DD209477A5

DD209477A5 - Verfahren zur herstellung von mikroorganismen

Info

Publication number: DD209477A5
Application number: DD81249415A
Authority: DD
Inventors: Roberto Crea; Goeddel David Van Normann
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-09-25
Filing date: 1981-09-25
Publication date: 1984-05-09
Also published as: EP0048970A2; AU7564981A; ATA410381A; NL8104400A; MTP900B; EP0048970A3; IT1139487B; PL233194A1; IE51679B1; YU44835B; ZW23981A1; KE3630A; ES515032A0; FR2490675B1; SE8105657L; DD209652A5; ES505742A0; CH656388A5; IE812224L; OA06908A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die zur Produktion von Polypeptiden mit der Aminosaeuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons faehig sind. Ziel der Erfindung ist es, den Herstellungsweg von Interferon zu vereinfachen und wesentlich groessere Mengen davon bereitzustellen. Erfindungsaufbabe ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von Mikroorganismen als Teilaspekt der rekombinanten DNS-Technologie bei der Fibroblasten-Interferon-Produktion. Erfindungsgemaess transformiert man einen Mikroorganismus mit einem zur Expression eines solchen Polypeptids befaehigten replikablen Vektor und kultiviert ihn. Der Mikroorganismus ist vorzugsweise ein E.coli-Stamm, Bacillus subtilis oder Saccharomyces cerevisiae.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie, d.h. Verfahren, die auf diesem Gebiet eingesetzt werden.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Herstellungsverfahren von Mikroorganismen, die zur Produktion von Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons fähig sind.

Hintergrund der Erfindung

Human-Fibroblasten-Interferon (FIF) ist ein Protein, das antivirale sowie ein weites Spektrum anderer biologischer Aktivitäten aufweist (Übersicht siehe W. E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 1979). Angeblich ist es bis zur Homogenität gereinigt worden. Es handelt sich um ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 19000 bis 20000, mit einer spezifischen Aktivität von 2 bis 10 x 10⁸ Einheiten/mg (E. Knight, Proc. Nat). Acad. Sei. USA 73,520 bis 523 [1976]; W. Berthold et al., J. Biol. Chem. 253,5206 bis 5212 [1978]). Die Sequenz der 13 NH₂-terminalen Aminosäuren des FIF wurde als Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser bestimmt (E. Knight et al., Science 207,525 bis 526 [1980]). Houghton et al. (Nucleic Acids Res. 8, 1913 bis 1931 [1980]) haben synthetische Deoxyoligonucleotide (vorausgesagt aus der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenz) verwendet, um die Sequenz der 276 5'-terminalen Nucleotide von FIF-mRNS zu bestimmen. Taniguchi et al. (Nature 285,547 bis 549 [1980]; Gene 10,11 bis 15 [1980]) und Derynck et al. (Nature 285,542 bis 547 [1980]) waren kürzlich in der Lage, die Nucleotidsequenz klonierter cDNS-Kopien von FIF-mRNS in E. coli zu bestimmen und haben daraus die vollständige Aminosäuresequenz von Human-FIF einschließlich einer 21 Aminosäure umfassenden Signalsequenz abgeleitet. Das reife Peptid umfaßt 166 Aminosäuren. Schließlich haben Taniguchi et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77,5230-5233 [1980]) ein Plasmid konstruiert, welches die Expression des Human-FIF-Gens in E. coli veranlaßt, so daß reifes FIF erhalten wird. "

Durch die rekombinante DNS-Technologie ist es inzwischen gelungen, eine große Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, daß sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, die A- und B-Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al., Science 198,1056 bis 1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281,544 bis 548 [1979]). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin, Thymosin ^₁ und Leukozyten-Interferon.

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfaßt diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d.h. ein „Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristika wie — im Fall von Bakterien — die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuclease eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder anschließend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt, aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt, und große Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekombinierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d.h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasmid

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(Expressionsvektor, Vektor) zur Herstellung des Polypeptide verwendet werden, das durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozeß wird als Expression bezeichnet. Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, die durch RfsiS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z.B. beim Tryptophan- oder „Trp"-Promoter, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promoter-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5'- zum 3'-Ende in mRNS, die dann wiederum in das Polypeptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure eines Polypeptide wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert. Nach der Bindung an den Promoter transkribiert die RNS-Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosom-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRNS zu AUG wird) und schließlich die Nukleotid-Sequenzen des Strukturgens selbst. Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNS-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, richtig liegen und bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.

Während das aus Spender-Fibroblasten isolierte homogene Fibroblasten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und für limitierte klinische Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschließende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Fibroblasten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit < 1 %), und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten, haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in größerem Maßstab geführt.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, den Herstellungsweg zu vereinfachen und wesentlich größere Mengen bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus zu entwickeln, das als Teilaspekt der rekombinanten DNS-Technologie zu Fibroblasten-Interferon führt.

Reinstes Fibroblasten-Interferon könnte trotz der Tatsache, daß es nicht glykosyliert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden.

Ein Fibroblasten-Interferon-Gen wurde durch die folgenden Maßnahmen erhalten:

1. Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkombinationen repräsentieren, durch die die Aminosäurepartäalsequenzen kodiert werden.

2. Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS enthielten. Die gemäß (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese

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radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDNS zu bilden. In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes so erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genfragment wurde als Sonde für ein vollständiges Gen verwendet.

3. Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde maßgeschneidert unter Verwendung synthetischer DNS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen Polypeptide verhindern könnte, auszuschließen und um es in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrowellen Promoters. Das exprimierte Interferon wurde so weit gereinigt, daß es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte.

Unter Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie konnte eine Reihe replizierbarer Plasmid-Vektoren hergestellt werden, die die Synthese eines reifen Polypeptids mit den Eigenschaften von authentischem Human-Fibroblasten-Interferon in einem transformierten Mikroorganismus mit hohen Ausbeuten veranlassen. Das erhaltene Polypeptid weist die Aminosäuresequenz des FIF auf und ist in in-vitro-Testen aktiv ungeachtet fehlender Glykosylierung, wie sie für Material, das aus natürlichen menschlichen Zellen gewonnen wurde, charakteristisch ist. Der Ausdruck „Expression von reifem Fibroblasten-Interferon" bezeichnet die mikrobielle (z. B. bakterielle) Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält, die unmittelbar die mRNS-Translation des Human-Fibroblasten-Interferon-Genoms veranlassen. Reifes Fibroblasten-Interferon wird erfindungsgemäß unmittelbar von einem Translations-Startsignal (ATG) exprimiert, das gleichzeitig die erste Aminosäure des natürlichen Produkts kodiert. Die An- oder Abwesenheit von Methionin als erste Aminosäure im mikrobiell hergestellten Produkt ist kinetisch bedingt und hängt ab von den Fermentationsbedingungen und/oder der Höhe der Expression in dem transformierten Mikroorganismus. Reifes Fibroblasten-Interfefon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader ist, exprimiert werden, wobei das Konjugat spezifisch intra- oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung Nr.2007676 A). Schließlich kann das reife Interferon zusammen mit einem mikrobiellen „Signal-Peptid" hergestellt werden, das das Konjugat an die Zellwand transportiert, wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezerniert wird.

Die zum Inhalt dieser Beschreibung gehörenden Figuren 1 bis 5 werden an den geeigneten Textstellen genauer beschrieben. Figur 6 stellt schematisch die Herstellung der Plasmide dar, die die direkte Expression von reifem Fibroblasten-Interferon kodieren. Die Restriktionsstellen und -fragmente sind angegeben („Pst I", usw.). „Ap^R" und „Tc^R" bezeichnen diejenigen Orte des Plasmids, die für die Expression der Ampicillin- bzw. Tetracyclin-Resistenz verantwortlich sind. Die Abkürzung „po" steht für „Promoter-Operator".

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen :

A) Die verwendeten Mikroorganismen

Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Mikroorganismus ist E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi~, hrs", hsm£), wie in der britischen Patentpublikation Nr.255382 A beschrieben. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr.31446) hinterlegt. Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institutes of Health durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung, obgleich in ihrer am meisten bevorzugten Ausführungsform an E. coli K-12 Stamm 294 beschrieben, umfaßt auch die Verwendung anderer E. coli-Stämme wie E. coli B,

E. coli x 1776 und E. coli W3110 sowie andere Mikroorganismen, von denen viele bei einem offiziellen Depositorium (z.B. der American Type Culture Collektion, ATCC) hinterlegt wurden und von dort (möglicherweise) erhältlich sind (vergleiche auch deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2644432). Weitere Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind

z. B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonalia

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typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die mit Hilfe von sich vermehrenden Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter Kontrolle eines Hefe-Promotors.

B) Allgemeine Methoden

Die Restriktionsenzyme wurden bei New England Biolabs gekauft und vorschriftsmäßig verwendet. Die Plasmid-DNS wurde nach einem Standard-Verfahren (D.B.CIewell, J.Bacteriol. 110,667-676 [1972]) hergestellt und durch Säulenchromatographie an Biogel A-50M gereinigt. Die DNS-Sequenzierung erfolgte nach der Methode von Maxam und Gilbert (Methods Enzymol. 65,499-560 [1989]). Die durch Restriktion erhaltenen DNS-Fragmente wurden durch Elektroelution aus Polyacrylamidgelen erhalten. Die Radiomarkierung der DNS-Fragmente zwecks Verwendung als Hybridisierungssonden erfolgte nach der Methode von Taylor et al. (Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 [1976]). Die in-situ-Koloniehybridisierung wurde nach der Methode von Grundstein und Hogness durchgeführt (Proc. Natl. Acad. Sei. USA72,3961-3965 [1975]).

C) Synthese der Deoxyoligonucleotide .

Die Deoxyoligonucleotide wurden synthetisiert nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung (Creä et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75,5765-1769 [1978]) unter Verwendung von Trideoxynecleotiden als Bausteinen (Hirose et al., Tetrahedron Letters 28,2449-2452 [1978]). Die Materialien und allgemeinen Verfahren ähnelten den von Crea et al. beschriebenen (Nucleic Acids Res. 8,2331-2348 [1980]). Die 6 Starter-Pools (Figur 1), die jeweils 4 Dedecanucleotide enthielten, wurden durch separate Kopplung von 2 Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 5'-terminalen Sequenzen) mit 3 verschiedenen Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 3'-terminalen Sequenzen) erhalten.

D) Induktion der Fibroblasten

Human-Fibroblasten (Zellinie GM-2504A) wurden gezüchtet, wie bereits von Pestka et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72,3898-3901 [1975]). Das Nährmedium (Eagle's Minimalmedium mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum) wurde aus den Rollflaschen (850cm³) entfernt und ersetzt durch 50ml Nährmedium, enthaltend 50^g/ml Poly(l):Poly(C) und 10£ig/ml Cycloheximid. Dieses Induktionsmedium wurde nach 4 Stunden bei 37°C entfernt, und die Zell-Monoschichten wurden mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen (PBS; 0,14M NaCI, 3mM KCI, 1,5mM KH₂PO₄,8mM Na₂HPO₄). Jede Flasche wurde bei 37°C mit 10ml einer Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco 610-5305) inkubiert, bis die Zellen sich ablösten. Dann wurde fötales Kälberserum bis zu einer Konzentration von 10% zugesetzt. Das Zellmaterial wurde 15 Minuten bei 500 χ g zentrifugiert, der Rückstand nochmals in PBS suspendiert und sedimentiert. Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Pro Rollflasche wurden etwa 0,17g Zellmaterial erhalten.

E) Herstellung und Assay von Interferon-mRNS

Po!y(A)-enthaltende mRNS wurde nach der von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172,74-89 [1975]) beschriebenen Methode aus Humanfibroblasten durch Phenolextraktion und Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie erhalten. Die Poly(A)-enthaltende RNS wurde bezüglich InterferonmRNS durch Zentrifugieren in einem linearen Saccharose-Gradienten (5 bis 20%, w/v) angereichert. Die RNS-Proben wurden während 2 Minuten auf 80⁰C erhitzt, schnell abgekühlt, über den Gradienten gegeben und 20 Stunden bei 30000U/min, bei 4⁰C in einem Beckman-SW-40-Rotor zentrifugiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, mit Ethanol gefällt und in Wasser gelöst. Ein-Mikrogramm-Proben von mRNS wurden wie von Cavalieri et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,3287-3291 [1977]) Xenopus laevis-Oocyten injiziert. Die Oocyten wurden 24 Stunden bei 21⁰C inkubiert, homogenisiert und 5 Minuten mit 10000 x g zentrifugiert. Im Überstand wurde das Interferon nach CPE-Hemmtest (Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 1979) bestimmt unter Verwendung von Sindbis-Virus und humanen diploiden Zellen (WISH).

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Für die 12-S-Fraktion der mRNS wurden Interferontiter von 1000 bis 6000 Einheiten/mg injizierter RNS festgestellt (NIH Referenzstandard).

F) Synthese und Clonierung von cDNS

Einsträngige cDNS wurde hergestellt in 100-ml-Reaktionen, aus5/Ag der 12S mRNS-Fraktion,20mM Tris-HCI (pH8,3), 2OmM KCI, 8mM MgCI₂,3OmM ß-Mercaptoethanol, 100/xCi (a³²p) dCTPund 1 mM dATP, dCTP, cGTP, dTTP. Der Starter war das synthetische Hind !Ü-Decamer dCCAAGCTTGG (Scheller et al., Science 196,177-180 [1977]), das auf der 3'-terminalen Seite um etwa 20 bis 30 Deoxythymidinreste unter Verwendung derterminalen Deoxynucleotidyl-Transferase (Chang et al., Nature 275,617-624 [1978]) verlängert worden war. 100 Einheiten reverserTranskriptase wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 42⁰C inkubiert. Die Synthese des zweiten Stranges der DNS wurde wie von Goeddel et al. bereits beschrieben (Nature 281,544-548 [1979]) ausgeführt. Die doppelsträngige cDNS wurde mit 1200 Einheiten S 1-Nuklease während der

2 Stunden bei 37°C in 25mM Natriumacetat (pH 4,5), 1 mM ZnCI₂ und 0,3M NaCI behandelt. Nach Phenolextraktion wurde das Gemisch elektrophoretisch an einem 8%igen Polyakrylamidgel aufgetrennt. Durch Elektroelution wurden etwa 0^g cDNS von 550 bis 1 500 Basenpaaren (bp) erhalten. Ein aliquoter Teil (20 ng) wurde mit Deoxy(C)-Resten verlängert unter Verwendung terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Chang et al., supra) und mit 100ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosi η resten an der Pstl-Spaltstelle (Chang et al., supra) verlängert worden war, verbunden. Das Gemisch wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 nach einem publizierten Verfahren (Hershfield et al., Pröc. Natl. Acad. Sei. USA 71,3455-3459 [1974]) verwendet.

G) Herstellung von induzierten und nicht induzierten ³²P-cDNS-Sonden

5μg 12S-mRNS wurden mit entweder 2^Oligo(dT) oder je δμ-g der synthetischen Starter-Pools (Figur 1) in 60μ\ 1OmM Tris-HCI (pH8) und 1 mM EDTH kombiniert.

Die Gemische wurden 3 Minuten gekocht, auf Eis gegeben und mit 60μ,Ι 4OmM Tris-HCI (pH8,3), 4OmM KCI, 16mM MgCI₂, 5OmM ß-Mercaptoethanol, 1 mM dATP, dGTP, dTTP und 5 x 10"⁷M (a-³²P) dCTP (2000-3000Ci/mM) bei O⁰C versetzt. Nach Zusatz von 100 Einheiten reverser Transkriptase wurde 30 Minuten lang bei 42⁰C inkubiert und durch Passage über eine 10-ml-Sephadex-G-50-Säule gereinigt. Die Produkte wurden mit 0,3N NaOH während 30 Minuten bei 70⁹C behandelt, neutralisiert und mit Ethanol gefällt.

Die ³²P-CDNSs wurden mit 100//,g Poly(A)-mRNS aus nichtinduzierten Fibroblasten in 50 μ,Ι 0,4M Natriumphosphat (pH 6,8) und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) versetzt. Die Gemische wurden 5 Minuten auf 98⁰C erhitzt und 15 Stunden bei 45°C getempert. Durch Chromatographie an Hydroxyapatit, wie von Galau et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,1020-1023 [1977]), wurden die DNS-RNS-Hybride (enthaltend nichtinduzierte cDNS-Sequenzen) von einsträngiger DNS (induzierten cDNS-Sequenzen) getrennt. Die DNS-RNS-Hybride wurden mit Alkali zwecks Entfernung von RNS behandelt.

H) Screening rekombinanter Plasmide mit ³²P-cDNS-Sonden Plasmid-DNS-Proben von etwa 1 /tg wurden aus individuellen Transformanten nach einem bekannten Verfahren (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7,1513-1523(1979]) hergestellt. Die DNS-Proben wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, in Alkali denaturiert und jeweils auf

3 Nitrocellulosefilter nach der Tüpfelshybridisationsmethode (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7,

1 541-1552 [1979]) gebracht. Die Filter wurden mit den ³²P-cDNS-Sonden während 16 Stunden bei 42⁰C in 50% Formamid, 10 x Denhardts Lösung (Biochem. Biophys. Res. Comm. 23,641-646 [1966]), 6 x SSC, 4OmM Tris-HCI (pH 7,5), 2mM EDTA und 40/ig/ml Hefe-RNS hybridisiert. (SSC enthält 0,15 M NaCI und 0,015 M Natriumeitrat, pH 7,0.) Die Filter wurden gewaschen mit 0,1 x SSC sowie 2 χ 30 Minuten lang bei 42°C mit 0,1 % SDS, getrocknet und der Autoradiographie unterworfen.

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I) Konstruktion von Plasmiden für direkte Expression vors FSF Die synthetischen Starter KdATGAGCTACAAC) und IKdCATGAGCTACAAC) wurden nach der von Goeddeletal.,Proc. Natl.Acad. Sei. USA 76,106-110 [1979], beschriebenen Methode phosphoryliert unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase und (y-³²P) ATP bis zu einer spezifischen Aktivität von700Ci/mM. Die Starterreparatur wurde folgendermaßen durchgeführt: 25OpM der ³²P-Starter wurden vereinigt mit 8Mg (1OpM) eines 1200 Basenpaare langen Hhal-Restriktionsfragments, das die F|F-cDNS-Sequenz enthielt. Das Gemisch wurde mit Ethanol präzipitiert, in 50μΙ Wasser resLispendiert, 3 Minuten gekocht, in Trockeneis-Ethanol gegeben und mit 50μ,Ι einer Lösung von 2OmM Tris-HCI (pH7,5), 14mM MgCI₂,12OmM NaCI, 0,5mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP bei O⁰C vermischt. Nach Zusatz von 10 Einheiten DNS-Polymerase I Klenowfragment wurde 4¹/2 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Nach Extraktion mit Phenol/CHCI₃ und Restriktion mit Pstl wurde das gewünschte Produkt an einer 6%igen Polyacrylamidgelsäule gereinigt. Die anschließenden Verknüpfungen erfolgten bei Raumtemperatur (kohäsive Enden) oder bei 4°C (stumpfe Enden) unter den von Goeddel et al., supra, angegebenen Bedingungen.

J) Assay für Interferonexpression in E. coli

Bakterienextrakte für den Interferon-Assay wurden folgendermaßen hergestellt: 1 ml Kulturen wurden über Nacht in LB (Luria-Bertani) Medium, enthaltend 5/u,g/ml Tetracyclin, gezüchtet und auf 25ml mit M9-Medium, das durch 0,2% Glucose, 0,5% Casaminosäuren und 5/*g/ml Tetracyclin ergänzt war, verdünnt. 10-ml-Proben wurden zentrifugiert, wenn die Absorption bei 550nm (A₅₅₀) den Wert 1,0 erreichte. Die Zellkuchen wurden schnell in Trockeneis-Ethanol gefroren, und geklärte Lysate wurden, wie von Clewell (supra) beschrieben, hergestellt. Die Interferonaktivität in den Überständen wurde durch Vergleich mit NIH-FIF-Standard nach dem CPE-Hemmtest bestimmt. Es wurden 2 verschiedene Tests verwendet: (a) WISH-Zellen (humane Amnionzellen) wurden auf Mikrotiterplatten verteilt. Nach 16 bis 20 Stunden wurden die Proben zugesetzt und seriell zweifach verdünnt. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 3 Stunden wurde Sidbis-Virus zugesetzt. Die Platten wurden nach 20 bis 24 Stunden mit Kristallviolett angefärbt, (b) MDBK-Zellen (aus Rindernieren) wurden ausgesät unter gleichzeitiger zweifacher Verdünnung der Proben. Nach einer Inkubationszeit von 2 bis 3 Stunden wurden vesikuläre Stomatitisviren zugesetzt, und nach weiteren 16 bis 18 Stunden wurden die Platten mit Kristallviolett angefärbt. Um die Stabilität bei pH 2 zu testen, wurden die Bakterienextrakte und Standarde in Minimalmedium auf eine Konzentration von 1000 Einheiten/ml verdünnt. Aliquote Teile von 1 ml wurden mit 1 N HCI auf pH 2 gebracht, 16 Stunden bei 4°C inkubiert und durch Zusatz von NaOH neutralisiert. Die Interferonaktivität wurde nach dem CPE-Hemmtest unter Verwendung menschlicher Amnionzellen bestimmt. Um antigenische Identität herzustellen, wurden aliquote Teile (25μΙ) der 1000 Einheiten/ ml enthaltenden Interferonproben (unbehandelt) 60 Minuten lang bei 37⁰C mit 25μΙ Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon inkubiert, 5 Minuten mit 12000 x g zentrifugiert, und der Überstand wurde getestet. FIF- und LIF-Standarde wurden vom NIH erhalten. Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon wurde vom National Institut of Allergy and Infectious Diseases erhalten.

K) Synthese von Starterpools, die komplementär sind zu FIF-mRNS Von der bekannten aminoterminalen Aminosäuresequenz des Human-Fibroblasten-Interferons wurden die 24 möglichen mRNS-Sequenzen, die für die Kodierung der ersten 4 Aminosäuren in Frage kommen, abgeleitet. Die theoretisch möglichen 24 komplementären Deoxyoligonucleotide wurden in 6 Pools zu je 4 Dodecameren synthetisiert (Figur 1). Die Synthese erfolgte nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung und an Festphasen (Crea et al., supra). Die grundlegende Strategie beruhte auf der Umsetzung zweier 3'-geschützer Trimerer mit einem Überschuß eines einzelnen 5'-geschützten Trimeren zu einem Pool von 2 Hexameren, die beide gleich stark vertreten waren. Die Kupplung von 2 Pools, die jeweils 2 Hexamere enthielten, lieferte dann einen Pool mit 4 Dodecameren.

L) identifizierung von FIF-cDNS-Klonen

Unter Verwendung von 12S-mRNS aus induzierten Human-Fibroblasten (1000 Einheiten Interferon-Aktivität//xg im Oocytentest) wurde doppelsträngige cDNS hergestellt und in das Plasmid pBR322

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an der Pstl-Restriktionsstelle nach der Standard dG :dC-TaiSing-Methode, wie von Chang et al. (supra) beschrieben, eingefügt. Eine FIF-cDNS-Bibliothek aus 30000 Ampiciiün-empfindiichen, Tetracyclinresistenten Transformanten von E. coli K-12 Stamm 294 wurde aus 20ng cDNS, enthaltend 550-1 300 Basenpaare, angelegt. Aus 600 der Transformanten wurde Plasmid-DNS hergestellt und auf

3 Sätze von Nitrocellulosefiltern, wie oben beschrieben, gebracht.

Die Methode zur Identifizierung hybrider Plasmide, die FiF-cDMS-Sequenzen enthielten, ähnelte der, die angewandt wurde zur Identifizierung entsprechender hybrider Plasmide mit LIF-cDNS-Sequenzen (Goeddel et al., Nature 287,411-416 [1980]). Radiomarkierte cDNS-Hybridisierungssonden wurden hergestellt unter Verwendung von entweder den 24 synthetischen Dodecameren oder von Oligo (dT)₁₂_₁₈ als Starter und 12S-RNS aus induzierten Fibroblasten (5000 Einheiten/)ag im Oocytentest) als Matrize. Die erhaltenen ³²P-CDNSs (spezifische Aktivität >5 χ 10⁸cpm/)u,g) wurden mit einem großen Überschuß an mRNS, aus nicht induzierten Human-Fibroblasten isoliert, hybridisiert, und die mRNS-cDNS-Hybride wurden von nicht umgesetzter cDNS mittels Chromatographie an Hydroxyapatit (Galau et al., supra) abgetrennt. Die einsträngigen cDNS-Fraktionen sollten angereichert sein mit Sequenzen, die in induzierten Fibroblasten vorhanden, in nicht-induzierten Zellen aber abwesend sind, und die mRNS-cDNS Hybride sollten Sequenzen darstellen, die sowohl in induzierten wie nicht-induzierten Zellen vorkommen. Etwa

4 x 10⁶cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungssonde A) und 8 x 10⁶cpm cDNS-mRNS-Hybride wurden unter Verwendung der mit Oligo (dT)₁₂_₁₈ gestarteten cDNS erhalten, während von der mit den synthetischen Dodecamerpools 1-6 gestarteten cDNS 1,5 x 10⁶cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungssonde B) und 1,5 χ 10⁶cpm Hybride erhalten wurden. Die cDNS-mRNS-Hybride aus beiden Fraktionierungen wurden vereinigt, die RNS durch Behandlung mit Alkali hydrolysiert, und die ³²P-CDNS wurde als Hybridisierungssonde C verwendet. Viele der 600 Plasmidproben hybridisierten sowohl mit der Sonde A wie mit Sonde C, was darauf hinwies, daß die Hybridisierungsreaktionen zwischen nicht induzierter mRNS und ³²P-cDNS (vor der Hydroxyapatitfraktionierung) nicht vollständig verlaufen waren. Nur 1 der 600 Plasmide (pF526) hybridisierte stark mit der speziell gestarteten, induzierten cDNS-Sonde B (Figur 2). Plasmid pF526 hybridisierte auch mit der Oligo (dT)₁₂_₁₈ gestarteten, induzierten cDNS-Sonde A und lieferte keine nachweisbare Hybridisierung mit der kombinierten nicht-induzierten Sonde C. Pstl-Behandlung mit pF526 zeigte, daß der Monierte cDNS-Abschnitt etwa 550 Basenpaare lang war, wahrscheinlich zu kurz, um den gesamten kodierenden Bereich für Fibroblasten-Interferon zu enthalten. Daher wurde eine ³²P-markierte DNS-Sonde aus diesem Pstl-Fragment hergestellt mittels DNS-Starter aus Kälberthymus (Taylor et al., supra). Diese Sonde wurde gebraucht, um 2000 einzelne Kolonien einer neu hergestellten Fibroblasten-cDNS-Bibliothek zu screenen. Die neue cDNS-Bibliothek wurde unter Verwendung von 12S-mRNS aus induzierten Fibroblasten mit einem Titer von 6000 Einheiten/ml im Oocytentest hergestellt. 16 Klone hybridisierten mit der Sonde. Die aus der Mehrzahl dieser Klone gewonnenen Plasmide lieferten bei Spaltung mit Pstl 2 Fragmente, d. h., sie besaßen eine interne Psti-Spaltstelle. Klon pFIF3 enthielt den längsten cDNS-Abschnitt von etwa 800 Basenpaaren. Die DNS-Sequenz dieses Abschnittes wurde nach der Maxam-Gilbert-Methode (supra) bestimmt und ist in Figur 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Human-Fäbrobjasten-Interferons, die aus d§riNucleotidsequenz vorhergesagt wurde, ist mit der kürzlich von Taniguchi et al. (Gene 10,11-15 [1980]) sowie von Deryncket al. (supra) beschriebenen identisch. Es wird zunächst eine Präsequenz oder ein Signalpeptid von 21 Aminosäuren kodiert, dann eine Aminosäuresequenz von 166 Aminosäuren, die das reife Interferon darstellen. Schließlich folgen 196 nicht übersetzte Nucleotide und ein Poly(A)-Schwanz. Die 20 amino-terminalen Aminosäuren des reifen FIF sind direkt bestimmt worden durch Sequenzierung und stimmen überein mit der aus der DNS-Sequenz.

M) Direkte Expression von Fibroblasten-Interferon

Um eine möglichst hohe Expression von reifem Fibroblasten-Interferon in E. coli zu erhalten, sollte der Start der Proteinsynthese am ATG-Codon des reifen Polypeptids (Aminosäure 1) und nicht am ATG-Codon des Signalpeptids (Aminosäure S1) stattfinden (Figur 3).

Wie die das Signalpeptid kodierende Region aus dem Plasmid-pFIF3 entfernt wurde, ist in Figur 4

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dargestellt. Ein DNS-Fragment aus 1200 Basenpaaren, das den gesamten, FiF kodierenden cDNS Abschnitt enthielt, wurde nach Behandlung von pF!F3 mit Hhai an einem Poiyacrylamidgel isoliert Zwei synthetische Deoxyoligonucleotidstarter, dATGAGCTACAACd) und dGATGAGCTACAACill) wurden hergestellt. Beide Starter enthalten die die ersten 4-Äminosäure des reifen Fibroblasten-Interferons kodierenden Sequenzen, und Starter Jl besitzt zusätzlich ein C am 5'-Ende. Starterreparatur und anschließende Verknüpfungen wurden für jeden der beiden Starter i und Ii getrennt durchgeführt und lieferten nahezu identische Resultate, Es werden daher hier nur die Reaktionen mit dem Starter I im Detail beschrieben. Die Starter wurden 5'-radiomarkiert unter Verwendung von (γ-³²Ρ) ATP und T4 Polynucleotidkinase und mit dem 1200 Basenpaare enthaltenden Hhal-DNS-Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde durch Erhitzen denaturiert. Nach Hybridisierung des Starters an das denaturierte Hhal-DNS- Fragment, wurde die Reparatur des oberen (+)-Stranges mit E. coü-DNS-Poiymerase I Klenowiregment (Kienow et al., Proc. Nail. Acad. Sei. USA 65,168-175 [1969]) katalysiert (Figur 4). Gleichzeitig wird durch die 3' 5'-Exonucieaseaktivität des Klenowfragments das in 3'-Richtung vorragende Ende des unteren (-)-Stranges entfernt unter Schaffung eines glatten Endes. Die Analyse des Reaktionsgemisches durch Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte, daß die Reparatur nicht vollständig war, sondern an verschiedenen bestimmten Stellen aufgehört hatte. Daher wurde das gesamte Reaktionsgemisch mit Pstl behandelt, und das gewünschte 141 Basenpaare-enthaltendes Fragment (180000 Cerenkow cpm; ca. 0,3 pM) wurde durch Polyacrylamidgeielektrophorese gereinigt (Figur 5). Die Bindung dieses Fragments an 1 /xg (ca. 4pM) des 363 Basenpaare-enthaitenden Pstl-Bgfll-Fragments, das aus pF!F3 isoliert wurde, mit anschließender Bglll-Behandlung, lieferte etwa 30 ng (ca. 0,1 pM, 50,000 Cerenkow cpm) des 504 Basenpaare-enthaitenden DNS-Fragments, das die gesamte reifes Fibroblasten-interferon kodierende Sequenz enthielt. Dieselben Reaktionen mit dem Starter Il lieferten etwa 50ng (ca. 0,15pM,"83,000 Cerenkow cpm) des 505 Basenpaare-enthaitenden Produkts.

Die Konstruktion von Plasmiden, die die Synthese von Human-Fibroblasten-Interferonen lenken, ist in Fig. 6 dargestellt. Es wurden verschiedene Plasmide konstruiert, die die FiF-Synthese unter die Kontrolle von E. coli Lac- oder Trp-Promötor-Operatorsystemen brachte. Diese beiden Systeme haben sich bereits als geeignet für die direkte Expression von Eukaryoten-Genen in E. coii erwiesen: humanes Wachstumshormon wurde unter Verwendung des Lac-Systems (Goeddel et al. Nature 281,544-548 [1979]) synthetisiert, während Human-Leukozyten-Interferon in hohen Ausbeuten unter Verwendung des Trp-Systems erhalten wurde (Goeddel etai., Nature 287,411 [1980]). pBRH-trp wurde mit EcoRI behandelt, und das erhaltene Fragment wurde durch PAGE und Eiektroelution isoliert. EcoRI-behandeites Plasmid pSmoil (Itakura et al., Science 198,1056-1063 [1977]); brit. Patentpublikation Nr.2007676 A) wurde mit dem obigen Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde mit T₄ DNS-Ligase behandelt und die erhaltene DNS zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 in der bereits beschriebenen Weise verwendet. Die transformierten Bakterien wurden auf Grund ihrer Ampicillinresistenz seiektioniert und nach der Koloniehybridisationsmethode von Grunstein et al. (supra) getestet, wobei das obige, aus pBRHtrp isoiierte Fragment, das den Trp-Promotor-Operator enthielt und mit P³² radioaktiv markiert war, als Sonde verwendet wurde. Die Plasmid-DNS verschiedener, im Koloniehybridisationstest positiver Kolonien wurde isoliert, und die Orientierung der eingefügten Fragmente wurde durch Restriktionsanaiyse mit den Enzymen BgIII und BamHI bestimmt. E. coli 294 mit dem Plasmid pSOM7d2, das das Trp-Promotor-Operator-Fragment in der gewünschten Orientierung enthielt, wurde in LB-Medium, enthaltend 10/ig/ml Ampicillin, gezüchtet. Man ließ die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 1 (bei 550nm) wachsen, zentrifugierte und suspendierte in M9-Medium bei 10facher Verdünnung. Die Zeilen wurden nochmals 2 bis 3 Stunden zu einer optischen Dichte 1 wachsen gelassen, dann lysie'rt, und das gesamte Zellprotein wurde durch SDS-Harnstoff (15%) PAGE (Maize! et al.. Methods Viroi. 5,180 bis 246 [1971]) analysiert.

Das Piasmid pBR322 wurde mit Hindll! behandelt, und die vorstehenden Hindlll-Enden wurden mit SI-Nuciease entfernt. Für letztere Reaktion wurden 10/xg Hindlll-gespaitenes pBR322 in 30μ\ S1-Puffer(0,3M NaCI, 1 mM ZnCI₂; 25mM Natriumacetat, pH4,5) mit 300 Einheiten SI-Nuciease 30 Minuten lang bei 15⁰C behandelt. Die Reaktion wurde beendet durch Zusatz von 1 μ! 30 χ 31-

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Nuciease-Stoplösung (0,8M Trisbase, 5OmM EDTA). Das Gemisch wurde mit Phenol und anschließend mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und schließlich mit EcoRI, wie bereits beschrieben, behandelt. Nach PAGE und Eiektroelution wurde das große Fragment (1) erhalten, das ein EcoRI kohäsives Ende und ein stumpfes Ende, dessen kodierender Strang mitThymidin beginnt, besitzt.

Das Plasmid pSom7A2 wurde mit Bgill behandelt, und die resultierenden kohäsiven Enden wurden mittels Kienow-Polymerase I unter Verwendung aller 4 Deoxynucleotidtriphosphatedoppelsträngig gemacht. Spaltung mit EcoRI sowie PAGE und Elektroelution lieferten ein kurzes lineares DNS-Fragment (2), das den Tryptophan-Promotor-Operator enthielt sowie Codons der LE' „proximalen" Sequenz stromaufwärts von der BgllJ-Spaltstelle („LE' lpl"). Dieses Fragment besaß ein kohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende, das von der Auffüllung der Bglll-Spaltstelle herrührte. Aus den beiden Fragmenten (1) und (2) wurde mit Hilfe von T₄-DNS-Ligase das Plasmid pHKY 10 gebildet, mit dem kompetente E. coli Stamm 294-Zellen transformiert wurden.

Das Plasmid pGM! trägt das E. coJi-Tryptophan-Qperon mit der Deletion ALE1413 (Miozzari et al., J.Bateriology 133,1457-1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des Trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des Trp E-Polypeptids (im folgenden LE' genannt) sowie dem vollständigen Trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des Trp-Prornotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20μg) wurde mit dem Restriktionsenzym Pvull an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer seibstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATG AATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere, Klonieren in einer Plasmid mit.einer solchen EcoRI-Spaitstelle zu schaffen. Die 20^g der aus pGM-1 erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T₄ DNS-Ligase in Gegenwart von 20OpMoI des 5'-phosphprylierten synthetischen Oligonucieotids pCATGAATTCATG in 20μΙ T₄.DNS-Ligase-Puffer (2OmMoI Tris, pH7,6,0,5mMol ATP, 1OmMoI MgCl₂,5mMol Dithiothreit) bei 4°C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70^cC erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten, und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5% Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Eihidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 χ TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 x TBE-Puffer der Elektrophorese bei .100 Volt ausgesetzt (TBErPuffet enthält: 10,8g Tris-Base, 5,5g Borsäure, 0,09g Na₂EDTAJn 1 Liter H_?OJ. Die wäßrige Lösung wurde gesammelt, mitPhenol extrahiert, mit Chlorpform extrahiert und 0,2 M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung in wäßriger Lösung: erhalten. Das den trp-Promotor-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, daß man Fragmente in ein Tetracyciin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden.

Das Piasmid pBRHi (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res.6,3267-3287 [19791) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promotor existiert, exprimiert diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist daher Tetracyciin-empfindlich. Durch Einfügung eines Promotor-Operator-Systemsran der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyciin-resfstent gemacht werden.

pBRHI wurde mit EcoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion entfernt. Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser enthaltene DNS-Molekül wurde in getrennten Reakiicnsgemischen kombiniert mit jedem der drei DNS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit T₄ DNS-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden. Die DNS des Reaktionsgemisches wurde zur Transformation kompetenter E. coii K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield et ah, Proc. Natl. Acad. USA 71,3455-3459 [1974]) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)-Platten gebracht, die 20/ig/ml Ampicillin und 5μg/mi Tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tetracyclin-resistente Kolonien ausgewählt, die Piasmid-DNS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzymanalysen bestätigt Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genannt.

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Ein EcoRI- und BamHI-Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 281,544 [1979]), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 μ\ E. coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), ίη30μΙ Polymerase-Puffer (5OmM Kaliumphosphat, pH7.4,7mM MgCI₂,1mM/3-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1mM dCTP, während 30 Minuten bei 0⁰C und 2 Stunden bei 37°C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle folgendermaßen verändert:

5' CTAGA- 5' CTAGA-

3' T- 3' TCT-

Dteser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das große Plasmidfragment wurde vom kleinen EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2μg) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den oben beschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 ^g) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes:

—T CTAGA —TCTAGA—

— AGC +TCT * —AGCTCT—

mit der ungewöhnlichen Basenpaarung T-C. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E.-coli-294-Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3ml LB-Medium aufgezogen, und das Plasmid wurde isoliert. Es wurde festgestellt, daß sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replikation regeniert hatten in folgender Weise:

-TCTAGA- -TCTAGA-

-AGCTCT-" -AGATCT-

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrp14 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.

Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281,544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aminosäurecodons und 153 Aminosäurecodons, die von cDNS über reverse Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10//,g pHGH107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E. coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment sowie dTTP und dÄTP wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetracyclineresistenzverleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promotor-Operator-System, so daß, wenn es anschließend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal behandelt, und die entstehenden kohäsiven Enden wurden nach dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt, und das entstandene große Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment besaß ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.

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Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4AXba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden wurden die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt:

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang

-TCTAG AATTCTATG- -TCTAGAATTCTATG-

-AGATC + TTAAGATAC- -^* -AGATCTTAAGATAC-

Xbal EcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auf das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promotor) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotor-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5μg/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert.

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt, und das den Trp-Promotor enthaltende Fragment wurde mittels PAGE und Elektroelution isoliert. Das Plasmid pBRH1 wurde mit EcoRI behandelt, und die Spaltstellen wurden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP, 1 /ig, in 5OmM Tris, pH8, und 1OmM MgCI₂) 30 Minuten lang bei 65⁰C behandelt, um die Phosphatgruppen an den vorstehenden EcoRI-Enden zu entfernen. Überschüssige bakterielle alkalische Phosphatase wurde durch Phenolextraktion, Chloroformextraktion und Ethanol-Fällung entfernt. Infolge der an den überstehenden Enden fehlenden Phosphatgruppen kann das erhaltene lineare DNS-Fragment sich nicht selbst zu einem Kreis schließen, sondern nur mit solchen anderen DNS-Fragmenten reagieren, deren kohäsive Enden phosphoryliert sind.

Das EcoRI-Fragment aus pHGH207 wurde mit dem aus pBRH1 erhaltenen linearen DNS-Fragment in Gegenwart von T₄-Ligase wie vorstehend beschrieben verbunden. Ein Teil des erhaltenen Gemischs wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 in der vorstehend beschriebenen Weise verwendet. 12 Tetracyclin-resistente Kolonien wurden selektioniert (LB-Medium mit einem Gehalt von 5/ig/ml Tetracyclin). Aus jeder Kolonie wurden Plasmid-DNS isoliert und durch Behandlung mit EcoRI und Xbal auf das Vorhandensein des gewünschten DNS-Abschnitts untersucht. Ein Plasmid, das den gewünschten Abschnitt enthielt, wurde pHKY1 bezeichnet. Das Plasmid pHKYIOistein Derivat von pBR322, das eine Bglll-Spaltstelle zwischen dem Tetracyclinresistenz (Tc^R)-Promotor und dem Strukturgen enthält. Das große DNS-Fragment, das nach Behandlung von pHKY10 mit Pstl und BgIII isoliert wurde, enthält daher einen Teil des Ampicillinresistenz (Ap^R)-Gens und das gesamte Tc^R-Strukturgen aber nicht den Tc^R-Promotor (Figur 6). Das Plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281,544-548 [1979]) wurde mit EcoRI behandelt, die einsträngigen Enden wurden mit DNS-Polymerase I aufgefüllt, und das Plasmid wurde mit Pstl gespalten. Das kleine Fragment, enthaltend einen Teil des Ap^R-Gens, einen doppelten Lac-Promotor und die Lac-Ribosomenbindungsstelle, nicht aber den ATG-Startcodon, wurde isoliert. Ein ähnliches Trp-Promotor-Fragment, das die Trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthält, nicht aber eine ATG-Sequenz (Goeddel et al., Nature 287,411-416 [1980]), kann aus pHKY1 isoliert werden. Das soeben erwähnte Trp-Fragment ist ein analoges des E. coli-Tryptophan-Operons, aus dem der sogenannte Trp-Attenuator entfernt wurde (Miozzari et al., J. Bact. 133,1457-1466 [1978]), um die Expression kontrolliert zu erhöhen. Expressionsplasmide, die das modifizierte Trp-Regulon enthalten, können bis zu vorgegebenen Konzentrationen in einem Nährmedium, das genügend zusätzliches Tryptophan enthält, um das Promotor-Operator-System zu unterdrücken, gezüchtet werden. Entzug des Tryptophans, wodurch der Promotor-Operator in Aktion tritt, bewirkt die Expression des gewünschten Produktes.

Die Expressionsplasmide können zusammengesetzt werden über 3stufige Verbindungsschritte, wie in Fig.6 gezeigt. 15ng (0,05pM) des FIF-Gens (504 bzw. 505 Basenpaare), 0,5^g (0,2pM) des großen Pstl-Bglll-Fragments von pHKYIO und 0,2/xg (0,3pM) des geeigneten Promotorfragments wurden miteinander verbunden, und das Gemisch wurde verwendet zur Transformation von E. coli 294 (Goeddel et al., Nature 287,

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411-416 [1980]). Aus den einzelnen Transformanten wurde Pfasmid-DNS isoliert und mittels Restriktionsenzym analysiert. Bei korrekter Verbindung des FIF-Gens mit dem Promotorfragment wird die EcoRI (Lac)- oder Xbal (Trp)-Erkennungssequenz wieder hergestellt. Die überwiegende Zahl der Plasmide lieferten das erwartete Restriktionsmuster. Einzelne Klone wurden hochgezüchtet (12 mit dem Trp-Promotor und 12 mit dem Lac-Promotor. Für den Interferon-Assay wurden aus ihnen Extrakte, wie bereits beschrieben, hergestellt.

Im CPE-Hemmtest auf menschlichen Amnionzellen (WISH) waren 5 Trp-Transformanten positiv (alle etwa gleich stark), und 11 der Lac-Transformanten zeigten äquivalente Interferonaktivitäten. Daher wurde aus jeder Serie ein Transformant für die weiteren Untersuchungen ausgesucht (pFIFac9 und pFIFtrp69, Tabelle 1). Die DNS-Sequenzanalyse bestätigte, daß in beiden Fällen die gewünschte Verknüpfung des Promotors an das FIF-Strukturgen stattgefunden hatte.

Tabelle 1 — Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli

E. coli K-12	Zelldichte	IF-Aktivität	FIF Moleküle
Stamm 294	(Zellen/ml)	(E/l	pro Zelle
transformiert		Kultur)
mit
pBR322	3,5x10⁸	—	—
pFIFIac9	3,5 x10⁸	9,0x10⁶	2,250
pFIFtrp69	3,5 x 10⁸	1,8 x 10⁷	4,500
pFIFtrp³69	3,5 x 10⁸	8,1 x 10⁷	20,200

Die Züchtung der Zellen und die Herstellung der Extrakte erfolgte in der oben angegebenen Weise. Die menschliche Amnionzellinie (WISH) wurde für den CPE-Hemmtest verwendet. Die angegebenen Aktivitäten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen. Um die Anzahl der Interferonmoleküle pro Zelle zu bestimmen, wurde eine spezifische FIF-Aktivität von 4 χ 10⁸ Einheiten/mg verwendet (Knight, supra).

Die mit pFIFIac9 und pFIFtrp69 erhaltenen FIF-Mengen sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Der Trp-Promotor lieferte eine höhere Expression als der Lac-Promotor. Um die FIF-Expression weiter zu erhöhen, wurde pFIFtrp69 mit EcoRI gespalten, und zwei 300 Basenpaar-lange EcoRI-Fragmente, die den Trp-Promotor enthielten (Goeddel et al., Nature 287,411-416 [1980]), wurden eingefügt. Das erhaltene Plasmid, pFIFtrp³69, enthält drei aufeinanderfolgende Trp-Promotoren, die in Richtung des FIF-Gens orientiert sind. Die von E. coli K-12 Stamm 294/pFIF trp³69 produzierte FIF-Menge ist vier- bis fünfmal so groß wie die von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 produzierte (Tabelle 1). Das von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 hergestellte FIF verhält sich wie authentisches Human-FIF. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, ist seine antivirale Aktivität etwa 30mal größer bei menschlichen Zellen als bei Rinderzellen. Zusätzlich ist das bakteriell hergestellte FIF bei pH2 über Nacht stabil und wird nich^H: durch Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon-Antikörper neutralisiert (Tabelle 3).

Tabelle 2 — Interferon-Aktivität verschiedener Zelltypen	Interferon-Aktivität (E/ml)	FIF	E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69-Extrakt
	LeIF	10,000 400	1 280 40
Zellen	20,000 13,000
Amnion (human) Niere (Rind)

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Tabelle 3 — Vergleich der Interferon-Aktivitäten aus Extrakten von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 mit Human-LelF- und -FIF-Standard

Interferon-Aktivität (E/ml)

LeIF F)F E. coli K-12 Stamm

294/pFIFtrp69

unbehandelt 1000 1000 1000

pH2 1000 1000 1000

Kaninchen-anti-

Human-LelF-Anti-

körper 16 1000 1000 ;

LeIF und FIF sind NTH-Standardlösungen mit 20,000 bzw. 10,000 Einheiten/ml.

N) Reinigung

Bakteriell hergestelltes Fibroblasten-Interferon wird folgendermaßen gereinigt:

1. Die gefrorenen Zellen werden in der 12fachen Menge (v/w) eines Saccharosepuffers (10OmM Tris-HCL, 10% Saccharose, 0,2m NaCI, 5OmM EDTA, 0,2mM PMSF [Phenylmethylsulfonylchlorid], ph 7,9), enthaltend 1 mg/ml Lysozym, suspendiert. Die ZeI!suspension wird 1 Stunde bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Fibroblasten-Interferonaktivität findet sich im Überstand.

2. Der mit Ultraschall behandelte Überstand wird mit 5%igem Polyethylenimin (v/v) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (v/v) versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 4⁰C gerührt und dann zentrifugiert. Die Interferonaktivität verbleibt im Überstand.

3. Der Überstand wird mit festem Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 50% versetzt, 30 Minuten bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag.

4. Der Ammoniumsulfatniederschlag wird im PBS (2OmM Natriumphosphat, 0,15M NaCI,pH7,4) suspendiert, und zwar in einem Volumen, das halb so groß ist wie das der 50%igen Ammoniumsulfat-Suspension. Es wird Polyethylenglykol 6000 (50%, w/v, in PBS) zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 12,5% (v/v), 2 Stunden bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag, der in einer minimalen Menge des unter (1) definierten Saccharosepuffers suspendiert und durch Zentrifugieren geklärt wird.

Durch dieses Extraktionsverfahren wird eine Anreicherung des Fibroblasten-Interferons von 0,001 % Gesamtprotein auf 0,05% Gesamtprotein erreicht. Das Material kann weiter bis zur Homogenität durch folgende säulenchromatographischen Verfahren gereinigt werden:

5. Affinitätschromatographie an Amicon-Blau B in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

6. Anionenaustauschchromatographie an QAE Sephadex in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer bei Abwesenheit von 0,2 M NaCI.

7. Größenausschlußchromatographie an Sephadex G-75 in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

8. HPLC an Umkehrphasen.

0) Parenteral Applikation

FIF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immundepressive Zustände aufweisen. Die Dosierung kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Material, das aus menschlichen Zellen gewonnen wurde, anlehnen und kann z.B. etwa 1-10 x 10⁶ Einheiten/Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die größer ist als 1 %, bis zu etwa 15 x 10⁷ Einheiten/Tag betragen. Die Dosierungen von bakteriell hergestelltem FIF können zur Erzielung eines besseren Effekts markant erhöht werden, wegen der höheren Reinheit und der weitgehenden Abwesenheit anderer Human-' Proteine, die als Pyrogene wirken können und für unerwünschte Nebenwirkungen verantwortlich sein können, beispielsweise erhöhte Temperatur, Übelkeit usw.

Claims

Ein für die parenteral Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß man 3mg bakteriell hergestelltes FIF mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 χ 10⁸ Einheiten/mg in 25ml 5%igem humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 χ 10⁶ Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20⁰C) aufbewahrt.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die erfindungsgemäße Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen.

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die zur Produktion von Polypeptiden mit der Aminosäuresequenzeines reifen Human-Fibroblasten-Interferons ohne Präsequenz oder Teil einer solchen fähig sind, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus mit einem zur Expression eines solchen Polypeptide befähigten replikablen Vektor transformiert und kultiviert.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Mikroorganismus um einen E. coli-Stamm handelt.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Mikroorganismus um Bacillus subtilis handelt.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Mikroorganismus um Saccharomyces cerevisiae handelt.