CN1138856C - 表皮生长因子工程菌及使用该菌制备表皮生长因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表皮生长因子工程菌及使用该菌制备表皮生长因子的方法，该工程菌为甲基营养型酵母细胞，它含有至少一个拷贝的能够编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列，其特征在于于所述的人表皮生长因子的基因序列的5’端连接一个a-因子前导肽，在该a-因子前导肽DNA序列前融合一个Kozak序列，然后再克隆到醇氧化酶启动子下游以构建成整合型的能表达单拷贝人表皮生长因子的序列。

Description

表皮生长因子工程菌及使用该菌制备表皮生长因子的方法

本发明涉及一种制备表皮生长因子过程中所使用的新型重组质粒，以及采用该质粒转化生成的遗传工程菌株，特别是涉及表皮生长因子(EGF)的改进的制备方法。

表皮生长因子是60年代发现的一种在鼠的颌下腺存在的只有53个氨基酸的多肽，具有广泛的刺激细胞增殖的作用。1975年从人尿中提取出类似物人表皮生长因子，其可抑制胃酸分泌故又称抑胃素。EGF可刺激多种细胞的增殖，主要是内皮和表皮细胞的增殖，因而有应用于角膜创伤、皮肤烧伤、胃肠溃疡治疗的可能性。重组人表皮生长因子已通过动物实验而开始用于上述疾病的临床实验。由于表皮生长因子作为一种脑肠肽而具有神经递质的作用及又发现有抑制肿瘤细胞增殖的作用(Harvey Bialy.Epidermal Growth Factor：Anti-Tumoral Too？.Bio/technology.September 1988；6：997)，其作用机制的研究加之可用于皮肤烧伤、角膜溃疡等临床应用的前景使EGF及其受体的研究成为近年来生物化学研究热点之一。

人表皮生长因子基因可用化学法合成，国内外均有在大肠杆菌系统(TakanoriOka，etal.，Synthesis and secretion of human epidermal growth factorby Escherichia coli.Biochemistry 1985；82：7212-7216)或者酵母系统表达成功的报道(Carlos George-Nascimento，et al.，Characterization ofrecombinant Human Epidermal Growth Factor produced in yeast.Biochemistry.1988；27：797-802)。

1984年美国Chiron公司料验室报道了应用α-因子启动子和前导肽在啤酒酵母体系中表达可分泌性EGF，表达产量为4.6mg/L(Anthony J.Brake，et al，.α-Factor-directed synthesis and secrection of mature foreign protein inSaccharomyces cerevisiae.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984；814642-4646)。

1991年Philips Research Center，Bartlesville，OK，74004，USA报道应用AOX启动子，19个拷贝的整和型表达质粒在Yeast Pichia pastoris系统中分泌性表达了鼠EGF，表达量为450mg/L(Jeffrey J.Clare.et al.，Production of mouthepidermal growth factor in yeast：high-level secretion using Pichia pastorisstrains containing  mμltiple gene copies.Gene 105：205-212)。

1992年美国专利5,102,789披露一种利用甲基营养型酵母(Yeast Pichiapastoris)体系来制备人表皮生长因子。文中报道的人表皮生长因子的表达产量可达600mg/L。

为克服现有技术的不足、本发明的目的在于提供一种新型的制备表皮生长因子中所使用的新型质粒以及采用该质粒制成的遗传工程菌株，本发明的另一目的在于采用所述的遗传工程菌株使用本发明之改进方法，提高表达产量，有利开发应用。

本发明人人工合成了编码51个氨基酸的人表皮生长因子(hEGF)基因，在应用α-因子启动子获得EGF表达基础上，又使用强启动子-乙醇脱氢酶(ADH)启动子在啤酒酵母体系中表达了人表皮生长因子，后为获得更高效表达又选用甲基营养型酵母(Yeast Pichia pastoris)体系，其中，所述51个氨基酸的人表皮生长因子基因的序列如下：1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11  12    13   14   15Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly  Tyr  Cys  LeuAAC  TCC  GAC  TCC  GAA  TGT  CCA  TTG  TCC  CAC  GAC  GGT  TAC  TGT  TTGTTG  AGG  CTG  AGG  CTT  ACA  GGT  AAC  AGG  GTG  CTG  CCA  ATG  ACA  AAC16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu  Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  AlaCAC  GAC  GGT  GTT  TGT  ATG  TAC  ATC  GAA  GCT  TTG  GAC  AAG  TAC  GCCGTG  CTG  CCA  CAA  ACA  TAC  ATG  TAG  CTT  CGA  AAC  CTG  TTC  ATG  CGG31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45Cys  Asp  Cys  Val  Val  Gly  Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Glu  Tyr  ArgTGT  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT  TAC  ATC  GGT  GAA  AGA  TGT  CAA  TAC  AGAACA  TTG  ACA  CAA  CAA  CCA  ATG  TAG  CCA  CTT  TCT  ACA  GTT  ATG  TCT46   47   48   49   50   51Asp  Leu  Lys  Trp  Trp  Glu stop code 1-2，EcoRIGAC  TTG  AAG  TGG  TGG  GAA    TAA  TGA    GAATTCCTG  AAC  TTC  ACC  ACC  ATT    ATT  ACT    CTTAAG

甲基营养型酵母是一种易于高密度培养，高效表达外源基因且表达蛋白糖基化类似哺乳动物细胞的新型基因工程宿主菌，极有开发应用前景。

本发明包括按酵母嗜用密码子化学合成人表皮生长因子基因，将化学合成的人表皮生长因子基因与编码酵母α-因子前导肽的DNA片段融合，经在α因子前导肽前加入Kozak顺序，再克隆到醇氧化酶启动子下游以构建成整合型单拷贝EGF表达载体；

以此载体为基础又构建了整合型三拷贝EGF的表达载体；

该载体转化甲基营养型酵母株GS115后筛选出整合型Mut^s基因型菌株(GS115-3EGF)；

高密度培养及诱导表达后该株可分泌人表皮生长因子。

另外，本发明的化学合成的人表皮生长因子基因含有51个氨基酸序列，在第51个氨基酸的末端连接有两个终止子TAA和TGA。这种设计有利于人表皮生长因子基因表达产物的分离纯化和人表皮生长因子基因转录的终止。而Kozak顺序的加入为高效表达人表皮生长因子提供了基础。

应用AOX启动子，含3个拷贝的α-因子前导肽-EGF基因表达框的整和型表达质粒在Yeast Pichia pastoris系统中分泌性表达了人EGF，表达量为300mg/L，通过高密度发酵等工艺改造可达到900mg/L的产量。即表达产量达依照高密度培养的差异可达300-900mg/L，提纯纯度可达95％或更高，纯化的蛋白产物经检测，结果表明其为高纯度，无热源、无内毒素、无甲基营养型酵母染色体DNA污染的，有正确的分子量，与天然EGF蛋白具有相同的等电点、氨基末端氨基酸顺序、紫外光谱、及完好的生物学活性性质的有可重复肽图的重组蛋白。

本发明中使用的命名为GS115-3EGF遗传工程菌株已于1997年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为0320。

附图简要说明：

图1：重组质粒pUC19-EGF51的构建图；

图2：重组质粒pUC19-EGF51的酶切鉴定图，即重组质粒pUC19-EGF51

     酶切电泳图谱；

图3：重组质粒pUC19-EGF51的荧光测序图；

图4：人工合成的hEGF基因的核苷酸顺序及相应的氨基酸顺序图；

图5：重组克隆pUC19-αEGF构建图；

图6：α-因子前导肽与EGF编码顺序融合基因及融合位点处的核苷酸顺序测定

     图；

图7：α因子前导肽与EGF编码顺序融合位点处核苷酸顺序；

图8：重组质粒pUC19-KαEGF51以及pA0815 EGF51的构建图；

图9：质粒pA0815物理图谱(pA0815的说明：7709核苷酸；5’AOX1启动子片段：碱基1-940；5’AOX1引物位点：碱基855-875；EcoR1位点：碱基943-948；3’AOX1引物位点：碱基1024-1044；3’AOX1转录中止(TT)：碱基950-1277；HIS4 ORF：碱基4199-1665；3’AOX1片段：碱基4554-5310；Co1E1起始：碱基6394-5740；氨苄青霉素抗性基因：碱基7399-6539)；

图10：重组质粒pAO815-EGF51酶切图谱；

图11：重组质粒pAO815-3EGF51构建图；

图12：重组pAO815-3EGF51酶切鉴定图谱；

图13：Mut⁺和Mut^s转化子之对比；

图14：EGF表达时相图谱(0～144小时)；

图15：EGF EC50检测图；

图16：第50代工程菌的GS115-3EGF染色体DNA中EGF基因的PCR扩增电泳

      图；

图17：第50代工程菌的GS115-3EGF分泌EGF的SDS-PAGE图谱。

以下将结合附图和实施例详细描述本发明。实施例1：基因来源

天然的、成熟的人表皮生长因子由53个氨基酸组成，但人表皮生长因子第53位氨基酸-精氨酸，在人体及酵母体内表达后经常被蛋白酶去除，而且第52位氨基酸-亮氨酸亦常被去除，加之第21位甲硫氨酸的在酵母菌体发酵过程中的氧化与否将造成4种EGF成分并存。人们已知表皮生长因子氨基端40多个氨基酸即具有了该因子的全部活性，故人工合成编码51个氨基酸的基因即表达后依然有完好生物活性的变异EGF的核苷酸编码顺序，会有利于该因子表达后的纯化。

(一)用DNA合成仪及亚磷酸三酯法合成四条寡聚核苷酸链，用聚丙烯酰胺-7M尿素变性胶电泳分离纯化(向上海生物工程研究所订购)，其顺序分别为：

引物1(60-mer)：5′-GGA ATT CGT TAA CTC CGA CTC CGA ATG TCC ATT GTC CCA CGA CGGTTA CTG TTT GCA CGA-3′

引物2(61-mer)：5′-AAG CTT TGG ACA AGT ACG CCT GTA ACT GTG TTG TTG GTT ACA TCGGTG AAA GAT GTC AAT A-3′

引物3(57-mer)：5′-GGA ATT CTC ATT ATT CCC ACC ACT TCA AGT CTC TGT ATT GAC ATCTTT CAC CGA TGT-3′

引物4(60-mer)：5′-GGC GTA CTT GTC CAA AGC TTC GAT GTA CAT ACA AAC ACC GTC GTGCAA ACA GTA ACC GTC-3′

其中引物1及3分别编码EGF基因的5′及3′端。引物1，4有互补顺序，引物2，3有互补顺序，引物4与1、2有互补顺序。

外源基因的高效表达涉及诸多因素，由于密码子的简并性，选用宿主系统嗜用密码子对提高表达有重要作用，故该人工合成基因全部由酵母嗜用密码子组成。除不含苯丙氨酸及苏氨酸外，18种氨基酸密码子的出现频率的有关情况如下：氨基酸      密码子及出现频率      氨基酸    密码子及出现频率Ala         GCT，1  GCC，1          Arg          AGA，2Asn         AAC，2                  Asp          GAC，5Cys         TGT，6                   Gln         CAA，1Glu         GAA，4                   Gly         GGT，4His         CAC，2                   Ile         ATC，2Leu         TTG，4                   Lys         AAG，2Met         ATG，1                   Pro         CCA，1Ser         TCC，3                   Trp         TGG，2Tyr         TAC，5                   Val         GTT，3实施例2：重组质粒pUC19-EGF51的构建

经上述实施例一所得的寡聚核苷酸酸链的5’末端经磷酸化、四个寡聚核苷酸链间的复性、链的延伸、连结、EcoRI内切酶酶切和克隆人pUC19的EcoRI位点及重组克隆的鉴定参照《分子克隆》，DNA序列测定应用荧光引物的双脱氧末端终止法在美国ABI公司373DNA测序仪上进行。获得重组质粒命名为pUC19-EGF51。

重组质粒pUC19-EGF51的构建见附图1。实施例3：重组质粒pUC19-EGF51的的酶切鉴定

鉴定方法：5μg重组质粒pUC19-EGF51以EcoRI酶于37℃酶切2h后1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色可见载体片段及编码EGF51个氨基酸、2个终止子及含EcoRI位点的约174bp的DNA克隆片段。

该质粒的酶切鉴定见附图2，即重组质粒pUC19-EGF51酶切电泳图谱。图中可见：泳道1：pBR322/BstN1分子量标准，片段由大至小为：1857bp，1060bp，929bp，383bp，121bp泳道2：pUC19-EGF51/EcoRI，片段由大至小为：2900bp，174bp泳道3：pUC19-EGF51

该质粒测序结果表明确该合成基因顺序正确且在基因的5′端加上了预期的EcoRI和HpaI酶切位点，3′端加上了TAA和TGA两个终止子顺序和预期的EcoRI酶切位点，参见所附荧光测序图3，以及人工合成的hEGF基因的核苷酸顺序及相应的氨基酸顺序图，即图4。证明合成基因如下：                              G GAA TTC GTT

                                            C CTT AAG CAA

                                                   EcoRI HpaI1    2    3    4    5    6    7    8    9   10   11   12   13   14   15Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly  Tyr  Cys  LeuAAC  TCC  GAC  TCC  GAA  TGT  CCA  TTG  TCC  CAC  GAC  GGT  TAC  TGT  TTGTTG  AGG  CTG  AGG  CTT  ACA  GGT  AAC  AGG  GTG  CTG  CCA  ATG  ACA  AAC16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu  Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  AlaCAC  GAC  GGT  GTT  TGT  ATG  TAC  ATC  GAA  GCT  TTG  GAC  AAG  TAC  GCCGTG  CTG  CCA  CAA  ACA  TAC  ATG  TAG  CTT  CGA  AAC  CTG  TTC  ATG  CGG31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45Cys  Asp  Cys  Val  Val  Gly  Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Glu  Tyr  ArgTGT  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT  TAC  ATC  GGT  GAA  AGA  TGT  CAA  TAC  AGAACA  TTG  ACA  CAA  CAA  CCA  ATG  TAG  CCA  CTT  TCT  ACA  GTT  ATG  TCT46   47   48   49   50   51Asp  Leu  Lys  Trp  Trp  Glu            stop code 1-2，            EcoRIGAC  TTG  AAG  TGG  TGG  GAA       TAA  TGA       GAATTCCTG  AAC  TTC  ACC  ACC  ATT       ATT  ACT       CTTAAG实施例4：表达载体的构建

典型的甲基营养型酵母表达载体包括醇氧化酶基因(5′AOX1启动子，3′AOX1终止序列，3′AOX1顺序)，其间含有克隆位点供外源基因插入；P.pastoris组氨醇脱氢酶基因(HIS4gene)为互补性筛选标志；作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒的序列。表达载体中无酵母复制起点，它是靠同源重组整合入酵母染色体基因组DNA中，并且随酵母的生殖传代，稳定存在。

将表达载体用不同的酶切(如BglII，.NotI或Sa1I，StuI等)后线性化，使之整合于酵母基因组的AOX1或HIS4基因的位置。整合的方式可以是单一交叉插入，亦可双重交叉替换，一般来说前一种方式更容易发生。当酵母的AOX1基因被替换而丢失后，就产生了Mut^s表型(methanol utilization slow)，它们将利用弱的AOX2基因启动合成AOX，在含甲醇的培养级基中生长缓慢。而野生型的酵母在含甲醇的培养基中生长正常，被称为Mut⁺表型。

为将hEGF基因在上述的一个甲基营养型酵母表达载体中表达，进行了下述一系列体外DNA重组工作。

以如下方式获得人表皮生长因子基因与α-因子前导肽基因的融合及融合基因克隆。

将构建的含α-因子启动子及α-因子前导肽及细胞色素C终止子的质粒pSKSB以HindIII酶切、S1酶削平，再以Sa1I酶切作为载体与从pUC19-EGF51经HpaI及Sa1I酶切所获DNA片段体外连结、转化得到重组克隆pUC19-αEGF，(见图5)。

α-因子前导肽与EGF编码顺序融合基因及融合位点处的核苷酸顺序测定如图6所示。

测序表明在EGF基因前有编码85个氨基酸的α因子前导肽顺序，这为酵母表达可分泌EGF创造了条件。因为α因子前导肽及EGF基因在转录翻译后的加工及分泌过程中，84位及85位氨基酸Lys-Arg后恰是KEX2基因产物，一种内源性蛋白酶的切割位点，见图7。

         α因子前导肽                hEGF1   2   3            82  83  84  85  1   2   3   4ATG AGA TTT...*      TTG GAT AAA AGA-AAC TCC GAC AGGTAC TCT AAA**        AAC CTA TTT TCT-TTG AGG CTG TCC实施例5：α-因子前导肽与EGF编码顺序融合基因前Kozak顺序的加入

用设计并人工合成的5′端含有Kozak顺序的寡聚核苷酸引物GGAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATT(其中ACC ATG是Kozak保守顺序，它的存在将有利于翻译的起始)及相应于EGF3′端的寡核苷酸引物，以pUC19-αEGF为模板扩增出的DNA片段将含Kozak顺序、α因子前导肽的85个氨基酸及EGF编码顺序，而且两端为EcoRI识别位点。该片段经EcoRI酶切后连入pUC19测序(或连入pAO815表达)，所得克隆为pUC19-KαEGF51(或pAO815EGF)，见图8。

经过测序结果表明在EGF基因前有完整的自ATG起始的编码85个氨基酸的α因子前导肽顺序，且在前导肽顺序前加入了Kozak顺序如下：

      Kozak-α因子前导肽                    hEGF

          1   2   3     82 83  84  85   1   2   3   4G GAATTC ACC ATG AGA TTT.**TTG GAT AAA AGA*AAC TCC GAC AGGC CTTAAG TGG TAC TCT AAA.**AAC CTA TTT TCT*TTG AGG CTG TCC实施例6：表达载体pAO815-3EGF51的构建

质粒pAO815购自Invitrogen公司，它是可克隆多拷贝外源基因的，并可整合入甲基营养型酵母染色体基因组，用来表达非分泌性胞内蛋白的表达载体，全长7709bp。其Co1E1复制起点顺序，及氨苄抗性基因来源于pBR322，使质粒可在大肠杆菌中复制和筛选。不含在酵母菌中可自我复制的核苷酸顺序但有来源于酵母染色体DNA上的HIS4基因，为酵母菌的筛选标志及整合位点。其5′AOX1及3′AOX1顺序也可使质粒经同源重组整合入甲基营养型酵母染色体基因组。AOX1启动子下游及AOX1终止子上游间的EcoRI位点为克隆位点，可使含Kozak顺序的外源基因在该位点插入后在胞内获得表达，本发明在EGF基因前加入了α因子前导肽而使外源基因表达产物的分泌成为可能。pAO815质粒见图9。

将含Kozak顺序、a-因子前导肽85个氨基酸及EGF编码顺序，且两端系EcoRI识别位点的DNA片段经EcoRI酶切后连入pAO815表达载体，重组克隆的酶切图谱见图10，经酶切鉴定筛选出正向克隆为pAO815-EGF51。

pAO851-EGF51经EcoRI酶切后，酶切可获得两个片段。一为载体片段长7.7kb。另一为碥码α-因子前导顺序85个氨基酸及EGF51个氨基酸、2个终止子及含EcoRI位点的约430bp的DNA克隆片段。

图10中可见：泳道1：pAO815-EGF51/EcoRI片段由大小为：7.7Kb，(载体)和430bp(插入片段)；泳道2：pAO815-EGF51；泳道3：λDNA/HindIII：片段由大至小31230bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp，564bp，125bp。

将pAO815-EGF51用BglII和BamHI切出含AOX1启动子、α-因子前导肽与EGF编码顺序及AOX1终止子的片段，使之体外自连后再用BglII和BamHI切，将获得两端分别为BglII及BamHI末端的二聚体片段。低熔点琼脂糖凝胶纯化二聚体片段后连入碱性磷酸酶处理过的pAO815-EGF51的BamHI位点，转化TOP10F′受体菌，重组子DNA酶切筛选鉴定后可获得含同方向的三拷贝EGF表达单元的重组pAO815-3EGF51，质粒构建图见图11。质粒酶切鉴定图谱见图12。

pAO815以BamHI及BgIII酶切后将产生由大至小4028bp，2405bp，1279bp三个片段。

pAO815-EGF51以BamHI及BgIII酶切后将产生由大至小4028bp，2405bp，1708bp三个片段，最后一片段系因430bp片段插入1279bp片段而来。pAO815-3EGF51以BamHI及BgIII酶切后将产生由大至小5124bp，4028bp，2405bp三个片段，5124bp片段系1708bp片段三倍体。

附图12中可见：泳道1：λDNA/HindIII：片段由大至小

   31230bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp，564bp，125bp。泳道2：pAO815/BamHI+BgIII，由大至小4028bp，2405bp，1279bp三个片段。泳道3：pAO815-EGF51/BamHI+BgIII，由大至小4028bp，2405bp，1708bp三个

   片段。泳道4：pAO815-3EGF51/BamHI+BgIII，由大至小5124bp，4028bp，2405bp三个

   片段。

质粒pAO815-3EGF测序结果证明EGF在AOX基因启动子调控之下且有正确的表达框架。经核苷酸顺序测序表明含Kozak顺序的α-因子前导肽及EGF的融合基因片段已正确连入AOX启动子下游。另外也证明EGF基因存在于插入片段的α-因子前导肽下游。实施例7：宿主菌的制备、转化及工程菌的筛选

本发明中采用甲基营养型酵母(P.pastoris)作为表达宿主。

甲基营养型酵母包括巴氏毕赤酵母(P.pastoris)和多性汉逊酵母，它有许多优点：(1).含特有的AOX1(醇氧化酶)启动子，用甲醇可以严格地调控表达。(2)有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，细胞干重达100g/1以上，蛋白表达产量高。(3)甲基营养型酵母生存能力强，易于处理，可以在廉价的非选择性培养基中生长，补充盐，维生素即可。(4)表达产物既可在胞内积聚，又可被分泌；分泌的异源蛋白占所有分泌蛋白的30％以上，利于工业规模的分离和下游加工。

甲基营养型酵母含有两个AOX基因，分别为AOX1，AOX2基因。它们二者的蛋白编码序列相似，有92％的同源性，其蛋白产物则有97％的同源性。AOX1基因的蛋白产物在氧化过程中起主要作用，Northern blot表明，AOX1基因的转录水平大大高于AOX2，且AOX1基因在转录水平上受到严格的双重调控：甲醇诱导AOX合成，一般的碳分解代谢产物抑制AOX产生。Tschopp，J.F.等人发现仅仅去除抑制不足以诱导表达AOX，在碳饥饿状态下，必须有甲醇诱导后，才能启动AOX1的信号转录，翻译。

为此，本发明采用的经实施例六得到的多拷贝EGF表达载体pAO815-3EGF51，它的转化、筛选和表达过程如下：

以下实施例7至9中使用的材料的材料为：1.10×YNB：134g含硫酸铵但不含氨基酸的酵母碱基溶于1000ml水，无菌过滤后备用。2.500×生物素(0.02％生物素)：20mg VitH溶于100ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。3.100×组氨酸(0.4％组氨酸)：400mg L-组氨酸溶于100ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。4.10×D(20％葡萄糖)：200g葡萄糖溶于1000ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。5.10×M(5％甲醇)：5ml甲醇溶于95ml水，无菌过滤后，4℃储存备用。6.10×GY(10％甘油)：100ml甘油溶于900ml水，高压灭菌，室温保存备用。7.1M磷酸盐缓冲液，pH6.0：混合132ml 1M K₂HPO4，868ml 1M KH₂PO4。8.YEPD或YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。9.MGY及MGYH：1.34％YNB，1％甘油，0.00004％生物素，0.004％组氨酸±。10.MD及MDH：1.34％YNB，0.5％甲醇，0.00004％生物素，0.004％组氨酸±。11.BMG及BMM：100mM磷酸缓冲液pH6.0，1.34％YNB，1％甘油或0.5％甲醇，0.00004％生物素。

宿主菌质粒pAO815-3EGF51的制备及线性化具体步骤：

中等量质粒DNA的制备：50ml LB培养基中接种含质粒菌株后，37℃摇床培养至OD值约为0.4，加入氯霉素使终浓度为170μg/ml，继续培养12-16小时。离心收集菌体后，用SDS裂解法提取质粒。再以聚乙二醇法纯化质粒DNA。

取10μg pAO815-3EGF51用BglII完全酶切后，酚-氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀、冷冻干燥备用。实施例8：宿主菌质粒pAO815-3EGF51转化

甲基营养型酵母GS115(his4-)购自Invitrogen公司，将之接种于YPD板上，30℃培养2天，分离出单克隆。单克隆再接种于5ml YPD液体培养基，30℃培养至OD约为0.5，离心收集菌体，TE缓冲液漂洗、离心后混悬于1ml 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M LiCl溶液。30℃振荡60分钟。取100μl该混悬液及5μl 10μg线性化质粒混合，30℃保温30分钟。加入0.7ml 70％聚乙二醇溶液，30℃再次保温30分钟，并37℃热休克5分钟。离心后将菌体混悬于0.1ml消毒水中，铺于MD培养板上30℃培养。如用电打孔仪则宿主菌单克隆接种于5ml YPD液体培养基，30℃培养过夜后接种于50ml YEPD培养基至OD约为1.5。离心收集菌体，消毒冷却水漂洗、离心后混悬于1ml冰冷的1M山梨醇溶液。取80μl经实施例七制备好的宿主菌与5μl 10μg线性化的pAO815-3EGF51混和于电打孔杯中，0℃预冷5分钟。设置Bio-Rad基因打孔仪(Gene-pluser II)程序，使产生7500V/cm，10ms的电脉冲以完成转化。立即加入1ml冰冷的1M山梨醇于电打孔杯中，取200μl铺MD培养板，30℃培养至重组子出现。转化过程中以水代替质粒DNA，铺MD板应无克隆出现，铺MDH板将出现满板克隆。实施例9：筛选Mut ⁺ 和Mut ^s 转化子

准备好MD-琼脂糖板和MM-琼脂糖板。在将GS115-Albumin(His⁺Mut^s)及GS115-Gal(His⁺Mut⁺)两个菌株作为对照的情况下，用无菌牙签将实施例八所获转化子对称接种到上述两种平板上，30℃培养，观察转化子的生长情况。这些His⁺转化子中，如果酵母的AOX1基因被替换而丢失后，就产生了Mut^s表型，它们只能利用弱的AOX2基因启动合成AOX，因尔在含甲醇的培养基中生长缓慢。而在His基因处进行整合的酵母在含甲醇的培养基中生长正常，则被称为Mut⁺表型见图13。取His⁺Mut^s的转化子作为遗传工程菌株GS115-3EGF，观察EGF表达情况。

由此可见甲基营养型酵母GS115，它的转化使用完整细胞法或Bio-Rad的基因打孔仪以His^-培养皿筛选出His⁺转化子，此后同时接种His⁺转化子于含甲醇或不含甲醇的培养基上，通过观察重组子生长情况，区分出整合于AOX1酶位点取代了AOX1酶，因而不能大量利用甲醇的Mut^s及整合于His位点而能利用甲醇的Mut⁺重组子。前者命名为GS115-3EGF，它用作本发明方法中使用的遗传工程菌株。实施例10：EGF的表达

应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐(美国NBS公司Bio Flo IV 20L)培养遗传工程菌株GS115-3EGF。以10％过夜培养基接种后，30℃培养，持续滴入氨水维持pH6.0，氧饱和度60％，流加甘油至每L湿菌达100-300g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达。

根据本发明表达时相的筛选，本发明方法的表达量确定4-5天为最佳诱导时间。本发明中为了使菌体快速增殖而提高了基础料中的甘油含量，使其由1％至3％，并在培养过程中流加甘油，流加氨水补氮并维持最适生长pH，以及维持氧溶解度等从而使菌体迅速生长，进而使表达产量可达300-900mg/L。

参见附图14。

附图14中蛋白标准分子量由大至小为：16949，14404，10700，6214，2512。

表达蛋白的纯化可以采用现有技术中通用的方法进行，例如，柱层析分离纯化法。本发明中将培养及诱导的重组克隆菌株离心收集上清，加入硫酸铵使浓度成0.5M，上样于用5倍柱体积量的20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸铵溶液平衡过的疏水柱Phenyl·sepharose 6 Fast Flow(high sub)柱。以20mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5M硫酸铵将进样峰洗至基线。以低盐缓冲液(20mM磷酸缓冲液)洗脱出EGF峰。该样品峰以20mM Tris-HCl pH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-sepharose HighPerformance柱，以A液(20mM Tris-Hcl pH7.6)至B液(20mM Tris-HCl pH7.6，0.5MNaCL)梯度洗脱方法收集EGF峰。最后用分子筛Superdex 30柱纯化重组hEGF蛋白。纯度可达95-97％或更高。实施例11：重组人表皮生长因子分子量的确定

经上述实施例十得到的重组人表皮生长因子使用SDS-PAGE蛋白电泳，参照Laemmli方法确定其分子量。

该方法的具体步骤如下：1.材料(1)Pharmacia LKBPhastSystem，由电泳分离单位和染色单位两部分组成，hEGF样品在该系统电泳分离并染色，需1小时完成。(2)PhastGel Separation Media：选用预制好的8-25％的梯度胶，或普通15％胶。(3)Pharmacia多肽分子量标准商品号80-1129-83：各分子量为16949，14404，10700，6214，2512。2.方法(1)输入SDS-PAGE程序后，将实施例样品100℃变性5分钟后上样电泳。电泳至溴酚兰到头，停止电泳，取出凝胶条放人染色器中，输入染色和脱色程序后进行染色。(2)照相留挡。3.结果

标准分子量蛋白与实施例十得到重组hEGF还原变性后上样于SDS-PAGE以测定分子量。hEGF样品电泳染色后均为单一条带，作图分析分子量约为6000，符合51个氨基酸组成的EGF的分子量。实施例12：EGF生物活性的测定

EGF生物活性的测定按卫生部生物制品鉴定所提供方案进行。其具体方法如下：1.材料和试剂(1)DMEM培养液(购自美国BRL公司)；(2)完全培养液1：DMEM培养液添加1.0％FBS；(3)完全培养液2：DMEM培养液添加0.4％FBS；(4)BalB/c-3T3细胞株(购自美国ATCC 20864)；(5)磷酸盐缓冲液：(6)MTT溶液：5mg/ml磷酸盐缓冲液，用0.22u滤膜过滤除菌，4℃避光保存备用；(7)裂解液：DMSO或10％SDS，50％DMSO；(8)EGF标准品及经实施例10得到的EGF样品。2.方法(1)收集培养的BalB/c-3T3细胞。用磷酸盐缓冲液漂洗两次，重悬于完全培养液1中，使细胞浓度为5.0-10×104/ml。(2)将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100μl，37℃，5％CO2培养过夜。(3)弃去上清，加入完全培养液2，每孔100μl，37℃，5％CO2培养4-24小时。(4)生检所提供的WHO标准品及带测样品用完全培养液2溶解至特定体积。按蛋白含量用完全培养液2稀释成如下梯度：40，10，2.5，0.625，0.156，0.039，0.0ng/ml(5)每孔依次加入稀释好的样品100μl。37℃，5％CO2培养48-72小时。(6)镜检后每孔加入MTT溶液20-25μl。37℃，5％CO2培养5小时。(7)弃去上清，每孔加入裂解液100μl。37℃，放置1小时后。实验波长570nm，参比波长630nm。(8)实验结果计算：在坐标纸上以OD570对稀释倍数或浓度作图，查出半效量的稀释度或EC50。

EGF活性(IU/ml)＝标准品效价×A×B

A＝标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效量稀释度

B＝样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数3.结果

OD570对EGF浓度作图(附图15)可计算出EGF蛋白的EC50＜0.88ng。实施例13：DNA遗传稳定性实验

(1).酵母染色体DNA的制备：

将上述实施例九得到工程菌GS115-3EGF及宿主菌GS115接种于BMG培养基5ml，30℃培养至饱和期。0.1ml培养液接种于1ml BMG培养基培养12小时后再取0.1ml培养液接种于1ml BMG培养基培养。如此循环50次。以最后一次的培养液铺板，随机挑取单克隆菌5个培养。

以酵母染色体DNA快速提取方法提取DNA。

方法如下：用1.5ml Eppendorf离心管离心沉淀菌体，水漂洗后加入200μl裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA)，0.3g细玻璃珠，0.2ml酚-氯仿-异戊醇后高速涡旋震荡3分钟。加入200μ1TE缓冲液再次震荡后高速离心，取出的上清内加入1ml 100％乙醇混匀后离心沉淀DNA。含RNase酶TE溶解DNA后37℃消化1小时，加入醋酸胺使成0.4M，并加入2.5倍体积100％乙醇，沉淀DNA。70％乙醇漂洗，沉淀后溶于100μ1TE缓冲液备用。

(2).PCR扩增EGF基因

取宿主DNA 10ng以及经实施例九制得5个工程菌的DNA10ng为模板，加入人工合成EGF基因用的寡聚核苷酸片断1及3各0.5μg，dNTP、含镁缓冲液、水至100μl，煮沸变性5分钟后冰浴，加入TAQ酶5u，石蜡油100μl。PCR仪(美国PE公司提供)上94摄氏度1分钟，70摄氏度2分钟，30个循环。

(3).2％Agarose电泳鉴定，如附图十六所示，已传代50次的5个克隆，100％扩增出150bp的DNA片断。证明本发明之工程菌在遗传上是稳定的。实施例14：蛋白表达稳定性实验

将实施例十三中使用的提取DNA的5个GS115-3EGF单克隆菌在BMM培养基中30摄氏度诱导表达96小时，取15μl上清加入5μl4倍SDS-PAGE上样缓冲液，热变性，15％SDS-PAGE电泳，考马氏兰染色，脱色后照相留档。如附图十七所示，证明遗传工程菌株传代50次后仍能稳定的表达出EGF。

Claims (12)

1、一种甲基营养型酵母细胞，它含有三个拷贝的能够编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列，其特征在于所述的人表皮生长因子的基因序列的5’端连接一个α-因子前导肽，在该α-因子前导肽DNA序列前融合一个Kozak序列，然后再克隆到醇氧化酶启动子下游以构建成整合型的能表达三拷贝人表皮生长因子的序列，其中所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列为：1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   12   13   14   15Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly  Tyr  Cys  LeuAAC  TCC  GAC  TCC  GAA  TGT  CCA  TTG  TCC  CAC  GAC  GGT  TAC  TGT  TTGTTG  AGG  CTG  AGG  CTT  ACA  GGT  AAC  AGG  GTG  CTG  CCA  ATG  ACA  AAC16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu  Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  AlaCAC  GAC  GGT  GTT  TGT  ATG  TAC  ATC  GAA  GCT  TTG  GAC  AAG  TAC  GCCGTG  CTG  CCA  CAA  ACA  TAC  ATG  TAG  CTT  CGA  AAC  CTG  TTC  ATG  CGG31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45Cys  Asp  Cys  Val  Val  Gly  Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Glu  Tyr  ArgTGT  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT  TAC  ATC  GGT  GAA  AGA  TGT  CAA  TAC  AGAACA  TTG  ACA  CAA  CAA  CCA  ATG  TAG  CCA  CTT  TCT  ACA  GTT  ATG  TCT46   47   48   49   50   51Asp  Leu  Lys  Trp  Trp  Glu    终止密码1-2  EcoRIGAC  TTG  AAG  TGG  TGG  GAA    TAA TGA      GAATTCCTG  AAC  TTC  ACC  ACC  CTT    ATT ACT      CTTAAG。

2、如权利要求1所述的甲基营养型酵母细胞，其特征在于在所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列的编码第51个氨基酸的核苷酸的末端连接有两个终止子TAA和TGA。

3、如权利要求1所述的甲基营养型酵母细胞，其为保藏号为CGMCC No.0320的甲基营养型酵母细胞，其于1997年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

4、一种重组质粒，它含有三个拷贝的能够表达编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列，其特征在于所述的人表皮生长因子的基因序列的5’端连接一个α-因子前导肽，在该α-因子前导肽DNA序列前融合一个Kozak序列，其中所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列为：1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   12   13   14   15Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly  Tyr  Cys  LeuAAC  TCC  GAC  TCC  GAA  TGT  CCA  TTG  TCC  CAC  GAC  GGT  TAC  TGT  TTGTTG  AGG  CTG  AGG  CTT  ACA  GGT  AAC  AGG  GTG  CTG  CCA  ATG  ACA  AAC16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu  Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  AlaCAC  GAC  GGT  GTT  TGT  ATG  TAC  ATC  GAA  GCT  TTG  GAC  AAG  TAC  GCCGTG  CTG  CCA  CAA  ACA  TAC  ATG  TAG  CTT  CGA  AAC  CTG  TTC  ATG  CGG31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45Cys  Asp  Cys  Val  Val  Gly  Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Glu  Tyr  ArgTGT  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT  TAC  ATC  GGT  GAA  AGA  TGT  CAA  TAC  AGAACA  TTG  ACA  CAA  CAA  CCA  ATG  TAG  CCA  CTT  TCT  ACA  GTT  ATG  TCT46   47   48   49   50   51Asp  Leu  Lys  Trp  Trp  Glu  终止密码1-2    EcoRIGAC  TTG  AAG  TGG  TGG  GAA  TAA TGA        GAATTCCTG  AAC  TTC  ACC  ACC  CTT  ATT ACT        CTTAAG。

5、如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于在所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列的编码第51个氨基酸的核苷酸的末端连接有两个终止子TAA和TGA。

6、如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于所述的质粒是质粒pAO815-3EGF51。

7、一种含有三个拷贝的外源基因的表达载体，其特征在于包括延着转录方向排列的三个拷贝的表达人表皮生长因子的基因序列，即甲基营养型酵母的AOX1启动子，Kozak序列，编码酵母α-因子前导肽85个氨基酸的核苷酸序列，编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列以及转录终止序列，其中编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列为：1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11  12    13   14   15Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly  Tyr  Cys  LeuAAC  TCC  GAC  TCC  GAA  TGT  CCA  TTG  TCC  CAC  GAC  GGT  TAC  TGT  TTGTTG  AGG  CTG  AGG  CTT  ACA  GGT  AAC  AGG  GTG  CTG  CCA  ATG  ACA  AAC16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu  Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  AlaCAC  GAC  GGT  GTT  TGT  ATG  TAC  ATC  GAA  GCT  TTG  GAC  AAG  TAC  GCCGTG  CTG  CCA  CAA  ACA  TAC  ATG  TAG  CTT  CGA  AAC  CTG  TTC  ATG  CGG31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45Cys  Asp  Cys  Val  Val  Gly  Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Glu  Tyr  ArgTGT  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT  TAC  ATC  GGT  GAA  AGA  TGT  CAA  TAC  AGAACA  TTG  ACA  CAA  CAA  CCA  ATG  TAG  CCA  CTT  TCT  ACA  GTT  ATG  TCT46   47   48   49   50   51Asp  Leu  Lys  Trp  Trp  Glu   终止密码1-2   EcoRIGAC  TTG  AAG  TGG  TGG  GAA   TAA TGA       GAATTCCTG  AAC  TTC  ACC  ACC  CTT   ATT ACT       CTTAAG。

8、如权利要求7所述的表达载体，其特征在于在所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列的编码第51个氨基酸的核苷酸末端连接有两个终止子TAA和TGA。

9、如权利要求7或8所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是重组质粒pAO815-3EGF51。

10、一种利用甲基营养型酵母细胞制备人表皮生长因子的方法，包括

人工合成编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因；

将所述的人表皮生长因子基因与编码酵母α-因子前导肽的DNA片段融合，经在α因子前导肽前加入Kozak序列，再克隆到醇氧化酶启动子下游以构建成EGF表达载体；

以此载体为基础构建整合型三拷贝EGF的表达载体；

将该表达载体转化甲基营养型酵母株GS115后筛选出整合型Mut^s基因型菌株GS115-3EGF；

高密度培养及诱导所述的菌株使其分泌人表皮生长因子，

其中所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列为：1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   12   13   14   15Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly  Tyr  Cys  LeuAAC  TCC  GAC  TCC  GAA  TGT  CCA  TTG  TCC  CAC  GAC  GGT  TAC  TGT  TTGTTG  AGG  CTG  AGG  CTT  ACA  GGT  AAC  AGG  GTG  CTG  CCA  ATG  ACA  AAC16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu  Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  AlaCAC  GAC  GGT  GTT  TGT  ATG  TAC  ATC  GAA  GCT  TTG  GAC  AAG  TAC  GCCGTG  CTG  CCA  CAA  ACA  TAC  ATG  TAG  CTT  CGA  AAC  CTG  TTC  ATG  CGG31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45Cys  Asp  Cys  Val  Val  Gly  Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Glu  Tyr  ArgTGT  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT  TAC  ATC  GGT  GAA  AGA  TGT  CAA  TAC  AGAACA  TTG  ACA  CAA  CAA  CCA  ATG  TAG  CCA  CTT  TCT  ACA  GTT  ATG  TCT46   47   48   49   50   51Asp  Leu  Lys  Trp  Trp  Glu   终止密码1-2     EcoRIGAC  TTG  AAG  TGG  TGG  GAA   TAA TGA         GAATTCCTG  AAC  TTC  ACC  ACC  CTT   ATT ACT         CTTAAG。

11、如权利要求10所述的方法，其特征在于在所述的编码51个氨基酸的人表皮生长因子的基因序列的编码第51个氨基酸的核苷酸末端连接有两个终止子TAA和TGA。

12、如权利要求10所述的方法，其特征在于所述的菌株GS115-3EGF是一种遗传工程甲基营养型酵母细胞，该细胞己于1997年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.0320。

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