DE3688225T2 - Herstellung menschlichen somatomedins c. - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von DNA-Sequenzen, die für die Produktion eines beliebigen gewünschten Proteins oder Polypeptids in mit diesen DNA-Sequenzen transformierten Wirten optimal sind. Insbesondere betrifft sie das Identifizieren von solchen modifizierten DNA-Sequenzen, die für die Produktion von menschlichem Somatomedin C ("SMC") optimal sind. Die Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante DNA-Moleküle und Wirte, die durch solche DNA-Sequenzen charakterisiert sind und Verfahren zur Verwendung solcher DNA-Sequenzen, rekombinanter DNA-Moleküle und Wirte, zur Verbesserung der Produktion von menschlichem SMC und anderen Proteinen prokaryontischen oder eukaryontischen Ursprungs.
- Somatomedin C ("SMC") ist ein insulinartiger Wachstumsfaktor, der anscheinend das kritische Protein ist, das nach Sekretion von Wachstumshormon aus der Hypophyse Gewebewachstum signalisiert.
- Von E. Rinderknecht und R. E. Humble, J. Biol. Chem., 253 (1978), Seiten 2769-76, wurde die Aminosäuresequenz von menschlichem SMC angegeben. Es besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette von 70 Aminosäuren, die durch drei Disulfidbrücken quervernetzt ist. Das berechnete Molekulargewicht beträgt 7649. SMC zeigt eine ausgedehnte Homologie mit Proinsulin. Die SMC-Aminosäuren 1 bis 29 sind Beispielsweise homolog mit der Insulin B-Kette und die SMC- Aminosäuren 42 bis 62 sind mit der Insulin A-Kette homolog. Die verbindende Kette in SMC zeigt jedoch keine Homologie zum C-Peptid des Proinsulins, und SMC besitzt außerdem ein C-terminales Octapeptid, das sich in Proinsulin nicht findet.
- SMC zeigt in vitro eine Reihe wachstumsfördernder Wirkungen wie Anregung der DNA-, RNA-, Protein- und Proteoglycan-Synthese [E. Rinderknecht und R. E. Humble, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 (1976), Seiten 2365-69; B. Morell und E. R. Froesch, Eur. J. Clin. Invest. 3 (1973), Seiten 119-123; E. R. Froesch et al., Adv. Mental. Disord., 8 (1975), Seiten 211-35; A. E. Zingg und E. R. Froesch, Diabetologia, 9 (1973), Seiten 472-76; E. R. Froesch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976), Seiten 2904-08]. Es stimuliert ebenfalls Ornithindecarboxylase und Zellproliferation [B. Morrel und E. R. Froesch, siehe oben; G. K. Haselbacher und R. E. Humble, J. Cell. Physiol., 88 (1976), Seiten 239-46]. In vivo regt SMC das Wachstum bei Ratten an, denen es nach Hypophysektomie an Wachstumshormon mangelt [E. Schoenle et al., Nature, 296 (1982), Seiten 252-53].
- Wie Wachstumshormone weisen SMCs eine gewisse Artenspezifität auf. SMC aus einer Art kann aber in einer anderen evolutionsmäßig niedriger stehenden Art biologisch aktiv sein. Man glaubt z. B. daß menschliches SMC nützlich zur Förderung des Wachstums beim Rindvieh, bei Schweinen und bei Hühnern ist. Es ist gezeigt worden, daß die wachstumsfördernden Wirkungen von SMC in Laboratieren ähnlich sind wie die von natürlichem menschlichem Wachstumshormon. Man glaubt aber, daß SMC menschlichem Wachstumshormon überlegen ist, da SMC ein zentraler Vermittler der Wachstumsreaktionen ist. Dementsprechend ist es ein direkterer Regulator des Wachstums als Wachstumshormon.
- Zusätzlich zur Verwendung von SMC zur Behandlung gewisser Formen von Wachstumsstörungen wie Zwergwuchs und Muskelatrophie ist es ebenfalls nützlich für die Anregung des Gewebewachstums in besonderen Bereichen, z. B. im Zusammenhang mit der Heilung von Wunden, Verletzungen und Knochenbrüchen.
- SMC hat jedoch sein klinisches Potential als Gewebewachstums-Stimulanz nicht erfüllt, weil es nur in winzigen Mengen durch Aufreinigung aus menschlichem Blut verfügbar war. Dementsprechend werden andere Verfahren benötigt, um diesen Mangel an gewerblich und klinisch nützlichen Mengen von SMC zu überwinden.
- Ein solches Verfahren könnte darin bestehen, DNA- Rekombinationstechnik zur Produktion von SMC in Wirten anzuwenden, die mit einer SMC-codierenden DNA-Sequenz transformiert sind [vgl. z. B. Europäische Patentanmeldung 0128733]. Es ist jedoch nicht bewiesen, daß dieses Verfahren zur Herstellung großer Mengen von SMC verwendbar ist, da die Expressions-Ausbeuten von SMC in verschiedenen E. coli- Wirten zu niedrig waren, um in ökonomischer Weise anwendbar zu sein oder gewerblich verwendbare Mengen von SMC zu liefern. Alternativ wurde SMC in Ion-, htpR- und Ion htpR- mutanten Wirtszellen [PCT-Patentanmeldung WO 85/03949] produziert.
- Die Erfindung löst die vorstehend genannten Probleme durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Identifizieren von DNA-Sequenzen, die für die Produktion von SMC oder von einem beliebigen anderen gewünschten eukaryontischen oder prokaryontischen Protein oder Polypeptid in mit diesen DNA- Sequenzen transformierten Wirten optimal sind. Die nach diesem Verfahren ausgewählten modifizierten DNA-Sequenzen codieren bei der Expression solche Proteine (in der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform insbesondere SMC) und erlauben auf hohem Niveau deren wirksame Produktion in verschiedenen Wirten. Dementsprechend ist es Dank der Erfindung zum ersten Male möglich, Polypeptide in klinisch nützlichen Mengen zu erhalten, die die Wachstums- Stimulations- und wachstumsvermittelnden Aktivitäten von SMC zeigen.
- Wie aus der nachfolgenden Offenbarung hervorgeht, sind die erfindungsgemäßen neuen DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA-Moleküle in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung fähig, in geeigneten Wirten die Produktion großer Mengen von SMC und SMC-artigen Polypeptiden zu steuern. Diese Polypeptide sind dann nützlich bei einer großen Anzahl von wachstumsstimulierenden und -vermittelnden Aktivitäten im Menschen, und ebenso auch im Rindvieh, im Schwein und in Hühnern.
- Es ist daher verständlich, daß ein grundsätzlicher Gesichtspunkt der Erfindung der Plan für ein Verfahren zum Identifizieren von DNA-Sequenzen ist, die optimal für die Produktion von SMC oder von einem beliebigen anderen gewünschten eukaryontischen oder prokaryontischen Protein oder Polypeptid sind. Der zweite grundsätzliche Gesichtspunkt der Erfindung betrifft eine Reihe von neuen DNA-Sequenzen, rekombinanten DNA-Molekülen und Wirten, die die Produktion dieser Proteine und insbesondere von SMC und SMC-artigen Polypeptiden in verbesserten Ausbeuten ermöglichen.
- Allgemein skizziert umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung der Produktion eines gewünschten eukaryontischen oder prokaryontischen Proteins oder Polypeptids in einem Wirt, der mit einer dieses Protein oder Polypeptid codierenden DNA-Sequenz transformiert ist, die nachfolgenden Schritte:
- - Ersetzen einer DNA-Sequenz, die ein Teil des N-terminalen Endes eines leicht testbaren Proteins oder Polypeptids codiert durch eine degenerierte Serie von DNA-Sequenzen, die einen Teil des N-terminalen Endes des gewünschten eukaryontischen oder prokaryontischen Proteins oder Polypeptids codiert;
- - Exprimieren der resultierenden Serien hybrider DNA- Sequenzen, die in einem geeigneten Wirt mit einer gewünschten Expressions-Kontrollsequenz funktionell verknüpft sind;
- - Auswählen der besonderen Hybrid-DNA-Sequenzen, die die optimale Produktion des leicht testbaren Proteins oder Polypeptids ermöglichen; und
- - Verwenden solch ausgewählter DNA-Sequenzen, die den N- terminalen Teil des gewünschten Polypeptids oder Proteins bei der Expression des gewünschten Polypeptids oder Proteins codieren.
- Dieses Verfahren erlaubt vorteilhafterweise eine optimale Produktion des gewünschten Proteins oder Polypeptids.
- Fig. 1 zeigt schematisch ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen f-Met-SMC-codierenden DNA- Sequenz und das Plasmid pLc24muSMCori, das diese DNA-Sequenz stromabwärts von Sequenzen enthält, die sich von mu und einem PL-Promotor ableiten.
- Fig. 2 zeigt synthetische Nucleotidsequenzen (beide Stränge) zweier Fragmente - SMC A (Fragment A) und SMC B (Fragment B), die in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer synthetischen f-Met-SMC-codierenden DNA-Sequenz verwendet werden. Fig. 2 zeigt ebenfalls die Aminosäuresequenzen der Fragmente SMC A und SMC B und die verschiedenen zur Herstellung dieser Fragmente verwendeten Oligonucleotidsequenzen 1 bis 11, X, Y und Z.
- Fig. 3 zeigt schematisch ein Verfahren zur Herstellung der Plasmide pUCmuSMCAori, pUCmuSMC A 1-18 und pLc24muSMC 1-18. In der in der Mitte von Fig. 3 gezeigten Sequenz des 512-fach degenerierten synthetischen Linkers bezeichnet "N" alle vier Basen-Möglichkeiten, "P" bezeichnet Purine und "Y" bezeichnet Pyrimidine.
- Die beste Art, die Erfindung auszuführen Zum vollen Verständnis der hier beschriebenen Erfindung wird die nachfolgende detaillierte Beschreibung angegeben.
- In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:
- Eine aus einer Zuckereinheit (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff-heterocyclischen Base bestehende monomere Einheit von DNA oder RNA. Die Base ist mit der Zuckereinheit über den glycosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) verknüpft. Diese Kombination einer Base und eines Zuckers wird mit Nucleosid bezeichnet. Jedes Nucleotid ist durch seine Base gekennzeichnet. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U")
- lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3' und 5'-Kohlenstoffatomen der benachbarten Pentosen verknüpft sind.
- DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), die durch die RNA eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translations- Terminationssignal codiert.
- DNA-Sequenz, die über ihre Matrize oder messenger RNA ("mRNA") eine für ein spezifisches Polypeptid charakteristische Aminosäuresequenz codiert.
- Vorgang der mRNA-Produktion von einem Gen.
- Vorgang der Polypeptid-Produktion von mRNA.
- Prozeß, den eine DNA-Sequenz oder ein Gen bei der Produktion eines Polypeptids durchläuft. Es handelt sich um eine Kombination von Transkription und Translation.
- Nicht-chromosomale doppelsträngige DNA- Sequenz, die ein intaktes "Replicon" umfaßt, so daß das Plasmid in der Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus vorhanden ist, können die Eigenschaften dieses Organismus als Ergebnis der Plasmid-DNA verändert oder transformiert sein. Beispielsweise transformiert ein das Gen für Tetracyclinresistenz (Tet®) tragendes Plasmid eine vorher gegen Tetracyclin sensitive Zelle zu einer, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformant" bezeichnet.
- Bakterielles Virus; viele von ihnen bestehen aus DNA-Sequenzen, die in eine Proteinhülle oder einen Proteinmantel ("Capsid") eingekapselt sind.
- Zur Replikation in einer Wirtszelle fähiges Plasmid, oder fähige Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß es/sie eine oder eine kleine Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen aufweist, an denen solch eine DNA-Sequenz in einer vorherbestimmbaren Weise ohne einen damit verbundenen Verlust einer wichtigen biologischen Funktion der DNA, z. B. Replikation, Produktion der Hüllproteine oder Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen geschnitten werden kann, und das/die einen Marker - z. B. Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz -, der zum Identifizieren von transformierten Zellen geeignet ist, enthält. Ein Clonierungsvehikel wird oft Vektor genannt.
- Verfahren, um zu einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen zu gelangen, die aus einem solchen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion abgeleitet sind.
- Molekül, das aus von verschiedenen Genomen stammenden DNA-Abschnitten besteht, die miteinander end-zu-end verknüpft worden sind, und das die Fähigkeit besitzt, Wirtszellen zu infizieren und in ihnen erhalten zu werden.
- Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionell verknüpft ist. Darunter fallen das lac-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, die Hauptoperator- und Promotor- Bereiche des Phagen λ, der Kontrollbereich des fd- Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus und Affenvirus (simian virus) abgeleitet sind, der Promotor für 3- Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren von Saurer Phosphatase aus Hefe z. B. Pho5, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren von Hefe und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen und ihrer Viren kontrollieren, oder Kombinationen davon.
- Somatomedin C
- Polypeptid, das wachstumsanregende oder -vermittelnde Aktivität von SMC zeigt. Beispielsweise kann ein SMC-artiges Polypeptid ein N- terminales Methionin oder ein anderes Peptid enthalten, das mit dem ersten Glycin von reifem SMC fusioniert ist. Es kann auch ein Threonin anstelle eines Methionins in der Aminosäureposition 59 enthalten. Ein SMC-artiges Polypeptid kann ebenfalls eine Reihe anderer Substitutionen, Additionen oder Deletionen bezüglich der Aminosäuresequenz des reifen SMC enthalten.
- Die Erfindung besitzt eine Reihe von Aspekten. Erstens betrifft sie ein Verfahren zur Verbesserung der Produktion eines beliebigen eukaryontischen oder prokaryontischen Proteins oder Polypeptids in einer Wirtszelle, die mit einer dieses Protein oder Polypeptid codierenden DNA-Sequenz zur Expression transformiert ist. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Auswahl von DNA-Sequenzen, die diese optimale Produktion eines beliebigen eukaryontischen oder prokaryontischen Proteins oder Polypeptids in einer mit diesen DNA-Sequenzen transformierten Wirtszelle erlaubt. Sie betrifft ebenfalls die DNA-Sequenzen, die durch das letztere Verfahren ausgewählt wurden und deren Verwendung bei der Herstellung der durch sie codierten Proteine und Polypeptide. Schließlich betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform DNA-Sequenzen, die SMC-artige Polypeptide codieren und Verfahren zur Selektion solcher DNA-Sequenzen und zu deren Verwendung bei der Optimierung der SMC- Produktion in mit ihnen transformierten Wirten.
- Bei der erfindungsgemäßen Expression sowohl der erfindungsgemäßen Hybrid-DNA-Sequenzen als auch der ausgewählten DNA-Sequenzen, die die optimale Produktion des gewünschten eukaryontischen oder prokaryontischen Proteins oder Polypeptids erlauben, kann man eine große Anzahl von Wirts-/Expressionsvektor-Kombinationen verwenden. Beispielsweise können nützliche Expressionsvektoren aus Abschnitten chromosomaler, nicht chromosomaler und synthetischer DNA- Sequenzen bestehen. Beispiele dafür sind verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide z. B. Plasmide von E. coli einschließlich Col E1, pcR1, pBR322, pMB9 und ihre Derivate, Plasmide mit einem größeren Wirtsbereich z. B. RP4, Phagen-DNAs, z. B. die zahlreichen Derivate des Phagen λ, z. B. NM 989 und andere DNA-Phagen, z. B.: M13 und Filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen, in Hefe verwendbare Vektoren, wie z. B. das 2u-Plasmid, in eukaryontischen und tierischen Zellen verwendbare Vektoren, wie diejenigen, die von SV40 abgeleitete DNA-Sequenzen enthalten, und Vektoren, die sich aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs ableiten, wie z. B. Plasmide, die so modifiziert worden sind, daß sie Phagen-DNA verwenden oder andere Derivate davon.
- Unter solchen nützlichen Expressionsvektoren finden sich auch Vektoren, die die Expression der clonierten DNA- Sequenzen in eukaryontischen Wirten wie tierischen und menschlichen Zellen ermöglichen (z. B. P. J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-41; S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1 (1981), S. 854-64; R. J. Kaufmann und P. A. Sharp. "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected With A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol., 159 (1982), S. 601- 21; R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol., 159 (1982), S. 601-64; S. I. Scahill et al., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80 (1983), S. 4654-59; G. Urlaub und Li. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980), S. 4216-20).
- Solche Expressionsvektoren sind außerdem durch mindestens eine Expressions-Kontrollsequenz gekennzeichnet, die funktionell mit der speziellen DNA-Sequenz verknüpft ist, um die Expression dieser clonierten DNA-Sequenz zu kontrollieren und zu regulieren. Beispiele nützlicher Expressions-Kontrollsequenzen sind das lac-System, das trp- System, das tac-System, das trc-System, die Hauptoperator- und Promotor-Bereiche des Phagen λ, der Kontrollbereich des fd-Hüllproteins, die glykolytischen Promotoren von Hefe, z. B. der Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase, die Promotoren der Sauren Phosphatase von Hefe, z. B. Phos, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren von Hefe und Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus und Affenvirus (simian virus) abgeleitet sind, z. B. die frühen und späten Promotoren von SV40, und andere DNA-Sequenzen, von denen man weiß, daß sie die Expression von Genen prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen und ihrer Viren kontrollieren und/oder Kombinationen von ihnen.
- Nützliche Wirte zur Expression schließen bekannte eukaryontische und prokaryontische Wirte wie E. coli-Stämme, z. B. E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI (λ) und E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, wie Bacillus subtilis, Streptomyces, Hefen und andere Pilze, tierische, z. B. COS- und CHO-Zellen und menschliche und pflanzliche Zellen in Gewebekultur ein.
- Natürlich funktionieren nicht alle Wirts/Expressionsvektor-Kombinationen mit gleicher Effizienz bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder bei der Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide. Die besondere Auswahl einer Wirts-/Expressionsvektor-Kombination kann der Fachmann jedoch unter angemessener Berücksichtigung der hier vorgetragenen Prinzipien vornehmen, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Zum Beispiel sollte der Auswahl ein Ausbalancieren einer Reihe von Faktoren zugrunde gelegt werden. Diese beinhalten z. B. Kompatibilität von Wirt und Vektor, Toxizität der durch die DNA-Sequenz codierten Proteine für den Wirt, Leichtigkeit der Gewinnung des gewünschten Proteins, Expressionseigenschaften der DNA- Sequenzen und der mit ihnen funktionell verknüpften Expressions-Kontrollsequenzen, Biosicherheit, Kosten und die Faltung, die Form oder beliebige andere notwendigen, der Expression nachgeschalteten Modifikationen des gewünschten Proteins.
- Außerdem können innerhalb eines jeden spezifischen Expressionsvektors eine Reihe von Stellen zur Insertion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise durch die Restriktionsendonuclease, die sie spaltet, gekennzeichnet. Sie sind dem Fachmann bekannt. Es versteht sich natürlich, daß ein in der vorliegenden Erfindung nützlicher Expressionsvektor keine Restriktions-Endonucleasestelle zur Insertion des gewählten DNA-Fragments besitzen muß. Statt dessen kann der Vektor mit dem Fragment durch alternative Verfahren verknüpft werden. Der Expressionsvektor und insbesondere die in ihm ausgewählte Stelle zum Inserieren eines selektionierten DNA- Fragments und dessen funktionelle Verknüpfung darin mit einer Expressions-Kontrollsequenz wird durch eine Reihe von Faktoren bestimmt, z. B. durch die Anzahl von Stellen, die einem bestimmten Restriktionsenzym zugänglich sind, die Größe des zu exprimierenden Proteins, die Empfindlichkeit des gewünschten Proteins gegen proteolytischen Abbau durch Wirtszell-Enzyme, Kontamination oder Bindung des zu exprimierenden Proteins durch Wirtszell-Proteine, die während der Reinigung schwer zu entfernen sind, Expressionseigenschaften, wie Lage von Start- und Stopcodons bezüglich der Vektorsequenzen, und durch andere dem Fachmann bekannte Faktoren. Die Wahl eines Vektors und einer Insertionsstelle für eine DNA-Sequenz wird durch die Ausgewogenheit dieser Faktoren bestimmt, wobei in einem gegebenen Fall nicht jede Auswahl gleich effektiv ist.
- Eine Reihe von DNA-Sequenzen, die leicht testbare Proteine oder Polypeptide codieren, können ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird z. B. β-Galactosidase verwendet, da die Produktion dieses Proteins mit gut bekannten kolorimetrischen Plattierungsassays leicht verfolgt werden kann. Es könnten ebenfalls andere, z. B. Galactokinase- oder Wirkstoffresistenz- (z. B. Apicillinresistenz-) Gene verwendet werden.
- Schließlich sind die erfindungsgemäßen Verfahren und die durch sie ausgewählten und in ihnen verwendeten DNA- Sequenzen bei jedem beliebigen prokaryontischen oder eukaryontischen Protein oder Polypeptid anwendbar. Unter diesen befinden sich menschliche und tierische Lymphokine, einschließlich Interferone, Interleukine und TNFs, menschliche und tierische Hormone einschließlich der Wachstumshormone und Insuline, menschliche und tierische Blutfaktoren, einschließlich Faktor VIII und tPA, Enzyme, Antigene und andere interessierende Proteine und Polypeptide. In der hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren angewendet, um die Produktion von SMC-artigen Polypeptiden zu optimieren.
- Zum besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung sind die nachfolgenden Beispiele aufgeführt. Es wird darauf hingewiesen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung dienen und keinesfalls so auszulegen sind, daß sie die Erfindung in irgend einer Weise auf die darin angegebenen spezifischen Ausführungsformen beschränken.
- Es wird nun auf Fig. 1 Bezug genommen. Dort wird schematisch eine Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls (pLc24muSMCori) angegeben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Human-f-Met-SMC codierende DNA-Sequenz aufweist, die mit einer von mu abgeleiteten und eine Shine Dalgarno-Sequenz von mu tragenden DNA-Sequenz fusioniert ist, wobei die kombinierte DNA-Sequenz funktionell mit einem aus dem Bacteriophagen λ abgeleiteten PL-Promotor verknüpft ist.
- Zur Konstruktion von pLc24musMcori wurden zuerst unter Verwendung der beschriebenen Aminosäuresequenz von menschlichem SMC [Rinderknecht und Humble, siehe oben; D. G. Klapper et al., Endocrinol., 112 (1983), S. 2215-17] 14 Oligodesoxynucleotide (vgl. Fig. 1 und 2, Sequenzen 1 bis 11, X, Y und Z) synthetisiert. Zur Synthese wurde das Fest-Phasen-Phosphotriesterverfahren [H. Ito et al., Nucleic Acids Res., 10 (1982), S. 1755-69] angewandt. Nach dem Entfernen des Schutzes der rohen Oligomere wurden diese durch Gelfiltration an Sephadex G-50 entsalzt und durch Elektrophorese auf präparativen denaturierenden Polyacrylamid-Flachgelen gereinigt, die Harnstoff enthielten [T. Maniatis et al., Biochem., 14 (1975), S. 3787-94]. Die Lage der Banden wurde durch UV-Schattierung bestimmt und die Oligodesoxynucleotide wurden durch Elektroelution aus Gelscheibchen isoliert. Die gel-gereinigten Oligodesoxynucleotide wurden dann mit T&sub4;-Polynucleotidkinase phosphoryliert und auf 15%igen Polyacrylamid-/7M-Harnstoffgelen erneut gereinigt, wobei die DNA durch Elektroelution wiedergewonnen wurde [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Die 14 Oligodesxoxynucleotide variierten in der Größe von 13 bis 37 Basen.
- Bei diesen Synthesen wurden die Codon-Verwendung in hochexprimierten Genen von E. coli [R. Grantham et al, Nucleic Acids Res., 8 (1980), S. 1983-92] und die tRNA- Häufigkeiten in E. coli [T. Ikemura, J. Mol. Biol., 151 (1981), S. 389-409] berücksichtigt. Außerdem wurde eine Reihe geeigneter Endonuclease-Erkennungsstellen in verschiedene Positionen innerhalb der Nucleotidsequenzen eingeführt.
- Dann wurden die Sequenzen 1-4 und X, Y und Z und die Sequenzen 5-11 ligiert und mit Klenow-Polymerase elongiert, um so zwei zusammengesetzte DNA-Sequenzen zu erzeugen - das Fragment A, ein 98 Basenpaar-Fragment mit glatten Enden ("SMC A") und das Fragment B, ein 138 Basenpaar-Fragment mit glatten Enden ("SMC B") [J. R. Rossi et al., J. Biol. Chem., 257 (1982), S. 9226-29] (Fig. 1 und 2). Fragment A codiert das N-terminale Ende von SMC und Fragment B den Rest von SMC (Fig. 2).
- Das Fragment SMC A wurde durch Erhitzen von je 2CO pMol der Sequenzen 1-4, X, Y und Z auf 95ºC in 20 ul eines Puffers zum Aneinanderlagern (Reannealing-Puffer; 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;) und durch anschließendes langsames Abkühlen des Gemisches auf 4ºC präpariert. Dithiothreit, ATP und T4-DNA-Ligase wurden bis zu Endkonzentrationen von 5 mM, 70 uM bzw. 20 u/ml zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde dann 10 Stunden bei 4ºC inkubiert. Nach Ethanolfällung wurde das Gemisch auf ein 8%iges Polyacrylamid-/7 M Harnstoffgel aufgetragen, und die Stränge mit 77 und 78 Basenpaaren wurden eluiert. Dann wurden je 25 pMol jedes Stranges in 5 ul Reannealing-Puffer kombiniert, das Reaktionsgemisch wurde auf 95ºC erhitzt und langsam auf 15ºC abgekühlt. Dann wurden Dithiothreit, dNTPs und Klenow-Fragment von DNA-Polymerase (bis zu 5 mM, 250 uM bzw. 2 Einheiten) zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktionsprodukte wurden wie vorstehend gereinigt, und es wurden 7 pMol SMC A mit 89 Basenpaaren isoliert. Auf im wesentlichen gleiche Weise wurden 20 pMol SMC B mit 138 Basenpaaren unter Verwendung von je 200 pMol der Sequenzen 5-11 hergestellt.
- Dann wurde jedes dieser Fragmente in einen M13mp8- Vektor mit glatten Enden inseriert, der präpariert worden war durch Spalten von 2 ug RF-DNA mit BamHI (für Fragment A) und mit BamHI und HindIII (für Fragment B), durch Reparatur der versetzten Enden mit einer Einheit E. coli DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) in Gegenwart der vier Desoxynucleosid-Triphosphate (dNTPs), durch Präzipitieren mit Ethanol und durch 30minütiges Dephosphorylieren der 5'-Enden mit Kälberdarm-Phosphatase (20 Einheiten in 10 mM Tris-HCl (pH 9,2), 0,2 mM EDTA) [J. Messing, Methods in Enzymology, 101 (1983), S. 20-78]. Zur Ligation wurden 20 ng des linearisierten Vektors und 0,1 pMol des DNA-Fragments in 10 ul Ligationspuffer und 40 Einheiten von T4-DNA-Polymerase 24 Stunden bei 15ºC verwendet; (Fig. 1).
- Bei der Ligation von Fragment A mit dem M13mp8-Vektor mit glatten Enden wurde ein rekombinanter Phage erhalten, bei dem sich die BamHI-Stellen an den Enden des SMC- Fragments wieder gebildet hatten; zusätzlich hatte sich eine Ncol-Stelle (GGATCCATGG) gebildet (mp8SMC A) (Fig. 1). Bei der Ligation von Fragment B mit dem zwei glatte Ende aufweisenden M13mp8-Vektor wurde ein rekombinanter Phage erhalten, der die BamHI- und HindIII-Stellen an den Enden des SMC-Fragments wiedergebildet hatte (mp8sMc B) (Fig. 1).
- Als nächstes wurde E. coli JM191 [J. Messing und J. Vieira, Gene, 19 (1982), S 269-76] mit jedem dieser rekombinanten Phagen transformiert, und die transformierten Wirte wurden auf L-Broth-Platten ausplattiert, die 5-Brom-4- chlor-3-chindolyl-β-galactopyranosid (X-GAL) enthielten. Dann wurde Phagen-DNA aus 24 weißen Plaques von mit mp8sMc A und mp8SMc B transformierten E. coli JM101 gereinigt und durch Didesoxy-Kettenabbruch sequenziert [A. J. H. Smith, Methods in Enzymol., 65 (1980), 5 560-80]. Dann wurde intrazelluläre RF-DNA von mp8SMc A und mp8SMc B präpariert, die erstere mit Ncol/BamHI und die letztere mit BamHI/HindIII gespalten und die SMC-verwandten Fragmente durch Gelelektrophorese isoliert (Fig. 1).
- Dann wurden die beiden Fragmente (SMC A und SMC B) gemischt mit einem 67 Basenpaar-Fragment des ner-Gens des Bacteriophagen mu (eine Gabe von 3. Allet) [G. Gray et al., Gene, 32, im Druck]. Dieses Fragment besteht aus den Nucleotiden 1043-96 [H. Priess et al, Mol. Gen. Genet., 186 (1982), S 315-21, Fig. 4], denen eine EcoRI-Endonuclease- Restriktionsstelle vorausgeht und denen eine NcoI-Stelle (CCATGG) folgt, wobei das interne ATG der NcoI-Stelle ein Translations-Initiationscodon bildet. Dieses Fragment enthält ebenfalls eine nahezu optimale ribosomale Bindungsstelle [J. Shine und L. Dalgarno, Nature, 254 (1975), S. 34-38]. Als Ergebnis dieser Ligation wurde ein 303 Basenpaar EcoRI -HindIII-Fragment isoliert, das das mu- Genfragment, SMC A und SMC B umfaßt (Fig. 1). Die Ligation erfolgte so, daß das ATG-Initiationscodon der NcoI-Stelle des mu-Fragments direkt und im richtigen Leserahmen mit SMC A fusioniert war (Fig. 1 und 2).
- Dieses Fragment wurde in zuvor mit EcoRI und HindIII gespaltenes pLc24 [E. Remaut et al., Gene 15 (1981), S. 81- 93] gebracht, wodurch das Plasmid pLc24musMCori entstand.
- Dieses Plasmid ist dadurch gekennzeichnet, daß es das SMC- Gen und sein Initiations-ATG unter der Kontrolle des PL- Promotors des Bacteriophagen λ besitzt (Fig. 1).
- E. coli HB101 [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)] wurde co-transformiert mit pLc24musMcori und pc1857, einem Derivat von pACYC 184, das einen temperatursensitiven Repressor von PL codiert [E. Remaut et al., Gene, 22 (1983), S. 103-13]. Da die beiden Plasmide unterschiedliche Antibiotikaresistenz-Gene - Penicillinase (pLc24muSMCori) und Kanamycin (pc1857) tragen, können korrekt co-transformierte Kulturen durch Wachstum in 50 ug/ml Ampicillin und 40 ug/ml Kanamycin selektioniert werden.
- 5 ml Kulturen (L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin und 40 ug/ml Kanamycin) wurden von Platten, die korrekt transformierte E. coli HB101 (pLc24muSMCori) (pc1857) enthielten, inokuliert, und die Kulturen wurden über Nacht bei 28ºC gezüchtet. Dann wurden 2 ml der Übernacht-Kultur zu 10 ml des auf 42ºC vorgewärmten L-Broth gegeben, und die Kulturen wurden in einem 100 ml-Erlenmeyer-Kolben 2 Stunden bei 42ºC heftig bewegt.
- Um die Produktion von SMC-artigem Polypeptid zu testen, wurden die Zellen aus 1 ml Aliquots der Kultur (A&sub5;&sub5;&sub0;=20) abzentrifugiert und durch 10 Minuten Kochen (100ºC) in 50 ul SDS-β-Mercaptoethanol-Lysepuffer [U. K. Laemmli, Nature, 227 (1970), S. 680-85] lysiert. Dann wurde auf jegliche SMC-Aktivität unter Verwendung eines käuflich erhältlichen Testkits (Nichols Institute Diagnostics) getestet, dessen Standards zuvor mit gereinigtem IGF-1 (eine Gabe von R. Humbel) verifiziert worden waren. Für den Test wurden die erfindungsgemäßen SMC-enthaltenden Lysate so wie für die Gelelektrophorese hergestellt, mindestens 20-fach im Testpuffer verdünnt und in doppelter Ausführung getestet. Es wurde beobachtet, daß menschliches unter den hier verwendeten Standard-Lysebedingungen denaturiertes SMC in diesem RIA genau so reaktiv war, wie das native Hormon.
- Dieser Test zeigte, daß E. coli HB101 (pLC24muSMCori) (pc1857) nach Temperaturinduktion sehr wenig SMC-Aktivität - 1,4 ug/ml dem RIA nach - und eine auf dem Proteingel durch Coomassie-Blau-Anfärbung nicht nachweisbare Menge produzierte. Dementsprechend wurde das Ausmaß der Produktion von SMC-artigem Polypeptid in diesem transformierten Wirt auf lediglich einige 100 Moleküle pro Zelle geschätzt.
- Als eine Konsequenz des sehr geringen Ausmaßes der Produktion von SMC-artigem Polypeptid bei Verwendung von pLc24muSMCori wurde versucht, verschiedene andere Plasmide zu konstruieren, die erhöhte Expressionsniveaus aufwiesen.
- Bei einer Vorgehensweise wurden Expressionsvektoren hergestellt, die SMC-codierende DNA-Sequenzen aufwiesen, die mit einer ein anderes Protein codierenden DNA-Sequenz fusioniert waren. Bei dieser Vorgehensweise wurde ein Fusionsprotein, das an seinem aminoterminalen Ende aus einem Nicht-SMC-Protein und an seinem carboxyterminalen Ende aus einem SMC-artigen Polypeptid bestand, hergestellt. Obwohl sich solche Fusionsproteine in hoher Ausbeute aus den hier verwendeten Vektoren produzieren ließen, können sie bei der Behandlung von Mensch und Tier weniger vorteilhaft sein als f-Met-SMC oder SMC selbst. Für die vorteilhafteste Verwendung benötigen solche Fusionsproteine deshalb eine zusätzliche Behandlung, um die Nicht-SMC-Anteile aus ihnen zu entfernen. Solche Verfahren sind zwar verfügbar (vgl. z. B. US-Patente 4,425,437, 4,338,397 und 4,366,246), sie können aber - außer im Fall der direkten Sekretion und Reifung - weniger bevorzugt sein, als die direkte Expression eines gewünschten SMC-artigen Polypeptids.
- Dementsprechend wurde bei einer zweiten Vorgehensweise, eine Verbesserung der Produktion von SMC- artigen Polypeptiden zu versuchen, die Deletions-Strategie übernommen, die sich bei der Erhöhung des Expressionsniveaus von Rinderwachstumshormon und Schweinewachstumshormon als nützlich erwiesen hat. Vergleiche z. B. Europäische Patentanmeldungen 103 395 und 104 920. Unter Anwendung dieser Verfahren wurde eine Reihe modifizierter SMC- codierender Sequenzen hergestellt, die SMC-artige Polypeptide produzierten, die durch aminoterminale Deletionen gekennzeichnet waren. Es wurden z. B. Expressionsvektoren hergestellt, die ein f-Met-A3-SMC und ein f-Met-A6-SMC produzierten. Obwohl die Produktionsausbeuten dieser modifizierten SMCs geringfügig höher waren als die Produktionsausbeute des f-Met-SMC von Vektor pLc24muSMCori waren die Expressionsausbeuten noch sehr gering.
- Schließlich wurden in einem dritten Versuch verschiedene Kombinationen von Promotoren und Ribosomen- Bindungsstellen zur Kontrolle der Expression der hier interessierenden SMC-codierenden Sequenz verwendet. Diese Modifikationen waren jedoch, was die SMC-Produktion anbetrifft, eher schlechter als pLc24musMcori.
- Da die beiden vorher beschriebenen Versuche entweder erfolglos waren, oder in vielen Fällen zur Produktion einer weniger bevorzugten Form eines SMC-artigen Polypeptids führten, wurde der Entschluß gefaßt, eine Vorgehensweise zu entwickeln, die es erlauben könnte, optimale, die Produktion eines beliebigen Proteins codierende Sequenzen und insbesondere diejenigen optimalen DNA-Sequenzen auszuwählen, die die Produktion von SMC-artigen Polypeptiden codieren.
- Diese Vorgehensweise beruhte auf unserer Hypothese, daß stille Mutationen in den DNA-Sequenzen, die den N- terminalen Teil eines beliebigen - und in der besonderen in diesem Beispiel beschriebenen Ausführungsform des f-Met-SMC codierenden - Gens codieren, eine verbesserte Sekundärstruktur der RNA liefern und deshalb zu höheren Expressionsausbeuten in einem gewählten Wirt führen könnten. Wegen der zahlreichen möglichen stillen Mutationen, die man zur Bestimmung ihrer Wirkung auf die Expression - falls überhaupt eine vorhanden ist - zu analysieren hätte, war es zur Auswahl der optimalen codierenden Sequenzen aber nötig, ein schnelles und einfaches Screening-Verfahren für solche Sequenzen zu entwerfen. Ohne solche Verfahren wäre ein Absuchen der Clone mühsam, wenn praktisch nicht sogar unmöglich, und das Verfahren würde versagen.
- Genfusionen mit lacZ sind früher verwendet worden, um die Produktion von Proteinen beim Fehlen von Tests für ihre Genprodukte zu verfolgen [L. Guarente et al., Cell, 20 (1980), S. 543-53; B. A. Castilho et al., J. Bacteriol., 158 (1984), S. 488-95]. Darüber hinaus läßt sich die Produktion von β-Galctosidase leicht durch Anwendung kolorimetrischer Plattierungs-Assays überwachen. Dementsprechend wurde eine Entscheidung zu Gunsten der Anwendung dieses Screening- Verfahrens zur Auswahl der erfindungsgemäßen optimalen DNA- Codierungssequenzen getroffen. Es wird darauf hingewiesen, daß natürlich auch andere Screening-Verfahren, wenn auch weniger bevorzugt, bei der Selektion der optimalen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendbar sind.
- Um die Sekundärstruktur der SMC-codierenden Sequenz in dieser erläuternden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zu variieren, wurde eine Reihe synthetischer Linker hergestellt, die die 256 möglichen die Aminosäuren 2- 6 von SMC codierenden DNA-Sequenzen umfaßten. Obwohl die Aminosäuren 2-6 von SMC durch 256 verschiedene Sequenzen codiert sein können, wurde ein 512-fach degenerierter Linker (Fig. 3) verwendet, wodurch alle möglichen Leucin-Codons (SMC-Position 5) einschließlich des ein Phenylalanin codierenden TTY zugelassen wurden. Es wird darauf hingewiesen, daß natürlich auch längere oder kürzere Oligonucleotide in dem erfindungsgemäßen Verfahren hätten verwendet werden können. Beispielsweise könnten längere synthetische Linker z. B. solche, die bis zur Aminosäure 20 von SMC codieren, nützlicherweise verwendet werden, um die Wirkung solcher längeren Sequenzen auf die Expression von SMC zu ermitteln. Die rendundanten DNA-Sequenzen der Serie von 512 Linkern ist in Fig. 3 dargestellt.
- Es wird nun auf Fig. 3 Bezug genommen. Dort wird eine Ausführungsform eines Verfahrens gezeigt, das diese redundanten DNA-Sequenzen bei der SMC-Produktion verwendet. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde zuerst das 165-Basenpaar EcoRI- BamHI-Fragment von pLc24musMcori in das mit EcoRI-BamHI - gespaltene pUC8 subcloniert, um eine "in-Phase"-Fusion zwischen lacZ und SMC an der BamHI-Stelle herzustellen. Dieser Vektor wurde mit pUcmusMcAori (Fig. 3) bezeichnet. pUC8 wurde wegen seiner kleinen Größe ausgewählt und wegen seiner einmalig vorkommenden Restriktionsstellen, die lacZ unterbrechen, und weil es in einem lacI&supmin;-Wirt verwendet werden kann. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß in dem hier beschriebenen Screening-Verfahren auch andere, ein lacZ-Gen tragende Plasmide hätten verwendet werden können.
- Da die Fusion durch Inserieren der SMC-codierenden Sequenzen in den promotorproximalen Bereich des lacZ-Gens hergestellt wurde, steht die Expression des Hybridgens unter der Kontrolle des lac-Promotors von pUC8.
- In pUCmuSMCAori können die Ribosomen an der lac- Ribosomen-Bindungsstelle die Translation initiieren. Solch eine Translation wird aber an dem in Phase liegenden Stopcodon des von pLc24muSMCori abgeleiteten mu-Fragments schnell terminieren. Alternativ können die Ribosomen die Translation an der mu-Ribosomen-Bindungsstelle initiieren, um so ein Fusionssprotein zu produzieren, das aus einem aminoterminalen Teil von SMC und einem carboxyterminalen Teil von lacZ besteht. Die SMC-β-Galactosidase-Fusion in pUcmusMc%ri enthielt 35 Aminosäuren von SMC am N-Terminus.
- Obwohl sich das Fusionsgen in pUcmuSMCAori in Phase befindet, wurden nach 16 Stunden bei 37ºC nur weiße Kolonien beobachtet, wenn E. coli JM83 [J. Vieira und J. Messing, Gene, 19 (1982), S. 259-68] mit dem Plasmid transfiziert und der transformierte Wirt auf 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galactopyranosid (X-GAL) enthaltenden LB-Agarplatten kultiviert wurde. Obwohl diese Kolonien nach 40 Stunden schließlich sehr schwach blau wurden, zeigte ihre weiße Farbe nach 16 Stunden, daß sie sehr kleine Mengen des SMC-βgal-Fusionsproteins produzierten. Dieses Ergebnis ist natürlich mit dem hier zuvor beobachteten niedrigen Expressionsniveau in pLc24muSMCori konsistent.
- In das Plasmid pUcmusMcAori wurde dann die gesamte Kollektion der 512-fach degenerierten synthetischen DNA- Linker (AvaII-HaeII-Fragmente) eingesetzt, die die Aminosäuren 2-6 von SMC an Stelle der Sequenzen codieren, die diese Aminosäuren im Originalplasmid codieren. Zur Vermeidung von Linker-Konkatenomeren wurden diese Linker vor der Ligation nicht phosphoryliert. Diese Sequenzen wurden in das Plasmid pUCmuSMCAori eingeführt durch Ligieren jeder einzelnen Sequenz mit dem Fragment, das die mu-Ribosomen- Bindungsstelle und die SMC-Aminosäure 1 codiert (das 70 bp EcoRI-AvaII-Fragment von pUCmuSMCori) und dem Fragment, das die Aminosäuren 7-32 von SMC codiert (das 71 bp HaeII- BamHI-Fragment von pUCmuSMCAori) und durch anschließendes Inserieren des resultierenden EcoRI-BamHI-Kombinationsfragmentes in das mit EcoRI-BamHI restringierte pUCmuSMCAori (vgl. Fig. 3).
- Auf X-GAL enthaltenden L-Broth-Platten wurden 5000 Kolonien von E. coli JM83 plattiert, der mit dem vorstehenden Gemisch von Plasmiden transformiert worden war. Ungefähr 10% der resultierenden Kolonien waren nach 40 Stunden bei 37ºC tiefer blau als pUC8muSMCAori. Dann wurden 14 (sowohl blaue als auch weiße) der 5000 Kolonien (E. coli JM83 (pUCmuSMCA 1-14)) nach einer Reihe von Verfahren analysiert: DNA-Sequenzierung des degenerierten Bereichs, enzymatische β-Galactosidaseaktivität und SMC-Expression in E. coli C600 [T. Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)] nach Substitution des 165 bp EcoRI-BamHI-Fragments in pLc24muSMCori durch das 165 bp EcoRI-BamHI-Fragment aus jedem pUCmuSMCA 1-18. Diese letzteren Plasmide werden in Fig. 3 mit pLc24muSMC 1-18 bezeichnet. 10 der 14 für die Analyse ausgewählten Kolonien waren blau und 4 waren auf X-GAL-Platten weiß. Tabelle I zeigt die Ergebnisse dieser verschiedenen Analysen: Tabelle I Plasmid pUC8-Fusion Einheiten β-gal* pL-Plasmid ug/ml SMC OD²&sup0; Lysat Originalsequenz 2-6 pUCmuSMCAori blaue Kolonien weiße Kolonien * β-Galactosidase-Aktivität wurde mit o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG), im wesentlichen wie von J. H. Miller, Experimente in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratories) (1972) beschrieben, analysiert.
- Wie in Tabelle I angegeben, produzierten die blauen pUC8muSMCA 1-10 enthaltenden Kolonien 2,5-8-mal mehr β-Galactosidaseeinheiten als E. coli JM83 (pUC8muSMCAori). Im Gegensatz dazu produzierten die weißen pUCmuSMCA 11-14 enthaltenden Kolonien keine nachweisbare Menge β- Galactosidase. Wenn die EcoRI-BamHI-Fragmente aus diesen Plasmiden in pLc24muSMCori inseriert wurden, wurden überraschenderweise Plasmide erzeugt, die in E. coli HB101 23-46 mal mehr SMC-Aktivität produzierten, als das Eltern-Plasmid, obwohl die β-Galactosidaseproduktion von pUC8muSMCA 1-10 2,5-8 mal höher war als die des Elternplasmids. Für eine gegebene Fusion ergab sich außerdem offensichtlich keine spezifische Korrelation zwischen β-Galactosidase-Einheiten und ug SMC für die korrespondierende Expression unter PL- Kontrolle. Die blau/weiß-Differenz der Kolonien auf X-GAL- Platten erlaubte aber eindeutig die Selektion von DNA- Sequenzen, die SMC-Konstruktionen mit hoher Expression codierten. Dementsprechend kann dieses Verfahren ganz allgemein zur Selektion optimaler DNA-Sequenzen zur Produktion eines beliebigen gewünschten eukaryontischen oder prokaryontischen Polypeptids angewandt werden.
- Obwohl es unerwünscht ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, kann man doch annehmen, daß die durch die erfindungsgemäßen degenerierten DNA-Sequenzen gezeigten unterschiedlichen Expressionsgrade in einer Beziehung zur RNA-Sekundärstruktur der die N-terminalen Aminosäuren von SMC codierenden Nucleotide stehen. Zum Beispiel weisen die Ergebnisse der Erfindung darauf hin, daß ein mögliches, durch die Condons für Threonin-Leucin (ACN-CTN) (SMC- Positionen 4 und 5) gebildetes CCC für die SMC-Synthese besonders schädlich ist. Alle hier analysierten weißen Kolonien und pUCmuSMCori waren durch diese Sequenz, die mit der Ribosomen-Bindungsstelle in pLc24muSMC Wasserstoffbrücken-Bindungen bilden konnte, charakterisiert.
- Obwohl in der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsform eine die gewünschte Protein-lacZ- Fusion codierende DNA-Sequenz verwendet wurde, die ein Fusionsprotein produzierte, das 35 Aminosäuren von SMC am N- terminalen Ende aufwies, muß man die relativen Längen der beiden Teile des Fusionsproteins für das wirksamste Screening nach unserem Verfahren empirisch bestimmen. Einige dieser Faktoren, die man bei dieser Wahl berücksichtigen sollte, wurden durch die experimentellen Ergebnisse identifiziert. Zum Beispiel ist die Stärke der Ribosomen- Bindungsstelle wichtig. Wenn eine trp-Ribosomen- Bindungsstelle anstatt derjenigen von mu verwendet wurde, produzieren die Fusionen, die 45 Aminosäuren von SMC enthielten, keine blauen Kolonien. Ebenfalls wichtig sind die relativen Anteile von β-Galactosidase und dem ausgewählten Protein im Fusionsprotein. Zum Beispiel erlaubten Genfusionen, die Fusionsproteine mit nur 14 SMC- Aminosäuren am N-Terminus erzeugten, keine blau-weiß-Selektion. In diesem Fall war die β-Galactosidaseaktivität des Fusionsproteins offensichtlich zu hoch, um die Entdeckung von optimalen N-terminal codierenden Sequenzen zu erlauben. Schließlich ist die Empfindlichkeit des Nachweissystems wichtig. Es wurde festgestellt, daß der beim Screening nutzbare β-Galactosidase-Aktivitätsbereich bei 1-8% des β- Galactosidaseniveaus lag, das durch das originale pUC8 produziert wurde. Bei angemessener Berücksichtigung dieser und anderer auf eine der vorstehenden ähnliche Weise bestimmbarer Faktoren kann der Fachmann das geeignete Fusionsprotein auswählen und zum Screenen nach dem hier beschriebenen Verfahren testen, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen.
- Obwohl das in dem vorstehenden erläuternden Beispiel produzierte spezifische SMC-artige Polypeptid ein f-Met-SMC ist, wird darauf hingewiesen, daß das f-Met von SMC durch eine Reihe verfügbarer Verfahren entfernt werden kann.
- Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren produzierten SMC-artigen Polypeptide lassen sich unter Anwendung herkömmlicher Verfahren zu pharmazeutisch nützlichen Zusammensetzungen formulieren. Diese Zusammensetzungen umfassen eine pharmazeutisch wirksame Menge des SMC-artigen Polypeptids zur gewünschten Anregung des Gewebewachstums und bevorzugt einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger sind bekannt. Wie vorstehend festgestellt, sind die Zusammensetzungen dann bei Verfahren zur Stimulation des Gewebewachstums und bei der Behandlung von Zwergwuchs, Muskelatrophie, Knochenbrüchen, Verwundungen oder anderen Verletzungen des Gewebes nützlich.
- Mikroorganismen und rekombinante DNA-Moleküle, die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, werden durch Kulturen exemplifiziert, die am 23. März 1985 bei der Kulturensammlung Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland hinterlegt und als SMC-1 und SMC-2 identifiziert wurden:
- SMC-1: E. coli HB101 (pc1857) (pLc24muSMCori)
- SMC-2: E. coli HB101 (pc1857) (pLc24muSMC 8)
- Diesen Kulturen wurden die Hinterlegungsnummern DSM 3276 bzw. 3277 zugeordnet.
- Obwohl vorstehend eine Reihe von Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, ist es offensichtlich, daß die grundlegenden Konstruktionen verändert werden können, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, die die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwenden. Deshalb wird man anerkennen, daß der Umfang der Erfindung eher durch die beigefügten Ansprüche als durch die spezifischen Ausführungsformen, die vorstehend als Beispiel vorgelegt wurden, zu definieren ist.
Claims (18)
1. Verfahren zur Verbesserung der Produktion eines
gewünschten Polypeptids in einem Wirt, der mit einer
dieses Polypeptid codierenden DNA-Sequenz transformiert
ist, die funktionell mit einer Expressions-
Kontrollsequenz verknüpft ist, die nachfolgenden
Schritte umfassend
- Ersetzen einer DNA-Sequenz, die einen Teil des N-
terminalen Endes eines leicht testbaren Polypeptids
codiert durch eine degenerierte Serie von DNA-
Sequenzen, die einen Teil des N-terminalen Endes des
gewünschten Polypeptids codiert, wobei der Ersatz
diese Testbarkeit nicht wesentlich beeinflußt;
- Exprimieren der resultierenden Serie hybrider DNA-
Sequenzen, die funktionell mit der gewünschten
Expressions-Kontrollsequenz im Wirt verknüpft sind;
- Auswählen der besonderen Hybrid-DNA-Sequenzen, die die
optimale Produktion des leicht testbaren Polypeptids
ermöglichen; und
- Verwenden solch ausgewählter DNA-Sequenzen bei der
Expression dieses Polypeptids, die den N-terminalen
Teil des gewünschten Polypeptids codieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das leicht testbare Polypeptid β-Galactosidase,
Galactokinase oder ein Wirkstoffresistenz- (drug
resistenz) Marker ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das gewünschte Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Interferonen, Interleukinen und anderen
Lymphokinen, Blutfaktoren, Enzymen, viralen Antigenen,
SMC, Wachstumshormonen und anderen Hormonen und anderen
Polypeptiden tierischen oder menschlichen Ursprungs
besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Expressions-Kontrollsequenz aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus dem lac-System, dem trp-System,
dem tac-System, dem trc-System, den Hauptoperator- und
Promotorabschnitten des Phagen λ, dem Kontrollbereich
des fd-Hüllproteins, den frühen und späten Promotoren
von SV40, den von Polyoma, Adenovirus und Affenvirus
(simian virus) abgeleiteten Promotoren und den
Hefepromotoren der glykolytischen Enzyme, der α-
Paarungsfaktoren und der Sauren Phosphatase besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Wirt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den
Stämmen von E. coli, Pseudomonas, Bacillus,
Streptomyces, Hefen, anderen Pilzen und tierischen und
pflanzlichen Zellen besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA-Sequenz ein eine wachstumsanregende oder
-vermittelnde Aktivität von SMC zeigendes Polypeptid
codiert und ausgewählt ist aus den DNA-Insertionen von
pLc24muSMC 1 und pLc24muSMC 3 bis pLc24muSMC 10, wie sie
in Tabelle I und Fig. 3 angegeben sind.
7. Eine ein gewünschtes Polypeptid codierende DNA-Sequenz,
die durch ein Verfahren hergestellt ist, das die
folgenden Schritte umfaßt:
- Ersetzen einer einen Teil des N-terminalen Endes des
leicht testbaren Polypeptids codierenden DNA-Sequenz
durch eine degenerierte Serie von DNA-Sequenzen, die
einen Teil des N-terminalen Endes des gewünschten
Polypeptids codieren, wobei der Ersatz diese
Testbarkeit nicht wesentlich beeinflußt;
- Exprimieren der resultierenden Serie der hybriden, mit
einer Expressions-Kontrollsequenz im Wirt funktionell
verknüpften DNA-Sequenzen;
- Auswählen der besonderen Hybrid-DNA-Sequenzen, die die
optimale Produktion des testbaren Polypeptids
ermöglichen; und
- Ersetzen eines Teils einer das N-terminale Ende des
gewünschten Polypeptids codierenden DNA-Sequenz durch
jene ausgewählte DNA-Sequenzen, die den N-terminalen
Teil dieses gewünschten Polypeptids codieren.
8. DNA-Sequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
sie ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus Interferonen, Interleukinen und
anderen Lymphokinen, Blutfaktoren, Enzymen, viralen
Antigenen, SMC, Wachstumshormonen und anderen Hormonen
und anderen Polypeptiden tierischen oder menschlichen
Ursprungs besteht.
9. DNA-Sequenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
sie ein eine wachstumsanregende oder -vermittelnde
Aktivität zeigendes Polypeptid codiert und ausgewählt
ist aus den DNA-Insertionen von pLc24muSMC 1 und
pLc24muSMC 3 bis pLc24muSMC 10, wie sie in Tabelle I
und Fig. 3 angegeben sind.
10. Rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch eine
DNA-Sequenz nach Anspruch 7.
11. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 10, wobei die
DNA-Sequenz funktionell mit einer Expresssions-
Kontrollsequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül
verknüpft ist.
12. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 11, wobei die
Expressions-Kontrollsequenz aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus dem lac-System, dem trp-System, dem tac-
System, dem trc-System, den Hauptoperator- und
Promotorbereichen des Phagen λ, dem Kontrollbereich des
fd-Hüllproteins, den frühen und späten Promotoren von
SV40, den von Polyoma, Adenovirus und Affenvirus (simian
virus)abgeleiteten Promotoren und den Promotoren der
glykolytischen Enzyme, α-Paarungsfaktoren und der Sauren
Phosphatase von Hefe besteht.
13. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 12, das aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus pLc24muSMC 1 und
pLc24muSMC 3 bis IPc24muSMC 10, wie sie in Tabelle I und
Fig. 3 angegeben sind, besteht.
14. Ein mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül nach
Anspruch 10 transformierter Wirt.
15. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids,
gekennzeichnet durch den Schritt des Züchtens eines
durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 10
transformierten Wirtes.
16. Verfahren zur Herstellung eines eine wachstumsanregende
oder -vermittelnde Aktivität von SMC zeigenden
Polypeptids, gekennzeichnet durch den Schritt des
Züchtens eines mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach
Anspruch 13 transformierten Wirtes.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß
der Wirt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den
Stämmen von E. coli, Pseudomonas, Bacillus,
Streptomyces, Hefen, anderen Pilzen und tierischen und
pflanzlichen Zellen besteht.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß
der transformierte Wirt E. coli HB101 (pc1857)
(pLc24muSMC 8) DSM 3277 ist.
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