NL8104400A - Microbiele bereiding van menselijk fibroblast interferon. - Google Patents

Description

* « i J

f . 1 N.0. 30.t26

Microbiele bereiding van menselijk fibroblast interferon

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebied van recombinant DNA technologie, dat vil zeggen op werkwijzen, die gebruikt worden in de recombinant DNA technologie en op produkten verkregen met deze werkwijzen· 5 Volgens een meer gedetailleerd aspekt heeft de onderhavige uitvinding betrekking op polypeptiden» in het bijzonder op vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon» op farmaceutische preparaten, die dit bevatten en op een werkwijze voor de bereiding ervan, die wordt gekenmerkt door een kweek van een microorganisms 10 getransformeerd met een repliceerbare microbiele expressie- drager» die in staat is deze polypeptiden uit te drukken deze polypeptiden te laten ontstaan en uit te drukken· De onderhavige uitvinding heeft, eveneens betrekking op de expressiedragers, die bij deze werkwijze worden gebruikt en op de nieuwe mieroorganismen, 13 die dese expressiedragers bevatten, alsmede de werkwijzen ter bereiding ervan· Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op DNA volgorden, die volgorden codering bevatten voor de aminozuur-volg-orde van een vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon·

Menselijk fibroblast interferon (PIP) is een proteïne, dat 20 antivirus activiteiten, alsmede een ruim traject van andere biolo_ gische activiteiten vertoont (zie voor een overzicht W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 1979)·

Het is volgens berichten gezuiverd tot homogeniteit als een enkelvoudig polypeptide met een molecuulgewicht van 19*000 - 20*000 met g 25 een specifieke activiteit van 2-10 x 10 eenheden/mg (E. Knight,

Proc· Natl* Acad. Sci· USA 73, [1976] 520-523? W* Berthold c.s·, J. Biol. Ghem· 253, [1978 ] 5206-5212). De volgorde van de 13 NH2-eindstandige aminozuren van FIP is bepaald als Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-§ln-Arg-Ser-Ser- (E* Knight c.s., Science 30 202, [1980] 525-526). Houghton c.s. (Nucleic Acids Bes. 8, [1980] 1913-1931 hebben synthetische deoxyoligonucleotiden (voorspeld uit deze aminozuur-volgorde) gebruikt om de volgorde van de 276 5*-eindstandige nucleotiden van FIP mBNA te bepalen. Taniguchi c.s. (Nature 28^, [1980] 5b7-5k9i Gene 10, [1980] 11-15 en 35 Derynck c.s. (Nature 285, [1980] 5t2-5t7 zijn onlangs in staat geweest de nucleotide-volgorde van gecloonde cDNA copieen van PIP mBNA in E. coli te identificeren en hebben daaruit de volledige aminozuur-volgorde van menselijk PIP met inbegrip van een 8104400 2 λ 1 s ignaal-voIgorde van 21 aminozuren afgeleid. Het vol ontwikkelde peptide is 166 aminozuren lang. Tenslotte hebben Taniguchi c.s. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 [ΐ9δθ] 5230-5233) een plasmide geconstrueerd j dat expressie in E» coli van het menselijke FIF gen 5 richt» waarbij vol ontwikkeld FIF wordt voortgebracht·

Met de komst van recombinant DNA technologie» is de geregelde microbiele produktie van een enorme verscheidenheid bruikbare polypeptiden mogelijk geworden. Heeds zijn bacteriën» gemodificeerd volgens deze technologie» in handen» die de produktie van 10 dergelijke polypeptide-produkten, zoals somatostatine* de A en B ketens van menselijk insuline, menselijk groei-hormoon (Itakura c.s·, Science 198» [1977] 1056-1063? Goeddel c.s·, Nature 281, [1979] 5^4-5^8) mogelijk maken* Meer recent zijn recombinant DNA technieken gebruikt om de bacteriele produktie van proinsuline, 15 thymosine en leucocyt interferon teweeg te brengen.

Het werkpaard van de recombinant DNA technologie is het plasmide, een non-chromosomale lus van dubbel strengig DNA aangetroffen in bacteriën en andere microben, vaak in veelvoudige co-pieen per cel. Opgesloten in de informatie, die in het plasmide 20 DNA is gecodeerd, is de informatie, die vereist is om het plasmide in dochtercellen· (dat wil zeggen een "replicon") en gewoonlijk een of meer selectie kenmerken te reproduceren, zoals in het geval van bacteriën, bestandheid tegen antibiotica, die het mogelijk maken clonen van de gasteel, die het plasmide van belang be-25 vat, te laten herkennen en bij voorkeur in selectieve media te laten groeien. De bruikbaarheid van plasmiden ligt in het feit, dat zij specifiek kunnen worden gesplitst door een of ander restrictie endonuclease of ''restrictie enzym", waarvan elk een verschillende plaats van het plasmide-achtige DNA herkent. Daarna 30 kunnen heterologe genen of gen-fragmenten opgenomen worden in het plasmide door eindstandige vereniging op de splitsingsplaats of opnieuw geconstrueerde einden, die grenzen aan de splitsingsplaats· DNA recombinatie wordt buiten de cel uitgevoerd, maar het verkregen "recombinant" plasmide kan daarin worden ingevoerd vol-33 gens een werkwijze, bekend als transformatie en grote hoeveelheden van het heterologe, gen bevattende recombinant plasmide zijn verkregen door de transformant te laten groeien. Bovendien kan, wanneer het gen op .geschikte wijze is ingesloten onder verwijzing naar delen van het plasmide, die de transcriptie en translatie 1*0 van de gecodeerde DNA boodschap regeren, de verkregen expressie- 8104400 3 * * % drager gebruikt worden om feitelijk de polypeptide-volgorde voort te brengen» waarvoor het opgenomen gen codeert» een werkwijze die wordt aangeduid als expressie·

Expressie wordt geïnitieerd in een gebied» dat bekend is als 5 de promotor» die wordt herkend door en gebonden door SNA polymerase· In sommige gevallen» zoals in de tryptofaan of ‘'bnp'1 promotor» die in de praktijk van de onderhavige uitvinding de voorkeur verdient» worden promotor-gebieden overlapt door ’’operator" gebieden onder vorming van een gecombineerde promotor-operator· Opera-10 tors zijn DNA volgorden, die herkend worden door zogenaamde repressor proteïnen, die dienen om de frequentie van transcriptie initiering bij een bijzondere promotor te regelen· Het polymerase beweegt zich langs het DNA, waarbij de informatie aanwezig in de coderingsstreng overgebracht wordt van het 5' naar het 3' einde 15 ia boodschapper BNA, dat op zijn beurt vertaald wordt ia een polypeptide met de aminozuur-volgorde, waarvoor het DNA codeert· Elk aminozuur is gecodeerd door een nucleotide triplet of ’’codon” waarbinnen voor de onderhavige doeleinden kan worden verwezen als het ’’structurele gen”, dat wil zeggea dat deel, dat de aminozuur-20 volgorde van het uitgedrukte produkt codeert· Na binding aan de promotor brengt het SNA polymerase eerst nucleotiden over, die een ribosoom bindingsplaats coderen, vervolgens een vertalings-initiering of ’’start” signaal (gewoonlijk ATG, dat in de verkregen boodschapper ENA AUG wordt), en vervolgens de nucleotide-25 codons in het structurele gen zelf· Zogenaamde stop-codons worden overgebracht naar het einde van het structurele gen, waarna het polymerase een additionele volgorde van boodschapper BNA kan vormen, die, vanwege de aanwezigheid van het stopsignaal, niet vertaald zal blijven door de ribosomen· Bibosomen binden aan de 50 bindingsplaats, verschaft op het boodschapper BNA* in bacteriën gewoonlijk naarmate het mBNA wordt gevormd en brengen zelf het gecodeerde polypeptide voort, beginnende bij het vertalings start-signaal en exciigeade bij het hiervoor vermelde stopsignaal· Het gewenste produkt wordt voortgebracht, wanneer de volgorden, die 35 de ribosoom bindingsplaats coderen, op geschikte wijze geplaatst zijn met betrekking tot het AÏÏG initiêringscodon en wanneer alle overblijvende codons het initiêringscodon ia fase volgen. Het verkregen produkt kan verkregen worden door de gasteel te lyseren en het produkt te winnen door geschikte zuivering uit ander bacte-ifO rieel proteïne.

8104400 * k

Terwijl isolering uit donor fibroblasten voldoende materiaal heeft verschaft voor partiele karakterisering en beperkte klinische onderzoekingen met homogeen leucocyt interferon, is het een totaal ontoereikende bron voor de hoeveelheden interferon» die 5 vereist zijn voor klinische onderzoekingen op grote schaal en voor profylactisch en/of therapeutisch gebruik daarna op grote schaal* Inderdaad zijn huidige klinische onderzoekingen onder toepassing van interferonen afkomstig van menselijk fibroblast bij antitumor en antivirus beproeving in hoofdzaak beperkt tot onzuivere (<1 % 10 zuiver) preparaten van het materiaal en lange aanvoertijden voor de bereiding van voldoende hoeveelheden» zelfs bij niet realistische prijsniveaus» hebben kritisch op een uitgebreid front onderzoek uitgesteld·

Bemerkt wordt» <jkat toepassing van recombinant DNA technolo-15 gie de meest doelmatige weg zal zijn voor het verschaffen van grote hoeveelheden fibroblast interferon» dat niettegenstaande de afwezigheid in aldus bereid materiaal van het glycosyleringskenmerk van van de mens afkomstig materiaal, klinisch kan worden toegepast bij de behandeling van een groot traject virusachtige en neoplas-20 tische ziekten en het is gelukt vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon microbieel voort te brengen» door een gen daarvoor te construeren, dat vervolgens kan worden opgenomen in micro-biele expressie-dragers en onder de controle van microbieel gen regelende controles kan uitdrukken* 25 Onze benadering voor het verkrijgen van een fibroblast gen omvat de volgende taken: 1* Partiele aminozuur-volgorden van menselijk fibroblast interferon werden gebruikt om stellen synthetische DNA sondes te construeren,, waarvan de codons, in het aggregaat, alle mogelijke 30 combinaties voorstelden, die in staat zijn de partiele aminozuur-volgorden te coderen* * 2* Bacteriele kolonie-banken werden bereid» die complementair DNA (cDNA) van geïnduceerd boodschapper RNA bevatten* De sondes van deel (1) werden gebruikt om de synthese van radioactief ge-35 merkt enkelstrengig cDNA voor te bereiden voor gebruik als hybri-diseringssondes. De synthetische zones zullen met geïnduceerd mRNA hybridiseren als mal en door omgekeerde overbrenging uitgebreid worden onder vorming van geïnduceerd, radioactief gemerkt cDNA* Clonen van de kolonie-bank, die hybridiseerden tot radio-k0 actief, gemerkt cDNA, op deze wijze verkregen, zijn verder onder- 8104400

Jr X

5 zocht om de aanwezigheid te bevestigen van een interferon met volle lengte coderend gen· Elk verkregen gen-fragment met vermeende partiele lengte werd zelf gebruikt als een sonde voor het gen met volle lengte· 5 3· Het hiervoor verkregen gen met volle lengte werd ónder toepassing van synthetisch DNA pasklaar gemaakt om eventuele gids— volgorde, die microbiele expressie zou kunnen voorkomen van het vol ontwikkelde polypeptide te eli^pren en een geschikte plaatsing in een expressie-drager mogelijk te maken met betrekking tot 10 startsignalen en de ribosoora bindingsplaats van een microbiele promotor· Uitgedrukt interferon werd gezuiverd tot een punt, dat bevestiging van de aard ervan en de bepaling van de activiteit ervan mogelijk maakt·

Door toepassing van werkwijzen van recombinant DNA technolo-15 gie zoals hiervoor uiteengezet, is een reeks repliceerbare plas-mide-achtige expressie-dragers geconstrueerd» die de synthese van hoog niveau in transformerende microorganismen van een vol ontwikkeld polypeptide met de eigenschappen van authentiek menselijk fibroblast interferon richten· Het polypeptide-produkt vertoont 20 de aminozuur-volgorde van een dergelijk interferon en is actief bij in vitro beproeving niettegenstaande het gemis van glycosyle-ringskenmerk van het van de mens afkomstig materiaal. Verwijzing hierin naar de ^uitdrukking van vol ontwikkeld fibroblast interferon11 betekent de bacteriêle of andere microbiele produktie van 25 een int erf er on-molecuul, dat gen glycosylgroepen of een voor-volg-orde bevat* die onmiddellijk gepaard gaat met mRNA vertaling van het menselijk fibroblast interferon genom· Vol ontwikkeld fibroblast interferon wordt volgens de onderhavige uitvinding onmiddellijk uitgedrukt uit een vertalingsstartsignaal (ATS)* dat ook het 30 eerste aminozuur codon van het natuurlijke produkt codeert· De aanwezigheid of afwezigheid van het methionine eerste aminozuur in het microbieel uitgedrukt produkt wordt geregeerd door een kinetisch verschijnsel afhankelijk van fermentatiegroei-omstan-digheden en/of expressie-niveaus in de transformerende gastheer.

35 Vol ontwikkeld fibroblast interferon kan ook tezamen worden uitgedrukt met een geconjugeerd proteïne anders dan de gebruikelijk gids, waarbij het conjugaat specifiek splitsbaar is in een intra-of extracellulaire omgeving (zie Brits octrooischrift 2.007.67βΑ). Tenslotte kan het vol ontwikkelde interferon geproduceerd worden 40 tezamen met een microbieel ,,sigaaal,, peptide, dat het conjugaat 8104400 s 6 i naar de celwand transporteert, waar het signaal wordt weggewerkt en het vol ontwikkelde polypeptide wordt afgescheiden·

De bijgevoegde figuren 1 en 5 worden in de tekst gedetailleerd beschreven· Fig· 6 stelt schematisch de constructie van 5 plasmiden codering voor voor de direkte expressie van vol ontwikkeld fibroblast interferon· Restrictieplaatsen en residuen zijn zoals aangegeven ("Pst I", enz·)· "Ap " en "Tc " stellen delen van het plasmide voor, die resp· bestandheid tegen ampicilline en tetracycline uitdrukken· Het opschrift "p o” is aan afkorting 1Q "promotor operator"·

Beschrijving van de voorkeursuitvoeringsvormen A· Toegepaste microorganismen

Het beschreven werk hield het gebruik in van het microorga-nisme E. coli K-12 stam 294 (einde A, thi , hsr , hsm^), zoals 15 beschreven in het Britse octrooischrift 2·055·3δ2. Deze stam is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, ATCC inschrijving no· 31446· Alle recombinant DNA werk werd uitgevoerd overeenkomstig toepasselijke richtlijnen van de National Institutes of Health· 20 De uitvinding, beschreven in de uitvoeringsvormen, die het meest de voorkeur verdienen onder verwijzing naar E· coli K-12 stam 294* zoals hiervoor gedefinieerd, omvat evenwel ook andere bekende E· coli stammen zoals E· coli B, E· coli x 1766 en E. coli W 3110* of andere microbiele stammen, waarvan vele gede-25 poneerd zijn en (potentieel) beschikbaar zijn bij erkende micro-organisme deponeringsinstituten, zoals de American Type Culture Collection (ATCC)· Zie ook het Duitse Offenlegungsschrift 2.62)4,432. Deze andere microorganismen omvatten bijvoorbeeld Bacilli zoals Bacillus subtilis en andere enterobacteriaceae 30 waaronder als voorbeelden vermeld kunnen worden Salmonella typhimurium en Serratia marcescens, onder toepassing van plasmiden, die heterologe gen volgorden daarin kunnen repliceren en uitdrukken· Gist, zoals Saccharomyces cerevisiae, kan ook met voordeel worden toegepast als gastheer organisme bij de bereiding 35 van interferon proteïne ervan door het uitdrukken van genen codering daarvoor onder de controle van een gistpromotor· B* Algemene methoden

Restrictie enzymen werden gekocht van New England Biolabs en zoals aangegeven gebruikt· Plasmide DNA werd bereid volgens 40 een vrijgegeven standaard lysaat methode (D*B, Clewell, J· Bac— 8104400 7 teriol. 110 [1972] 667-676) en gezuiverd door kolomchromatografie met Biogel A-50M. DNA volgorde aanbrenging werd uitgevoerd onder toepassing ran de methode van Maxam en Gilbert (Methods Enzymol.

65 [19S0] 499-560)* DNA restrictie fragmenten werden geisoleerd 5 uit polyacrylamide gelen door elektro-elutie· DNA fragmenten werden radioactief gemerkt voor gebruik als hybridiseringssondes volgens de willekeurige kalf thymus DNA voorbereidingsmethode van Taylor c«s* (Biochim· Biophys. Acta 4421 [1976] 324-330)· In situ kolonie hybridiseringen werden uitgevoerd volgens de Grunstein-10 Hogness procedure (Proc· Natl· Acad. Sci· ÏÏSA 22, [1975] 3961-3975).

C. Chemische synthese van deoxyoligonucleotiden

De deoxyoligonucleotiden werden gesynthetiseerd volgens de gemodificeerde fosfotriestermethode in oplossing (Crea c.s·» 15 Proc· Natl. Acad· Sci· ÏÏSA 75» [1978] 5765-5769)» onder toepassing van trideoxynucleotiden als bouwblokken (Hirose c.s.» Tetrahedron Letters 28, [1978] 2449-2452). De materialen en algemene methoden waren soortgelijk aan die beschreven door Crea c.s., Nucleic Acids Hes. 8 [1980] 2331-2348. De zes poules van voor-20 bereiders (fig. 1), die elk vier dodecanucleotiden bevattenf werden verkregen door gescheiden koppeling van twee hexamere poules (van twee verschillende 5 '-eindstandige volgorden elk) met drie verschillende hexamere poules (van twee verschillende 3f-eiudstan-dige volgorden elk)· 25 D· Inductie van fibroblasten

Menselijke fibroblasten (cel lijn GN-2504A) werden voortgebracht zoals hiervoor beschreven door Pestka c.s·, Proc· Natl.

Acad· Sci· ÏÏSA 72, [1975] 3898-3901. Groeimedium (Eagle's minimaal essentieel medium, dat 10 % foetaal kalfserum bevat) werd 30 verwijderd uit rolflessen (850 cm^) en vervangen door 50 ml groeimedium, dat 50yUg/ml poly(I):poly(C) en 10yug/ml cyelo-heximide bevat. Dit inductiemedium werd na 4 uren bij 37°C verwijderd en cel-monolagen werden gewassen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 0,14 mol NaCl, 3 mmol KCl, 1,5 mmol 35 KH^PO^, 8 mmol Na^HPO^). Elke fles werd geïncubeerd bij 37°C met 10 ml van een trypsine - EDTA oplossing (Gibco 610-5305) tot de cellen waren losgemaakt en foetaal kalfsserum werd toegevoegd tot een concentratie van 10 Cellen werden 15 minuten bij 500 x G gesponnen en korrels werden opnieuw gesuspendeerd in PBS, sa-40 mengebracht en opnieuw gesedimenteerd. Cellen werden in vloei- 8104400 8 Λ ·;;> .....

bare stikstof bevroren* Ongeveer 0,17 g cellen werden verkregen per rolfles»

E* Bereiding en bepaling van interferon mBNA

Poly(A) bevattend mBNA werd bereid uit menselijke fibroblas-5 ten door fenol extracties en.oligo(dÜ?)-cellulose chromatografie zoals bescbreven door Green c.s. (Arch.· Biochem· Biophys. 172, [1975] 7^-89, Het poly (A) bevattende SNA werd verrijkt aan interferon mBNA door centrifugeren op een lineaire 5-20 gew./vol·# sucrose-gradient. De BNA monsters werden 2 minuten tot 80°C ver-10 warmd, snel gekoeld, als laag aangebracht over de gradient en 20 uren gecentrifugeerd bij 30*000 omwentelingen/minuut bij lf°C in een Beekman SW-JfO rotor· Fracties werden verzameld, met ethanol neergeslagen en in water opgelost·

Monsters van 1 microgram mBNA werden geïnjecteerd in 15 Xenopus laevis oocytes zoals beschreven door Cavalieri c*s.,

Proc, Natl. Acad# Sci. USA 7kt [1977] 3287-3291* De geïnjecteerde oocyten werden 2½ uren bij 21°C geïncubeerd, gehomogeniseerd en 5 minuten bij 10,000 x g gecentrifugeerd. Het interferon in de bovenstaande laag werd bepaald door de remmingsbepaling van het 20 cytopathische effect (CPE) (Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, New-York-ïïien, 1979) onder toepassing van Sindbis virus en menselijke diploïde cellen (WISH)· Interferon titers van 1,000 tot 6,000 eenheden gewonnen (NIH referentie standaard) per microgram geïnjecteerd BNA werden routinematig 25 verkregen voor de 12S soorten van mBNA.

F. Synthese en cloonvorming van cDNA

Enkel strengig cDNA werd bereid in 100^ul reacties, die 5/Ug 12S fractie mBNA, 20 mmol Tris-HCl (pH 8,3)$ 20 mmol KCl, / *52 8 mmol MgCl^,^^50 mmol β-mercatoethanol» 100^uCi (a P)dCTP en 30 1 mmol dATP,ydGfri?, dTTP, bevatten· De voorbereider was het syn thetische HindlII decameer dCCAAGCTTGG (Scheller c«s·, Science 196, [1977] 177“18o) dat aan de eindstandige 3'-plaats was verlengd met ongeveer 20 tot 30 deoxythymidine-residuen onder toepassing van eindstandig deoxynucleotidyl transferase (Chang c.s·, 35 Nature 275, [1978] 617-62½). 100 eenheden van tegengesteld transcriptase werden toegevoegd en het reactiemengsel werd 30 minuten bij 42°C geïncubeerd. De tweede streng DNA synthese werd uitgevoerd zoals hiervoor beschreven (Goeddel c.s., Nature 281, [1979] 544-5^8. Het dubbel-strengige cDNA werd behandeld met ¥> 1200 eenheden S1 nuclease gedurende 2 uren bij 37° C in 25 mmol 8104400 9 natriumacetaat (pH 4,5)» 1 nuaol ZaCl^ ^ 0*3 mmol NaGl· Na fenol— extractie werd het mengsel elektroforetisch gescheiden over een 8 # polyacrylaminegel· cDNA (ongeveer 0*5^us) variërend van 550 tot 1500 basisparen in afmeting werd door elektro-elutie gewon-5 nen· Een evenmatig deel van 20 ng werd verlengd met deoxy C residuen onder toepassing van eindstandig deoxynucleotidyl transferase (Chang c«s·, zie hiervoor) en langzaam afgekoeld met 100 ng pBR322, dat gesplitst was met PstI en van een staart was voorzien met deoxy G residuen (Ghang c,s», zie hiervoor)· Het gekoelde 10 mengsel werd gebruikt om E* coli K-12 stam 29b te transformeren volgens een gepubliceerde methode (Hershfield c#s·, Proc· Natl# Acad* Sci* USA £1, [197½] 3455-3459).

G· BftreTd-tnpi van geïnduceerde en niet-gexnduceerde ^2P-cDNA sondes 15 5yUg 12S mHNA werden gecombineerd met hetzij 2^ug oligo (dT)^2 -jg of 5yüg van. elke synthetische voorbereider poule (fig. 1) in 60yUl 10 mmol Tris-HCl (pH 8)» 1 mmol EDTA· De mengsels werden 3 minuten gekookt en op ijs afgeschrikt· 60^ul 40 mmol Tris-HCl (pH 8,3), 40 mmol KCl, 16 mmol MgCl-, 60 mmol -7 20 β-mercaptoethanol, 1 mmol dATP, dGTP, dTTP en 5 x 10 mmol (a-^2P) dCTP (2,000 - 3.000 Ci/mmol) werd toegevoegd aan elk mol-voorbereidermengsel bij 0°C. Na de toevoeging van 100 eenheden omgekeerde transcriptase werden de reacties geïncubeerd bij 42°C gedurende 3° minuten en gezuiverd door passage over kolommen van 25 10 ml Sephadex G-50· De produkten werden 30 minuten bij 70°C be handeld met 0,3 N NaOH, geneutraliseerd en met ethanol geprecipiteerd ·

De ^P-cDNA's werden gecombineerd met 100^ug poly(A) mHNA van niet-gexnduceerde fibroblasten in 50^ul 0,4 molair natrium-30 fosfaat (pH 6,8), 0,1 % natriumdodecylsulfaat (SOS), De mengsels werden 5 minuten tot 98°C verwarmd en langzaam gedurende 15 uren tot 45°C gekoeld* De DNA-HNA hybriden (die niet geïnduceerde cDNA volgorden bevatten) werden gescheiden van enkel strengig DNA (geïnduceerde cDNA volgorden) door chromatografie over hydroxy-35 apatiet, zoals beschreven door Galau c.s· (Proc· Natl· Acad. Sci· USA 74, [1977] 1020-1023. De DNA-HNA hydriden werden met alkali behandeld ter verwijdering van ENA.

H· Zeven van recombinant plasmid en met ^P-cDNA sondes

Monsters van ongeveer 1^ug van plasmide DNA werden bereid 40 uit afzonderlijke transformanten volgens een gepubliceerde metho- 8104400 « • ‘ 1p de (Birnboim c.s·, Nucleic Acids Res· 7, [1979] 1513-1523)· De DNA monsters werden lineair gemaakt door ontsluiting met EcoRI , gedenatureerd in alkali en aangebracht op elk van drie nitrocellulose filters volgens de stip hybridiseringsmethode 5 (Kafatos c.s·» Nucleic Acids Res· £, [1979] 1541-1552). De filters werden gehybridise'erd met de ^P-cDNA sondes gedurende 16 uren bij 42° C in 50 %. formamide, 10x Denhardt's oplossing (Biochem. Biophys· Res* Comm· 23» [1966] 61*1-646, 6xSSC, 40 mmol Tris-HCl (pH 7,5), 2 mmol EDTA, 40yug/ml gist RNA. Filters werden 10 gewassen met 0,1 x SSC, 0,1 % SDS tweemaal gedurende 30 minuten bij 42°C, gedroogd en blootgesteld aan Kodak XR-2 rontgenstraal-film onder toepassing van Dupont lightning-Plus intensiverings-zeven bij -80°C· [SSC bevat 0,15 mol NaCl en 0,015 mol natrium-citraat, pH 7,01]· 15 I* Constructie van plasmiden voor direkie expressie van FIF De synthetische voorbereiders I (dATGAGCTACAAC) en IX (dCATGAGCTACAAC) werden gefosforyleerd onder toepassing van T4 *zp polynucleotide kinase en (ƒ- P)ATP tot een specifieke activiteit van 700 Ci/mmol zoals beschreven door Goeddel c.s·, Proc· Natl.

20 Acad. Sci. USA 21» [1979] 106-110· Voorbereider herstelreacties 32 werden als volgt uitgevoerd: 250 pM van de P-voorbereiders werden gecombineerd met 8yUg (10 pM) van een 1200 bp Hhal restrictie fragment, dat de FIF cDNA volgorde bevat· Het mengsel werd met ethanol neergeslagen, opnieuw gesuspendeerd in 50^ul water, 3 mi-25 nuten gekookt, in een bad van droog ijs en ethanol af geschrikt en gecombineerd met 50yUl van een oplossing van 20 mmol Tris-HCl (pH 7,5), 14 mmol MgCl^, 120 mmol NaCl, 0,5 mmol dATP, dCTP, dGTP, dTTP bij 0°C· 10 eenheden van DNA polymerase I Klenow fragment werden toegevoegd en het mengsel werd 4,5 uren bij 37°C ge-30 incubeerd· Na extractie met fenol/CHCl, en restrictie met PstI werd het gewenste produkt gezuiverd over een 6 % polyacrylamide-gel· Daaropvolgende afbindingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (cohesieve termini) of 4°C (stompe einden) onder omstandigheden, die hiervoor zijn vermeld (Goeddel c*s*,· zie hiervoor). 35 J. Bepaling voor interferon expressie in E· coli

Bacteriele extracten werden als volgt bereid voor IF bepaling: Cultures van 1 ml werden een nacht gekweekt in LB (Luria-Bertani) medium, dat 5/Ug/ml tetracycline bevatte, vervolgens verdund in 25 ml van een M9 medium, aangevuld met 0,2 % glucose, 40 0,5 % casaminozuren en 5yUg/ml tetracycline· Monsters van 10 ml 8104400 * 11 werden door centrifugeren verzameld wanneer het absorberend vermogen bij 550 am (A-,.,,) de waarde 1 *0 bereikte· De oelkorrels werden snel bevroren in een bad van droogijs en ethanol en gezuiverde lysaten werden bereid zoals beschreven door Clewell (zie 5 hiervoor)· De interferon activiteit in de bovenstaande lagen werd bepaald door vergelijking met NIH FIF standaards onder toepassing van CPE remmingsbepalingen· Twee verschillende bepalingen werden gebruikt: (a) WISH (menselijk amnion) cellen werden uitgezaaid in microtiter schalen· Monsters werden 16 tot 20 uren later toe-10 gevoegd en verdund door achtereenvolgende tweevoudige verdunningen· Sindbis virus werd toegevoegd na ten minste 3 uren incubatie· Platen werden 20 tot 24 uren later gekleurd met kristal violet· (b) MDBK (rundemier) cel-reeks werd gelijktijdig uitgezaaid met tweevoudige verdunningen van monsters· Vesiculair stomatitis virus 13 werd na 2 tot 3 uren incubatie toegevoegd en platen werden 16 tot 18 uren later met kristal violet gekleurd* Voor het onderzoek van de stabiliteit bij pH 2 werden bacteriele extracten en standaardproeven verdund in minimaal essentieel medium tot een concentratie van 1000 eenheden/ml· Evenmatige hoeveelheden van 1 ml werden met 20 1 N HC1 op een pH van 2 ingesteld» 16 uren bij 4°C geincubeerd en door toevoeging van NaOH geneutraliseerd· De IP activiteit werd bepaald volgens de CPE remmingsbepaling onder toepassing van menselijke amnion cellen· Om de antigene identiteit vast te stellen werden evenmatige hoeveelheden van 25^ul van de interferon mon-25 sters van 1000 eenheden/ml (onbehandeld) geïncubeerd met 25^ul konijnen antimenselijk leucocyt interferon gedurende 60 minuten hij 37°C» met 12*000 x g 5 minuten gecentrifugeerd en de bovenstaande laag werd bepaald· Fibroblast en leucocyt interferon standaards werden verkregen van de National Institutes of Health» 30 Konijnen antimenselijk leucocyt interferon werd verkregen van de National Institute of Allergy and Infectious Diseases·

Κ· Chemische synthese van voorbereider -poules complementair voor FIF mBNA

De bekende amino-eindstandige protelne-volgorde van mense-35 lijk fibroblast interferon maakte het mogelijk de 24 mogelijke mBNA volgorden af te leiden» die de eerste vier aminozuren kunnen coderen· De 24 complementaire deoxyoligonucleotiden werden gesynthetiseerd in 6 poules van 4 dodecameren elk (fig* 1).

De zes poules van 4 deoxyoligonucleotiden elk werden gesyn-40 thetiseerd volgens de gemodificeerde fosfotriester-methode in op- 8104400

* V

v 12 lossing of op een vaste fase (Crea c»s·, zie hiervoor)· De basisstrategie hield reactie in van twee verschillende 31-geblokkeerde ' trimeren met een overmaat van een enkelvoudig 5*-beschermd tri-meer voor het voortbrengen van een poule van twee hexameren , elk 5 gelijk aanwezig. De koppeling van twee poules* die elk twee hexa-meren bevatten,; resulteerde daarna in een poule van vier dodeca-meren..

L· Identificatie van FIF cDNA olonen.

Onder toepassing van 12S mRNA van geïnduceerde menselijke 10 fibroblasten (1000 eenheden IF activiteit per yUg bij de oocyt bepaling), werd dubbel strengig cDNA bereid en opgenomen in pBR322 bij de PstI plaats volgens de standaard dG:dC staartvor-mingsmethode zoals beschreven door Chang c.s., zie hiervoor. Een fibroblast cDNA bibliotheek bestaande uit 30.000 voor ampicilline-13 gevoelige, tegen tetracycline bestand zijnde transformanten van E. coli K-12 stam 29½ werd verkregen uit 20 ng cDNA, in grootte variërend van 550 tot 1300 basis-paren. Plasmide DNA werd bereid uit 600 van de trans formanten en aangebracht op 3 stel nitrocel-lulose-fliters zoals hiervoor beschreven» 20 De benadering gevolgd bij de identificatie van hybride plasmiden, die fibroblast interferon cDNA volgorden bevatten, was soortgelijk aan de benadering gebruikt voor het identificeren van menselijke leucocyt interferon recombinant plasmiden (Goeddel c.s., Nature 287, [1980] If11-ifl6). Radioactief gemerkte cDNA 25 hybridiseringssondes werden bereid onder toepassing van hetzij de 2½ synthetische dodecameren hetzij oligoCdT)^.^ a^s voorbereiders en 12S RNA van geïnduceerde fibroblasten (5000 eenheden/ 32 ,ug in oocyten) als mal. De verkregen J P-cDNA's (specifieke / 8 viscositeit > 5 x 10 cpm/^ug) werden gehybridiseerd tot een gro-30 te overmaat mRNA geïsoleerd uit niet-geïnduceerde menselijke fibroblasten en de mRNA-cDNA hybriden- werden afgescheiden van niet-omgezet cDNA volgens hydroxyapatiet chromatografie (Galau'e.s·, zie hiervoor). De enkel strengige cDNA fracties dienen verrijkt te zijn aan volgorden, die aanwezig zijn in geïnduceerde fibro-35 blasten, maar afwezig zijn in niet-geïnduceerde cellen en de mRNA-cDNA hybriden dienen volgorden voor te stellen, die gemeenschappelijk zijn voor zowel geïnduceerde als niet-geïnduceerde cellen». Ongeveer if x 10^ cpm enkel strengig cDNA (hybridiserings-sonde A) en 8 x 10 cpm cDNA-mRNA hybriden werden verkregen onder ifO toepassing van met oligo(dT)^2_ig ν00Γΐ3ΘΓβ^^ cDNA; 1,5 x 10 cpm 8104400 .s ., «* 13 c van enkel strengig (hybrid iseringss onde B) en 1 *5 x 10 cpm hy- briden werden verkregen uit cDNA voorbereid onder toepassing van synthetische dodecameer poules 1-6· De cDNA-mRNA hybriden van beide fractioneringen werden samengevoegd, het RNA werd gehydro- 5 lyseerd door behandeling met alkali en het ^P-cDNA werd gebruikt als hybridiseringssonde C. Vele van de 600 plasmide monsters en hybridiseerd met zowel sonde A als C* hetgeen erop wees* dat de _ 32 hybridiseringsreacties tussen niet-gexnduceerd mRNA en P-cDNA (voorafgaande aan de hydroxyapatie fractioneringstrap) niet vol-10 tooid werden. Slechts êên van de 600 plasmiden (pF526) echter hybridiseerde sterk met de specifiek voorbereide* geïnduceerde cDNA sonde B (fig. 2). Plasmide pF526 hybridiseerde eveneens met de totale met oligoidT)^ voorbereide* geïnduceerde cDNA sonde A en schoot te kort bij het geven van een waarneembare hybridise-15 ring tot de gecombineerde niet-geïnduceerde sonde C.

Pstl ontsluiting&pF526 liet zien dat de gecloonde cDNA opname ongeveer 53° basis-paren lang was* waarschijnlijk te kort om het gehele coderingsgebied te bevatten voor fibroblast interferon.

Daarom werd een met P-gemerkte DNA sonde bereid uit dit PstI 20 fragment door willekeurige voorbereiding met kalfsthymus DNA (Taylor c.s·* zie hiervoor). Deze sonde werd gebruikt voor het zeven van 2000 afzonderlijke koloniën van een nieuw gecobstrueer-de fibroblast cDNA bibliotheek (de nieuwe cDNA bibliotheek werd bereid onder toepassing van 12S mRNA van geïnduceerde fibroblas-25 ten met een titer van 6.000 eenheden/ml in het oocyt bepalings-systeem). Zestien clonen hybridiseerden tot de sonde. Plasmiden bereid uit het grootste deel ervan gaven twee fragmenten af bij splitsing met PstI* hetgeen erop wees dat het cDNA een inwendige PstI plaats bevatte. Cloon pFIF3 bevatte de grootste cDNA opname* 50 ongeveer 800 basis-paren. De DNA volgorde van de opname werd be paald volgens de Maxam-Gilbert methode (zie hiervoor) en is in fig. 3 getoond. De aminozuurvolgorde van menselijk fibroblast interferon voorspelt uit de nucleotide volgorde is identiek aan die* die onlangs is vermeld door Taniguchi c.s. (Gene 10, [1980] 35 11-15) en door Derynck c.s. (zie hiervoor) uit DNA volgorde vor ming van FIF cDNA clonen. Een voorprodukt of signaal-peptide van 21 aminozuren wordt gevolgd door een volgorde van 166 aminozuren, die het vol ontwikkelde interferon * een verlenging van voorstelt 106 3'-niet vertaalde nucleotiden en een poly(A) staari/· De NH^-IfO eindstandige 20 aminozuren van vol ontwikkeld FIF zijn direkt 8104400 * • 1b ♦ bepaald door proteïne micro-volgordevorming en zijn dezelfde als die voorspeld uit de DNA volgorde·

Direkte expressie van fibroblast interferon Om hoge niveaus van vol ontwikkeld fibroblast interferon in 5 Ε· coli uit te drukken dient initiering van proteïne-synthese plaats te hebben bij de ATG codon van het vol ontwikkelde polypeptide (aminozuur 1)' in plaats van het bij ATG van het signaal peptide (aminozuur S1) (fig# 3)·

Onze benadering voor de verwijdering van de signaal peptide 10 coderingsgebieden van pFIF3 is ia fig· b voorgesteld· Een 1200 bp DNA fragment) dat de gehele cDNA opname bevat) werd geïsoleerd uit een polyacrylamidegel na ontsluiting van pFIF3 met Hhal· Twee afzonderlijke synthetische deoxyoligonucleotide voorbereiders, dATGAGCTACAAC (I) en dCATGAGCTACAAC (II), werden bereid. Beide 15 voorbereiders bevatten de coderingsvolgorde voor de eerste vier aminozuren van vol ontwikkeld fibroblast interferon; voorbereider II heeft een additionele C bij het 5'-einde. Voorbereider-herstelreacties en daarop volgende afbindingen werden gescheiden uitgevoerd voor de voorbereiders I en II en gaven vrijwel iden-20 tieke resultaten· Daarom worden slechts reacties onder toepassing van voorbereider I hier in detail besproken· De voorbereiders wa-ren 3' -radioactief gemerkt onder toepassing van (ƒ- P)ATP en Tif polynucleotide kinase, gecombineerd met het 1200 bp Hhal DNA fragment en de mengsels werden door koken gedenatureerd· Na hy-25 bridisering van de voorbereider tot het gedenatureerde Hhal DNA fragment, werd E. coli DNA polymerase I Klenow fragment (Klenow c.s., Proc. Natl. Acad. Sci* USA 65, [1970] 168-175) gebruikt om de herstelsynthese van de plus (top) streng (fig· b) te katalyseren· Bovendien verwijderde de samengaande 3' 5' exonuclease 30 activiteit van het Klenow fragment het 3’-uitstekende einde van de minus (bodem) streng, waarbij een glad einde achterbleef· Analyse van monsters van het reactiemengsel door polyacrylamidegel-elektroforese gaf aan dat de herstel-synthese niet tot voltooiing was gegaan, maar bij verschillende afzonderlijke plaatsen ophield. 35 Daarom werd het gehele reactiemengsel behandeld met PstI en het gewenste 1if1 bp fragment (180·000 Cerenkow cpm;/-*- 0,3 pM) werd gezuiverd door polyacrylamide-gel-elektroforese (fig· 5)· Afbinding van dit fragment tot 1^ug (~ if pM) van het 363 bp Pstl-BglII fragment geisoleerd uit pFIF3 (fig· b)y gevolgd door BglII ont-40 sluiting, gaf 50.000 Cerenkow cpm (-^ 0,1 pM, />*- 30 ng) van het 8104400 Αι 15 504 bp DNA fragment, dat de gehele coderingsvolgorde bevat voor vol ontwikkeld fibroblast interferon· Dezelfde reacties onder toepassing van voorbereider II gaven 83·000 cpm (^ 0,15 pM, rv 50 ng) van 505 bp produkt* 5 Be constructie van plasmiden, die de synthese van menselijk fibroblast interferon richt, is in fig· 6 toegelicht· Afzonderlijke expressie-plasmiden werden geconstrueerd, die de FIF synthese onder de controle plaatsen van de E· coli lac of promotor-opera-tor systemen· Deze beide systemen hebben bewezen bruikbaar te 10 zijn voor de direkte expressie van eucaryotische genen in E· coli: menselijk groei-hormoon is doelmatig gesynthetiseerd onder toepassing van het lac systeem (Goeddel c.s·, Nature 281, [1979] 544-548) en menselijk leucocyt interferon is geproduceerd met hoge opbrengsten onder toepassing van het trp systeem (Goeddel c.s·, 13 Nature 28£, [1980] 411.

pBBH trp werd ontsloten met EcoEI restrictie enzym en het verkregen fragment werd geïsoleerd door PAGE en elektro-elutie.

Met EcoBI ontsloten plasmide pSom 11 (Itakura c.s., Science 198,

[1977] 1056-1063); Brits octrooischrift 2.007.676) werd gecombi-20 neerd met het hiervoor vermelde fragment. Het mengsel werd afgebon-den met T, DNA ligase en het verkregen DNA werd getransformeerd in E· coli K-12 stam 294 zoals hiervoor beschreven. Transformant bacteriën werden geselecteerd op ampicilline bevattende platen· Verkregen tegen ampicilline bestand zijnde koloniën werden ge-25 zeefd door kolonie hybridisering (Grunstein c.s·, zie hiervoor) onder toepassing «is sonde van de tip promotor-operator, die het hiervoor vermelde fragment geïsoleerd uit pBBHtrp bevat, dat radioactief gemerkt is met P32. Verschillende koloniën, die positief blijken bij kolonie hybridisering werden geselecteerd, 30 plasmide DNA werd geïsoleerd en de oriëntatie van de opgenomen fragmenten werd bepaald door restrictie analyse onder toepassing van restrictie enzymen ÊglII en Bamïïl in dubbele ontsluiting.

E. coli 294» dat het plasmide aangeduid met pS0M7A2 bevatte, dat het trp promotor-operator fragment in de gewenste oriëntatie be-35 zat, werd gekweekt in LB medium, dat lO^ug/ml ampicilline bevat.

De cellen werden gekweekt tot de optische dichtheid 1 (bij 550 nM), door centrifugeren verzameld en opnieuw gesuspendeerd in M9 media in tienvoudige verdunning. Cellen werden 2 tot 3 uren gekweekt, opnieuw tot de optische dichtheid 1, vervolgens gelyseerd 40 en het totale cellulaire proteïne werd geanalyseerd door SDS ureum 8104400 Λ 16 (15 #) PAGE (Maize! c.s.r Methods Virol» £, [1971] I80-246.

Plasmid© pBR322 was ontsloten HindlII en de zich uitstrekkende HindlII einden werden op hun beurt ontsloten met S1 nuclease. De S1 nuclease ontsluiting hield de behandeling in van 10yug 5 met HindlII gesplitst pBR322 in 30^ul SI buffer (0,3 mol NaCl, 1 mmol ZnClp, 25 mmol natriumacetaat, pH 4,5) met 300 eenheden SI nuclease gedurende 30 minuten bij 15 C* De reactie werd gestopt door de toevoeging van 1^ul 30 x S1 nuclease stopoplossing (0,8 mol Tris base, 50 mmol EDTA)· Het mengsel werd met fenol ge-10 extraheerd, met chloroform geextraheerd en met ethanol neergesla-, gen, vervolgens werd EcoRI ontsloten zoals hiervoor beschreven en werd het grote fragment (1) verkregen volgens de RAGE methode gevolgd door elektro-elutie* Het verkregen fragment heeft een eerste EcoRI klevend eind en een tweede stomp eind, waarvan de 15 coderingsstreng begint met het nucleotide thymidine.

Plasmide pSom7A2, zoals hiervoor bereid, was met BglII ontsloten en de verkregen BglII klevende einden waren dubbelstrengig gemaakt met de Klenow polymerase I methode onder toepassing van alle vier deoxynucleotide trifosfaten* EcoRI splitsing van het 20 verkregen produkt gevolgd door PAGE en elektro-elutie van het kleine fragment (2) gaf een lineair stuk van DNA, dat de trypto-fan promotor-operator en codons van de ΙΕ* "proximale" volgorde stroomopwaarts van de BglII plaats (’’LE*(p)H) bevatte. Het produkt bezat een EcoRI einde en een stomp einde afkomstig van het opvul-25 len van de BglII plaats* Echter wordt de BglII plaats opnieuw samengesteld door afbinding van het stompe einde van fragment (2) aan het stompe einde van fragment (1). Derhalve werden de twee fragmenten verbonden bij aanwezigheid van DNA ligase onder vorming van het gerecirculeerde plasmide pHKY 10, dat was voortge-30 plant door transformatie in competente E. coli stam 294· cellen.

Plasmide pGMl draagt het E. coli tryptofan operon, dat de coupure ΔΙΕ1413 (Miozzari c.s., J. Bacteriology 133, [1978] 1457-12*66) bevat en dientengevolge een fusie proteïne uitdrukt, dat de eerste 6 aminozuren van de trp gids en ongeveer het laatste derde 35 deel van het trp E polypeptide (hierna aangeduid in samenhang als LEJ’), alsmede het trp D polypeptide in zijn geheel bevat, alle onder de controle 'van het trp promotor-operator systeem. Het plasmide, 20^ug, werd ontsloten met het restrictie enzym PvuII, dat het plasmide op vijf plaatsen splitst. De gen fragmenten wer-40 den vervolgens gecombineerd met EcoRI verbinders (bestaande uit 8104400 * 17 ' een zelf complementair oligonucleotide van de volgorde: pCATGAAÏTCATG) waarbij een EcoEI splitsingsplaats verschaft wordt voor een latere cloonvorming in een plasmide, dat een EcoRI plaats bevat· De 20^ug van DNA fragmenten verkregen uit pGM1 wer-5 den behandeld met 10 eenheden T^ DNA ligase bij aanwezigheid van 200 pico mol van het 5^86^810^18 er de synthetische oligonucleotide pCATGAATTCATG en in 20^ul T^ DNA ligase buffer (20 mmol Tris, pH 7,6, 0,5 mmol ATP* 10 mmol MgCl^i 5 mmol dithiotreitol) bij if°C gedurende de-nacht· De oplossing werd vervolgens 10 minuten 10 tot 70°c verwarmd om afbinding tot staan te brengen· De verbindingsmiddelen werden gesplitst door EcoRI ontsluiting en de fragmenten, nu met EcoRI einden werden gescheiden onder toepassing van 5 % PAGE en de drie grootste fragmenten werden geïsoleerd uit de gel door eerst te kleuren met ethidiumbromide', de fragmenten met 15 ultraviolet licht te lokaliseren en uit de gel de delen van belang te snijden. Elk gel-fragment, met 300 microliter 0,1 x TBE, werd in een dialysezak geplaatst en onderworpen aan elektroforese bij 100 7 gedurende een uur in 0,1 x TBE buffer (TBE buffer, die 10,8 gm Tris base, 5>5 Sm boorzuur, 0,9 gm Na£EDTA in 1 liter 20 H^O bevat).De water bevattende oplossing werd uit de dialyse-zak verzameld, met fenol geëxtraheerd, met chloroform geëxtraheerd en met natriumchloride 0,2 molair gemaakt en het DNA werd in water gewonnen na ethanol precipitatie. De trp promotor-operator, die gen bevat met EcoRI klevende einden werd geïdentificeerd volgens 25 de hierna beschreven methode, die de opname van fragmenten in een voor tetracycline gevoelig plasmide met zich mee brengt, dat na promotor-operator opname, tegen tetracycline bestand wordt.

Plasmide pBRH1 (Rodriguez c«s., Nucleic Acids Research 6,

[1979] 3267-3287) drukte bestandheid tegen ampicilline uit en 30 bevat het gen voor bestandheid tegen tetracycline maar drukt, daar geen geassocieerde promotor aanwezig is, niet deze bestandheid uit. Het plasmide is dientengevolge gevoelig voor tetracycline. Door introductie van een promotor-operator systeem in de EcoRI plaats, kan het plasmide tegen tetracycline bestand worden 35 gemaakt.

pBRE1 werd ontsloten met EcoRI en het enzym werd verwijderd door extractie met fenol gevolgd door extractie met chloroform en in water gewonnen na precipitatie met ethanol· Het verkregen DNA molecuul werd, in gescheiden reactiemengsels, gecombineerd met if0 elk van de drie DNA fragmenten zoals hiervoor verkregen en afge- 8104400 18 bonden met T^ DNA ligase zoals hiervoor beschreven* Het in het reactiemengsel aanwezige DNA werd gebruikt om competente E. coli K-12 stam. 294 te transformeren volgens standaard-technieken (Hershfield c.s*,. zie hiervoor) en de bacteriën werd op LB platen 5 .aangebracht» die 20yUg/ml ampicilline en 5yUg/ml tetracycline bevatten* Verschillende tegen tetracycline bestand zijnde koloniën werden geselecteerd» met plasmide DNA geïsoleerd en de aanwezigheid van het gewenste fragment werd bevestigd door restrictie enzym analyse» Het verkregen plasmide wordt aangeduid met pBBHtrp.

10 Een EcoRI en BamHI ontsluitingsprodukt van het virale genom van hepatitis B werd verkregen met gebruikelijke methoden en ge-cloond in de EcoBI en BamHI plaatsen van plasmide pGH6 (foeddel c.s*» Nature 281» [1979] 544-548) voor het vormen van het plasmide pHS32» Plasmide pHS32 werd gesplitst met Xbal, met fenol geëxtra-15 heerd» met chloroform geëxtraheerd en met ethanol neergeslagen* Vervolgens werd het behandeld met 1^ul E* coli polymerase I»

Klenow fragment» in 30yVÜ. polymerase buffer (50 mmol kaliumfos-faat pH 7*4» 7 mmol MgCfl^» 1 mmol β-mercaptoethanol), die 0»1 mmol dTTP en 0,1 mmol dCTP bevat gedurende 30 minuten bij 0°C en vervol-20 gens 2 uren bij 37°C* Deze behandeling brengt 2 van de 4 nucleotiden complementair naar het 5' uitstekende einde van de in te vullen Xbal splitsingsplaats: 5' CTAGA-- 5' CTAGA- ji......... ffg ...... · 25 Twee nucleotiden, dC en dT, werden opgenomen, waarbij een einde werd verkregen met twee 5' uitstekende nucleotiden. Deze lineaire rest van plasmide pHS32 (na extractie met fenol en chloroform en winning in water na precipitatie met ethanol) werd gesplitst met EcoBI. Het grote plasmide fragment werd afgescheiden 30 van het kleinere EcoBI-Xbal fragment door PAGE en na elektro- elutie geïsoleerd* Dit DNA fragment van pHS32 (0,2yUg) werd afgebonden onder soortgelijke omstandigheden als hiervoor beschreven, aan het EcoRI-Taq I fragment van het tryptofan operon (λ/·0,01 ^ug), afgeleid van pBBHtrp.

35 Bij de afbindingswerkwijze van het fragment yan pHS32 aan het

EcoRI-Taql fragment, zoals hiervoor beschreven, wordt het Taql uitstekende einde gebonden aan het Xbal overblijvende uitstekende einde zelfs hoewel het niet volledig Watson-Crick basis gepaard is: 8104400 19 — -T CTAGA- -TCTAGA- —AGC TCT- -AGCTCT-

Een deel van dit afbindingsreactiemengsel werd getransformeerd in E· coli 29 if cellen* met warmte behandeld en op LB platen* ^ die ampicilline bevatten* aangebracht· 2if koloniën werden geselecteerd* in LB media van 3 ml gekweekt en plasmide geïsoleerd· Zes daarvan bleken de Xbal plaats geregenereerd te hebben via met E· coli gekatalyseerd DNA herstel en replicatie· -TCTAGA- / -—TCTAGA- -AGCTCT- -AGATCT- 10 Deze plasmiden bleken ook beide te splitsen met EcoRI en

Hpal en de verwachte restrictie fragmenten te geven· Een plasmide* aangeduid pTrplif, werd gebruikt voor de expressie van heterogene polypeptiden* zoals hierna besproken·

Het plasmide pHGH 107 (Goeddel c.s·* Nature 281 * [1979] 54V· 15 5i*8) bevat een gen voor menselijk groeihormoon bestaande uit 23 aminozuur-codons voortgebracht uit synthetische DNA fragmenten en 163 aminozuur-codons verkregen uit complementair DNA voortgebracht via omgekeerde transcriptie van menselijk groeihormoon boodschapper RNA. Dit gen, hoewel de codons van de "pre” volgorde van menselijk 20 groeihormoon ontbreken, bevat een ATG vertalingsinitiêringscodon. Het gen werd geïsoleerd uit 10^,ug pHGH 107 na behandeling met EcoRI gevolgd door E. coli polymerase I Klenow fragment en dTTP en dATP zoals hiervoor beschreien* Na extractie met fenol en chloroform en precipitatie met ethanol werd het plasmide behandeld met 25 BamHI.

Het menselijk groeihormoon (HGH) gen bevattende fragment werd geïsoleerd volgens PAGE gevolg!door elektro-elutie. Het verkregen DNA fragment bevat eveneens de eerste 350 nucleotiden van het tegen tetracycline bestand zijnde structurele gen, maar het tetra-30 cycline promotor-operator systeem is afwezig, zodat, wanneer vervolgens gecloond wordt tot een expressie plasmide, plasmiden* die de opname bevatten, geldsliseerd kunnen worden door het herstel van de bestandheid tegen tetracycline· Omdat het EcoRI einde van het fragment is ingevuld volgens de Klenow polymerase I methode, heeft 35 het fragment een stomp en een klevend einde, waardoor een geschikte oriëntatie gewaarborgd wordt, wanneer later wordt opgenomen in een expressie plasmide*

Het expressie plasmide pTrpl if werd vervolgens gereed gemaakt 8104400 * 20 w»· om het HGH gen bevattende fragment* zoals hiervoor bereid» te ontvangen* Derhalve werd pTrpl 4 ontsloten met Xbal en de verkregen klevende einden werden ingevuld met de Klenow polymerase I methode onder toepassing van dATP* dTTP» dGTP en dCTP* Na extrac-5 tie met fenol en chloroform en precipitatie met ethanol werd het verkregen DNA behandeld met BamHI en het verkregen grote plasmlde-fragment werd geïsoleerd volgens PAGE en elektro-elutie« Het van pTrpl4 afkomstige fragment bezat een stomp einde en een klevend einde» wat de recombinatie mogelijk maakt in geschikte oriëntatie 10 met het hiervoor beschreven HGH gen bevattende fragment.

Het HGH gen fragment en het pTRP14 AXba-BamHI fragment werden gecombineerd en met elkaar verbonden onder soortgelijke omstandigheden zoals hiervoor beschreven. De ingevulde Xbal en EcoRI einden bonden aan elkaar door binding van het stompe einde 15 om zowel de Xbal en de EcoRI plaats voort te brengen:

Xbal ingevuld EcoRI ingevuld HGH gen initiering -TCTAG AATTCTATG- -1 STAG AATTCTATG- -AGATC TTAAGATAC- —AGATC ΓΤΑΑ GATAC-

Xbal EcoRI

20 Deze constructie brengt ook het tegen tetracycline bestand zijnde gen voort. Aangezien het plasmide pHGH 107 bestandheid tegen tetracycline uitdrukt uit een promotor* die stroomopwaarts ligt van het HGH gen (de lac promotor)* maakt deze constructie* aangeduid als pHGH 207* de expressie mogelijk van het gen voor 25 bestandheid tegen tetracycline onder de controle van de trypto-fan promotor-operator. Derhalve werd het bindingsmengsel getransformeerd in E* coli 294 en werden koloniën geselecteerd op LB platen* die 5yUg/ffil tetracycline bevatten.

Plasmide pHGH 207 werd met EcoRI ontsloten en de trp promo-30 tor» die EcoRI fragment bevat» werd gewonnen volgens PAGE gevolgd door elektro-elutie* Plasmide pBRH1 werd met EcoRI ontsloten en de gesplitste einden werden behandeld met bacteriele alkalische fosfatase (BAP* 1^ug, ia 50 mmol Iris* pH 8 en 10 mmol MgCl^ gedurende 30 minuten bij 65°C) ter verwijdering van de fosfaatgroe-35 pen op de uitstekende EcoRI einden. Overmaat bacteriele alkali- sche fosfatase werd verwijderd door extractie met fenol» extractie met chloroform en precipitatie met ethanol. Het verkregen lineaire DNA zal vanwege het ontbreken van fosfaten op de uitstekende einden daarvan, in binding alleen opnamen accepteren, waarvan 40 complementaire klevende einden gefosforyleerd zijn, maar zal niet 8104400

Mfc 21 zelf opnieuw rond gaan» waardoor een meer gemakkelijke zeving voor plasmiden, die de opnamen bevatten» mogelijk wordt·

Het EcoEI fragment afkomstig van pHGÏÏ 207 en hetAlineaire DNA verkregen uit pBEH1 werden gecombineerd bij aanwezigheid van 5 T^ ligase zoals hiervoor beschreven en verbonden· Een deel van het verkregen mengsel werd getransformeerd in E· coli stam 294 zoals hiervoor beschreven» als laag aangebracht op LB media, die 5^ug/ml tetracycline bevatten en 12 tegen tetracycline bestand zijnde koloniën werden geselecteerd. Plasmide werd uit elke kolonie gelso-10 leerd en onderzocht op de aanwezigheid van een DNA opname door restrictie endonuclease analyse onder toepassing van EcoEI en Xbal· Eén plasmide, dat de opname bevatte, werd aangeduid met ρΗΚΠ.

Het hiervoor beschreven plasmide pHKTIQ is een derivaat van 13 pBE322, dat een BglII plaats bevat tussen de tetracycline resis- T> tentie (Tc ) promotor en structurele gen. Het grote DNA fragment geïsoleerd na ontsluiting van pHKHO met PstI en,, BglII bevat daar-om een deel van het ampicilline resistentie (Ap ) gen en alle Tc structurele gen, maar mist de Tc promotor (fig· 6). Het plasmide 20 pGH6 (Goeddel c.s·, Nature 281, [1979] 544-548) werd ontsloten met EcoEI, de verkregen enkel-strengige einden werden ingevuld met DNA polymerase I en het plasmide werd gesplitst met PstI· Het kleine J> fragment, dat een deel van het Ap gen, een dubbele lac promotor en lac ribosoom bindingsplaats bevat, maar een ATG initiërings-25 triplet mist, werd geïsoleerd. Een soortgelijk trp promotor frag ment, dat de trp gids ribosoom bindingsplaats bevat, maar een ATG volgorde mist (Goeddel c*s*, Nature 287, [1980] 411-416), kan geïsoleerd worden uit het hiervoor beschreven pHKY1.

Het trp fragment» waaraan zo juist gerefereerd is, is een 30 analoog van het E. coli tryptofan operon, waaruit de zogenaamde trp verzwakker is geschrapt (Mïozzari c.s·, J. Bact. 133» [1978J 1457-1466) om op regelbare wijze expressie-niveaus te verhogen. Expressie plasmiden, die het gemodificeerde trp regulon bevatten, kunnen gekweekt worden tot vooraf bepaalde niveaus in voedingsme-35 dia, die extra tryptofan bevatten in voldoende hoeveelheden om het promotor-operator systeem te onderdrukken» vervolgens van tryptofan worden bevrijd om het onderdrukken van het systeem op te heffen en de expressie van het beoogde produkt te veroorzaken.

De expressie plasmiden kunnen samengebracht worden via drie 40 deel-bindingsreacties zoals aangegeven in fig, 6. 15 ng (0,05 pmol) 8104400 22 .

van het samengevoegde FIF gen (504 of 505 bp), 0,5^ug (0,2 pmol) van het grote PstI - BgXII fragment van pHKHO en 0,2^ug (0,3 pmol) van het geschikte promotor fragment werden gebonden en het mengsel werd gebruikt om Ξ· coli 294 te transformeren (Goeddel 5 c.s., Nature 287, [198o] 411-416), Plasmide DNA werd bereid uit afzonderlijke transformanten en geanalyseerd door restrictie indeling· Juiste vereniging van het samengevoegde gen met het promotor fragment dient de EcoRI (lac) of de Xbal (trp) herkenningsvolg-orde te herstellen· Het grootste deel van de plasmiden gaf de ver-10 wachte restrictie enzym ontsluitingspatronen. Afzonderlijke clonen (12, die de trp promotor bevatten en 12, die de Lac promotor bevatten) werden gekweekt en extracten werden bereid voor interferon-bepaling zoals hiervoor beschreven·

Bij bepalingen op menselijke amnion (WISH) cellen van aati-15 virus-activiteit volgens de CPE remmingsproef waren vijf van de trp transformanten positief (elk ongeveer equivalent); elf gaven van de lac transformanten/equivalente IP activiteiten. Daarom werd lên transformant uit elke reeks (pFIFlac9 en pFIFtrp69) geselecteerd voor verder onderzoek (tabel A). DNA volgorde-analyse liet 20 zien, dat de gewenste aanhechting van promotor aan FIF structurele gen in beide gevallen had plaatsgevonden·

Tabel A· Interferon activiteit in extracten van E* coli E. coli K-12 stam Cel-dichtheid IF actici- FIF mole- 294 getransfer- (cellen/mL) text (een- culen per meerd door heden/1 cul- cel tuur) pBH322 3,5 x 1O8 o c pFIFlac9 3,5 x 10 9,0 x 10 2,250 pFIFtrp69 3,5 x 108 1,8 x 107 4.500 pFIFtrp569 3,5 x 108 8,1 x 107 20.200

Cellen werden gekweekt en extracten werden bereid zoals hiervoor beschreven· De menselijke amnion (WISH) celreeks werd ge-25 bruikt voor de CPE remmingsbepaling* Gegeven activiteiten zijn gemiddeldenvan drie onafhankelijke experimenten· Voor het bepalen van het aantal IF moleculen per cel werd een FIF specifieke acti-

O

viteit van 4 x 10 eenheden/mg gebruikt (Knight, zie hiervoor).

De hoeveelheden fibroblast interferon voortgebracht door 30 pFIFlac9 en pFIFtrp.69 zijn in tabel A vermeld. De trp promotor gaf een hoger meetbaar FIF expressie-niveau dan de lac promotor. In 8104400 * 23 fx een poging om de FIF expressie-niveaus te vergroten werd pFIFtrp69 gesplitst met EcoSI en twee 300 basis paar EcoBI fragmenten, die de trp promotor bevatten (Goeddel c.s.» Nature 287, [1980] 2*11 -2*16) werden opgenomen· Het verkregen plasmide, pFIFtrp 69» bevat drie 5 opeenvolgende trp promotors» die wijzen in de richting van het FIF gen. De hoeveelheid FIF gesynthetiseerd door E, Coli K-12 stam 29VpFIF trp^69 is 4-5 maal de hoeveelheid geproduceerd door pFIFtrp69 (tabel A). Dit is blijkbaar toe te schrijven een het opheffen van de onderdrukking van de trp promotor* die plaats heeft, 10 wanneer trp onderdrukker-niveaus getitreerd worden door de veelvoudige copieen van de trp operator.

Het FIF geproduceerd door E· coli K-12 stam 29b/pFIFtrp69 gedraagd zich als authentiek menselijk FIF· Zoals aangegeven in tabel B is de antivirus-activiteit ervan ongeveer 30 maal groter 15 op menselijke cellen dan op runder-cellen· Bovendien is het bac-terieel geproduceerde FIF stabiel ten opzichte van een behandeling bij een pH van 2 gedurende de nacht en wordt niet geneutraliseerd door anti-menselijke leucocyt interferon antilichamen van het konijn (tabel 0).

20 label B» Interferon activiteiten gemeten bij verschillende cel-typen

Interferon activiteit (eenheden/ml)

Cellen LelF FIF E, coli K-12 stam 29b/pFIFtrp69 extract

Menselijk amnion 20,000 10.000 1280

Eundernier 13,000 2*00 2*0

LelF en FIF waren NIH standaard oplossingen met resp. 20.000 eenheden/ml en 10,000 eenheden/ml. Bepalingen werden uitgevoerd zoals hiervoor beschreven.

8104400

A

• 2¼

Tabel C. Vergelijking van activiteiten van extracten van E* coli K-12 s%am 29^/^15^^69 net standaard menselijk leucocyt en fibroblast interferons.

Interferon activiteit (eenheden/ml)

LelF FIF E. coli K-12 stam 29VpFIFtrp69 onbehandeld 1000 1000 1000 pH 2 1000 1000 1000 konijnen antimen- <16 1000 1000 selijkeLelF anti-lichamen

Experimentele methoden zijn hiervoor beschreven. Bepaling door CPE remming onder toepassing van WISH cellen/Sindbis virus.

N. Zuivering

De zuiveringsmethode voor bacterieel afgeleid fibroblast 5 interferon is als volgt: 1# Bevroren cellen worden gesuspendeerd in 12 maal volume per gewicht met sucrose lysis buffer (100 mmol Tris-HCl, 10 % sucrose, O, 2 mmol NaGl* 50 mmol EDTA, 0,2 mmol EMSF [fenylmethylsulfonyl-chloride], pH 7,9), die lysozyme met 1 mg/ml bevat* De celsuspen- 10 sie wordt 1 uur bij ^°C geroerd en gecentrifugeerd* Fibroblast interferon activiteit blijft in de bovenstaande laag* 2* Polyethyleenimine (5 vol/vol·#) wordt toegevoegd aan de so— nisch behandelde bovenstaande laag tot een eindconcentratie van 0,5 vol/vol·#. De oplossing wordt 1 uur bij k°G geroerd en gecen-15 trifugeerd* De interferon-activiteit blijft in de bovenstaande laag* 5. Vast ammoniumsulfaat wordt toegevoegd aan de polyethyleen-ioine bovenstaande laag tot een eind-concentratie van 50 % verzadiging, 30 minuten bij k°G geroerd en gecentrifugeerd* De inter-20 feron-activiteit is in. de 50 % korrel.

2*· De 50 % ammoniumsulfaat-korrel wordt gesuspendeerd in de helft van het volume van de 50 % ammoniumsulfaat-suspensie met PBS (20 mmol natriumfosfaat, 0,15 mmol Nad, pH 7»4). Polyethy-leenglycol 6000 (50 gew/vol.# in PBS) wordt toegevoegd tot een 25 eindconcentratie van 12,5 vol/vol.#, 2 uren bij k°C geroerd en gecentrifugeerd. De interferon-activiteit is in de korrel. De korrel wordt gesuspendeerd in een minimaal volume van de sucrose lysis buffer en geklaard door centrifugeren.

8104400 25

Deze initiële extractie-methode resulteert in een zuivering van fibroblast interferon van 0,001 % van bet totale proteïne tot 0*05 % van bet totale proteïne* Dit materiaal kan verder gezuiverd worden tot homogeniteit door de volgende kolorachromatogra-5 fie-trappen: 5* Affiniteitschromatografie op Amicon Blue B in sucrose lysis buffer, 6« Anion-uitwisselingschromatografie op QAE Sephadex in sucrose lysis buffer bij afwezigheid van 0*2 mol NaCl* 10 7* Grootte uitsluitingschromatografie op Sephadex G-75 ia sucro se lysis buffer, 8, Hoge-druk-vloeistofchromatografie met omgekeerde fase, 0, Farenterale toediening.

FIF kan parenteraal worden toegediend aan individuen, die 15 een antitumor of antivirus behandeling nodig hebben* Dosering en doseringssnelheid kan parallel zijn aan die thans in gebruik zijn bij klinische onderzoekingen van van de mens afkomstige materialen, bijvoorbeeld ongeveer (1-10) x 10^ eenheden per dag en in het geval van materialen met een zuiverheid groter dan op geschikte 7 20 wijze tot bijvoorbeeld 15 x 10 eenheden per dag* Doseringen van bacterieel verkregen FIF konden aanzienlijk verhoogd worden voor een groter effect tengevolge van de in hoofdzaak afwezigheid van menselijke proteïnen anders dan FIF, welke proteïnen in van fibroblast afgeleide materialen kunnen ftingeren als pyrogenen, nadelige 25 effecten kunnen vertonen, bijvoorbeeld onbehagelijkheid, tempera-tuursverhoging, enz··

Als een voorbeeld van een geschikte doseringsvorm voor in hoofdzaak homogeen bacterieel FIF in parenterale vorm kan 5 mg FIF van specifieke activiteit, bijvoorbeeld 2 x 10 eenheden/mg worden 50 opgelost in 25 ml 5 Sé menselijk serum-albumine, wordt de oplossing door een bacteriologisch filter geleid en wordt de gefilterde oplossing aseptisch verdeeld over 100 flesjes, die elk 6 x 10^ eenheden zuiver interferon bevatten geschikt voor parenterale toediening. De flesjes worden bij voorkeur in %oude (-20°C) voorafgaande 55 aan het gebruik, opgeslagen·

De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen volgens bekende methoden geformuleerd worden voor de bereiding van farmaceutisch geschikte preparaten, waarbij het polypeptide gemengd wordt met een farmaceutisch aanvaardbare drager. Geschikte dragers 40 en hun formulering zijn beschreven in Eemmington's Pharmaceutical 8104400 r' - 26

Sciences door E·!· Martin· Dergelijke preparaten zullen een werkzame hoeveelheid bevatten van het interferon proteïne tezamen met een geschikte hoeveelheid drager voor de bereiding van farmaceutisch aanvaardbare preparaten» die geschikt zijn voor een effec-5 tieve toediening aan de gastheer· Een voorkeurstoedieningsmethode is parenteraal· ^ 4 8104400

Claims (25)

1. Polypeptide, dat de aminozuur-volgorde van een vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon bevat* dat microbieel bereid is en niet vergezeld gaat van een of andere overeenkomst!-5 ge voor-volgorde of deel daarvan*

2* Polypeptide volgens conclusie 1 * niet vergezeld van begeleidende glycosylering.

3· Polypeptide volgens conclusie 1 * dat facultatief bet aminozuur methionine als bet gewone eerste aminozuur van bet 10 interferon bevat·

4· Polypeptide volgens conclusie 1, dat facultatief een splitsbaar conjugaat of microbieel signaal proteïne gebonden aan bet eindstandige stikstofatoom van bet gewone eerste aminozuur van bet interferon bevat* 15

5· DNA volgorde* die een volgorde bevat die codeert voor bet polypeptide volgens conclusies 1* 3 of if»

6. DNA volgorde volgens conclusie 5* die werkbaar verbonden is met een DNA volgorde» die in staat is microbiele expressie van een polypeptide volgens conclusies 1, 3 of 4 te bewerkstelligen· 20

7· Kepliceerbare» microbiele expressie-drager, die in staat is in een transformant microorganisms een polypeptide volgens conclusies 1, 3 of lf uit te drukken.

8. Microbiele expressie-drager volgens conclusie 7* die een plasmide is· 25

9· Plasmide gekozen uit de groep bestaande uit pFIFlac9 » 'Z pFIFtrpö9 en pFIFtrp"o9·

10· Microorganisme getransformeerd met een expressie-drager volgens een van de conclusies 7-9·

11* Microorganisme volgens conclusie 10, verkregen door bet 30 transformeren van een E· coli stam·

12· Getransformeerd microorganisme volgens conclusie 11, waarbij de E· coli stam E. coli K-12 stam 294 is.

13· Getransformeerd microorganisme volgens conclusie 10» verkregen door bet transformeren van Bacillus subtilis. 35

14· Getransformeerd microorganisme volgens conclusie 10, verkregen door bet transformeren van Saccbarorayces cerevisiae.

15· Voortbrengsel» dat een tberapeutiscb actieve fractie van een polypeptide bevat» in boofdzaak bestaande uit de aminozuur-volgorde van een vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon, 40 waarbij de rest van bet preparaat oplosbaar microbieel proteïne 8104400 * * 28 · a bevat, waaruit bet polypeptide gezuiverd kan worden tot een voldoende mate voor een effectieve therapeutische toepassing·

16· Bacterieel extract, dat meer dan ongeveer 95 % zuiver polypeptide bevat, in hoofdzaak bestaande uit de aminozuur-volg-5 orde van een vol ontwikkeld fibroblast interferon volgens conclusies 1 - 4·

17* Farmaceutisch preparaat, dat een therapeutisch werkzame hoeveelheid bevat van een vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon volgens conclusies 1, 3 of if geschikt voor farmaceu-10 tisch toediening.

18. Preparaat volgens conclusie 17 geschikt voor parenterale toediening.

19. Cultuur van inicrobiêle cellen, die in staat is een menselijk fibroblast interferon voort te brengen in vol ontwikkelde 15 vorm.

20. Gebruik van een vol ontwikkeld menselijk fibroblast interferon volgens conclusies 1, 3 of 4, voor antitumor of antivirus behandeling Of voor de bereiding van farmaceutische preparaten, die voor een dergelijke behandeling geschikt zijn.

21. Werkwijze ter bereiding van een polypeptide volgens con clusies 1 -4» met het kenmerk, dat men een micro-organisme, getransformeerd met een repliceerbare, microbiele ex-pressie-drager, die in staat is het polypeptide uit te drukken, laat groeien, het polypeptide uitdrukt en wint.

22. Werkwijze ter bereiding van microorganismen, die in staat zijn een polypeptide volgens conclusies 1-4 uit te drukken, met het kenmerk, dat men een microorganisme transformeert met een repliceerbare, microbiele expressie-drager, die in staat is het polypeptide uit te drukken en het getransformeer-50 de microorganisme kweekt.

23· Werkwijze ter bereiding van een repliceerbare, microbiele expressie-drager, die in staat is in een transformant microorganisme een polypeptide volgens conclusies 1-4 uit te drukken, met het kenmerk, dat men een eerste DNA volgorde 55 construeert, die voor het polypeptide codeert en werkzaam de eerste DNA volgorde verbindt met een tweede DNA volgorde, die in staat is de microbiele expressie van de eerste DNA volgorde te bewerkstelligen.

24· Werkwijze volgens conclusie 23» met het ken-40 merk, dat de tweede DNA volgorde een veelvoudige trp promotor- 8104400 operator bevat.

25· -^rodukten en werkwijzer voor de bereiding daarvan zoals hiervoor beschreven. ******* # 8104400