CN101605807A - 改良的重组人类精氨酸i表达系统 - Google Patents

改良的重组人类精氨酸i表达系统 Download PDF

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CN101605807A
CN101605807A CNA2007800459580A CN200780045958A CN101605807A CN 101605807 A CN101605807 A CN 101605807A CN A2007800459580 A CNA2007800459580 A CN A2007800459580A CN 200780045958 A CN200780045958 A CN 200780045958A CN 101605807 A CN101605807 A CN 101605807A
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China
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human arginase
nucleic acid
arginase enzyme
plasmid
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CNA2007800459580A
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黄予良
先宗树
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BIO CANCER TREAT INTERNAT Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
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    • C12Y305/03001—Arginase (3.5.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract

本发明提供一种用以改善重组人类精氨酸酶I表达的新重组蛋白表达系统。所述系统包含一用以改善重组人类精氨酸酶I表达的分离和纯化核酸分子以建构质粒和大肠杆菌种。在另一方面，本发明提供一种生产分离的大肠杆菌种的方法用以表达所述精氨酸酶。

Description

改良的重组人类精氨酸I表达系统
技术领域
本发明涉及人类精氨酸酶I的克隆。特别地，本发明涉及对应于所述人类精氨酸酶I的核酸分子和质粒。本发明还涉及一种用以表达所述人类精氨酸酶I的重组蛋白的大肠杆菌。本发明还涉及一种生产重组蛋白的方法。
背景技术
重组工序是利用基因工程生物去生产有医药用途的蛋白。好些例子如胰岛素，生长激素和疫苗就是重组工序的产品。上述的蛋白可以在工厂里大量地以大桶的基因工程细菌来生产。在重组工序中，最普遍使用的生物是大肠杆菌。
相比于其它生物，我们大概对于细菌的生理和基因更为了解得多。然而，一个工序的成功与否通常依靠所述用基因工程技术制作的细菌的存活率和所述带有重要讯息以制做最后成品的重组脱氧核糖核酸。建构差劣的质粒可能不能够产生有意义数量的成品但同时降低所述用基因工程技术制作的细菌的存活率。而且，亦会有产生难以剔除的污染物和损害最终成品质量的风险。
发明内容
基于上述原因，本发明目的是提供一个更好的基因工程技术制作的细菌以生产人类精氨酸酶I，从而扩大所述精氨酸酶的产量，令所述方法安全及有效地制造出符合药品生产质量管理规范的材料。
因此，在一方面本发明是一分离并纯化的核酸分子用以表达重组人类精氨酸酶I。
在本发明的一优选实施例是使用所述核酸分子以建构用以表达重组人类精氨酸酶I的质粒。
在另一方面，本发明是使用所述质粒以建构一分离品种的大肠杆菌，用以制做重组人类精氨酸酶I。
附图说明
图1显示从已转化的感受态DH5(α)大肠杆菌细胞中萃取的质粒pET30(+)/ARGC的琼脂糖电泳分析。萃取后的pET30(+)/ARGC以限制性内切酶NdeI和XhoI酶解。预期中大小为1.4kb和5kb的片段显现。Lane M：λDNA/EcoRI+HindIII标记(MBI)；Lane1：以NdeI和XhoI双重酶解后的pET30a(+)/ARGC；Lane2：未经酶解的pET30a(+)/ARGC。
图2显示包含1,383个核酸的重组pET30(+)/ARGC中的插入核苷酸序列。
图3显示从已转化的感受态DH5(α)大肠杆菌细胞中萃取的质粒pET30(+)/ARGM的琼脂糖电泳分析。萃取后的pET30(+)/ARGM以限制性内切酶NdeI和XhoI酶解。预期中大小为1kb和5kb的片段显现。Lane M：λDNA/EcoRI+HindIII标记(MBI)；Lane1：以NdeI和XhoI双重酶解后的pET30a(+)/ARGM；Lane2：未经酶解的pET30a(+)/ARGM。
图4显示包含993个核酸的重组pET30(+)/ARGM中的插入核苷酸序列，其中包括2套终止密码子TAA。
图5显示由pET30a(+)/ARGM的核苷酸序列中的993个核酸编码区域推论出的蛋白序列。所述已表达的人类精氨酸酶I蛋白是一322氨基酸残基加上起始的甲硫氨酸和6个组氨酸标记的蛋白，或总共329氨基酸残基。
图6显示所述以BL21(DE3)表达的pAED-4/ARGC的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。Lane M：低分子量蛋白标记；Lane1：没有IPTG诱导的重组人类精氨酸酶I；Lane2：诱导后一小时；Lane3：诱导后2小时；Lane4：诱导后3小时；Lane5：诱导后4小时；Lane6：诱导后5小时。
图7显示所述以BL21(DE3)表达的pET30a(+)/ARGC的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。Lane M：低分子量蛋白标记；Lane1：没有IPTG诱导的重组人类精氨酸酶I；Lane2：诱导后一小时；Lane3：诱导后2小时；Lane4：诱导后3小时；Lane5：诱导后4小时；Lane6：诱导后5小时。
图8显示所述以BL21(DE3)表达的pET30a(+)/ARGM的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。Lane M：低分子量蛋白标记；Lane P：纯人类精氨酸酶I；Lane1：没有IPTG诱导的重组人类精氨酸酶I；Lane2：诱导后一小时；Lane3：诱导后2小时；Lane4：诱导后3小时；Lane5：诱导后4小时；Lane6：诱导后5小时。
具体实施方式
实施例1：建构pET30a(+)/ARGC质粒
pET30a(+)/ARGC质粒可用基因克隆领域中的普通实验技巧制备。首先，pAED-4/ARGC质粒和pET30a(+)质粒独立地分别以限制性内切酶NdeI和XhoI在37℃中酶解过夜。然后，已酶解的片断与T4DNA连接酶在16℃中混合过夜。所述已连接的质粒转化进感受态DH5(α)大肠杆菌细胞内。在包含30ug/ml卡那霉素的LB plate中进行筛选。挑选单一菌落并培养。所述已连接质粒以限制性内切酶NdeI和XhoI在37℃中酶解一小时萃取，并以电泳方法核实。最后，所述已连接并萃取的质粒，当中包含一pET30(+)骨干和所述人类精氨酸酶基因(包含非编码序列)被命名为pET30(+)/ARGC。所述核酸序列经InvitrogenBiotechnology Co.，Ltd.(Shanghai)核实。如图2所示，所述核酸序列与理论上的序列完全相同，其包含1,383核酸。
实施例2：pET30a(+)/ARGC质粒的表达
所述已建构的pET30a(+)/ARGC在包含30μg/mL卡那霉素的LB培养碟中用以转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌细胞。经过12小时的生长时间后，挑选单一菌落并转移至50mL LB培养基。所述细胞在37℃，250rpm中发酵。当OD600是0.6到0.8时，加入IPTG使浓度达到0.4mM以诱导细胞进行表达。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试表达水平。
实施例3：建构pET30a(+)/ARGM质粒
如下所示的两个引物(SEQ ID NO.1和2)，是设计为利用限制性内切酶NdeI和XhoI建构pET30a(+)/ARGM质粒所用：
1-F：5’-GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCAC-3’
2-R：5’-CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAATAG-3
pET30a(+)/ARGM质粒可用基因克隆领域中的普通实验技巧制备。首先，以pAED-4/ARGC质粒作为模板用PCR(聚合酶链锁反应)技术扩增pAED-4/ARGC质粒。所述已扩增的基因片段和pET30a(+)质粒独立地分别以限制性内切酶NdeI和XhoI在37℃中酶解过夜。然后，已酶解的片断与T4DNA连接酶在16℃中混合过夜。所述已连接的质粒转化进感受态DH5(α)大肠杆菌细胞内。在包含30ug/ml卡那霉素的LBplate中进行筛选。挑选单一菌落并培养。所述已连接质粒以限制性内切酶NdeI和XhoI在37℃中酶解一小时萃取，并以电泳方法核实。最后，所述已连接并萃取的质粒，当中包含一pET30(+)骨干和所述人类精氨酸酶基因(不包含非编码序列)被命名为pET30a(+)/ARGM。所述核酸序列经Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd.(Shanghai)核实。如图4所示，所述核酸序列与理论上的序列完全相同，其包含993核酸。
实施例4：pET30a(+)/ARGM质粒的表达
所述已建构的pET30a(+)/ARGM在包含30μg/mL卡那霉素的LBplate中用以转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌细胞。经过12小时的生长时间后，挑选单一菌落并转移至50mL LB培养基。所述细胞在37℃，250rpm中发酵。当OD600是0.6到0.8时，加入IPTG使浓度达到0.4mM以诱导细胞进行表达。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试表达水平。
实施例5：比较以BL21(DE3)大肠杆菌表达的人类精氨酸酶I的表达水平
图6显示以pAED-4/ARGC转化的BL21(DE3)大肠杆菌细胞的人类精氨酸酶的表达水平。显然，杂质高而表达水平低。图7显示以pET30a(+)/ARGC转化的BL21(DE3)大肠杆菌细胞的重组人类精氨酸酶的表达水平。显然而见，如与以pAED-4/ARGC转化的细胞比较，其内容包含更少纯度。虽然如图6所示，pET30a(+)/ARGC的表达水平是稍微高于pAED-4/ARGC，但人类精氨酸酶I的产量依然低。图8显示以pET30a(+)/ARGM转化的BL21(DE3)大肠杆菌细胞的人类精氨酸酶的表达水平。可以见到，在三个质粒当中，其内容是最纯净而表达水平也是最高的。
实施例6：比较表达人类精氨酸酶I的BL21(DE3)大肠杆菌的稳定性
表1，2和3显示以pAED-4/ARGC，pET30a(+)/ARGC和pET30a(+)/ARGM转化的大肠杆菌细胞的生理特征在质粒稳定性的一方面的比较。最初，以pAED-4/ARGC和pET30a(+)/ARGC转化的大肠杆菌细胞表现出正常的生长率和抗卡那霉素的能力。但经过4个月储存在-80℃的甘油里面后，除非将稀释倍数减至10e4-10e5，否则没有任何菌落可以检测到。而在发酵液培养基当中，没有任何基因表达可以检测到。
以pET30a(+)/ARGM转化的大肠杆菌细胞，最初在稀释倍数为10e9-10e10的情况下，显示正常的抗卡那霉素能力。而且，其表达水平亦为15％至25％，这是相比pAED-4/ARGC和pET30a(+)/ARGC转化的细胞更高。而经过6个月储存在-80℃的甘油里面后，pET30a(+)/ARGM转化的细胞仍然保持正常水平的抗卡那霉素能力，而表达水平亦比经过4个月储存在-80℃的甘油里面后，以pET30a(+)/ARGC转化的细胞更高。
表1-pAED-4/ARGC转化的BL21(DE3)的生理性质
  时间   监测菌落的稀释倍数   从SDS PAGE推断的IPTG诱导基因表达
  T0   10e9-10e10   ～7％
  T4月   10e4-10e5   0％
表2-pET30a(+)/ARGC转化的BL21(DE3)的生理性质
  时间   监测菌落的稀释倍数   从SDS PAGE推断的IPTG诱导基因表达
  T0   10e9-10e10   ～7％
  T4月   10e4-10e5   0％
表3-pET30a(+)/ARGM转化的BL21(DE3)的生理性质
  时间   监测菌落的稀释倍数   从SDS PAGE推断的IPTG诱导基因表达
  T0   10e9-10e10   15％-25％
  T6月   10e9-10e10   15％-25％
本发明的优选实施例在此完全描述。虽然具体描述提及个别的实施例，但本发明所属领域的技术人员可以在本发明范围内对其加以修改。因此，本文描述的实施例不应视作为限制本发明的解释。
例如，尽管本发明参照使用由Novagen所出品的pET30a(+)载体，本发明所属领域的技术人员可以知道其它的载体也可以使用，例如pTrcHis(Invitrogen)，pGEX(Amersham Biosciences)，pBAD(Invitrogen)，pRSET(Invitrogen)，pBV220，和pQE(Qiagen)。
本发明所属领域的技术人员亦能充分意识到，虽然本发明使用一lac启动子，本技术领域的技术人员可以知道其它的启动子例如色氨酸启动子，Trc启动子，Tac启动子，araBAD启动子，T7启动子，T5启动子，和温度诱导启动子也可使用。
此外，本发明所属技术领域的技术人员亦知道，虽然本发明使用BL21(DE3)为宿主，其它的表达系统例如TOP10，M15，和DH5a大肠杆菌亦可以使用。
本发明描述了使用人类精氨酸酶I的编码区域，其包含990bp并包括最后转译为终止密码子UAA的TAA。本发明的最优选实施例使用人类精氨酸酶I的编码区域，其包含993bp，并有一附加系列的TAA以进一步确保终止讯号会表达。
序列表
<110>黄予良
     先宗树
<120>改良的重组人类精氨酸I表达系统
<130>B001.012.NPRUS
<140>US 11/609,902
<141>2006-12-12
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>化学合成
<400>1
ggaattccat atgcatcacc atcaccatca c                                    31
<210>2
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>化学合成
<400>2
ccgctcgagt tattacttag gtgggttaag gtagtcaata g                         41
<210>3
<211>1383
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>3
atgcatcacc atcaccatca catgagcgcc aagtccagaa ccatagggat tattggagct     60
cctttctcaa agggacagcc acgaggaggg gtggaagaag gccctacagt attgagaaag    120
gctggtctgc ttgagaaact taaagaacaa gagtgtgatg tgaaggatta tggggacctg    180
ccctttgctg acatccctaa tgacagtccc tttcaaattg tgaagaatcc aaggtctgtg    240
ggaaaagcaa gcgagcagct ggctggcaag gtggcagaag tcaagaagaa cggaagaatc    300
agcctggtgc tgggcggaga ccacagtttg gcaattggaa gcatctctgg ccatgccagg    360
gtccaccctg atcttggagt catctgggtg gatgctcaca ctgatatcaa cactccactg    420
acaaccacaa gtggaaactt gcatggacaa cctgtatctt tcctcctgaa ggaactaaaa    480
ggaaagattc ccgatgtgcc aggattctcc tgggtgactc cctgtatatc tgccaaggat    540
attgtgtata ttggcttgag agacgtggac cctggggaac actacatttt gaaaactcta    600
ggcattaaat acttttcaat gactgaagtg gacagactag gaattggcaa ggtgatggaa    660
gaaacactca gctatctact aggaagaaag aaaaggccaa ttcatctaag ttttgatgtt    720
gacggactgg acccatcttt cacaccagct actggcacac cagtcgtggg aggtctgaca    780
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gatataatgg aagtgaaccc atccctgggg aagacaccag aagaagtaac tcgaacagtg    900
aacacagcag ttgcaataac cttggcttgt ttcggacttg ctcgggaggg taatcacaag    960
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caggagacaa agctaccaca tgtggaaagg tactatgggt ccatgtcatt caaaaaatgt   1380
gat                                                                 1383
<210>4
<211>993
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>4
atgcatcacc atcaccatca catgagcgcc aagtccagaa ccatagggat tattggagct     60
cctttctcaa agggacagcc acgaggaggg gtggaagaag gccctacagt attgagaaag    120
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ccctttgctg acatccctaa tgacagtccc tttcaaattg tgaagaatcc aaggtctgtg    240
ggaaaagcaa gcgagcagct ggctggcaag gtggcagaag tcaagaagaa cggaagaatc    300
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aacacagcag ttgcaataac cttggcttgt ttcggacttg ctcgggaggg taatcacaag    960
cctattgact accttaaccc acctaagtaa taa                                 993
<210>5
<211>329
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>5
Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly
1               5                   10                  15
Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu
            20                  25                  30
Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp
    50                  55                  60
Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val
65                  70                  75                  80
Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys
                85                  90                  95
Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile
            100                 105                 110
Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile
        115                 120                 125
Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser
    130                 135                 140
Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile
                165                 170                 175
Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly
            180                 185                 190
Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr
        195                 200                 205
Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser
    210                 215                 220
Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val
                245                 250                 255
Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr
            260                 265                 270
Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val
    290                 295                 300
Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys
305                 310                 315                 320
Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys
                325

Claims (13)

1.一种表达重组人类精氨酸酶I的分离和纯化的核酸分子，其中所述核酸分子包括人类精氨酸酶I的编码序列和一可操作地与之连接的预先设定的启动子序列，所述启动子序列刺激一预先设定的表达系统表达所述人类精氨酸酶I，其中所述核酸序列不包括人类精氨酸酶I mRNA的非编码序列。
2.如权利要求1的分离和纯化核酸分子，其中所述核酸分子进一步包括一编码多个组氨酸的核酸序列。
3.如权利要求2的分离和纯化核酸分子，其中所述核酸序列编码最少六个组氨酸。
4.一种表达重组人类精氨酸酶I的质粒，其中所述质粒包括人类精氨酸酶I的编码序列和一可操作地与之连接的预先设定的启动子序列，所述启动子序列刺激一预先设定的表达系统表达所述人类精氨酸酶I，其中所述质粒不包括人类精氨酸酶I mRNA的非编码序列。
5.如权利要求4的质粒，其中所述质粒包括一编码多个组氨酸的核酸序列。
6.如权利要求5的质粒，其中所核酸序列编码最少六个组氨酸。
7.如权利要求4的质粒，其中所述启动子序列编码一可操作地与所述人类精氨酸酶I编码序列连接的lac操纵子。
8.一种表达重组人类精氨酸酶I的大肠杆菌种，其中所述大肠杆菌包括一核酸分子，所述核酸分子包括人类精氨酸酶I的编码序列和一可操作地与之连接的预先设定的启动子序列，所述启动子序列刺激一预先设定的表达系统表达所述人类精氨酸酶I，其中所述核酸序列不包括人类精氨酸酶I mRNA的非编码序列。
9.如权利要求8的大肠杆菌种，所述核酸分子包括一编码多个组氨酸的核酸序列。
10.如权利要求9的大肠杆菌种，其中所述核酸序列编码最少六个组氨酸。
11.如权利要求8的大肠杆菌种，其中所述核酸分子包括一在一T7启动子下游序列的lac操纵子序列，所述lac操纵子序列可操纵地与所述核酸分子连接。
12.一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括：
a)建构一如权利要求8所示的重组大肠杆菌种；
b)以批次发酵法发酵所述重组大肠杆菌细胞；
c)诱导所述重组大肠杆菌细胞以刺激所述重组蛋白的表达；和
d)由所述发酵产品纯化出所述重组蛋白。
13.如权利要求12的方法，其中所述人类精氨酸酶I有最少六个组氨酸与之连结，所述纯化方法包括在一螯合柱中的亲和层析。
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