JPH0691832B2 - ポリペプチドの産生を向上する方法 - Google Patents

ポリペプチドの産生を向上する方法

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JPH0691832B2 JP61501992A JP50199286A JPH0691832B2 JP H0691832 B2 JPH0691832 B2 JP H0691832B2 JP 61501992 A JP61501992 A JP 61501992A JP 50199286 A JP50199286 A JP 50199286A JP H0691832 B2 JPH0691832 B2 JP H0691832B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、任意所望の蛋白もしくはポリペプチドを産生
するのに最適なDNA配列をこれらにより形質転換された
宿主にて産生するポリペプチドの産生を向上させる方法
に関するものである。
〔発明の背景〕
ソマトメジンＣ（「SMC」）はインシュリン様の成長因
子であって、下垂体から成長ホルモンを分泌した後に組
織成長を指令する重要な蛋白であると思われる。
ヒトSMCのアミノ酸配列はE.リンダークネヒトおよびR.
E.ハンブルにより報告された〔ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第253巻、第2769−2776頁（197
8）〕。これは、３個のジスルフィド結合によって架橋
された70個のアミノ酸よりなる一本鎖ポリペプチドで構
成される。計算分子量は7649である。このSMCはプロイ
ンシュリンに対し著しい類似性を示す。たとえば、SMC
アミノ酸１〜29はインシュリンＢ鎖に対し同族であり、
かつSMCアミノ酸42〜62はインシュリンＡ鎖に同族であ
る。しかしながら、SMCにおける接続連鎖はプロインシ
ュリンのＣペプチドに対する類似性を示さず、またSMC
はプロインシュリンには見られないＣ−末端オクタペプ
チドを有する。
SMCはインビトロにおいて多くの成長促進作用を示し、
たとえばDNA,RNA,蛋白およびプロテオグリカンの合成を
刺戟する作用を示す〔E.リンダークネヒトおよびR.E.ハ
ンブル、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンスUSA、第73巻、第2365−2369頁（1976）〕;B.
モレルおよびE.R.フロエシュ、ヨーロピアン・ジャーナ
ル・クリニカル・インベスティゲーション、第３巻、第
119−123頁（1973）;E.R.フロエシュ等、Adv.Mental.Di
sord、第８巻、第211−235頁（1975）;A.E.チングおよ
びE.R.フロエシュ、ダイアベトロジア、第９巻、第472
−476頁（1973）;E.R.フロエシュ等、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・サイエンスUSA、第73巻、
第2904−2908頁（1976）〕。さらに、これはオルニチン
デカルボキシラーゼおよび細胞増殖をも刺戟する〔B.モ
レルおよびE.R.フロエシュ、上記;G.K.ハーゼルバッハ
ーおよびR.E.ハンブル、ジャーナル・セルラー・フィジ
オロジー、第88巻、第239−246頁（1976）〕。インビボ
において、SMCは下垂体切除により成長ホルモンを欠如
させたラットにおける成長を刺戟する〔E.シェンル等、
ネーチャー、第296巻、第252−253頁（1982）〕。
成長ホルモンと同様に、SMCは或る程度動物種類に特異
性である。しかしながら、或る種の動物からのSMCは、
進化論的尺度において低位の他の動物種類でも生物学上
活性である。たとえば、ヒトSMCは牛，豚およびニワト
リにおける成長促進に有用であると思われる。実験動物
において、SMCは天然ヒト成長ホルモンと同様な成長刺
戟作用を示した。しかしながら、SMCは成長反応の中枢
媒体であるためヒト成長ホルモンよりも有利であると思
われる。したがって、成長ホルモンよりも一層直接的な
成長調節剤となる。
たとえば、矮小発育症および筋肉アトロピーなどの或る
種の成長障害を処置するSMCの用途の他に、SMCはさらに
たとえば外傷および折骨の治癒に関連するような特定領
域における組織成長を刺戟するにも有用である。
しかしながらSMCは、ヒト血液からの精製により極く微
量しか入手し得ないため、組織成長刺戟剤としてその臨
床的能力を果していない。したがって、産業上および臨
床上有用な量のSMCにおけるこの欠乏を解消するため、
他の方法が要求される。
この種の１つの方策は、SMCをコードするDNA配列で形質
転換された宿主においてSMCを産生させるための組換DNA
技術の使用である。しかしながら、この方策は多量のSM
Cを製造するには有用でないことが判明している。何故
なら、各種のイー・コリ宿主におけるSMCの発現収率が
極めて低く、経済上または産業上有用な量のSMCを提供
し得ないからである。
〔発明の開示〕
本発明は、SMC或いはその他任意所望の真核もしくは原
核蛋白もしくはポリペプチドを産生するのに最適なDNA
配列を、これらDNA配列により形質転換された宿主にお
いて産生を行なうために同定する方法を提供することに
より上記問題を解決する。この方法により選択される改
変DNA配列はこれら蛋白、特に本発明の好適実施例にお
いてはSMCの発現をコードし、かつこれらを各種の宿主
において効率的に高レベルで産生することを可能にす
る。したがって、本発明によれば、臨床上有用な量でSM
Cの成長刺戟性および媒介活性を示すポリペプチドを初
めて得ることが可能になる。
以下の開示から明らかとなるように、本発明の好適具体
例において、本発明の新規なDNA配列および組換DNA分子
は適当な宿主において多量のSMCおよびSMC様ポリペプチ
ドの産生を指令することができる。かくして、これらの
ポリペプチドはヒト並びに牛，豚およびニワトリにおけ
る広範な種類の成長刺戟および媒介活性において有用と
なる。
したがって、本発明の基本的一面は、SMC或いはその他
任意所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチド
を産生するのに最適なDNA配列の同定方法を設計するこ
とにあることが了解されよう。本発明の第二の基本的面
はこれら蛋白、特にSMCおよびSMC様ポリペプチドを向上
した収率で産生しうる各種の新規なDNA配列、組換DNA分
子および宿主に関するものである。
要約して、所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペ
プチドをコード化するDNA配列により形質転換された宿
主において、これら所望の蛋白もしくはポリペプチドの
産生を向上させる本発明の方法は、前記DNA配列が容易
に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドのＮ−末端部分
をコード化するDNA配列を、所望の真核もしくは原核蛋
白もしくはポリペプチドのＮ−末端部分をコード化する
DNA配列の縮重シリーズで置換し；得られたシリーズの
所望発現制御配列に作用結合したハイブリッドDNA配列
を適当な宿主で発現させ；容易に分析しうる蛋白もしく
はポリペプチドの最適な産生を可能にする特定ハイブリ
ッドDNA配列を選択し；かつ所望のポリペプチドもしく
は蛋白のＮ−末端部分をコードするこれら選択されたハ
イブリッドDNA配列を所望ポリペプチドもしくは蛋白の
発現において使用する諸工程からなっている。有利に
は、この方法は、所望の蛋白もしくはポリペプチドの最
適産生を可能にする。
図面の簡単な説明 第１図は概要においてｆ−Met−SMCをコードする合成DN
A配列並びにmuおよびPLプロモータから誘導される配列
の下流に前記DNA配列を有するプラスミドpLc24muSMCori
の一つの製造方法を示し、 第２図はｆ−Met−SMCをコードする合成DNA配列を製造
するための本発明による方法の１実施例に使用する２種
の断片〔SMC A（断片Ａ）およびSMC B（断片Ｂ）〕の合
成ヌクレオチド配列（両者ともストランド）を示し、さ
らにこの第２図はこれら断片を製造するために使用する
断片SMC AおよびSMC B並びに各種のオリゴヌクレオチド
配列１−11,X,YおよびＺのアミノ酸配列をも示し、 第３図は概要においてプラスミドpUCmuSMC Aori,pUCmuS
MC A1−18およびpLc24muSMC1−18の１製造方法を示し、
第３図の中央に図示された512倍縮退した合成リンカの
配列において「Ｎ」は４種の全ての塩基の可能性を示
し、「Ｐ」はプリンを示しかつ「Ｙ」はピリミジンを示
す。
〔発明を実施する最良方式〕
ここに記載する本発明を充分理解しうるよう、以下詳細
に説明する。
説明において次の用語を使用する： ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素複
素環塩基とよりなるDNAもしくはRNAの単量体単位であ
る。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を
介して糖成分に結合される。塩基と糖とのこの組合せを
ヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特徴
とする。４種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」），グアニ
ン（「Ｇ」），シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNA塩基はA,G,Cおよびウラシ
ル（「Ｕ」）である。
DNA配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素と
の間でホスホジエステル結合により互いに連結されたヌ
クレオチドの線状列である。
コドン:3個のヌクレオチド（トリプレット）のDNA配列
であって、mRNAを介しアミノ酸、翻訳開始信号または翻
訳停止信号をコードする。
遺伝子：雛型またはメッセンジャーRNA（「mRNA」）を
介し、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコ
ードするDNA配列である。
転写：遺伝子からmRNAを生成する過程。
翻訳:mRNAからポリペプチドを生成する過程。
発現：ポリペプチドを産生するためにDNA配列もしくは
遺伝子により行われる過程。これは転写と翻訳との組合
せである。
プラスミド：プラスミドが宿主細胞で複製されるような
完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖DNA配列で
ある。プラスミドが単細胞生物内に挿入されると、この
生物の特性がこのプラスミドのDNAの結果として変化し
或いは形質転換しうる。たとえばテトラサイクリン耐性
（TetR）に関する遺伝子を有するプラスミドは、テトラ
サイクリンに対し感受性であった細胞をテトラサイクリ
ンに対し耐性である細胞に形質転換する。プラスミドに
より形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
ファージもしくはバクテリオファージ：その多くが蛋白
エンベロプもしくはコート蛋白（「カプシド」）にカプ
セル化されたDNA配列よりなる細菌性ウイルスである。
クローン化ベヒクル：宿主細胞で複製しうるプラスミ
ド，ファージDNAもしくはその他のDNA配列であって、こ
の種のDNA配列がDNAの本質的な生物学機能，たとえは複
製、コート蛋白の産生などの損失を伴なわずに或いはプ
ロモータもしくは結合部位の損失を伴なわずに決定可能
に切断されうる１個もしくは少数のエンドヌクレアーゼ
認識部位を特徴とし、さらに形質転換細胞の同定に使用
するのに適した標識、たとえばテトラサイクリン耐性も
しくはアンピシリン耐性を有する。クローン化ベヒクル
はしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化：無性繁殖により１種の生物もしくはDNA配
列から誘導される、これら生物もしくはDNA配列の集団
を得る過程である。
組換DNA分子、すなわちハイブリッドDNA:互いに末端結
合されかつ或る種の宿主細胞に感染してそこに維持され
る能力を有する種々異なるゲノムからのDNA断片よりな
る分子である。
発現制御配列：遺伝子の発現を、これら遺伝子に作用結
合された際に制御しかつ調整するヌクレオチドの配列で
ある。これらはlac系，trp系，tac系，trc系，ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域,fdコート蛋白
の制御領域,SV40の早期および後期プロモータ，ポリオ
ーマ，アデノウイルスおよび猿ウイルスから誘導される
プロモータ,3−ホスホグリセレートキナーゼまたはその
他の糖分解酵素のプロモータ，酵母酸ホスファターゼの
プロモータ、たとえばPho5,酵母α−接合因子のプロモ
ータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウイルス
の遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配
列、或いはその組合せを包含する。
SMC:ソマトメジンＣ。
SMC様ポリペプチド:SMCの成長刺戟もしくは媒体活性を
示すポリペプチドである。たとえばSMC様ポリペプチド
は成熟SMCの第１グリシンに融合したＮ−末端メチオニ
ンまたはその他のペプチドを含むことができる。さら
に、これはアミノ酸位置59にメチオニンの代りにスレオ
ニンを含むこともできる。さらに、SMC様ポリペプチド
は、成熟SMCのアミノ酸配列に対しその他各種の置換，
付加または欠失を含むこともできる。
本発明は幾つかの局面を有する。第１に、本発明は任意
の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの発現を
コードするDNA配列で形質転換された宿主細胞におい
て、これら蛋白もしくはポリペプチドを産生される改良
方法に関する。さらに本発明は、これらDNA配列により
形質転換された宿主細胞において任意の真核もしくは原
核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にするDN
A配列の選択方法にも関する。さらに本発明は、前記方
法により選択されるDNA配列およびこれらによりコード
される蛋白およびポリペプチドの産生におけるその使用
に関する。最後に１つの好適例において、本発明はSMC
様ポリペプチドをコードするDNA配列、並びにこれらDNA
配列を選択しかつこれらにより形質転換された宿主にて
SMCの産生を最適化する際に使用する方法に関するもの
である。
本発明のハイブリッドDNA配列および所望の真核もしく
は原核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にす
る選択DNA配列の両者を発現させる際、広範な種類の宿
主／発現ベクター組合せを用いることができる。たとえ
ば、有用な発現ベクターは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、たとえばSV40の各種公知の誘導体およ
び公知の細菌性プラスミド、たとえばColE1,pCR1,pBR32
2,pMB9およびその誘導体を含むイー・コリからのプラス
ミド、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP4,ファ
ージDNA,たとえばファージλの多数の誘導体、たとえば
NM989およびその他のDNAファージ、たとえばM13並びに
フィラメント状一本鎖DNAファージ、酵母に有用なベク
ター、たとえば２μプラスミド，真核細胞および動物細
胞に有用なベクター、たとえばSV40から誘導されたDNA
配列を含むもの、並びにプラスミドとファージDNAとの
組合せから誘導されるベクター、たとえばファージDNA
もしくはその他の誘導体を使用すべく改変されたプラス
ミドで構成することができる。
この種の有用な発現ベクターには、真核宿主（たとえば
動物およびヒト細胞）においてクローン化DNA配列の発
現を可能にするベクター〔たとえばP.J.サンザーンおよ
びP.ベルク、ジャーナル・モレキュラー・アプライド・
ジェネティックス、第１巻、第327−341頁（1982）;S.
サブラマニ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、
第１巻、第854−864頁（1981）;R.J.カウフマンおよび
P.A.シャープ、「モジュール・ジヒドロホレート・レダ
クターゼ相補性DNA遺伝子を組込んだ配列の増殖および
発現」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第
２（11）巻、第1304−1319頁（1982）;R.J.カウフマン
およびP.A.シャープ、モレキュラ・セルラー・バイオロ
ジー、第159巻、第601−664頁（1982）;S.I.スカヒル
等、「支那ハムスター卵細胞におけるヒト免疫インタフ
ェロンDNA遺伝子の産生物の発現および特性化」、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンスUS
A、第80巻、第4654−4659頁（1983）;G.ウルラウブおよ
びL.A.ケーシン、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンスUSA、第77巻、第4216−4220頁（198
0）〕がある。
さらに、この種の発現ベクターは、特定のDNA配列に作
用結合されてクローン化DNA配列の発現を制御しかつ調
整する少なくとも一種の発現制御配列を特徴とする。有
用な発現制御配列の例はlac系，trp系，tac系，trc系，
ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域,fdコ
ート蛋白の制御領域，酵母の糖分解プロモータ、たとえ
ば３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ，酵母
酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばPho5,酵母α
−接合因子のプロモータ、並びにポリオーマ，アデノウ
イルスおよび猿ウイルスから誘導されるプロモータ、た
とえばSV40の早期および後期プロモータ、並びに原核も
しくは真核細胞の遺伝子およびそれらのウイルスの発現
を制御することが知られたその他の配列、或いはその組
合せである。
有用な発現宿主は周知の真核および原核宿主、たとえば
イー・コリHB101,イー・コリX1776,イー・コリX2282,イ
ー・コリDHI（λ）およびイー・コリMRC1のようなイー
・コリ，シュードモナス，バチルス（たとえばバチルス
・ズブチリス），ストレプトミセス，酵母およびその他
の真菌類の菌株，動物細胞たとえばCOS細胞およびCHO細
胞、並びに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞を
包含する。
勿論、必ずしも全ての宿主／発現ベクター組合せが同等
な効率をもって本発明におけるDNA配列の発現或いは本
発明のポリペプチドの産生に機能するとは限らない。し
かしながら、宿主／発現ベクター組合せの特定の選択
は、以下説明する原理を考慮して、本発明の範囲を逸脱
することなく当業者により行なうことができる。たとえ
ば、この選択は多数の因子のバランスに基づいている。
たとえば、これらは宿主およびベクターの適合性,DNA配
列によりコードされた蛋白の宿主に対する毒性，所望蛋
白の回収容易性,DNA配列の発現特性、並びにこれらに作
用結合された発現制御配列，生物安全性，コストおよび
所望蛋白の重なり，形態或いはその他の任意の必要とす
る発現後の改変を包含する。
さらに、各特定発現ベクターには、本発明のDNA配列を
挿入するため各種の部位を選択することができる。これ
らの部位は、一般にこれらを切断する制限エンドヌクレ
アーゼにより命名され、当業者に充分認識されている。
勿論、本発明に有用な発現ベクターは、選択DNA断片を
挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必
要がないことを了解すべきである。寧ろ、このベクター
は他の手段によって断片に結合させうる。発現ベクタ
ー、特に選択DNA断片を挿入して、ここで発現制御配列
に作用結合させるための選択部位は各種の因子、たとえ
ば特定制限酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白
の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋
白の感受性、宿主細胞により発現されて精製の際に除去
するのが困難な蛋白の汚染もしくは結合、発現特性、た
とえばベクター配列に対する開始コドンおよび停止コド
ンの位置、並びに当業者に認識されたその他の因子によ
り決定される。DNA配列のためのベクターおよび挿入部
位の選択はこれら因子のバランスによって決定され、必
らずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であると
は限らない。
さらに、容易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドを
コードする各種DNA配列も、本発明に使用することがで
きる。たとえば、本発明の好適具体例においてはβ−ガ
ラクトシダーゼを使用する。何故なら、この蛋白の産生
は周知の比色プレート分析を用いて容易に監視しうるか
らである。さらに、たとえばガラクトキナーゼもしくは
薬品耐性の遺伝子、たとえばアンピシリン耐性などを用
いることもできる。
最後に、本発明の方法並びにこれにより選択されかつ使
用されるDNA配列は、任意の原核もしくは真核蛋白もし
くはポリペプチドに適用することができる。これらのう
ちには、ヒトおよび動物リンホキン、たとえばインタフ
ェロン，インタロイキンおよびTNF,ヒトおよび動物ホル
モン、たとえば成長ホルモンおよびインシュリン，ヒト
および動物血液ファクタ、たとえばファクタVIIIおよび
tPA,酵素，抗原並びに興味あるその他の蛋白およびポリ
ペプチドがある。ここに説明する１好適具体例において
は、本発明の方法を用いてSMC様ポリペプチドの産生を
最適化させた。
本発明を一層充分に理解しうるよう、以下実施例につき
説明する。これらの実施例は例示の目的であって、決し
て本発明をこれら特定実施例に限定すると解釈すべきで
ないことを了解すべきである。
SMC様ポリペプチドをコードするDNA配列を持った組換DN
A分子の作成 次に第１図を参照すれば、ここには組換DNA分子（pLc24
muSMCori）の製造方法の１具体例が概要として示されて
おり、これはmuから誘導されたDNA配列に融合しかつmu
からのシャイン・ダルガルノ配列を有するヒトｆ−Met
−SMCをコードするDNA配列を有し、この組合せDNA配列
はバクテリオファージλから誘導されたPLプロモータに
作用結合されていることを特徴とする。
pLc24muSMCoriを作成するため、先ず報告されているヒ
トSMCのアミノ酸配列〔リンダークネヒトおよびハンブ
ル、上記;D.G.クラッパー等、Endocrinal、第112巻、第
2215−2217頁（1983）〕を用いて14種のオリゴデオキシ
ヌクレオチドを合成した（第１図および第２図の配列１
−11,X,YおよびＺ参照）。合成には固相のホスホトリエ
ステル法を用いた〔H.イトー等、ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ、第10巻、第1755−1769頁（1982）〕。粗
製オリゴマを除蛋白した後、これらをセファデックスＧ
−50でのゲル濾過によって脱塩し、かつ尿素を含有する
変性ポリアクリルアミド調製用スラブゲルでの電気泳動
によって精製した〔T.マニアチス等、バイオケミストリ
ー、第14巻、第3787−3794頁〕（1975）〕。UV分析によ
ってバンドの位置決定を行ない、かつ電気溶出によって
ゲルスライス物からオリゴデオキシヌクレオチドを単離
した。次いで、ゲル精製したオリゴデオキシヌクレオチ
ドをT4ポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化し、か
つ15％ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルにて再精製し、
電気溶出でDNAを回収した〔T.マニアチス等、モレキュ
ラ・クローニング、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（1982）〕。これら14種のオリゴデオキシ
ヌクレオチドは、寸法において13塩基から37塩基まで変
化した。
これらの合成において、イー・コリの高度発現した遺伝
子におけるコドンの使用〔R.グランタム等、ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ、第８巻、第1983−1992頁（19
80）〕およびイー・コリ）tRNA発生〔T.イケムラ、ジャ
ーナル・モレキュラ・バイオロジー、第151巻、第389−
409頁（1981）〕を考慮した。。さらに、各種の便利な
エンドヌクレアーゼ認識部位を、これらオリゴヌクレオ
チド配列に沿った種々の位置に含ませた。
次いで、配列１−４並びにX,YおよびＺと配列５−11と
を結合させ、かつこれらをケレノ−ポリメラーゼで延長
化させて２種の複合DNA配列、すなわち断片Ａとしての9
8塩基対の平滑末端断片（「SMC A」）および断片Ｂとし
ての138塩基対の平滑末端断片（「SMC B」）を形成させ
た〔J.R.ロッシ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第257巻、第9226−9229頁（1982）〕（第１
図および第２図参照）。断片ＡはSMCのＮ−末端をコー
ドし、かつ断片ＢはSMCの残部をコードする（第２
図）。
配列１−4,X,YおよびＺのそれぞれ200pモルを20μｌの
再融合用緩衝液（50mMトリス−HCl（pH7.6）、10mM MgC
l2）中にて95℃まで加熱することにより断片SMC Aを作
成し、次いでこの混合物を４℃まで徐々に冷却した。ジ
チオスレイトールとATPとT4DNAリガーゼとを最終濃度5m
M、７μＭおよび20μ/mlまでそれぞれ添加し、次いでこ
の反応混合物を４℃にて10時間培養した。エタノール沈
澱の後、この混合物を８％ポリアクリルアミド/7M尿素
ゲルに加え、かつ77−および78−塩基対のストランドを
溶出させた。次いで、各ストランド25pモルを５μｌの
再融合用緩衝液中にて組合せ、反応混合物を95℃まで加
熱し、次いで15℃まで徐々に冷却した。次いで、ジチオ
スレイトールとdNTPとDNAポリメラーゼのクレノー断片
とをそれぞれ5mM、250μＭおよび２単位の濃度まで添加
し、次いで混合物を室温にて30分間静置した。上記のよ
うに反応生成物を精製し、かつ7pモルの98塩基対SMC A
を単離した。配列５−11のそれぞれ200pモルを用いてほ
ぼ同様な方法で、20pモルの138塩基対SMC Bを作成し
た。
次いで、これらの断片のそれぞれを、BamHI（断片Ａに
つき）並びにBamHIおよびHindIII（断片Ｂにつき）で２
μｇのRF DNAを制限することにより作成された平滑末端
M13mp8ベクターに挿入し、交差末端を４種のデオキシヌ
クレオシドトリホスフェート（dNTP）の存在下に１単位
のイー・コリDNAポリメラーゼ（クレノー断片）により
修復し、エタノールで沈澱させ、かつ牛腸内ホスファタ
ーゼ（10mMトリス−HCl（pH9.2）および0.2mMEDTAにお
ける20単位）によって30分間にわたり５′−脱燐酸した
〔J.メッシング、メソッズ・イン・エンチモロジー、第
101巻、第20−78頁（1983）〕。結合させるため20ngの
線状化したベクターと0.1pモルのDNA断片とを10μｌの
結合用緩衝液および40単位のT4DNAポリメラーゼにおい
て15℃にて24時間用いた（第１図）。
断片Ａを平滑末端のM13mp8ベクターに結合させて、SMC
断片の末端にBamHI部位を再生成し、かつさらにNcoＩ部
位（GGATCCATGG）が生成した組換ファージを得た（mp8S
MC A）（第１図）。断片Ｂを二重平滑末端M13mp8ベクタ
ーに結合させて、SMC断片の末端にBamHIおよびHindIII
部位を再生成した組換ファージ（mp8SMC B）を得た（第
１図）。
次いで、これら組換ファージのそれぞれによりイー・コ
リJM101〔J.メッシングおよびJ.ビエイラ、ジィーン、
第19巻、第269−276頁（1982）〕を形質転換させ、そし
て形質転換宿主を５−ブロモ−４−クロル−３−インド
リル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−GAL）を含有する
Ｌ−ブロスプレートに塗抹した。次いで、mp8SMC Aおよ
びmp8SMC Bで形質転換されたイー・コリJM101の24個の
白色プラークからファージDNAを精製し、ジデオキシ−
連鎖末端によりDNAを配列決定した〔A.J.H.スミス、メ
ソッズ・イン・エンチモロジー、第65巻、第560−580頁
（1980）〕。次いで、mp8SMC Aおよびmp8SMC Bから細胞
内RF DNAを作成し、前者をNcoI/BamHIで、後者をBamHI/
HindIIIでそれぞれ切断し、かつゲル電気泳動によってS
MC関連断片を単離した（第１図）。
次いで、２種の断片（SMC AおよびSMC B）をバクテリオ
ファージmu（B.アレット氏の寄贈物）のner遺伝子から
の67塩基対断片と混合した〔G.クレー等、ジィーン、第
32巻、出版中〕。この断片はヌクレオチド1043−96で構
成され〔H.プリース等、モレキュラ・ゼネラル・ジェネ
ティックス、第186巻、第315−321頁（1982）、第４
図〕。その前にはEcoRIエンドヌクレアーゼ制限部位が
存在し、かつ後にはNcoＩ部位（CCATGG）が存在し、Nco
Ｉ部位の内部ATGは翻訳開始コドンを形成する。さら
に、この断片はほぼ最適なリボソーム結合部位をも有す
る。〔J.シャインおよびL.ダルガルノ、ネイチャー、第
254巻、第34−38頁（1975）〕。この結合の結果とし
て、mu遺伝子断片とSMC AとSMC Bとからなる303塩基対
のEcoRI−HindIII断片を単離した（第１図）。結合は、
mu断片のNcoＩ部位のATG開始コドンが直接融合しかつ正
確な読み枠内でSMC Aに融合されたようなものである
（第１図および第２図）。
この断片を、予めEcoRIおよびHindIIIで制限されたpLc2
4に導入し〔E.レムート等、ジーン、第15巻、第81−93
頁（1981）〕、プラスミドpLc24muSMCoriを生成させ
た。このプラスミドは、SMC遺伝子とその開始ATGコドン
とをバクテリオファージλのPLプロモータの制御下で有
することを特徴とする（第１図）。
プラスミドpLc24muSMCoriを用いるSMC様ポリペプチドの
発現 pLc24muSMCoriとpcI857、すなわちPLの温度感受性リプ
レッサをコードするpACYC184の誘導体〔E.レムート等、
ジーン、第22巻、第103−113頁（1983）〕を用いてイー
・コリHB101を形質転換させた〔T.マニアチス等、モレ
キュラ・クローニング（コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー）（1982）〕。これら２種のプラスミ
ドは異なる抗生物質耐性遺伝子、すなわちペニシリナー
ゼ（pLc24muSMCori）およびカナマイシン（pcI857）を
有するので、正確に形質転換された培養物は50μg/mlの
アンピシリンおよび40μg/mlのカナマイシンと増殖させ
ることにより選択することができる。
50μg/mlのアンピシリンと40μg/mlのカナマイシンとを
含有するＬ−ブロス中に、正確に形質転換されたイー・
コリHB101（pLc24muSMCori）（pcI857）を含有するプレ
ートからの培養物5mlを接種し、この培養物を28℃にて
１晩増殖させた。次いで、2mlの１晩培養物を42℃まで
加温された10mlのＬ−ブロスに添加し、この培養物を10
0mlの三角フラスコ中で42℃にて２時間にわたり激しく
攪拌した。
SMC様ポリペプチドの産生につき分析するため、培養物1
ml当りから細胞を遠心分離し（A550＝20）、かつこれら
を50μｌのSDS−β−メルカプトエタノール溶解緩衝液
〔U.K.レムリ、ネイチャー、第227巻、第680−685頁（1
970）〕において10分間沸とう（100℃）させることによ
り溶解させた。次いで、市販の分析キット（ニコルス・
インスティチュート・ダイアグノスティックス社）を用
いる放射免疫分析により、全てのSMC活性を分析し、そ
の標準については精製IGF−１（R.ハンブルの寄贈物）
を用いて予め証明した。分析用としてゲル電気泳動用と
同様に溶解物を含有するSMCを作成し、これを分析用緩
衝液に少なくとも20倍希釈し、かつ２反復で分析した。
標準溶解条件下で変性させたヒトSMCはこのRIAにおいて
天然ホルモンと同様な反応性を有することが観察され
た。
この分析は、温度誘発に際しイー・コリHB101（pLc24mu
SMCori）（pcI857）が極めて少量のSMC活性（RIAにより
1.4μg/ml）を生成したことを示し、この量は蛋白ゲル
におけるクーマシ−青染色によって検出しえない量であ
る。したがって、この形質転換宿主におけるSMC様ポリ
ペプチド産生のレベルは細胞１個当り僅か数100分子で
あると推定された。
SMC様ポリペプチドの産生を向上させる試み pLc24muSMCoriを用いるSMC様ポリペプチド産生のレベル
が極めて低かったので、向上したレベルの発現を有する
他の各種のプラスミドを作成すべく試みた。
１つの方法において、他の蛋白をコードするDNA配列に
融合されたSMCをコードするDNA配列を備えた発現ベクタ
ーを作成した。この方法において、アミノ末端における
非SMC蛋白とカルボキシ末端におけるSMC様ポリペプチド
とよりなる融合蛋白を作成した。この融合蛋白は前記ベ
クターから高収率で産生されうるが、これらは動物およ
びヒト治療においてｆ−met−SMCまたはSMC自身程好適
でない。その結果、最も有利な使用には、この融合蛋白
は非−SMC蛋白をこれらから除去する追加処理を必要と
する。この種の方法は公知であるが（たとえば米国特許
第4,425,437号、第4,338,397号および第4,366,246号参
照）、これらは直接的分泌および成熟の場合を除いて所
望のSMC様ポリペプチドの直接的発現ほど好適でない。
したがって、SMC様ポリペプチドの産生を向上させる第
２の試みにおいて、牛成長ホルモンおよび豚成長ホルモ
ンの発現レベルを向上させるのに有用であることが証明
されている削除技術を採用した〔たとえば、ヨーロッパ
特許出願第103,395号および第104,920号参照〕。これら
の方法を用いてSMC様ポリペプチドを産生し、アミノ末
端の欠失を特徴とする各種の改変SMCコード配列を作成
した。たとえば、ｆ−Met−△３−SMCおよびｆ−Met−
△６−SMCを産生する発現ベクターを作成した。これら
改変SMCの産生レベルはベクターpLc24muSMCoriからのｆ
−Met−SMCの産生レベルより若干高いものであったが、
この発現レベルはまだ極めて低いものである。
最後に、第３の方法としてプロモータとリボソーム結合
部位との各種組合せを用いて、SMCコード配列の発現を
制御した。しかしながら、いずれにせよ、これらの改変
はSMC産生の点でpLc24muSMCoriよりも貧弱であった。
SMC様ポリペプチドの産生をコード化する最適DNA配列の
選択 上記２種の方法はいずれも成功せず或いは多くの場合SM
C様ポリペプチドの大して好適でない産生をもたらした
ので、任意の蛋白の産生をコードする最適配列、より詳
細にはSMC様ポリペプチドの産生をコードする最適DNA配
列を選択しうるような方法を設計することに決定した。
この方法は、遺伝子のＮ−末端部分をコードするDNA配
列およびこの実施例に記載した特定具体例においては、
ｆ−Met−SMCをコードする遺伝子における暗黙の突然変
異が改良されたRNA二次構造を与え、したがって選択宿
主においてより高レベルの発現をもたらしうるという本
発明の仮説に基づいている。しかしながら、最適コード
配列を選択するには発現に際し存在するどの作用を決定
するかにつき分析せねばならない多くの可能な暗黙突然
変異が存在するため、これら配列に対する迅速かつ簡単
なスクリーニング法を設計する必要がある。このような
方法がなければ、クローンのスクリーニングは全く不可
能でないとしても面倒であり、その方法は失格である。lac Ｚとの遺伝子融合体を予め使用して、それらの遺伝
子生産物を分析せずに蛋白の産生を監視した（L.グアレ
ンテ等、セル、第20巻、第543−553頁（1980）;B.A.カ
ルチルホ等、J.バクテリオロジー、第158巻、第488−49
5頁（1984）〕。さらに、β−ガラクトシダーゼ産生
は、比色プレート分析によって容易に監視することがで
きる。したがって、このスクリーニング法を用いて本発
明による最適DNAコード化配列を選択することに決定し
た。勿論、好適ではないにせよ、他のスクリーニング法
も本発明の最適DNA配列を選択する際に用いうることを
了解すべきである。
本発明による方法のこの実施例にてSMCコード化配列の
二次構造を変化させるため、SMCのアミノ酸２−６をコ
ードする256種の可能なDNA配列からなる一連の合成リン
カを作成した。SMCのアミノ酸２−６は256種の異なる配
列によってコードされうるが、フエニルアラニンをコー
ドするTTYを含め全ての可能なロイシンコドン（SMC位置
５）を可能にする512倍の縮退リンカを使用した（第３
図）。勿論、本発明の方法にはそれより長いまたは短い
オリゴヌクレオチドも使用しうることを了解すべきであ
る。たとえば、SMCアミノ酸20までをコードするような
長い合成リンカを、SMCの発現に際しこれらの長い配列
の作用を決定するために有利に使用することができる。
これら一連の512−リンカの余分なDNA配列を第３図に示
す。
第３図を参照して、ここにはSMC産生におけるこれら余
分なDNA配列を用いる方法の１具体例が図示されてい
る。第３図に示したように、先ず最初にpLc24muSMCori
の165塩基対のEcoRI−BamHI断片をEcoRI−BamHI断片さ
れたpUC8にサブクローン化して、lacＺとSMCとの間のBa
mHI部位における相内融合を生ぜしめた。このベクター
をpUCmuSMC Aoriと呼ぶ（第３図）。pUC8を選択した理
由は、その小さい寸法およびlacZを中断するその独特な
制限部位並びにそれがlacI-宿主に使用され得るからで
ある。しかしながら、lacＺ遺伝子を有する他のプラス
ミドもこのスクリーニング法に用いうることを了解すべ
きである。
SMCコード配列をlacＺ遺伝子のプロモータ近接領域に挿
入して融合体を作成したので、このハイブリッド遺伝子
の発現はpUC8のlacプロモータの制御下にある。
リボソームは、lacリボソーム結合部位において、pUCmu
SMC Aoriでの翻訳を開始することができる。しかしなが
ら、この種の翻訳はpLc24muSMCoriから誘導されたmu断
片の枠内停止コドンにて急速に停止する。或いはこれら
リボソームはmuリボソーム結合部位で翻訳を開始して、
SMCからのアミノ末端部分とlacＺからのカルボキシ末端
部分とよりなる融合蛋白を生成することもできる。pUCm
uSMCoriのおけるSMC−β−ガラクトシダーゼ融合体は、
Ｎ−末端にSMCの35個のアミノ酸を含有した。
pUCmuSMCAoriにおける融合遺伝子は相内にあるが、イー
・コリJM83〔J.ビエイラおよびJ.メッシェング、ジー
ン、第19巻、第259−268頁（1982）〕をプラスミドでト
ランスフェクトしかつ形質転換宿主を５−ブロモ−４−
クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（Ｘ−GAL）を含有するLB−寒天板で培養した際、37℃
にて16時間後に白色コロニーのみが観察された。これら
のコロニーは40時間後に最終的に極めて淡い青色となっ
たが、16時間後におけるその白色はこれらが極めて少量
のSMC−β−gal融合蛋白しか産生しなかったことを示し
ている。勿論、この結果はpLc24muSMCoriにおける低発
現レベルという本発明者等の従前の観察と一致する。
次いで、プラスミドpUCmuSMC Aori中へ、SMCのアミノ酸
２−６をコードする512倍縮退合成DNAリンカ（AvaII−H
aeII断片）よりなる各保存物を、原プラスミドにおける
これらアミノ酸のコード配列に対する置換体として導入
した。リンカ結合体を回避するため、結合前にこれらリ
ンカを燐酸化しなかった。これらの配列をプラスミドpU
CmuSMC Aori中に導入し、その際各配列をmuリボソーム
結合部位とSMCアミノ酸１（pUCmuSMC Aoriの70bp EcoRI
−AvaII断片）とをコードする断片およびSMCのアミノ酸
７−32をコードする断片（pUCmuSMC Aoriの71bp HaeII
−BamHI断片）と結合させ、次いで得られたEcoRI−BamH
I組合せ断片をEcoRI−BamHI制限pUCmuSMC Aoriに導入し
た（第３図参照）。
上記プラスミドの混合体で形質転換させたイー・コリJM
83の5000個のコロニーをＸ−GALを含有するＬ−ブロス
板に塗抹した。得られたコロニーの約10％は、37℃にて
40時間後にpUC8muSMC Aoriよりも暗青色であった。次い
で、5000個のコロニーのうち14個（青色および白色の両
者）（イー・コリJM83（pUCmuSMC Al−14））を各種の
方法で分析した。すなわち、縮退領域のDNA配列決定、
β−ガラクトシダーゼの酵素活性、およびイー・コリC6
00におけるSMC発現〔T.マニアチス等、モレキュラ・ク
ローニング（コールド・スプニング・ハーバー・ラボラ
トリー）（1982）〕。これらの分析は各pUCmuSMC Al−1
8の165bp EcoRI−BamHI断片をpLc24muSMCori中に置換し
た後に行なった。これら後者のプラスミドを、第３図に
おいてpLc24muSMC1−18と呼ぶ。分析用に選択した14個
のコロニーのうち、10個は青色であり、４個はＸ−GAL
板上で白色であった。第Ｉ表はこれら各種の分析の結果
を示している。
第１表に示したように、pUC8muSMC A1−10を含有する青
色コロニーは、イー・コリJM83（pUC8muSMC Aori）より
も2.5〜８倍多いβ−ガラクトシダーゼ単位を生成し
た。これに対し、pUCmuSMC A11−14を含有する白色コロ
ニーは、検出しうるβ−ガラクトシダーゼを生成しなか
った。驚くことにpUC8muSMC A1−10のβ−ガラクトシダ
ーゼ生成は原プラスミドのそれよりも2.5〜８倍高かっ
たが、これらプラスミドからのEcoRI−BamHI断片をpLc2
4muSMCoriに挿入した際これらプラスミドはイー・コリH
B101において原プラスミドにおけるよりも23〜46倍多い
SMC活性を与えた。さらに、所定の融合体に対するβ−
ガラクトシダーゼ単位とPL制御下における対応の発現に
対するSMCのマイクログラムとの間には明らかな特異的
相関関係が存在しなかった。しかしながら、Ｘ−GAL板
におけるこれらコロニーの青色／白色の差は、SMCの高
度発現をコードするDNA配列の選択を簡単に可能にし
た。したがって、この方法を一般的に使用して、任意所
望の真核もしくは原核ポリペプチドの産生につき最適な
DNA配列を選択することができる。
特定理論に拘束されるものでないが、本発明による縮退
DNA配列により示される発現レベルの差はSMCのＮ−末端
アミノ酸をコードするヌクレオチドのRNA二次構造に関
連すると思われる。たとえば、本発明による結果は、ス
レオニン−ロイシンに対するコドン（ACN−CTN）により
形成される可能なCCC（SMC位置４および５）がSMC合成
に対し特に悪影響があることを示している。ここで分析
した白色コロニーおよびpUCmuSMC Coriは全てpLc24muSM
Cにおけるリボソーム結合部位に対し水素結合を形成し
うるこの配列を特徴とする。
上記本発明の実施例においては、Ｎ−末端にSMCの35個
のアミノ酸を有する融合蛋白を産生するような所望の蛋
白−lacＺ融合体をコードするDNA配列を使用したが、融
合蛋白における２つの部分の相対的長さはこの方法にお
ける最も有効なスクリーニングにつき実験的に決定せね
ばならない。この実験結果は、この選択を可能にすると
考えられる幾つかのファクタを確認した。たとえば、リ
ボソーム結合部位の強度が重要である。muからのもので
なくtrpリボソーム結合部位を使用すると、SMCの35個の
アミノ酸を含有する融合体は青色コロニーを生成しなか
った。融合蛋白におけるβ−ガラクトシダーゼと選択蛋
白との相対的割合も重要である。たとえば、Ｎ−末端に
14個のみのSMCアミノ酸を有する癒合蛋白を生成した遺
伝子融合体は、青色／白色の選択を可能にしなかった。
この場合、融合蛋白のβ−ガラクトシダーゼ活性が高過
ぎて、最適Ｎ−末端コード配列の検出を可能にしなかっ
たことが明らかである。最後に、検出系の感度も重要で
ある。このスクリーニング法で有用なβ−ガラクトシダ
ーゼ活性範囲は、原pUC8により生成されるβ−ガラクト
シダーゼレベルの１〜８％であることを確認した。これ
らファクタ並びに上記のように同様に決定しうるファク
タを相応に考慮して、当業者は適当な融合蛋白並びにこ
こに説明した方法によるスクリーニング分析を本発明の
範囲を逸脱することなく選択することができる。
上記実施例で産生された特定のSMC様ポリペプチドはｆ
−Met−SMCであるが、各種の可能な手段によってこのSM
Cからｆ−Metを除去しうることも了解すべきである。
本発明の方法により産生されるSMC様ポリペプチドは、
常法を用いて医薬上有用な組成物に配合することができ
る。これらの組成物は、所望の組織成長刺戟を行なうの
に医薬上有効量のSMC様ポリペプチドと、好ましくは医
薬上許容しうるキャリヤとからなっている。適するキャ
リヤは周知されている。上記したように、これら組成物
は組織成長を刺戟する方法、並びに矮小発育症，筋肉ア
トロピー，骨折，外傷あるいは組織に対するその他の傷
を治療するのに有用である。
ここに説明した方法で作成された微生物および組換DNA
分子は、1985年３月23日付けで西ドイツ、ゲッチンゲン
在、ドイッチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガ
ニスメンの培養物寄託機関に寄託して、SMC−１およびS
MC−２として同定された培養物により例示される： SMC−1:イー・コリHB101（pcI857） （pLc24muSMCori） SMC−2:イー・コリHB101（pcI857） （pLc24muSMC8） これらの培養物はそれぞれDSM3276および3277の受託番
号が付与された。
以上、本発明を多くの実施例につき説明したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および構成を利用する他
の実施例を提供しうることが了解されよう。したがっ
て、本発明の範囲は、例示した上記特定実施例のみに限
定されないことが了解されよう。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】所望のポリペプチドをコードするDNA配列
    を特徴とする組換えDNA分子により形質転換された単細
    胞宿主における所望のポリペプチドの産生を向上させる
    方法において、前記DNA配列は、前記組換えDNA分子中の
    発現制御配列に作用結合され、前記方法は、容易に分析
    可能なポリペプチドのＮ−末端部分をコード化するDNA
    配列を所望のポリペプチドのＮ−末端部分をコード化す
    る一連の縮重DNA配列で置換し、この置換は分析可能性
    に実質的に影響を与えず；発現制御配列に作用結合した
    一連の得られたハイブリッドDNA配列を形質転換された
    単細胞宿主中で発現させ；容易に分析し得るポリペプチ
    ドの最適産生を可能にする特定ハイブリッドDNA配列を
    選択し；かつ所望ポリペプチドのＮ−末端部分を、所望
    ポリペプチドをコードするDNA配列の残部と共にコード
    するこれらの選択したDNA配列を前記ポリペプチドの発
    現に使用する；これら諸工程からなることを特徴とする
    所望ポリペプチドの産生を向上する方法。
  2. 【請求項２】容易に分析し得るポリペプチドが、β−ガ
    ラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ及び薬剤耐性標識よ
    りなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第
    １項記載の方法。
  3. 【請求項３】所望のポリペプチドが、インタフェロン、
    インタロイキン及びその他のリンホキン、血液因子、酵
    素、ウイルス抗原、SMC、成長ホルモン及びその他のホ
    ルモン並びに動物及びヒト起源のその他のポリペプチド
    よりなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲
    第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】発現制御配列が、lac系、trp系、tac系、t
    rc系、ファージλの主オペレータ及びプロモータ領域、
    fdコート蛋白の制御領域、SV40の早期及び後期プロモー
    タ、ポリオーマ、アデノウイルス及び猿ウイルスから誘
    導されるプロモータ、並びに酵母糖分解酵素、α−接合
    因子及び酸ホスファターゼのプロモータよりなる群から
    選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】単細胞宿主が、イー・コリ、シュードモナ
    ス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、その他の真菌
    類の菌株、培養中の動物細胞及び植物細胞よりなる群か
    ら選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の
    方法。
  6. 【請求項６】前記所望のポリペプチドが、pLC24muSMC1
    〜pLC24muSMC10のDNA挿入物から選択されるDNA配列によ
    り発現のためにコードされるSMC様ポリペプチドを特徴
    とする請求の範囲第１項記載の方法。
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