AT394207B - Verfahren zur herstellung von human-leukozyteninterferonen - Google Patents

Description

AT 394 207 B

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie, d. h. Verfahren die zur Herstellung von rekombinanten Proteinen durch Mikroorganismen führen.

Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von reifen Human-Leukozyten-Interferonen, das darin besteht, daß man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Expression eines solchen Polypeptids befähigten, replikablen Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und das Polypeptid isoliert

Hintergrund der Erfindung

Human-Leukozyten-Interferon (LelF) wurde zuerst von Isaacs and Lindenmann (Proc. R. Soc. B 147,258-267 [1957]; U.S.P. 3.699.222) entdeckt und in Form der rohen Präzipitate hergestellt. Die seit dieser Zeit andauernden Anstrengungen, das Material zu reinigen und zu charakterisieren, haben zur Herstellung relativ homogener Leukozyten-Interferone aus normalen Leukozyten oder aus Leukozyten von leukämischen Spendern geführt (z. B. DE-OS 2.947.134). Diese Interferone gehören zu einer Familie von Proteinen, die die bekannte Eigenschaft besitzen, bestimmten Zellen einen Virus-resistenten Zustand zu verleihen. Darüberhinaus kann Interferon die Zell-Proliferation hemmen und die Immunantwort modulieren. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, daß Leukozyten-Interferon klinisch als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und Krankheiten eingesetzt wurde.

In der Vergangenheit wurden Leukozyten-Interferone im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (Rubinstein et al„ Proc. NaÜ. Acad. Sei. U.S.A. 76, 640-644 [1979]; Zoon et al., ibid. 26, 5601-5605 [1979]). Die berichteten Molekulargewichte liegen im Bereich von etwa 17,500 bis etwa 21,000. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparate sind bemerkenswert hoch mit 2 x 10 bis 1 x 10 Einheiten pro mg Protein, aber die aus den Zellkulturen erhaltenen Ausbeuten sind bisher entmutigend niedrig. Trotzdem gelang durch verfeinerte Proteinsequenzierungsmethoden die Bestimmung von Aminosäurepartialsequenzen (Zoon et al., Science 207.527 [1980]; Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77, 5102-5104 [1980]). Die Frage der Glycosylierung der verschiedenen Leukozyten-Interferone ist bis jetzt noch nicht völlig abgeklärt, aber es ist soviel klar, daß Unterschiede in den Molekulargewichten nicht allein durch Glykosylierung hervorgerufen werden. Es ist auch klar, daß die Leukozyten-Interferone deutlich unterschieden sind voneinander durch unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung und -sequenz und die Aminosäurehomologie ist in manchen Fällen niedriger als 80 %. Während das aus Spender-Leukozyten isolierte homogene Leukozyten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und zu limitierten klinischen Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschließende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Leukozyten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit < 1 %) und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in größerem Maßstab geführt.

Durch rekombinante DNS-Technologie ist es jedoch inzwischen gelungen, eine große Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, daß sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, den A und B Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al., Science 198.1056-1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281,544-548 [1979]). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin und Thymosin alpha 1 und verschiedene Autoren haben berichtet, daß es ihnen gelungen ist, Human-Leukozyten-Interferon kodierende DNS und entsprechende Proteine mit Leukozyten-Interferonaktivität zu erhalten (Nagata et al., Nature 284. 316-320 [1980]; Mantei et al., Gene IQ, 1-10 [1980]; Taniguchi et al., Nature 285, 547-549 [1980]).

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfaßt diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d. h. ein "Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Fall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuclease eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder anschließend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und große Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekombinierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d. h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasmid (Expressionsvektor, Vektor) zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, das durch das heterologe Gen kodiert wird. -2-

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Dieser Prozeß wird als Expression bezeichnet.

Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, die durch RNS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z. B. beim Tryptophan- oder "trp"-Promoter, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promotor-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5'- zum 3-Ende in mRNS, die dt. nn wiederum in das Polypeptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert. Nach der Bindung an den Promotor transkribiert die RNS-Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRNS zu AUG wird) und schließlich die Nukleotid Sequenzen des Strukturgens selbst Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNS-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.

Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, daß die Anwendung der rekombinanten DNS-Techno-logie (d. h. die Einfügung von Interferongenen in mikrobielle Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobieller genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung großer Mengen Leukozyteninterferon wäre, welches trotz der Tatsache, daß es nicht glykosyliert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.

Ein erstes Leukozyten-Interferon-Gen wurde erfindungsgemäß durch die folgenden Maßnahmen erhalten: (1) Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Humanleukozyten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkombi-nationen repräsentierten, durch die die Aminosäurepartialsequenzen kodiert werden können. (2) Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS enthielten. Andere induzierte und radioaktiv markierte mRNS wurde mit Plasmid-cDNS aus dieser Bank hybridisiert. Hybridisierende mRNS wurde eluiert und auf Translation in Interferon im Oozyten-Test getestet. Plasmid-DNS aus Kolonien, die in diesem Test Interferonaktivität besaßen, wurden ferner auf Hybridisierung mit Sonden die nach (1) erhalten wurden, getestet (3) Parallel zu dem Vorgehen unter (2) wurde mittels induzierter mRNS erhaltene cDNS in Plasmiden dazu verwendet, eine unabhängige Barüc transformierter Kolonien zu bilden. Die gemäß (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDNS zu bilden. In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes gemäß (1) oder (2) erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genfragment kann als Sonde für ein ungekürztes Gen verwendet werden. (4) Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde maßgeschneidert unter Verwendung synthetischer DNS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen Polypeptids verhindern könnte, auszuschließen und um es in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrobiellen Promoters. Das exprimierte Interferon wurde soweit gereinigt, daß es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte. (5) Das auf diese Weise erhaltene Interferon-Genfragment konnte seinerseits als Sonde für die Isolierung (mittels Hybridisierung) von weiteren Genen für andere, teilweise homologe Leukozyten-Interferone verwendet werden.

Durch die Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie, wurde die mikrobielle Herstellung der Familie homologer Leukozyten-Interferone (in nicht-glykosylierter Form) als reife Polypeptide, d. h. im wesentlichen frei von entsprechenden Präsequenzen oder Teilen davon, erreicht Diese Interferone können direkt exprimiert, isoliert und soweit gereinigt werden, daß sie für die Verwendung zur Behandlung viraler und bösartiger Krankheiten von Tieren und Menschen geeignet sind.

Einzelne Glieder der Interferon-Familie, soweit sie exprimiert wurden, waren in in vitro-Tests wirksam und, in einem ersten derartigen Versuch, ebenfalls in einem in vivo-Test, wobei es sich bei letzterem um die Prüfung des ersten mikrobiell hergestellten reifen Leukozy ten-Interferons handelte. -3-

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Der Ausdruck "reifes Leukozyten-Interferon", der im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, definiert ein mikrobiell (z. B. bakteriell) hergestelltes Interferonmolekül, das keine Glykosyl-gruppen trägt. Reifes Leukozyten-Interferon, gemäß vorliegender Erfindung, wird von einem Translations-Startsignal (ATG) direkt vor dem ersten Aminosäurecodon des natürlichen Produktes exprimiert. Das "reife" Polypeptid kann daher als erste Aminosäure seiner Sequenz Methionin (für das ATG codiert) enthalten, ohne daß damit sein Charakter wesentlich geändert würde. Andererseits kann der mikrobielle Wirt aus dem unmittelbaren Translationsprodukt das Methionin abspalten. Reifes Leukozyten-Interferon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader ist, exprimiert werden, wobei das Konjugat spezifisch intra-oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung Publikations-Nr. 2007676A). Schließlich kann das reife Interferon zusammen mit einem mikrobiellen "Signal-Peptid" hergestellt werden, das das Konjugat an die Zellwand transportiert, wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezemiert wird. Expression von reifem Leukozyten-Interferon bedeutet bakterielle oder andere mikrobielle Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält.

Die Aminosäuresequenzen der einzelnen Leukozyten-Interferone (Figuren 4 und 9) wurden auf Grund der DNS-Sequenzen der entsprechenden Gene (Figuren 3 und 8) ermittelt. Für alle diese einzelnen Leukozyten-Interferone existieren natürliche, von Individuum zu Individuum unterschiedliche allelische Varianten. Diese Varianten können gekennzeichnet sein durch Austausch (Substitution, Inversion), Deletion oder Insertion einzelner oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Derartige allelische Variationen der erfindungsgemäßen Leukozyten-Interferone A bis J sind von den jeweiligen Formeln (LelF A bis LelF J) mitumfaßt und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 beschreibt zwei Aminosäurepartialsequenzen, die allen Interferonspezies, die aus menschlichen Leukozyten isoliert und bis zur Homogenität gereinigt wurden, gemeinsam sind. Sie sind T-l und T-13 bezeichnet Es sind alle möglichen mRNS-Sequenzen, die diese Peptide kodieren, dargestellt, ebenso wie die entsprechenden cDNS-Sequenzen. Die Buchstaben A, T, G, C und U bezeichnen die Nucleotide mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil. Der Buchstabe N bedeutet A, G, C oder U. Die Polynucleotide sind vom 5'-Ende (links) zum 3'-Ende (rechts) angegeben und wo sie doppelsträngig dargestellt sind, ist die untere DNS (nicht-kodierender Strang) von 3'- in 5'-Richtung wiedergegeben.

Figur 2 stellt ein Autoradiogramm dar, das die Hybridisierung von möglichen LelF-Plasmiden mit 39 J P-markierten synthetischen Deoxyoligonukleotiden zeigt.

Figur 3 gibt die Nukleotidsequenzen (kodierende Stränge) von acht isolierten Genfragmenten (bezeichnet A-H) wieder, die für die Expression von Leukozyten-Interferonen verwendet werden können. Der ATG Translations-Start-Codon und die Stoptripletts für jedes LelF sind unterstrichen. Auf die Stoptripletts folgen unübersetzte Sequenzen. Dem vollständigen Gen für LelF A fehlt ein Codon in der Position 200 bis 202, der bei den anderen LelFs vorhanden ist. Vor der Leader-Sequenz liegen ebenfalls unübersetzte Sequenzen. Dem isolierten Fragment E fehlt die volle Leader-Präsequenz, aber es enthält das vollständige Gen für ein etwaiges reifes LelF E. Dem isolierten Fragment G hingegen fehlt ein Teil der kodierenden Sequenz.

Figur 4 gibt einen Überblick über die aus den bestimmten Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen von 8 Leukozyten-Interferonen (A bis H). Die für die Bezeichnung der einzelnen Aminosäuren verwendeten großen Buchstaben sind die von der IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur empfohlenen. Es bedeuten: A Alanin; C Cystein; D Asparaginsäure; E Glutaminsäure; F Phenylalanin; G Glycin; H Histidin; I Isoleucin; K Lysin; L Leucin; M Methionin; N Asparagin; P Prolin; Q Glutamin; R Arginin; S Serin; T Threonin; V Valin; W Tryptophan; und Y Tyrosin. Die Zahlen geben die Position der Aminosäuren an (S bezieht sich auf das Signal-Peptid). Der Bindestrich in der 165 Aminosäuren umfassenden Sequenz von LelF A in Position 44 wurde eingeführt, um die Sequenz des LelF A in Übereinstimmung mit den 166 Aminosäuren der anderen Leukozyten-Interferone zu bringen. Für die Festlegung der Aminosäuresequenz des LelF E wurde das Nukleotid in Position 187 (Figur 3) nicht berücksichtigt. Die Sterne (Sequenz von LelF E) stellen in-Phase-befindliche Stopcodons dar. Aminosäuren, die allen LelFs (mit Ausnahme des Pseudogens LelF E) gemeinsam sind, sind in Zeile "All" dargestellt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch im Human-Fibroblasten-Interferon Vorkommen.

Figur 5 gibt die Restriktionsendonuclease-Karten der klonierten cDNSs von 8 verschiedenen Leukozyten-Interferonen wieder (A bis H). Die hybriden Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailing-Methode (Goeddel, D. V. et al, Nature 287.411-416 [1980]) hergestellt. Die cDNS-Einsätze können daher mitPstl herausgeschnitten werden. Die Linien an den Enden jedes cDNS-Einsatzes stellen die anschließenden homopolymeren dC:dG-Schwänze dar. Die Lage der PvuII-, EcoRI- und Bglll-Restriktionsstellen sind angegeben. Schattierte Regionen in der Figur stellen kodierende Sequenzen für reife LelFs dar; die schräg-gestrichelten Regionen bezeichnen kodierende Sequenzen für Signalpeptide, während die weißen Regionen nicht-kodierende Sequenzen darstellen.

In Figur 6 wird schematisch die Konstruktion eines Gens, das die direkte mikrobielle Synthese von reifem LelF A kodiert, dargestellt. Es werden die Restriktionsstellen (Pstl, usw.) sowie die verwendeten Bruchstücke gezeigt. Die Abkürzung "b.p." bedeutet Basenpaare. -4-

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Figur 7 (nicht maßstabsgerecht) stellt schematisch die Restriktions-Karte von 2 Genftagmenten dar, die zur Expression von reifem LelF B verwendet wurden. Die bezeichneten Nukleotid-Codons sind die Enden der kodierenden Stränge, die durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Sau3a in den beiden dargestellten Fällen entstehen.

Die Figuren 8 und 9 geben die DNS- und Aminosäuresequenzen der Leukozyten-Interferone A, C, Η, I und J wieder. In Figur 9 bedeutet der Stern einen Stopcodon in der entsprechenden DNS-Sequenz, während der Bindestrich in der Sequenz von LelF A die benachbarten Aminosäuren, Phenylalanin und Glycin miteinander verbindet

Beschreibung der bevorzugten Ausfiihrungsformen A. Die verwendeten Mikroorganismen

Die beiden folgenden Mikroorganismen wurden verwendet: E. coli x 1776, wie beschrieben in US-PS 4.190.495, und E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi', hsr', hsmk+), wie in der britischen Patentanmeldung Publikations-Nr. 2055382 A beschrieben. Beide Organismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert unter den ATCC Nr. 31537 und 31446. Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt.

Außer den beiden oben genannten E. coli-Stämmen können aber auch andere Stämme, beispielsweise E. coli B oder weitere Mikroben-Stämme, verwendet werden, von denen die meisten an einem Depositorium, wie der American Type Culture Collection, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind; vergleiche auch die DE-OS 2644432. Weitere Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind z.B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die unter Verwendung von replikablen Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefepromotors.

B. Quelle und Reinigung von LelF mRNS

LelF mRNS kann von Human-Leukozyten (normalerweise von CML-Patienten), die zur Produktion von Interferon mit Sendai-Virus oder NDV, wie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2947134 beschrieben, angeregt wurden, erhalten werden. Eine besonders bevorzugte und für die vorliegende Arbeit verwendete Quelle ist eine Zellinie, die KG-1 bezeichnet ist und sich von einem Patienten mit akuter myelogener Leukämie ableitet. Die Zellinie, beschrieben von Koeffler, Η. P. und Golde, D. W., Science 200.1153 (1978), wächst schnell in einem Medium enthaltend RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 mit 10 % FCS (fötales Kälberserum), hitzeinaktiviert, 25 mM HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethan-sulfonsäure) und 50 pg/ml Gentamycin. Die Zellen können in dem vorstehend beschriebenen Medium nach Zusatz von 10 % Dimethylsulfoxid eingefroren werden. Die KG-1 Linie ist bei der American Type Culture Collecüon unter der ATCC Nr. CRL 8031 deponiert worden.

Die KG-l-Zellen wurden nach der von Rubinstein et al. in (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 640-644 [1979]) beschriebenen Weise mit Sendai-Virus oder NDV zur Produktion von Leukozyten-Interferon-mRNS angeregt. Die Zellen wurden 5 Stunden nach der Induktion geerntet und die mRNS wurde nach der Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Methode (Chirgwin et al., Biochemistry 1&, 5294-5299 [1979]) hergestellt. RNS aus nicht-induzierten Zellen wurde in der gleichen Weise isoliert. Oligo-deoxythymidin (dT)-Cellulose-Chromatographie und Saccharose-Gradient-Ultrazentrifugation wurden benutzt, um die 12S Fraktion von Poly(A)-mRNS, wie von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1976]) und Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188.98-104 [1989]) beschrieben, zu erhalten. Diese mRNS hatte einen Interferonüter von 8000-10,000 Einheiten pro Microgramm im Xenopus laevis Oozytentest (Cavalieri et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 21. 3287-3291 [1977]). C. Herstellung von Koloniebänken. die LelF-cDNS-Sequenzen enthalten. 5 μg mRNS wurde zur Herstellung doppelsträngiger cDNS nach Standardmethoden (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253.2483-2495 [1978] und Goeddel et al., Nature 281.544-548 [1979]) verwendet. Die cDNS wurde der Größe nach fraktioniert durch Elektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel und 230 ng des Materials mit 500-1500 Basenpaaren wurden durch Elektroelution isoliert. 100 ng dieser cDNS wurden mit Deoxycytidin (dC)-Resten nach der von Chang et al. (Nature 275.617-624 [1978]) beschriebenen Methode verlängert, verbunden mit 470 ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosin (dG)-Resten an der Pstl-Spaltstelle (Bolivar et al., Gene 2. 95-113 [1977]) verlängert worden war und zur Transformation von E. coli x 1776 verwendet. Es wurden etwa 130 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten pro ng cDNS erhalten.

In einem zweiten ähnlichen Experiment wurden etwa 1000 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche E. coli K-12 Stamm 294-Transformanten pro ng cDNS erhalten. In diesem Falle lag die Größe des fraktionierten cDNS-Materials zwischen 600 und 1300 Basenpaaren. Es wurde durch Elektroelution für die Verlängerung mit -5-

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Deoxycytidin (dC) gewonnen. D. Herstellung synthetischer Oligonucleotide und deren Verwendung

Die Kenntnis der Aminosäuresequenzen verschiedener tryptischer Fragmente von humanen Leukozyten-Interferonen erlaubte die Synthese von Deoxyoligonukleotiden, die bestimmten Regionen der LelF mRNS komplementär waren. Die beiden tryptischen Peptide TI und T13 wurden ausgewählt, weil ihre Aminosäuresequenzen die Synthese von nur 12 bzw. 4 Undecameren erforderte, um alle möglichen Nucleotidsequenzen zu erfassen (Figur 1). 4 Sätze von Deoxynukleotidsonden wurden für jede Sequenz synthetisiert, die entweder 3 (T-1A, B, C, D) oder ein (T-13A, B, C, D) Oligonucleotid enthielten. Die bezeichneten komplementären Deoxyoligonucleotide aus jeweils 11 Basen wurden chemisch synthetisiert nach der Phosphortriestermethode (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 21, 5765-5769 [1978]). In der T-13 Serie wurden 4 individuelle Sonden hergestellt. Die zwölf T-l Sonden wurden in vier Pools zu 3 Sonden, wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt.

Die vier individuellen Sonden der T-13 Serie und die zwölf T-l Sonden, hergestellt in je vier Gruppen zu 3 Sonden, wurden verwendet, um die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS zum Gebrauch als Hybridisierungssonden zu starten. Die Matrizen-mRNS war entweder 12S RNS von mit Sendai-Virus induzierten KG-1 Zellen (8000 Einheiten IF-Aktivität per pg) oder gesamte Poly(A)-mRNS aus nicht induzierten

Leukozyten (10 Einheiten pro pg). P-markierte cDNS wurde aus diesen Startern hergestellt unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen (Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 1770-1774 [1979]). Die 60 pl-Reaktionen wurden durchgeführt in 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM KCl, 8 mM MgC^ und 30 mM ß-Mercaptoethanol, jeweils mit 1 pg jedes Starters (d. h. 12 pg insgesamt für die T-l Serie, 4 pg insgesamt für die T-13 Serie), 2 pg induzierter 12S mRNS (oder 10 pg nicht induzierter Poly (A)-mRNS), 0,5 mM dATP, dCTP, d'lTP, 200 pCi (a^P)dCTP (Amersham, 2-3000 Ci/mmole) und 60 Einheiten reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Das Produkt wurde von nicht-markiertem Material durch Gelfiltrationen an einer 10 ml-Sephadex® G-50 Säule gepennt, 30 Minuten bei 70 °C mit 0,3N NaOH, zur Zerstörung der RNS, behandelt und mit HCl neuPalisiert. Die Hybridisierungen wurden wie von Kafatos et al. (Nucleic Acids Res. 2, 1541-1552 [1979]) beschrieben, durchgeführt. E. Identifizierung der Klone pLl-pL30

Die Methode von Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7,1513-1523 (1979), zur schnellen Isolierung von Plasmiden wurde verwendet, um 1 pg Plasmid-DNS aus jeder der 500 individuellen E. coli K-12 Stamm 294-Transformanten (vergleiche Q zu gewinnen. Jede DNS-Probe wurde denaturiert und auf Nipocellulosefilter in dreifacher Ausführung, nach der Methode von Kafatos et al. (siehe oben), aufgebracht.

Die drei Sätze der Nipocellulosefilter, die 500 Plasmidproben enthielten, wurden hybridisiert mit a) induzierter cDNS, gestärkt mit einem T-l Startersatz, b) T-13 gestarteter induzierter cDNS und c) nicht induzierter cDNS, hergestellt unter Verwendung beider Startersätze. Klone wurden als positiv angesehen, wenn sie stärker hybridisierten mit einer oder beiden der induzierten cDNS-Sonden als mit der gesamten nicht induzierten Sonde. 30 positive Klone (pLl-pL30) wurden aus den 500 zur weiteren Analyse ausgesucht F. Identifikation der Klone pL-31-pL39.

Isolierung eines Plasmids (Nr. 1041. das ein LelF-Genffagment enthielt

Transformanten von E. coli x 1776 wurden nach der Koloniehybridisierungsmethode von Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]) getestet, unter Verwendung von ^P-markierter induzierter mRNS als Sonde (Lillenhaug et al., Biochemistry, 15, 1858-1865 [1976]). Nichtmarkierte mRNS von nicht-induzierten Zellen wurde mit der Sonde in einem Verhältnis von 200:1 gemischt, um zu konkurrieren mit in dem -^P-markierten Präparat vorhandener nicht-induzierter mRNS. Die Hybridisierung markierter mRNS sollte vorwiegend bei Kolonien erfolgen, die induzierte Sequenzen enthalten. Drei Klassen von Transformanten wurden erhalten: (1) 2-3 % der Kolonien hybridisierten sehr stark mit ^P-mRNS, (2) 10 % hybridisierten signifikant schwächer als die erste Klasse und (3) der Rest lieferte kein erkennbares Hybridisierungssignal.

Die positiven Kolonien (Klassen (1) und (2)) wurden auf die Anwesenheit Interferon-spezifischer Sequenzen mittels eines Assays geprüft, der auf der spezifischen Hybridisierung von Interferon-mRNS an Plasmid-DNS beruht Zunächst wurden 60 der stark positiven Kolonien (Klasse (1)) individuell in 100 ml M9-Medium, das -6-

AT 394 207 B ergänzt war mit Tetracyclin (20 pg/ml), Diaminopimelinsäure (100 μg/ml), Thymidin (20 μg/ml) und d-Biotin (1 pg/ml), gezüchtet. Das M9-Medium enthält pro Liter: Na2HP04 (6 g), KH2PO4 (3 g), NaCl (0,5 g) und NH4CI (1 g). Nach Autoklavieren wurde 1 ml steriles IM MgSC^ und 10 ml steriles 0,01M CaC^ zugesetzt. Jeweils 10 der 60 Kulturen wurden zusammengefaßt und die Plasmid-DNS wurde, wie von Clewell et al., Biochemistry £, 4428-440 [1970], beschrieben, isoliert. 10 pg jedes Plasmid-DNS-Pools wurden mit Hindlll gespalten, denaturiert und kovalent an DBM-Papier (Diazobenzyloxymethylpapier) gebunden. 1 pg gereinigter mRNS aus induzierten Zellen wurde an jedes Filter hybridisiert. Nicht-hybridisierte mRNS wurde durch Waschen entfernt. Die spezifisch hybridisierte mRNS wurde eluiert und in Xenopus laevis Oozyten überführt. In diesem Assay waren alle sechs Pools negativ. Aus 59 schwach positiven Kolonien (Klasse (2)) wurden fünf Pools zu je 10 Kolonien und 1 Pool zu 9 Kolonien gebildet und nach der oben beschriebenen Methode geprüft. Unter den sechs Pools hybridisierte einer (K10) jedesmal, wenn er geprüft wurde, signifikant stärker als die übrigen. Um den spezifischen Interferon-cDNS-Klon zu identifizieren, wurde aus jeder der im Pool K10 zusammengefaßten neun Kolonien Plasmid-DNS hergestellt und individuell geprüft. Zwei der neun Plasmide (Nr. 101 und 104) banden Interferon-mRNS stärker als die anderen. Aus dem Plasmid Nr. 104 wurde ein besonderes Bgl II-

Restriktionsfragment, das 260 Basenpaare enthielt, isoliert, ^P-markiert nach der von Taylor et al., Biochim, Biophys. Acta 442, 324-330 (1976), beschriebenen Methode und als Sonde verwendet, um 400 E. coli 294-Transformanten nach einem in situ-Kolonie-Screeningverfahren (Grünstem und Hogness, Proc. Natl. Sei. U.S.A. 72.3961-3965 [1975]) zu testen. Neun Kolonien (pL31-pL39) wurden identifiziert, die in verschieden starkem Maße mit dieser Sonde hybridisierten.

Zusätzlich wurde das markierte 260-Basenpaar-Fragment verwendet, um 4000 E. coli 294-Transformanten in derselben Weise zu testen. 50 Kolonien konnten identifiziert werden, die in unterschiedlichem Maße mit dieser Sonde hybridisierten. Eine enthielt das LeEF G-Fragment, eine enthielt das LelF H-Fragment und eine enthielt ein Fragment, das als LelF Hl bezeichnet wurde (offensichtlich ein Allel von LelF H). Die hybriden Plasmide, die erhalten wurden, wurden "LelF G", "pLelF H", usw., bezeichnet. G. Isolierung und Sequenzierung eines ersten vollständigen LelF Gens.

Plasmid DNS wurde aus allen 39 potentiellen LelF-cDNS-Klonen hergestellt und nochmals mit der gleichen 260 Basenpaare-enthaltenden DNS-Sonde getestet, unter Verwendung des Hybridisierungsprozederes von Kafatos et al. (siehe oben). Drei Plasmide (pL4, pL31, pL34) gaben sehr starke Hybridisierungssignale, vier (pL13, pL30, pL32, pL36) hybridisierten mittelmäßig, während drei (pL6, pL8, pL14) nur schwach mit der Sonde hybridisierten.

Die 39 potentiellen LelF cDNS Rekombinant-Plasmide wurden ebenfalls unter Verwendung der J P-markierten synthetischen Undecameren (individuelle T-l Starteipools oder individuelle T-13 Starter) als Hybridisierungssonden getestet Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausgewählt daß eine perfekte Basen-Paarung notwendig war, um feststellbare Hybridisierungssignale zu erhalten (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 [1979]). Auf diese Weise wurde Plasmid-DNS aus den 39 Klonen nach einer Standardmethode (Clewell et al., siehe oben) hergestellt und mittels Biorad Agarose A-50 Säulenchromatographie gereinigt. Proben von je 3 pg jedes Präparats wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, mit Alkali denaturiert und auf 2 Nitrocellulosefilter getüpfelt (1,5 pg/Fleck) wie von Kafatos et al., (siehe oben) beschrieben. Die individuellen synthetischen Deoxyoligonucleotid-Starter und Starterpools wurden mit (y^P)ATP folgendermaßen phosphoryliert: 50 pmol Oligonucleotid und 100 pMol 73½ ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mMol) wurden mit 30 μΐ 50 mMol Tris-HCl, 10 mMol MgCl2 und 15 mMol ß-Mercaptoethanol versetzt. Es wurden 2 Einheiten T4 Polynucleotid-Kinase zugesetzt und nach 30 Minuten bei 37 °C wurden die ^p-markierten Starter durch Chromatographie an 10 ml Sephadex® G-50-Säulen gereinigt. Die Hybridisierungen wurden unter

Verwendung von 10^ cpm Starter T-13C oder 3 x 10^ cpm Starterpool T-1C durchgeführt und zwar bei 15 °C während 14 Stunden in 6 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2], 10 x Denhardt's Lösung [0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Polyvinylpyrolidon, 0,2 % Ficoll], wie von Wallace et al. (siehe oben) beschrieben. Die Filter wurden während 5 Minuten bei 0 °C in 6 x SSC gewaschen, getrocknet und Röntgenfilm ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 für ^P-Starterpool T-13C und Starter T-1C dargestellt.

Die Plasmid-DNS aus Klon 104 lieferte bemerkenswerte Hybridisation mit Starterpool T-1C und Starter T-13C, während Hybridisation mit den anderen Undecameren nicht festgestellt werden konnte. Wie in Figur 2 dargestellt, hybridisierten verschiedene der 39 potentiellen LelF-Plasmide (pL2,4,13,17,20, 30, 31, 34) mit diesen beiden Sonden. Die Restriktionsanalyse zeigte jedoch, daß nur 1 der Plasmide, pL31, auch ein 260 Basenpaare-enthaltendes Bglll-Fragment enthielt. Pstl-Behandlung von pL31 zeigte, daß die Größe des cDNS-Abschnittes etwa 1000 Basenpaare war.

Der gesamte Pstl Abschnitt von pL31 wurde sowohl nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 65,499-560 [1980]) wie nach der Dideoxy-Kettenbruchmethode (Smith, Methods Enzymol. 65. 560-580 [1980]) durchgeführt, nachdem die Sau3a-Fragmente in einen M13-Vektor unterkloniert worden -7-

AT 394 207 B waren. Die DNS-Sequenz ist in Figur 3 ("A") gezeigt. Aus dieser Sequenz wurde die gesamte Aminosäuresequenz des LelF A vorhergesagt, einschließlich des Prä- oder Signalpeptids. Der erste ATG Translations-Startcodon befindet sich 60 Nukleotide vom 5'-Ende der Sequenz entfernt und wird nach 188 Codons von einem TGA Stoptriplett gefolgt. Es gibt 342 nicht übersetzte Nucleotide am 3'-Ende, die schließlich von einer Poly (A)-Sequenz gefolgt werden. Das mutmaßliche Signalpeptid (wahrscheinlich beteiligt an der Sekretion von reifem LelF aus Leukozyten) ist 23 Aminosäuren lang. Das aus 165 Aminosäuren bestehende reife LelF A hat ein berechnetes Molekulargewicht von 19,390. Der Figur 4 kann entnommen werden, daß die tryptischen Peptide T-l und T-13 den Aminosäuren 145-149 und 57-61 des LelF A entsprechen. Die tatsächlichen DNS-Sequenzen, die in diesen beiden Regionen gefunden wurden, werden durch den Starterpool Tl-C und den Starter T13-C (Figur 8) dargestellt. H. Direkte Expression von reifem Leukozvten-Interferon A (LelF Al I. Allgemeines

Die Methode, nach der das reife LelF A direkt exprimiert wurde, ist eine Variante der früher bereits für das menschliche Wachstumshormon angewandten (Goeddel et al., Nature 281. 544-548 [1979]), insofern es eine Kombination von synthetischer (N-terminal) und komplementärer DNS darstellte.

Wie in Figur 6 gezeigt, befindet sich zwischen den Codons 1 und 3 von LelF A eine Sau3a-Restriktions-endonuclease-Stelle. Es wurden 2 synthetische Deoxyolinucleotide geschaffen, die einen ATG-Translations-Startcodon enthalten, den Codon für die Aminosäure 1 (Cystein) wiederherstellen und ein EcoRI kohäsives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein Sau3a-AvaII Fragment von pL31, das aus 34 Basenpaaren bestand, gehängt. Das entstandene 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde an 2 zusätzliche DNS-Fragmente gehängt, so daß ein künstlich-natürliches Hybridgen aus 865 Basenpaaren entstand, das LelF A kodierte und welches durch EcoRI- und Pstl-Restriktionsstellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde zwischen die EcoRI- und Pstl-Restriktionsstellen des Plasmids pBR322 eingefügt und lieferte das Plasmid pLelF Al. 2. Konstruktion des Trvptophan-Kontrollelements [enthaltend den E. coli trp Promoter. Operator und die tro-

Leader-Ribosomenbindungsstelle ohne die ATG-Sequenz für den Translationsbeginn').

Das Plasmid pGMI trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Deletion ALE1413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 111,1457-1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids (im folgenden LE’ genannt), sowie dem vollständigen trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20 pg) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltstelle zu schaffen. Die 20 pg der aus pGMI erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T4 DNS-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG in 20 pl T4 DNS-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgC^, 5 mMol Dithiothreit) bei 4 °C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70 °C erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5 % Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 x TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 x TBE-Puffer der Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na2EDTA in 1 Liter H2O). Die wäßrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfallung in wäßriger Lösung erhalten. Das den trp-Promoter-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, daß man Fragmente in ein Tetracyclinempfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden.

Das Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287 [1979]) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promoter existiert, exprimiert diese Resistenz nicht Das Plasmid ist daher Tetracyclin-empfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden. pBRHI wurde mit EcoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion enfernt. Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen kombiniert mit jedem der drei DNS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit T4 DNS-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden. Die DNS des Reaktionsgemisches wurde zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 71.3455-3459 [1974]) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)-Platten gebracht, die 20 μg/ml -8-

AT 394 207 B

Ampicillin und 5 pg/ml Tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tretacyclin-resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzym-analysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genannt.

Ein EcoRI und BamHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 281.544 [1979]), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 μΐ E. coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 μΐ Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mM MgC^, 1 mM ß-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCTP, während 30 Minuten bei 0 °C und 2 Stunden bei 37 °C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle folgendermaßen verändert 5' CT AGA— 5’ CTAGA— 3' T— 3' TCT—

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das große Plasmidfragment wurde vom kleinen EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2 pg) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den obenbeschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 pg) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes: -TCTAGA- -> -AG£TCT- -T ~AG£ CTAGA- + TCT— mit der ungewöhnlichen Basenpaarung T-C. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294-Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB-Medium aufgezogen und das Plasmid isoliert Es wurde festgestellt, daß sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replikation regeniert hatten in folgender Weise: —TCTAGA— —TCTAGA— -> —AG£TCT— —AGATCT—

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet

Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al„ Nature 281. 544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aminosäurecodons und 153 Aminosäurecodons, die von cDNS über reverse Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht'enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10 pg pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E. coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment, sowie dTTP und dATP, wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetracyclinresistenz-verleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promoter-Operator-System, so daß, wenn es anschließend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal behandelt und die entstehenden kohäsiven Enden wurden -9-

AT 394 207 B nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt und das entstandene große Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment besaß ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpM AXba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden wurden die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt;

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang —TCTAG AATTCTATG— —TCTAGAATTCTATG— + -> —AGATC TTAAGATAC— —AGATCTTAAGATAC—

Xbal EcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promoter) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 pg/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt und ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution erhalten, das den trp-Promoter, Operator und die trp-Leader-Ribosomenbindungs-stelle enthielt, dem aber eine ATG-Sequenz für den Start der Translation fehlte. Dieses DNS-Fragment wurde in die EcoRI-Spaltstelle von pLelF A kloniert. Expressionsplasmide, die das so modifizierte trp-Regulon (E. coli-Operon, dem die Attenuator-Sequenz fehlt, so daß die Expression erhöht ist) können bis zu vorgegebenen Konzentrationen herangezüchtet werden in einem Medium, das genügend Tryptophan enthält, um das Promoter-Operatorsystem zu unterdrücken. Wird dann das Tryptophan entzogen und dais System entblockiert, so wird das gewünschte Produkt exprimiert

Im vorliegenden Fall und wie in Figur 6 dargestellt, wurden 250 pg des Plasmids pL31 mit Pstl behandelt und das 1000 Basenpaare-enthaltende Teilstück durch Gelelektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel isoliert. Es wurden etwa 40 pg des Teilstücks aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und in 3 gleiche Teile für die weitere Behandlung aufgeteilt a) Eine 16 pg-Probe des Fragments wurde teilweise gespalten mit 40 Einheiten von Bglll während 45 Minuten bei 37 °C und das Reaktionsgemisch wurde an einem 6 % Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 2 pg des gewünschten 670 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden erhalten, b) Eine andere Probe (8 pg) des 1000 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Bruchstücks wurde mit Avall und Bglll behandelt. 1 pg des in Figur 6 gezeigten 150 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden nach Gelelektrophorese erhalten, c) 16 pg des 1000 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden mit Sau3a und Avall behandelt Nach Elektrophorese an 10 % Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 pg (10 pMol) des 34 Basenpaare-enthaltenden Fragments erhalten. Die zwei angegebenen Deoxyolinucleotide, 5’-dAATTCATGTGT (Fragment 1) und 5’-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriestermethode synthetisiert. Das Fragment 2 wurde folgendermaßen phosphoryliert: 200 pl (etwa 40 pM) von (γ^Ρ) ATP (Amersham, 5000 Ci/mM) wurden zur Trockne gebracht und in 30 pl 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgC^, 15 mM ß-Mercaptoethanol, 100 pM des DNS-

Fragments und 2 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase resuspendiert. Nach 15 Minuten bei 37 °C wurde 1 pl 10 mM ATP hinzugesetzt und die Reaktion weitere 15 Minuten laufengelassen. Das Gemisch wurde dann während 15 Minuten auf 70 °C erwärmt, mit 100 pM des 5'-OH-Fragments 1 und 10 pM des 34 Basenpaare-enthaltenden Sau3a-AvaII-Fragments versetzt. Die Verbindung wurde bei 4 °C während 5 Stunden in 50 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM Dilhiothreit, 0,5 mM ATP und 10 Einheiten T4 DNS-

Ligase hergestellt. Das Gemisch wurde der Elektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel unterworfen und das 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde durch Elektroelution erhalten. Etwa 30 ng (1 pM) des 45 Basenpaare-enthaltenden Produkts wurden mit 0,5 pg (5 pM) des 150 Basenpaare-enthaltenden Avall - Bglll-Fragments und 1 pg (2 pM) des 670 Basenpaare-enthaltenden Bglll - Pstl-Fragments vereint. Die Bindung wurde bei 20 °C während 16 Stunden unter Verwendung von 20 Einheiten T4 DNS-Ligase hergestellt. Die Ligase wurde dann durch Erhitzen auf 65 °C während 10 Minuten inaktiviert und das Gemisch wurde mit EcoRI und Pstl behandelt zwecks Spaltung von Polymeren des Gens. Das Gemisch wurde dann durch PAGE (6 %) gereinigt. Es wurden etwa 20 ng (0,04 pM) des 865 Basenpaare-enthaltenden Produkts isoliert. Eine Hälfte davon (10 ng) wurde zwischen die EcoRI- und Pstl-Spaltstellen von pBR322 (0,3 pg) eingefügt. Die Transformation von E. coli 294 -10-

AT 394 207 B lieferte 70 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten.

Die aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNS wurde mit EcoRI und Pstl behandelt. 16 der 18 Plasmide besaßen ein EcoRI - Pstl-Fragment, das 865 Basenpaare lang war. 1 pg eines dieser Plasmide (pLelF Al) wurde mit EcoRI behandelt und an das 300 Basenpaare enthaltende EcoRI-Fragment (0,1 pg), das den E. coli trp-Promoter und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthielt, gebunden. Die den trp-Promoter enthaltenden Transformanten wurden unter Verwendung einer trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness Kolonie-Screening-Methode identifiziert. Eine asymmetrisch sitzende Xbal-Spaltstelle in dem trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinanten, in denen der trp-Promoter in der Richtung des LelF A-Gens orientiert war.

I. In vitro und in vivo Aktivität von LelF A

Extrakte für den IF-Assay wurden folgendermaßen hergestellt: 1 ml-Kulturen wurden in L-Brühe, enthaltend 5 pg/ml Tetracyclin, bis zu einem A^Q-Wert von etwa 1,0 aufgezogen, dann mit 25 ml M9-Medium, enthaltend 5 pg/ml Tetracyclin verdünnt. Wenn der A^Q-Wert 1,0 erreicht hatte, wurden jeweils 10 ml-Proben zentrifugiert und die Zellkuchen in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 ml-Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA suspendiert. 1 mg Lysozym wurde zugesetzt und nach 5-minütiger Aufbewahrung bei 0 °C wurden die Zellen durch Ultrabeschallung zerstört. Es wurde 10 Minuten zentrifugiert (15,000 U/Min) und die Interferon-Aktivität im Überstand wurde bestimmt durch Vergleich mit LelF-Standard nach dem CPE-Hemmtest. Zur Bestimmung der Anzahl von IF-Molekülen pro Zelle wurde eine spezifische LelF-Aktivität von 4 x 10** Einheiten pro mg verwendet.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, liefert Klon pLelF A trp 25, in dem der trp-Promoter in der richtigen Richtung orientiert ist, hohe Aktivitäten (bis zu 2,5 x 108 Einheiten pro Liter). Wie in Tabelle 2 gezeigt, verhält sich das von E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF A trp 25 hergestellte Interferon wie authentisches Human-LelF; es ist bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20,000.

Der Nachweis von in vivo-Aktivität von Interferon macht die Gegenwart von Makrophagen und natürlichen Killerzellen (NK) notwendig, und es scheint daß diese Zellen stimuliert werden. Es war daher möglich, daß das von E. coli 294/pLeIF A 251 produzierte Interferon, das im Zellkultur-Assay antivirale Aktivität zeigte, an infizierten Tieren inaktiv ist. Ferner ist es durchaus möglich, daß sich die antivirale in vivo-Aktivität des bakteriell hergestellten, nicht-glykosylierten LelF A von der des glykosylierten Interferons, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wird, unterscheidet. Es wurden daher die biologischen Aktivitäten von bakteriell hergestelltem LelF A (2 % rein) und von aus Leukozyten isoliertem LelF (8 % rein) miteinander verglichen und zwar an Hand der lethalen Enzephalomyocarditis (EMC) bei Totenkopfäffchen (Tabelle 3).

Tabelle 1

Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli E. coli K-12 Stamm 294 Zelldichte IF-Aktivität LelF-Moleküle transformiert durch (Zellen/ml) E/ml Kultur pro Zelle pLelF A trp 25 3,5 x 108 36,000 9,000 pLelF A trp 25 1,8 x 109 250,000 12,000 -11- AT 394 207 B Tabelle 2

Vergleich der Aktivität von Extrakten aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit Standard-LelF *)

Interferon-Aktivität (E/ml) unbehandelt pH 2 Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Antikörper 294/pLeIF A trp 25-Extrakt 500 500 < 10 LelF-Standard 500 500 < 10 *) Der 250,000 E/ml enthaltende Extrakt von E. coli 294/pLeIF A trp 25, der in Tabelle 1 beschrieben wird, wurde auf das 500-fache verdünnt mit Minimalmedium, so daß er eine spezifische Aktivität von 500 E/ml aufwies. Ein vorher gegen NIH-Leukozyten-Interferon-Standard titrierter Leukozyten-Interferon-Standard (Wadley Institute) wurde ebenfalls auf eine Endkonzentration von 500 E/ml verdünnt Aliquote Teile (jeweils 1 ml) wurden mit 1 N HCl auf pH 2 gebracht, 52 Stunden bei 4 °C inkubiert, durch Zusatz von NaOH neutralisiert und die IF-Aktivität nach dem Standard-CPE-Hemmtest bestimmt. Aliquote Teile (25 μΐ) der 500 E/ml-Proben (unbehandelt) wurden mit 25 μΐ Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Interferon während 60 Minuten bei 37 °C inkubiert, zentrifugiert mit 12,000 x g während 5 Minuten und der Überstand getestet.

Tabelle 3

Antiviraler Effekt verschiedener LelF-Präparate gegen EMC Virus-Infektionen bei Totenkopfäffchen

Behandlung Überlebende Serum PFU/ml Tag 2 Tag 3 Tag 4 Kontrolle 0/3 10 3 x 104 105 (Bakterienproteine) 0 I 3 o [ 104 1,200 \ 3.4 X 104 0 o J 0 Bakterielles 3/3 0 0 0 LelF 0 0 0 0 0 0 LelF-Standard 3/3 0 0 0 0 0 0

Alle Affen waren männlichen Geschlechts (mittleres Gewicht 713 g) und besaßen keine EMC Virus-Antikörper vor der Infektion. Die Affen wurden intramuskulär mit 100 x LD^q EMC-Virus (bestimmt an Mäusen) infiziert. Die Kontrolltiere starben 134, 158 und 164 Stunden nach der Infektion. Die Interferon-Behandlung mit 106 Einheiten erfolgte intravenös und zwar 4, +2,23, 29, 48, 72, 168 und 240 Stunden nach der Infektion. Bei dem bakteriellen Leukozyten-Interferon handelte es sich um eine Säulenchromatographie- -12-

AT 394 207 B

Fraktion eines Lysats aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit einer spezifischen Aktivität von 7,4 x 10^ E/mg Protein. Die bei den Kontrollen verwendeten Bakterien-Proteine waren der Säulenfraktion des Lysats von E. coli 294/pBR322 bei doppelter Gesamtproteinkonzentration äquivalent. Bei dem Leukozyten-Interferon-Standard handelte es sich um durch Sendai-Virus induziertes Interferon aus normalen menschlichen Zellen, das chromatographisch auf eine spezifische Aktivität von 32 x 10^ E/mg Protein gereinigt war.

Die Kontrolltiere verloren das Gleichgewicht, zeigten progressive Lethargie, schlaffe Lähmung der hinteren Gliedmaßen und wässerige Augen, beginnend etwa 8 Stunden vor dem Tod. Die mit Interferon behandelten Affen zeigten keine dieser Abnormalitäten: sie blieben während der gesamten Zeit aktiv und entwickelten keine Virämie. Der eine Affe der Kontrollgruppe, der innerhalb von 4 Tagen keine Virämie entwickelte, starb zuletzt (164 Stunden nach der Infektion), aber zeigte nach dem Tode hohe Virus-Titer im Herzen und Gehirn. Die Interferon-behandelten Affen entwickelten keine Antikörper gegen EMC-Viren, was 14 und 21 Tage nach der Infektion festgestellt wurde. Die Ergebnisse zeigen somit, daß der antivirale Effekt der LelF-Präparate an den infizierten Tieren lediglich der Wirkung des Interferons zugeschrieben werden kann, da die kontaminierenden Proteine des bakteriellen und des aus Leukozyten gewonnenen Interferons völlig unterschiedlich sind. Außerdem deuten die Ergebnisse daraufhin, daß für eine in vivo antivirale Aktivität von LelF A eine Glykosylierung nicht notwendig ist. J. Isolierung von cDNS für weitere Leukozvten-Interferone DNS aus dem Plasmid, das DNS für das vollständige LelF A enthält, wurde mit Pstl herausgeschnitten, elektrophoretisch isoliert und mit P markiert. Die erhaltene radioaktiv markierte DNS wurde als Sonde für das Screening von zusätzlichen E. coli 294-Transformanten verwendet, die in der gleichen Weise, wie in Teil C beschrieben, erhalten wurden [nach der in-situ-Kolonie-Testmethode von Grunstein und Hogness (siehe oben)]. Die mit der Sonde hybridisierenden Kolonien wurden isoliert. Plasmid-DNS aus diesen Kolonien sowie aus den zehn hybridisierenden Kolonien, die in Teil G oben erwähnt wurden, wurden durch Behandlung mit Pstl herausgeschnitten und nach drei verschiedenen Methoden charakterisiert. Zunächst wurden diese Pstl-Fragmente durch die Abbauprodukte, die durch Behandlung mit der Restriktions-Endonucleasen Bglll, PvuII und EcoRI entstanden, charakterisiert. Die Analyse erlaubte die Klass-Klassifizierung von mindestens acht unterschiedlichen Typen (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G und LelF H), dargestellt in Figur 5, wie einen Überblick über die Lage der verschiedenen Restriktionsstellen relativ zu der bis jetzt bekannten Präsequenz und der kodierenden Sequenz von LelF A gibt. Ein Typ von diesen, LelF D, ist anscheinend identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284.316-320 (1980), beschriebenen LelF.

Ferner wurden verschiedene DNSs mit dem von Cleveland et al. (Cell 20, 95-105 [1980]) beschriebenen Hybridisations-Selektions-Test untersucht auf ihre Fähigkeit, LelF-mRNS selektiv von Poly-A enthaltender RNS aus KG-1 Zellen zu entfernen. In diesem Test waren LelF A, B, C und F positiv. Schließlich wurden letztere Pstl-Fragmente in Plasmide eingefügt, E. coli 294 wurde mit diesen Plasmiden transformiert und die Fragmente wurden exprimiert. Die exprimierten Produkte, von denen man annahm, daß sie Präinterferone wären, waren im CPE-Assay auf Interferon-Aktivität alle positiv, wobei nur das LelF F-Fragment geringfügige Aktivität aufwies. Im übrigen wurden alle LelF-Typen sequenziert. K. Direkte Expression eines zweiten reifen Leukozvten-Interferons /LelF Bl

Die Sequenz des isolierten DNS-Fragements, welches das Gen für reifes LelF B enthält, zeigt, daß die ersten vierzehn Nucleotide für LelF A und B identisch sind. Folglich wurde ein Fragment aus pLelF A25, das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle und den Beginn des LelF A (= B)-Gens enthielt, isoliert und mit dem Rest der B-Sequenz in einem Expressions-Plasmid kombiniert. Die Restriktionskarten für die Pst-Fragmente von pL4 (ein Plasmid, enthaltend das LelF B-Gen aus Figur 5) und pLelF A25 sind in den Figuren 7a und 7b dargestellt.

Um das etwa 950 (= Basenpaare) lange Sau3a-Pstl-Fragment aus der Sequenz, die in Figur 7a dargestellt ist, zu erhalten, waren mehrere Schritte notwendig wegen des Vorkommens weiterer, in diesem Bereich liegender Sau3a-Restriktionsstellen. Es wurde folgendermaßen vorgegangen: 1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert: a) 110 b.p. aus Sau3a-EcoRI; b) 132 b.p. aus EcoRI-Xba; c) 700 b.p. aus Xba-Pst. 2. Die Fragmente (la) und (lb) wurden miteinander verbunden und mit Xba und Bglll behandelt, um Selbstpolymerisation über die Sau3a- und Xba-Enden zu verhindern (die entsprechende Sau3a-Spaltstelle lag innerhalb einer BgHI-Spaltstelle; Bglll-Schnitte hinterlassen ein Sau3a kohäsives Ende). Es wurde ein 242 b.p. enthaltendes Fragment isoliert. -13-

AT 394 207 B 3. Das Produkt von (2) wurde mit (lc) verbunden und mit Pstl und Bglll behandelt, wieder um Selbstpolymerisation zu verhindern. Ein etwa 950 b.p. enthaltendes Fragment, Sau3a-Pstl (siehe Figur 7a) wurde isoliert. Dieses Fragment enthielt denjenigen Teil des LelF B-Gens, der keine Entsprechung beim LelF A hatte. 4. Ein etwa 300 b.p. enthaltendes Fragment (HindIII-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG-Startsignal und den Cystein-Codon von LelF A enthielt, wurde aus pLelF A25 isoliert. 5. Ein etwa 3600 b.p. enthaltendes Fragment (Pstl-Hindlll) wurde aus pBR322 isoliert. Es enthielt das Replikon, das Tetracyclin-Resistenz, nicht aber Ampicillin-Resistenz kodiert. 6. Die Fragmente, die gemäß 3, 4 und 5 erhalten wurden, wurden miteinander verbunden und mit dem resultierenden Plasmid wurde E. coli K-12 Stamm 294 transformiert.

Die Transformanten wurden einem Minitest unterzogen (Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 2, 1513-1523 [1979]) und Plasmidproben wurden mit EcoRI behandelt. Der Abbau lieferte folgende drei Fragmente: 1) Ein EcoRI-EcoRI trp Promoter-Fragment; 2) das innere EcoRI-EcoRI-Fragment von pL4 und 3) das Fragment vom Translations-Startsignal bis zur EcoRI-Spaltstelle von pL4.

Im CPE-Assay zeigen Bakterienextrakte aus Klonen, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, Aktivitäten von 10 x 10^ Einheiten Interferon pro Liter bei A^q = 1. Ein repräsentativer Klon, der in dieser Weise hergestellt wurde, ist E. coli 294/pLeIF B trp 7.

L. Direkte Exnression weiterer reifer Leukozyten Interferone (LelF C. D, F. Η, I und D

Weitere Genfragmente in voller Länge von anderen LelF-Typen können geschneidert und in Vektoren eingebaut werden zwecks Expression in Analogie zu der für das LelF A beschriebenen Weise. Durch vollständige Sequenzierung in konventioneller Weise kann festgestellt werden, ob eine Restriktionsstelle genügend nahe an dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interferons liegt, so daß die im Teil H beschriebene Methode für die Expression von reifem LelF A verwendet werden kann, d. h. die Eliminierung der Präsequenz durch einen Restriktionsschnitt und Ersatz der aminoendständig zusammen mit der Präsequenz verlorenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNS-Fragments. Sollte dies nicht der Fall sein, so kann die folgende Methode angewandt werden. Hierbei wird das die Präsequenz kodierende Fragment präzis an der Stelle abgetrennt, an der der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar dadurch, daß 1. in der Umgebung dieses Punktes die doppelsträngige DNS in einsträngige DNS übeigeführt wird; 2. die im ersten Schritt gebildete einsträngige Region mit einer komplementären Starter-Sequenz einer einsträngigen DNS hybridisiert wird, deren 5'-Ende gegenüber dem Nukleotid liegt, das an die beabsichtigte Spaltstelle grenzt; 3. derjenige Teil des in 3'-Richtung des Starters liegenden zweiten Stranges, der in (1) eliminiert wurde, durch Umsetzung mit DNS-Polymerase in Gegenwart von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosinhaltigen Deoxynucelotid-triphosphaten wieder hergestellt wird und 4. die verbleibende einsträngige DNS-Sequenz, die über die beabsichtigte Spaltstelle hinausreicht, abgebaut wird.

Eine kurze synthetische DNS-Sequenz, die am 3'-Ende des kodierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann verbunden werden, z. B. über stumpfe Enden, mit dem zurechtgeschnittenen Gen für die reifen Interferone. Die Gene können in ein Plasmid eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters und seiner zugehörigen Ribosomenbindungsstelle gebracht werden.

In ähnlicher Weise, wie es in Abschnitt K oben beschrieben ist, wurden Genfragmente, die für LelF C und LelF B kodieren aufgebaut, zwecks direkter Expression in Bakterien. Bei der Strategie, die zur Expression dieser weiteren Leukozyten-Interferone führte, wurde in jedem Falle auf das etwa 300 Basenpaare-enthaltende Fragment (HindIII-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG Startsignal und den Cystein-Codon von LelF A aus pLelF A25 enthielt, zurückgegriffen. Dieses Fragment wurde kombiniert mit den Fragmenten anderer Interferone, die die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die auf den allen gemeinsamen Cysteinrest folgen, kodieren. Jedes erhaltene Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet Für die einzelnen Gene waren folgende Schritte notwendig:

LelF C

Isolierung der folgenden Fragmente aus pLelF C: (a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau3a-Sau96; (b) ein mehr als 900 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau96-Pstl; -14-

AT 394 207 B (c) Isolierung eines etwa 300 Basenpaare-enthaltenden Fragments (HindIII-Sau3a) aus pLelF A-25, wie in Teil K (4) oben beschrieben; (φ Isolierung des etwa 3600 Basenpaare-enthaltenden Fragments aus Abschnitt K (5) oben.

Konstruktion: (1) Verbindung von (a) mit (c). Spaltung mit Bglll, Hindill und Isolierung des etwa 335 Basenpaare-enthaltenden Produktes. (2) Verbindung der unter (1), (b) und (d) erhaltenen Bruchstücke und Transformierung von E. coli mit dem resultierenden Plasmid.

Ein repräsentativer Klon der auf diese Weise erhalten wurde, ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF C trp 35.

LelFD

Aus pLelF D wurden isoliert: a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Sau3a-AvaII); b) ein 150 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Avall-Bglll) und c) ein etwa 700 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Bglll-Pstl).

Aus pLelF A25 wurde isoliert: d) ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment (HindIII-Sau3a).

Aus pBR322 wurde isoliert: e) ein etwa 3600 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Hindlll-Pstl).

Konstruktion (1) Die Verbindung von (a) mit (b), Spaltung mit Bglll und Reinigung liefert ein 185 Basenpaare-enthaltendes Produkt. (2) Die Verbindung von (1) mit (d), Spaltung mit Hindin und Bglll und Reinigung liefert ein etwa 500 Basenpaare enthaltendes Produkt. (3) Die Fragmente (2), (c) und (e) wurden miteinander verbunden und E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiert.

Ein in dieser Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.

LelFF

Bei der Konstruktion eines vollständigen LelF F Gens und der direkten Expression des entsprechenden Interferons kann man sich die Homologie der Aminosäuren 1-13 zwischen LelF B und LelFF zunutze machen. Ein den trp Promotor enthaltendes Fragment (A) mit geeignet konstruierten Enden wird aus pHGH207 erhalten, das oben beschrieben ist, über die Behandlung mit Pst I und Xba I und anschließende Isolierung eines ca. 1050 Basenpaare enthaltenden Fragments. Ein zweites Fragment (B) steht in dem größeren der beiden durch Behandlung des Plasmids pHky 10 mit Pstl und Bglll entstandenen Fragmente zur Verfügung. Das Fragment A enthält etwa das halbe die Ampicillinresistenz kodierende Gen, während Fragment B den Rest dieses Gens und das vollständige Gen für die Tetracyclinresistenz bis auf den zugehörigen Promotor enthält. Die Fragmente A und B werden mittels T4 Ligase kombiniert und das erhaltene Produkt wird mit Xbal und Bglll behandelt, um Dimerisierungen auszuschließen. So entsteht das Fragment (c), welches den trp Promoter-Operator, sowie die Gene für die Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz enthält.

Ein Fragment (d) mit etwa 580 Basenpaaren wird durch Behandlung von pLelF F mit Avall und Bglll erhalten. Dieses Fragment enthält die Codons für die Aminosäuren 14-166 von LelF F.

Ein Fragment (e) (49 Basenpaare) wird durch Behandlung von pLelF B mit Xbal und Avall erhalten. Dieses Fragment kodiert die Aminosäuren 1-13 von LelF F.

Die Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4 Ligase miteinander verbunden. Die kohäsiven Enden der entsprechenden Fragmente sind so beschaffen, daß das entstehende Plasmid in der richtigen Weise gebildet wird, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz unter die Kontrolle des trp Promoter-Operators gebracht wird, zusammen mit dem Gen für reifes LelF F, so daß die damit transformierten Bakterien auf Grund ihrer Tetracyclin-Resistenz selektioniert werden können. Ein auf diese Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLelF F trp 1. -15-

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LelFH

Das für die Expression von reifem LelF H geeignete Gen kann folgendermaßen hergestellt weiden: 1. Plasmid pLelF H wird der Behandlung mit Haell und Rsal unterworfen und ein 816 Basenpaareenthaltendes Fragment wird isoliert, welches den Bereich von der Aminosäure 10 des Signalpeptids bis zur 3' nicht codierenden Region kodiert. 2. Das Fragment wird denaturiert und der Reparatursynthese mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (&, 168 [1970]) unterworfen, bei der der synthetische Deoxyribooligonucleotid-Starter 5’-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird. 3. Das erhaltene Produkt wird mit Sau3a gespalten und ein 452 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Aminosäuren 1-150 kodiert, wird isoliert. 4. Die Behandlung von pLelF H mit Sau3a und Pstl und die Isolierung eines 500 Basenpaare-enthaltenden Fragments führt zu einem Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der Sequenz kodiert. 5. Die in (3) und (4) isolierten Fragmente werden verbunden zu dem folgenden Fragment

166 Asp Stop GATTGA

Pstl , 1

Met Cys ATG TGT..

Sau3a das die 166 Aminosäuren des LelF H kodiert. 6. pLelF A trp 25 wird zunächst mit Xbal, dann mit DNA Polymerase I und schließlich mit Pst I behandelt. Das resultierende große Fragment kann isoliert und mit dem Produkt aus (5) verbunden werden zu einem Plasmid, mit dem E. coli K-12 Stamm 294 oder ein anderes Bakterium transformiert werden kann, das dann in der Lage ist, reifes LelF H zu exprimieren.

LelFI

Die von Lawn et al., (Cell 1J., 1157 [1978]) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen R Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen untersucht, wobei die von Lawn et al. (siehe oben) und Maniatis et al. (Cell 1£, 687 [1978]) angegebenen Verfahren verwendet wurden. Eine von der cDNS des LelF A-Klons abgeleitete radioaktive LelF-Sonde wurde verwendet, um etwa 5000,000 Plaques zu testen. Sechs LelF-Klone wurden bei diesem Screening erhalten. Nach nochmaligem Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, für die weitere Analyse ausgewählt.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode können andere Sonden verwendet werden, um weitere pLelF-Klone aus dem menschlichen Genom zu isolieren. Diese wiederum können verwendet werden, um weitere Leukozyten-Interferon-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. 1. Das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment des Klons HLeIF2 wurde an der EcoRI-Spaltstelle in pBR325 kloniert. Das resultierende Plasmid LelF E wurde mit EcoRI gespalten und das 2000 Basenpaare-enthaltende Fragment isoliert. Das Deoxyoligonukleotid dAATTCTGCAG (ein EcoRI-Pstl-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment gebunden und das resultierende Fragment mit Pstl gespalten, so daß man ein 2000 Basenpaare-enthaltendes Fragment mit Pstl-Enden erhielt. Dieses wurde mit Sau96 gespalten und ein Fragment aus 1100 Basenpaaren wurde isoliert, welches ein Pstl- und ein Sau96-Ende besaß. 2. Das Plasmid pLelF C trp 35 wurde mit Pstl und Xbal behandelt. Das große Fragment wurde isoliert. 3. Das kleine Xbal-Pstl-Fragment aus pLelF C trp 35 wurde mit Xbal und Sau96 behandelt. Ein 40 Basenpaare-enthaltendes Xbal-Sau96-Fragment wurde isoliert. 4. Die unter (1), (2) und (3) isolierten Fragmente wurden verbunden zu dem Plasmid pLelF I trp 1.

LelFJ 1. Das Plasmid pLelF J enthält ein aus 3800 Basen bestehendes Hindlll-Fragment des menschlichen Genoms, welches die LelF J Gensequenz umfaßt. Ein 760 Basenpaare-enthaltendes Ddel-Rsal-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert. 2. Das Plasmid pLelF B trp 7 wurde mit Hindlll und Ddel gespalten und ein 340 Basenpaare-enthaltendes Hindül-Ddel-Fragment isoliert. -16-

AT 394 207 B 3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pstl gespalten, die Enden wurden abgespalten durch Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) und schließlich wurde mit Hindlll behandelt. Das große, etwa 3600 Basenpaare-enthaltende Fragment wurde isoliert 4. Die Fragmente aus (1), (2) und (3) wurden miteinander verbunden zu dem Plasmid pLelF J trp 1. M. Reinigung

Der Leukozyten-Interferon-Gehalt von Bakterienextrakten kann durch die folgenden Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolge erhöht werden: 1. Polyethyleniminfällung, bei der der größte Teil der cellulären Proteine, einschließlich des Interferons, im Überstand verbleibt. 2. Amoniumsulfatfraktionierung, wobei das Interferon bei einer Sättigung von 55 % mit Ammoniumsulfat aus der Lösung ausfällt. 3. Suspendierung des Ammoniumsulfatkuchens in 0,06 M Kaliumphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) und Dialyse gegen 25 mM Tris-HCl (pH 7,9), wobei die Interferonaktivität in der Lösung bleibt. 4. Chromatographie des Überstandes, auf ein pH von 8,5 eingestellt, an einer DEAE-Cellulose-Säule (Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8,5). 5. Adsorption an Cibachrom Blau-Agarose bzw. Hydroxylapatit und Elution mit 1,5 M KCl bzw. 0,2 M Phosphatlösung (fakultativ). 6. Fraktionierung an einer Sephadex® G-75 Säule. 7. Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose in 25 mM Ammoniumacetat bei pH 5,0 mit einem Ammoniumacetatgradienten (bis zu 0,2 M Ammoniumacetat).

Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren erhält man ein Material von einer Reinheit mit über 95 %.

Das Material kann auch gereinigt werden durch Größenausschluß-Chromatographie, HPLC an umgekehrten Phasen (RP-8) oder Afßnitätschromatographie an immobilisierten Antiinterferon-Antikörpem.

Ferner kann das nach Absatz 4 oben erhaltene Material auf eine Säule monoklonaler Antikörper gebracht werden, die, wie von Milstein in Scientific American 243. 66 (1980) beschrieben, hergestellt wird und mit 0,2 M Essigsäure, 0,1 % Triton und 0,15 M NaCl eluiert werden.

In einem anderen, bevorzugten Verfahren kann das erfindungsgemäß erhaltene Interferon folgendermaßen gereinigt werden: 1. Gefrorenes Zellmaterial wird mechanisch zerkleinert. Die teilweise aufgetauten Zellen werden in dem vierfachen Volumen des Puffers A, enthaltend 0,1 M Tris (pH 7,5-8,0), 10 % (w/v) Saccharose, 0,2 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 10-100 mM MgC^, suspendiert. Die Suspension wird dann 2 x bei 4 °C unter einem Druck von etwa 400 und weniger als 70 Atmosphären durch einen Homogenisator gegeben und schließlich in einem Eisbad gekühlt. 2. Dem Homogenisat wird langsam Polyethylenimin bis zu einer Konzentration von etwa 0,35 % zugesetzt. Das Gemisch wird stehengelassen und die Feststoffe werden durch Zentrifugieren und Filtration getrennt. Bei diesem Schritt wird die Temperatur unter 10 ÖC gehalten. Der Überstand (bzw. das Filtrat) wird durch Ultrafiltration auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentriert. Die Lösung wird notfalls noch einmal durch eine mikroporöse Membran filtriert. 3. Die klare Lösung wird direkt auf eine Säule monoklonaler Antikörper bei einer Durchflußrate von 5-8 cm/Stunde (z. B. 25-40 ml pro Stunde bei einem Säulendurchmesser von 2,6 cm) gegeben. Es wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 25 mM Tris-HCl (pH 7,5-8,5), 0,5 M NaCl und 0,2 % eines Detergenzes, wie Triton X-100 enthält, gewaschen. Anschließend wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 0,15 M NaCl und 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton® X-100, enthält gespült. Die Säule wird dann mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton® X-100, eluiert. Die proteinhaltigen Fraktionen werden zusammengefaßt und mit 1 N NaOH oder 1,0 M Tris-Base auf einen pH von etwa 4,5 gebracht. 4. Diese Fraktion wird dann auf einen Kationenaustauscher, beispielsweise Whatmann CM52-Cellulose, der vorher mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise Ammoniumacetat, pH 4,5 (50 mM), äquilibriert wurde, gebracht. Es wurde dann mit dem Puffer so lange gewaschen, bis die UV-Absorption im Eluat konstant war. Die Säule wurde dann mit 25 mM Ammoniumacetat/0,12 M Natriumchlorid eluiert und das Eluat wurde in üblicher Weise aufgearbeitet.

Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten monoklonalen Antikörper können nach dem von Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2£, 1848-52 (1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Reinigung und Bindung der monoklonalen Antikörper an Affigel-10 wird im folgenden beschrieben. -17-

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Gewinnung und Reinigung monoklonaler Antikörper aus Aszites-Flüssigkeit Fünf weibliche Balb/c Mäuse wurden jeweils mit 5-10 x 10^ Hybridomzellen aus der Mitte der lo-garithmischen Wachstumsphase inokuliert. Weitere Mäuse (10 oder mehr) wurden jeweils mit 5 x 10^ lebensfähigen Zellen, die aus der von inokulierten Mäusen hergestellten Flüssigkeit gewonnen wurden, intraperitoneal inokuliert.

Die Aszites-Flüssigkeit jeder Maus wurde gesammelt Die Flüssigkeit wurde zunächst 15 Minuten mit 500-1000 x g und dann 90 Minuten mit 18000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde gefroren und bei -20 °C aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurde weiteres festes Material durch 90 minütiges Zentrifugieren mit 35000 Umdrehungen pro Minute entfernt. Die von jeder Maus erhaltenen einzelnen Batches wurden auf spezifische Antikörperaktivität nach einem Festphasenantikörperbindungstest (Staehelin et al., siehe oben) getestet und, wenn möglich, zusammengefaßt.

Die Proteinkonzentrationen der Lösungen wurden annäherungsweise bestimmt, wobei man davon ausging, daß in einer 1 cm-Küvette 1 mg Protein eine Absorption von 1,2 bei 280 nm lieferte. Aszites-Flüssigkeiten mit einem hohen Antikörpergehalt enthielten 30-35 mg Protein/ml. Dies entspricht etwa 4-7 mg spezifischem Antikörper/ml. Die Flüssigkeit wurde verdünnt mit PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3,0,15 M NaCl) auf eine Proteinkonzentration von 10-12 mg/ml.

Zu je 100 ml der verdünnten Lösungen wurden bei 0 °C unter starkem Rühren langsam 90 ml von bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Die Suspension wurde während 40-70 Minuten in Eis aufbewahrt, dann während 15 Minuten bei 4 °C mit 10,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Der Proteinkuchen wurde in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9)/0,04 M NaCl (Puffer I) gelöst und die Proteinlösung während 16-18 Stunden bei Raumtemperatur gegen 100 Volumina des Puffers I dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 10 Minuten mit 15,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Etwa 30-35 % des ursprünglichen Gesamtproteingehalts der Aszites-Flüssigkeit wurde wiedergefunden mittels Messung der Absorption bei 280 nm.

Eine Lösung, enthaltend 30-40 mg Protein/ml wurde dann auf eine DEAE-Cellulosesäule, die mit Puffer I äquilibriert war, gegeben, wobei für jeweils 1 g Protein mindestens ein Säulenvolumen von 100 ml verwendet wurde. Der Antikörper wurde von der Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,04 M-0,5 M) in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) eluiert. Die Fraktionen mit einem NaCl-Gehalt von 0,06-0,1 M wurden zusammengefaßt, konzentriert und mit bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Es wurde zentrifugiert, der Proteinkuchen wurde in 0,2 M NaHCO^ (pH etwa 8,0)/0,3 M NaCl (Puffer II) gelöst und bei

Raumtemperatur gegen diesen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 15 Minuten lang mit 20,000 x g zentrifugiert und der Proteingehalt wurde auf 20-25 mg/ml mit Puffer II eingestellt.

Herstellung von Immunadsorhentien

Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien) wurde auf einem gesinterten Glasfilter dreimal mit eiskaltem Isopropanol und dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel, das noch etwa 50 % Wasser enthielt, wurde in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert. Der Überstand wurde verdunstet Das gepackte Gel wurde mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und während 5 Stunden bei 4 °C Ende-über-Ende rotieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gel zentrifugiert und zweimal mit Puffer III (0,1 M NaHCOyO,15 M NaCl) gewaschen, um nicht-gebundene Antikörper zu entfernen. Die Proteinbestimmung zeigte, daß mehr als 90 % des Antikörpers an das Gel gebunden worden war.

Um noch freie, reaktive Bindungsstellen abzusättigen, wurde das Gel mit einem gleichen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gemischt und während 60 Minuten bei Raumtemperatur Ende-über-Ende rotieren gelassen. Schließlich wurde das Gel mit PBS gewaschen und bei 4 °C in PBS in Gegenwart von 0,02 % (w/v) Natriumazid aufbewahrt. N. Parenterale Applikation

LelF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immunsuppresive Zustände aufweisen. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Interferone kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Materials, das aus menschlichen

Leukozyten gewonnen wurde, anlehnen und kann z. B. etwa 1-10 x 10^ Einheiten pro Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die größer ist als 1 %, bis zu etwa 5 x io”7 Einheiten pro Tag betragen.

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß

O man 3 mg bakteriell hergestelltes LelF mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 10 Einheiten pro mg in 25 ml 5 N humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 x 10^ Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20 °C) aufbewahrt. -18-

Claims (16)

1. AT 394 207 B Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die erfindungsgemäße Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferons ohne Präsequenz und ohne Glykosylgruppen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Expression eines solchen Peptids befähigten replikablen Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und das Polypeptid isoliert.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um Methionin verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons besitzt.
3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um ein abspaltbares Konjugat oder mikrobielles Signalprotein verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons besitzt
4. 4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäurepartialsequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser enthält
5. 5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die in Figur 4 in Zeile "All" angegebenen Aminosäuren an der angegebenen Stelle der Aminosäuresequenz enthält
6. 6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Human-Leukozyten-Interferon (LelF) A, B, C, D, F, Η, I oder J ist.
7. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon A (LelF A).
8. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon B (LelF B).
9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon C (LelF C).
10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon D (LelF D).
11. 11. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon F (LelF F).
12. 12. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon H (LelF H).
13. 13. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon I (LelF I).
14. 14. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon J (LelF J).
15. 15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
16. 16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium E. coli ist. Hiezu 10 Blatt Zeichnungen -19-