JPH0691832B2 - ポリペプチドの産生を向上する方法 - Google Patents
ポリペプチドの産生を向上する方法Info
- Publication number
- JPH0691832B2 JPH0691832B2 JP61501992A JP50199286A JPH0691832B2 JP H0691832 B2 JPH0691832 B2 JP H0691832B2 JP 61501992 A JP61501992 A JP 61501992A JP 50199286 A JP50199286 A JP 50199286A JP H0691832 B2 JPH0691832 B2 JP H0691832B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- smc
- dna
- polypeptide
- expression
- dna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 68
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102100021242 Dymeclin Human genes 0.000 claims description 92
- 101000817629 Homo sapiens Dymeclin Proteins 0.000 claims description 92
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 2
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 2
- -1 blood factors Proteins 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 8
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 abstract description 4
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 6
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 6
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000633434 Arabidopsis thaliana Structural maintenance of chromosomes protein 1 Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102100025354 Macrophage mannose receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100021079 Ornithine decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102100029540 Structural maintenance of chromosomes protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710117946 Structural maintenance of chromosomes protein 2 Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 101150054342 ner gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 101150023453 smc gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、任意所望の蛋白もしくはポリペプチドを産生
するのに最適なDNA配列をこれらにより形質転換された
宿主にて産生するポリペプチドの産生を向上させる方法
に関するものである。
するのに最適なDNA配列をこれらにより形質転換された
宿主にて産生するポリペプチドの産生を向上させる方法
に関するものである。
ソマトメジンC(「SMC」)はインシュリン様の成長因
子であって、下垂体から成長ホルモンを分泌した後に組
織成長を指令する重要な蛋白であると思われる。
子であって、下垂体から成長ホルモンを分泌した後に組
織成長を指令する重要な蛋白であると思われる。
ヒトSMCのアミノ酸配列はE.リンダークネヒトおよびR.
E.ハンブルにより報告された〔ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第253巻、第2769−2776頁(197
8)〕。これは、3個のジスルフィド結合によって架橋
された70個のアミノ酸よりなる一本鎖ポリペプチドで構
成される。計算分子量は7649である。このSMCはプロイ
ンシュリンに対し著しい類似性を示す。たとえば、SMC
アミノ酸1〜29はインシュリンB鎖に対し同族であり、
かつSMCアミノ酸42〜62はインシュリンA鎖に同族であ
る。しかしながら、SMCにおける接続連鎖はプロインシ
ュリンのCペプチドに対する類似性を示さず、またSMC
はプロインシュリンには見られないC−末端オクタペプ
チドを有する。
E.ハンブルにより報告された〔ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第253巻、第2769−2776頁(197
8)〕。これは、3個のジスルフィド結合によって架橋
された70個のアミノ酸よりなる一本鎖ポリペプチドで構
成される。計算分子量は7649である。このSMCはプロイ
ンシュリンに対し著しい類似性を示す。たとえば、SMC
アミノ酸1〜29はインシュリンB鎖に対し同族であり、
かつSMCアミノ酸42〜62はインシュリンA鎖に同族であ
る。しかしながら、SMCにおける接続連鎖はプロインシ
ュリンのCペプチドに対する類似性を示さず、またSMC
はプロインシュリンには見られないC−末端オクタペプ
チドを有する。
SMCはインビトロにおいて多くの成長促進作用を示し、
たとえばDNA,RNA,蛋白およびプロテオグリカンの合成を
刺戟する作用を示す〔E.リンダークネヒトおよびR.E.ハ
ンブル、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンスUSA、第73巻、第2365−2369頁(1976)〕;B.
モレルおよびE.R.フロエシュ、ヨーロピアン・ジャーナ
ル・クリニカル・インベスティゲーション、第3巻、第
119−123頁(1973);E.R.フロエシュ等、Adv.Mental.Di
sord、第8巻、第211−235頁(1975);A.E.チングおよ
びE.R.フロエシュ、ダイアベトロジア、第9巻、第472
−476頁(1973);E.R.フロエシュ等、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・サイエンスUSA、第73巻、
第2904−2908頁(1976)〕。さらに、これはオルニチン
デカルボキシラーゼおよび細胞増殖をも刺戟する〔B.モ
レルおよびE.R.フロエシュ、上記;G.K.ハーゼルバッハ
ーおよびR.E.ハンブル、ジャーナル・セルラー・フィジ
オロジー、第88巻、第239−246頁(1976)〕。インビボ
において、SMCは下垂体切除により成長ホルモンを欠如
させたラットにおける成長を刺戟する〔E.シェンル等、
ネーチャー、第296巻、第252−253頁(1982)〕。
たとえばDNA,RNA,蛋白およびプロテオグリカンの合成を
刺戟する作用を示す〔E.リンダークネヒトおよびR.E.ハ
ンブル、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンスUSA、第73巻、第2365−2369頁(1976)〕;B.
モレルおよびE.R.フロエシュ、ヨーロピアン・ジャーナ
ル・クリニカル・インベスティゲーション、第3巻、第
119−123頁(1973);E.R.フロエシュ等、Adv.Mental.Di
sord、第8巻、第211−235頁(1975);A.E.チングおよ
びE.R.フロエシュ、ダイアベトロジア、第9巻、第472
−476頁(1973);E.R.フロエシュ等、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・サイエンスUSA、第73巻、
第2904−2908頁(1976)〕。さらに、これはオルニチン
デカルボキシラーゼおよび細胞増殖をも刺戟する〔B.モ
レルおよびE.R.フロエシュ、上記;G.K.ハーゼルバッハ
ーおよびR.E.ハンブル、ジャーナル・セルラー・フィジ
オロジー、第88巻、第239−246頁(1976)〕。インビボ
において、SMCは下垂体切除により成長ホルモンを欠如
させたラットにおける成長を刺戟する〔E.シェンル等、
ネーチャー、第296巻、第252−253頁(1982)〕。
成長ホルモンと同様に、SMCは或る程度動物種類に特異
性である。しかしながら、或る種の動物からのSMCは、
進化論的尺度において低位の他の動物種類でも生物学上
活性である。たとえば、ヒトSMCは牛,豚およびニワト
リにおける成長促進に有用であると思われる。実験動物
において、SMCは天然ヒト成長ホルモンと同様な成長刺
戟作用を示した。しかしながら、SMCは成長反応の中枢
媒体であるためヒト成長ホルモンよりも有利であると思
われる。したがって、成長ホルモンよりも一層直接的な
成長調節剤となる。
性である。しかしながら、或る種の動物からのSMCは、
進化論的尺度において低位の他の動物種類でも生物学上
活性である。たとえば、ヒトSMCは牛,豚およびニワト
リにおける成長促進に有用であると思われる。実験動物
において、SMCは天然ヒト成長ホルモンと同様な成長刺
戟作用を示した。しかしながら、SMCは成長反応の中枢
媒体であるためヒト成長ホルモンよりも有利であると思
われる。したがって、成長ホルモンよりも一層直接的な
成長調節剤となる。
たとえば、矮小発育症および筋肉アトロピーなどの或る
種の成長障害を処置するSMCの用途の他に、SMCはさらに
たとえば外傷および折骨の治癒に関連するような特定領
域における組織成長を刺戟するにも有用である。
種の成長障害を処置するSMCの用途の他に、SMCはさらに
たとえば外傷および折骨の治癒に関連するような特定領
域における組織成長を刺戟するにも有用である。
しかしながらSMCは、ヒト血液からの精製により極く微
量しか入手し得ないため、組織成長刺戟剤としてその臨
床的能力を果していない。したがって、産業上および臨
床上有用な量のSMCにおけるこの欠乏を解消するため、
他の方法が要求される。
量しか入手し得ないため、組織成長刺戟剤としてその臨
床的能力を果していない。したがって、産業上および臨
床上有用な量のSMCにおけるこの欠乏を解消するため、
他の方法が要求される。
この種の1つの方策は、SMCをコードするDNA配列で形質
転換された宿主においてSMCを産生させるための組換DNA
技術の使用である。しかしながら、この方策は多量のSM
Cを製造するには有用でないことが判明している。何故
なら、各種のイー・コリ宿主におけるSMCの発現収率が
極めて低く、経済上または産業上有用な量のSMCを提供
し得ないからである。
転換された宿主においてSMCを産生させるための組換DNA
技術の使用である。しかしながら、この方策は多量のSM
Cを製造するには有用でないことが判明している。何故
なら、各種のイー・コリ宿主におけるSMCの発現収率が
極めて低く、経済上または産業上有用な量のSMCを提供
し得ないからである。
本発明は、SMC或いはその他任意所望の真核もしくは原
核蛋白もしくはポリペプチドを産生するのに最適なDNA
配列を、これらDNA配列により形質転換された宿主にお
いて産生を行なうために同定する方法を提供することに
より上記問題を解決する。この方法により選択される改
変DNA配列はこれら蛋白、特に本発明の好適実施例にお
いてはSMCの発現をコードし、かつこれらを各種の宿主
において効率的に高レベルで産生することを可能にす
る。したがって、本発明によれば、臨床上有用な量でSM
Cの成長刺戟性および媒介活性を示すポリペプチドを初
めて得ることが可能になる。
核蛋白もしくはポリペプチドを産生するのに最適なDNA
配列を、これらDNA配列により形質転換された宿主にお
いて産生を行なうために同定する方法を提供することに
より上記問題を解決する。この方法により選択される改
変DNA配列はこれら蛋白、特に本発明の好適実施例にお
いてはSMCの発現をコードし、かつこれらを各種の宿主
において効率的に高レベルで産生することを可能にす
る。したがって、本発明によれば、臨床上有用な量でSM
Cの成長刺戟性および媒介活性を示すポリペプチドを初
めて得ることが可能になる。
以下の開示から明らかとなるように、本発明の好適具体
例において、本発明の新規なDNA配列および組換DNA分子
は適当な宿主において多量のSMCおよびSMC様ポリペプチ
ドの産生を指令することができる。かくして、これらの
ポリペプチドはヒト並びに牛,豚およびニワトリにおけ
る広範な種類の成長刺戟および媒介活性において有用と
なる。
例において、本発明の新規なDNA配列および組換DNA分子
は適当な宿主において多量のSMCおよびSMC様ポリペプチ
ドの産生を指令することができる。かくして、これらの
ポリペプチドはヒト並びに牛,豚およびニワトリにおけ
る広範な種類の成長刺戟および媒介活性において有用と
なる。
したがって、本発明の基本的一面は、SMC或いはその他
任意所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチド
を産生するのに最適なDNA配列の同定方法を設計するこ
とにあることが了解されよう。本発明の第二の基本的面
はこれら蛋白、特にSMCおよびSMC様ポリペプチドを向上
した収率で産生しうる各種の新規なDNA配列、組換DNA分
子および宿主に関するものである。
任意所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチド
を産生するのに最適なDNA配列の同定方法を設計するこ
とにあることが了解されよう。本発明の第二の基本的面
はこれら蛋白、特にSMCおよびSMC様ポリペプチドを向上
した収率で産生しうる各種の新規なDNA配列、組換DNA分
子および宿主に関するものである。
要約して、所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペ
プチドをコード化するDNA配列により形質転換された宿
主において、これら所望の蛋白もしくはポリペプチドの
産生を向上させる本発明の方法は、前記DNA配列が容易
に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドのN−末端部分
をコード化するDNA配列を、所望の真核もしくは原核蛋
白もしくはポリペプチドのN−末端部分をコード化する
DNA配列の縮重シリーズで置換し;得られたシリーズの
所望発現制御配列に作用結合したハイブリッドDNA配列
を適当な宿主で発現させ;容易に分析しうる蛋白もしく
はポリペプチドの最適な産生を可能にする特定ハイブリ
ッドDNA配列を選択し;かつ所望のポリペプチドもしく
は蛋白のN−末端部分をコードするこれら選択されたハ
イブリッドDNA配列を所望ポリペプチドもしくは蛋白の
発現において使用する諸工程からなっている。有利に
は、この方法は、所望の蛋白もしくはポリペプチドの最
適産生を可能にする。
プチドをコード化するDNA配列により形質転換された宿
主において、これら所望の蛋白もしくはポリペプチドの
産生を向上させる本発明の方法は、前記DNA配列が容易
に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドのN−末端部分
をコード化するDNA配列を、所望の真核もしくは原核蛋
白もしくはポリペプチドのN−末端部分をコード化する
DNA配列の縮重シリーズで置換し;得られたシリーズの
所望発現制御配列に作用結合したハイブリッドDNA配列
を適当な宿主で発現させ;容易に分析しうる蛋白もしく
はポリペプチドの最適な産生を可能にする特定ハイブリ
ッドDNA配列を選択し;かつ所望のポリペプチドもしく
は蛋白のN−末端部分をコードするこれら選択されたハ
イブリッドDNA配列を所望ポリペプチドもしくは蛋白の
発現において使用する諸工程からなっている。有利に
は、この方法は、所望の蛋白もしくはポリペプチドの最
適産生を可能にする。
図面の簡単な説明 第1図は概要においてf−Met−SMCをコードする合成DN
A配列並びにmuおよびPLプロモータから誘導される配列
の下流に前記DNA配列を有するプラスミドpLc24muSMCori
の一つの製造方法を示し、 第2図はf−Met−SMCをコードする合成DNA配列を製造
するための本発明による方法の1実施例に使用する2種
の断片〔SMC A(断片A)およびSMC B(断片B)〕の合
成ヌクレオチド配列(両者ともストランド)を示し、さ
らにこの第2図はこれら断片を製造するために使用する
断片SMC AおよびSMC B並びに各種のオリゴヌクレオチド
配列1−11,X,YおよびZのアミノ酸配列をも示し、 第3図は概要においてプラスミドpUCmuSMC Aori,pUCmuS
MC A1−18およびpLc24muSMC1−18の1製造方法を示し、
第3図の中央に図示された512倍縮退した合成リンカの
配列において「N」は4種の全ての塩基の可能性を示
し、「P」はプリンを示しかつ「Y」はピリミジンを示
す。
A配列並びにmuおよびPLプロモータから誘導される配列
の下流に前記DNA配列を有するプラスミドpLc24muSMCori
の一つの製造方法を示し、 第2図はf−Met−SMCをコードする合成DNA配列を製造
するための本発明による方法の1実施例に使用する2種
の断片〔SMC A(断片A)およびSMC B(断片B)〕の合
成ヌクレオチド配列(両者ともストランド)を示し、さ
らにこの第2図はこれら断片を製造するために使用する
断片SMC AおよびSMC B並びに各種のオリゴヌクレオチド
配列1−11,X,YおよびZのアミノ酸配列をも示し、 第3図は概要においてプラスミドpUCmuSMC Aori,pUCmuS
MC A1−18およびpLc24muSMC1−18の1製造方法を示し、
第3図の中央に図示された512倍縮退した合成リンカの
配列において「N」は4種の全ての塩基の可能性を示
し、「P」はプリンを示しかつ「Y」はピリミジンを示
す。
ここに記載する本発明を充分理解しうるよう、以下詳細
に説明する。
に説明する。
説明において次の用語を使用する: ヌクレオチド:糖成分(ペントース)と燐酸と含窒素複
素環塩基とよりなるDNAもしくはRNAの単量体単位であ
る。塩基はグリコシド炭素(ペントースの1′炭素)を
介して糖成分に結合される。塩基と糖とのこの組合せを
ヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特徴
とする。4種のDNA塩基はアデニン(「A」),グアニ
ン(「G」),シトシン(「C」)およびチミン
(「T」)である。4種のRNA塩基はA,G,Cおよびウラシ
ル(「U」)である。
素環塩基とよりなるDNAもしくはRNAの単量体単位であ
る。塩基はグリコシド炭素(ペントースの1′炭素)を
介して糖成分に結合される。塩基と糖とのこの組合せを
ヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特徴
とする。4種のDNA塩基はアデニン(「A」),グアニ
ン(「G」),シトシン(「C」)およびチミン
(「T」)である。4種のRNA塩基はA,G,Cおよびウラシ
ル(「U」)である。
DNA配列:隣接するペントースの3′炭素と5′炭素と
の間でホスホジエステル結合により互いに連結されたヌ
クレオチドの線状列である。
の間でホスホジエステル結合により互いに連結されたヌ
クレオチドの線状列である。
コドン:3個のヌクレオチド(トリプレット)のDNA配列
であって、mRNAを介しアミノ酸、翻訳開始信号または翻
訳停止信号をコードする。
であって、mRNAを介しアミノ酸、翻訳開始信号または翻
訳停止信号をコードする。
遺伝子:雛型またはメッセンジャーRNA(「mRNA」)を
介し、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコ
ードするDNA配列である。
介し、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコ
ードするDNA配列である。
転写:遺伝子からmRNAを生成する過程。
翻訳:mRNAからポリペプチドを生成する過程。
発現:ポリペプチドを産生するためにDNA配列もしくは
遺伝子により行われる過程。これは転写と翻訳との組合
せである。
遺伝子により行われる過程。これは転写と翻訳との組合
せである。
プラスミド:プラスミドが宿主細胞で複製されるような
完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配列で
ある。プラスミドが単細胞生物内に挿入されると、この
生物の特性がこのプラスミドのDNAの結果として変化し
或いは形質転換しうる。たとえばテトラサイクリン耐性
(TetR)に関する遺伝子を有するプラスミドは、テトラ
サイクリンに対し感受性であった細胞をテトラサイクリ
ンに対し耐性である細胞に形質転換する。プラスミドに
より形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配列で
ある。プラスミドが単細胞生物内に挿入されると、この
生物の特性がこのプラスミドのDNAの結果として変化し
或いは形質転換しうる。たとえばテトラサイクリン耐性
(TetR)に関する遺伝子を有するプラスミドは、テトラ
サイクリンに対し感受性であった細胞をテトラサイクリ
ンに対し耐性である細胞に形質転換する。プラスミドに
より形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
ファージもしくはバクテリオファージ:その多くが蛋白
エンベロプもしくはコート蛋白(「カプシド」)にカプ
セル化されたDNA配列よりなる細菌性ウイルスである。
エンベロプもしくはコート蛋白(「カプシド」)にカプ
セル化されたDNA配列よりなる細菌性ウイルスである。
クローン化ベヒクル:宿主細胞で複製しうるプラスミ
ド,ファージDNAもしくはその他のDNA配列であって、こ
の種のDNA配列がDNAの本質的な生物学機能,たとえは複
製、コート蛋白の産生などの損失を伴なわずに或いはプ
ロモータもしくは結合部位の損失を伴なわずに決定可能
に切断されうる1個もしくは少数のエンドヌクレアーゼ
認識部位を特徴とし、さらに形質転換細胞の同定に使用
するのに適した標識、たとえばテトラサイクリン耐性も
しくはアンピシリン耐性を有する。クローン化ベヒクル
はしばしばベクターと呼ばれる。
ド,ファージDNAもしくはその他のDNA配列であって、こ
の種のDNA配列がDNAの本質的な生物学機能,たとえは複
製、コート蛋白の産生などの損失を伴なわずに或いはプ
ロモータもしくは結合部位の損失を伴なわずに決定可能
に切断されうる1個もしくは少数のエンドヌクレアーゼ
認識部位を特徴とし、さらに形質転換細胞の同定に使用
するのに適した標識、たとえばテトラサイクリン耐性も
しくはアンピシリン耐性を有する。クローン化ベヒクル
はしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化:無性繁殖により1種の生物もしくはDNA配
列から誘導される、これら生物もしくはDNA配列の集団
を得る過程である。
列から誘導される、これら生物もしくはDNA配列の集団
を得る過程である。
組換DNA分子、すなわちハイブリッドDNA:互いに末端結
合されかつ或る種の宿主細胞に感染してそこに維持され
る能力を有する種々異なるゲノムからのDNA断片よりな
る分子である。
合されかつ或る種の宿主細胞に感染してそこに維持され
る能力を有する種々異なるゲノムからのDNA断片よりな
る分子である。
発現制御配列:遺伝子の発現を、これら遺伝子に作用結
合された際に制御しかつ調整するヌクレオチドの配列で
ある。これらはlac系,trp系,tac系,trc系,ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域,fdコート蛋白
の制御領域,SV40の早期および後期プロモータ,ポリオ
ーマ,アデノウイルスおよび猿ウイルスから誘導される
プロモータ,3−ホスホグリセレートキナーゼまたはその
他の糖分解酵素のプロモータ,酵母酸ホスファターゼの
プロモータ、たとえばPho5,酵母α−接合因子のプロモ
ータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウイルス
の遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配
列、或いはその組合せを包含する。
合された際に制御しかつ調整するヌクレオチドの配列で
ある。これらはlac系,trp系,tac系,trc系,ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域,fdコート蛋白
の制御領域,SV40の早期および後期プロモータ,ポリオ
ーマ,アデノウイルスおよび猿ウイルスから誘導される
プロモータ,3−ホスホグリセレートキナーゼまたはその
他の糖分解酵素のプロモータ,酵母酸ホスファターゼの
プロモータ、たとえばPho5,酵母α−接合因子のプロモ
ータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウイルス
の遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配
列、或いはその組合せを包含する。
SMC:ソマトメジンC。
SMC様ポリペプチド:SMCの成長刺戟もしくは媒体活性を
示すポリペプチドである。たとえばSMC様ポリペプチド
は成熟SMCの第1グリシンに融合したN−末端メチオニ
ンまたはその他のペプチドを含むことができる。さら
に、これはアミノ酸位置59にメチオニンの代りにスレオ
ニンを含むこともできる。さらに、SMC様ポリペプチド
は、成熟SMCのアミノ酸配列に対しその他各種の置換,
付加または欠失を含むこともできる。
示すポリペプチドである。たとえばSMC様ポリペプチド
は成熟SMCの第1グリシンに融合したN−末端メチオニ
ンまたはその他のペプチドを含むことができる。さら
に、これはアミノ酸位置59にメチオニンの代りにスレオ
ニンを含むこともできる。さらに、SMC様ポリペプチド
は、成熟SMCのアミノ酸配列に対しその他各種の置換,
付加または欠失を含むこともできる。
本発明は幾つかの局面を有する。第1に、本発明は任意
の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの発現を
コードするDNA配列で形質転換された宿主細胞におい
て、これら蛋白もしくはポリペプチドを産生される改良
方法に関する。さらに本発明は、これらDNA配列により
形質転換された宿主細胞において任意の真核もしくは原
核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にするDN
A配列の選択方法にも関する。さらに本発明は、前記方
法により選択されるDNA配列およびこれらによりコード
される蛋白およびポリペプチドの産生におけるその使用
に関する。最後に1つの好適例において、本発明はSMC
様ポリペプチドをコードするDNA配列、並びにこれらDNA
配列を選択しかつこれらにより形質転換された宿主にて
SMCの産生を最適化する際に使用する方法に関するもの
である。
の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの発現を
コードするDNA配列で形質転換された宿主細胞におい
て、これら蛋白もしくはポリペプチドを産生される改良
方法に関する。さらに本発明は、これらDNA配列により
形質転換された宿主細胞において任意の真核もしくは原
核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にするDN
A配列の選択方法にも関する。さらに本発明は、前記方
法により選択されるDNA配列およびこれらによりコード
される蛋白およびポリペプチドの産生におけるその使用
に関する。最後に1つの好適例において、本発明はSMC
様ポリペプチドをコードするDNA配列、並びにこれらDNA
配列を選択しかつこれらにより形質転換された宿主にて
SMCの産生を最適化する際に使用する方法に関するもの
である。
本発明のハイブリッドDNA配列および所望の真核もしく
は原核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にす
る選択DNA配列の両者を発現させる際、広範な種類の宿
主/発現ベクター組合せを用いることができる。たとえ
ば、有用な発現ベクターは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、たとえばSV40の各種公知の誘導体およ
び公知の細菌性プラスミド、たとえばColE1,pCR1,pBR32
2,pMB9およびその誘導体を含むイー・コリからのプラス
ミド、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP4,ファ
ージDNA,たとえばファージλの多数の誘導体、たとえば
NM989およびその他のDNAファージ、たとえばM13並びに
フィラメント状一本鎖DNAファージ、酵母に有用なベク
ター、たとえば2μプラスミド,真核細胞および動物細
胞に有用なベクター、たとえばSV40から誘導されたDNA
配列を含むもの、並びにプラスミドとファージDNAとの
組合せから誘導されるベクター、たとえばファージDNA
もしくはその他の誘導体を使用すべく改変されたプラス
ミドで構成することができる。
は原核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にす
る選択DNA配列の両者を発現させる際、広範な種類の宿
主/発現ベクター組合せを用いることができる。たとえ
ば、有用な発現ベクターは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、たとえばSV40の各種公知の誘導体およ
び公知の細菌性プラスミド、たとえばColE1,pCR1,pBR32
2,pMB9およびその誘導体を含むイー・コリからのプラス
ミド、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP4,ファ
ージDNA,たとえばファージλの多数の誘導体、たとえば
NM989およびその他のDNAファージ、たとえばM13並びに
フィラメント状一本鎖DNAファージ、酵母に有用なベク
ター、たとえば2μプラスミド,真核細胞および動物細
胞に有用なベクター、たとえばSV40から誘導されたDNA
配列を含むもの、並びにプラスミドとファージDNAとの
組合せから誘導されるベクター、たとえばファージDNA
もしくはその他の誘導体を使用すべく改変されたプラス
ミドで構成することができる。
この種の有用な発現ベクターには、真核宿主(たとえば
動物およびヒト細胞)においてクローン化DNA配列の発
現を可能にするベクター〔たとえばP.J.サンザーンおよ
びP.ベルク、ジャーナル・モレキュラー・アプライド・
ジェネティックス、第1巻、第327−341頁(1982);S.
サブラマニ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、
第1巻、第854−864頁(1981);R.J.カウフマンおよび
P.A.シャープ、「モジュール・ジヒドロホレート・レダ
クターゼ相補性DNA遺伝子を組込んだ配列の増殖および
発現」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
2(11)巻、第1304−1319頁(1982);R.J.カウフマン
およびP.A.シャープ、モレキュラ・セルラー・バイオロ
ジー、第159巻、第601−664頁(1982);S.I.スカヒル
等、「支那ハムスター卵細胞におけるヒト免疫インタフ
ェロンDNA遺伝子の産生物の発現および特性化」、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンスUS
A、第80巻、第4654−4659頁(1983);G.ウルラウブおよ
びL.A.ケーシン、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンスUSA、第77巻、第4216−4220頁(198
0)〕がある。
動物およびヒト細胞)においてクローン化DNA配列の発
現を可能にするベクター〔たとえばP.J.サンザーンおよ
びP.ベルク、ジャーナル・モレキュラー・アプライド・
ジェネティックス、第1巻、第327−341頁(1982);S.
サブラマニ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、
第1巻、第854−864頁(1981);R.J.カウフマンおよび
P.A.シャープ、「モジュール・ジヒドロホレート・レダ
クターゼ相補性DNA遺伝子を組込んだ配列の増殖および
発現」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
2(11)巻、第1304−1319頁(1982);R.J.カウフマン
およびP.A.シャープ、モレキュラ・セルラー・バイオロ
ジー、第159巻、第601−664頁(1982);S.I.スカヒル
等、「支那ハムスター卵細胞におけるヒト免疫インタフ
ェロンDNA遺伝子の産生物の発現および特性化」、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンスUS
A、第80巻、第4654−4659頁(1983);G.ウルラウブおよ
びL.A.ケーシン、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンスUSA、第77巻、第4216−4220頁(198
0)〕がある。
さらに、この種の発現ベクターは、特定のDNA配列に作
用結合されてクローン化DNA配列の発現を制御しかつ調
整する少なくとも一種の発現制御配列を特徴とする。有
用な発現制御配列の例はlac系,trp系,tac系,trc系,
ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域,fdコ
ート蛋白の制御領域,酵母の糖分解プロモータ、たとえ
ば3−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ,酵母
酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばPho5,酵母α
−接合因子のプロモータ、並びにポリオーマ,アデノウ
イルスおよび猿ウイルスから誘導されるプロモータ、た
とえばSV40の早期および後期プロモータ、並びに原核も
しくは真核細胞の遺伝子およびそれらのウイルスの発現
を制御することが知られたその他の配列、或いはその組
合せである。
用結合されてクローン化DNA配列の発現を制御しかつ調
整する少なくとも一種の発現制御配列を特徴とする。有
用な発現制御配列の例はlac系,trp系,tac系,trc系,
ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域,fdコ
ート蛋白の制御領域,酵母の糖分解プロモータ、たとえ
ば3−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ,酵母
酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばPho5,酵母α
−接合因子のプロモータ、並びにポリオーマ,アデノウ
イルスおよび猿ウイルスから誘導されるプロモータ、た
とえばSV40の早期および後期プロモータ、並びに原核も
しくは真核細胞の遺伝子およびそれらのウイルスの発現
を制御することが知られたその他の配列、或いはその組
合せである。
有用な発現宿主は周知の真核および原核宿主、たとえば
イー・コリHB101,イー・コリX1776,イー・コリX2282,イ
ー・コリDHI(λ)およびイー・コリMRC1のようなイー
・コリ,シュードモナス,バチルス(たとえばバチルス
・ズブチリス),ストレプトミセス,酵母およびその他
の真菌類の菌株,動物細胞たとえばCOS細胞およびCHO細
胞、並びに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞を
包含する。
イー・コリHB101,イー・コリX1776,イー・コリX2282,イ
ー・コリDHI(λ)およびイー・コリMRC1のようなイー
・コリ,シュードモナス,バチルス(たとえばバチルス
・ズブチリス),ストレプトミセス,酵母およびその他
の真菌類の菌株,動物細胞たとえばCOS細胞およびCHO細
胞、並びに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞を
包含する。
勿論、必ずしも全ての宿主/発現ベクター組合せが同等
な効率をもって本発明におけるDNA配列の発現或いは本
発明のポリペプチドの産生に機能するとは限らない。し
かしながら、宿主/発現ベクター組合せの特定の選択
は、以下説明する原理を考慮して、本発明の範囲を逸脱
することなく当業者により行なうことができる。たとえ
ば、この選択は多数の因子のバランスに基づいている。
たとえば、これらは宿主およびベクターの適合性,DNA配
列によりコードされた蛋白の宿主に対する毒性,所望蛋
白の回収容易性,DNA配列の発現特性、並びにこれらに作
用結合された発現制御配列,生物安全性,コストおよび
所望蛋白の重なり,形態或いはその他の任意の必要とす
る発現後の改変を包含する。
な効率をもって本発明におけるDNA配列の発現或いは本
発明のポリペプチドの産生に機能するとは限らない。し
かしながら、宿主/発現ベクター組合せの特定の選択
は、以下説明する原理を考慮して、本発明の範囲を逸脱
することなく当業者により行なうことができる。たとえ
ば、この選択は多数の因子のバランスに基づいている。
たとえば、これらは宿主およびベクターの適合性,DNA配
列によりコードされた蛋白の宿主に対する毒性,所望蛋
白の回収容易性,DNA配列の発現特性、並びにこれらに作
用結合された発現制御配列,生物安全性,コストおよび
所望蛋白の重なり,形態或いはその他の任意の必要とす
る発現後の改変を包含する。
さらに、各特定発現ベクターには、本発明のDNA配列を
挿入するため各種の部位を選択することができる。これ
らの部位は、一般にこれらを切断する制限エンドヌクレ
アーゼにより命名され、当業者に充分認識されている。
勿論、本発明に有用な発現ベクターは、選択DNA断片を
挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必
要がないことを了解すべきである。寧ろ、このベクター
は他の手段によって断片に結合させうる。発現ベクタ
ー、特に選択DNA断片を挿入して、ここで発現制御配列
に作用結合させるための選択部位は各種の因子、たとえ
ば特定制限酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白
の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋
白の感受性、宿主細胞により発現されて精製の際に除去
するのが困難な蛋白の汚染もしくは結合、発現特性、た
とえばベクター配列に対する開始コドンおよび停止コド
ンの位置、並びに当業者に認識されたその他の因子によ
り決定される。DNA配列のためのベクターおよび挿入部
位の選択はこれら因子のバランスによって決定され、必
らずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であると
は限らない。
挿入するため各種の部位を選択することができる。これ
らの部位は、一般にこれらを切断する制限エンドヌクレ
アーゼにより命名され、当業者に充分認識されている。
勿論、本発明に有用な発現ベクターは、選択DNA断片を
挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必
要がないことを了解すべきである。寧ろ、このベクター
は他の手段によって断片に結合させうる。発現ベクタ
ー、特に選択DNA断片を挿入して、ここで発現制御配列
に作用結合させるための選択部位は各種の因子、たとえ
ば特定制限酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白
の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋
白の感受性、宿主細胞により発現されて精製の際に除去
するのが困難な蛋白の汚染もしくは結合、発現特性、た
とえばベクター配列に対する開始コドンおよび停止コド
ンの位置、並びに当業者に認識されたその他の因子によ
り決定される。DNA配列のためのベクターおよび挿入部
位の選択はこれら因子のバランスによって決定され、必
らずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であると
は限らない。
さらに、容易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドを
コードする各種DNA配列も、本発明に使用することがで
きる。たとえば、本発明の好適具体例においてはβ−ガ
ラクトシダーゼを使用する。何故なら、この蛋白の産生
は周知の比色プレート分析を用いて容易に監視しうるか
らである。さらに、たとえばガラクトキナーゼもしくは
薬品耐性の遺伝子、たとえばアンピシリン耐性などを用
いることもできる。
コードする各種DNA配列も、本発明に使用することがで
きる。たとえば、本発明の好適具体例においてはβ−ガ
ラクトシダーゼを使用する。何故なら、この蛋白の産生
は周知の比色プレート分析を用いて容易に監視しうるか
らである。さらに、たとえばガラクトキナーゼもしくは
薬品耐性の遺伝子、たとえばアンピシリン耐性などを用
いることもできる。
最後に、本発明の方法並びにこれにより選択されかつ使
用されるDNA配列は、任意の原核もしくは真核蛋白もし
くはポリペプチドに適用することができる。これらのう
ちには、ヒトおよび動物リンホキン、たとえばインタフ
ェロン,インタロイキンおよびTNF,ヒトおよび動物ホル
モン、たとえば成長ホルモンおよびインシュリン,ヒト
および動物血液ファクタ、たとえばファクタVIIIおよび
tPA,酵素,抗原並びに興味あるその他の蛋白およびポリ
ペプチドがある。ここに説明する1好適具体例において
は、本発明の方法を用いてSMC様ポリペプチドの産生を
最適化させた。
用されるDNA配列は、任意の原核もしくは真核蛋白もし
くはポリペプチドに適用することができる。これらのう
ちには、ヒトおよび動物リンホキン、たとえばインタフ
ェロン,インタロイキンおよびTNF,ヒトおよび動物ホル
モン、たとえば成長ホルモンおよびインシュリン,ヒト
および動物血液ファクタ、たとえばファクタVIIIおよび
tPA,酵素,抗原並びに興味あるその他の蛋白およびポリ
ペプチドがある。ここに説明する1好適具体例において
は、本発明の方法を用いてSMC様ポリペプチドの産生を
最適化させた。
本発明を一層充分に理解しうるよう、以下実施例につき
説明する。これらの実施例は例示の目的であって、決し
て本発明をこれら特定実施例に限定すると解釈すべきで
ないことを了解すべきである。
説明する。これらの実施例は例示の目的であって、決し
て本発明をこれら特定実施例に限定すると解釈すべきで
ないことを了解すべきである。
SMC様ポリペプチドをコードするDNA配列を持った組換DN
A分子の作成 次に第1図を参照すれば、ここには組換DNA分子(pLc24
muSMCori)の製造方法の1具体例が概要として示されて
おり、これはmuから誘導されたDNA配列に融合しかつmu
からのシャイン・ダルガルノ配列を有するヒトf−Met
−SMCをコードするDNA配列を有し、この組合せDNA配列
はバクテリオファージλから誘導されたPLプロモータに
作用結合されていることを特徴とする。
A分子の作成 次に第1図を参照すれば、ここには組換DNA分子(pLc24
muSMCori)の製造方法の1具体例が概要として示されて
おり、これはmuから誘導されたDNA配列に融合しかつmu
からのシャイン・ダルガルノ配列を有するヒトf−Met
−SMCをコードするDNA配列を有し、この組合せDNA配列
はバクテリオファージλから誘導されたPLプロモータに
作用結合されていることを特徴とする。
pLc24muSMCoriを作成するため、先ず報告されているヒ
トSMCのアミノ酸配列〔リンダークネヒトおよびハンブ
ル、上記;D.G.クラッパー等、Endocrinal、第112巻、第
2215−2217頁(1983)〕を用いて14種のオリゴデオキシ
ヌクレオチドを合成した(第1図および第2図の配列1
−11,X,YおよびZ参照)。合成には固相のホスホトリエ
ステル法を用いた〔H.イトー等、ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ、第10巻、第1755−1769頁(1982)〕。粗
製オリゴマを除蛋白した後、これらをセファデックスG
−50でのゲル濾過によって脱塩し、かつ尿素を含有する
変性ポリアクリルアミド調製用スラブゲルでの電気泳動
によって精製した〔T.マニアチス等、バイオケミストリ
ー、第14巻、第3787−3794頁〕(1975)〕。UV分析によ
ってバンドの位置決定を行ない、かつ電気溶出によって
ゲルスライス物からオリゴデオキシヌクレオチドを単離
した。次いで、ゲル精製したオリゴデオキシヌクレオチ
ドをT4ポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化し、か
つ15%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルにて再精製し、
電気溶出でDNAを回収した〔T.マニアチス等、モレキュ
ラ・クローニング、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー(1982)〕。これら14種のオリゴデオキシ
ヌクレオチドは、寸法において13塩基から37塩基まで変
化した。
トSMCのアミノ酸配列〔リンダークネヒトおよびハンブ
ル、上記;D.G.クラッパー等、Endocrinal、第112巻、第
2215−2217頁(1983)〕を用いて14種のオリゴデオキシ
ヌクレオチドを合成した(第1図および第2図の配列1
−11,X,YおよびZ参照)。合成には固相のホスホトリエ
ステル法を用いた〔H.イトー等、ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ、第10巻、第1755−1769頁(1982)〕。粗
製オリゴマを除蛋白した後、これらをセファデックスG
−50でのゲル濾過によって脱塩し、かつ尿素を含有する
変性ポリアクリルアミド調製用スラブゲルでの電気泳動
によって精製した〔T.マニアチス等、バイオケミストリ
ー、第14巻、第3787−3794頁〕(1975)〕。UV分析によ
ってバンドの位置決定を行ない、かつ電気溶出によって
ゲルスライス物からオリゴデオキシヌクレオチドを単離
した。次いで、ゲル精製したオリゴデオキシヌクレオチ
ドをT4ポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化し、か
つ15%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルにて再精製し、
電気溶出でDNAを回収した〔T.マニアチス等、モレキュ
ラ・クローニング、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー(1982)〕。これら14種のオリゴデオキシ
ヌクレオチドは、寸法において13塩基から37塩基まで変
化した。
これらの合成において、イー・コリの高度発現した遺伝
子におけるコドンの使用〔R.グランタム等、ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ、第8巻、第1983−1992頁(19
80)〕およびイー・コリ)tRNA発生〔T.イケムラ、ジャ
ーナル・モレキュラ・バイオロジー、第151巻、第389−
409頁(1981)〕を考慮した。。さらに、各種の便利な
エンドヌクレアーゼ認識部位を、これらオリゴヌクレオ
チド配列に沿った種々の位置に含ませた。
子におけるコドンの使用〔R.グランタム等、ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ、第8巻、第1983−1992頁(19
80)〕およびイー・コリ)tRNA発生〔T.イケムラ、ジャ
ーナル・モレキュラ・バイオロジー、第151巻、第389−
409頁(1981)〕を考慮した。。さらに、各種の便利な
エンドヌクレアーゼ認識部位を、これらオリゴヌクレオ
チド配列に沿った種々の位置に含ませた。
次いで、配列1−4並びにX,YおよびZと配列5−11と
を結合させ、かつこれらをケレノ−ポリメラーゼで延長
化させて2種の複合DNA配列、すなわち断片Aとしての9
8塩基対の平滑末端断片(「SMC A」)および断片Bとし
ての138塩基対の平滑末端断片(「SMC B」)を形成させ
た〔J.R.ロッシ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第257巻、第9226−9229頁(1982)〕(第1
図および第2図参照)。断片AはSMCのN−末端をコー
ドし、かつ断片BはSMCの残部をコードする(第2
図)。
を結合させ、かつこれらをケレノ−ポリメラーゼで延長
化させて2種の複合DNA配列、すなわち断片Aとしての9
8塩基対の平滑末端断片(「SMC A」)および断片Bとし
ての138塩基対の平滑末端断片(「SMC B」)を形成させ
た〔J.R.ロッシ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第257巻、第9226−9229頁(1982)〕(第1
図および第2図参照)。断片AはSMCのN−末端をコー
ドし、かつ断片BはSMCの残部をコードする(第2
図)。
配列1−4,X,YおよびZのそれぞれ200pモルを20μlの
再融合用緩衝液(50mMトリス−HCl(pH7.6)、10mM MgC
l2)中にて95℃まで加熱することにより断片SMC Aを作
成し、次いでこの混合物を4℃まで徐々に冷却した。ジ
チオスレイトールとATPとT4DNAリガーゼとを最終濃度5m
M、7μMおよび20μ/mlまでそれぞれ添加し、次いでこ
の反応混合物を4℃にて10時間培養した。エタノール沈
澱の後、この混合物を8%ポリアクリルアミド/7M尿素
ゲルに加え、かつ77−および78−塩基対のストランドを
溶出させた。次いで、各ストランド25pモルを5μlの
再融合用緩衝液中にて組合せ、反応混合物を95℃まで加
熱し、次いで15℃まで徐々に冷却した。次いで、ジチオ
スレイトールとdNTPとDNAポリメラーゼのクレノー断片
とをそれぞれ5mM、250μMおよび2単位の濃度まで添加
し、次いで混合物を室温にて30分間静置した。上記のよ
うに反応生成物を精製し、かつ7pモルの98塩基対SMC A
を単離した。配列5−11のそれぞれ200pモルを用いてほ
ぼ同様な方法で、20pモルの138塩基対SMC Bを作成し
た。
再融合用緩衝液(50mMトリス−HCl(pH7.6)、10mM MgC
l2)中にて95℃まで加熱することにより断片SMC Aを作
成し、次いでこの混合物を4℃まで徐々に冷却した。ジ
チオスレイトールとATPとT4DNAリガーゼとを最終濃度5m
M、7μMおよび20μ/mlまでそれぞれ添加し、次いでこ
の反応混合物を4℃にて10時間培養した。エタノール沈
澱の後、この混合物を8%ポリアクリルアミド/7M尿素
ゲルに加え、かつ77−および78−塩基対のストランドを
溶出させた。次いで、各ストランド25pモルを5μlの
再融合用緩衝液中にて組合せ、反応混合物を95℃まで加
熱し、次いで15℃まで徐々に冷却した。次いで、ジチオ
スレイトールとdNTPとDNAポリメラーゼのクレノー断片
とをそれぞれ5mM、250μMおよび2単位の濃度まで添加
し、次いで混合物を室温にて30分間静置した。上記のよ
うに反応生成物を精製し、かつ7pモルの98塩基対SMC A
を単離した。配列5−11のそれぞれ200pモルを用いてほ
ぼ同様な方法で、20pモルの138塩基対SMC Bを作成し
た。
次いで、これらの断片のそれぞれを、BamHI(断片Aに
つき)並びにBamHIおよびHindIII(断片Bにつき)で2
μgのRF DNAを制限することにより作成された平滑末端
M13mp8ベクターに挿入し、交差末端を4種のデオキシヌ
クレオシドトリホスフェート(dNTP)の存在下に1単位
のイー・コリDNAポリメラーゼ(クレノー断片)により
修復し、エタノールで沈澱させ、かつ牛腸内ホスファタ
ーゼ(10mMトリス−HCl(pH9.2)および0.2mMEDTAにお
ける20単位)によって30分間にわたり5′−脱燐酸した
〔J.メッシング、メソッズ・イン・エンチモロジー、第
101巻、第20−78頁(1983)〕。結合させるため20ngの
線状化したベクターと0.1pモルのDNA断片とを10μlの
結合用緩衝液および40単位のT4DNAポリメラーゼにおい
て15℃にて24時間用いた(第1図)。
つき)並びにBamHIおよびHindIII(断片Bにつき)で2
μgのRF DNAを制限することにより作成された平滑末端
M13mp8ベクターに挿入し、交差末端を4種のデオキシヌ
クレオシドトリホスフェート(dNTP)の存在下に1単位
のイー・コリDNAポリメラーゼ(クレノー断片)により
修復し、エタノールで沈澱させ、かつ牛腸内ホスファタ
ーゼ(10mMトリス−HCl(pH9.2)および0.2mMEDTAにお
ける20単位)によって30分間にわたり5′−脱燐酸した
〔J.メッシング、メソッズ・イン・エンチモロジー、第
101巻、第20−78頁(1983)〕。結合させるため20ngの
線状化したベクターと0.1pモルのDNA断片とを10μlの
結合用緩衝液および40単位のT4DNAポリメラーゼにおい
て15℃にて24時間用いた(第1図)。
断片Aを平滑末端のM13mp8ベクターに結合させて、SMC
断片の末端にBamHI部位を再生成し、かつさらにNcoI部
位(GGATCCATGG)が生成した組換ファージを得た(mp8S
MC A)(第1図)。断片Bを二重平滑末端M13mp8ベクタ
ーに結合させて、SMC断片の末端にBamHIおよびHindIII
部位を再生成した組換ファージ(mp8SMC B)を得た(第
1図)。
断片の末端にBamHI部位を再生成し、かつさらにNcoI部
位(GGATCCATGG)が生成した組換ファージを得た(mp8S
MC A)(第1図)。断片Bを二重平滑末端M13mp8ベクタ
ーに結合させて、SMC断片の末端にBamHIおよびHindIII
部位を再生成した組換ファージ(mp8SMC B)を得た(第
1図)。
次いで、これら組換ファージのそれぞれによりイー・コ
リJM101〔J.メッシングおよびJ.ビエイラ、ジィーン、
第19巻、第269−276頁(1982)〕を形質転換させ、そし
て形質転換宿主を5−ブロモ−4−クロル−3−インド
リル−β−ガラクトピラノシド(X−GAL)を含有する
L−ブロスプレートに塗抹した。次いで、mp8SMC Aおよ
びmp8SMC Bで形質転換されたイー・コリJM101の24個の
白色プラークからファージDNAを精製し、ジデオキシ−
連鎖末端によりDNAを配列決定した〔A.J.H.スミス、メ
ソッズ・イン・エンチモロジー、第65巻、第560−580頁
(1980)〕。次いで、mp8SMC Aおよびmp8SMC Bから細胞
内RF DNAを作成し、前者をNcoI/BamHIで、後者をBamHI/
HindIIIでそれぞれ切断し、かつゲル電気泳動によってS
MC関連断片を単離した(第1図)。
リJM101〔J.メッシングおよびJ.ビエイラ、ジィーン、
第19巻、第269−276頁(1982)〕を形質転換させ、そし
て形質転換宿主を5−ブロモ−4−クロル−3−インド
リル−β−ガラクトピラノシド(X−GAL)を含有する
L−ブロスプレートに塗抹した。次いで、mp8SMC Aおよ
びmp8SMC Bで形質転換されたイー・コリJM101の24個の
白色プラークからファージDNAを精製し、ジデオキシ−
連鎖末端によりDNAを配列決定した〔A.J.H.スミス、メ
ソッズ・イン・エンチモロジー、第65巻、第560−580頁
(1980)〕。次いで、mp8SMC Aおよびmp8SMC Bから細胞
内RF DNAを作成し、前者をNcoI/BamHIで、後者をBamHI/
HindIIIでそれぞれ切断し、かつゲル電気泳動によってS
MC関連断片を単離した(第1図)。
次いで、2種の断片(SMC AおよびSMC B)をバクテリオ
ファージmu(B.アレット氏の寄贈物)のner遺伝子から
の67塩基対断片と混合した〔G.クレー等、ジィーン、第
32巻、出版中〕。この断片はヌクレオチド1043−96で構
成され〔H.プリース等、モレキュラ・ゼネラル・ジェネ
ティックス、第186巻、第315−321頁(1982)、第4
図〕。その前にはEcoRIエンドヌクレアーゼ制限部位が
存在し、かつ後にはNcoI部位(CCATGG)が存在し、Nco
I部位の内部ATGは翻訳開始コドンを形成する。さら
に、この断片はほぼ最適なリボソーム結合部位をも有す
る。〔J.シャインおよびL.ダルガルノ、ネイチャー、第
254巻、第34−38頁(1975)〕。この結合の結果とし
て、mu遺伝子断片とSMC AとSMC Bとからなる303塩基対
のEcoRI−HindIII断片を単離した(第1図)。結合は、
mu断片のNcoI部位のATG開始コドンが直接融合しかつ正
確な読み枠内でSMC Aに融合されたようなものである
(第1図および第2図)。
ファージmu(B.アレット氏の寄贈物)のner遺伝子から
の67塩基対断片と混合した〔G.クレー等、ジィーン、第
32巻、出版中〕。この断片はヌクレオチド1043−96で構
成され〔H.プリース等、モレキュラ・ゼネラル・ジェネ
ティックス、第186巻、第315−321頁(1982)、第4
図〕。その前にはEcoRIエンドヌクレアーゼ制限部位が
存在し、かつ後にはNcoI部位(CCATGG)が存在し、Nco
I部位の内部ATGは翻訳開始コドンを形成する。さら
に、この断片はほぼ最適なリボソーム結合部位をも有す
る。〔J.シャインおよびL.ダルガルノ、ネイチャー、第
254巻、第34−38頁(1975)〕。この結合の結果とし
て、mu遺伝子断片とSMC AとSMC Bとからなる303塩基対
のEcoRI−HindIII断片を単離した(第1図)。結合は、
mu断片のNcoI部位のATG開始コドンが直接融合しかつ正
確な読み枠内でSMC Aに融合されたようなものである
(第1図および第2図)。
この断片を、予めEcoRIおよびHindIIIで制限されたpLc2
4に導入し〔E.レムート等、ジーン、第15巻、第81−93
頁(1981)〕、プラスミドpLc24muSMCoriを生成させ
た。このプラスミドは、SMC遺伝子とその開始ATGコドン
とをバクテリオファージλのPLプロモータの制御下で有
することを特徴とする(第1図)。
4に導入し〔E.レムート等、ジーン、第15巻、第81−93
頁(1981)〕、プラスミドpLc24muSMCoriを生成させ
た。このプラスミドは、SMC遺伝子とその開始ATGコドン
とをバクテリオファージλのPLプロモータの制御下で有
することを特徴とする(第1図)。
プラスミドpLc24muSMCoriを用いるSMC様ポリペプチドの
発現 pLc24muSMCoriとpcI857、すなわちPLの温度感受性リプ
レッサをコードするpACYC184の誘導体〔E.レムート等、
ジーン、第22巻、第103−113頁(1983)〕を用いてイー
・コリHB101を形質転換させた〔T.マニアチス等、モレ
キュラ・クローニング(コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー)(1982)〕。これら2種のプラスミ
ドは異なる抗生物質耐性遺伝子、すなわちペニシリナー
ゼ(pLc24muSMCori)およびカナマイシン(pcI857)を
有するので、正確に形質転換された培養物は50μg/mlの
アンピシリンおよび40μg/mlのカナマイシンと増殖させ
ることにより選択することができる。
発現 pLc24muSMCoriとpcI857、すなわちPLの温度感受性リプ
レッサをコードするpACYC184の誘導体〔E.レムート等、
ジーン、第22巻、第103−113頁(1983)〕を用いてイー
・コリHB101を形質転換させた〔T.マニアチス等、モレ
キュラ・クローニング(コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー)(1982)〕。これら2種のプラスミ
ドは異なる抗生物質耐性遺伝子、すなわちペニシリナー
ゼ(pLc24muSMCori)およびカナマイシン(pcI857)を
有するので、正確に形質転換された培養物は50μg/mlの
アンピシリンおよび40μg/mlのカナマイシンと増殖させ
ることにより選択することができる。
50μg/mlのアンピシリンと40μg/mlのカナマイシンとを
含有するL−ブロス中に、正確に形質転換されたイー・
コリHB101(pLc24muSMCori)(pcI857)を含有するプレ
ートからの培養物5mlを接種し、この培養物を28℃にて
1晩増殖させた。次いで、2mlの1晩培養物を42℃まで
加温された10mlのL−ブロスに添加し、この培養物を10
0mlの三角フラスコ中で42℃にて2時間にわたり激しく
攪拌した。
含有するL−ブロス中に、正確に形質転換されたイー・
コリHB101(pLc24muSMCori)(pcI857)を含有するプレ
ートからの培養物5mlを接種し、この培養物を28℃にて
1晩増殖させた。次いで、2mlの1晩培養物を42℃まで
加温された10mlのL−ブロスに添加し、この培養物を10
0mlの三角フラスコ中で42℃にて2時間にわたり激しく
攪拌した。
SMC様ポリペプチドの産生につき分析するため、培養物1
ml当りから細胞を遠心分離し(A550=20)、かつこれら
を50μlのSDS−β−メルカプトエタノール溶解緩衝液
〔U.K.レムリ、ネイチャー、第227巻、第680−685頁(1
970)〕において10分間沸とう(100℃)させることによ
り溶解させた。次いで、市販の分析キット(ニコルス・
インスティチュート・ダイアグノスティックス社)を用
いる放射免疫分析により、全てのSMC活性を分析し、そ
の標準については精製IGF−1(R.ハンブルの寄贈物)
を用いて予め証明した。分析用としてゲル電気泳動用と
同様に溶解物を含有するSMCを作成し、これを分析用緩
衝液に少なくとも20倍希釈し、かつ2反復で分析した。
標準溶解条件下で変性させたヒトSMCはこのRIAにおいて
天然ホルモンと同様な反応性を有することが観察され
た。
ml当りから細胞を遠心分離し(A550=20)、かつこれら
を50μlのSDS−β−メルカプトエタノール溶解緩衝液
〔U.K.レムリ、ネイチャー、第227巻、第680−685頁(1
970)〕において10分間沸とう(100℃)させることによ
り溶解させた。次いで、市販の分析キット(ニコルス・
インスティチュート・ダイアグノスティックス社)を用
いる放射免疫分析により、全てのSMC活性を分析し、そ
の標準については精製IGF−1(R.ハンブルの寄贈物)
を用いて予め証明した。分析用としてゲル電気泳動用と
同様に溶解物を含有するSMCを作成し、これを分析用緩
衝液に少なくとも20倍希釈し、かつ2反復で分析した。
標準溶解条件下で変性させたヒトSMCはこのRIAにおいて
天然ホルモンと同様な反応性を有することが観察され
た。
この分析は、温度誘発に際しイー・コリHB101(pLc24mu
SMCori)(pcI857)が極めて少量のSMC活性(RIAにより
1.4μg/ml)を生成したことを示し、この量は蛋白ゲル
におけるクーマシ−青染色によって検出しえない量であ
る。したがって、この形質転換宿主におけるSMC様ポリ
ペプチド産生のレベルは細胞1個当り僅か数100分子で
あると推定された。
SMCori)(pcI857)が極めて少量のSMC活性(RIAにより
1.4μg/ml)を生成したことを示し、この量は蛋白ゲル
におけるクーマシ−青染色によって検出しえない量であ
る。したがって、この形質転換宿主におけるSMC様ポリ
ペプチド産生のレベルは細胞1個当り僅か数100分子で
あると推定された。
SMC様ポリペプチドの産生を向上させる試み pLc24muSMCoriを用いるSMC様ポリペプチド産生のレベル
が極めて低かったので、向上したレベルの発現を有する
他の各種のプラスミドを作成すべく試みた。
が極めて低かったので、向上したレベルの発現を有する
他の各種のプラスミドを作成すべく試みた。
1つの方法において、他の蛋白をコードするDNA配列に
融合されたSMCをコードするDNA配列を備えた発現ベクタ
ーを作成した。この方法において、アミノ末端における
非SMC蛋白とカルボキシ末端におけるSMC様ポリペプチド
とよりなる融合蛋白を作成した。この融合蛋白は前記ベ
クターから高収率で産生されうるが、これらは動物およ
びヒト治療においてf−met−SMCまたはSMC自身程好適
でない。その結果、最も有利な使用には、この融合蛋白
は非−SMC蛋白をこれらから除去する追加処理を必要と
する。この種の方法は公知であるが(たとえば米国特許
第4,425,437号、第4,338,397号および第4,366,246号参
照)、これらは直接的分泌および成熟の場合を除いて所
望のSMC様ポリペプチドの直接的発現ほど好適でない。
融合されたSMCをコードするDNA配列を備えた発現ベクタ
ーを作成した。この方法において、アミノ末端における
非SMC蛋白とカルボキシ末端におけるSMC様ポリペプチド
とよりなる融合蛋白を作成した。この融合蛋白は前記ベ
クターから高収率で産生されうるが、これらは動物およ
びヒト治療においてf−met−SMCまたはSMC自身程好適
でない。その結果、最も有利な使用には、この融合蛋白
は非−SMC蛋白をこれらから除去する追加処理を必要と
する。この種の方法は公知であるが(たとえば米国特許
第4,425,437号、第4,338,397号および第4,366,246号参
照)、これらは直接的分泌および成熟の場合を除いて所
望のSMC様ポリペプチドの直接的発現ほど好適でない。
したがって、SMC様ポリペプチドの産生を向上させる第
2の試みにおいて、牛成長ホルモンおよび豚成長ホルモ
ンの発現レベルを向上させるのに有用であることが証明
されている削除技術を採用した〔たとえば、ヨーロッパ
特許出願第103,395号および第104,920号参照〕。これら
の方法を用いてSMC様ポリペプチドを産生し、アミノ末
端の欠失を特徴とする各種の改変SMCコード配列を作成
した。たとえば、f−Met−△3−SMCおよびf−Met−
△6−SMCを産生する発現ベクターを作成した。これら
改変SMCの産生レベルはベクターpLc24muSMCoriからのf
−Met−SMCの産生レベルより若干高いものであったが、
この発現レベルはまだ極めて低いものである。
2の試みにおいて、牛成長ホルモンおよび豚成長ホルモ
ンの発現レベルを向上させるのに有用であることが証明
されている削除技術を採用した〔たとえば、ヨーロッパ
特許出願第103,395号および第104,920号参照〕。これら
の方法を用いてSMC様ポリペプチドを産生し、アミノ末
端の欠失を特徴とする各種の改変SMCコード配列を作成
した。たとえば、f−Met−△3−SMCおよびf−Met−
△6−SMCを産生する発現ベクターを作成した。これら
改変SMCの産生レベルはベクターpLc24muSMCoriからのf
−Met−SMCの産生レベルより若干高いものであったが、
この発現レベルはまだ極めて低いものである。
最後に、第3の方法としてプロモータとリボソーム結合
部位との各種組合せを用いて、SMCコード配列の発現を
制御した。しかしながら、いずれにせよ、これらの改変
はSMC産生の点でpLc24muSMCoriよりも貧弱であった。
部位との各種組合せを用いて、SMCコード配列の発現を
制御した。しかしながら、いずれにせよ、これらの改変
はSMC産生の点でpLc24muSMCoriよりも貧弱であった。
SMC様ポリペプチドの産生をコード化する最適DNA配列の
選択 上記2種の方法はいずれも成功せず或いは多くの場合SM
C様ポリペプチドの大して好適でない産生をもたらした
ので、任意の蛋白の産生をコードする最適配列、より詳
細にはSMC様ポリペプチドの産生をコードする最適DNA配
列を選択しうるような方法を設計することに決定した。
選択 上記2種の方法はいずれも成功せず或いは多くの場合SM
C様ポリペプチドの大して好適でない産生をもたらした
ので、任意の蛋白の産生をコードする最適配列、より詳
細にはSMC様ポリペプチドの産生をコードする最適DNA配
列を選択しうるような方法を設計することに決定した。
この方法は、遺伝子のN−末端部分をコードするDNA配
列およびこの実施例に記載した特定具体例においては、
f−Met−SMCをコードする遺伝子における暗黙の突然変
異が改良されたRNA二次構造を与え、したがって選択宿
主においてより高レベルの発現をもたらしうるという本
発明の仮説に基づいている。しかしながら、最適コード
配列を選択するには発現に際し存在するどの作用を決定
するかにつき分析せねばならない多くの可能な暗黙突然
変異が存在するため、これら配列に対する迅速かつ簡単
なスクリーニング法を設計する必要がある。このような
方法がなければ、クローンのスクリーニングは全く不可
能でないとしても面倒であり、その方法は失格である。lac Zとの遺伝子融合体を予め使用して、それらの遺伝
子生産物を分析せずに蛋白の産生を監視した(L.グアレ
ンテ等、セル、第20巻、第543−553頁(1980);B.A.カ
ルチルホ等、J.バクテリオロジー、第158巻、第488−49
5頁(1984)〕。さらに、β−ガラクトシダーゼ産生
は、比色プレート分析によって容易に監視することがで
きる。したがって、このスクリーニング法を用いて本発
明による最適DNAコード化配列を選択することに決定し
た。勿論、好適ではないにせよ、他のスクリーニング法
も本発明の最適DNA配列を選択する際に用いうることを
了解すべきである。
列およびこの実施例に記載した特定具体例においては、
f−Met−SMCをコードする遺伝子における暗黙の突然変
異が改良されたRNA二次構造を与え、したがって選択宿
主においてより高レベルの発現をもたらしうるという本
発明の仮説に基づいている。しかしながら、最適コード
配列を選択するには発現に際し存在するどの作用を決定
するかにつき分析せねばならない多くの可能な暗黙突然
変異が存在するため、これら配列に対する迅速かつ簡単
なスクリーニング法を設計する必要がある。このような
方法がなければ、クローンのスクリーニングは全く不可
能でないとしても面倒であり、その方法は失格である。lac Zとの遺伝子融合体を予め使用して、それらの遺伝
子生産物を分析せずに蛋白の産生を監視した(L.グアレ
ンテ等、セル、第20巻、第543−553頁(1980);B.A.カ
ルチルホ等、J.バクテリオロジー、第158巻、第488−49
5頁(1984)〕。さらに、β−ガラクトシダーゼ産生
は、比色プレート分析によって容易に監視することがで
きる。したがって、このスクリーニング法を用いて本発
明による最適DNAコード化配列を選択することに決定し
た。勿論、好適ではないにせよ、他のスクリーニング法
も本発明の最適DNA配列を選択する際に用いうることを
了解すべきである。
本発明による方法のこの実施例にてSMCコード化配列の
二次構造を変化させるため、SMCのアミノ酸2−6をコ
ードする256種の可能なDNA配列からなる一連の合成リン
カを作成した。SMCのアミノ酸2−6は256種の異なる配
列によってコードされうるが、フエニルアラニンをコー
ドするTTYを含め全ての可能なロイシンコドン(SMC位置
5)を可能にする512倍の縮退リンカを使用した(第3
図)。勿論、本発明の方法にはそれより長いまたは短い
オリゴヌクレオチドも使用しうることを了解すべきであ
る。たとえば、SMCアミノ酸20までをコードするような
長い合成リンカを、SMCの発現に際しこれらの長い配列
の作用を決定するために有利に使用することができる。
これら一連の512−リンカの余分なDNA配列を第3図に示
す。
二次構造を変化させるため、SMCのアミノ酸2−6をコ
ードする256種の可能なDNA配列からなる一連の合成リン
カを作成した。SMCのアミノ酸2−6は256種の異なる配
列によってコードされうるが、フエニルアラニンをコー
ドするTTYを含め全ての可能なロイシンコドン(SMC位置
5)を可能にする512倍の縮退リンカを使用した(第3
図)。勿論、本発明の方法にはそれより長いまたは短い
オリゴヌクレオチドも使用しうることを了解すべきであ
る。たとえば、SMCアミノ酸20までをコードするような
長い合成リンカを、SMCの発現に際しこれらの長い配列
の作用を決定するために有利に使用することができる。
これら一連の512−リンカの余分なDNA配列を第3図に示
す。
第3図を参照して、ここにはSMC産生におけるこれら余
分なDNA配列を用いる方法の1具体例が図示されてい
る。第3図に示したように、先ず最初にpLc24muSMCori
の165塩基対のEcoRI−BamHI断片をEcoRI−BamHI断片さ
れたpUC8にサブクローン化して、lacZとSMCとの間のBa
mHI部位における相内融合を生ぜしめた。このベクター
をpUCmuSMC Aoriと呼ぶ(第3図)。pUC8を選択した理
由は、その小さい寸法およびlacZを中断するその独特な
制限部位並びにそれがlacI-宿主に使用され得るからで
ある。しかしながら、lacZ遺伝子を有する他のプラス
ミドもこのスクリーニング法に用いうることを了解すべ
きである。
分なDNA配列を用いる方法の1具体例が図示されてい
る。第3図に示したように、先ず最初にpLc24muSMCori
の165塩基対のEcoRI−BamHI断片をEcoRI−BamHI断片さ
れたpUC8にサブクローン化して、lacZとSMCとの間のBa
mHI部位における相内融合を生ぜしめた。このベクター
をpUCmuSMC Aoriと呼ぶ(第3図)。pUC8を選択した理
由は、その小さい寸法およびlacZを中断するその独特な
制限部位並びにそれがlacI-宿主に使用され得るからで
ある。しかしながら、lacZ遺伝子を有する他のプラス
ミドもこのスクリーニング法に用いうることを了解すべ
きである。
SMCコード配列をlacZ遺伝子のプロモータ近接領域に挿
入して融合体を作成したので、このハイブリッド遺伝子
の発現はpUC8のlacプロモータの制御下にある。
入して融合体を作成したので、このハイブリッド遺伝子
の発現はpUC8のlacプロモータの制御下にある。
リボソームは、lacリボソーム結合部位において、pUCmu
SMC Aoriでの翻訳を開始することができる。しかしなが
ら、この種の翻訳はpLc24muSMCoriから誘導されたmu断
片の枠内停止コドンにて急速に停止する。或いはこれら
リボソームはmuリボソーム結合部位で翻訳を開始して、
SMCからのアミノ末端部分とlacZからのカルボキシ末端
部分とよりなる融合蛋白を生成することもできる。pUCm
uSMCoriのおけるSMC−β−ガラクトシダーゼ融合体は、
N−末端にSMCの35個のアミノ酸を含有した。
SMC Aoriでの翻訳を開始することができる。しかしなが
ら、この種の翻訳はpLc24muSMCoriから誘導されたmu断
片の枠内停止コドンにて急速に停止する。或いはこれら
リボソームはmuリボソーム結合部位で翻訳を開始して、
SMCからのアミノ末端部分とlacZからのカルボキシ末端
部分とよりなる融合蛋白を生成することもできる。pUCm
uSMCoriのおけるSMC−β−ガラクトシダーゼ融合体は、
N−末端にSMCの35個のアミノ酸を含有した。
pUCmuSMCAoriにおける融合遺伝子は相内にあるが、イー
・コリJM83〔J.ビエイラおよびJ.メッシェング、ジー
ン、第19巻、第259−268頁(1982)〕をプラスミドでト
ランスフェクトしかつ形質転換宿主を5−ブロモ−4−
クロル−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド
(X−GAL)を含有するLB−寒天板で培養した際、37℃
にて16時間後に白色コロニーのみが観察された。これら
のコロニーは40時間後に最終的に極めて淡い青色となっ
たが、16時間後におけるその白色はこれらが極めて少量
のSMC−β−gal融合蛋白しか産生しなかったことを示し
ている。勿論、この結果はpLc24muSMCoriにおける低発
現レベルという本発明者等の従前の観察と一致する。
・コリJM83〔J.ビエイラおよびJ.メッシェング、ジー
ン、第19巻、第259−268頁(1982)〕をプラスミドでト
ランスフェクトしかつ形質転換宿主を5−ブロモ−4−
クロル−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド
(X−GAL)を含有するLB−寒天板で培養した際、37℃
にて16時間後に白色コロニーのみが観察された。これら
のコロニーは40時間後に最終的に極めて淡い青色となっ
たが、16時間後におけるその白色はこれらが極めて少量
のSMC−β−gal融合蛋白しか産生しなかったことを示し
ている。勿論、この結果はpLc24muSMCoriにおける低発
現レベルという本発明者等の従前の観察と一致する。
次いで、プラスミドpUCmuSMC Aori中へ、SMCのアミノ酸
2−6をコードする512倍縮退合成DNAリンカ(AvaII−H
aeII断片)よりなる各保存物を、原プラスミドにおける
これらアミノ酸のコード配列に対する置換体として導入
した。リンカ結合体を回避するため、結合前にこれらリ
ンカを燐酸化しなかった。これらの配列をプラスミドpU
CmuSMC Aori中に導入し、その際各配列をmuリボソーム
結合部位とSMCアミノ酸1(pUCmuSMC Aoriの70bp EcoRI
−AvaII断片)とをコードする断片およびSMCのアミノ酸
7−32をコードする断片(pUCmuSMC Aoriの71bp HaeII
−BamHI断片)と結合させ、次いで得られたEcoRI−BamH
I組合せ断片をEcoRI−BamHI制限pUCmuSMC Aoriに導入し
た(第3図参照)。
2−6をコードする512倍縮退合成DNAリンカ(AvaII−H
aeII断片)よりなる各保存物を、原プラスミドにおける
これらアミノ酸のコード配列に対する置換体として導入
した。リンカ結合体を回避するため、結合前にこれらリ
ンカを燐酸化しなかった。これらの配列をプラスミドpU
CmuSMC Aori中に導入し、その際各配列をmuリボソーム
結合部位とSMCアミノ酸1(pUCmuSMC Aoriの70bp EcoRI
−AvaII断片)とをコードする断片およびSMCのアミノ酸
7−32をコードする断片(pUCmuSMC Aoriの71bp HaeII
−BamHI断片)と結合させ、次いで得られたEcoRI−BamH
I組合せ断片をEcoRI−BamHI制限pUCmuSMC Aoriに導入し
た(第3図参照)。
上記プラスミドの混合体で形質転換させたイー・コリJM
83の5000個のコロニーをX−GALを含有するL−ブロス
板に塗抹した。得られたコロニーの約10%は、37℃にて
40時間後にpUC8muSMC Aoriよりも暗青色であった。次い
で、5000個のコロニーのうち14個(青色および白色の両
者)(イー・コリJM83(pUCmuSMC Al−14))を各種の
方法で分析した。すなわち、縮退領域のDNA配列決定、
β−ガラクトシダーゼの酵素活性、およびイー・コリC6
00におけるSMC発現〔T.マニアチス等、モレキュラ・ク
ローニング(コールド・スプニング・ハーバー・ラボラ
トリー)(1982)〕。これらの分析は各pUCmuSMC Al−1
8の165bp EcoRI−BamHI断片をpLc24muSMCori中に置換し
た後に行なった。これら後者のプラスミドを、第3図に
おいてpLc24muSMC1−18と呼ぶ。分析用に選択した14個
のコロニーのうち、10個は青色であり、4個はX−GAL
板上で白色であった。第I表はこれら各種の分析の結果
を示している。
83の5000個のコロニーをX−GALを含有するL−ブロス
板に塗抹した。得られたコロニーの約10%は、37℃にて
40時間後にpUC8muSMC Aoriよりも暗青色であった。次い
で、5000個のコロニーのうち14個(青色および白色の両
者)(イー・コリJM83(pUCmuSMC Al−14))を各種の
方法で分析した。すなわち、縮退領域のDNA配列決定、
β−ガラクトシダーゼの酵素活性、およびイー・コリC6
00におけるSMC発現〔T.マニアチス等、モレキュラ・ク
ローニング(コールド・スプニング・ハーバー・ラボラ
トリー)(1982)〕。これらの分析は各pUCmuSMC Al−1
8の165bp EcoRI−BamHI断片をpLc24muSMCori中に置換し
た後に行なった。これら後者のプラスミドを、第3図に
おいてpLc24muSMC1−18と呼ぶ。分析用に選択した14個
のコロニーのうち、10個は青色であり、4個はX−GAL
板上で白色であった。第I表はこれら各種の分析の結果
を示している。
第1表に示したように、pUC8muSMC A1−10を含有する青
色コロニーは、イー・コリJM83(pUC8muSMC Aori)より
も2.5〜8倍多いβ−ガラクトシダーゼ単位を生成し
た。これに対し、pUCmuSMC A11−14を含有する白色コロ
ニーは、検出しうるβ−ガラクトシダーゼを生成しなか
った。驚くことにpUC8muSMC A1−10のβ−ガラクトシダ
ーゼ生成は原プラスミドのそれよりも2.5〜8倍高かっ
たが、これらプラスミドからのEcoRI−BamHI断片をpLc2
4muSMCoriに挿入した際これらプラスミドはイー・コリH
B101において原プラスミドにおけるよりも23〜46倍多い
SMC活性を与えた。さらに、所定の融合体に対するβ−
ガラクトシダーゼ単位とPL制御下における対応の発現に
対するSMCのマイクログラムとの間には明らかな特異的
相関関係が存在しなかった。しかしながら、X−GAL板
におけるこれらコロニーの青色/白色の差は、SMCの高
度発現をコードするDNA配列の選択を簡単に可能にし
た。したがって、この方法を一般的に使用して、任意所
望の真核もしくは原核ポリペプチドの産生につき最適な
DNA配列を選択することができる。
色コロニーは、イー・コリJM83(pUC8muSMC Aori)より
も2.5〜8倍多いβ−ガラクトシダーゼ単位を生成し
た。これに対し、pUCmuSMC A11−14を含有する白色コロ
ニーは、検出しうるβ−ガラクトシダーゼを生成しなか
った。驚くことにpUC8muSMC A1−10のβ−ガラクトシダ
ーゼ生成は原プラスミドのそれよりも2.5〜8倍高かっ
たが、これらプラスミドからのEcoRI−BamHI断片をpLc2
4muSMCoriに挿入した際これらプラスミドはイー・コリH
B101において原プラスミドにおけるよりも23〜46倍多い
SMC活性を与えた。さらに、所定の融合体に対するβ−
ガラクトシダーゼ単位とPL制御下における対応の発現に
対するSMCのマイクログラムとの間には明らかな特異的
相関関係が存在しなかった。しかしながら、X−GAL板
におけるこれらコロニーの青色/白色の差は、SMCの高
度発現をコードするDNA配列の選択を簡単に可能にし
た。したがって、この方法を一般的に使用して、任意所
望の真核もしくは原核ポリペプチドの産生につき最適な
DNA配列を選択することができる。
特定理論に拘束されるものでないが、本発明による縮退
DNA配列により示される発現レベルの差はSMCのN−末端
アミノ酸をコードするヌクレオチドのRNA二次構造に関
連すると思われる。たとえば、本発明による結果は、ス
レオニン−ロイシンに対するコドン(ACN−CTN)により
形成される可能なCCC(SMC位置4および5)がSMC合成
に対し特に悪影響があることを示している。ここで分析
した白色コロニーおよびpUCmuSMC Coriは全てpLc24muSM
Cにおけるリボソーム結合部位に対し水素結合を形成し
うるこの配列を特徴とする。
DNA配列により示される発現レベルの差はSMCのN−末端
アミノ酸をコードするヌクレオチドのRNA二次構造に関
連すると思われる。たとえば、本発明による結果は、ス
レオニン−ロイシンに対するコドン(ACN−CTN)により
形成される可能なCCC(SMC位置4および5)がSMC合成
に対し特に悪影響があることを示している。ここで分析
した白色コロニーおよびpUCmuSMC Coriは全てpLc24muSM
Cにおけるリボソーム結合部位に対し水素結合を形成し
うるこの配列を特徴とする。
上記本発明の実施例においては、N−末端にSMCの35個
のアミノ酸を有する融合蛋白を産生するような所望の蛋
白−lacZ融合体をコードするDNA配列を使用したが、融
合蛋白における2つの部分の相対的長さはこの方法にお
ける最も有効なスクリーニングにつき実験的に決定せね
ばならない。この実験結果は、この選択を可能にすると
考えられる幾つかのファクタを確認した。たとえば、リ
ボソーム結合部位の強度が重要である。muからのもので
なくtrpリボソーム結合部位を使用すると、SMCの35個の
アミノ酸を含有する融合体は青色コロニーを生成しなか
った。融合蛋白におけるβ−ガラクトシダーゼと選択蛋
白との相対的割合も重要である。たとえば、N−末端に
14個のみのSMCアミノ酸を有する癒合蛋白を生成した遺
伝子融合体は、青色/白色の選択を可能にしなかった。
この場合、融合蛋白のβ−ガラクトシダーゼ活性が高過
ぎて、最適N−末端コード配列の検出を可能にしなかっ
たことが明らかである。最後に、検出系の感度も重要で
ある。このスクリーニング法で有用なβ−ガラクトシダ
ーゼ活性範囲は、原pUC8により生成されるβ−ガラクト
シダーゼレベルの1〜8%であることを確認した。これ
らファクタ並びに上記のように同様に決定しうるファク
タを相応に考慮して、当業者は適当な融合蛋白並びにこ
こに説明した方法によるスクリーニング分析を本発明の
範囲を逸脱することなく選択することができる。
のアミノ酸を有する融合蛋白を産生するような所望の蛋
白−lacZ融合体をコードするDNA配列を使用したが、融
合蛋白における2つの部分の相対的長さはこの方法にお
ける最も有効なスクリーニングにつき実験的に決定せね
ばならない。この実験結果は、この選択を可能にすると
考えられる幾つかのファクタを確認した。たとえば、リ
ボソーム結合部位の強度が重要である。muからのもので
なくtrpリボソーム結合部位を使用すると、SMCの35個の
アミノ酸を含有する融合体は青色コロニーを生成しなか
った。融合蛋白におけるβ−ガラクトシダーゼと選択蛋
白との相対的割合も重要である。たとえば、N−末端に
14個のみのSMCアミノ酸を有する癒合蛋白を生成した遺
伝子融合体は、青色/白色の選択を可能にしなかった。
この場合、融合蛋白のβ−ガラクトシダーゼ活性が高過
ぎて、最適N−末端コード配列の検出を可能にしなかっ
たことが明らかである。最後に、検出系の感度も重要で
ある。このスクリーニング法で有用なβ−ガラクトシダ
ーゼ活性範囲は、原pUC8により生成されるβ−ガラクト
シダーゼレベルの1〜8%であることを確認した。これ
らファクタ並びに上記のように同様に決定しうるファク
タを相応に考慮して、当業者は適当な融合蛋白並びにこ
こに説明した方法によるスクリーニング分析を本発明の
範囲を逸脱することなく選択することができる。
上記実施例で産生された特定のSMC様ポリペプチドはf
−Met−SMCであるが、各種の可能な手段によってこのSM
Cからf−Metを除去しうることも了解すべきである。
−Met−SMCであるが、各種の可能な手段によってこのSM
Cからf−Metを除去しうることも了解すべきである。
本発明の方法により産生されるSMC様ポリペプチドは、
常法を用いて医薬上有用な組成物に配合することができ
る。これらの組成物は、所望の組織成長刺戟を行なうの
に医薬上有効量のSMC様ポリペプチドと、好ましくは医
薬上許容しうるキャリヤとからなっている。適するキャ
リヤは周知されている。上記したように、これら組成物
は組織成長を刺戟する方法、並びに矮小発育症,筋肉ア
トロピー,骨折,外傷あるいは組織に対するその他の傷
を治療するのに有用である。
常法を用いて医薬上有用な組成物に配合することができ
る。これらの組成物は、所望の組織成長刺戟を行なうの
に医薬上有効量のSMC様ポリペプチドと、好ましくは医
薬上許容しうるキャリヤとからなっている。適するキャ
リヤは周知されている。上記したように、これら組成物
は組織成長を刺戟する方法、並びに矮小発育症,筋肉ア
トロピー,骨折,外傷あるいは組織に対するその他の傷
を治療するのに有用である。
ここに説明した方法で作成された微生物および組換DNA
分子は、1985年3月23日付けで西ドイツ、ゲッチンゲン
在、ドイッチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガ
ニスメンの培養物寄託機関に寄託して、SMC−1およびS
MC−2として同定された培養物により例示される: SMC−1:イー・コリHB101(pcI857) (pLc24muSMCori) SMC−2:イー・コリHB101(pcI857) (pLc24muSMC8) これらの培養物はそれぞれDSM3276および3277の受託番
号が付与された。
分子は、1985年3月23日付けで西ドイツ、ゲッチンゲン
在、ドイッチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガ
ニスメンの培養物寄託機関に寄託して、SMC−1およびS
MC−2として同定された培養物により例示される: SMC−1:イー・コリHB101(pcI857) (pLc24muSMCori) SMC−2:イー・コリHB101(pcI857) (pLc24muSMC8) これらの培養物はそれぞれDSM3276および3277の受託番
号が付与された。
以上、本発明を多くの実施例につき説明したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および構成を利用する他
の実施例を提供しうることが了解されよう。したがっ
て、本発明の範囲は、例示した上記特定実施例のみに限
定されないことが了解されよう。
本構成を改変して本発明の方法および構成を利用する他
の実施例を提供しうることが了解されよう。したがっ
て、本発明の範囲は、例示した上記特定実施例のみに限
定されないことが了解されよう。
Claims (6)
- 【請求項1】所望のポリペプチドをコードするDNA配列
を特徴とする組換えDNA分子により形質転換された単細
胞宿主における所望のポリペプチドの産生を向上させる
方法において、前記DNA配列は、前記組換えDNA分子中の
発現制御配列に作用結合され、前記方法は、容易に分析
可能なポリペプチドのN−末端部分をコード化するDNA
配列を所望のポリペプチドのN−末端部分をコード化す
る一連の縮重DNA配列で置換し、この置換は分析可能性
に実質的に影響を与えず;発現制御配列に作用結合した
一連の得られたハイブリッドDNA配列を形質転換された
単細胞宿主中で発現させ;容易に分析し得るポリペプチ
ドの最適産生を可能にする特定ハイブリッドDNA配列を
選択し;かつ所望ポリペプチドのN−末端部分を、所望
ポリペプチドをコードするDNA配列の残部と共にコード
するこれらの選択したDNA配列を前記ポリペプチドの発
現に使用する;これら諸工程からなることを特徴とする
所望ポリペプチドの産生を向上する方法。 - 【請求項2】容易に分析し得るポリペプチドが、β−ガ
ラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ及び薬剤耐性標識よ
りなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第
1項記載の方法。 - 【請求項3】所望のポリペプチドが、インタフェロン、
インタロイキン及びその他のリンホキン、血液因子、酵
素、ウイルス抗原、SMC、成長ホルモン及びその他のホ
ルモン並びに動物及びヒト起源のその他のポリペプチド
よりなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲
第1項記載の方法。 - 【請求項4】発現制御配列が、lac系、trp系、tac系、t
rc系、ファージλの主オペレータ及びプロモータ領域、
fdコート蛋白の制御領域、SV40の早期及び後期プロモー
タ、ポリオーマ、アデノウイルス及び猿ウイルスから誘
導されるプロモータ、並びに酵母糖分解酵素、α−接合
因子及び酸ホスファターゼのプロモータよりなる群から
選択されることを特徴とする請求の範囲第1項記載の方
法。 - 【請求項5】単細胞宿主が、イー・コリ、シュードモナ
ス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、その他の真菌
類の菌株、培養中の動物細胞及び植物細胞よりなる群か
ら選択されることを特徴とする請求の範囲第1項記載の
方法。 - 【請求項6】前記所望のポリペプチドが、pLC24muSMC1
〜pLC24muSMC10のDNA挿入物から選択されるDNA配列によ
り発現のためにコードされるSMC様ポリペプチドを特徴
とする請求の範囲第1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858507833A GB8507833D0 (en) | 1985-03-26 | 1985-03-26 | Production of human somatomedin c |
GB8507833 | 1985-03-26 | ||
PCT/US1986/000579 WO1986005810A1 (en) | 1985-03-26 | 1986-03-25 | Production of human somatomedin c |
Related Child Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6117435A Division JPH07102152B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | 所望ポリペプチドの産生方法 |
JP6117443A Division JP2602628B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | Smc様ポリペプチド及びその産生方法 |
JP6117430A Division JP2568383B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | ポリペプチドをコード化するdna配列 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62502305A JPS62502305A (ja) | 1987-09-10 |
JPH0691832B2 true JPH0691832B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=10576658
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61501992A Expired - Lifetime JPH0691832B2 (ja) | 1985-03-26 | 1986-03-25 | ポリペプチドの産生を向上する方法 |
JP6117430A Expired - Lifetime JP2568383B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | ポリペプチドをコード化するdna配列 |
JP6117435A Expired - Lifetime JPH07102152B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | 所望ポリペプチドの産生方法 |
JP6117443A Expired - Lifetime JP2602628B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | Smc様ポリペプチド及びその産生方法 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6117430A Expired - Lifetime JP2568383B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | ポリペプチドをコード化するdna配列 |
JP6117435A Expired - Lifetime JPH07102152B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | 所望ポリペプチドの産生方法 |
JP6117443A Expired - Lifetime JP2602628B2 (ja) | 1985-03-26 | 1994-05-09 | Smc様ポリペプチド及びその産生方法 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0215110B1 (ja) |
JP (4) | JPH0691832B2 (ja) |
CN (1) | CN1034588C (ja) |
AT (1) | ATE87977T1 (ja) |
AU (1) | AU594950B2 (ja) |
CA (1) | CA1339305C (ja) |
DE (1) | DE3688225T2 (ja) |
DK (1) | DK175223B1 (ja) |
ES (1) | ES8705921A1 (ja) |
GB (1) | GB8507833D0 (ja) |
IL (1) | IL78278A0 (ja) |
NO (1) | NO302709B1 (ja) |
WO (1) | WO1986005810A1 (ja) |
ZA (1) | ZA862240B (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ221789A (en) * | 1986-09-12 | 1991-05-28 | Genentech Inc | Recombinant prorelaxin, its preparation and pharmaceutical compositions comprising it |
GB8712540D0 (en) * | 1987-05-28 | 1987-07-01 | Ucb Sa | Expression of human proapolipoprotein a-i |
US4876242A (en) * | 1987-09-21 | 1989-10-24 | Merck & Co., Inc. | Human insulin-like growth factor analoges with reduced binding to serum carrier proteins and their production in yeast |
AUPP807899A0 (en) * | 1999-01-08 | 1999-02-04 | University Of Queensland, The | Codon utilization |
JP6018719B1 (ja) * | 2016-03-15 | 2016-11-02 | Bx新生精機株式会社 | シャッター開閉機の巻上装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE95236T1 (de) * | 1983-04-25 | 1993-10-15 | Chiron Corp | Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren. |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
SE8303626D0 (sv) * | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Kabigen Ab | A recombinant plasmid a transformant microorganism, a polydoxyrebonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced |
EP0151760A1 (en) * | 1984-01-06 | 1985-08-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel DNA and use thereof |
US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
-
1985
- 1985-03-26 GB GB858507833A patent/GB8507833D0/en active Pending
-
1986
- 1986-03-21 CA CA000504757A patent/CA1339305C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-25 EP EP86902217A patent/EP0215110B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-25 ZA ZA862240A patent/ZA862240B/xx unknown
- 1986-03-25 JP JP61501992A patent/JPH0691832B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-25 DE DE8686902217T patent/DE3688225T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-25 AU AU56657/86A patent/AU594950B2/en not_active Expired
- 1986-03-25 AT AT86902217T patent/ATE87977T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-03-25 WO PCT/US1986/000579 patent/WO1986005810A1/en active IP Right Grant
- 1986-03-25 ES ES553374A patent/ES8705921A1/es not_active Expired
- 1986-03-26 CN CN86102889A patent/CN1034588C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-26 IL IL78278A patent/IL78278A0/xx unknown
- 1986-11-25 NO NO864724A patent/NO302709B1/no unknown
- 1986-11-26 DK DK198605698A patent/DK175223B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-05-09 JP JP6117430A patent/JP2568383B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 JP JP6117435A patent/JPH07102152B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 JP JP6117443A patent/JP2602628B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0215110A1 (en) | 1987-03-25 |
DE3688225T2 (de) | 1993-07-22 |
NO302709B1 (no) | 1998-04-14 |
CN1034588C (zh) | 1997-04-16 |
JPH07143896A (ja) | 1995-06-06 |
JPH07143885A (ja) | 1995-06-06 |
NO864724L (no) | 1987-01-23 |
JPH07145200A (ja) | 1995-06-06 |
JP2568383B2 (ja) | 1997-01-08 |
ES553374A0 (es) | 1987-05-16 |
JPS62502305A (ja) | 1987-09-10 |
EP0215110A4 (en) | 1987-07-09 |
GB8507833D0 (en) | 1985-05-01 |
AU5665786A (en) | 1986-10-23 |
DK175223B1 (da) | 2004-07-12 |
ZA862240B (en) | 1986-11-26 |
DE3688225D1 (de) | 1993-05-13 |
CN86102889A (zh) | 1986-11-26 |
DK569886D0 (da) | 1986-11-26 |
EP0215110B1 (en) | 1993-04-07 |
ES8705921A1 (es) | 1987-05-16 |
DK569886A (da) | 1986-11-26 |
JPH07102152B2 (ja) | 1995-11-08 |
JP2602628B2 (ja) | 1997-04-23 |
CA1339305C (en) | 1997-08-19 |
AU594950B2 (en) | 1990-03-22 |
IL78278A0 (en) | 1986-07-31 |
WO1986005810A1 (en) | 1986-10-09 |
ATE87977T1 (de) | 1993-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4693973A (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield | |
Seeburg et al. | Efficient bacterial expression of bovine and porcine growth hormones | |
AU620673B2 (en) | Somatotropin analogs | |
EP0200986B1 (en) | Recombinant human interleukin-1 | |
JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのdna配列,組換dna分子および生産方法 | |
JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
CS273152B2 (en) | Method of mature human leucocytic interferon production | |
WO1985000831A1 (en) | Microbial expression of insulin-like growth factor | |
HU195535B (en) | Process for producing dna transfer vector comprising base sequence determining cattle growth hormone or prehormone | |
CZ284204B6 (cs) | Zvyšování sekrece polypeptidů | |
KR940005585B1 (ko) | 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법 | |
JPH0240080B2 (ja) | ||
JP2602628B2 (ja) | Smc様ポリペプチド及びその産生方法 | |
JP2612264B2 (ja) | Dna配列体 | |
Mayne et al. | Direct expression of human growth in Escherichia coli with the lipoprotein promoter | |
JPS61149089A (ja) | Dna塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
US5654177A (en) | Production of human somatomedin C | |
JPH07501220A (ja) | 異種プレプロ領域を有する神経栄養因子の発現 | |
JP2574146B2 (ja) | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 | |
JPH0723788A (ja) | 神経栄養因子の生産方法及びそのためのべクター | |
JPH0156757B2 (ja) | ||
JPH03503360A (ja) | リボソーム結合部位 | |
KR19980074788A (ko) | 대장균에서 인간 혈소판 생성 촉진인자의 제조방법 | |
JPS63267290A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド | |
CS273182B2 (en) | Method of expressive vector production capable to give mature human leucocytic interferon in transformed strain of escherichia coli by means of expression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |