JPH01501840A

JPH01501840A - 繊維芽細胞成長因子の産生

Info

Publication number: JPH01501840A
Application number: JP88501259A
Authority: JP
Inventors: バンクス，アリン・アール．; フオツクス，ゲーリー・エム．
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1987-01-16
Filing date: 1988-01-13
Publication date: 1989-06-29
Also published as: DK510388D0; CA1323317C; EP0275204A2; FI884252A; PT86558B; WO1988005465A1; NZ223198A; FI884252A0; EP0275204A3; PT86558A; DK510388A; AU1185488A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１ｉ維芽細胞成長因子の産生本発明は、大腸菌宿主株内での組換え塩基性！！雑雑報細胞成長因子産生方法に係わる。特に、本発明は大腸菌宿主株内での組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ヒトｒ　−ｂＦＧＦ）の産生方法及び該因子をコードするポリヌクレオチドに関する。

先　行　技　術繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　ニよ゛ツテＮａｔｕｒｅ　、　２４９．１２３　（１９７４）に初めて、牛の脳又は下垂体組織由来の、１！帷芽ｌＩｌ胞及び内皮細胞に対するマイトジェン効果を有する活性物質として報告されたものである。その後、脳由来のこの初代マイトジェンは下垂体から単離されたものとは異なるものであることが判明した。

これら二種類の物質は、生物学的活性は同一ではないが互いに類似しており、等電点が異なっているため、夫々、酸性及び塩基性ＦＧＦと呼ばれている。引き続いて、塩基性ＦＧＦに非常に良く似ているか又は同一である他の内皮細胞マイトジェンが様々な＠織及び腫瘍から単離された。例えば、肝がん由来成長因子（にＩａｇｓｂｒｕｎ他、ＰＮＡＳ、　８３．２４４８−２４５２　（１９８６）及びＬｏｂｂ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ、　２３．６２９５−６２９９　（１９８４））　、軟骨肉腫由来成長因子（Ｓｈｉｎｇ他、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２３．１２９６−１２９９　（１９８４））　、β−網膜由来成長因子（Ｂａｉｒｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋＋１ｓｔｒｙ、　２４．７８５５−７８６０（１９８５））　、軟骨由来成長因子（Ｓｕｌｌｉｖａｎ及びにＩａｇｓｂｒｕｎ、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６０．２３９９−２４０３　（１９８５））　、星状膠細胞成長因子２　（Ｐｅｔｔｌａｎ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１８９．１０２−１０８）、眼由来成長因子（ｃｏｕｒｔｙ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、　６７、２６５−２６９８　（１９８５））　、カチオン性視床下部由来成長因子（にｌａｇｓｂｒｕｎ及びＳｈｉｎｇ、　ＰＮＡＳ、　８２．８０５−８０９　（１９８５））、クラス２及びβヘパリン結合成長因子（ＬＯｂｂ及びＦｅｔｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３．６２６５−６２９９　（１９８４）　；　Ｌｏｂｂ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２４．　４９６９−４９７３　（１９８５）　：　Ｌｏｂｂ他、　ＢＢＲＣ，１３１，５８６−５９２（１９８５）；　Ｌｏｂｂ他、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、、２６１．１９２４−１９２８（１９８６））　。

及びマクロファージ由来成長因子の成分（Ｂａｉｒｄ他、ＢＢＲＣ，１２６゜３５８−３６ｊｌ　（１９８５））等を挙げることができる。以上列記したものは全て、ヘパリンに強固に結合するという塩基性ＦＧＦの性質を有しており、かつ全て塩基性タンパクである。ヘパリン結合性因子である類似群、典型的には、例えば酸性ＦＧＦも同様に発見されている。この群に属する分子は、低塩化ナトリウム濃度下でヘパリンから溶離し酸性の等電点を有している。これらの因子がヘパリン結合を有しているが故に、その精製は容易であり、幾つかのものについてはアミノ酸配列分析をするに充分足る船のタンパクを単離することを可能にした。このように、ヘパリンを使用することによってＦＧＦの精製を容易に行なうことができるが、六Ｍ模な精製操作に於いては、費用がかかりすぎること、ヘパリンにより汚染されている可能性があること、及びヘパリンに対する不可逆的結合による収率低下の理由によって、ヘパリンを用いることはのぞましくない。酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦは恐らく同じ系統の遺伝子由来のものであり、アミノ酸配列に於いて５５％の相同性を有し、同じイントロン／エクソン構造を有している。サザンプロットによって酸性及び塩基性ＦＧＦに対する遺伝子は夫々一つだけであることが示唆されている。異なる組織から単離された分子間の差違は恐らく翻訳後のプロセシングに依るものと思われる。この二種類のＦＧＦの生物学的活性領域は同一であるが、塩基性ＦＧＦは酸性ＦＧＦと比較してほとんどのバイオアッセイ系に於いて約１０倍の活性を示す。

塩基性ＦＧＦは、グリコジル化されていない分子量約１６，５００の単鎖タンパクである。塩基性ＦＧＦには４つのシスティン残基が含まれているが、それらがジスルフィド結合を構成しているか、又は構成しでいるとした場合のその数については知られていない。塩基性ＦＧＦについては、１５５個のアミノ酸から成る一次翻訳産物が考えられているが、下垂体組織中に見出される主な形態は１４６個のアミノ酸を有するものである。Ｎ末端長が異なっている幾種類かの分子最形態のものが種々の組織から単離されており、それらは全て生物学的活性を保持している。

ＦＧＦは等電点が９．６という極めて塩基性のタンパクである。

塩基性ＦＧＦはヘパリンに強固に結合し、１．６ＨＮａＧ！１１度近傍でヘパリンセファ０−ス力ラムから溶出される。ＦＧＦの生物学的活性は熱処理（７０℃ ）又は界面活性剤によって破壊される。

ＦＧＦは３７℃に於いてはかなりの長期間安定であると思われる。

ゲノム中では、この翻訳産物をコードする配列は二つのイントロンによって切断されていて、第１番目の切れ目（Ｓｐｌｉｔ）　６００番目コドンにあり、二番目の切れ目は９４及び９５番目のコドンを分離するものである。ゲノムコード領域の全長は明らかにされていないが、少なくとも３４ｋｂである。塩基性ＦＧＦの遺伝子は第４染色体上に位置している。

塩基性ＦＧＦの配列に関するデータはＢｏｈｌｅｎ他によってＰＮＡＳ。

８１、５３６４−５３６８　（１９８４）に最初に発表され、これは牛の下垂体組織から精製された物質のＮ末端１５個のアミノ酸について得られたものである。その後、Ｅｓｃｈ他はＰＮＡＳ、　８２．６５０７−６５１１　（１９８５）に、年下垂体由来の塩基性ＦＧＦの全配列を報告し、同時にこれを酸性ＦＧＦのＮ末端配列と比較している。国際特許出願第Ｗ　Ｏ８６／　０７５９５には大腸菌内に於ける中塩基性ＦＧＦの産生について開示されている。しかしながら、報告されている収率は極めて低いものである。牛の塩基性ＦＧＦの遺伝子のクローニングについては、Ａｂｒａｈａｍ他によって５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３．５４５−５４８に最初に報告されており、その後、同じ蕃者によってそのヌクレオチド配列及びヒト塩基性ＦＧＦのゲノム構造が明らかにされている（ＥＨＢＯＪ、、　５．２５２３−２５２８　（１９８６））。牛由来の塩°基性ＦＧＦとヒト由来の塩基性ＦＧＦとは豆いにアミノ酸が２つだけ異なっているにすぎない。

高度にＮ製された塩基性ＦＧＦ調製物は最近になってようやく試験用に入手可能になったが、様々なＮ製段階の物質を用いて、これまでにも数多くのイン・ごトロ研究がなされてきた。

これらの研究を通じて、ＦＧＦが中胚葉を起源とする広範囲な細胞に対するマイトジェンとして作用し得るものであって、内皮細胞及び繊維芽細胞に対して走化作用を示す（ＣｈｅｌＯｔａＣｔ　ｉＣ）ことが判明した。加えて、天然及び組織由来の組換え塩基性ＦＧＦはウサギ角膜及びひよこ漿尿膜を用いたアッセイに於いて血管新生を誘発することが判った。従って、ＦＧＦは傷の癒着を促進させるために使用し得るものである。Ｆｏｕｒｔａｎｉｅｒ他はＪ。

ｌｎＶ、　Ｄｅｒｌ、、　８７．７６−８０　（１９８６）に、牛網膜由来の１１Ｍ物がテンジクネズミの水Ｎ　（ｂｌｉｓｔｅｒ）モデルに於ける傷の癒着を促進し、血管新生及び再上皮化（ｒｅｅｐｉｔｈｅｌ　１ａｌｉｚａｔｉｏｎ）を刺激し臀ることを報告している。ＤａＶｉｄＳＯｎ他はＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１００．１２１９−１２２７　（１９８５）に、ラット創傷モデルに於いて、牛軟骨（ｂｏｖｉｎｅｃａｒＨｌａｇｅ）由来因子によって、顆粒組織及びコラーゲン蓄積の増加を伴う傷の修復促進が誘発されることを報告している。

同様に、ＢｕｎｔｒＯＣｋ及び彼の共同研究者によって、牛の脳組織抽出物を用いることにより、ラットに於ける傷の１！肴促進に伴って顆粒組織及び血管新生が増加することがＥｘｐ、　Ｐａｔｈ、、　２１．６２−６７　（１９８２）に報告されている。

＆一旦−色一里−１本発明は、天然ヒト塩基性繊維芽Ｉ胞成長因子の一次構造フンホメーションの全て又は一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチドの産生方法であって、（ａ）　適当な栄養条件下で、ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の一次構造コンホーメーションの全て又は一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチドを大腸菌宿主発現用にコードするＤＮＡ配列、調節プロモーター配列、及び温度誘導性コピー数調節遺伝子を含むＤＮＡプラスミドベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を増殖し、（ｂ）　前記ベクター内のＤＮＡ配列の発現による所望ポリペプチド産生物を単離し、（Ｃ）　該所望ポリペプチド産生物を精製する、ことから成る前記方法に係わるものである。

本発明はまた、ヘパリン非含有クロマトグラフィ系を用いた、大腸菌からの組換え塩基性繊維芽細胞成長因子の精製に関するものである。

本発明は更に、ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の全て又は一部をコードするＤＮＡ配列を提供するものである。これらの配列は、好ましくは、大腸菌宿主株によって選択される発現用「優先コドン」　（大腸菌発現コドン）が導入されており、更に制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂部位が供給されており、そして発現容易なベクターを容易に構築するための開始、終結又は中１ｍＤＮＡ配列を付加的に有しているものである。

本発明の新規なりＮＡ配列は、天然塩基性繊維芽＠胞成長因子の一次構造フンホメーションの少なくとも一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチド産生物を大腸菌宿主細胞内で発現させるのに使用し得るＤＮＡ配列である。

該ＤＮＡ配列は、特異的には、（ａ）　第■表に記載のＤＮＡ配列又はその相補鎖：（ｂ）　第■表に記載のＤＮＡ配列又はその断片と本明細書に記載のハイブリダイゼーション条件下又はよりストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列：及び（Ｃ）　遺伝コードの縮重がないとしたら、第１表に記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズし得るＤＮＡ配列を含むものである。上記（Ｃ）が特異的に意味するものは、微生物宿主内の伝令ＲＮＡの１訳を促進するコドンを含有する、塩基性Ｍｉｌｌ芽細胞成長因子をコードする人よりＮＡ配列である。

こうした人工配列は、公開された国際出願Ｗ　Ｏ８３／　０４０５３に記載のＡｌｔＯｎ他の方法によって容易に構築することができる。

本発明は、天然塩基性繊維芽細胞成長因子及びその対立遺伝子変異体の一次構造コンホメーション（即ち、アミノ酸残基の連続配列）の一部又は全て、それらの生物学的性質（例えば、免疫学的性質及びイン・ヒドロ生物学的活性）の一つ又はそれ以上及び物理的性質（例えば、分子量）を有するｉ製・単離ポリペプチド産生物を提供するものである。

これらのポリペプチドは、遺伝子合成によって得られた外来性ＤＮＡ配列の大腸菌宿主発現産生物であるということによっても特徴付けられるものである。大腸菌宿主細胞によって発現された本発明のポリペプチド産生物は哺乳動物由来の如何なるタンパクとも共存していないものである。加えて、本発明ポリペプチドは開始メチオニンアミン酸残基（第２図中１番目の位置にある）をも含むものである。

本発明は更に、種々の複製可能クローニングベヒクル、発現ベヒクル及び形質転換大腸菌培養物に係わる。これらのものは全て、大腸菌に組換え塩基性繊維芽ｉｔ胞成長因子の産生を°行なわせるのに必要な変更された遺伝情報を所有しているものである。

図面の簡単な説明第１図は、ｂＦＧＦ遺伝子アセンブリ及びそのクローニングを概略的に表わしたものである。

第２図は、組換えｂＦＧＦのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。実線で描かれた四角形は、牛ｂＦＧＦ遺伝子をヒトｂＦＧＦをコードする遺伝子に変換させるための部位特異的突然変異によって生じるヌクレオチド変化及びその結果であるアミノ酸変化を示すものである。

第３図は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するｂＦＧＦのマイトジェン活性を示すグラフである。（・）はヒトｂＦＧＦを（０）は牛ｂＦＧＦの前記活性を示す。ｂＦＧＦの投与量は、３Ｈチミジン取込みによって測定されるＤＮＡ合成の最大刺激に対する百分率でプロットされている。

詳　細　な　説　明寒明ＩＩＩ中、「組織由来！Ｉ性ｌｌ雑芽細胞成長因子」とは、腫瘍、培養真核ｍ胞及び正常組織等から得られる塩基性１１１ｆｆｌ芽細胞成長因子を意味する。

本明細書中、ＤＮＡ配列又は遺伝子に関して使用される「人工」という用語は、ヌクレオチド塩基の集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）によって完全に化学的に合成されるか、又はこうして化学的に合成された生成物の生物的複製によって得られる産生物を意味するものである。このように、「人工」という用語は、元々生物的起源である出発物質を含むゲノムクローニングによるｃＤ　Ｎ　Ａ方法によって合成される産生物は排除するものである。

本明細書中、「対立遺伝子変異体（型）」という用語は、本発明のｂＦＧＦアナログの生物学的活性を変えることなく、そのアミノ酸配列のうちの一つ又はそれ以上を修飾することを意味する。こうした対立遺伝子変異体は当業者によって容易に製造・確認することができる。

大腸菌による朝換え塩基性ＦＧＦは以下の一般的な手法によって製造することができる。

Ｅｓｃｈ他によってＰＮＡＳ、　８２．６５０７−６５１１　（１９８５）に発表された牛の塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列に基づいて大腸菌内発現用の人よりＦＧＦ遺伝子を合成した。この人工遺伝子のヌクレオチド配列は、大腸菌によって最も頻発に用いられるコドンを含み、さらにクローニングの目的に使用するために便利な１限酵素部位を含むものである。この人工遺伝子の例を第工表及び第■ 表に示す。第１表は牛のｂＦＧＦに対する人工遺伝子を、第■表はヒトｂＦＧＦに対する人工遺伝子を夫々示している。該遺伝子の画鋲に対応するオリゴヌクレオチドを重複する領域で合成し、二つの大きなセクションにハイブリダイゼーションよって集合させ、その後連結させた。この二つの大きなセクションを適当なファージベクター（即ち、Ｍ１３＠ｐ　１８）内でクローニングししてヌクレオチド配列の分析に供した。このようなファーベクターは当業者には公知のものであって容易に入手可能である。

配列が正しいことを確認した上で、二つのセクションを制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲルで単離し、適当な発現ベクターと連結した。前記プラスミド上にコードされているｂＦＧＦ遺伝子の発現は、発現ベクター上に位１１Ｆする調節プロモーター配列及び温度誘導性コピー数調節遺伝子によって調節される。

本明ｗＡ！中、「調節プロモーター」とは、Ｐ１プロモーター類及び短縮されたＰ、プロモーターを意味する。このような調節遺伝子類を有する発現ベクターは、欧州特許出願用１３６．４９０号に開示されている。大腸菌宿主株内でこのプラスミドを増殖させると本発明のポリペプチド産生物が得られた。ｂＦＧＦを含有する細胞を溶解し低速遠心にかけると、上溝画分にｂＦＧＦの約７０％が可溶形態で見出される。ヘパリン非含有クロマトグラフィ系、即ち、アフィニティクロマトグラフィを用いてｆｉＨすると、実質的にエンドトキシンを含まずＤＮＡによる汚染も見られない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により純度が少なくとも９５％であると推定されるポリペプチド産生物が得られる。このようにヘパリン非含有クロマトグラフィ系を使用することによって、精製ｂＦＧＦの収率を高め、ヘパリンに帰因する汚染物質混入の可能性を回避することができるのである。

大腸菌内で発現された組換えｂＦＧＦ　（ｒ−ｂＦＧＦ）は、ヘパリンのＦＧＦ結合活性に依らないクロマトグラフィ系を用いて精製される。好適には、大腸菌由来のｒ−ｂＦＧＦはヘパリン非含有アフィニティクロマトグラフィカラムを用いて［Ｊする。

前述の如く、牛及びヒトｂＦＧＦは互いに２つのアミノ酸が異なっているだけである。牛ｂＦＧＦをコードする遺伝子を部位特異的突然変異によってヒトｂＦＧＦ遺伝子に変換した。ヒト及び牛のｂＦＧＦ遺伝子は極めて類似しているので、牛ｂＦＧＦについて開発された［ｉ手順はそのままヒトｂＦＧＦｔ１Ｍにも利用できる。

本発明の大腸菌由来ｒ−ｂＦＧＦのマイトジェン活性は、細胞分裂期のＤＮＡ合成増加を伴うマウス３Ｔ３細胞による放射標識チミジンの取込みの増加に基づくマイトジェンアッセイを用いて測定した。大腸菌由来ｒ−ｂＦＧＦの血管形成（新生）活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、ひよこ漿尿膜アッセイによって測定した。これらの結果から、０．４５％メチルセルロース中に調製し乾燥させた本発明の大腸菌由来中ｒ−ｂＦＧＦ（１１Ｉ９）は検出し得るだけの上記血管形成活性を示さなかった。同様に調製した天然ｂＦＧＦは同投与量で内管形成活性を上記アッセイに於いて示した。

しかしながら、同様に：Ｉ製した本発明の大腸菌由来中ｒ−ｂＦＧＦは同投与量でも、天然の塩基性繊維芽細胞成長因子と同様に、毛管内皮細胞に対してマイトジェン活性を保持している。この驚くべき結果については、多くの因子をその理由として考えることができる。大腸菌由来のｒ−ＦＧＦポリペプチドがマイトジェン活性は保持し得るが血管形成活性は保持し得ないような様式で折畳まれた可能性があろう。また、組織由来ＦＧＦ調製物には汚染物質が混入していた可能性があり、この汚染物質が報告されている組織由来ＦＧＦの血管形成特性を担っていることも考えられる。第三番目の可能性としては、ＦＧＦの一次翻訳産物のある断片が血管形成活性を担っているということである。いずれの汚染物質も、それが元の分子の断片でない限り、血管形成に関与するその汚染物質が組織のまったく同じ範囲に見出されそしてあらゆる場合に一緒に精製されるということは考えにくいことである。

実施例　１シｂＦＧＦをコードしている人造遺伝子の製造に関する。組換ＦＧＦ産物をコードしている人造遺伝子を製造するのに使用した実験手順（プロトコール）は、Ａ　Ｉ　ｔｏｎらのＰＣＴ公開第ＷＯ３３１０４０５３（引用によって本明細書中に含ませる）の開示中に一般的に記載されている。これらの遺伝子は、最初に成分のオリゴヌクレオチドを多数の二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）に組み立て、次にこれを組立てて２個の別々の部分とするように設計した。これらの部分は容易に増幅できるように設計されており、増幅系から取り出した際、継続的に、または多断片連結によって、適切な発現ベクター内に組立てることができた。

ｉｌｌ芽細胞成長因子の第１の部分の組立て二表■に示した彫工部分の組立てに必要な１６種のオリゴマーを各々２００　ｐｉずつ測り取ってエツベンドルフチューブに入れ、高速真空ポンプで乾燥した。１０ｘ連結バツフア（５０Ｍへベス、ｐＨ７，６＞を３２４．１０ｍＨのＡＴＰをＯ０鷹、３　ｘ　１０７カウント／分／越の放射能標識したＡＴＰを１屑、および水を２６６４含有するキナーゼミックス３２０ＩＩｉを調製した。１０単位／／１ｌｌｊの激変の酵素キナーゼが２０４入ツテイるＢｏｅｈｒｉｎ（Ｈｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍキナーゼチューブ中で試薬を合わせた。このキナーゼミックスの試料を採取し、オリゴヌクレオチド２〜１５をそれぞれ入れたチューブ２〜１５の各々に入れた。オリゴヌクレオチド１と１６を入れたチューブには連結バッファだけを入れた。、２〜１５を入れたチューブを３７°で４５分間インキュベートした。この時間の経過後、各チューブから１７４４の試料を取り、Ｄ　Ｅ　８１．１片上にじみをつけ、０．３５Ｍギ酸アンモニウムで溶出し、液体シンチレーションカウンターで分析した。

液体シンチレーション分析によってカウントの半分以上が原点にあることが示されたので、２〜１５のオリゴヌクレオチドを含むチューブの各々に１０ｍＨのＡＴＰを２度ずつ加え、その後このチューブをさらに４５分間３７°でインキュベートした。この時間の経過後、全てのチューブを１０分間煮沸し、遠心し、合わせて二重鎖を作成した。すなわち、チューブ９をチューブ１に加え（二重鎖＃１）、チューブ１０をチューブ２に（二重鎖＃２）、チューブ１１をチューブ３に（二重鎖＃３）、チューブ１２をチューブ４に（二重鎖＃４）、チューブ１３をチューブ５に（二重鎖＃５）、チューブ１４をチューブ６に（二重鎖＃６）、チューブ１５をチューブ７に（二重鎖＃７）、そしてチューブ１６をチューブ８に加えたに１鎖＃８）、次に、これら８個のオリゴヌクバンドを認めることができ、連結が完全であることを示していた。７Ｍ尿素も含有している８％ポリアクリルアミドゲルを作成した。連結ミックスをエタノールで沈澱させ、乾燥した後８０薦の８０％ホルムアミド中に入れた。次に、この連結ミックスの半分を、ＨｐａＩｒで切断したｐＢ　Ｒ３２２のマーカーを含むレーンの隣の分取ｖＡ製用ゲル上に載せた。キシレンシアツール染料マーカーがゲルの底に到達するまでゲルを泳動処理した。次にこのゲルを電気泳動装置から外し、１枚のＫｏｄａｋ　Ｘ線フィルムに接するフィルムカセット内に入れた。このフィルムを現像してバンドを可視化し、隣りのレーンのｌ−１ｐａ■２４２マーカーのすぐ上にあるバンドを、繊維芽細胞成長因子の完全に連結された第Ｉ部分に対して期待される２４４塩基対のバンドと共に取り出した。このゲル片を注射器によってエツベンドルフチューブ内に押し出し、Ｈａｘａｉ＋　Ｇ１１ｂｅｒｔグル溶出溶液で覆い、 −晩３７°にインキュベートした。次に、このチューブの中身を注射器筒の中のガラス繊維フィルターによって濾過し、上清をトブタノールで三回抽出し、エタノールで沈澱させた。乾燥したベレットを、次に２００ＩｉｉのＴＥ中に入れ、遠心でチューブの底に沈澱するポリアクリルアミドの残渣を除去した後再度エタノールで沈澱させた。このエタノールで沈澱したサンプルは、約３７．０００カウント／分を含んでおり、この連結に必要とされたオリゴマーに対応する放射能に基づいて約１．５ρｍの二重鎖に相当していた。次に、これらの１．５１）！＋を、放射能標識したＡＴＰを３×１０７カウント／分含有する連結バッファ２０Ｉｉｉに溶解した。１７４４の試料を採り、ＤＥ８１細片上にしみをつけた。

次に、１／１１１のキナーゼを加え、チューブを３７′″で４５分間インキュベートした。この時点でチューブから１７４ハを採り、別のＤＥ８１細片上にしみをつけた。次にこれらの細片を０．３５Ｍギ酸アンモニウムで溶出した後、切片に分け、液体シンチレーションカウンターで計数した。

これら光の細片と後の細片は、カウントが最初の原点で取り込まれていたことを明白に示していた。したがって、このキナーゼ酵素反応（に１ｎａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、１０１のＡＴＰを１ρ添加して３７°で３０分以上インキュベートすることで完了することが明らかとなった。次に、キナーゼ反応混合物を５分間煮沸し、ゆっくり室温に冷却した。

同様にして繊維芽細胞成長因子の第■の部分を組立てた。表■に示した１２種のオリゴヌクレオチドを各々２００　ｐｉずつ測り取ってエツペンドルフチューブに入れ、高速真空乾燥した。

表　■ ＦＧ（−オリゴマー第ｌｌ−８Ｐ分８０％エタノールを１００成用いて乾燥を繰返した。キナーゼミックスをｖＡ製した。このミックスは、１０×連結バツフアを２４成、放射能で標識したＡ　Ｔ　Ｐ　（１，５Ｘ　１０７カウント／分／越）を２Ｊ１１．１０ｍＨのＡＴＰを０．５４、キナーゼを２０度、およびこのキナーゼミックスの全容積を２４０Ｉ１１とする水を１９３４含有していた。この混合物を２０ρずつ、キナーゼ処理するオリゴヌクレオチド１８〜２７をそれぞれ収容した各チューブに加えた。オリゴヌクレオチド１７と２８を入れたチューブには連結バッファだけを入れた。

次いでこれらのチューブを３７°で４５分間インキュベートし、この時点で各チューブから１７４ｐの試料を取り出し、ＤＥ８１細片上にじみをつけた。次に、ＤＥ８１１Ｂ片を０．３５Ｍギ酸アンモニウムで溶出し、液体シンチレーションカウンターでチェックして開始点でのカウント数を決定した。カウンターはキナーゼ酵素反応が進行中であることを示していた。この時点で各チューブに１０ｍＨのＡＴＰを１ρずつ加え、チューブをさらに４５分間３７℃でインキュベートした。これらのチューブを５分間煮沸した後遠心し、合わせて二重鎖を形成させた。オリゴヌクレオチド＃２３は＃１７と結合しく二重鎖＃１７）　、　＃２４は＃１８と（二重鎖＃１ｇ）　、＃２５は＃１９と（二重鎖＃１９）　、＃２６は＃２０と（二重鎖＃２０）　、＃２７は＃２１と（二重鎖＃２１）、そして＃２８は＃２２と（二重鎖＃２２）それぞれ結合した。次にこれらの二重鎖混合物を煮沸し、１時間かけてゆっくり室温に冷却した。次いで、二重鎖を合せてテトラマーを形成させた。二重鎖１７＋１８が結合してテトラマー１７を形成し、二重鎖１９＋　２０が結合してテトラマー１９を形成し、二重鎖２１＋２２が結合してテトラマー２１を形成した。これらを３７°で１０分間アニールした。各テトラマー混合物に１０ｉＨのＡＴＰを２４とＴ４　ＤＮＡリガーゼを２４加えた。３つの連結混合物を一晩４℃でインキュベートした。この時点でこれらテトラマーを含有する３個のチューブの各々から４ｇの試料を採り、７Ｍ尿素を用いて作成した１０％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。このゲルのオートラジオグラフィーによって、連結反応が進行中であることが示された。テトラマー１７と１９をプールし、１０ｉＨのＡＴＰ４／ＩＩｉと共にリガーゼ４成を加えた。次いで、この連結混合物に最後のテトラマーを加える前に、この８片連結混合物を３７°で１５分間、そして４°で６時間インキュベートした。この時点でオクタマ一連結混合物にテトラマー２１を加え、連結混合物全体を３７℃で１５分間インキュベートした。

リガーゼを５ｕ１加え、１０ｉＨのＡＴＰを５Ｊ１１３７°テ１５分間加えた。

リガーゼを５Ｊｌ！加え、１０ｉ＋ＨのＡＴＰを５ＲＬｅ連結混合物に加え、連結混合物全体を４°で一晩インキユベートした。７Ｍ尿素を用いて作成した８％ポリアクリルアミドゲルで全連結混合物をチェックしたところ、予想通りの突出した２４２塩基対バンドが示された。連結ミックスをフェノール抽出し、エタノールに沈澱した後ｐｒｅｐゲルに載せた。連結ミックスの１７２を８％の７Ｈ尿素ゲルに載せ、オートラジオグラフィーで２４２塩Ｗ対生成物を可視化し、取り出した。

実施例　２ウシ塩基性繊維芽ａ胞成長因子のクローニングと発現ウシｂＦＧＦ遺伝子を、実施例１に記載したように、２つの部分にして合成した。各々の部分を、発現ベクターのｐＣＦＭ１１５６中に組み込む前に配列検証のためにＭ１３ｍｐｌａ中にクローン化した。第Ｉの部分のクローニングのために、Ｍ　１３＋ａｐ１８を３倍過剰のＥＣ０ＲＩとＸｂａ■で２時間消化した。等容量のフェノールで抽出することによって反応を停止した後、クロロホルム抽出し、２．５容量のエタノールで沈澱させた。ＤＮＡベレットをエタノールで洗浄し、減圧下で乾燥し、１０ｉＨトリス、０．１ｓｌｙｌのＥ　Ｄ　ＴＡ　、　ｐＨ７，４ニ溶解した。上記ノヨうニｗＩ！ａシタＭ１３ＩＩｌｐ１８ベクター０．０６　ｐｍｏｌｅを、５０ｒＡＨトリス（１）Ｈ＝７．４）　、１０１１１８のＨｇα２．１０ｍＨのＤＴＴ、１ｍＨスペルミジン、１１ＩＩＨのＡＴＰ、　１００埒／！ｄのＢＳＡおよび１単位のＴ４リガーゼ中、１４℃で４時間、合成ＦＧＦの第１部分０．３　ｐｍｏｌｅと共にインキュベーションすることによって連結した。ＪＭ１０９宿主細胞をコンピテントにした。

すなわち、指数増殖期の培養細胞を取って遠心し、氷冷した５０ｇ＋ＨのＣａＣｅ２中に１．２０Ｄ／ｄの濃度で２０分間懸濁した後、再度遠心し、細胞を同じ溶液に１２０Ｄ／Ｉｄの濃度で再懸濁した。連結混合物の試料（０，１〜１０／１１）をコンピテント宿主細胞の試料２００薦に加え、氷上に４０分放置した。

次に各チューブの中身を、２００威の新鮮なＪＭ１０９．１００ｍＨのＩＰＴＧを１０４と２％のＸ−Ｇａ１を５０４含む融解した１−ｔｏｐ寒天３ｍに加えた。この混合物をし一プレート上に置き、−晩３７℃でインキュベートした。得られた透明なプラークの４個をプレートから取り上げ、宿主株としてＪＭ１０９を用いて１０Ｉ１１になるまで培養増殖させた。これらの培養物から単鎖のファージＤＮＡを調製し、Ｍ１３ユニバーサルブライマーを用いてジデオキシ法によって配列決定した。これら４個のうちの１個が望みの配列をもっており、ＦＧＦ遺伝子を発現ベクター中に組み込むために貯えた。

人造ＦＧＦ遺伝子の第１の部分と同一の方法を使用して配列決定するために、第 ■の部分をＭ　１３ｎｐ１８中でクローン化した。

場合は、第■の部分に付着端を設けるために、Ｍ　１３ｇ＋ｐ１８ベクターを（３倍過剰の））ｌｉｎｄＩ［［とＥＣ０ＲＩで消化した。連結するために、０．０２５　ｐｍｏｌｅのＭ　１３ｍｐ１８ベクターを０．０７５　ｐｍｏｌｅのリン酸化合成ＦＧＦ第■部分と混合し、前のように１４℃で４時間インキュベートした。第Ｉの部分と同じＣａＣｌ２法を使用して形質転換すると透明なプラークが得られた。しかし、コントロールのプレート上の透明プラークのバックグランドが高かったため、ハイブリダイゼーションによってさらに選択した。前に記載したようにＪＭ１０９を宿主を使用していくつかのプラークを増殖させ、ファージＤＮＡを含有する上清でニトロセルロースフィルターにじみをつけた。第■の部分の合成に使用したオリゴヌクレオチドキナーゼを用いてリン−３２ＡＴＰで放射能標識し、上記のフィルターを探査するのに使用した。スクリーニングに陽性のクローン２個を選択し、前のようにして配列決定した。これらのクローンのうちの１個は期待した配列をもっており、遺伝子をｐｃ　Ｆ　Ｍ　１１５６中に組み込むのに使用した。

第１の部分と第■の部分のＭ１３クローンに対する二重鎖複製型ＤＮＡをＩＩ製した。ＪＭ１０９宿主中で各ファージの培養物５００　ｄを増殖させ、遠心して細胞を集めた。次に、細胞を１５％スクロース、０．０５Ｍトリス、０．０５ＭのＥＤＴＡ、およびｌｄ／ｄのリゾチーム中に再！！濁し、氷上で２５分間インキュベートした。ＲＮ　Ａ　ｓｅを０．１１Ｐｇ／　ｄまで加え、氷上でさらニ１０分間インキュベーションを続けた。等容量の０．１％トリトン）ｆニー１００．５０１Ｈ）−リス、５０ｉＨのＥＤＴＡを加え、氷上でさらに１０分間インキュベーションを続けた。次に、これらの溶解物を３９０００Ｘ　９で６０分間遠心し、透明な上清を貯えた。エチジウムプロミドを１ｊＩｙ／ＩＩｌ！まで加え、塩化セシウムを加えて１．５５ＳＦ／ｄの密度とした。この溶液を平衡させるためにＶ　ｔｉ−５００−ター中、４５．０００ｒｐ園で１８時間遠心した。

各チューブから得たスーパーコイルＤＮＡバンドをＵＶ光で可視化し、注射器で集めた。ブタノールで抽出してエチジウムプロミドを素早く除去し、１０■Ｈトリス、０、　ＩＩＩＨのＥＤＴＡに対して充分に透析してＣｓＣｌ！を除去した。

このようにしてｉｔ製したＤＮＡストックを用いてざらにクローニングした。

このＤＮＡを発現するには数多くのベクターが使用できるけれども、産物の収量を最大にするためには、調節プロモーターおよび温度誘導コピー゛数制御遺伝子を有する発現ベクターが好ましい。本実施例で使用する発現プラスミドｐＣＦ　Ｍ　１１５ＢはプラスミドＩ）ＣＦＭ８３６から容易に構築でき、この後者の構築は公開されたヨーロッパ特許出願第１３６，４９０号に記載されている。

まずｐＣＦ　Ｍ　８３６をＮｄｅＩで切った後、Ｔ４ポリメラーゼを用いて存在している両ＮｄｅＩＩＩＳ位が失なわれるようにプラント末端を形成する。次に、このベクターをＣ１ａ工と３ａｃ［で消化して存在しているポリリンカーを除去した後、表Ｖに示したような別のポリリンカーに連結する。この代わりのポリリンカーはＡｌｔｏｎら、５ｕｐｒａの手順に従ｖｉａ築できる。発現ｐｃＦＭ１１５Ｇプラスミドにおける発現は短縮ラムダＰ、プロモーターによって制御され、このプロモーター自身は（Ｅ　、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株△Ｈｔｒｐから得られるような）ＣＩ８５７リブレツサー遺伝子に１４節され得る。

ＦＧＦの第Ｉと第■の部分と連結するために、発現ベクターｐｃ　Ｆ　Ｍ　１１５６を（２倍過剰の）ＸｂａＩとＨｉｎｄＩ［ｌｒ消化した。

上記のように１ｌｌｊした第Ｉと第■の部分のＤＮＡストックを（２倍過剰の）ＸｂａＩおよびＫｐｎＩ（第工の部分の場合）で、またはＫｐｎＩおよびＨｉｎｄｌ［ｌ（第■の部分の場合）で消化した。

３種の消化物を、５０１Ｈトリス−酢酸塩中で作成した１、２％５ｅａ−プラークアガロースゲル上に載せ、６０ボルトで３時間電気泳動した。１埒／ｄのエチジウムプロミド溶液でゲルを染色し、ＵＶ光の下でバンドを可視化した。線状化したベクターバンドと第Ｉおよび第■の部分のバンドとをメスでゲルから切り出し、別々のチューブに入れ、７０℃で１５分間融解させた。線状化したベクターを含む融解ゲル５１ｉ１を、第Ｉと第■の部分を含む切片の各１０４に加え、混合物を３７℃で平衡化させた。融解しているゲルを、２■ＨのＡＴＰと０．５単位のＴ４リガーゼを含有する氷冷した２×リガーゼバツフアと等容置ですばやく混合し、１４４ａ工一晩インキユベートした。この連結ミックスの試料を、Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、、１６６、５５７−５８０　（１９８３Ｅ記載の形質転換法を用いて、凍結したコンピテントＦＭ６′Ｆ３主株中に形質転換し、２．５時間増殖させてカナマイシン耐性を発現させ、２０Ｒ／Ｉｄのカナマイシンを含有するし一プレート上で平板培養した。

プレートを一晩２８度Ｃにインキュベートした。コロニーをニトロセルロースフィルター上にレプリカ培養し、マスタープレートを保存した。フィルター上のコロニーを２８度で約１ｍｌの直径になるまで増殖させた後、３７［で−晩平板培養してプラスミドのコピー数を増大させた。６×のＳＳＣＳＣバフフッ９６Ｃで（遺伝子合成で得た）放射能標識したオリゴヌクレオチド１８とハイブリダイゼーションすることによってフィルターをスクリーニングした。２４個の陽性クローンが得られ、そのうちの４個を選択して５００ｄに培養増殖させた。第Ｉと第 ■の部分について記載したように、透明ライゼート法を使い、その後ＣｓＣｅ平衡密度勾配遠心して複製型ＤＮＡをＩＩＢ製した。

表　ＶＬ　Ｃ１ａｎ、ｎ　ＸｂａＺ、２９　ＮｄｅＬ、コＳ　！１ｉｎｅａｌ、ＨＢ４Ｌｔ　３９　ＱλｕＬ、４７　ｍｅｏＲｉｌ。

ｓ５””Ｔｉｏｉｃ１ｘＥ’ｉｓ　５７　ｓ’ＥＥＸ　ト１゜ジデオキシ配列決定反応用の鋳型として発現ベクターの二重鎖を直接用い、これら４つのり０−ンの配列を決定したところ、４つの全部が正確な配列をもっていることが判明した。これらのうちの１つを選んでウシｂＦＧＦの発現に使用した。これは以後ｐＣＦＭ１１５６／　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆと称する。こうして構築されたりＣＦＭ１１５Ｇ／ｂＦＧＦベクター中のウシｂＦＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列は表工に示されている。

実施例　４シｂＦＧＦの発現と１１ｉ製発　現前記製造株の一晩培養物を２０ｎ／ｌｄカナマイシンを含むし一ブロス中２８℃ で増殖させ、８！！の醗酵バッチへの接種に使用した。８１バツチの培地は４０ｇの酵母エキス、４０７のグルコース、１０ｇの塩化ナトリウム及び適当な１ｌｉｉｌｉｉ！、ビタミン溶液、及び撤回金属を含むものであった。二連絵詞プロトコルを使用した。

最初の飼料（１１）　）は４５０ｇのグルコースと適当量のビタミン及び塩を含んでいた。２００　Ｄ　（６００ｎｍにおける光学密度）まで増殖させた後、２００ｄ　／　ｈｒの速度で２番目の絵詞を開始し、温度を４２℃に変えた。この飼料溶液は２００ｇ／ｉ）のバクトドリブトン、１００ｇ／ｉｔの酵母エキス及び１００ｇ／ｉ）のグルコースを含むものであった。４２℃で６時間、ｉｔ胞濃度が回収時の５００Ｄに達するまで増殖を継続した。

精　製水中で、Ｇａｕ　ｌ　ｉ　ｎホモジナイザーにより旦、亜旦細胞を破壊し、４．２にで４０分間Ｊ６Ｂ遠心分離器により遠心分離した。５Ｏ３−ＰＡＧＥで分析すると、ＦＧＦは沈降物及び上清の両方に見られ、上清の該タンパク質は６０〜７０％であった。そこで沈降物は廃棄し、上溝をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。上溝をトリス塩基によりｐＨ７，４に滴定した後、１霞ＨＤＴＴとし、４０ｍＭトリス−ＨＣｊ　／１ｎＨＤＴＴ／ｐＨ７，４で平衡化したＣＭ−セフ７０−ス樹脂と混合した。該樹脂を同じバッファーでバッチ式に洗浄し、０〜０．７ＨのＮａａｌ直線勾配によりカラムで溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づき、０．５Ｈ周辺の単一ピークを集収した。集収物をトリス−ＰＡ基によりＩ）８８．２に滴定し、冷水で３倍に希釈し、４０釦Ｈトリス−ＨＣ４ｌ　／１＋＋ＨＤＴＴ／ｐＨ８，２中のＣＭ−セファロースにかけた。カラムを０．１５Ｍ　ＮａＣ１！で洗浄し、０．１５〜０．５ＨのＮａ（ｊ！　Ｍ線勾配により溶出した。２つの小ピークの間の主たるピークを集収し、これは非還元５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析により約り５％純度であり、少量のダイマーを含んでいることが判明した。収率は約９０％であった。

集収物を直ちに１８　Ｎａ０Ａｃ／ｐＨ４により約ｐＨ５に滴定してウシｂＦＧＦ生成物の酸化を防ぎ、その後２０＠Ｈクエン酸ナトリウム１０、ＩＨＨａ　Ｃｉ！／ｐＨ５中のセファデックスＧ−１５カラムに直接かけ、肩部（ダイマーに相当する）と小化合物（例えばＤＴＴ＞のピークの間の単一溶出ピークを得た。

このピーク中のフラクションを集収し、４℃あるいは一２０℃で保存するか、あるいは凍結乾燥した。このグル濾過における収率はほぼ１００％であつた。５６０ｇの細胞ペーストから約４００■のウシｂＦＧＦを得た。

友１里−１ヒトｂＦＧＦの調製この実施例に使用した方法はＧｉ　ｌ　Ｉ　１ａｌＨ等、Ｇｅｎｅ、　１２．　ｐ、１２９−１３７　（１９８０）の方法の変形である。ヒトｂＦＧＦはウシＦＧＦとは１１３位！（ｓｅｒに代えてｔｉｒ　）及び１２９位１（ｐｒｏに代えてｓｅｒ　）の２つのアミノ酸のみが異なる。実施例１においてｖＡｌｌＦＧＦをコードする遺伝子への変換には、２つのヌクレオチドの変換を必要とするのみである。この変換は、下記のプライマーを使用した部位指向突然変異誘発によりＭ　１３ｍｐ１８／　ｂＦＧＦセクション■クローンにおいて行なった。

’１６−１５）　５’　ＧＡＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＣＡＧ’ｌｌ’ｒＴＧＴＡ　３”９６−１６）　５’　ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＧＡ　３’Ｍ１３ユニバーサルプライマー及び上記のプライマーそれぞれの１０ｇｍｏｌを、７００１８　トリス、１０Ｉ１８　Ｈ（ＩＣ１２，５１＋１４　ＤＴＴ　１０ｄ中の１ｍＨＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼの１０単位と共に３７℃で３０分間インキュベートすることによりホスホリル化した。キナーゼを作用させたそれぞれのオリゴヌクレオチドの５ｐｉｏｌを約０．５埒の一本！ｌ　Ｍ　１３＋ｅｐ１８／　ｂＦＧＦと混合し、６５℃に加熱し、室温に冷却することにより再結合させた。この鋳型／プライマー混合物に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰのそれぞれの２５ｍＨの溶液の１４．１００ｉＨＡ　Ｔ　Ｐの１４、Ｔ４リガーゼの２単位及び８単位ＤＮＡ　Ｐｏ１Ｉ大フラグメント（にＩｅｎｏｗ）を加えた。この混合物を１４℃で４時間インキュベートした。この結合混合物を前述のＪＭ１０１中に形質転換し、０．７％Ｌ−アガーにプレート化した。得られた透明プラーク上にニトロセルロースフィルターを載置及び除去し、放射線標識オリゴヌクレオチド９６−１５６よび９６−１６に対するハイブリダイゼーションによりフィルターをスクリーニングした。各プローブの使用によりいくつかの陽性が得られたが、両方のプローブについて陽性のものはなかった。９６−１５から陽性の１つを選択し、−重鎖ＤＮＡを調製し、オリゴヌクレオド９６−１６を突然変異誘発性プライマーとして使用した以外は前と同じ手順を繰返した。この実験により、９６−１５及び９ト１６の両方とハスプリダイズしたいくつかのプラークが得られた。これ等の４つを選び、−重鎖ＤＮＡを配列決定のため増殖させた。四つのクローンは全て正しい配列を含んでいた。このようにしてｉＩ製したヒトｂＦＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列を表２に示す。旦５匹旦に由来するヒトｗＡ換えｂＦＧＦは実施例４に記載した方法により発現及びｙｉ製され得る。ヒト組換えｂＦＧＦのアミノ酸配列を表４に示す。

表　４ヒト塩基性フィブロブラスト増殖因子ＭｅｔＰｒｏ入１ａＬｅｕＰｒｏｃｌｕ入ｓｐｃ；ｌｙＧｌｙｓｅｒｃｌｙ入１ａＰｈｅＦ’ｒｏＰｒｏＣ＋ｌｙＨｉｓＰｈｅＬｙｓλｓｐ入ｒｇｃ．１ｙＶａｌＶａｌｓｅｒ：ｌｅＬｙｓＧ１ｙＶａｌｃｙｓＡｌｉ入ｓｎ入ｒｄｙｒＬｅｕ入１ａＪ｛ｅｔＬｙｓｃ１ｕ八ｓｐＧｌｙＡｒｑＬａｕＬｅｕ入１ａｓｅｒＬｙｓｃｙｓａ１τｈｒ八ｓｐＣｌｕＣｙｓＥ’ｈｅＰｈｅＰｈｅＧ１ｕ入ｒｇＬｅｕｃＬｕＳｅｒＡｓｎＡｓｎＴｙｒＡｓｎ′ｒｈｒＴｙｒＡｒｇＳｅｒＡｒｑＬｙｓ丁ｙｒτｈｒｓｅｒＴｒｐτｙｒＶａｌ入１ａＬｅｕＬｙｓＡｒｇτｈｒ（，１ｙＧ１ｎＴｙｒａｙｓＬｅｕＣ，１ｙＳｅｒＬｙｓＴｈｒ（，ｌｙＰｒｃｃｌｙ（，ｌｒ．Ｌｙｓ入１ａｌｌｅＬｅｕＰ■■ シｂＦＧＦの特性活性：ウシｂＦＧＦの活性を［３Ｈ］チミジン添加３Ｔ３１１Ｂ胞において測定した。４℃及び−２０℃で保存したもの及び凍結乾燥したものの全ての調製物は、アッセイに使用した３７３１［１胞の特定の株に応じ、２０−２１０ｐｇ／　Ｉ！１からのタンパク質濃度で、半最大活性に関し、投与量依存性の活性を示した。

ＲＩ？生成物の一般的な特性２６０／２８０比　〜２．ＯＬＡ　Ｌ　＜０．６　Ｅｌ／Ｉｄ（０．６２３　ＦＧＦ■）Ｄ　Ｎ　Ａ　＜２０　ｐＱ／ｄ！　（０．６２３　ＦＧＦク》消哀係数　０．１％タンパク質について１．３純　度　〉９５％安　定　性ウシｂＦＧＦ調製物を４℃において異なるｐＨにおいてインキユベートすると、ウシｂＦＧＦはｐＨ≧５．９においては鎖間のジスルフィド結合により２つ以上のｂＦＧＦ分子がらなるポリマーの形成を示し、ｐＨ≧４．０においてはＡｓｐ −Ｐｒｏ結合の酸不安定性により分解した。この知見に基づきｐＨ　５のバッファーを選択した。この安定性のデータは、Ｔｉ離の−ＳＨ基は最終生成物において鎖内よりは鎖間のジスルフィド結合を示す傾向にあることを示している。ウシｂＦＧＦＨｌ製物は、セファデックスＧ−７５ゲルＰ過により測定すると明らがに単量体である。

実施例　７本実験に使用したＨｔＪＶ内皮細胞は、Ｇｉｍｂｒｏｎｅの方法（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，　ＨＡ，　Ｃｏｔｒａｎ，　Ｒ．Ｓ．，　Ｆｏｌｋｉａｎ，　Ｊ．　Ｈｕｉｌａｎ　ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｃｌｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７４　Ｖｏｌ．　６０　ｐｇｓ．　６７３−６８４）によりＪｕｄｉｔｈ　Ａ．　Ｂｅｒｌｉｎｅｒが単離したものである。細胞は、リン酸塩緩衝塩水中の０．１％ゼラチン及びウシ胎児血清を含まない培地中の１０Ｒ／−フィブロネクチン（　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍ）でコートした培養フラスコ中ヘ３０分間連続的に前培養することによって雑持した。ｍ胞は０．０１２５％トリブシンーｏ．　ｏｏｓ％ＥＤＴＡで解放され、週に１：２あるいは１：３が死滅した。使用した維持培地は、ペニシリンＧ（１０ｕｎｉｔｓ／ｄ）　、ストレプトマイシン（１０ＩＩｇ／ｘｉ！）　、ウシ胎児血清（２０％，　ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｌ−グルタミン（　２ｉＨ）、ビルピン酸ナトリウム（１ｉＭ）、ヘバリン（　４０ｇｙ　／　ｒｄ　，　１７０ｕｎｉｔｓ／雌）及び内皮細胞増殖補充物（ＥＣＧＳ，　４０Ｒ／ＩＩＲＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅｒｃｈ）を含むＭ　（：，　［）　Ｂ１０５　（　Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。ｉ胞は２％Ｃ　Ｏ　２インキュベーターで増殖させた。

以下の実験を実施し、ＨＵＶ内皮細胞に対する下記の３つの異なる形態のＦＧＦの増殖抑嗣及びマイトジエン活性を比較した。

１）　Ｅ．　ｃｏｌｉ由来組換ウシ塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（ｒｂＦＧＦ）、２》ウシ酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ，特にウシ脳からｆＩ製）、３）ウシ塩基性ＦＧＦ（ウシ下垂体より精製したｎ−ｂＦＧＦ，Ｓｉｇｍａ　）。

２４ウェルプレートの中央の８ウェルのみを使用し、ウェル当り　１００個の細胞をプレート化した。各２４ウエルプレートの細胞を、上記維持培地中でｎ−ｂＦＧＦの代りに上記の増殖因子の１つのみの存在下あるいは増殖因子なしに増殖させた。

最初の接種から３日及び６日後にそれ等の同じ増殖因子を供給した。接種の１０日後、培養物をクリスタルバイオレット染色により分析した。

表７の結果は、８ウエル当りのコロニーにおいて、ａ　ＦＧＦあるいはｎ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆを含むウエルのコロニーよりもｒｂＦＧＦを含むコロニーの方がそれぞれ２０％及び３２％多いことを示している。また、ｒｂＦＧＦを含む培養に由来する全コロニーの７５％は０．５ｊｗ及びそれより大きいのに対し、ａ　ＦＧＦ及びｎ一ｂＦＧＦと共に増殖したコロニーにおいてはそれぞれ５５％及び５１％のみがそのような大きさであることも興味がもたれる。

これ等の結果は、ｒｂＦＧＦがａＦＧＦあるいはｎ−ｂＦＧＦのいずれよりも優れたＨｔＪＶ内皮細胞の成長及び増殖因子であることを示している。増殖因子を含まないコントロールについても評価した。

表　７増殖因子　８ウェル当りの　８ウェル当りのコロニー数　≧０．５ａｌｌコロニー数ｒ　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　３５１　２６５ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　２９３　１６０ｎ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　２６５　１３４コントロール　８　。

実施例８本アッセイで使用した細胞は、ＡＴＣＣから入手したＮｉ１（３Ｔ３細胞である。細胞をペニシリンＧ　（１０埒／ｄ）、ストレプトマイシン（１０埒／ｄ）及び仔ウシ血清（１０％）を含むＤＭＥ＠地中で成長させる。細胞を１：４０で１週間に２回継代させる。アッセイ　１日目に、下位集密的培養物（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）をトリプシン分散させ、前記成長培地のウェル当り　１Ｈ！、１ｄ当り２ｘ　１０’細胞の濃度で２４枚のウェルプレートに載せる。

５日目に、培地をペニシリン、ストレプトマイシン及び５％ヒト血小板に冨まない血Ｗ（清澄化ヘパリン添加血清）を含むＤＭＥと置換する。ウェル当り１ｄとする。この時点で細胞は集密的でなければならない。６日目に、ＦＧＦの実験サンプル及び対照サンプルを１００成以下の容量で培地に添加する。

１８時間後、細胞を５％仔ウシ血清及び２μＣｉの３Ｈ−Ｈｅチミジンを含むＤＭＥ　１ｄを用いて３７℃で１時間パルスする。次いで、細胞を４℃においてＰＢＳ、５％トリクロロ酢酸を１１ｄずつ用いて洗浄する。プレートを３０分間風乾後、各ウェルに１ｄの０．２５Ｈ−ＮａＯＨを添加する。室温で１時間放置後、各ウェルの内容物を１０１ｄのａｑｕａｓｏｌ　ｌを収容した個々の計数バイアルに移す。サンプルをＬＳ　７，５００シンチレーシヨンカウンターの０−３９７ウインドを介して１分間計数する。

ｐＨ５のクエン酸ナトリウム緩衝液中に６００埒／　ｄの濃度のストックから、ＦＧＦ標準を作成する。使用した標準の濃度範囲は５〜１０００１１ｇ／ａｄ！である。最大の３日−チミジン摂取を示す標準の最低濃度はｓｏｏｐｇである。

平均１４０〜２１０　ｐＣＩで、標識したチミジンの最大取込み量の半分が取込まれる。

対照：希釈剤５０ｉ１１、添加剤なし夫々５０成の複製希釈剤−ＤＨＥＨ＋　０．１％ＢＳＡ　（Ｍｉｌｅｓ　）　＋０．０１％ＮＰ４０＋ｐｅｌｌ　／　５ｔｒｅｐｔ＋　Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）１／２１ａＸは１４０〜２１０　［１である。

実施例１で作成したウシｂＦＧＦ遺伝仔のヒトｂＦＧＦをコードする遺伝子への変換は、オリゴサイト定方向突然変異誘発により実施した。

修飾さすべきセグメントをまずファージベクター８１３園ｐ１８にクローン化させ、−重鎖ファージＤＮＡを成長及び作成するためにＥ、ｃｏｌｔ　ＪＨｌｏｌに形質転換させた［Ｈｅｓｓｉｎｇ、　、Ｊ、ら、　Ｖａｔ、　９゜Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　、　ｐｐ、３０９〜３２ｔ（１９８１）　］　、約０．５１４の鋳型ＤＮＡを５９１ＯＩの万能８１３配列決定プライマーと５ｐｍＯ＋の各突然変異誘発性プライマーと混合し、６５℃に３分間加熱し、ゆっくり冷却した。アニーリングした鋳型プラニマーをＡＴＰ、ｄＮＴＰミックス、　ＤＮＡ　Ｐｏｔ■大断片及びリガーゼと混合後、１５℃で４時間インキュベートした。

この反応ミックスのアリコートをコンピテントＪＨ１０１細胞に形質転換し、０．７％Ｌ−寒天に入れた。突然変異体ファージを含むプラークを、複製ニトロセルロースフィルターを３２．−標識突然変異プライマーを用いてハイブリダイゼーションすることにより選択した。−重鎖ＤＮＡを、正のスクリーニングプラークから作成し、その配列をジデオキシ鎖終止法を用いて証明した。実施したアミノ酸変化及び使用した対応の突然変異誘発性プライマーは次の通りである。

プライマーはｂＦＧＦ遺伝子のアンチセンス鎖に対応する。

ＦＧＦのＷｉｉ酵生産（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）　Ｌｔ　次（７）　ヨウニＬｔて実施する。

培養物のバイアルを封をした（ｓｅｃｕｒｅ＋ｊ）培養物好ｊｌ−７０℃フリーザーから取り出した。バイアルを室温で解凍し、層流フードの下でＦｅｒｎｂａｃｈフラスコに接種する。各フラスコには［υｒｉａブロス（Ｌｕｒｉａブロス：バクトトリプトファン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５９／Ｌ、　ＮａＣ１！　５９／Ｌ）が含有されている。

接種したフラスコを約２８℃で１０〜１６時間振盪する。標準の操作法に従って加圧滅菌したバッチ培地（表■）を収容したｍＷ器に、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコの内容物を無菌移動して接種する。攪拌速度、温度、＋１）１及び溶存酸素は製造規格に特定されている如く設定する。ｐｌ（をリン酸及び水酸化アンモニウムを用いて自動的に維持する。溶存酸素は、攪拌速度、空気流速及び／又は背圧を増大させることにより特定のレベルに維持する。

サンプルを一定間隔で無菌的に取り出し、細胞密度を測定した。供給培地＃１（表■）をＩＢ胞密度に従って特定の流速で長時間に亘って供給する。特定のｉ飽密度で温度は約４２℃に上昇し、生成物の合成が誘発される。供給培地＃１を直ちに供給培地＃２（表■）に置換する。供給培地＃２を醗酵の終りまで成る特定の供給速度で維持する。温度が上昇してから約６時間後、醗酵器を冷却し、醗酵器内の細胞を遠心分離により集める。

表　■ ｐｃＦＨ１１５６中に合成りＦＧＦ遺伝子を含むＥ、ｃｏｌｉｌ［ｌ胞を実施例４と同様にして成長させた。ｉｌＢ胞を分裂させ、低速度で遠心分離すると、ｂＦＧＦが上清及びベレット画分中に検出された。ペレットからの精製は、変性剤により可溶化し、再生して活性物質を得る必要がある。これらの工程は、下記する如き上清からの精製により避けられ得る。上記画分を４０ａ＋ＨＴｒｉｓ−ＨＧ、　ｐＨ７，４のＣＭ−セファ０−ス力ラムにかけ、直線Ｎａα勾配で溶出させた。

次いで、ＦＧＦ含有画分を同一のａ脂（但し４０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＧ、　ｐＨ８，２）に結合させ、直線Ｈａα勾配で溶出させた。これらの２種のクロマトグラフィーにおいて、１ｎＨのＤＤＴを含有させて酸化を防止した。さもなければ、分子間ジスルフィド結合が形成された。タンパクを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１ＨＮａＣ１，Ｉ）Ｈ５，０のセファデックスＧ−７５カラムを用いるゲル濾過によりｙｉ製した。Ｅ、　Ｃｏ　Ｉ　ｉ細胞からＦＧＦをＮ製するｊＩ初の試みで、１ａＨのＤＤＴを精製過程で含有させないときにはダイマーがすぐに形成されることが判明した。ヒトｂＦＧＦの精製は、実施例４に記載されているウシ材料の場合と本質的に同様にして実施した。精製過程でヒト及びウシｂＦＧＦの差異は認められなかった。還元条件下で５ＯＳ−ＰＡＧＥを試験すると、ｂＦＧＦ類はモノマーな分子量に相当する１６，５００ダルトンで主要なバンドと多分ダイマー及びテトラマー形態を表す高分子量で小さなバンドを示した。非還元条件下で操作すると、高分子量バンドによる混入がより多く見られた。

精製ｂＦＧＦのアミノ酸配列分析から、多くの材料からメチオニンが開裂し、７０％ブＯリン、１３％アラニンが生じ、ト末端のメチオニンはたった１７％であった。天然の材料と同様に、組換えｂＦＧＦはヘパリンに対して強い親和性を示し、ヘパリンセファロースカラムから約１．５〜２．０　Ｍ　Ｈａ（ｊ！で溶出させた（データ示さヒトｂＦＧＦの活性を、実施例８と同様にして３Ｔ３　ｍ胞への［３Ｈコチミシンの取込みにより調べた。ＨＩＭ　３Ｔ３細胞はＡＴＣＣから入手した。細胞を１０％ウシ血清、　１０ｕ／ｄペニシリン及び１０１５／ｍストレプトマイシンを補充したＤＨＥ中で成長させた。

細胞を１：４０で１３！！間に２回継代させた。アッセイ　１日目に、下位集密的培養物をトリプシン分散させ、前記成長培地のウェル当り　１ｊＩｉ！、１１！１当り２０．０００１［１１！＋７）濃度テ２４枚Ｑ）つｘルフレートに載せた。５日目に、培地をペニシリン、ストレプトマイシン及び５％ヒト血小板に冨まない血漿を含むＤＨＥと置換する。

ウェル当り　１１ｄとする。６日目に、実験サンプルを１００ｆｉ以下の容量で培地に添加した。１８時間後、細胞を５％仔ウシ血清及び２μＣｉの３日チミジンを含むＤＨＥ　１ａ！を用いて３７℃で１時間パルスした。次いで、細胞を４ ℃においてＰＢＳ、５％トリクＯ口酢酸を１７！ずつ用いて洗浄した。プレートを３０分間風乾後、各ウェルに１ｍの０．２５８−Ｈａ叶を添加し、室温で１時間放置した。

各ウェルの内容物を１０ｊｄ！のＡｑｕａｓｏｌ　Ｉ［を収容した個々のバイアルに移し、液体シンチレーションカウンターを用いて計数した。

第３図に示すように、組換えヒトｂＦＧＦは本アッセイで組換えウシｂＦＧＦと本質的に同一の能力を示し、約１５０〜２００　Ｄｇ／ｄでＤＮＡ合成の最大刺激の半分を生じた。

１１１遍ｔ：　トＦＧＦ　Ｇニー　ＨＵＶ−ＥＣツＨＵＶＥｉＢ胞アッセイについては実施例７に記載されている。本実験で使用したヒト鱗静脈内皮細胞はＪｕｄｉｔｈ　Ａ、　Ｂｅｒｌｉｎｅｒ博士から提供された。細胞を、リンｌ１ｌｆｔｉ食塩水中の０．１％ゼラチンを用いて３０分間、次いで胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含まない培地中の１１０１Ｉ／Ｉｄフイブロネクチンを用いて３０分間コーティングして作成したフラスコ内で成長させた。使用した維持培地は、１０ｕ／ｄペニシリンＧ、１０ｕ、／ｄストレプトマイシン、２０％ＦＢＳ。

２ａＨＬ−グルタミン、　１ｉＨピルビン酸ナトリウム、　４０埒／ｍｅヘパリン（１７０μ／ｍｙ）及ヒ４０４　／　ｄ内皮細胞成長補足要素（ＥＣＧＳ。

Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を補充したＨＣＤＢ１０５（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎ−ｔｉｆｉＣ）でありた。細胞を２４枚のウェルプレートに載せ、ＥＣＧ５含有維持培地、又はＥＣＧ５に代えて組換えヒトｂＦＧＦを含むか成長因１　子を含まない同一培地中で成長させた。最初の接種から３目釘及、ノ゛６日目に細胞を供給した。このとき新鮮な成長因子も添加、シ１之。

接種から１０日目釘、ＷＩＡ胞をクリスタルバイオレットで染色し、計数した。

組換えヒトＦＧＦを添加すると、成長因子を含まない対照に比べて広範な細胞増殖が生じた。ウシ及びヒトｂＦＧＦの間に有為な差は認められなかった。

当業者に自明の如く、上記した実施例を参照して各種変更及び修飾を行なうことが可能である。従って、本発明は請求の範囲にのみ限定されると解釈されるべきである。

ごＵ　詫　ごギ　３ヨ　ごじ　託００　＜υ　＜ａ　ｏａ波　５ヨ　ル　芯　ごゴ　北００　ΦＣＪ　ψく　ひＨ＜Ｏ８５ｇ２ギ　ニ？　８８８　おじ　：翻χＣｂＣＪ　＜ｔＪ　Ｈ，１１：　ｋｔＪ　のト　く０ｇ日　ニヨ　ＯＦ−へＥｓ　、４Ｆ−１コくｅＪ（Ｊ　、Ｊ　＜ｔＪ　＜＜：）　：）Ｌ）　（ｊ（ｊ″′Ｆ″　芸？　；日　；じ　；ｉ　遡〉 −〇＜ｕ　山Ｈ−〇　のＥ−１＞ｏ　−＜ｏ＜　、ｔＱｈ　ｃｕリ　ｔａｇ’　＞）４　Ｊ−Ｔ。

しυ　−一＜　Ｊ：）−１＞ｃＬＩ（Ｊ　：ｌ：（Ｊ　Ｑｌｌ→　−〇〇　＝くしくＪ　：３ｔＪ　００：≦　、＜、Ｉ−しＵｏｏ　８←　−Ｕ　山Ｕ、ｅ）４　＞乏　′！＞て　、８ＣＵＵ　フ０１１＋）４　−＜　、−３＜　ＪＵ Φ）’　０（７１Ｆ４　Ｌｌ（Ｊ　０（Ｌ））−に〇　−一〇　＞＜　寸：ＨＱｌ　＋　−４＜　（Ｊ　）４　＋　、−４ｅｋｌ　）−１ｇ　（Ｊ　ＳＪ　）ｌ　ｃ　ａ　コＯＪｌ：　Ｆ−１、−１＜　（Ｌｌ　［−’ＱａＨδ）’　ｔ、：）ＣＪ　！（Ｊ、−ＩＦ−Ｉ　５Ｊ（Ｊ　＞トで。

句ｆ４　＞＜　Ｊ　、−＋Ｌ）　（２＜〉０　トド　−Ｕ　ＯＯ口ＨＩ／）ｅ　ｃリ　弓Ｈｏａ　℃く＞じ　−０レリ　〔くｕ←　；乏　く０　山ＣＪ　Ｅ−Ｊ）ＩＳＪＦ−４５−ａｈ　ＳＪ）−１−ト　 ψくＣＤＵ　ΦＵ　＞＜　二Ｕ　＞＜のＥ−１の←　）４）１　）４＜　−＜コ］国際訴査報告１″＋１１１″Ｊ″ｌＡ″ｇ＃ｌ″ＰＣ〒／１１’：８１！１０（ｌＯｆＦｌｌｌに＋ＲＭ１ｍ＋４１＾−−”””’　ＰＣ？／ＵＳ８８１０００６８

Claims

【特許請求の範囲】

１．天然ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の一次構造コンホメーションの少なくとも一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチド産生物を大腸菌宿主細胞内で発現させるのに使用するＤＮＡ配列であって、（ａ）第ＩＩ表に記載のＤＮＡ配列又はその棺補鎖；（ｂ）上記（ａ）で定義されたＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）遺伝コードの縮重がないとしたら、上記（ａ）及び（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列とハイブリダイズし得るＤＮＡ配列の中から選択される前記ＤＮＡ配列。
２．前記ポリペプチド産生物を発現し得るような方法で請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列で形質転換された大腸菌宿主細胞。
３．請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する、生物学的に機能するブラスミド又はウィルス性ＤＮＡベクター。
４．請求の範曲第３項記載のＤＮＡベクターで安定的に形質転換された大腸菌宿主細胞。
５．天然ヒト塩基性繊維細胞成長因子の一次構造コンホメーションの全て又は一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチドの産生方法であって、（ａ）適当な栄養条件下で、塩基性繊維芽細胞成長因子の一次構造コンホメーションの全て又は一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチドを大腸菌宿主発現用にコードするＤＮＡ配列、調節プロモーター配列、及び温度誘導性コピー数調節遺伝子を含むＤＮＡブラスミドベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を増殖し、（ｂ）前記ベクター内のＤＮＡ配列の発現による所望ポリペプチド産生物を単離し、（ｃ）該所望ポリペプチド産生物を精製する、ことから成る前記方法。
６．ヘパリン非含有クロマトグラフィ系を用いて前記所望ポリペプチド産生物を精製する、請求の範囲第５項記載の方法。
７．前記ＤＮＡ配列が請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列である、請求の範囲第５項記載の方法。
８．ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の一次構造コンホメーションの全て又は一部及びその生物学的性質の一つ又はそれ以上を有するポリペプチドを大腸菌宿主発現用にコードするＤＮＡ配列、調節プロモーター配列、及び温度誘導性コピー数調節遺伝子を含むＤＮＡブラスミドベクター。
９．塩基性繊維芽細胞成長因子をコードするブラスミドを含む大腸菌宿主株が発現した組換え塩基性繊維芽細胞成長因子の精製法であって、該大腸菌宿主株からの単離に続いて、該組換え塩基性繊維芽細胞成長因子をヘパリン非含有クロマトグラフィ用カラムを用いてクロマトグラフィにかけることを含む前記精製法。