CN1034588C - 人促生长因子c的改进生产方法 - Google Patents

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Abstract

一种用来选择DNA片段的方法，转化有这些DNA片段的宿主可使多肽生产获得最佳效果。这些DNA片段可储存有各种人和动物蛋白质的密码，并可使这些蛋白质在宿主细胞中表现出高效表达。在本发明的优选实施方案中，选择出具有生产人SMC最佳效果的DNA片段，用来表达这种生长促进因子。

Description

人促生长因子C的改进生产方法
本发明涉及一种确定DNA片段的方法，该DNA片断对转化这些DNA片段的宿主生产所需蛋白质或多肽为最适。本发明特别涉及到确定对生产人促生长因子C(“SMC”)为最适的并经过修饰的DNA片段。本发明还涉及到以这些DNA片段为特征的重组DNA分子和宿主以及使用这些DNA片段、重组DNA分子和宿主来提高人促生长因子C或来源于其核和原核生物的其它蛋白质的生产方法。
人促生长因子C是一种类似于胰岛素的生长因子，在垂体分泌生长激素后，它是激发组织生长的关键蛋白质。
人促生长因子C的氨基酸顺序是由E.Rinderknecht和R.E.Humble在J.Biol.Chem.，253，pp.2769-76(1978)上报道。它是由一条含有70个氨基酸的单链多肽经3个二硫键联结而成。计算出的分子量为7649。促生长因子C的结构与胰岛素前体很相似，例如，促生长因子C第1-29个氨基酸相当于胰岛素B链，第42-62个氨基酸相当于胶岛素A链。然而，促生长因子C中的联结链却与胰岛素前体的C肽链不相似，促生长因子C还有1个在胰岛素前体中不存在的位于C端的8肽。
促生长因子C在体外表现出强烈的生长促进作用，如它能促进DNA、RNA、蛋白质和糖蛋白的合成〔E.Rinderknechtand.R.E.Humble，Proc.Natl.Acad.Sci USA，73，pp.2365-69(1976)；B.Morell and E.R.Froesch，Eur.J.Clin.Invest.，3，pp.119-123(1973)；E.R.Froesch et al.，Adv.Mental.Disord.，8，pp.211-35(1975)；A.E.Zingg and  E.R.Froesch，Diabetologia，9，pp.472-76(1973)；E.R.Froesch et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，pp.2904-08(1976)〕。它还能促进鸟氨酸脱羧酶和细胞增殖〔B.Morrel and E.R.Froesch，supra；G.K.Haselbacherand R.E.Humble，J.Cell. Physiol.，88，pp.239-46(1976)〕。在生物体内，促生长因子C有促进因垂体切除而造成的生长激素缺乏症的老鼠生长的作用。〔E.Schoenle.et al.，Nature.296，pp.252-53(1982)〕
象生长激素一样，促生长因子C也有一定程度的物种特异性。然而，从一种生物提出的促生长因子C对在进化地位较低的种类可以具有生物学活性，例如，人们相信人促生长因子C在促进牛、猪和鸡的生长中有一定的作用。对实验动物，促生长因子C表现出来的促进生长作用与天然人生长激素的作用相同。但是，人们认为促生长因子C优于人生长激素，因为促生长因子C是生长反应中的中枢调节因子。因此，同生长激素相比，促生长因子C是生长的更加直接的调节因子。
促生长因子C除了可以治疗某些形式的生长失调如侏儒症、肌肉萎缩外，还可用于刺激特殊部位的组织生长，如伤口愈合、组织损伤和骨折的愈合。
然而，由于促生长因子C只能从人类血液中提取，得到的数量很少，它作为组织生长促进因子在医学上的可能应用受到很大限制。因而，需要用其它方法来制取具有商业和医用价值的足够多的促生长因子C。
一种方法是：利用重组DNA技术，将编码促生长因子C的DNA片段转化到宿主中，由宿主来生产促生长因子C。然而，由于转化后的各种大肠杆菌宿主的促生长因子C表达产量很低，从经济上考虑无法进行商业生产。
本发明对上述问题的解决方法是：用一种方法来确定这样的DNA片段，该片段对用这些DNA片段转化的宿主生产促生长因子C或其它所需原核、真核生物蛋白质或多肽为最适。经过这个方法选择出来的经过修饰的DNA片段表达时编码这些蛋白质。具体在本发明优选实施方案为促生长因子C，并且可在各种宿主中进行有效的高水平生产。因此，借助于本发明的方法，人类有可能首次得到具有促生长因子C的促进和调节生长作用的多肽，并且其数量足以供应医学应用所需。
以下的描述将说明，按本发明的优选实施方案，本发明的新DNA片段和重组DNA分子能够在合适的宿主内生产出大量的促生长因子C或类似于它的多肽。由此获得的多肽在人、牛、猪和鸡体内具有广泛的促进和调节生长的作用。
还可看到，本发明的一个基本要求是计设一个方法来确定在促生长因子C、其它所需原核或真核生物蛋白及多肽的生产中具有最佳效果的DNA片段。另一基本要求是关于能够增加这些蛋白质特别是促生长因子C或其类似多肽产量的各种新DNA片段、重组DNA分子和宿主。
大概地讲，本发明之对在用编码所需蛋白或多肽的DNA片段所转化的宿主中生产所需真核或原核生物蛋白或多肽的改进方法包括下列步骤：将编码一种易分析蛋白质或多肽之N末端的一部分的DNA片段，用编码所需原核或真核生物蛋白质或多肽N末端一部分的DNA片段的简并系列来取代；使得到的一系列杂种DNA片段与合适的表达控制片段联结，在适宜的宿主内表达；选择出使易分析蛋白质或多肽生产达到最佳效果的杂种DNA片段，并且应用那些所选择出的杂种DNA序列，其在所需多肽或蛋白的表达中编码所需多肽或蛋白的N末端部分。该方法使所需蛋白或多肽的生产达到最适。
图1表明了如何制备编码f-Met-SMC(甲酰甲硫氨酸促生长因子C，以下用SMC代表促生长因子C)的合成DNA片段和如何制备pLc24-muSMCori质粒的简要轮廓，pLc24muSMCori′质粒含有的该DNA片段位于来自mu噬菌体和PL启动子的片段下游。
图2表示两个片段SMC A和SMC B的合成核苷酸顺序(都是双链)，这两个片段在本发明的一个方法实例中用于制备编码f-Met-SMC的DNA片段。图2还表明了片段SMC A和SMCB的氨基酸顺序和1-11、X、Y和z等用以制备这两个片段所需的各个多聚核苷酸顺序。
图3表示一个制备质粒pUCmuSMC Aori，pUCmuSMCA1-18和pLC24muSMC1-18的简单轮廓。图3中部表示的512次简并合成连接子的顺序中，“N”代表所有4种可能的碱基，“P”代表嘌呤，“Y”代表“嘧啶”。
下面，对本发明的详细说明将有助于对本发明的充分理解。
在说明中，使用了以下术语：
核苷酸：DNA或RNA的单体，由糖分子(戊糖)、磷酸分子和一含氮杂环碱基组成。碱基与糖苷碳(戊糖的1′碳)相连，形成的结合物叫核苷。每一核苷酸的性质取决于其所含有的碱基。DNA中的4个碱基为腺嘌呤(“A”)、鸟嘌呤(“G”)、胞嘧啶(“C”)和胸腺嘧啶(“T”)，RNA中的4个碱基为A、G、C和尿嘧啶(“U”)。
DNA片段核苷酸的线性排列，各核苷酸之间是通过磷酸二酯键将相邻二个戊糖分子的3′碳和5′碳联结而成。
密码子  含有三个核苷酸的DNA片段(三联体)，通过RNA编码一个氨基酸，转译起始信号或转译终止信号。
基因  一段DNA片段，它通过它的模板即mRNA编码出代表特定多肽的氨基酸序列。
转录  从基因形成mRNA的过程。
转译  从mRNA形成多肽链的过程。
表达  从一DNA片段或基因到形成一多肽的过程，它是转录和转译的综合。
质粒  非染色体的双股DNA片段，它含有一个完整的复制子，由于复制子的存在，质粒能在宿主细胞中被复制。当一个质粒放置在单细胞生物个体中后，此种个体的特性就会由于质粒中的DNA而发生变化即被转化。例如，带有抗四环素基因的质粒可使本来不具抗四环素性质的细胞变得对四环素有抗性。被质粒转化的细胞叫“转化体”。
噬菌体  细菌病毒，它们中的很多种类是由DNA片段外包以蛋白质外壳组成。
无性繁殖载体  一个质粒、噬菌体DNA或其它DNA片段，它们能在宿主细胞内复制，而且还具有一个或数个内切核酸酶识别位点，在此类位点上，这些DNA片段可以被有控制地切开而不丧失其基本生物学功能，如复制、外壳蛋白质形成、启动子或结合位点的丧失。这些DNA片段还具有适于确定已经被转化的细胞的标记物，如对四环素和氨苄青霉素的抗性。
克隆化  用无性繁殖从单个个体或DNA片段获得其群体的过程。
重组DNA分子或杂种DNA。来自不同基因组的DNA片段头尾互联形成的分子，它能感染一些宿主细胞并在其中保存下去。
表达控制片段  一段核苷酸顺序，当它与某些基因经人工操作接合后，能够控制和调节这些基因的表达。其包括有：lac、try、tac、trc系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白的控制区域，SV40早期和晚期启动子，从多形瘤、腺病毒、猿病毒得到的启动子，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子如Pho5，酵母α-配对因子的启动子，还有其它已知的可用于控制原核或真核细胞、它们的病毒和其复合体的基因表达的核苷酸片段
SMC促生长因子C
类似SMC的多肽  能够表现出SMC对生长的促进和调节作用的多肽。这样的多肽可以是在成熟SMC第一个甘氨酸上连结一个N端蛋氨酸或其它肽而获得的产物。它还可以是在第59个氨基酸位置上用苏氨酸代替甲硫氨酸后的产物。类似SMC多肽也可以用缩短或增加成熟SMC氨基酸序列的方法来获得。
本发明含有几个方面的内容。第一、本发明涉及到改进任何原核、真核生物蛋白质或多肽生产的方法，这些蛋白质或多肽是由转化有编码这些蛋白质或多肽表达的DNA片段的宿主细胞生产的。第二、本发明涉及到选择DNA片段的方法，这些DNA片段能使“第一”方面中蛋白质或多肽的生产达到最佳结果。第三，本发明涉及到“第二”方面中选择出的DNA片段和利用它们来产生由它们编码的蛋白质或多肽。最后，本发明的一个优选实施方案中，涉及到编码类似SMC多肽的DNA片段，选择这些DNA片段的方法和把这些DNA片段转化到宿主中来获得最佳生产SMC的效果。
大量的宿主-表达载体复合体被用来表达本发明的杂种DNA片段和选择出来用以获得最佳生产所需真核和原核生物蛋白质或多肽效果的DNA片段。例如，可使用的表达载体可以是染色体、非染色体节段，合成DNA片段，如UV40的各种已知衍生物，已知的细菌质粒，象从大肠杆菌获得的质粒ColEl，pCRl，pBR322，pMB9和它们的衍生物，适应宿主范围广的质粒如RP4，噬菌体DNA如NM989等λ噬菌体的各种衍生物，和其它的DNA噬菌体如M13和丝状单股DNA噬菌体，酶母中用的载体如2μ质粒，在真核细胞和动物细胞中使用的载体，如含有来自SV40的DNA片段的载体，质粒和噬菌体DNA结合而成的载体，如经过修饰后能使用噬菌体DNA及其衍生物的质粒。
上述所举的表达载体中，有些载体能使克隆化的DNA片段在真核宿主如动物和人细胞中得到表达。〔如，P.J.Southern andP.Berg，J.Mol.Appl.Genet，1，pp.327-41(1982)；S.Subramanietal.，Mol.Cell.Biol.，1，pp.854-64(1981)；R.J.Kaufmann andP.A.Sharp，“Amplification and Expression ofSequences Cotransfected With A Modular Dihydr-ofolate Reductase Complementary DNA Gene”，J.Mol.Biol.，159，pp.601-21(1982)；R.J.Kaufmann and P.A. Sharp，“Constructionof a Molecular Dihydrofolate Reductase CDNAGene：Analysis of Signals Utilized for EfficientExpression”Mol.Cell.Biol.，2(11)，pp.1304-19(1982)；S.I.Scahill et al，“ExpressionAnd Characterization of The Product of A HumanImmune Interferon DNA Gene In Chinese HamsterOvary Cells”，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，80，pp.4654-59(1983)；G.Urlaub andL.A.CHasin，proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，pp.4216-20(1980)。
这类表达载体的特征，在于至少具有一个表达控制片段，它与特定DNA片段经人工操作结合以控制和调节克隆化的DNA片段的表达。可使用的表达控制片段的例子有：lac、trp.、tac、trc系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白的控制区域，酵母糖酵解启动子如3-磷酸甘油酸激酶，酵母酸性磷酸酶的启动子，象Pho5，酵母α-配对因子的启动子，来自多形瘤、腺病毒和猿病毒的启动子如SV40的早期和晚期启动子，和其它可用来控制原核、真核细胞和它们病毒及复合体的基因表达的已知序列。
可利用的表达宿主包括已知的各种原核和真核生物宿主，如大肠杆菌菌株HB101、X1776、X2282、DHI(λ)和MRCl，假单孢菌属，杆菌属如枯草杆菌，链霉菌属、酵母及其它真菌，动物细胞如COS细胞和CHO细胞，组织培养出的人细胞和植物细胞。
当然，在表达本发明的DNA片段或生产本发明的多肽时，各种宿主-表达载体复合体表现出的效率是不同的。然而，本专业领域的技术人员在考虑了此处列出的原则后，可以选择出一特定宿主-表达载体复合体，而又不离开本发明的范围。如，此种选择应基于众多因子的综合作用，这些因子可以是：宿主和载体的亲和性；DNA片段编码成的蛋白质对宿主的毒性；所需蛋白质的收集难易程度；DNA片段的表达特性和与之相连的表达控制片段；生物学安全性；费用；人类所需蛋白质表达后的必要修饰如折叠、构形等。
进一步讲，每一个表达载体都有很多位点可用以插进本发明的DNA片段。这些位点通常由切割这些片段的限制性核酸内切酶而定名，本专业领域的技术人员对这些位点是很熟悉的。可以理解，本发明中所用的表达载体并不必需一个限制性核酸内切酶作用位点来插入选定的DNA片段，载体可用很多方法连到DNA片段上。表达载体，尤其是其插入经过选择的DNA片段的位点和与表达控制片段的人工连结，是由众多因子决定的。如，特定限制内切酶可作用的位点数目；所要表达的蛋白的大小，所需蛋白质对宿主细胞蛋白水解酶的抵抗力；对表达出的蛋白质的污染或其与宿主蛋白质在提纯时的可分离程度；表达特性如启动和终止密码子相对于载体片段的位置；以及其它本专业领域技术人员应考虑的问题。载体的造择和DNA片段插入位点是由这些因子的综合作用来决定的，具体的选择因条件而异。
本发明也可用编码易分析蛋白质或多肽的各种DNA片段，例如，在本发明的优选实施方案中，我们使用了β-半乳糖苷酶，因为可以很容易地用广泛使用的比色板分析法来监测该蛋白的生产。我们也可利用其它物质，如半乳糖激酶；或抗药性基因如抗氨苄青霉素的基因。
本发明的方法和利用本方法选择出的及其中所用的DNA片段可用于任何原核、真核生物蛋白质或多肽，如人和动物的淋巴因子，包括干扰素、白细胞介素、TNFs；人和动物的激素如生长激素、胰岛素；人和动物血液因子，包括第八因子和tPA；酶、抗原和有关的蛋白质和多肽。在我们的优选实施方案中，我们使用本发明的方法来提高类似SMC多肽的生产。
以下例证将有助于对本发明的深入了解。应该知道，这些例证仅仅是说明性的，而不应看为本发明任何具体实施方案的限制条件。
在图1中，我们简要描述了制备重组DNA分子(pLc24muSMCori)方法的一个优选实施方案，其特征在于，这种重组DNA分子由两段DNA片段连结而成，一段编码人f-Met-SMC，另一段DNA片段来目mu噬菌体并从mu噬菌体那里获得了一个ShineDalgarno片段，连结而成的DNA片段再与来自λ噬菌体的PL启动子联结。
为了制备pLc24muSMCori，我们用报道过的人SMC的氨基酸序列首先合成数目为14的多聚脱氧核苷酸(见图1、2，1-11、X、Y、Z片段)〔Rinderknecht andHumble，supra；D.G.Klapper et al.，Endocrinol.，112，pp.2215-17(1983)〕。合成中使用固相磷酸三酯法〔H.Ito et al.，NucleicAcids Res.，10，pp.1755-69(1982)〕。低聚物去保护后，我们在葡聚糖凝胶G-50柱上用凝胶过滤法再进行脱盐处理，并用含有尿素的变性聚丙烯酰胺制备所用凝胶板经电泳提纯〔T.Maniatis et al.，Biochem.，14，pp.3787-94(1975)〕。用紫外线显影确定条带，再用电洗脱的方法从凝胶切片中分离出低聚脱氧核苷酸，通过T4多核苷酸激酶使提纯过的低聚脱氧核苷酸磷酸化，用15％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶电泳再提纯，经电洗脱回收DNA〔T.Maniatiset al.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory(1982)〕。
我们得到的数目为14的低聚脱氧核苷酸的碱基变动范围为13-37个。
在这些合成中，我们考虑了密码子在大肠杆菌高效表达基因中〔R.Grantham et al.，Nucleic AcidsRes.，8，pp.1983-92(1980)〕和在大肠杆菌tRNA丰盛度〔T.Ikemura，J.Mol.Biol.，151，pp.389-409(1981)〕中的应用。在我们制备出的低聚核苷酸片段上的不同位置上，具有很多核酸内切酶易于识别的位点。
我们再把片段1-4、X、Y和z，和片段5-11连接起来，用Klenow多聚酶延长，来形成二个复合DNA片段：含98个碱基对的平头片段(SMC A)，它储存有SMC N端部分的密码；含138个碱基对的平头片段B(SMC B)，它储存有SMC剩余部分的密码〔J.R.Rossi et al.， J.Biol.Chem.，257，pp.9226-29(1982)〕(图1、2)。
我们制备片段SMC A的方法如下：片段1-4、X、Y、Z各200pmol在20μl退火缓冲液(50mM Tris-HCl7.6，10mM MgCl2)中，加热至95℃，将混合液缓慢冷却至4℃，再加入二硫苏糖醇、ATP和T4 DNA连结酶至最后浓度分别为5mM、70μM和20μ/ml。混合液在4℃保持10小时，乙醇沉淀后，将混合液加到8％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上，洗脱出含有77个和78个碱基对的链。这两种DNA链各取20pmol混合后加入到5μl退火缓冲液中，加热至95℃，缓慢冷却至15℃，然后加入二硫苏糖醇、dNTPs和DNA多聚酶的Klenow碎片至浓度分别为5mM、250μM和2单位，室温下放置30分钟。用上述方法提纯反应产物，分离出7pmol的含98个碱基对的SMC A。5-11片段各取200pmole，我们用几乎与上同样的方法从它们当中制备出20pmole含有138个碱基对的SMC B。
把2μg复制型DNA用BamHI限制内切，制备出平头M13mp8运载体(为了插入片段A)，再用BamHI和HindIII限制内切(为了插入片段B)，在制备出的平头M13mp8运载体中插入片段A和B，用1单位大肠杆菌DNA多聚酶(Klenow碎片)在四种三磷酸脱氧核苷(dNTPs)存在下修复交错切头，乙醇沉淀，再用牛小肠磷酸酶(10mM Tris-HCl pH9.2，0.2mM EDTA中含有20个单位)进行5′脱磷酸处理30分钟〔J.Messing，Methods in Engymology，101，pp.20-78(1983)〕。把20ng线性载体和0.1pmole DNA片段加到10μl连结缓冲液和40单位T4 DNA多聚酶中，15℃下反应24小时以充分连结。
当片段A与平头M13 mp8载体连合后，我们就得到了重组噬菌体mp8SMCA，其中SMC片段末端的BamHI位点重新形成，并形成了一个NcoI位点(GGATCCATGG)(图1)。当片段B与双平头M13mp8载体连合后，在得到的重组噬菌体mp8SMC B中，SMC片段末端的BamHI和HindIII位点也都重新形成(图1)。
我们进一步把这两种重组噬菌体转化到JM101大肠杆菌中〔J.Messing and J.Vieira，Gene，19，pp.269-76(1982)〕，并把转化的宿主移到含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃半乳糖苷(X-GAL)的L-肉汤培养平板上培养，从转化有mp8SMC A和mp8SMC B的JM101大肠杆菌形成的24个白色噬菌斑中，我们提纯出噬菌体DNA，用双脱氧链末端终止法分析这种DNA顺序〔A.J.H.Smith，Methods in Enzymol.，65，pp.560-80(1980)〕。我们然后从mp8SMCA和mp8SMCB中分别制各出细胞内复制型DNA，用Ncol/BamHI处理前者的产物而用BamHI/HindIII处理后者产物，再用凝胶电泳分离出相应的EMC碎片(图1)。
将来目mu噬菌体ner基因的一个含67个碱基对的片段(B.Allet赠)与SMC A和SMC B连结。这个片段是由1043-96核苷酸组成〔H.Priess et al.，Mol.Gen.Genet.，186，pp.315-21(1982)，图4〕，前端为1个EcoRI核酸内切酶限制内切位点，后端为1个NcoI位点(CCATGG)，这个Ncol位点内部的ATG形成一个转译起始密码子。这个片段还含有一个几近理想化的核糖体结合位点〔J.Shine and L.Dalgarno，Nature，254，pp，34-38(1975)〕。由于连结的结果，我们可以分离出一个有303个碱基对的EcoRI-HindIII片段，它是由mu基因片段、SMC A和SMC B组成(图1)。连结时，mu片段的Ncol位点上的ATG起始密码子按正确的阅读框架与SNC A连结。
我们把这个片段引入预先用EcoRI和HindIII限制内切过的pLc24〔E.Remeut et al.，Gene，15，ppp.81-93(1981)〕来制出质粒pLc24muSMCori。这种质粒的特征在于，它具有SMC基因和它的受λ噬菌体PL启动子控制的启动密码子ATG。
我们把pLc24muSMCori和pcI857同时转化到HB101大肠杆菌中，pcI857是储存有对温度敏感的PL遏制子密码的pACYC184的一种衍生物〔E.Remaut et al，Gene，22，pp103-113，1983〕。因为这两种质粒带有不同的抗生素抑制基因，即，pLc24muSMCori有青霉素酶的，pcI857有抗卡那霉素的，因此正确联合转化的培养物可用含有50μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml卡那霉素的培养基选择出来。
从含有正确联合转化的HB101大肠杆菌(pcI857)(pLc24muSMCori)的培养平板上，取5ml培养物加到含有50μg/ml氨苄精霉素和40μg/ml卡那霉素的L-肉汤培养基中，在28℃下培养过夜。再将2ml过夜培养物加到预热为42℃的10mL-肉汤培养基中，在100ml三角瓶内，42℃下剧烈震荡2小时。
取1ml培养基的试样离心(A550＝20)，在50μlSDS-β-巯基乙醇细胞溶解缓冲液中100℃沸腾10分钟使之溶胞，然后分析类似SMC多肽的生产〔U.K.Laemmli，Nature，227，pp.680-85(1970)〕。用市场上所购分析盒通过放射免疫分析技术来分析SMC活性(NicholsInstitute Diagnostics)。分析盒的性能指标预先用纯化过的IGF-1(R.Humble赠)来核准。将SMC溶胞产物用分析缓冲液至少稀释20倍，凝胶电泳分析，重复分析一次。我们看到，用放射免疫技术分析，在标准细胞溶解条件下变性的人SMC，其反应性与天然激素相同。
分析表明，在温度诱导下，HB101大肠杆菌(pLc24muSMCori)(pcI857)表现出很小的SMC活性-放射免疫分析中为1.4μg/ml，数量少得连用蛋白质凝胶上的考马斯亮兰也检验不出。我们可以估计，此种转化宿主生产类似SMC多肽的水平不过是每个细胞几百个分子。
由于用pLc24muSMCori得到的类似SMC多肽产量很低，我们从而试图通过制备其它质粒来提高它的表达水平。
一种方法是：将储存有SMC密码的-DNA片段与储存有另一蛋白质的-DNA片段结合起来制成表达运载体。用这种方法，非SMC蛋白质的氨基末端与类似SMC多肽的羧基末部连结，形成一个联合蛋白质，尽管这样的联合蛋白质通过我们的运载体可获得很高的产量，但是对动物和人的医疗效果却不如f-met-SMC或SMC本身。从而，为了更好地利用，要对这样的联合蛋白质进行额外处理，来去掉其中的非SMC部分。尽管这样的设想是可行的(如美，美国第4,425,437、4,338,397和4,366,246号专利)，但除了在直接分泌和成熟的情况中外，同直接表达的类似SMC多肽相比，效果还是不理想。
另一种用来提高类似SMC多肽产量的方法是采用缺失策略，这种策略在增加牛生长激素和猪生长激素的表达水平中证明是有用的。如欧洲第103,395和104,920号专利申请。使用这些方法，我们制备各种经过修饰的SMC编码顺序，它们生产出的类似SMC多肽具有氨基末端缺失的特征，如我们制备出能生产f-Met-△3-SMC和f-Met-△6-SMC的表达运载体。尽管这些修饰过的SMC的产量稍高于运载体pLc24muSMCori生产f-Met-SMC的水平，但表达水平还是很低。
在第三个方法中，我们使用启动子和核糖体结合位点的各种结合体来控制我们所需的SMC编码顺序的表达。然而，它得出的结果比用pLcmu24SMCori生产SMC还要糟。
由于上述两种方法或者不成功，或者在很多情况下生产出效果不理想的类似SMC多肽类型，我们决心设计新的方法来选择最佳编码片段来生产任何的蛋白质，特别是选择最佳DNA编码片段来生产类似SMC多肽。
新的方法是基于如下的假说：编码基因N端部分的DNA片段(具体到本发明中为编码f-met-SMC的基因)中发生的同义突变可能改良RNA的二级结构，从而导致在宿主中的较高表达水平。然而，由于需要对很多可能发生的同义突变进行分析来确定它们对表达的影响，以选择出最优编码顺序，这就要求我们计设一个快速简捷的筛选方法，否则，克隆筛选将是徒劳无功。
使用与lacZ融合的基因来监测蛋白质生产在以前有过报道，但没有对基因产物进行分析〔L.Guarente et al.，Cell，20，pp.543-53(1980)；B.A.CCastilho et al.，J.Bacteriol.，158，pp.488-95(1984)〕，而且，β-半乳糖苷酶的生产可利用比色板分析法来很容易地监测。因此，我们决定利用这种筛选方法来选择最佳DNA编码顺序。应该注意，其它筛选方法，尽管效果差一点，还是可以用来选择供本发明所用的最佳DNA片段。
在本发明的示范性优选方案中，为了改变SMC编码顺序的二级结构，我们制备一系列合成连接子，储存有SMC2-6氨基酸密码的256个可能的DNA片段都包含在这些连接子中。尽管SMC2-6氨基酸可由256个不同DNA片段来编码，我们使用的是512次简并连接子来应用于所有可能的亮氨酸密码子(SMC第5部位)，包括编码苯基丙氨酸的TTY。当然，不同长度的低聚核苷酸可用于本发明的这种方法，如编码SMC1-20氨基酸的较长合成连接子可用来确定较长接头片段对SMC表达的影响。512-连接子系列中的重复DNA片段见图3。
在图3中，我们表现了在SMC生产中使用这些重复DNA片段的具体方法。如图3所示，我们首先将pLc24muSMCori的含165个碱基对的EcoRI-BamHI片段与经过EcoRI-BamHI内切过的pUC8整合，亚克隆化，通过lacZ和SMC在BamHI位点上按正确相位结合起来，即制成pUCmuSMCAori载体(图3)。我们之所以使用pUC8，是因为它体积小和具有一个独特的可将lacZ断开的限制内切位点，还因为它能够在lacI宿主中使用。载有lacZ基因的其它质粒也可在我们的筛选方法中使用。
因为SMC编码顺序是插到lacZ基因的邻近启动子的区域内，由此获得的杂种基因的表达是受pUC8 lac启动子的控制。
核糖体可在pUCmuSMCAori的lac核糖体结合位点上起始转译，然而，这种转译遇到相位正确的mu片段上的停止密码子就会很快停止，mu片段是从pLc24muSMCori衍生来的。核糖体可在mu核糖体结合位点上起始转译，来形成一个联合蛋白质，这个蛋白质是由SMC氨基末端和lacZ的羧基末端构成的。pUCmuSMCAori的SMC-β-半乳糖苷酶融合蛋白质在N末端含有SMC的35个氨基酸。
尽管pUCmuSMCAori中的融合基因相位正确，但是，当我们用它转染JM83大肠杆菌〔J.Vieira and J.Messing，Gene，19，pp.259-68(1982)〕，并用含有X-GAL的L-肉汤琼脂培养转化的宿主，37℃下培养16小时后，只出现白色菌落，40小时后菌落最终变成淡兰色。16.小时后出现的白色菌落表明，只生产出很少的SMC-β-半乳糖苷酶融合蛋白。这个结果与前面出现的pLc24muSMCori低表达水平相吻合。
然后，我们把一系列512次简并合成DNA连接子(AvaII-HaeII片段)逐个引入质粒pUCmuSMCAori，引入的连接子编码SMC2-6氨基酸，并用来取代质粒中原来的相应DNA片段。只是在引入前才将连接子磷酸化，以防止连接子多联体。把这些序列逐个与储存有mu核糖体结合位点-SMC第1氨基酸(pUCmuSMCAori中含70个碱基对的EcoRI-AvaII片段)密码的片段相连，再与储存有SMC7-32氨基酸(pUCmuSMCAori中含71个碱基对的HaeII-BamHI片段)密码的片段连结，然后把得到的EcoRI-BamHI组合片段插入到用EcoRI-BamHI限制内切过的pUCmuSMCAori中(图3)。
我们将5,000个用上述质粒混合物转化的JM83大肠杆菌菌落放在含有X-GAL的L-肉汤培养平板上，37℃下培养40小时后，大约有10％的菌落呈现出比pUC8muSMCAori更深的深兰色。在这5,000个菌落中(E.Coli JM83(pUCmnSMCA1-14))，选14个兰色或白色菌落，用多种方法分析：简并区域的DNA顺序分析；β-半乳糖苷酶活性；及把每个pUCmuSMC1-18的含165个碱基对的EcoRI-BamHI片段置换到pLc24muSMCori中后观察SMC在C600大肠杆菌〔T.Maniatis et al.，Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory)(1982)〕中的表达。最后得出的质粒在图3上表示为pLc24muSMC1-18。在选出供分析用的14个菌落中，在X-GAL平皿上10个为兰色，4个白色。表1列出了它们的各种分析结果：
                        表I
                                           pUC8  pL质粒
                2    3    4    5    6
                                           融合  μg/ml质粒             pro.   glu. thr. leu. cys    units    SMIO OD20β-gal*  溶胞物原始的2-6片段    CCA    GAA  ACC  CTG  TGC     0.4      1.4pUCmuSMCAori兰色菌落pUCmuSMCA    1   CCC    GAA  ACT  CTG  TGT     3.1      33
         2   CCT    GAA  ACT  TTG  TGC     2.6      45
         3   CCA    GAG  ACG  TTG  TGC     0.9      35
         4   CCA    GAG  ACG  TTG  TGT     0.9      43
         5   CCT    GAA  ACT  TTG  TGT     2.9      33
         6   CCT    GAG  ACG  TTG  TGT     1.2      58
         7   CCG    GAA  ACG  TTA  TGT     1.9      50
         8   CCG    GAA  ACA  TTG  TGT     1.2      65
         9   CCA    GLA  ACG  TTG  TGT     1.1      32
        10   CCT    GAG  ACT  CTA  TGT     2.3      42白色菌落pUCmuSMCA   11   CCC    GAA  ACC  CTC  TGT    ＜0.1    0.10
        12   CCT    GAA  ACC  CTC  TGT    ＜0.1    0.11
        13   CCG    GAA  ACC  CTC  TGT    ＜0.1    0.10
        14   CCA    GAA  ACC  CTC  TGT    ＜0.1    0.09*在β-半乳糖苷酶活性分析中，我们使用邻-硝苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)，具体方法见J.H.Miller，Experiments inmolecular Genetics(Cold Spring HarborLaboratories)(1972)。
如表1所示，含有pUC8muSMCA1-10的兰色菌落产生出的β-半乳糖苷酶比JM83大肠杆菌(pUC8muSMCAori)多2.5-8倍，然而，在含有pUCmuSMCA11-14的白色菌落中却检查不出β-半乳糖苷酶。令人惊奇的是，虽然pUC8muSMCA1-10的β-半乳糖苷酶的产量比其亲本质粒的β-半乳糖苷酶的产量高2.5-8倍，但是，如把这些质粒的EcoRI-BamHI片段插入到质粒pLc24mu SMCori中，这样获得的质粒在HB101大肠杆菌中生产出的SMC活性就可比亲本质粒高23-46倍。而且，融合时形成的β-半乳糖苷酶单位数与PL控制下相应表达的SMC μg数之间并无明显的特异性相关。然而，X-GAL培养基上的兰/白色菌落的差异却足以选择出能编码高SMC表达物的DNA片段，所以，这种方法可广泛用来选择生产拟制真核或原核生物多肽的最佳DNA片段。
抛开理论的局限，我们相信，各简并DNA片段表现出来的不同表达水平，是与RNA核苷酸链的二级结构有关，而正是这些RNA核苷酸链储存有SMC的N末端氨基酸密码。例如，苏氨酸-亮氨酸的密码子(ACN-CTN)(SMC上的4.5部位)可能形成的CCC对SMC合成特别有害。所有我们所分析过的白色菌落和pUCmuSMCori都具有一个片段，这个片段能与pLc24muSMC上的核糖体结合位点形成氢键。
虽然，在本发明上述的实施方案中，我们是使用了储存有我们所需蛋白质-lacZ融合体密码的DNA片段，这个片段生产出的融合蛋白质的N端部上有SMC的35个氨基酸，但是，组成融合蛋白质的二部分的相对长度却必须凭经验来确定以使我们的筛选方法获得最佳效果。我们的试验结果已经确定出与此有关的几个因子的作用，如，核糖体结合位点的长度具有重要意义。当使用的是trp核糖体结合位点而不是从mu中得到的核糖体结合位点，我们所得的含有SMC35个氨基酸的融合就不会形成兰色菌落。融合蛋白质中β-半乳糖苷酶的相对部位和选用的蛋白质亦具有重要意义，例如，融合基因生产出的融合蛋白质如在N端只有14个SMC氨基酸的话，就不会出现兰/白色菌落的选择作用，这种情况是因为融合蛋白质的β-半乳糖苷酶的活性高得足以使效果最佳的N端编码顺序显露不出来。最后，检查方法的敏感性也很重要。我们确认，可供筛选中使用的β-半乳糖苷酶活性范围只有原始pUC8的β-半乳糖苷酶生产水平的1-8％。
适当地考虑了这些因子的作用后，其它因子的作用也可用类似方法来确定，从而，本专业领域的技术人员就可以选择出适当的融合蛋白质，用上述方法分析来进行筛选，而又不离开本发明的涉及范围。
虽然上述说明性实施例中生成的具体类似SMC多肽是f-Met-SMC，但应该理解的是，从SMC上去除f-Met的方法却有很多。
本发明的方法所生产出的类似SMC多肽可用常规方法制备出供医学上使用的组合物。这些组合物包括：医用剂量的类似SMC多肽，它能促进相应组织生长；能被医疗对象接受的合适的载体。如前所述，该组合物可用于促进组织生长，并可用于治疗侏儒症、肌肉萎缩、骨折和组织损伤等。
用此处描述的方法制备的微生物和重组DNA分子以1985年3月23日储存在德意志微生物收集中心(DSM)的样品为准，并确定为SMC-1和SMC-2
SMC-1：E.coli HB101(pcI857)(pLc24muSMCori)
SMC-2：E.coli HB101(pcI857)(pLc24muSMC 8)
分别编号为DSM3,276和3,277。这些培养物也于1985年4月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC86-066和86-067。
尽管在这里披露了本发明的数种实施方案，很明显，我们的基础构思只要稍加改变就能产生其它的具体操作方法，同样可以达到本发明的目的。因此，有必要通过后附的权利要求而不是用前面的列举具体例证的方法来限定本发明的涉及范围。

Claims (23)

1.一种提高SMC在细菌或酵母宿主中的产生的方法，所说的宿主是用编码SMC并经人工操作与表达控制序列相连的DNA序列转化的，该方法包括下述步骤：
(a)用编码SMC N末端一部分的在SMC的3’区至起始密码子内具有简并突变的一系列DNA序列取代编码易分析多肽N末端一部分的DNA序列；
(b)在细菌或酵母宿主中表达得到的一系列经人工操作与表达控制序列相连的杂种DNA序列；
(c)选择使所说的易分析多肽的产生达到最佳效果的特定的杂种DNA序列；
(d)从步骤(c)中所选的杂种DNA序列中除去编码SMC N-末端部分的DNA序列；和
(e)用步骤(d)中除去的DNA序列之一取代一部分编码SMC N-末端3’区至起始密码子的DNA序列。
2.一种提高SMC在细菌或醇母宿主中的产生的方法，该方法包括下述步骤：
(a)制备一种包含编码易分析多肽的DNA序列和编码SMC的DNA序列的同相融合基因或其一部分，其中融合基因经人工操作与表达控制序列相连，并且其中编码SMC的DNA序列体现出针对所述细菌或醇母宿主密码子使用的偏倚；
(b)用编码SMC N-末端一部分的一系列合成DNA序列取代编码所述易分析多肽N-末端一部分的DNA序列，所述系列的每个成员在SMC的3’区至起始密码子内具有简并突变；
(c)在所说的宿主中表达得到的突变融合基因系列；
(d)选择使所说的易分析多肽的产生达到最佳效果的特定的突变融合基因；
(e)从步骤(d)中所选的每个突变融合基因中除去编码SMCN-末端部分的DNA序列；和
(f)用步骤(e)中除去的DNA序列之一取代一部分编码SMC N-末端3’区至起始密码子的DNA序列。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所说的SMC的3’区至起始密码子是跨越突变SMC的氨基酸2-6的区域。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述的易分析多肽选自β-半乳糖苷酶、半乳糖激酶和耐药标志物。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述的表达控制序列选自lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、SV40的早期和晚期启动子、来自多形瘤、腺病毒和猿病毒的启动子、以及酵母糖酵解酶、α-配对因子和酸性磷酸酶的启动子。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述的细菌或酵母宿主选自大肠杆菌、假单胞菌属、杆菌属和链霉菌属。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述的编码SMC的DNA序列选自如表I和图3所述的pLC 24muSMC1至pLC24muSMC10的DNA插入片段。
8.一种生产编码SMC的DNA序列的方法，该方法包括下述步骤：
(a)用编码SMC N-末端一部分的在SMC的3’区至起始密码子内具有简并突变的一系列DNA序列取代编码易分析多肽N-末端一部分的DNA序列；
(b)在细菌或酵母宿主中表达得到的一系列经人工操作与表达控制序列相连的杂种DNA序列；
(c)选择使所说的易分析多肽的产生达到最佳效果的特定的杂种DNA序列；
(d)从步骤(c)中所选的杂种DNA序列中除去编码SMC N-末端部分的DNA序列；和
(e)用步骤(d)中除去的DNA序列之一取代一部分编码SMC起始密码子的DNA序列。
9.一种生产编码SMC的DNA序列的方法，该方法包括下述步骤：
(a)制备一种包含编码易分析多肽的DNA序列和编码SMC的DNA序列的同相融合基因或其一部分，其中融合基因经人工操作与表达控制序列相连，并且其中编码SMC的DNA序列体现出针对所述细菌或酵母宿主密码子使用的偏倚；
(b)用编码SMC N-末端的一部分的一系列合成DNA序列取代编码易分析多肽N-末端一部分的DNA序列，所述系列的每个成员在SMC的3’区至起始密码子内具有简并突变；
(c)在所说的细菌或酵母宿主中表达得到的突变融合基因系列；
(d)选择使易分析多肽的产生达到最佳效果的特定的突变融合基因；
(e)从步骤(d)中所选的每个突变融合基因中除去编码SMCN-末端部分的DNA序列；和
(f)用步骤(e)中除去的DNA序列之一取代一部分编码SMC N-末端3’区至起始密码子的DNA序列。
10.根据权利要求8或9的方法，其中所说的SMC的3’区至起始密码子是跨越突变SMC的氨基酸2-6的区域。
11.根据权利要求8或9的方法，其中所述的易分析多肽选自β-半乳糖苷酶、半乳糖激酶和耐药标志物。
12.根据权利要求8或9的方法，其中所述的表达控制序列选自lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、SV40的早期和晚期启动子、来自多形瘤、腺病毒和猿病毒的启动子、以及酵母糖酵解酶、α-配对因子和酸性磷酸酶的启动子。
13.根据权利要求8或9的方法，其中所述的细菌或酵母宿主选自大肠杆菌、假单胞菌属、杆菌属和链霉菌属。
14.根据权利要求8或9的方法，其中所述的编码SMC的DNA序列选自如表I和图3所述的pLC 24muSMC1至pL24mu SMC10的DNA插入片段。
15.一种生产重组DNA分子的方法，该方法包括将用权利要求8或9所述的方法生产的编码SMC的DNA序列插入到克隆载体中的步骤。
16.根据权利要求15的方法，其中所说的DNA序列经人工操作与所述重组DNA分子中的表达控制序列相连。
17.根据权利要求16的方法，其中所说的表达控制序列选自lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、SV40的早期和晚期启动子、来自多形瘤、腺病毒和猿病毒的启动子、以及酵母糖酵解酶、α-配对因子和酸性磷酸酶的启动子。
18.根据权利要求15的方法，其中所说的编码SMC的重组DNA分子序列选自如表I和图3所述的pLC 24mu SMC1至pL24mu SMC10的DNA插入片段。
19.一种转化细菌或酵母宿主的方法，该方法包括将用权利要求15所述的方法生产的重组DNA分子引入到所说的宿主中的步骤。
20.根据权利要求19的方法，其中所说的宿主是大肠杆菌HB101(pCL857)(pLC24mu SMC8)，DSM3277，CCTCC No.86-067。
21.一种生产SMC的方法，其特征在于培养由用权利要求15所述的方法生产的重组DNA分子转化的细菌或酵母宿主的步骤。
22.根据权利要求21的方法，其中所述的细菌或酵母宿主选自大肠杆菌，假单胞菌属、杆菌属和链霉菌属。
23.根据权利要求22的方法，其中所述的宿主是大肠杆菌HB101(pCI857)(pLC24mu SMC8)，DSM3277，CCTCC No.86-067。
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