CN103484471A - 人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体 - Google Patents
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Abstract
人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体，涉及基因工程和多肽类药物。新的人表皮细胞生长因子DNA，具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列。大肠杆菌表达载体pBADME包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。根据人表皮细胞生长因子hEGF全长序列设计引物，并替换掉密码子中的ACA序列以获得不含ACA序列的hEGF基因，再将hEGF-ACA-基因序列克隆进入pBADM载体，重组成表达载体pBADME；将构建好的表达载体pBADME分别转化至大肠杆菌BL-21/JM109，培养至OD600达到3，再培养至OD600达到0.5，用IPTG与阿拉伯糖双诱导，得人表细胞皮生长因子。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和多肽类药物生产领域，尤其是涉及一种人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体。
背景技术
人表皮细胞生长因子（Human epidermal growth factor,hEGF），是由53个氨基酸组成的多肽，分子量为6200道尔顿，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用，具有重要的临床应用价值。医学临床研究结果表明，hEGF可促进皮肤表层，内皮细胞和毛细血管生长，可应用于皮肤溃疡、烧烫伤，眼角膜损伤及手术创面等的修复和愈合（参考文献1：Hardwicke J,Schmaljohann D,Boyce D.et al.Epidermal growth factor therapy and wound healing-past,present and future perspectives,Surgeon.2008,6(3)：172-177;参考文献2：Jorge B,JorgeG,Pedro L,et al.Epidermal growth factor in clinical practice–a review of its biological actions,clinical indications and safety implications，International Wound Journal，2009,6(5)：331–346）。此外，随着人年龄增长，表皮细胞活性降低，皮肤新陈代谢减缓，逐渐引起皮肤的老化和损伤，而应用hEGF可促进表皮细胞生长，起到皮肤抗衰老作用，因而也被作为天然活性成分添加于高档护肤品当中。
人表皮细胞生长因子（hEGF)基因编码序列公布在GenBank数据库中的序号为X04571，人表皮细胞生长因子活性肽对应的核酸位置为3347～3505，多肽链的相对位置在AA949～1001。
国内外虽然已有报道根据hEGF基因序列在大肠杆菌(E.coli)中的表达（参考文献3：中国专利CN100362103C；参考文献4：中国专利CN102344924A），但存在产量低、纯化成本高、难以获得规模效益等难题。
大肠杆菌ChpA基因编码一个限制性核糖核酸酶，专一识别并切割核糖核酸（mRNA）的ACA序列。ChpA的表达将迅速降解大多数含有ACA序列的mRNA。在大肠杆菌中mRNA出现ACA的几率是相当高的，理论上平均每64个核苷酸长度就可能出现一个ACA序列。因此在特定生理条件下ChpA的基因过量表达是大肠杆菌的一种应激反应，使大肠杆菌进入一种生理状态，在这种状态下，绝大多数mRNA因为含有ACA序列将被降解而无法转译成新的蛋白，而细菌的其他代谢功能还可维持。ChpA作为限制性核糖核酸酶的这一功能可以被应用于本发明的hEGF生产系统。
将ChpA基因亚克隆于pBAD22a表达载体，置于BAD启动子下游，由阿拉伯糖进行诱导操控，获得pBADM载体。
依据人表皮细胞生长因子(hEGF)基因序列，对其ACA部分进行突变，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因(hEGF-ACA-)，并克隆到pBADM质粒，获得pBADME并转化到大肠杆菌BL21中进行发酵。
大肠杆菌BL21菌株的pBADME转化子经IPTG与阿拉伯糖双诱导，ChpA与hEGF-ACA-共表达，结果菌体内大量含ACA密码子的新生mRNA被ChpA降解，而hEGF-ACA-的mRNA不受影响，并持续翻译成hEGF蛋白。该技术优势在于将重组细菌中的翻译系统集中用于目标蛋白hEGF的表达，使翻译效率提高。经实验证实，应用所合成的序列配合含ChpA的表达载体，可获得hEGF在大肠杆菌系统中的高表达。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种新的人表皮细胞生长因子DNA序列。
本发明的第二目的是提供大肠杆菌表达载体pBADME。
本发明的第三目的是提供利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法。
所述新的人表皮细胞生长因子DNA(hEGF-ACA-)，具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列。该核苷酸序列共有162个核苷酸，由人工合成获得，其中，最后3个TAA为终止密码子。与公布的人表皮细胞生长因子DNA(SEQ ID No.2)比较，有2个碱基不同。(除外加TAA终止密码子外）分别是第81个碱基与第111个碱基的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）。
人工合成的hEGF-ACA-(SEQ ID No.1)核苷酸序列不同于hEGF(SEQ ID No.2)，但因为密码子具有简并性，所表达的多肽同天然人表皮细胞生长因子多肽完全相同(SEQ IDNo.3)，因而具有天然人表皮细胞生长因子的全部特性。
人表皮细胞生长因子DNA序列(SEQ ID No.1)，用于制备人表皮细胞生长因子，该DNA序列转译的mRNA不含ACA序列，而翻译的多肽与人体天然表皮细胞生长因子氨基酸序列相同。
所述大肠杆菌表达载体pBADME，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。所述载体是包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的表达载体pBADME；其质粒共表达不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因hEGF与专一识别ACA序列的限制性核酸内切酶基因ChpA。
所述大肠杆菌表达载体pBADME的构建如下：
将ChpA基因亚克隆于pBAD22a表达载体，置于BAD启动子下游，由阿拉伯糖进行诱导操控，获得pBADM载体。依据人表皮细胞生长因子(hEGF)基因序列，对其ACA部分进行突变，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因(hEGF-ACA-)，并克隆到pBADM质粒，获得pBADME。
所述利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，具体包括以下步骤：
1)根据人表皮细胞生长因子hEGF全长序列设计引物，并替换掉密码子中的ACA序列以获得不含ACA序列的hEGF基因，再将hEGF-ACA-基因序列克隆进入pBADM载体，重组成表达载体pBADME；相应表达出的重组蛋白hEGF与人体表皮细胞生长因子在氨基酸序列上一致；
2)将步骤1)中构建好的表达载体pBADME分别转化至大肠杆菌BL-21/JM109，在35℃下，250rpm.培养至OD600达到3.0，以l∶100接种到新鲜培养基继续培养至OD600达到0.5，将温度调到30℃，用IPTG与阿拉伯糖双诱导16～20h（IPTG诱导浓度范围为0.1～1mmol；阿拉伯糖诱导浓度范围为0.01%～0.1%），得到高产量的人表细胞皮生长因子。
在步骤1)中，所述pBADME载体含有受阿拉伯糖诱导的限制性核酸内切酶ChpA的表达盒，同时含有受IPTG诱导的人表皮细胞生长因子hEGF-ACA-表达盒。
在步骤2)中，所述IPTG与阿拉伯糖双诱导后，所表达的ChpA将降解细胞内大多数含ACA序列的mRNA,而对于hEGF-ACA-基因的mRNA没有影响。
所述利用大肠杆菌pBADME转化子进行发酵的技术优点描述如下:
大肠杆菌的pBADME转化子经IPTG与阿拉伯糖双诱导，ChpA与hEGF-ACA-共表达，结果菌体内大量含ACA密码子的新生mRNA被ChpA降解，而hEGF-ACA-的mRNA不受影响，并持续翻译成hEGF蛋白。本发明的技术优势在于将重组细菌中的翻译系统集中用于目标蛋白hEGF的表达，使翻译效率提高。本发明利用ChpA基因与合成的不含ACA序列的表皮细胞生长因子在同一质粒载体中共表达，经优化，表皮细胞生长因子在大肠杆菌发酵系统中可获得高产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：人表皮细胞生长因子核酸序列的人工合成及克隆
根据SEQ ID No.1所示核苷酸序列构成的基因(hEGF-ACA-)，采用固相合成法在全自动DNA合成仪上按操作手册合成4条长链引物，其序列分别为：
ACA-l:
CGGATCCATGAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATG
ACA-2:
GCATGCATACTTATCCAATGCTTCAATATACATGCACACCATCATGGAGGC
ACA-3:
GGATAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTATATCGGGGAGCGATGTCAG
ACA-4:
GGAATTCTTAGCGCAGTTCCCACCACTTCAGGTCTCGGTACTGACATCGCTCCCCG
分别对ACA-l、ACA-2和ACA-3、ACA-4进行第一轮PCR扩增。
反应1：采用下列原料进行反应
0.5μL的嗜热性DNA聚合酶(Taq polymerase)
1μL10mmol的四种单核苷酸混合物(dNTPs)
5μL10×PCR缓冲液
3μL25mmol的MgCl2
2μL25μmol的ACA-l和ACA-2的混合物
37.5μL的水
先在96℃下进行预变性反应2min，再进行28次变性一复性一延伸循环反应，每个循环包括，94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min。
反应2：与反应l相同，只是反应对象变为2μL25μmol的ACA-3、ACA-4的混合物。再将二个反应的产物进行混合，进行第二次PCR扩增反应，反应条件与上述反应相同。
扩增后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，再进行TA克隆测序，将测序完全正确的挑选出来，就得到人工合成的hEGF-ACA-。合成的hEGF-ACA-序列两端设计有BamH I、EcoR I位点，经酶切后，克隆进pBADM中，获得原核表达载体pBADME。
实施例2：重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达
将实施例1中构建的pBADME质粒转化至E.coli（BL21）菌株中，挑取单克隆，在LB培养基中35℃培养至OD600值3.0，将转化菌以l∶100接种于含有氨苄青霉素的TB培养基中，35℃培养至OD600值0.5，加入IPTG以及阿拉伯糖至终浓度分别为0.5mmol/mL与0.1%，在30℃进行诱导表达16h。hEGF在E coli中的表达结果检测：将鉴定正确的表达质粒pBADME转化E coli受体菌BL21，并用IPTG与阿拉伯糖双诱导表达。Western blot检测表明，重组蛋白在分子量6kDa左右检测到有粗条带，与EGF理论分子量相当，证明重组蛋白在大肠杆菌内获得高表达。
实施例3：重组质粒在大肠杆菌JM109中的表达
将实施例1中构建的pBADME质粒转化至E.coli（JM109）菌株中，挑取单克隆，在LB培养基中35℃培养至OD600值3.0，将转化菌以l∶100接种于含有氨苄青霉素的2XYT培养基中，35℃培养至OD600值0.5，加入IPTG以及阿拉伯糖至终浓度分别为0.5mmol/mL与0.1%，在30℃进行诱导表达20h。hEGF在E coli中的表达结果检测：将鉴定正确的表达质粒pBADME转化E coli受体菌JM109，并用IPTG与阿拉伯糖双诱导表达。Western blot检测表明，重组蛋白在分子量6kDa左右检测到粗条带，与EGF理论分子量相当，证明重组蛋白在大肠杆菌内获得高表达。
Claims (6)
1.人表皮细胞生长因子DNA(hEGF-ACA-)，其特征在于具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，该核苷酸序列共有162个核苷酸，由人工合成获得，其中，最后3个TAA为终止密码子，除外加TAA终止密码子外，分别是第81个碱基与第111个碱基的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）。
2.大肠杆菌表达载体pBADME，其特征在于包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体，所述载体是包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的表达载体pBADME；其质粒共表达不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因hEGF与专一识别ACA序列的限制性核酸内切酶基因ChpA。
3.如权利要求2所述大肠杆菌表达载体pBADME的构建方法，其特征在于其具体步骤如下：
将ChpA基因亚克隆于pBAD22a表达载体，置于BAD启动子下游，由阿拉伯糖进行诱导操控，获得pBADM载体；依据人表皮细胞生长因子(hEGF)基因序列，对其ACA部分进行突变，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因(hEGF-ACA-)，并克隆到pBADM质粒，获得pBADME。
4.利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1)根据人表皮细胞生长因子hEGF全长序列设计引物，并替换掉密码子中的ACA序列以获得不含ACA序列的hEGF基因，再将hEGF-ACA-基因序列克隆进入pBADM载体，重组成表达载体pBADME；相应表达出的重组蛋白hEGF与人体表皮细胞生长因子在氨基酸序列上一致；
2)将步骤1)中构建好的表达载体pBADME分别转化至大肠杆菌BL-21/JM109，在35℃下，250rpm.培养至OD600达到3.0，以l∶100接种到新鲜培养基继续培养至OD600达到0.5，将温度调到30℃，用IPTG与阿拉伯糖双诱导16～20h，IPTG诱导浓度范围为0.1～1mmol；阿拉伯糖诱导浓度范围为0.01%～0.1%，得到高产量的人表细胞皮生长因子。
5.如权利要求4所述利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，其特征在于在步骤1)中，所述pBADME载体含有受阿拉伯糖诱导的限制性核酸内切酶ChpA的表达盒，同时含有受IPTG诱导的人表皮细胞生长因子hEGF-ACA-表达盒。
6.如权利要求4所述利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，其特征在于在步骤2)中，所述IPTG与阿拉伯糖双诱导后，所表达的ChpA将降解细胞内大多数含ACA序列的mRNA，而对于hEGF-ACA-基因的mRNA没有影响。
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