、温度１８〜４０℃で通
気撹拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培養菌
体中に該生理活性ポリペプチドが蓄積するので、培養物
から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、遠
心分離して上清に該生理活性ポリペプチドを分離抽出す
る。０．４５ｊ１ｍフィルターを用いて除菌した後、ヒ
トＢリンパ球系細胞、例えばヒトリンパ芽球細胞ナマル
バ株を用い、上記方法で細胞増殖促進活性を測定するこ
とができる。

該生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを動物細胞
で発現させる際に用いるプラスミドとしては、動物細胞
で該ＤＮＡを発現できるものならいかなるプラスミドも
用いることができる。好ましくは、適当なプロモーター
、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プ
ロモーターなどの下流に外来ＤＮＡを挿入することがで
き、しかも、ポリＡシグナル、スプライシングシグナル
などを有するプラスミドを用いることができる。

具体的に好適なプラスミドとしては、本発明者らによっ
て造成されたｐＡＧＥｌ　０３などがあげられる。ｐＡ
ＧＥｌ　０３は第９図に示したプラスミドで、それを含
む大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＥＡＧ
Ｅ１０３　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３１２）として昭和６
２年３月２３日付で工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）に寄託されている。また、ジヒドロ葉酸還元酵
素（以下ｄｈｆｒと略記する）遺伝子を選択マーカーと
して有するプラスミドとしては、例えば、ｐＳＶ２−ａ
ｈ　ｆ　ｒ　ＣｘスΦサブラマニ（Ｓ、　Ｓｕｂｒａｍ
ａｎｉ　）ら：モレキユラー・アンド・セルラー・バイ
オロジイ　（１Ｊｏｌ。

Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　）　　１．８５４　（１９８
１））などがあげられる。

該生理活性ポリペプチドを発現させる際の宿主としては
、該ペプチドを発現できるものならいかなる動物細胞も
用いることができる。具体的に好適な動物細胞としては
、ｄｈｆｒが欠損したＣＨＯ細胞〔ジー・ウルラウブ＆
エル・ニー・チェインｙ　（Ｇ、　Ｖｒｌａｕｂ　＆　
Ｌ、Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ　）　：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　　７７、．４２１
６　（１９８０）　）などがあげられる。

該生理活性ペプチドｃＤＮＡとし工はｐ　ＬＧＡ−ｅ　
１　（ｐＬＧＡ−ｅ　１を含む大腸菌は３Ｂｃｈｅｒ　
ｉｃｈ　１ａｃｏｌｉ　ＥＬＧＡ−ｅ　１　　（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ　−１３１３）として昭和６２年３月２３日付
で微工研に寄託されている。〕を、該ｃＤＮＡを組み込
むためのプラスミドとしてはｐＡＧＥ１０３をそれぞれ
用いて該生理活性ペプチドを動物細胞で発現可能な組換
え体プラスミドを造成し、選択マーカーとしてｄｈｆｒ
遺伝子を有するプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒおよび宿
主としては、ｄｈｆｒを欠損したＣＨＯ細胞を用いて該
ペプチドを生産する例を以下に述べる。

第９図に示したようにしてｐＡＧＥｌ　０３をＨｉｎｄ
ｌとＢａｍＨＩで切断しＬＧＴ法にて約４、　Ｉ　Ｋ　
ｂのＤＮＡ断片を精製する。また、ｐ　ＬＧＡ−ｅｌを
ＨｉｎｄＩＩ［とＢａｍＨＩで切断し、ＬＧＴ法にて約
５６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。このようにして得
たＤＮＡ断片を７４ＤＮＡＩＪガーゼにより結合し、ｐ
ＳＥＡ−ｅｌを得る。上記組換え技法における反応の条
件は前述のとおりである。

本発明の該生理活性ポリペプチドは以下のとおりに製造
できる。すなわち、プラスミド（ｐＳＥＡ−ｅ　１右よ
びｐＳＶ２−ｄｈ　ｆ　ｒ）を例えばリン酸カルシウム
法〔グラハム＆ファン・デル・ニブ（Ｇｒａｈａｍ　＆
　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｂ）　：　ヴイロロジイ（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）５２、５４６　（１９７８））によりｄｈ
ｆｒ欠損Ｃ欠損Ｃ−０株する。ｐｓＥＡ−ｅｌおよびｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒの両方を有する形質転換株は例えば０
４１８および透析ウシ胎児血清を含むＭＥＭ　　ＡＬＰ
ＨＡ培地（リボ核酸およびデオキシリボ核酸不含有；ギ
ブコ・オリエンタル社製）により選択することができる
。さらに形質転換株の中からメソトレキセートを用いて
該生理活性ポリペプチド遺伝子が増幅された形質転換株
を得ることもできる。得られた形質転換株を培地に培養
することにより培養物中に該生理活性ポリペプチドを生
成させることができる。

培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血清）を加え
たハムＦＩＯ培地、ハムＦ１２培地（以上フローラボ社
製）、ダルベツコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地
（以上日水製薬社製）、ＭＥＭＡＬＰＨＡ培地およびこ
れらの混合培地が用いられる。培地には必要により、グ
ルタミン０．５〜５ｍ　Ｍ　、抗生物質〔ペニシリン（
２５Ｕ／ｍ１２）　、ストレプトマイシン（２５ｘｒ／
ｍｌ＞　、　　Ｇ　４１８（０，３ｍｇ／ｍｌ　）など
〕、重曹（０，０１％）などを適量加えてもよい。

培養には、種々の培養ピン、デイツシュ、ローラーボト
ル、スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを
用いることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１０
’〜ＩＸ１’０６細胞／ｍｌとし、３０〜４０℃、２〜
１０日聞行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に
細胞内に生成する。

培養物から細胞を遠心回収し、例えばテフロンホモゲナ
イザーを用いて細胞を破砕した後、遠心分離して上清に
該生理活性ポリペプチドを分離抽出する。細胞増殖促進
活性は、ヒ）　Ｂ　ＩＪンパ球系細胞、例えばヒトリン
パ芽球細胞ナマルバ株を用い、上記方法で測定すること
ができる。

本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のような微生
物、あるいは真核細胞による該生理活性ポリペプチドの
大量生産に用いられる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ Ｋ５６２−７１株よりのポリ　（Ａ）ＲＮＡの調製： ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２−７１株より、チオシ
アン酸グアニジン−塩化リチウム法〔カサラ（Ｃａｔｈ
ａｌａ）ら：ディーエヌエイ　（ＤＮＡ）２゜３２９　
（１９８３））に従い、ポリ　（Ａ）を有するＲＮＡを
下記のごとく調製した。

Ｋ５６２−７１株を、基礎培地として、ハムーＦＩＯ培
地（フローラボ社製）およびダルベツコらのＭＥＭ培地
（日水製薬社製）を３：１の比率で混合したものに、ピ
ルビン酸（５ｍＭ）、亜セレン酸（１，２５Ｘ　１０−
’Ｍ）　、ガラクトース（１ｍｇ／ｍｌ）　、グルタミ
ン（４ｍＭ）、ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）　、ストレ
プトマイシン（２５ｇ／ｍｌ　）および重曹（０，０１
％）を加えた無蛋白培地１！に、８Ｘ１０’個／ｍｌと
なるように接種し、スピンナー・カルチャー・ボトルを
用い、３７℃で３日間培養した。

続いて、この細胞懸濁液の一部（２５０ｍ１）から１，
１１０Ｏｘ、４℃ＩＯ分間の遠心分離によって細胞を集
め、８０ｍ１のリン酸塩バッファー（ｐＨ７，０）で洗
浄した後、５Ｍチオシアン酸グアニジン、ｌ　ＱｍＭ　
ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　　（ｐ
Ｈ７）および８％（Ｖ／Ｖ）　　２−１　ルカブトエタ
ノールからなる溶液１０ｍ１中でポルテックス・ミキサ
ーを用い可溶化した。この可溶化物を遠心管に移し、４
Ｍ　　ＬｉＣｊ！溶液３Ｑｍｌを加えて撹拌した後、４
℃、２０時間静置した。

Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰ　Ｒ１０ローター（日立製作所社
製）にて９．０００’ｒ　ｐｍ、　　９０分間遠心後、
ＲＮＡを沈澱として回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素
および２Ｍ塩化リチウムからなる溶液５ＱｍＩに懸濁し
、旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲ１０ローターにて９．００　Ｏ
ｒｐｍ。

６０分間遠心後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。Ｒ
ＮＡの沈殿を０．１％ラウリル硫酸す）　ＩＪウム、１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ＩＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（
ｐＨ７，５＞からなる溶液１０ｍｌに溶解し、フェノー
ルクロロホルムで抽出後、エタノール沈澱により回収し
た。得られたＲＮＡ約２．５　ｍｇを１０ｍＭ　　Ｔｒ
　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡからなる溶液１ｍｌに溶かした。

６５℃、５分間インキュベートし、０．１ｍｌの５ＭＮ
ａＣβを加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース・
カラム〔ビー・エル・バイオケミカルズ（Ｐ　−Ｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕クロマトグラフィー（
カラム体積０．５ｍ１）にかけた。吸着したポリ（Ａ）
を有するｍＲＮＡをｌＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−Ｈｃｔｔ
　（ｐＨ７，５）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶
液で溶出し、ポリ　（Ａ＞を有するｍＲＮＡ約１００■
を得た。

実施例２゜ ｃＤＮＡ合成と該ｃＤＮΔのベクターへの挿入：オカヤ
マーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法〔モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（！、ｌｏ
ｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、）、　２．１６１　（１
９８２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込ん
だ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概略
を第１図に示す。

ｐｃＤＶｌ　　（ファルマシア社製）　〔オカヤマ・ア
ンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）　　：
　％ｌ／キュラー・アンド・セルラー・バイオロシイ（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）、　３．２８０　（１９８３）　）　４０
０１℃ｇをｌＱｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７，５
）、６ｍＭ　　ＭｇＣ，ｉ！ｚおよび１０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｊ！からなる溶液３００ｍに加え、さらに５００単位
のＫｐｎ　Ｉを加えて、３７℃、６時間反応させ、プラ
スミド中のＫｐｎ■部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。

Ｋｐｎ、Ｉ切断した該ＤＮＡ約２００ｔｔｇを４０＋ｎ
Ｍカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！　（ｐＨ６，８）　、１　ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃｊ２
２および０．１ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと
略記する）からなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記す
る）にｄＴＴＰを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２
００Ｊｄｌに加え、さらに８１単位のターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略
記する）　　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）を加えて、３７℃、１１分間反応させた。こコテ、ｐ
ｃＤＶｌのＫｐｎ　Ｉ切断部位の３′末端にポ’Ｊ　　
（ｄＴ）鎖が約６７個付加された。該溶液からフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ　
（ｄＴ）６Ｎの付加したｐ、ｃＤＶＩＤＮＡ約１００眉
を回収した。該ＤＮＡをｌＱｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ
ｉ！　（ｐＨ７，５）、　　６ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ。

１００ｍＭ　　ＮａＣ１からなる緩衝液１５０４に加え
、さらに３６０単位のＥＣ０ＲＩを加え、３７℃２時間
反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処理後、約３．　Ｉ
　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を回収し、約６０■のポリ　（ｄ
Ｔ）鎖付加ｐｃＤＶ１を得た。

該ＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！（ｐＨ８
，０）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶　液５００
４に溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷して
５０ｍの５Ｍ　　ＮａＣｊ！を加えた。混合物をオリゴ
（ｄ　Ａ）セルロースカラム（コラボラティブリサーチ
社製）クロマトグラフィーにかけた。

ポ’）（ｄＴ）鎖長が充分なものはカラムに吸着し、こ
れをｌＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）およ
び１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポＩＪ（
ｄＴ）鎖の付加したｐｃＤＶｌ　　（以下ベクタープラ
イマーと略記する）２７１１ｇを得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行った。

ｐＬｌ、（ファルマシア社製）〔オカヤマ・アンド・バ
ーブ（Ｏｋａｙａｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）　：モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジイ　（Ｍｏ１．Ｃｅ
１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）、　３．２８０　（１９８３）　）約１４
埒をｌＱｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６
ｍＭ　Ｍｇ（、Ｊ’２および５０ｍＭ　　ＮａＣｊ！か
らなる緩衝液２００Ｍに加え、さらに５０単位のＰｓｔ
Ｉを加え、３７℃４時間反応させ、Ｉ）ＬＩＤＮＡ中の
ＰＳｔ１部位で切断させた。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、ＰｓｔＩで
切断したｐ　Ｌ　Ｉ　ＤＮＡ約１３■を回収した。

該ＤＮＡ約１３■をＴｄＴ緩衡液に＃濃度０．２５ｍＭ
のｄＧＴＰを含む溶液５０１Ｉｉ゛に加え、さらにＴ　
ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）　
５４単位を加えて３７℃１３分間インキコベートし、ｐ
ＬｌのＰｓｔＩ切断部位３′末端に（ｄ　Ｇ）鎖を約１
４個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタノ
ール沈殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮ、Ａを１０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、６ｍＭＭｇ
ＣＬおよび６０ｍＭ　　ＮａＣｊ！からなる緩衝液１０
（ｂｄ！に加え、さらに８０単位のＨｉｎｄ■を加えて
３７℃３時間インキエベートし、ｐＬＩ　ＤＮＡの）（
ｉｎｄｎ［部位で切断した。該反応物をアガロースゲル
電気泳動にて分画し、約０．５　Ｋ　ｂ（７）ＤＮＡＦ
ｒ片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツェン（Ｄｒｅｔｚｅ
ｎ）　　ら：アナリティカル・バイオケミストリイ（Ａ
ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　　１１２．２９５　
（１９８１）　〕にて回収し、オリゴ（ｄＧ）ｍｌ付き
のリンカ−ＤＮＡ（以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する
）を得た。

上記で調製したポ！Ｉ　（Ａ）ＲＮＡ約２Ｊ１ｇ、ベク
ターブライマー約１．４■を５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！　　（ｐＨ８，３）、８ｍＭ　　ＭｇＣＬ、３０
ｍＭ　　ＫＣｊ！、０．３ｍＭ　　ＤＴＴ、　　２ｍＭ
ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄｃ
ＴＰ）および１０単位のりボヌクレアーゼインヒビター
（Ｐ−Ｌ　ｆｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社！ｌりからな
る溶液２２．３ｄに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生
化学工業社製）を加え、４１℃９０分間インキニベート
し、ｍ　ＲＮ　Ａに相補的なりＮＡを合成させた。該反
応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱
を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重二重材加したベクタープラ
イマーＤＮＡを回収した。

該ＤＮＡを６６ｐＭ　　ｄＣＴＰおよび０．２■ポリ（
Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液２０頭に溶かし、１４単位のＴ
　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
を加えて３７℃２分間インキコベートし、ｃＤＮＡ３’
末端に２０個の（ｄＣ）＃Ｊを付加した。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により
（ｄＣ）鎮の付加したｃＤＮＡ−ベクターブライマーＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｈ
Ｃｆ（ｐＨ７，５）、　　６ｍＭ　　ＭｇＣ（ｈおよび
６０ｍＭ　　ＮａＣβからなる液４００μｇに溶かし、
２０単位のＨｉｎｄｌｌｌを加え、３７℃２時間インキ
ニベートし、Ｈｉｎｄｎ１部位で切断した。該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱して０
．５ピコモルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープラ
イマーＤＮＡを得た。

該Ｄ　Ｎ　Ａ　０．２ピコモルおよび前記のリンカ−Ｄ
ＮＡ０．４ピコモルをｌＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２
（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ　　ＮａＣｊ！および１ｍＭ
ＥＤＴＡからなる溶液１００ｍに溶かし、６５℃。

４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分、３０分間イン
キュベートした。２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　
（ｐＨ７，５＞、４ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２．１０ｍＭ　
（ＮＨ，）２ＳＯ４，０，１Ｍ　　Ｋ（ｌおよび０．１
ｍＭ　　β−ＮＡＤの組成で、全量１０００ｊｉＩｌと
なるよう反応液を調製した。該反応液に２５単位の大腸
菌ＤＮＡ！Ｉガーゼにューイングランド・バイオラブズ
社製）を加え、１１ｔ、１８時間インキニベートした。

該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ。

０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製
し、１０単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼ、２０単位の大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）右よび１０単位の大腸菌リボヌクレアー
ゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加え
、１２℃。

２５℃で順次１時間ずつインキュベートした。上記反応
で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮ　Ａ
　−Ｄ　Ｎ　Ａ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され
完全な二重鎖となったＤＮＡの組換え体プラスミドが生
成した。

実施例３゜ 生理活性ポリペプチドｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選
択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６
００ＳＦ８株〔カメｏ　ン（Ｇａｍｅｒｏｎ）ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　７２．３４１６　（１９７５）、
昭和６１年５月２７日付で微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１０７０として寄託〕を５ｃｏｔｔらの方法〔重定勝哉
：細胞工学、　２．６１６（１９８３）　）に従い形質
転換した。得られた約１万個のコロニーをニトロセルロ
ースフィルター上に固定した。ウィボルグらが単離した
ヒトユビキチン前駆体遺伝子〔口、　ｌｌｉｂｏｒｇ　
ら：［！ＭＢＯＪ、　４．７５５（１９８５）　）のユ
ビキチン前駆体のＮ末端から１番目−１５番目のアミノ
酸配列に対応する合成りＮＡ。

すなわち、 を３２ｐで標識したプローブに４５℃で強く会合しまた
、Ｎ末端から３０番目−３５番目のアミノ酸配列に対応
する合成りＮＡ、すなわち、（３番目の塩基はＣ，Ｔ、
　Ａのいずれか、６番目はＡまたはＧ、９番目はＴまた
は０１１２番目はＧまたはＡ１１５番目はＡまたはＧで
あり、組み合わせて４８通りの合成りＮＡの混合物とな
る）を３２ｐで、標識したプローブに４０℃で強く会合
した８菌株を選んだ〔Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅ
ｓｓの方法：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　
　Ｓｃｉ、、　　ＵＳＡ、、　　７２．　３９６１　　
（１９７５））　　。

これらのプラスミドはｐＬＧＡ８．ｐＬＧＡ９゜ｐＬＧ
Ａｌｌ、ｐＬＧＡ１３．ｐＬ−ＧＢ１２゜ｐＬＧＢ１６
．ｐＬＧＢ１９．ｐＬＧＣ１５と命名した。上記で得ら
れたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化し、
ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。制限酵素部位の存
在位置から、得られたプラスミドは３群に分類でき、ｐ
ＬＧＡ８゜ｐＬＧＡ９．ｐＬＧＡｌｌ、ｐＬＧＡ１３の
群、ｐＬＧＢ１２．ｐＬＧＢ１６．ｐＬＧＢ１’９０群
およびｐ　ＬＧＣ１５に分けられた。それぞれの群の制
限酵素地図を第２図に示す。

次に、各群から、はぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えら
れるプラスミドｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２゜ｐＬＧＣ１
５を選び、動物細胞に導入し発現させた。宿主としては
ＣＯ３−１細胞株ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０を用いた。Ｃ
Ｏ３−１細胞株は、ＳＶ４０ウィルスのＴ抗原を構成的
に発現しているので、同ウィルスの複製起点をもち同ウ
ィルスの初期遺伝子プロモーターの下流に遺伝子を挿入
した構造を有するｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２゜ｐＬＧＣ
１５の一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ）が可能である。ｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２お
よびｐＬＧＣ１５のｃｏｓ−ｉ細胞株への導入はＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法に準じて行った。すなわち、１０％
のウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むダルベツコ変法イーグ
ル（ＤＭＥ）培地（日永製薬社製＞４５ｍ１に２Ｘ１０
’細胞／ｍ１ニナルヨウニ細胞を接種し〔培養にはコー
ニング社！！７５ｍ１−テッシュカルチャーフラスコを
３本使用した（１５ｍｌ／フラＸ：ｌ）：１．３７℃、
　　ＣＯ２インキ、：Ｌ　ヘ−ターにて３日間培養した
。このようにして培養したＣＯ３−１細胞株１：１５０
ｇのｌ）　ＬＧＡ　８゜ｐＬＧＢ１２もしくはｐＬＧＣ
１５を溶解させた５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（
ｐＨ７，３）５００■／ｍ　ｌのＤＥＡＥ−デキストラ
ンを含む２１ｍ１のＤＭＥ培地を加え、８時開インキュ
ベートした後、細胞を洗浄し、３Ｑｍｌの１０％のウシ
胎児血清（Ｆｅ２）を含むＤＭＥ培地を加えさらに３日
間インキュベートした。細胞を洗浄後、２ｍｌのＰＢＳ
ＣＮａＣ１８ｇ／β、ＫＣβ０．２ｇ／／！。

Ｎ　ａ　２　ＨＰＯ２（無水）１．１５ｇ／Ｌ　　ＫＨ
ｉＰｏ。

０．２ｇ／ｊ！］に懸濁し、テフロンホモゲナイザーに
て細胞を破砕後、１２．０００ｒｐｍ、２０分間遠心し
て得られる上清を４℃でＰＢＳに対して透析した。

細胞増殖促進活性の測定は、ヒトリンパ芽球細胞ナマル
バ株（ＡＴＣＣＣＲＬ　１４３２）を用いて行った。す
なわち、ナマルバ株５〜１０×１０’ｉ［ｌｌ胞／ｍｌ
をＲＰＭＩ−１６４０培地（日永製薬社製）にグルタミ
ン（４ｍＭ）、ストレプトマイシン（２５ｉＬｇ／ｍｌ
＞　、ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルフォン酸（
ＨＥＰＥＳ）　　（１０ｍＭ）、重曹（０，０１％）お
よび分生血清（１０％）を加えた培地７５ｍ１で３７℃
４８時間培養した。培養物を８００Ｘｇ、５分間遠心し
て細胞を集め、上記の培地から血清を除いた培地で洗浄
し、２４穴マルチデイツシニプレート（コーニンク社製
）に分注し、Ｑ、９ｍｌの血清を含まない培地と、Ｑ、
１ｍｌの試料液を添加した。ＣＯ２インキュベーターで
３７℃３日間培養後、細胞数を血球計算板を用いて測定
した。測定結果は第１表に示した。

ナマルバ株に対して明らかに細胞増殖促進活性がｌ忍め
られたことから、ｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２゜ｐＬＧＣ
１５は該生理活性ポリペプチドをコードしていることが
確認された。

ｐＬＧＡ８を含む大腸菌菌株は、［４ＳＣｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ　　ＥＬＧＡ８　　ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１
０６７として微工研に昭和６１年５月２７日付で寄託し
である。

第　　　　１　　　　表 ｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２およびｐＬＧＣ１５のｃＤＮ
Ａについて、その翻訳領域の全塩基配列をＭ１３ファー
ジを用いたデイデオキシ・シーフェンス法〔ジエイｅメ
シング（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ）　　らニジ−７（Ｇｅ
ｎｅ）　１９．２６９　（１９８５）〕により決定した
。

ｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列をｐＬＧＡ８
については第２表に、ｐＬＧＢ１２については第３表に
、ｐＬＧＣ１５については第６表に示す。いずれもヒト
ユビキチンに相当するアミノ酸配列を構造の一部として
有していることが判明した。

２表 ＧＧＧ八八へへＣへＡＴＣ八ＣへＣＴＣＧ八ＧへＴＴＧ
八八へへＣＴＣＧＧ１ｙＬｙｓＴｈｒ１１ｅＴｈｒＬｅ
ｕＧ１ｕＶａｌＧ１ｕＰｒｏＳｅｒＡＴＣＣ八ＧＧ八Ｔ
八八ＧＧＡ八ＧＧ八ＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧ八ＴＣＡＧＩ
　１ｅＧ１ｎＡｓｐＬｙｓＧ１ｕＧｌｙＩ　１ｅＰｒｏ
Ｐｒｏ八５ｐＧｌｎＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＡ
（Ｉ’ＴＴＴＧＴ（Ｉ’ＴＧＡＣＴＡＣ八八ＴＬｅｕＧ
１へへｓｐＧ１ｙＡｒへＴｈｒＬｅｕＳｅｒＡｓｐＴｙ
ｒ八ｓｎゴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧ
ＴＡＡ３衰 ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧ
ＡＧＣＣＣＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧ
ＣＡＴＯ’Ｃ’ＣＣＵ［’ＣＧＡＣＣＡＧｒＴｍｃＡＡ
ｎＡＴｎｎｒ（’ＣｒＡｒＴｒＴＴＴｒＴＣ＾１”Ｔ＾
ｒＡＡｒし１　ｔＪＬＪｎｎＬＪｎｊ　ｕｕしＬＬＪｕ
ｎしｊ　ｕｌ　１１す１ｕｆｌｕｊｆｌｔ、＋ｎ口し一
＋−１ａ／ｌ１１ａＩ’ｎＩ雪バー−轟−ｍ−−−−ｉ
−−ＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧ
ＴＴＡＡＡＴＧＣ八ＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡ八ＡＣＣ
ＣＴＴ八ＣＣＧＭｅｔＧ１ｎＩ１ｅＰｈｅＶａｌＬｙｓ
ＴｈｒＬｅｕＴｈｒＧＧ八ＣＡＣＣＡＴＣＧＡ八Ａ八Ｔ
ＧＴＧ八ＡＧＧＣＣＡ八Ｇ八八ｓｐＴｈｒＩ１ｅＧｌｕ
ＡｓｎＶａＩＬｙｓＡ１ａＬｙｓＩＣ八ＧＡＧＧＣＴＣ
八ＴＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡ八ＧＣＡＧＣＧ１ｎＡｒｇ
ＬｅｕＩ１ｅＰｈｅＡ１ａＧ１ｙＬｙｓＧ１ｎＬＡＴＣ
ＣＡＧ八八ＧＧ八ＧＴＣＧ八ＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧ
１　１ｅＧ　１ｎＬｙｓＧ　１ｕＳｅｒＴｈｒＬｅｕＨ
　ｉｓＬｅｕＶＧＣＡ八Ｇ八ＣＣ八ＴＣＡＣＣＣＴＴＧ
八ＧＧＴＧＧ八ＧＣＣＣ八ＧＴＴＣＣ八ＧＧ八Ｔ八八Ｇ
ＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡ
ＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴ八ＣＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＡＣ
八八ＣＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧ八ＧＡＧＧＴＧＧＴ八Ｔ
ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣａＩＬｅｕ八ｒｇＬｅｕＡｒｇＧ
１ｙＧ１ｙＭｅｔＧＩｎＩ１ｅＰｈｅ５５０　　　　５
６０　　　　５’ ＡＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣ
ＣＣＣ（Ｌｙｓｌ　１ｅＧ１ｎ八５ｐＬｙｓＧ１ｕＧ１
ｙ１１ｅＰｒｏＰ１６１０　　　　　６２０　　　　　
６：ＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＴ
ＴＴＣＴＧ）ＧｌｎＬｅｕＧｌｕＡｓｐＧｌｙＡｒｇＴ
ｈｒＬｅｕＳｅｒＡｓｒｏ　　　　　５８０　　　　５
９０　　　　６００′、ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣ
ＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＡＧｒｏＡｓｐＧ　ｌ
ｎＧ　１ｎＡｒｇＬｅｕ　Ｉ　１ｅＰｈｅＡ　１ａＧ　
１ｙＬｙｓ＼ＣＴＡＣ八ＡＣＡＴＣＣＡＧＡ八八ＧＡＧ
ＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣ；ｐＴｙｒＡｓｎ　Ｉ　１ｅ
Ｇ　１ｎＬｙｓＧ　１ｕＳｅｒＴｈｒＬｅｕＨ１ｓＣＴ
ＧＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧＴ
ＴＬｅｕＶａ　ｌＬｅｕＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧ　１ｙＧ
　１ｙＣｙｓ＊実施例４゜ 組換え体プラスミドｐＬＧＢ−ａｌの造成：実施例１．
実施例２および実施例３により得られたｐＬＧＢｌ　２
　（３，６Ｋｂ）をもつ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養
し、培養菌体から常法によりｐＬＧＢ１２ＤＮＡを調製
した。得られたｐＬＧＢ１２ＤＮＡ　　：ｂｃｇを１０
ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、７
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　　２−メルカプトエタノ
ールを含む全量４０頭の溶液（以下“Ｙ−０緩衡液”と
略記する）に溶かし、制限酵素Ｈｐａ［（二ニーイング
ランド・バイオラブズ社製〉　６単位を加えて、３７℃
で２時間切断反応を行った。次いで、ＮａＣｊ！を終濃
度１００ｍＭになるように加え、制限酵素ＢａｍＨＩ　
　（全酒造社製、以下制限酵素については特記しない限
りすべて全酒造社製）６単位を加え、３７℃でさらに２
時間切断反応を行った。反応液からＬＧＴ法により該生
理活性ポリペプチドの大部分を含む約４９０ｂｐのＤＮ
Ａ断片（ＨｐａＩ［−ＢａｍＨＩ断片）約０．２■を得
た。

別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　（４，７Ｋｂ）２■を１０ｍＭ
　Ｔｒ　ｉ　５−ＮＣＲ（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ
ｊ！ｚ　、６ｍＭ　　２−１ルカブトエタノールおよび
１００ｍＭ　　ＮａＣ１を含む溶液（以下“Ｙ−１００
緩衝液”と略記する）全量４０１ｆＪｌに溶かし、制限
酵素ＨｉｎｄＩ［ＩとＢａｍＨＩそれぞれ６単位ずつを
加え３７℃で２時間切断反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法によりトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ
）を含む約４．４　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｂ　ａ’ｍＨ
Ｉ　−Ｈ’ｉ’ｎ　ａ　ｍ断片）約１．５μｇを得た。

一方、該生理活性ポリペプチドのＮ末端であるＭｅｔ（
ＡＴＧ）から、９番目のアミツ酸であるＴｈｒ　（ＡＣ
Ｃ）の２番目の塩基（ＡＣ’）までを付与する必要があ
ること、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距
離は、６〜１８ｂｐの間の適当な長さにする必要がある
ことなどの理由から、下記のＤＮＡＩＪンカーを合成し
た。

まず、−木調ＤＮＡ、３１−ｍｅｒと２９−ｍａｒを通
常のトリエステル法〔アール・フレア（Ｒ，Ｃｒｅａ）
ら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　
［ＩＳＡ　７５．５７６５　（１９７８））により合成
した。３１−ｍａｒおよび２９−ｍａｒの各々２０ピコ
モルを５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオスレイトー
ル、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび１ｍＭＡＴＰを含む
全量４０１ＩＪｌの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（全酒造社製）１単位を加えて、３７℃で６
０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＬＧＢ１２由来のＨｐａＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（約４９０ｂｐ）０．１ｇと発現ベクターｐＫ
ＹＰ１０のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ［断片（約４．４
Ｋｂ）０．５ｘを全量２０ρの２０ｍＭＴｒ　ｉ　５−
ＨＣｌ（ｐＨ７，６＞、１０ｍＭ　ＭｇＣＬ。

１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭＡＴＰを含む
緩衝液〈以下この緩衝液を“Ｔ４リガーゼ緩衡液”と略
記する）に溶かし、この混合液に上記ＤＮＡＩＪンカー
を約１ピコモル加えた。この混合液にさらにＴ　４　Ｄ
ＮＡ　’Ｊガーゼ（宝酒造社！ｌ！二以下同じ）５０単
位を加え、４℃で１８時間反応を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ３株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た
。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法〔
エイチ・シー・バーンボイム＜Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　７．１５１３　（１
９７９））（以下プラスミドＤＮＡの分離はこの方法を
用いる）に従って分離・精製した。得られたプラスミド
の構造は、制限酵素ｐｖｕ［、ＢａｍＨＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動により確認した。

このプラスミドをｐＬＧＢ−ａｌとよぶ。ｐＬＧＢ−ａ
ｌのＨｉｎｄｌ付近の塩基配列は下記のとおりであるこ
とをデイデオキシ・シーフェンス法で確ε忍した。

実施例５゜ 組換え体プラスミドｐＬＧＢ−ｄ２の造成：実施例４に
より得られたｐＬＧＢ−ａ　１　　（４，９Ｋｂ）をも
つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体から常法
によりｐＬＧＢ−ａ　ｌＤＮＡを調製した。得られたｐ
ＬＧＢ−ａｌＤＮＡ　　５４ｇをＹ−１００緩衝液８０
誠に溶かし、制限酵素ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績社製）
とＢａｍＨＩそれぞれｌＯ単位ずつを加え３７℃で２時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により該
生理活性ポリペプチド遺伝子を含む約５３０ｂｐのＤＮ
Ａ断片（Ｂ　ａ　ｎ　ｎＩ−Ｂ　ａｍＨＩ断片）約０．
３尾を得た。

別に、ｐＧＥＬｌ　　（３，４Ｋｂ）２贋をＹ−１００
緩衝液４０誠に溶かし、Ｂａｎ１ＩＩとＢａｍＨＩそれ
ぞれ４単位ずつを加え３７℃で２時間切断反応を行った
。この反応液からＬＧＴ法によりトリブトファンクンデ
ムプロモーター（ＰｔｒｐＸ２）を含む約２．７　Ｋ　
ｂのＤＮＡ１片（ＢａｎＩＩ［−ＢａｍＨＩ断片）約１
肩を得た。

次に上記で得たｐＬＧＢ−ａｌ由来のＢａｎＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（約５３０ｂｐ）０．２ｘとｐＧＥＬ１由
来のＢａｎｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（約２．７Ｋｂ）０
．５■を全量２０〃のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ
　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ２単位を加え、４℃で１８時
間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ３株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た
。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収
し、ｐＬＧＢ−ｄ２を得た。

ｐＬＧＢ−ｄ　２の構造は、制限酵素ＥＣ０ＲＩ。

ＰｖｕＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｐｓｔｌで切断後、アガロー
スゲル電気泳動により確認した。

実施例６゜ 組換え体プラスミドｐＬＧＡ−ｄ５の造成；実施例５に
より得られたｐＬＧＢ−ｄ２　（３，２Ｋｂ）を持つ大
腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体から常法によ
りｐＬＧＢ−ｄ２　ＤＮＡを調製した。得られたｐＬＧ
Ｂ−ｄ２　ＤＮＡ　　２■をＹ−１００緩衝液４０ｍに
溶かし、ｐｖｕｌｌとＢａｍＨＩそれぞれ４単位ずつを
加え、３７℃で２時間切断反応を行った。この反応液か
らＬＧＴ法によりＰｔｒｐｘ２を含む約２．３　Ｋ　ｂ
のＤＮＡ断片（Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ−Ｂ　ａｍＨＩ断片）
約ＩＩｔｇを得た。

別に、実施例１．実施例２および実施例３により得られ
たｐＬＧＡ８　（３，７Ｋｂ）をもつ大腸菌Ｃ６００Ｓ
Ｆ８株を培養し、培養菌体から常法によりｐＬＧＡ８Ｄ
ＮＡを調製した。得られたｐＬＧＡ８　　ＤＮＡ　　３
■をＹ−１００緩衝液４０誠に溶かし、ｐｖｕｌＩと１
３ａｍＨＩそれぞれ６単位ずつを加え、３７℃で２時間
切断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により該生理活性ポリペプチド
のＣ末部分をコードするＤＮＡを含む約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片（Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ−Ｂ　ａｍＨＩ断片）約０
．２肩を得た。

次に上記で得たｐＬＧＢ−ｄ２由来のｐｖｕ［−Ｂａｍ
ＨＩ断片（約２．８Ｋｂ）０．３Ｊｉｇとｐ　ＬＧＡ８
由来（ＤＰｖｕｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（約４００ｂｐ）
０、ＩＪｔｇを全量２０薦のＴ４リガーゼ緩衝液に溶か
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２０単位を加え、４℃で１８時
間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た
。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収
し、ｐＬＧＡ−ｄ５を得た。

ｐＬＧＡ−ｄ５の構造は制限酵素ＰｖｕＩＩ。

ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌで切断後、アガロー
スゲル電気泳動により確認した。

実施例７゜ 組換え体プラスミドｐＬＧＡ−ｅｌの造成：実施例６に
より得られたｐＬＧＡ−ｄ５　（３，２Ｋｂ）をもつ大
腸菌Ｃ６００３Ｆ８株を培養し、培養菌体から常法によ
りｌ、ＧＡ−ｄ５　ＤＮＡを調製した。得られたｐＬＧ
Ａ−ｄ５　ＤＮＡ　　２ｇをＹ−１００緩衝液４０ｄに
溶かし、ＢａｎＩＩ［とＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを
加え、３７℃で２時間切断反応を行った。この反応液か
らＬＧＴ法により該生理活性ポリペプチド遺伝子を含む
約２．２ＫｂのＤＮＡ断片（Ｂａ　ｎｎＩ−Ｐ　ｓ　ｔ
　ｒ断片）約１ｇを得た。

別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　（４，７Ｋｂ）４■をＹ−１０
０緩衝液８０薦に溶かし、ＢａｎｎＩとＰｓｔｌそれぞ
れ８単位ずつを加え、３７℃で２時間切断反応を行った
。この反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約１．
　ｌ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｂａｎｌｌｒ−Ｐｓ　ｔ　
Ｔ断片）約０．５ｇを得た。

次に上記で得たｐＬＧＡ−ｄ５由来のＢａｎＩＩＩ−Ｐ
ｓ　ｔ　Ｉ断片（約２．２Ｋｂ）０．５■とｐＫＹＰ１
０由来のＢａｎＩＩＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片０．２■を全
量２０４のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ２単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った
。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００３Ｆ８株を形質転換し、Ａ　ｐ　ｒのコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを
回収し、ｐＬＧＡ−ｅｌを得た。

ｐＬＧＡ−ｅｌの構造は制限酵素ｐｖｕ［、ｐｓｔＴ、
１３ａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動に
より確認した。

実施例８゜ ｐＬＧＢ−ａ　ｔ、ｐＬＧＡ−ｅ　１を保有する大腸菌
による該生理活性ポリペプチドの生産：実施例４および
実施例７で得た組換え体プラスミドｐＬＧＢ−ａ　１．
　　ｐＬ’ＧＡ−ｅ　１を持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株
（ｐＬＧＢ−ａｔを保有するＣ６００ＳＦ８株をＥＬＧ
Ｂ−ａｌと命名し、微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−１，０
６８として昭和６１年５月２７日付で寄託しである〕を
ＬＧ培地〔バタトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
　Ｎａｃｊ’５ｇ、グルコース１ｇを水１２に溶かし、
ＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３７℃、１８時
間培養し、この培養液９．５ｍｌを２５．ｑ／ｍｌのト
リプトファンと５０ｘ／ｍ＋のアンピシリンを含むＭＣ
Ｇ培地（Ｎ　ａ　２　ＨＰ○４０．６％、ＫＨ２Ｆ０．
０．３％。

ＮａＣｊ！　　０．５％、カザミノ酸０．５％、　Ｍ　
ｇ　Ｓ　０４１ｍＭ、　　ビタミンＢ＋　　４Ｒ／ｍ１
．ｐＨ７，２３１０ｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間
培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インド
ール−アクリル酸（３β−１ｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ
　ａｃｉｄ、　以下ＩＡＡと略す）を１０■／ｍｌにな
るように加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養
液を８．　ＯＯＯｒｐｍ。

１０分間遠心して集菌し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄菌体
をＰＢＳ　　５ｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕（ＢＲ
ＡＮＳＯＮ　５ＯＮＩＣＰＯＷＢＲＣＯＭＰＡＮＹ社Ｓ
ＯＮ＋ＦＩ巳ＲＣ已ＬＬ　ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ２００，
０ＵＴＰＵＴ　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ　２．１０分間処理）し
た。これを１５．０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離する
ことにより該生理活性ポリペプチドを上清に分離抽出し
た。０．４５声のフィルター（日本ミリポア・リミテッ
ド社製）を用いて除菌した後、実施例３に記載されてい
る方法に従って細胞増殖促進活性の測定を行った。測定
結果は第４表に示した。

第　　　　４　　　　表 実施例９゜ 組換え体プラスミドｐＬＧ’Ｃ：５ｃｌｌの造成：実施
例３により得られたｐＬＧＣ１５　（４，２Ｋｂ）をも
つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体から常法
によりｐＬＧＣ１５ＤＮＡを調製した。

得られたｐＬＧＣ１５ＤＮＡ　　３ｇをＹ−１００緩衝
液全量６０Ｉｄ！に溶かし、制限酵素Ｘｈｏ１６単位を
加え３７℃で２時間切断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により該生理活性ポリペプチド
（ＵＬ−Ｃ）遺伝子を含む約１．３　Ｋ　ｂのＤＮＡ断
片（ＸｈｏＩ断片）約０．５μｇを得た。

別に、ｐＵｃｌ　９　（２，７Ｋｂ）２ｇをｌＱｍＭＴ
ｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ！２゜５ｍＭ　　２−メルカプトエタノールおよび
１７５ｍＭ　　ＮａＣ，ｉ！を含む溶液全量４０〃に溶
かし、制限酵素ＳａβＩＩＯ単位を加え３７℃で２時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により約２
．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｓａｊ！Ｉ断片）約１．０
■を得た。

次に上記で得たｐＬＧＣ１５由来のＸｈｏｌ断片（約１
．３Ｋｂ）０．４１１ｇとｐＵｃ１９由来の５ａｊｉ’
■断片（約２．７Ｋｂ）０．３■を全量２０薦のＴ４リ
ガーゼ緩衡液に溶かし、この混合液にさらに２単位のＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造社製：以下同じ）を加え４
℃で１８時間反応を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た
。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡをバーンボイム
らの方法に従って分離・精製した。得られたプラスミド
の構造は、制限酵素ＳａβＩ、ＢａｍＨＩで切断後、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。このプ
ラスミドをｐＬＧＣ：５ｃｌｌとよぶ。

実施例１０゜ 組換えプラスミドｐＬＧＣ−ｘｌの造成；実施例９によ
り得られた＋）ＬＧＣ：５ｅｌｌ（４，０Ｋｂ）をもつ
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体から常法に
よりｐＬＧＣ：　Ｓｃ　ｌ　１ＤＮＡを調製した。得ら
れたｐＬＧＣ：５ｃｌｌＤＮＡ　　１０■をＹ−１００
緩衝液１００ρに溶かし、制限酵素ＢｇβＩ［，１０単
位を加え３７℃で１時間切断反応を行った（この条件で
ｐ　ＬＧＣ：５ｃｌｌＤＮＡはＢｇβ■により部分切断
された）。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エ
タノール沈殿によりＤＮＡ断片約８．０ｇを精製、回収
した。この４．　ＯＫ　ｂのＤＮＡ断片８．０■を５０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）、７ｍＭ
Ｍ　ｇ　Ｃ１ｚおよび６ｍＭ　　２−メルカプトエタノ
ールを含む溶液に溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。

ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰをそれぞれ１ｍＭになるように加え
（全ｊｌ１６０ｍ）、さらに５単位のクレノー断片（全
酒造社製）を加えて室温で１時間反応させた。シェノー
ル抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により
、ＤＮＡ断片約６．０■を回収した。該ＤＮＡ断片６．
０■を全量１２０ｊＩＩｌのＹ−１００緩衝液に溶かし
、１ｇ単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で３時間切断反
応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、ＵＬ−Ｃ
ポリペプチドのＮ末端の一部を除く全領域を含む約９５
０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂｇｊ！ＩＩ（部分切断）−クレ
ノー断片−ＢａｍＨＩ断片〕約０．１■を得た。

別に、ｐＧＥＬｌ　　２■をＹ−１００緩衝液４０誠に
溶かし、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＰｓｔＩおよびＢａ
ｍＨＩそれぞれ４単位ずつを加え３７℃で３時間切断反
応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、リポプロ
ティン由来ターミネータ−を含む約１．７　Ｋ　ｂのＤ
ＮＡ断片（Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ−Ｂ　ａｍＨ１断片）約０．
７■を得た。

また、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　３■をＹ−１００緩衝液６０Ｊ
ｉ！ｌに溶かし、制限酵素ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績社
製）とＰｓｔＩをそれぞれ６単位ずつ加え３７℃で３時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりト
リプトファンプロモーター（Ｐ　ｔ　ｒ　ｐ）を含む約
１．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（Ｂａ　ｎＩＩＩ−Ｐ　
ｓ　ｔ　Ｉ断片）約０．６■を得た。

一方、該生理活性ポリペプチド（ＵＬ−Ｃ）のＮ末端で
あるＭｅ　ｔ　（ＡＴＧ）から、２番目のアミノ酸であ
るＧｌｎ　（ＣＡＧ）の２番目の塩基（ＣＡ）までを付
与する必要があること、またＰｔｒｐ下流のＳＤ配列と
ＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な長さにす
る必要があることなどの理由から、下記のＤ　Ｎ　Ａ　
、！ｊンカーを合成した。

まず、−木調ＤＮＡ、１３−ｍｅｒ　と１５−ｍａｒを
通常のトリエステル法により合成した。１３−ｍａｒお
よび１５−ｍａｒの各２０ピコモルを５０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、　　１０ｍＭ　　Ｍｇ
ＣＬ　。

５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡお
よび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量４０μＱの溶液に溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）１単
位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たＩ）ＬＧＣ：５ｃｌｌ由来のＢｇｆＩＩ
（部分切断）−クレノー断片−１３ａｍＨＩ断片（約９
５０ｂｐ）０，１ｘとｐＧＥＬ１由来のＰｓｔｌ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（約１．７Ｋｂ）０．１／Ｉｇおよび発現ベ
クターｐＫＹＰ１０のＢａｎＩ［−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片（
約１．ＩＫｂ）０．３／７１ｇをＴ４リガーゼ緩衝液２
０ρに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡＩＪンカーを約
１ピコモル加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ５０単位を加え、４℃で１８時間反応を行った。

組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐ’のコロニーを得た
。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収
した。得られたプラスミドの構造は制限酵１ＥｃｏＲＩ
、Ｂｇｊ！ＩＩ、ＢａｍＨＩて切断後、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により確認した。このプラスミドをｐ
ＬＧＣ−ｘｌとよぶ。ｐＬＧＣ−ｘｉのＨｉｎｄｌ］ｌ
付近の塩基配列は下記のとおりであることをデイデオキ
シ・シークエンスミ去で確Ｓ忍した。

実施例１１゜ ｐＬＧＣ−ｘｌを保有する大腸菌による該生理活性ポリ
ペプチド（ＵＬ−Ｃ）の生産：実施例１０で得た組換え
体プラスミドｐＬＧＣ−ｘｌを持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ
８株［ｐ　ＬＧＣ−ｘｉを保有するＣ６００ＳＦ８株を
ＥＬＧＣ−ｘｌと命名する］をＬＧ培地〔バクトドリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ２　５ｇ、グル
コース１ｇを水１１に溶かし、ＮａＯＨにてｐＨを７．
０とする。〕で３７℃、１８時間培養し、この培養液Ｑ
、５ｍｌを２５ｇ／ｍｌのトリプトファンと５０■／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地１０ｍ１に接種し、
３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質
である３β−インドール−アクリル酸（３β−１ｎｄｏ
ｌｅａｃｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ、　以下ＩＡＡと略す）
を１０■／ｌＴｌ１になるように加え、さらに２〜１２
時間培養を続けた。培養液を８．００　Ｏｒｐｍ。

１０分間遠心して集菌し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄菌体
をＰＢＳ　　５ｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕（ＢＲ
ＡＮＳＯＮ　５ＯＮＩＣＰＯｌｌＥＲＣＯＭＰＡＮＹ社
Ｓ［］ＮＩＰＩＩＥＲＣＥＬＬ　ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ２
００，０１ｌＴＰＵＴ　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ　２．１０分間
処理）した。これを１５．０００ｒｐｍ、３０分間遠心
分離することにより該生理活性ポリペプチドを上清に分
離抽出した。０．４５ｐ省フイルター（日本ミリボア・
リミテッド社製）を用いて除菌した後、実施例３に記載
されている方法に従って細胞増殖促進活性の測定を行っ
た。測定結果は第７表に示した。

第　　　　７　　　　表 実施例１２゜ 組換え体プラスミドｐ、５ＥＡ−ｅｌの造成：ｐＡＧＥ
　１０３　（４，Ｉ　Ｋｂ）をもつ大腸菌Ｃ６００ＳＦ
８株（ＥＡＧＥｌ　０３）を培養し、培養菌体から常法
によりｐＡＧＥｌ　０３ＤＮＡを調製した。得られたｐ
ＡＧＥ１０３ＤＮＡ　　２■をＹ−１００緩衝液３０Ｉ
ＩＩｌに溶かし、ＨｉｎｄｌｌＩと１３ａｍＨＩそれぞ
れ４ｊ１位ずつを加え３７℃で２時間切断反応を行った
。この反応液からＬＧＴ法によりＳＶ４０初期プロモー
ター（Ｐｓｉ）を含む４．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（
Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ−ＢａｍＨ１断片）約１μｇを得た
。

また、ｐＬＧＡ−ｅ　１　（３，３Ｋｂ）をもつ大腸菌
Ｃ６００３Ｆ８株（ＥＬＧＡ−ｅｌ）を培養し、培養菌
体から常法によりｐＬＧＡ−ｅｌＤＮＡを調製した。得
られたｐＬＧＡ−ｅｌＤＮＡ　　３ｕをＹ−１００１衝
液４０ｍに溶かし、ＨｉｎｄＩＩ［とＢａｍＨＩそれぞ
れ６単位ずつを加え３７℃で２時間切断反応を行った。

この反応液からＬＧＴ法により該生理活性ポリペプチド
遺伝子を含む約５６０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈｉ　ｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片）約０．２■を得た。

次に上記で得たｐＡＧＥ１０３由来のＨｉｎｄｌＩ［−
ＢａｍＨＩ断片（約４．ＩＫｂ）０．５ｇとｐ　ＬＧＡ
−ｅｌ由来のＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約５６
０ｂｐ）０．１７４ｇを全量２０４のＴ４リガーゼ緩衝
液に溶かし、Ｔ　４　ＤＮＡ　’）ガーゼ２単位を加え
、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株を形質転換し、カナマイシン耐性のコロ
ニーを得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤ
ＮＡを回収し、Ｉ）ＳＥＡ−ｅｌを得た。ｐＳＥＡ−ｅ
ｌの構造は、ＨｉｎｄＩＩＩ。

ＸｈｏＩ、ＰｖｕＩｌ、ＢａｎｎＩで切断後、アカロー
スゲル電気泳動により確認した。

実施例１３゜ ｐＳＥＡ−０１を保有する動物細胞による該生理活性ペ
プチドの生産； ｐＳＥＡ−ｅｌおよびｐＳＶ２−ｄｈｆｒのｄｈｆｒ欠
損ＣＨＯ株への導入はリン酸カルシウム法に準じて行っ
た。すなわち、ＦＣ３を１０％。

７．５％Ｎ　ａ　ＨＣＯ３溶液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ社製）を１１５０！、１００×非必須ア
ミノ酸溶液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製
）を１　／１００量加えたＭＥＭ　　ＡＬＰＨＡ培地（
リボ核酸およびデオキシリボ核酸含有；ギブコ・オリエ
ンタル社製）〔以下、この培地をＭＥＭα（非選択培地
）と略記する）　５ｍｌに１×１０５細胞／ｍ　ｌにな
るように細胞を接種し〔培養には直径６ｃｍのデイツシ
ュを使用した；　ＬＵＸ社製（以下、培養にはＬＵＸ社
のデイツシュを用いた）〕、３７℃、ＣＯ□インキュベ
ーターにて１日間培養した。一方、ｐＳＥＡ−ｅ　ＩＤ
ＮＡｌ　０１１ｇおよびｐＳＶ２−ｄｈｆｒＤＮＡ　　
１ｇを４５０薦のｌｏｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７，５）溶液に溶解し、この溶液に５００４の２８０ｍ
Ｍ　　ＮａＣｊ！、１．５ｍＭＮａ、ＨＰＯ，，５０ｍ
Ｍ　　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジン−Ｎ’　−２−二タンスルフォン酸）（ｐＨ７，１
）を含む溶液を加えて混合した。さらに、５０ρの（２
，５Ｍ）　Ｃａ　Ｃｊ！　２溶液を加えて混合し、室温
で５分間静置した。このＤＮＡ溶液全量を、培地を除き
新しいＭＥＭα（非選択培地＞ｌｏｍ＋を加えてさらに
１時間培養したｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ株に添加し、８時間
インキニベートした。ＰＢＳで細胞を洗浄し、５＋ｎｌ
のＭＥＭα（非選択培地）を加えて１６時間培養した。

細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン。

０．０２％ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸〉を含
む溶液３ｍｌを加え、余分の溶液を除いた後、３７℃に
５分間インキ二ベートしたくトリプシン処理）。

透析ＦＣ３（ギブコ・オリエンタル社製）を１０％、７
．５％ＮａＨＣＯａ溶液を１１５０１．　１００×非必
須アミノ酸溶液を１　／１００量、Ｇ４１８（ギブコ・
オリエンタル社製）を０．３　ｍｇ／ｍｌになるように
加えたＭＥＭ　　ＡＬＰＨＡ培地（リボ核酸およびデオ
キシリボ核酸不含有）〔以下、この培地をＭＥＭα（選
択培地）と略記する〕を加えてよく細胞を懸濁し、直径
１０ｃｍのデイツシュを用い、３７℃、Ｃ０ｗインキュ
ベーターにて５日間培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し、
ＭＥＭα（選択培地）を加えて５日間培養した。同様の
操作をして、さらに５日間培養した。ＰＢＳで細胞を洗
浄した後、トリプシン処理し、１０ｍ１のＭＥＭα（選
択培地）を加えて細胞を懸濁し、直径１０ｃｆｆｌのデ
イツシュを用い、３７℃、ＣＯ２インキニペーターにて
７日間培養した。トリプシン処理した後、各１０１′Ｉ
ｌｌのＭＥＭα（選択培地）を用いて細胞濃度５Ｘ１０
’　〜ＩＸＩ　Ｑ’／ｍ＋になるように直径ｆｏｃｉの
デイツシュ１枚に植え込んだ。細胞は、４日間培養後ト
リプシン処理し、ＭＥＭα（選択培地）１２ｍｌを含む
直径１５ｃｍのデイツシュに植え継いでさらに４日間培
養した。細胞を洗浄後、０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、
テフロンホモゲナイザーにて細胞を破砕後、１２．００
Ｏｒｐｍ。

２０分間遠心して得られる上清を活性測定に供した。

細胞増殖活性の測定は、実施例３に記載の方法に従って
行った。結果を第８表に示した。

第　　　　８　　　　表 参考例１゜ 骨髄性白血病細胞株に５６２−７１株を８×１０５個／
ｍｌの濃度で、８１の下記培地を含む２Ｏｆ大型スピン
ナフラスコに入れ、３７℃で３日間培養した。培地は、
基礎培地として、ハムーＦＩＯ培地（フローラボ社製）
およびダルベツコらのＭＥＭ培地（日永製薬社製）を３
：１の比率で混合したものに、ピルビン酸（５ｍＭ）、
　亜セレン酸（１，２５Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ）　、ガラク
トース（１ｍｇ／ｍｌ）　、　グルタミン（４ｍＭ）、
ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）　、　ｘトレプトマイシン
（２５μｇ／ｍｌ）および重曹（０，０１％）を加えた
無蛋白培地を用いた。培養物上清１２０βをホローファ
イバー（分子量カット−３０００，アミコン社製）を用
い約１０　Ｑｍｌに濃縮した。濃縮物約１０　Ｑｍｌを
１％酢酸を用い、４℃、２４時間透析した。生じた沈殿
物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）で除き
、上清を酢酸除去のために凍結乾燥し粉末を得た。これ
を蒸留水１２　Ｑｍｌに溶解した。

１６　Ｑｍｌ容量のＱＡＥ　−３ｅｐｈａｄｅｘ−Ａ５
　　（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）カラム
に上記で得られた溶液を６０ｍ１ずつ二度に分けて通塔
した。ＰＢＳ　　１５０＋ｎｌで溶出し、さらに０．１
％の酢酸１９　Ｑｍｌで溶出し、ＰＢＳで溶出した活性
画分３０　Ｑｍｌを得た。活性回収率は、約８．３％で
あり、活性は１．９倍に上昇した。

この活性画分３０　Ｑｍｌを凍結乾燥し、２０ＩＴ１１
の蒸留水に溶解し、Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ　−６０４００ｍ
（を含むカラムにＳ　Ｖ　５．０で２回に分けて通塔し
た。ＰＢＳで溶出し、溶出液を５ｍｌずつに分画し、４
１〜４５番目の画分６０１１を得た。活性の回収率は１
．７％で、比活性は１３．３倍に上昇した。この活性画
分をファルマシア・ファイン・ケミカル社製ＦＰＬＣ（
Ｆａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ）　　Ｍｏ　ｎ　。

３　５ｍｌを含むカラムに通塔した。ＰＢＳで洗浄し、
０〜０．５Ｍ食塩水で溶出した。溶出液を１ｍｌずつに
分画し、５３番目の両分に活性が認められた。活性の回
収率は０．２％で、比活性は３６００倍に上昇した。

上記精製工程の結果は第５表のとふりである。

第　　　　５　　　　表 アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製４７０Ａ型シ
ーケンサ−およびスペクトラ・フィジクス（Ｓｐｅｃｔ
ｒａＰｈｙｓｉｃｓ）社製　高速液体クロマトグラフィ
ーとの組合せによってＮ末端側３０アミノ酸まで決定し
た。すなわち、 Ｎｅｔ−Ｇ　Ｉｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａ　Ｉ−Ｌ　ｙ
ｓ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌ　ｙ
ｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｖａ
　］−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ−１１ｅ−Ｘ
−Ａｓｎ−Ｖａ］−Ｘ−Ａｌａ−Ｘ−１１ｅ−（Ｘは未
同定アミノ酸を示す。） であることが判明した。

発明の効果 本発明によれば、ヒト骨髄性白血病細胞株に５６２−Ｔ
Ｉ株の産生ずる新規生理活性ポリペプチドをコデドする
ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡ
を含む微生物が得られ、これらは該生理活性ポリペプチ
ドの大量生産に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法によるｃＤＮＡ合
成と、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過程の
概略を示す。 第２図はｐＬＧＡ８．ｐＬＧＢ１２．ｐＬＧＣ１５に含
まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第３図は、プラスミドｐＬＧＢ−ａｌの造成工程を示す
フローシートである。 第４図は、プラスミドｐＬＧＢ−ｄ２の造成工程を示す
フローシートである。 第５図は、プラスミドｐＬＧＡ−ｄ５の造成工程を示す
フローシートである。 第６図は、プラスミドｐＬＧＡ−８１の造成工程を示す
フローシートである。 第７図は、プラスミドＴ）ＬＧＣ：５ｃｌｌの造成工程
を示すフローシートである。 第８図は、プラスミドｐＬＧＣ−ｘｌの造成工程を示す
フローシートである。 第９図は、プラスミドｐＳＥＡ−ｅｌの造成工程を示す
フローシートである。 Ｕ 区 ２．８Ｋｂ　　　　　　　　　　　　　　４００ｂｐ第
６図 ＦＢａｎ［［＋Ｐｓｔｌ　　　　　　　　　　　１Ｂａ
ｎ［ｌ　＋Ｐｓｔ１２．２Ｋｂ　　　　　　　　　　　
　　　　１．　ＩＫｂ第７図 第８図 第９図 ｖｕＩＩ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）第２表、第３表および第６表に示したペプチド配
   列から選ばれるペプチド配列を有するポリペプチド。
2. （２）第３表に示したペプチド配列を有するポリペプチ
   ドを構造の一部として有する蛋白性物質。
3. （３）ヒトＢリンパ球系細胞に対する増殖促進作用を有
   するポリペプチドである特許請求の範囲第１項または第
   ２項のポリペプチド。
4. （４）第２表、第３表および第６表に示したペプチド配
   列から選ばれるペプチド配列を有するポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。
5. （５）第２表、第３表および第６表に示したペプチド配
   列から選ばれるペプチド配列を有するポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。
6. （６）プラスミドｐＬＧＡ８、ｐＬＧＢ１２またはｐＬ
   ＧＣ１５と名づけた特許請求の範囲第５項の組換え体Ｄ
   ＮＡ。
7. （７）第２表、第３表および第６表に示したペプチド配
   列から選ばれるペプチド配列を有するポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生
   物または動物細胞。
8. （８）該微生物がエッシェリヒア・コリに属する特許請
   求の範囲第７項の微生物。
9. （９）ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＥＬＧＡ８、Ｅ
   ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＥＬＧＢ−ａ１またはＥ
   ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＥＬＧＣ１５である特許
   請求の範囲第８項の微生物。
10. （１０）第２表、第３表および第６表に示したペプチド
    配列から選ばれるペプチド配列を有するポリペプチドを
    コードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微
    生物または動物細胞を培地に培養し、培養物中に該ポリ
    ペプチドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを
    採取することを特徴とするポリペプチドの製造法。
11. （１１）プラスミドＤＮＡとしてトリプトファンプロモ
    ーターまたはＳＶ４０初期プロモーターを有するプラス
    ミドＤＮＡを用い、該ＤＮＡ断片が該プラスミドＤＮＡ
    のプロモーターの下流に組み込まれたことを特徴とする
    特許請求の範囲第１０項記載の製造法。
12. （１２）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
    許請求の範囲第１０または１１項記載の製造法。