CN105874063A - 产生端粒酶逆转录酶(tert)的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在酵母细胞中表达端粒酶逆转录酶(TERT)来可再现地产生大量可溶的且有活性的该酶的方法。已通过控制纯化过程的特定参数获得高产率的重组活性TERT。由此获得的TERT蛋白质在有体外转录的TR的情况下展示端粒酶活性,从而为端粒酶装配抑制剂的高通量化学筛选和治疗应用提供了方便。
Description
背景技术
端粒是位于真核染色体末端的含有非编码重复DNA序列(人中为TTAGGG)的结构。这些区域在连续多轮的细胞分裂中渐进地缩短,从而导致基本遗传信息的损失并最终导致细胞死亡。因此端粒区域的存在阻止了来自染色体末端的DNA的损失,使得免于发生细胞衰老和老化的现象。
维持端粒是被称为端粒酶的端粒特异性DNA聚合酶的一种功能。端粒酶是携带其自身RNA分子(TR)的逆转录酶,所述RNA分子用作用于将多个TTAGGG重复序列添加到端粒的富G链的3’-端的模板。因此,端粒酶含有两种必需组分,即具有逆转录酶(RT)活性的蛋白质核心和RNA分子(TR)。人端粒酶的核心蛋白质被称为“端粒酶催化亚单位”或“hTERT”(表示人端粒酶逆转录酶)。该亚单位是含有以下三个区域的127kDa多肽:i)催化性RT结构域;ii)端粒酶特异性N-末端结构域,其与端粒酶活性、结合到RNA亚单位和多聚化有关;和iii)C-末端延伸物,其据推测具有促进酶持续合成能力的作用(Autexier C.等人,Annu.Rev.Biochem.2006)。在细胞中,hTERT和其模板RNA是更大复合体的一部分,所述更大复合体包括许多其它蛋白质,包括TLP1(Nakayama J.等人,Cell 1997)、hsp90、hsp23(HoltS.E.等人,Genes Dev.1999)和角化不良素(dyskerin)(Mitchell J.R.等人Nature 1999)。
现在广泛接受的是,端粒酶活性促进许多癌症类型的永生性。因此,预计抑制hTERT催化组分将恢复端粒缩短过程并最终导致癌细胞死亡,而不影响正常的体细胞,因为这些细胞不表达端粒酶。因此,hTERT酶活性抑制剂或端粒酶装配抑制剂被认为是用于癌症治疗的有前景的工具(Zhang X.等人,Genes Dev.1999)。
然而,鉴别有效的端粒酶抑制剂需要预先对进行性端粒酶复合体、特别是活性hTERT催化亚单位进行体外重构,以执行决定性的筛选测定。
此外,生成大量活性形式的重组hTERT对于开发旨在诱发抗端粒酶免疫应答的疫苗可能是至关重要的,所述疫苗可用于针对罹患癌症的患者的免疫治疗方案。
最后,重组hTERT可以有利地被用于药物组合物中以治疗特征在于不存在人端粒酶活性的疾病和病况,如与细胞衰老有关的疾病(特别是老化疾病)和不育症。
因此迫切需要获得大量可溶的且有活性的重组hTERT蛋白质。然而,迄今为止,尚未开发出令人满意的表达和纯化方案。
实际上,纯化大量适当折叠且有酶活性的重组hTERT被认为是异常困难的问题,因为使用不同的表达和纯化系统来产生该蛋白质的各种尝试都只得到了有限的结果。全长hTERT不能被过表达(Holt S.E.等人,Genes Dev.1999)或已被报道是不可溶的(MasutomiK.等人J.Biol.Chem.2000;Mikuni O.等人BBRC 2002;Wu C.K.等人ProteinExpr.Purif.2007)。使用MEGA-9洗涤剂将所述酶溶解(如由Masutomi K.等人J.Biol.Chem.2000所提出的)是不可再现的(WuC.K.等人Protein Expr.Purif.2007)。此外,借助于亲和标签纯化活性hTERT是低效率的:His-hTERT融合物已被表达,但尚未报道利用His标签进行成功纯化(Bachand F.等人,JBC 1999和Wenz等人EMBO 2001)。作为纯化的一种替代方案,由昆虫细胞分泌hTERT是不成功的,因为该酶保持结合到内质网(Wu等人,Protein Expr.Purif.2007)。最后,已报道使用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(sepharose)或肝素-琼脂糖凝胶纯化的hTERT在柱纯化后丧失其端粒酶重构能力(Bachand F等人,JBC 1999和Mizuno H.等人,J.Biochem.,2007)。因此,似乎不能容易地产生经标记的hTERT蛋白质以制备重组端粒酶。鉴于所有这些不成功的尝试,推断人端粒酶“纯化起来是具有挑战性的并且不能被大量制备”(Alves D.等人,Nat.Chem.Biol.2008)。
然而,本发明的诸位发明人在本文中证明,实际上可以通过在酵母细胞如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞中表达hTERT而可再现地产生大量可溶的且有活性的hTERT。可以通过控制如下文所详述的纯化过程的特定参数进一步获得高产率的重组活性hTERT。由此获得的hTERT蛋白质在有体外转录的hTR的情况下展示端粒酶活性,从而为端粒酶装配抑制剂的高通量化学筛选和治疗应用提供了方便。
附图说明
图1:hTERT可以使用PGAPZ载体来表达,但除非使用特定的MBP标签,否则不能被纯化。
A)使用PGAPZ载体在细胞内表达GST-hTERT(155kDa)。使用抗GST抗体(Sigma)对来自野生型巴斯德毕赤酵母的细胞提取物(泳道1)或对来自表达GST-hTERT的巴斯德毕赤酵母细胞的细胞提取物(泳道2)进行蛋白质印迹(Western-blot)。B)Zeocin抗性克隆表达GST-hTERT。使用抗GST抗体(Sigma)对来自野生型巴斯德毕赤酵母的细胞提取物(泳道1)或对经转化以表达GST-hTERT的不同巴斯德毕赤酵母克隆的细胞提取物(泳道2-7)进行蛋白质印迹。C)GST-hTERT显示对谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(泳道1:流动的;泳道2:结合级分)的差亲和力。D)不能分泌α-hTERT。利用抗hTERT抗体对野生型巴斯德毕赤酵母细胞(泳道1、3)或α-hTERT转化酶母(泳道2、4)的细胞内级分(泳道1-2)或细胞外级分(泳道3-4)进行的蛋白质印迹,所述α-hTERT转化酶母对应于融合到酵母(Saccharomyces s.)α因子的分泌信号的hTERT。E)含有不同标签的hTERT表达水平的比较。通过利用抗hTERT抗体对用α-hTERT(泳道1)、GST-hTERT(泳道2)和未标记的hTERT(泳道3,127kDa)转化的巴斯德毕赤酵母细胞进行的蛋白质印迹来分析酵母的可溶性细胞内含量。F)MBP-hTERT和α-MBP-hTERT在巴斯德毕赤酵母细胞中以较低水平表达。用抗hTERT抗体对用MBP-hTERT(泳道1和2)、hTERT(泳道3)和α-MBP-hTERT(泳道4)转化的巴斯德毕赤酵母细胞的细胞提取物进行的蛋白质印迹。G)利用基于甲醇的表达系统未检测到MBP-hTERT和α-MBP-hTERT蛋白质。利用抗HA抗体对在AOX1启动子(pPIC3.5K载体)的控制下表达MBP-hTERT的毕赤酵母属细胞(泳道1)或对表达α-MBP-hTERT的毕赤酵母属细胞(泳道2)进行的蛋白质印迹。H)hTERT的N-末端部分是可及的。使用抗HA标签抗体使来自表达His-HA-hTERT的巴斯德毕赤酵母细胞的总细胞裂解物的His-HA-hTERT免疫沉淀后进行的蛋白质印迹(泳道3)。对照:来自表达His-HA-hTERT的酵母的总细胞裂解物(泳道1)和仅用A+G珠进行免疫沉淀(泳道2)。I)低细胞内pH导致蛋白质降解。当在本发明的条件下(在细胞内pH 6.3下)纯化hTERT时,它不降解(泳道1),而当细胞内pH是5.5时,它显著降解(泳道2)。J)不需要蛋白酶抑制剂和洗涤剂。进行标准纯化(泳道1)并且与在提取溶液和洗涤溶液中添加蛋白酶抑制剂混合液(Roche)和1%triton的情况下进行的纯化(泳道2)进行比较,后者不增加产率并且仅非常微小地提高纯度。K)最佳纯化在微酸性/中性pH下发生。在柱结合之前,将提取物的pH调节到不同的pH,然后针对每种条件以对应的pH进行洗涤步骤。
图2:巴斯德毕赤酵母中的cMBP-hTERT的纯化。A)cMBP-hTERT的纯化和切割。使用直链淀粉-琼脂糖凝胶纯化cMBP-hTERT。通过蛋白质印迹(左)和考马斯亮蓝(CoomassieBrilliant Blue)(右)两者来监测纯化的蛋白质。泳道1:细胞提取物,泳道2:从直链淀粉珠中洗脱的cMBP-hTERT,和泳道3:由TEV蛋白酶切割MBP标签之后的蛋白质。B)cMBP-hTERT纯度和MBP标签去除效率。泳道1:从直链淀粉柱中洗脱之后的cMBP-hTERT。泳道2:由过量的His-TEV蛋白酶在室温下切割1小时后的cMBP-hTERT。泳道3:通过镍柱再结合来去除TEV蛋白酶,并且将样品再浓缩以更精确地评价纯度水平和由TEV蛋白酶切割的效率。
图3:端粒酶活性的重构。通过向100ng纯化的cMBP-hTERT中添加500ng体外转录的hTR来重构端粒酶活性并且通过若干方法来检测。A)利用cMBP-hTERT和hTR(泳道1)、单独的cMBP-hTERT(泳道2)或单独的hTR(泳道3)进行的端粒酶直接测定。B)qTRAP。利用LightCycler II(Roche)对端粒酶活性的定量测量显示重构活性是在一个293T细胞中发现的重构活性(3)的约9000倍(1,2)。C)利用单独的hTR(泳道1)、cMBP-hTERT和hTR(泳道2)以及单独的MBP-hTERT(泳道3)进行的TRAP(端粒重复序列扩增方案)。D)通过qTRAP测量的端粒酶重构动力学。
图4:hTERT与内源性酵母RNA的缔合。(A)hTERT蛋白质被纯化为核糖核蛋白(RNP),如通过琼脂糖凝胶迁移所显示。(B)泳道L:100bp DNA梯状条带(ladder)(Promega)。泳道3:纯化的cMBP-hTERT。泳道4:用蛋白酶K消化的cMBP-hTERT。泳道5:纯化的cMBP-hTERT。泳道6:纯化的cMBP-hTERT+DNA酶I。泳道7:纯化的cMBP-hTERT+RNA酶A。泳道8:纯化的cMBP-hTERT+RNA酶T1。泳道8:纯化的cMBP-hTERT+微球菌核酸酶(MNase)。泳道9:纯化的cMBP-hTERT+Benzonase。
图5:电泳迁移率变动测定(Electrophoretic Mobility Shift Assay)(EMSA)。在添加50μCi[α-32P]-CTP的情况下体外合成hTR。对于每个泳道来说,将1μg cMBP-hTERT与20μl 0.5μg经标记的hTR培育1小时。使复合体在1x TBE中的1.2%冷冻的琼脂糖凝胶上在110V下迁移2小时。将凝胶在10%乙酸和10%乙醇中固定1小时,干燥并暴露于磷光成像仪屏。使用STORM 860(GE Healthcare)进行扫描。泳道1仅含有hTR。泳道2和3含有用RNA酶A纯化的hTR和cMBP-hTERT。泳道4和5含有未用RNA酶A纯化的hTR和cMBP-hTERT。
具体实施方式
已报道端粒酶的hTERT亚单位在例如昆虫细胞(Masutomi K.等人J.Biol.Chem.2000;Wenz C.等人EMBO 2001;Mikuni O.等人BBRC 2002和Wu C.K.等人,Protein Expr.Purif.2007)或酵母细胞(Bachand F.等人,JBC 1999)中的成功表达。然而,所有这些方法都需要使用蛋白酶抑制剂,这显著地影响这些操作的成本。因此,它们不适于获得大量hTERT酶。
本发明涉及用于以低成本可再现地产生大量可溶的且有活性的TERT的方法。本发明的方法需要使用在酵母细胞中引入的重组载体(例如,整合质粒)。重要的是,进行TERT的细胞裂解和纯化不需要蛋白酶抑制剂。也不推荐使用商业裂解缓冲液,因为显示纯水产生最好结果。因此本发明的方法可以在具有常规设施的实验室中以低成本进行。
本发明的诸位发明人公开了在酵母系统中表达正确折叠的hTERT,以及借助于严密调控的纯化过程来可再现地回收大量该酶。重要的是,并且与现有技术所公开的方案相比,本发明的表达和纯化过程使得能够在纯化后回收酶活性的hTERT。此外,借助于本发明的方法回收的酶是可溶的,并且可以有效地用于鉴别人端粒酶装配和/或活性的强效且特异性的抑制剂的筛选方法。
发明人测试并比较了许多实验条件以鉴别用于表达和纯化过程的每个步骤的最好条件。因此,他们鉴别出一种优化且可再现的方法以体外产生端粒酶的TERT亚单位,这被认为是一个巨大挑战。
该方法可用于产生与人hTERT同源的端粒酶逆转录酶(TERT),例如来自其它物种(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母、嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)、斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryziaslatipes)、小家鼠(Mus musculus)等)的端粒酶逆转录酶。因此,可以通过本发明的方法产生人端粒酶逆转录酶(hTERT)和非人TERT。
更确切地说,本发明的方法含有至少4个不同的步骤:
a)提供包含核苷酸载体的酵母细胞,所述核苷酸载体编码用适当标签标记的TERT蛋白质,
b)使所述细胞在特定条件下生长,以使得由所述酵母细胞在细胞内产生重组的TERT蛋白质,
c)在特定条件下制备所述酵母细胞的粗制蛋白质提取物,
d)借助于适当的亲和纯化方案纯化所述TERT蛋白质。
更确切地说,该适当的标签是缺失N-末端周质靶向信号的麦芽糖结合蛋白质(MBP)标签(cMBP)。实际上,本发明的诸位发明人已经证明,当TERT结合到所述标签时,可以从酵母中回收大量活性的TERT,并且当它可操作地连接到在酵母中有功能的组成型启动子(例如,GAPDH启动子)时,cMBP-TERT融合蛋白质的表达被有利地增强。
发明人也已证实,必须精确地监测表达cMBP-hTERT的酵母细胞的生长直到达到静止期,并且在其中培养酵母细胞的培养基是至关重要的。
对于cMBP-hTERT融合蛋白质的提取来说,不需要复杂的裂解缓冲液,因为可以在冷的纯水中进行机械剪切,所述纯水有利地不含有任何蛋白酶抑制剂。然后优选地通过使用pH为6.0到7.5、更优选地6.3到7.0的结合和洗涤缓冲液进行纯化步骤。使用pH低于7.6的结合和洗涤缓冲液使得提高纯化的hTERT的产率和比活性。
通过再现这些实验条件,本领域技术人员将能够以低成本产生大量活性形式的hTERT酶。通常,通过在摇瓶中生长的1升酵母细胞可以回收0.3mg有活性且可溶的hTERT酶。
在第一方面,本发明涉及一种产生可溶且有活性的端粒酶逆转录酶(TERT)蛋白质的方法,其包括以下步骤:
a)使包含核苷酸载体的酵母细胞生长,所述载体含有可操作地连接到编码融合蛋白质的核苷酸序列的组成型启动子,所述融合蛋白质含有:
-缺失N-末端周质靶向信号的麦芽糖结合蛋白质标签(cMBP),和
-端粒酶逆转录酶(TERT)蛋白质,
b)制备步骤a)的所述细胞的粗制蛋白质提取物,
c)如有必要,将所述提取物的pH调节到6.0到7.5的pH,
d)借助于直链淀粉偶联的固体支持物来纯化所述融合蛋白质cMBP-TERT。
本发明的方法可以用于产生人端粒酶逆转录酶(hTERT),以及来自其它动物种的与人hTERT同源的TERT酶。
这些非人TERT蛋白质可以在由以下组成的组中进行选择:
-酿酒酵母的TERT(uniprot Q06163),
-粟酒裂殖酵母的TERT(uniprot O13339),
-乳酸克鲁维酵母的TERT(GenBank:CAH01870.1),
-巴斯德毕赤酵母的TERT(uniprot F2QT80),
-嗜热四膜虫的TERT(uniprot O77448),
-红鳍东方鲀的TERT(uniprot Q4KTA7),
-青鳉的TERT(NCBI NP_001098286.1),
-小家鼠的TERT(uniprot O70372),
-褐鼠(Rattus Norvegicus)的TERT(uniprot Q673L6),
-斑马鱼的TERT(uniprot A2THE9),
-狼犬(Canis lupus)的TERT(uniprot Q6A548),
-或本领域内所述的任何TERT蛋白质,例如,NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=telomerase+reverse+transcriptase上所述的任何TERT蛋白质,
-ENSEMBL基因组服务器www.ensembl.org/Multi/Search/Results?q=TERT;facet_feature_type=Gene上所述的任何TERT蛋白质,
-或被Uniprot:http://www.uniprot.org/uniprot/?query=tert&sort=score引用的任何TERT蛋白质。
在一个优选的实施方案中,本发明涉及一种产生可溶且有活性的人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白质的方法,其包括以下步骤:
a)使包含核苷酸载体的酵母细胞生长,所述载体含有可操作地连接到编码融合蛋白质的核苷酸序列的组成型启动子,所述融合蛋白质含有:
-缺失N-末端周质靶向信号的麦芽糖结合蛋白质标签(cMBP),和
-人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白质,
b)制备步骤a)的所述细胞的粗制蛋白质提取物,
c)如有必要,将所述提取物的pH调节到6.0到7.5的pH,
d)借助于直链淀粉偶联的固体支持物来纯化所述融合蛋白质cMBP-hTERT。
优选地,在酵母细胞的细胞内pH达到低于5.8的值之前且更优选地在酵母细胞的细胞内pH达到低于6.3的值之前,制备步骤a)的细胞的粗制蛋白质提取物。
优选地,在步骤c)中,将所述提取物的pH调节到6.3到7.0的pH。如果在步骤b)之后,所述粗制蛋白质提取物已具有6.3到7.0的pH,则这一步骤不是必要的。
端粒酶逆转录酶(缩写为TERT或人中的hTERT)是端粒酶的催化亚单位。这一亚单位连同端粒酶RNA组分(hTR)是端粒酶复合体的最重要组分(Weinrich SL.等人,Nat.Genet.1997)。具体地说,hTERT负责催化在每个染色体端粒的末端添加TTAGGG序列(SEQ ID NO:5)。DNA重复序列的这一添加防止染色体末端在多轮复制后发生降解(PooleJC等人,Gene 2001)。hTERT具有例如SEQ ID NO:1(亚型1,Genbank保藏号:NP_937983.2)。该酶是展示逆转录酶(RT)活性的RNA依赖性DNA聚合酶,即,它能够由RNA模板合成DNA。
术语“人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白质”在本文中是指SEQ ID NO:1的hTERT蛋白质以及其变体。在本发明的上下文中,“hTERT变体”被定义为与SEQ ID NO:1共有至少75%、优选地至少80%且更优选地至少90%序列同一性并且与SEQ ID NO:1的酶具有相同的端粒酶催化活性。
通常,hTERT变体具有100kDa到150kDa、优选地100kDa到130kDa的分子量。它们与SEQ ID NO:1的hTERT蛋白质的不同之处可以在于氨基酸残基的内部缺失、插入或保守取代。此类变化可以对应于在天然剪接变体中所发现的那些。EP 0 841 396中公开了优选变体的示例。文献中已提供了催化活性hTERT蛋白质变体的其它示例。Armbruster等人,Mol.Cell.Biol.2001中描述了缺少对于端粒酶活性不必要的接头区域L1和L2的突变体。此外,Banik SSR等人(Mol.Cell.Biol.2002)描述了在区域E-I到E-IV之间呈现突变的突变体,所述突变容许取代而不影响hTERT的催化活性。
术语“序列同一性”是指氨基酸序列之间的同一性或一致性的程度。在本发明的上下文中,如果两个氨基酸序列的氨基酸中的各自至少75%、优选地至少80%且更优选地至少90%是同一的,则它们具有至少75%、优选地至少80%且更优选地至少90%同一性。优选地,通过使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.1970)的全局算法来鉴别氨基多肽序列的同一性。
如本文中所用的,如果hTERT蛋白质变体与SEQ ID NO:1的酶具有相同的逆转录酶活性,则所述hTERT蛋白质变体与SEQ ID NO:1的hTERT蛋白质具有“相同的端粒酶催化活性”。更确切地说,这些变体应当能够通过添加与SEQ ID NO:1的酶一样多的序列TTAGGG(SEQ ID NO:5)的重复序列来延伸DNA引物或染色体端粒。测量逆转录酶活性的方法是本领域所熟知的。下文公开了它们中的一些。
优选地,当被用于本申请中时,术语“hTERT蛋白质”表示SEQ ID NO:1的hTERT蛋白质自身。
用于本发明的方法中的核苷酸载体含有编码人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白质的核苷酸序列。应当了解的是,由于遗传密码的简并性,因此所述核苷酸序列无需具有天然存在的hTERT基因的序列(NM_198253.2,SEQ ID NO:2)。实际上,大量多核苷酸编码具有SEQID NO:1的氨基酸序列的hTERT蛋白质或其变体。用于克隆编码hTERT蛋白质或其变体的核苷酸的试剂和方法例如公开于EP 0841396中。具体地说,使用已针对酵母表达被优化的编码hTERT的核苷酸序列是有利的。
如本文中所用的,术语“核苷酸载体”意指可以借以将外源基因的DNA或RNA序列引入到宿主细胞中的媒介物。核苷酸载体可以包括例如质粒、噬菌体和病毒。在酵母中可以使用三种类型的载体:整合载体质粒(YIp)、游离质粒(YEp)和着丝粒质粒(YCp)。用于在酵母中表达的合适载体包括但不限于pYepSec1、pMFa、pJRY88、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)、PGAPZ(Invitrogen)和pTEF-MF(DualsystemsBiotechProduct)pKLAC2(New England Biolabs)。优选地,本发明的核苷酸载体是整合质粒,也就是说,依赖于整合到用于存活和复制的宿主染色体中的质粒。更优选地,该核苷酸载体是整合质粒PGAPZ(Invitrogen)。
“编码”表达产物如RNA或酶的序列是当被表达时导致产生所述RNA或所述酶的核苷酸序列。
在本发明的载体中,编码hTERT或TERT蛋白质的开放阅读框可操作地连接到组成型启动子。编码序列“可操作地连接到”启动子序列,所述启动子序列当RNA聚合酶将所述编码序列转录成RNA时控制所述编码序列的表达,所述RNA然后被翻译成蛋白质。
“启动子”是可以起始转录(即,在双链DNA的有义链上的3’方向上)的核苷酸序列。在启动子序列内将发现转录起始位点(例如通过利用核酸酶S1作图而方便地发现),以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。启动子可以是组成型的(也就是说,它们在酵母细胞中的所有情况下都是活性的并且允许其可操作地缔合的基因的连续转录)或诱导型的(也就是说,它们的活性是通过限定的生物因素或非生物因素的存在或不存在而被诱导的)。
可以用于本发明的方法中的酵母细胞优选地选自由以下组成的组:酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),以及甲基营养酵母(methylotropic yeast),如巴斯德毕赤酵母和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。在一个优选的实施方案中,用于本发明的方法中的酵母细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。
优选地用于控制本发明基因的表达的启动子是在酵母细胞中组成性地作用的那些。若干组成型酵母启动子可用于酵母宿主细胞中的蛋白质表达。这些包括例如:pCYC启动子、pAdh启动子、pSte5启动子、酵母ADH1启动子、cyc100最小启动子、cyc70最小启动子、cyc43最小启动子、cyc28最小启动子、cyc16最小启动子、pPGK1启动子、CLB1启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)启动子(这些启动子的序列公开于例如http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Yeast/Constitutive)中。
在一个优选的实施方案中,本发明的核苷酸载体含有GAPDH启动子。该启动子在巴斯德毕赤酵母细胞中确实是组成功能性的。在一个更优选的实施方案中,该GAPDH启动子具有序列SEQ ID NO:10。
本发明的核苷酸载体也必定含有编码麦芽糖结合蛋白质(MBP)标签的核苷酸序列,所述麦芽糖结合蛋白质标签缺失其N-末端周质靶向信号。麦芽糖结合蛋白质(MBP)是大肠杆菌(Escherichia coli)的麦芽糖/麦芽糖糊精系统的一部分,所述系统负责麦芽糖糊精的摄取和有效的分解代谢。它是涉及许多蛋白质的复杂运输系统。其N-末端部分含有周质靶向信号,也被称为“周质信号肽”(SEQ ID NO:7)。该信号肽参与将MBP蛋白质输出到细菌细胞的周质中。
与全长MBP标签(SEQ ID NO:6)的融合经常用于增加在大肠杆菌中表达的重组蛋白质的溶解度。另外,MBP可以被用作用于纯化重组蛋白质的亲和标签。通常,含有MBP的融合蛋白质结合到直链淀粉柱,而所有其它蛋白质流过。这些融合蛋白质可以通过用麦芽糖洗脱所述柱来纯化。在本发明中,MBP被用作有利于hTERT或TERT的纯化的标签。
与先前的报道(Wu等人,Protein Expr.Purif.2007)相反,发明人已经证明,可通过减少hTERT蛋白质的细胞外输出来提高hTERT纯化的产率。这是通过去除融合蛋白质MBP-hTERT中的MBP N-末端周质靶向信号实现的。缺失N-末端周质靶向信号的MBP标签在下文中将被称作“cMBP”。cMBP优选地具有SEQ ID NO:8。
在一个优选的实施方案中,本发明的核苷酸载体不含有在酵母中有功能的任何分泌信号,以使得hTERT蛋白质将保留在细胞内。
因此,在一个优选的实施方案中,用序列SEQ ID NO:8的麦芽糖结合蛋白质标签(对应于缺失N-末端周质靶向信号的麦芽糖结合蛋白质标签)标记hTERT或TERT蛋白质。该cMBP标签例如由核苷酸序列SEQ ID NO:9编码。
在本发明的一个优选的实施方案中,编码hTERT或TERT蛋白质的核苷酸序列位于编码cMBP标签的核苷酸序列的5’中。在本发明的另一个实施方案中,编码hTERT蛋白质或TERT的核苷酸序列位于编码cMBP标签的核苷酸序列的3’中。因此,在本发明的融合蛋白质中,cMBP标签可以位于hTERT或TERT酶的C-末端或N-末端。优选地,cMBP标签位于hTERT或TERT酶的N-末端。
本发明的融合蛋白质含有直接或间接连接到cMBP标签的hTERT或TERT酶。所述两种多肽尤其可以通过削弱它们之间的位阻的间隔序列(或“间隔物”)来分隔。在一个优选的实施方案中,因此本发明的融合蛋白质可以含有位于cMBP标签与hTERT或TERT蛋白质之间的间隔物。在这一实施方案中,因此本发明的核苷酸载体含有在编码hTERT或TERT的核苷酸序列与编码cMBP的核苷酸序列之间的编码间隔物的核苷酸序列。该间隔物具有例如SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13。
在获得纯化形式的融合蛋白质cMBP-hTERT或cMBP-TERT后,将目标蛋白质hTERT或TERT与cMBP标签分离可能有利。如果本发明的融合蛋白质含有位于cMBP标签与hTERT或TERT蛋白质之间的蛋白酶切割位点,则可以借助于特定的蛋白酶来实现这一分离。
有利的是,本发明的核苷酸载体可以进一步含有编码已知的蛋白酶切割位点的核苷酸序列。该核苷酸序列优选地位于编码麦芽糖结合蛋白质标签的序列与编码hTERT或TERT蛋白质的序列之间。
蛋白酶切割位点是本领域所熟知的。它们是被至少一种蛋白酶(尤其例如丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶)识别的氨基酸序列。肽切割位点的一个示例是SEQ ID NO:16(AspAspAspAspLys/Asp)的肠激酶切割位点。所述肠激酶是已知通过在所述序列的C-末端进行切割而将非活性胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.9):Val--(Asp)4--Lys--Ile--Val~(胰蛋白酶原)→Val--(Asp)4--Lys(六肽)+Ile--Val~(胰蛋白酶)。如果赖氨酸之前是4个Asp并且之后不是脯氨酸残基,则肠激酶在所述Lys之后切割。另一有用的蛋白酶切割位点是所谓的“TEV蛋白酶”的切割位点,其具有氨基酸序列SEQID NO:14或SEQ ID NO:15(Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly或Ser)。TEV蛋白酶是由烟草蚀纹病毒编码的核内包涵体a蛋白质的27kDa催化结构域的常用名。它是可商购的(Invitrogen)。
在一个优选的实施方案中,本发明的载体含有编码TEV蛋白酶切割位点的序列(SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15),所述序列位于编码麦芽糖结合蛋白质标签的序列与编码hTERT或TERT蛋白质的序列之间。
如本文中所用的,术语“cMBP-hTERT”或“cMBP-TERT”与表达“本发明的融合蛋白质”可互换使用。它们表示含有hTERT或TERT多肽序列或其变体和缺失N-末端周质靶向信号的麦芽糖结合蛋白质标签的融合蛋白质,在它们所有可能的空间定向(hTERT-cMBP或cMBP-hTERT)中,该融合蛋白质的所述两个部分任选地被间隔物和/或蛋白酶切割位点分开。
在一个更优选的实施方案中,用于本发明的方法中的核苷酸载体包含在酵母中有功能的组成型启动子,如GAPDH启动子,所述启动子可操作地连接到编码融合蛋白质cMBP-TEV-hTERT或cMBP-TERT的核苷酸序列。
在一个特定的实施方案中,核苷酸载体是含有GAPDH启动子的整合质粒PGAPZ(Invitrogen),所述启动子与编码融合蛋白质cMBP-hTERT或cMBP-TEV-hTERT(SEQ ID NO:17)(或hTERT-cMBP或hTERT-TEV-cMBP)的核苷酸序列可操作地缔合。该载体具有序列SEQID NO:18。
可以通过本领域内已知的任何方法将本发明的表达载体引入到本发明的酵母细胞中。优选地,将所述载体转化到酵母细胞中。若干转化方法是本领域技术人员已知的。它们包括基于乙酸锂的转化、原生质球形成(spheroplasting)、电穿孔等。
术语“转化”在本文中意指将编码限定蛋白质的异源核酸引入到酵母宿主细胞中,以使得所述细胞将表达由所引入的核酸编码的蛋白质。接受并表达所引入的核酸的宿主细胞已“被转化”。
随后使被转化的酵母细胞生长,以使得允许融合蛋白质表达。在本文中推荐常规用于生长酵母细胞的培养基。本领域技术人员熟悉这些已被广泛描述的培养基。
在一个优选的实施方案中,用于表达实验的被转化酵母细胞已预先在琼脂糖培养皿(含有例如琼脂1.5%、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.2%含有硫酸铵的酵母氮基(YeastNitrogen Base)、2%右旋糖)上生长。更优选地,该预培养步骤持续1到2天。有趣的是,该预培养步骤增强了纯化酶的比活性和稳定性,并且也降低了污染RNA的水平。
在另一个优选的实施方案中,使被转化的酵母细胞在含有至少0.5%、更优选地1%和甚至更优选地至少2%酵母提取物的营养培养基上生长。所述营养培养基还可以含有碳源(如葡萄糖)和盐(如NaHPO4)。葡萄糖可以约2%到8%的量、优选地以4%存在于所述营养培养基中。NaHPO4可以约10mM到300mM、优选约50mM到200mM的量且更优选地以100mM存在于所述营养培养基中。所述营养培养基的初始pH优选地为6.0到7.0。此外,酵母细胞优选地在15℃到35℃、优选地27℃到30℃的温度下生长。
通过使被转化的酵母细胞在这些条件下生长,它们的细胞内pH缓慢降低。而且并且重要的是,在机械剪切后测量的酵母细胞的细胞内pH不应降低到低于5.8、优选地6.3的值。换句话说,使酵母细胞在营养培养基中生长,只要它们的细胞内pH高于或等于约5.8、优选地高于或等于约6.3即可。用于测量细胞内pH的方法是本领域所熟知的(关于综述,参见Loiselle FB和Casey JR,Methods Mol.Biol.2010)。例如,可以通过将酵母细胞裂解在冷温(通常在4℃)的冷水中并且通过用pH计测量上清液中的pH来测量细胞内pH。
值得注意的是,在指数生长结束之后不久,即,在静止生长期开始时,达到这一临界pH值。实际上,发明人已经观测到,当含酵母培养物的600nm的光密度(OD600)是11到16、优选地12到15(如例如利用分光光度计Eppendorf所测量)时,达到6.3/5.8的细胞内临界pH值(在细胞裂解后测量)。
在细胞生长期间,cMBP-hTERT或cMBP-TERT融合蛋白质在酵母细胞内被表达并且累积而不被分泌。有利的是,将酵母细胞裂解以释放细胞内累积的cMBP-hTERT或cMBP-TERT融合蛋白质。这一裂解步骤b)应当在被转化细胞的细胞内pH达到5.8、优选地6.3之前进行。在一个特定的实施方案中,这一裂解步骤b)应当在被转化细胞的细胞内pH达到6.3之后进行。
在一个优选的实施方案中,在步骤b)中将酵母细胞在水基溶液中裂解。在一个更优选的实施方案中,所述水基溶液不含盐和洗涤剂。在一个甚至更优选的实施方案中,所述水基溶液是纯水。在一个特别优选的实施方案中,所述水基溶液不含有任何蛋白酶抑制剂。发明人确实已经观测到,令人惊讶地,hTERT或TERT蛋白质对在优化的培养条件下的蛋白水解降解不敏感,并且不需要蛋白酶抑制剂。这使得本发明的方法相比于现有技术的纯化方案费用较低。
优选地在冷温下,即在0℃到10℃的温度下(通常在4℃)实现裂解步骤b)。
在一个优选的实施方案中,通过任何常规装置进行细胞裂解。例如通过使用任何物理装置如弗氏压碎器(French press)机械地破碎酵母细胞壁有利于该细胞裂解。或者,可以向含有酵母细胞的水基裂解溶液中添加专用玻璃珠,随后在例如5到15分钟、优选地10分钟期间剧烈地涡旋所述混合物。细胞片段(如细胞碎片和大细胞器)和玻璃珠可以通过以适当的速度离心混合物(例如,3000g持续10分钟,然后任选地以10 000g持续15分钟)被有利地丢弃。应当在冷温下,即在0℃到10℃的温度下(通常在4℃)实现细胞裂解和离心。
含有cMBP-hTERT或cMBP-TERT融合蛋白质的粗制蛋白质提取物的获得可以通过在冷温下离心含有酵母细胞的水基溶液进行。“粗制蛋白质提取物”在本文中对应于含有细胞内蛋白质的溶液的级分-其中有融合蛋白质cMBP-hTERT或cMBP-TERT-并且几乎没有细胞壁的片段或碎片和大细胞器。
本领域技术人员完全知道可以用于有效地去除所有细胞片段(如细胞碎片和大细胞器)而不改变目标hTERT蛋白质的量或活性的适当离心条件。离心速度通常是3,000g到20,000g。非压实粒子如可溶性蛋白质多数保留于被称为“上清液”的液体中并且可以被转移于另一管中,由此将所述蛋白质与细胞片段分离。所述上清液然后被用于进一步纯化步骤。
本发明的方法可能进一步需要增加含有裂解细胞的水基溶液的pH以达到6.0到7.5的pH,优选地达到6.3到7.0的pH(步骤c)。优选地在步骤b)之后获得的粗制蛋白质提取物中实现这一pH增加。然而,还可能在去除细胞片段之前增加pH。如果所述粗制蛋白质提取物已具有6.0到7.5或更优选地6.3到7.0的pH,则这一步骤不是必要的。
发明人确实观测到,将含hTERT样品的pH维持在该范围内有助于在纯化过程结束时回收大量的活性hTERT蛋白质。任何碱性缓冲液均可以用于实现这一pH增加。通常用于蛋白质提取方法中的缓冲液包括例如Tris 1M pH8.0缓冲液、HEPES、磷酸盐或MOPS缓冲液。
cMBP-hTERT或cMBP-TERT融合蛋白质可以通过亲和纯化被容易地纯化。优选地,用于这一步骤中的缓冲液具有6.0到7.5的pH,更优选地6.3到7.0的pH(图1K)。
可以在这一步骤任选地添加RNA酶如RNA酶A(例如,每ml提取物10μg来自Fermentas的牛胰RNA酶A)以降低污染RNA的水平。然而,由于内源性酵母RNA提高了hTERT的稳定性和溶解度(参见实施例2.8.和图5),因此优选Benzonase和微球菌核酸酶(Mnase),因为它们降解释放的RNA,但它们不去除与RNP中的hTERT紧密缔合的酵母RNA(参见图4B)。
亲和纯化涉及基于与固定到固体支持物的配体的结合相互作用的差异来分离粗制蛋白质提取物中所含有的cMBP-hTERT或cMBP-TERT蛋白质。所述配体共价连接到固体支持物,但非共价地结合到融合蛋白质。因此可以在本领域所熟知的特定洗脱条件下从固体支持物中洗出融合蛋白质。
优选地,本发明中共价结合到固体支持物的配体是可以非共价结合到MBP和cMBP的直链淀粉。直链淀粉是含有D-葡萄糖单元的线性聚合物。它通常被用于纯化经MBP标记的融合蛋白质(pMALTM Protein Fusion&Purification System.New England Biolabs)。
用于本发明的方法的纯化步骤中的固体支持物是可以与直链淀粉共价附着的任何材料。有用的固体支持物是具有高的表面积对体积比、容易被修饰用于共价附着配体的化学基团、最低非特异性结合性质、良好的流动特性以及机械和化学稳定性的那些。在一个优选的实施方案中,用于本发明的方法中的固体支持物选自由亲和基质和亲和珠组成的组。通常,它们由琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、胶乳和玻璃制得。还可以使用多孔支持物(如基于糖或丙烯酰胺的聚合物树脂或凝胶)和磁性支持物(例如,磁珠)。
在一个优选的实施方案中,本发明的方法的纯化步骤d)使用了直链淀粉偶联的琼脂糖珠。直链淀粉偶联的琼脂糖珠例如被New England Biolabs(NEB)商业化。
然后使粗制蛋白质提取物与配体偶联的固体支持物接触,以使得存在于所述提取物中的cMBP-hTERT或cMBP-TERT蛋白质变得非共价结合到所述固体支持物。本领域技术人员熟悉有利于这一结合的实验条件。通常,接触可以持续30分钟,优选地1小时。优选地在冷温下进行这一步骤。
然后通过用适当的洗涤缓冲液洗涤固体支持物有利地去除未结合的组分。有利的是,这些洗涤缓冲液的pH是6.0到7.5,并且更优选地是6.3到7.0。因此,在一个优选的实施方案中,本发明的方法的步骤d)包括用具有6.0到7.5、优选地6.3到7.0的pH的缓冲液洗涤所述固体支持物。发明人确实观测到,将这些缓冲液的pH维持在该范围内有助于在纯化过程结束时回收大量的活性hTERT或TERT蛋白质。
洗涤缓冲液可以含有高水平的盐以防止非特异性(例如,离子)结合相互作用。高盐缓冲液通常含有KCl、MgCl2、NaCl和/或磷酸钠,更确切地说,400mM到800mM的NaCl和5mM到20mM的磷酸钠。优选的高盐缓冲液含有600mM NaCl和10mM磷酸二氢钠。
在一个优选的实施方案中,将固体支持物首先用如上文所定义的高盐缓冲液洗涤,然后用无盐缓冲液洗涤。需要这些常规步骤以有效地去除非特异性结合到固体支持物的所有污染物分子。
无盐缓冲液包括例如Tris,pH 7.0,10mM;Hepes,例如,10mM;MOPS缓冲液;等。
通过向所述系统中添加麦芽糖来进一步洗脱本发明的融合蛋白质。这使得能够从固体支持物中洗脱cMBP-hTERT或cMBP-TERT融合蛋白质以回收所述融合蛋白质。实际上,麦芽糖蛋白质可以与直链淀粉竞争并且有利于融合蛋白质的释放。
可以使用含有麦芽糖的常规洗脱缓冲液。在一个优选的实施方案中,所述洗脱缓冲液含有例如NaCl、KCl和/或MgCl2的盐。它还可以包含5mM到30mM的Hepes。在一个更优选的实施方案中,所述洗脱缓冲液含有100mM到200mM的KCl、1mM到5mM的MgCl2、5mM到30mM的Hepes、40mM到80mM的麦芽糖,并且具有6.5到7.5的pH。在一个甚至更优选的实施方案中,所述洗脱缓冲液含有130mM KCl、2mM MgCl2、10mM Hepes、50mM麦芽糖,并且具有约7.0的pH。
洗脱级分通常含有约300ng/μL有活性且可溶的cMBP-hTERT或cMBP-TERT蛋白质。本发明的方法首次使得能够可再现地且以低成本获得至少100μg/L基本上纯的且有活性的hTERT或TERT酶。
在一个优选的实施方案中,通过向洗脱级分中添加蛋白酶而从MBP标签中切下hTERT或TERT。显然,只有在所述融合蛋白质包含被所述蛋白酶识别的位于所述融合蛋白质的两个部分之间的切割位点时,所述蛋白酶才能对所述融合蛋白质具有活性。例如,如果已在编码hTERT或TERT蛋白质的核苷酸序列与编码cMBP标签的核苷酸序列之间添加编码TEV蛋白酶切割位点的序列,则通过在洗脱级分中添加TEV蛋白酶将有利地获得所述两种多肽的分离。这些蛋白酶的应用先前已被描述并且可获得商业试剂盒(Invitrogen)。
发明人已证明,通过应用上述表达和纯化方法,纯化产率是约50%。因此,hTERT或TERT蛋白质是存在于洗脱级分中的主要蛋白质。换句话说,它意味着洗脱级分仅含有50%的除hTERT或TERT以外的分子。
重要的是,在含有用于端粒重复序列合成的模板的端粒酶RNA组分(TR)存在下,借助于本发明的方法回收的融合蛋白质和在切割cMBP标签后回收的hTERT或TERT蛋白质是活性的,即,它们展示出显著的端粒酶活性,并且更确切地说,展示出显著的逆转录酶(RT)活性。在一个优选的实施方案中,它们所展示出的逆转录酶(RT)活性与SEQ ID NO:1的天然hTERT酶在人端粒酶RNA(hTR)存在下所展示的逆转录酶(RT)活性相同。在另一个优选的实施方案中,它们所展示出的逆转录酶(RT)活性与天然的非人TERT酶在其对应的非人端粒酶RNA(TR)存在下所展示出的逆转录酶(RT)活性相同。TR序列是本领域所熟知的。它们是例如作为NC_001134.8(酿酒酵母S288c的TR)、NC_006038.1(乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140的TR)、NC_000069.6(小家鼠的TR)、EF569636.1(斑马鱼的TR)等被引用的。
可以通过任何常规测定来评估本发明的蛋白质的活性。通常,在TR存在下实施这些测定。该TR具有例如SEQ ID NO:4(GenBank:U86046.1)或其在其它物种中的同源序列。下文简要地描述了这些测定中的一些。
首先,可以使用基于PCR的端粒重复序列扩增方案(TRAP测定)(Kim等人NAR1997)。TRAP测定可以包括制备测试的hTERT或TERT蛋白质,以及添加体外转录的TR、引物和dNTP(参见下文的实施例)。如果hTERT蛋白质或TERT或其变体是酶活性的,则它将延长所添加的引物,并且反应产物(模板)将通过PCR被扩增。该技术是高度灵敏的,但仅可提供定性评价。对于定量分析来说,可以通过光密度测定法利用计算机程序来测量出现于X-射线胶片中的6bp梯状条带的面积或强度。商业试剂盒在减少样品处理时间的情况下产生了增加的灵敏度,从而使得对大量样品中的端粒酶活性的检测得以改进。用于测量hTERT或TERT蛋白质和/或其变体的逆转录酶酶活性的另一定量方法是引物延长测定。该测定测量掺入到在引物序列上合成的多核苷酸中的放射性核苷酸的量。随暴露于凝胶的磷光成像仪屏上的条带的强度的变化来测量所掺入的量,在所述凝胶上分离放射性产物。可以在磷光成像仪屏上用肉眼比较测试实验和对照实验。该测定是基于Morin,G.B.,Cell,1989中所述的测定。用于评估hTERT蛋白质和变体的逆转录酶活性的另一测定是斑点印迹测定(dot blotassay)。
斑点印迹测定可用于常规筛选,因为它具有高通量并且可以在一天内多半自动化地进行成百上千的测定。到第二天的下午获得结果。最后,已经提出了若干灵敏的直接端粒酶活性测定(CohenSB.等人,Nat.Methods,2008,HoudiniTM of Capital Biosciences)。
虽然不是必需的,但可以进行进一步的纯化步骤,例如凝胶过滤、甘油梯度过滤或超滤。
本发明的hTERT/TERT蛋白质的表征
本发明的方法使得能够产生经MBP标记的hTERT或TERT酶。有趣的是,已知MBP在先天免疫中发挥作用,使得借助于本发明的方法获得的经MBP标记的hTERT或TERT酶可以按原样用于疫苗组合物中。在这种情况下,将没有必要进行MBP-标签的切割,并且进行本发明的方法比进行现有技术的纯化方法容易得多。
如下文的实施例中所示的,当在酵母细胞中表达hTERT蛋白质时,本发明的方法使得能够获得纯化的、可溶性的且有活性的hTERT蛋白质。本发明的诸位发明人观测到,酵母细胞中产生的hTERT与能够溶解并稳定该酶的酵母内源性RNA(图4)被共纯化。如图5中所示的,通过本发明获得的hTERT蛋白质在含有外源添加的RNA酶的样品中聚集,但未在未处理的样品中聚集。更确切地说,已观测到,当在RNA酶A存在下纯化时,通过本发明的方法获得的hTERT酶在4℃储存24h后具有降低的活性,而未处理的hTERT可以在相同条件下储存至少48h,不损失任何活性(数据未显示)。因此,似乎内源性酵母RNA结合到通过本发明的方法获得的hTERT并且它们在hTERT蛋白质的稳定中发挥作用。
因此,借助于本发明的方法获得的hTERT或TERT蛋白质相对于现有技术具有的独特特征在于它结合到酵母RNA。根据发明人的结果,这一结合诱导稳定并随时间维持hTERT酶的溶解度。
如本文中所用的,术语“本发明的TERT蛋白质”因此涉及已通过本发明的方法、即在酵母中获得的人TERT(hTERT)蛋白质或任何其它动物TERT蛋白质。如上文所解释的,该蛋白质含有以下独特的特征:
-它可以结合到酵母RNA,
-它可以融合到MBP标签,
-它已在不涉及任何变性剂或洗涤剂的生产过程中获得。
本发明涉及包含本发明的TERT蛋白质的任何组合物。
如上文所解释的,含有本发明的TERT蛋白质的组合物与现有技术中所述的那些的差异可能在于它们含有没有分泌信号的MBP标签。
此外,含有本发明的TERT蛋白质的组合物与现有技术中所述的那些的差异可能在于它们含有酵母RNA(当尚未使用RNA酶处理时)。
最后,这些组合物与现有技术的差异还可能在于它们不含有任何洗涤剂或变性剂,也没有其任何痕迹。实际上,与现有技术的方法不同,在本发明的可溶且有活性的TERT蛋白质的生产和/或纯化过程期间,本发明的方法不需要使用任何洗涤剂或变性剂。
在一个优选的实施方案中,本发明涉及含有本发明的TERT蛋白质的组合物,其不包含在由以下组成的组中选择的任何洗涤剂或变性剂:Triton X-100、IGEPALCA-630(Nonidet P-40)、脱氧胆酸钠、Tween 20、CHAPS、十二烷基硫酸钠或MEGA-9。
在一个更优选的实施方案中,本发明涉及包含与核糖核蛋白复合体中的酵母RNA缔合的纯化的、可溶的且有活性的TERT蛋白质的组合物,所述组合物没有任何洗涤剂或变性剂。
在一个优选的实施方案中,本发明涉及含有本发明的经MBP标记的TERT蛋白质的组合物,其不包含在由以下组成的组中选择的任何洗涤剂或变性剂:Triton X-100、IGEPALCA-630(Nonidet P-40)、脱氧胆酸钠、Tween 20、CHAPS、十二烷基硫酸钠或MEGA-9。
在一个优选的实施方案中,本发明涉及含有本发明的经MBP标记的TERT蛋白质的组合物,所述TERT蛋白质与酵母RNA缔合。
本发明的组合物可以是药物组合物或体外用于实验测定中的组合物。
具体地说,这些组合物可以是疫苗组合物。或者,它们可以例如被用作实验工具用于通过晶体学来分析TERT结构。
本发明的TERT蛋白质的治疗用途
本发明的TERT蛋白质可以用于若干应用中。
在第二方面,如此纯化的本发明的重组TERT蛋白质可以用于产生或提高细胞中的端粒酶活性以增强其增殖能力。例如,TERT蛋白质在真皮成纤维细胞中表达,由此增加端粒长度,将使成纤维细胞增殖能力增加;该表达可减缓或逆转伤口闭合的年龄依赖性慢化(参见例如West,Arch.Derm.1994)。
因此,在这一方面,本发明提供可用于治疗特征在于细胞中不存在人端粒酶活性的疾病和病况的试剂和方法。如下文所更全面地描述,这些疾病尤其包括与细胞衰老有关的疾病(特别是老化疾病)和不育症。
在一个方面,因此本发明涉及药学上可接受的组合物,其含有任选地与稳定化合物、稀释剂、载剂或另一活性成分或试剂组合的本发明的TERT蛋白质。
在一个优选的实施方案中,用于这些药物组合物中的本发明的TERT蛋白质还连接到MBP-标签。在另一个优选的实施方案中,用于这些药物组合物中的本发明的TERT蛋白质还与核糖核蛋白复合体中的酵母内源性RNA缔合。在另一个优选的实施方案中,这些药物组合物不含有任何洗涤剂或变性剂,也没有其任何痕迹。
任何合适的药学上可接受的载剂均可以用于本发明的组合物中,并且此类载剂是本领域所熟知的。载剂的选择将部分取决于待施用组合物的具体位点以及用于施用所述组合物的具体方法。适于注射的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌注射溶液,其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质;以及水性和非水性无菌悬浮液,其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所述制剂可以呈现在单位剂量或多剂量密封容器(例如,安瓿和小瓶)中,并且可以冷冻干燥(冻干)的状态储存,只需要在临使用前添加无菌液体载剂,例如水。临时注射溶液和悬浮液可以由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
具体地说,本发明涉及含有本发明的TERT蛋白质的药物组合物,其用于治疗特征在于不存在人端粒酶活性的疾病和病况,如与细胞衰老有关的疾病(特别是老化疾病)和不育症。
此外,本发明涉及本发明的TERT蛋白质用于制备药物组合物的用途,所述药物组合物意在治疗特征在于不存在人端粒酶活性的疾病和病况,如与细胞衰老有关的疾病(特别是老化疾病)和不育症。
某些老化疾病的特征在于由于减小的端粒长度(相较于较幼小的细胞)所致的与细胞衰老有关的变化,所述减小的端粒长度源于所述细胞中不存在(或低得多的水平的)端粒酶活性,从而导致减小的端粒长度和降低的复制能力。与细胞衰老有关的病况包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和中风;年龄相关性体被疾病,如真皮萎缩、弹性组织离解和皮肤起皱纹、皮脂腺增生、衰老性着色斑、头发变白(graying of hair)和脱发、慢性皮肤溃疡和年龄相关性伤口愈合不良;变性关节病;骨质疏松症;年龄相关性免疫系统受损(例如,涉及细胞如B淋巴细胞和T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和它们各自的祖细胞);年龄相关性血管系统疾病,包括动脉粥样硬化、钙化、血栓形成和动脉瘤;糖尿病、肌肉萎缩、呼吸性疾病、肝病和胃肠道疾病、代谢疾病、内分泌疾病(例如,垂体和肾上腺病症)、生殖疾病和年龄相关性黄斑变性。
本发明还提供可用于治疗不育症的方法和组合物。人生殖系细胞(例如,精原细胞、它们的祖细胞或子代)能够无限增殖且其特征在于高端粒酶活性。异常或降低的TERT蛋白质水平可使例如精子的产生不充分或异常,从而导致不育症或生殖病症。因此,可以使用本文所述的方法和组合物增加端粒酶水平来治疗“基于端粒酶的”不育症。本发明的方法和试剂还可用于在治疗干预之前增加表达低水平的端粒酶或不表达端粒酶的干细胞中的端粒酶活性和增殖潜力。
可以通过增加细胞中TERT蛋白质的水平以增加端粒长度、由此恢复或赋予所述细胞更大的复制能力来治疗这些疾病和病况。可以对离体培养的细胞或体内细胞实施此类方法。在一个实施方案中,使所述细胞与TERT蛋白质离体接触以活化端粒酶并延长端粒,然后向有需要的受试者施用所述细胞。可以例如通过显微注射或本领域已知的其它手段将催化活性TERT多肽引入到细胞或组织中。
本发明的TERT蛋白质的接种用途
在另一方面,本发明的TERT蛋白质可以用于在患者中诱发抗TERT免疫应答(即,充当疫苗)。一旦被接种,个体或动物将诱发针对表达高水平的端粒酶的细胞(例如,恶性细胞)的增加的免疫应答。
在另一方面,因此本发明涉及用于在受试者中诱发抗TERT免疫应答的疫苗组合物,所述受试者罹患例如癌症。
此外,本发明涉及本发明的TERT蛋白质用于制备意在在受试者中诱发抗TERT免疫应答的免疫原性疫苗的用途。具体地说,免疫原性疫苗意在向罹患癌症的患者施用。
在一个优选的实施方案中,用于这些疫苗组合物中的本发明的TERT蛋白质还连接到MBP标签。在另一个优选的实施方案中,用于这些疫苗组合物中的本发明的TERT蛋白质还与核糖核蛋白复合体中的酵母内源性RNA缔合。
在另一个优选的实施方案中,这些疫苗组合物不含有任何洗涤剂或变性剂。
借助于本发明的TERT蛋白质筛选端粒酶抑制剂
或者,本发明的TERT蛋白质可以用于以各种药物筛选技术中的任一种筛选治疗化合物。用于此类测试中的本发明的TERT蛋白质可以游离于溶液中,附着到固体支持物,载于细胞表面上,或位于细胞内。TERT蛋白质与所测试的试剂之间的结合复合体的形成可以通过EMSA、凝胶过滤或甘油梯度来检测。
在特定实施方案中,本发明的筛选方法使得能够分离调节剂,所述调节剂尤其i)结合到酶活性位点,ii)抑制TERT与其RNA部分的缔合,与端粒酶相关蛋白质(HSP90、HSP70、角化不良素(Dyskerin)、Pontin等)的缔合,与核苷酸的缔合,或与端粒DNA的缔合,iii)促进酶复合体的解离,iv)干扰端粒DNA的合成,或v)影响所述酶的持续合成能力。
一个实施方案中,本发明涉及用于鉴别端粒酶复合体拮抗剂的体外测定。这些拮抗剂是例如肽(如结构模拟物)、多肽(如TERT或端粒酶相关蛋白质的显性负性突变体)、小化学分子(天然或合成的)、寡核苷酸(如结合TERT或TR的DNA或RNA寡核苷酸(例如,适体))或抗体。
这些测定包括以下步骤:使本发明的TERT蛋白质与样品中的测试化合物接触,和确定所述测试化合物是否影响所述样品中的端粒酶活性。通常,该确定包括比较所述样品中的端粒酶活性与不含有测试化合物的样品的端粒酶活性。
用于鉴别有效的端粒酶抑制剂的方法包括以下步骤:
-在样品中使本发明的TERT蛋白质、端粒酶RNA(TR)和候选抑制剂接触,
-测试所述样品的端粒酶活性。
优选地,用于鉴别作为端粒酶装配抑制剂的有效端粒酶抑制剂的方法按以下顺序包括以下步骤:
a)在样品中使本发明的TERT蛋白质和候选抑制剂接触,
b)添加端粒酶RNA(TR),
c)测试所述样品的端粒酶活性。
在另一个优选的实施方案中,用于鉴别作为端粒酶催化抑制剂的有效端粒酶抑制剂的方法按以下顺序包括以下步骤:
a)在样品中使本发明的TERT蛋白质和端粒酶RNA(TR)接触,
b)添加候选抑制剂,
c)测试所述样品的端粒酶活性。
优选地,如果含有候选抑制剂的样品中的端粒酶活性低下或不存在,则将选择候选抑制剂。
在一个优选的实施方案中,所述筛选方法需要比较不存在候选抑制剂的端粒酶活性与存在候选抑制剂的端粒酶活性。在这种情况下,如果相较于在候选抑制剂不存在下在样品中测量的端粒酶活性,在所述抑制剂存在下在样品中测量的端粒酶活性被降低至少50%,更优选地被降低至少70%且甚至更优选地被降低至少90%,则将选择候选抑制剂。
在另一个优选的实施方案中,所述筛选方法包括评价候选抑制剂对端粒酶活性测定的PCR步骤的作用。在这种情况下,如果在端粒延长之前添加候选抑制剂时影响端粒酶活性,但在端粒延长之后添加候选抑制剂时不影响端粒酶活性,则将选择候选抑制剂。
用于测定样品的端粒酶活性的实验条件先前已被描述。用于测量端粒酶复合体的活性的经典测定是例如先前已被描述的TRAP测定、斑点印迹测定或直接端粒酶活性测定。精确方案详细描述于下文的实施例中。
优选地,通过监测包含本发明的TERT蛋白质和模板RNA(例如,SEQ ID NO:4的hTR)的核糖核蛋白复合体(RNP)的端粒酶活性的变化来鉴别所述抑制剂,所述RNP被体外重构。
为了进行本发明方法的不同步骤,可以采用在本领域技术内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中有充分说明。参见例如Sambrook、Fitsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(在本文中被称作“Sambrook等人,1989”);DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(D.N.Glover编辑,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,1984);Animal Cells Culture(R.I.Freshney编辑,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);B.E.Perbal,A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
实施例
1.材料和实验设置
1.1.质粒构建
使用hTERT cDNA(Robert Weinberg,Whitehead Institute of BiomedicalResearch的友好赠品)和pMAL p-2(New England Biolabs)作为模板以供利用以下引物对MBP(SEQ IDNO:9)和hTERT(SEQ ID NO:3)进行PCR扩增:
MBP-F(SEQ ID NO:19):ATGCAATTCGAAGGTACCAAGCTTGCCACCATGAAAATCGAAGAAGGTAAAC
MBP-R(SEQ ID NO:20):p-TCGTTGGATCGTAATCGTTGTTGTTATTGTTATTG
hTERT-F(SEQ ID NO:21):p-CCGAAAACTTATATTTTCAGGGTATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCG和
hTERT R(SEQ ID NO:22):CTTCAAGACCATCCTGGACTGAGTCGAGCCGCGGCGGCCGCATGCAA。
然后,对PCR片段进行柱纯化。用BstBI消化MBP DNA并且用XbaI消化hTERT DNA。再次对两个片段进行柱纯化,并且将其双连接(double-ligated)到PGAPZα载体的BstBI/XbaI位点中。
1.2.根据本发明的方法对cMBP-hTERT的表达和纯化
通过测序检查质粒,然后用AvrII将20μg线性化,进行纯化并且使用Bio-Rad GenePulser(1500V,25μF,200Ω)将其电穿孔到巴斯德毕赤酵母X-33株(Invitrogen)中。在琼脂板(0.2%含有硫酸铵的酵母氮基,1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%右旋糖,1M山梨醇,pH7.0,300μg/ml Zeocin)上对多种成分进行选择并且将其在27℃培育2-3天。将菌落重新划线(restreacked),然后在LBG(Luria Broth和葡萄糖,各20g/L)中生长以通过蛋白质印迹(hTERT抗体来自Epitomics)检测hTERT表达。将经过验证的克隆在200ml(1%酵母提取物,pH 7.0,1%右旋糖,500μg/ml zeocin)中在160RPM、27℃下扩增,然后等分于2ml管中并与10%甘油储存在-80℃。
对于各培养来说,将一个小瓶解冻,将酵母在固体培养基上预培养1-2天,并且在2L摇瓶中的250-500mL培养基(2%酵母提取物,4%葡萄糖,100mM,NaHPO4pH7.5培养基)中扩增,直到OD600=12-15,使得细胞内pH不低于6.3。
在具有冷溶液和冷冻仪器的冷室中进行所有纯化步骤。
将酵母在1500RPM下沉淀10分钟,用水洗涤,然后再悬浮于15ml水中并且用5ml玻璃珠涡旋10分钟。没有必需在水中添加任何盐和任何洗涤剂。该裂解产物的pH是约5.9-6.4。
将上清液在3000g下离心10分钟,并且在新管中再次在3000g下离心15分钟。检查pH为约6.3并且将所述上清液施加到2ml预冲洗过的直链淀粉-琼脂糖珠(NEB)中。在转轮上1小时后,用高盐缓冲液(600mM NaCl,10mM磷酸二氢钠pH 7.0)将直链淀粉珠洗涤一次,并且用无盐缓冲液(10mM Hepes pH 7.0)洗涤一次。用500μL洗脱缓冲液(130mM KCl,2mMMgCl2,10mM Hepes pH 7.0,50mM麦芽糖)洗脱cMBP-hTERT。在凝胶上通过相对于BSA梯状条带进行考马斯亮蓝染色(图2A)来估计cMBP-hTERT蛋白质浓度。cMBP-hTERT通常被发现为约0.1-0.3mg/mL。将cMBP-hTERT在4℃保持2天。
1.3.纯化过程的控制
使用直链淀粉-琼脂糖凝胶对cMBP-hTERT蛋白质进行纯化,之后进行蛋白质印迹和考马斯亮蓝染色(图2A)。泳道2(在用TEV蛋白酶切割MBP标签之前)与泳道3(在用TEV蛋白酶切割MBP标签之后)之间的大小的移变确认了被纯化的蛋白质是cMBP-hTERT(在MBP与hTERT之间已包含TEV位点)。
通过TEV蛋白酶在室温下切割1小时且然后通过镍柱再结合加以去除的cMBP-hTERT的纯度允许更精确地评价通过TEV蛋白酶切割的纯度水平和效率(图2B)。
使用胰蛋白酶消化被纯化的MBP-hTERT蛋白质并且通过MS/MS进行分析。hTERT是具有最高序列覆盖率(75%,未显示)的蛋白质。
已通过向100ng纯化的MBP-hTERT中添加500ng体外转录的hTR来重构端粒酶活性。已通过若干方法如端粒酶直接测定(图3A)、端粒重复序列扩增方案(TRAP或qTRAP,图3B和3C)来揭示该活性。端粒酶活性在前几分钟内增加,然后达到稳定的平台期(图3D)。最后,EMSA也可以显示重组hTERT与32P标记的hTR的结合。
1.4.端粒酶直接测定
如所述(D′Ambrosio等人,2012)在略微修改的情况下进行直接测定。在30℃将重构的端粒酶在含有40mM Tris-HCl pH 7.9、1mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、2mM亚精胺、40μMdATP、80μM dTTP、2μM dGTP、20μCi[α-32P]-dGTP(3,000Ci/mmol)和33nM作为端粒酶底物的5′-生物素化引物的20μl反应缓冲液中培育45min。通过添加25mM EDTA来终止反应。通过在室温使所述生物素化引物与20μl抗生蛋白链菌素-琼脂糖珠(GE Healthcare)结合10min来去除未掺入的核苷酸。将抗生蛋白链菌素-琼脂糖珠用10mM Tris-HCl pH 8.0、1mM EDTA、1M NaCl洗涤两次,并且用10mM Tris-HCl pH 8.0、1mM EDTA洗涤一次。通过在95℃在90%甲酰胺、10mM EDTA、0.5mM生物素(Sigma)中加热10分钟来洗脱引物并且在15%聚丙烯酰胺-尿素测序凝胶(19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺比率)上分离。用塑料膜覆盖凝胶,将其暴露于磷光成像仪屏,并使用STORM860(Molecular Dynamics)扫描。
1.5.电泳迁移率变动测定
通过电泳迁移率变动测定(EMSA)来分析cMBP-hTERT/hTR复合体。通过添加50μCi的[α-32P]-CTP来合成hTR,并且将其与cMBP-hTERT装配1小时。使全长hTR在1x TBE中的1.2%冷冻的琼脂糖凝胶上在110V下迁移2小时。将凝胶在10%乙酸10%乙醇中固定1小时,干燥并暴露于磷光成像仪屏。使用STORM 860(Molecular Dynamics)进行扫描。
1.6酵母RNA的检测
将10μL(1μg)纯化的cMBP-hTERT蛋白质与若干商业酶于它们的专有缓冲液中的1μl母液一起培育30min,然后将样品在含有SYBR GREEN II RNA(Invitrogen)的1%琼脂糖凝胶中在TAE缓冲液(Tris,乙酸盐,EDTA)中迁移30min。
2.用于hTERT表达的优化条件的鉴别
2.1.去除N-末端周质靶向信号允许在酵母中的更好表达
MBP含有N-末端周质靶向信号。本发明的诸位发明人已证明,从MBP-hTERT中去除该序列允许在酵母中的更好表达,使得可以在考马斯亮蓝上检测纯化的蛋白质cMBP-hTERT(参见图2)。
这有利地避免了不希望有的糖基化的出现。
2.2.hTERT不能从酵母细胞中分泌
GST-hTERT(155kDa)是使用PGAPZ载体在细胞内表达的(参见图1A和B)。
然而,当GST-hTERT融合到酿酒酵母α因子的分泌信号(α-hTERT,136kDa)时,α-hTERT保留在细胞内(图1D和1E)。比较hTERT和α-hTERT的细胞内水平和细胞外水平显示添加分泌信号不提高hTERT的表达水平。图1F也显示通过蛋白质印迹抗HA,在细胞内或细胞外几乎检测不到α-MBP-hTERT。
因此,与昆虫细胞(Wu等人,Protein Expr.Purif.2007)中所述的情形相反,在本酵母系统中,不需要添加肽信号(来自酿酒酵母α因子)来表达可溶性hTERT(图1E)。
此外,证实去除MBP的周质信号提高了MBP-hTERT在酵母中的表达水平(图2)。
2.3.仅MBP允许hTERT的有效纯化
本发明的诸位发明人已证实使用若干其它标签(His、His-MBP、GST)不支持有效纯化(参见GST的示例,图1C)。经His标记的hTERT在纯化后不能通过考马斯亮蓝检测到,并且仅生成利用纯化的MBP-hTERT获得的端粒酶活性水平的2-5%。通过蛋白质印迹在经转化以表达与Strep标签II在其N-末端融合的hTERT(两种不同的测试构建体)的酵母中不能检测到蛋白质表达,因此该标签可能对蛋白质表达或稳定性有害。
2.4.表达系统(组成型启动子和富营养培养基(rich media))的重要性
利用基于AOX1启动子的经典的毕赤酵母属系统不能有效地表达完整蛋白质(图1G)。对于GAPDH启动子来说,发现hTERT仅在富营养培养基(含有酵母提取物)中有效地表达。因此,优选组成型启动子或可能地在富营养培养基中不受抑制的诱导型启动子。
2.5.生长条件的重要性
最近解冻或储存在4℃的酵母产生质量不太好的hTERT蛋白质。利用来源于新鲜预培养物的指数生长的酵母获得了最好结果。
酵母必须生长直到细胞内pH将为约6.0时。在摇瓶条件下,这通常对应于OD600nm=10-12。酵母在酸性条件下生长有助于回收降解的MBP-hTERT蛋白质(图1I)。
2.6.提取条件的重要性
对于核蛋白/碱性蛋白来说出乎意料的是,发现高盐浓度(NaCl或KCl)降低提取效率。缓冲溶液(hepes或tris pH 7-8)也降低提取率。
有趣的是,使用纯水发现最好结果,纯水在细胞破坏后得到酵母的细胞内pH(约6.0)。在提取/纯化期间添加甘油、洗涤剂、EDTA、EGTA、DTT、蛋白酶抑制剂以及在提取后添加盐(KCL、Mg2+、NaCL、碳酸氢铵……)均对纯化蛋白质的产率、纯度和活性水平具有很少的作用。(图1J)。
2.7.纯化条件的重要性
在微酸性pH(6.3-7.0)下观测到与直链淀粉树脂的最好结合(图1K)。因此有效的纯化需要将结合溶液和所有洗涤溶液设定为6.0到7.5的pH。
2.8.作为核糖核蛋白的hTERT蛋白质的纯化和酵母RNA的重要性
利用本方法产生的hTERT蛋白质被发现与一些内源性酵母RNA缔合(图4A)。这些成分可以通过RNA酶A被去除(图4B)。它们似乎可逆地结合到hTERT(推测通过离子型相互作用和/或氢键),因为它们通过引入对hTERT具有高亲和力的hTR而被置换。因此,用hTR重构端粒酶活性不需要使用RNA酶A去除这些RNA。然而,当在纯化过程期间添加RNA酶A以去除这些成分时,如果浓缩超过3mg/ml,则纯化的cMBP-hTERT被发现倾向于聚集并沉淀。通过电泳迁移率变动测定分析cMBP-hTERT-hTR复合体揭示与利用RNA酶A制备的蛋白质形成了高分子量聚集物。实际上,大部分的复合体保留于孔的底部中并且不能进入凝胶中(图5,泳道2和3)。此外,在保持缔合的酵母RNA的条件下纯化的hTERT蛋白质展示在纯化后在4℃稳定至少48h的催化活性,而在没有这些RNA的情况下回收的hTERT在前24h内损失了其大部分活性。因此,在保持与这些酵母RNA缔合的条件下对hTERT的纯化相较于在没有这些成分的情况下纯化的hTERT提供了具有增加的时间稳定性和提高的溶解度的重组蛋白质。
3.MBP-纯化的hTERT在高通量筛选中的用途
已经使用MBP-纯化的hTERT利用8000种组分的化学库鉴别出潜在的端粒酶抑制剂。
抑制模式的确定:在三种条件下测试每种分子。它是在端粒酶装配之前(PRE)或在端粒酶装配之后(POST)或在端粒伸长之后(PCR-C.)添加的。通过仅在步骤1被引入时进行抑制来鉴别端粒酶装配抑制剂。端粒酶催化抑制剂在步骤1或2被引入时起作用。PCR抑制剂(假阳性)仅在步骤3进行抑制。
书目参考
Alves D.等人,Nat.Chem.Biol.2008;4(5):287-9
Armbruster等人,Mol.Cell.Biol.2001;第22卷第17期;第6234-6246页
Autexier C.等人,Annu.Rev.Biochem.75(2006)493-517
Bachand F.等人,JBC 1999;274(53):38027-31
Banik SSR等人,Mol.Cell.Biol.2002;第21卷第22期,第7775-7786页
CohenSB.等人,Nat.Methods,2008;5(4):355-60
D′Ambrosio等人Biochimie,2012;94:854-863
Holt S.E.等人,Genes Dev.13(1999)817-826
Kim等人NAR 1997;25(13):2595-2597
Loiselle FB和Casey JR,Methods Mol.Biol.2010;637:311-31
Masutomi K.等人J.Biol.Chem.2000;275(29):22568-73
Mikuni O.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.2002;298(1):144-50
Mitchell J.R.等人Nature 402(1999)551-555
Morin,G.B.,Cell 59:521-529,1989
Nakayama J.等人,Cell 88(1997)875-884
Needleman和Wunsch.J.Mol.Biol.1970,48(3):443-53.
Poole JC等人,Gene 2001;269(1-2):1-12
Weinrich SL.等人,Nat.Genet.1997;17(4):498-502
Wenz C.等人EMBO 2001;20(13):3526-34
West,1994,Arch.Derm.130:87
WuC.K.等人,Protein Expr.Purif.2007;56(1):8-19
Zhang X.等人,Genes Dev.1999,13(18):2388-99
Claims (27)
1.一种产生有活性且可溶的端粒酶逆转录酶(TERT)蛋白质的方法,其包括以下步骤:
a)使包含核苷酸载体的酵母细胞生长,所述载体含有可操作地连接到编码融合蛋白质的核苷酸序列的组成型启动子,所述融合蛋白质含有:
-缺失N-末端周质靶向信号的麦芽糖结合蛋白质(cMBP),和
-端粒酶逆转录酶(TERT)蛋白质,
b)制备步骤a)的所述细胞的粗制蛋白质提取物,
c)如有必要,将所述提取物的pH调节到6.0到7.5的pH,
d)借助于与直链淀粉偶联的固体支持物来纯化所述融合蛋白质cMBP-TERT。
2.根据权利要求1所述的方法,其中在所述酵母细胞的细胞内pH达到低于5.8的值之前进行步骤b)。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述组成型启动子是GAPDH启动子,优选地,具有序列SEQ ID NO:10的GAPDH启动子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述麦芽糖结合蛋白质标签具有多肽序列SEQ ID NO:8。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述核苷酸序列在编码所述麦芽糖结合蛋白质标签的序列与编码所述TERT蛋白质的序列之间进一步含有编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中步骤b)包括在水基溶液、优选不含盐和洗涤剂的水中裂解所述酵母细胞。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述水基溶液不含有任何蛋白酶抑制剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述固体支持物包括直链淀粉偶联的琼脂糖珠。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中用具有6.0到7.5的pH的洗涤缓冲液洗涤所述固体支持物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其进一步包括通过在纯化级分中添加蛋白酶从所述TERT蛋白质中切割所述cMBP标签的步骤。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述载体是整合载体。
13.一种组合物,其含有通过权利要求1至12中任一项所述的方法获得的TERT蛋白质。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中TERT连接到所述cMBP。
15.根据权利要求13或14所述的组合物,其中TERT与酵母RNA缔合。
16.根据权利要求13、14或15中任一项所述的组合物,其中它不含有任何洗涤剂和任何变性剂。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的组合物,其用作药剂。
18.根据权利要求13至16中任一项所述的组合物的用途,其用于体外实验测定。
19.一种药物组合物,其含有通过权利要求1至12中任一项所述的方法获得的TERT蛋白质,所述药物组合物用于治疗细胞衰老或不育症。
20.根据权利要求19所述的药物组合物,其中TERT连接到所述cMBP。
21.根据权利要求19或20所述的药物组合物,其中TERT与酵母RNA缔合。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的药物组合物,其中它不含有任何洗涤剂或变性剂。
23.一种疫苗组合物,其含有通过权利要求1至12中任一项所述的方法获得的TERT蛋白质,所述疫苗组合物用于在受试者中诱发抗TERT免疫应答。
24.根据权利要求23所述的疫苗组合物,其中TERT连接到所述cMBP。
25.根据权利要求23或24所述的疫苗组合物,其中TERT与酵母RNA缔合。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的疫苗组合物,其中它不含有任何洗涤剂或变性剂。
27.一种使用通过权利要求1至12中任一项所述的方法获得的TERT蛋白质来鉴别有效的端粒酶抑制剂的方法。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110205337A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-06 | 王跃驹 | 植物作为宿主表达人源端粒酶的应用 |
CN110573173A (zh) * | 2016-09-30 | 2019-12-13 | 宾夕法尼亚大学理事会 | Tert免疫原性组合物及使用其的治疗方法 |
CN112921002A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-06-08 | 中山大学 | 一种以人内源性tert蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型及其制备方法和应用 |
CN113583141A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-11-02 | 江西农业大学 | 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 |
CN114107252A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-01 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | CL7蛋白质、高活性重组TET酶CL7-NgTET1、其原核表达载体及应用 |
CN116286562A (zh) * | 2021-12-10 | 2023-06-23 | 虹摹生物科技(上海)有限公司 | 一种基因工程菌及其制备方法和应用 |
CN117362452A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-01-09 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | 一种表达包含全能核酸酶的融合蛋白的工程菌或其衍生产物在核酸降解中的应用 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018531022A (ja) * | 2015-10-19 | 2018-10-25 | ユニバーシティ オブ メリーランド ボルチモア | 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法 |
WO2017176087A1 (ko) * | 2016-04-07 | 2017-10-12 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 텔로머라제 활성 증가 및 텔로미어 연장 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 |
US20220065857A1 (en) * | 2018-12-12 | 2022-03-03 | The Johns Hopkins University | Hiv serosignatures for cross-sectional incidence estimation |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060040307A1 (en) * | 1997-04-18 | 2006-02-23 | Geron Corporation | Human telomerase catalytic subunit |
CN101310023A (zh) * | 2005-07-15 | 2008-11-19 | 韩国生命工学研究院 | 用于生产重组蛋白质的翻译融合配偶体文库和从中筛选的翻译融合配偶体 |
EP1994942A1 (en) * | 2007-05-25 | 2008-11-26 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof |
CN102021153A (zh) * | 1996-10-01 | 2011-04-20 | 杰龙公司 | 人类的端粒酶催化亚单位 |
CN102239183A (zh) * | 2008-12-04 | 2011-11-09 | 韩国生命工学研究院 | 大量分泌的蛋白的筛选和它们作为融合配偶体在重组蛋白制备中应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU1606999A (en) * | 1997-11-26 | 1999-06-15 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Mouse telomerase reverse transcriptase |
CN101365783B (zh) * | 2005-11-15 | 2013-07-17 | 格利科菲公司 | 具有降低的o-糖基化的糖蛋白的产生 |
-
2013
- 2013-11-07 EP EP20130306526 patent/EP2871235A1/en not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-11-07 CA CA2932212A patent/CA2932212A1/en not_active Abandoned
- 2014-11-07 AU AU2014345501A patent/AU2014345501A1/en not_active Abandoned
- 2014-11-07 US US15/034,008 patent/US20160251636A1/en not_active Abandoned
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102021153A (zh) * | 1996-10-01 | 2011-04-20 | 杰龙公司 | 人类的端粒酶催化亚单位 |
US20060040307A1 (en) * | 1997-04-18 | 2006-02-23 | Geron Corporation | Human telomerase catalytic subunit |
CN101310023A (zh) * | 2005-07-15 | 2008-11-19 | 韩国生命工学研究院 | 用于生产重组蛋白质的翻译融合配偶体文库和从中筛选的翻译融合配偶体 |
EP1994942A1 (en) * | 2007-05-25 | 2008-11-26 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof |
WO2008145603A2 (en) * | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof |
CN102239183A (zh) * | 2008-12-04 | 2011-11-09 | 韩国生命工学研究院 | 大量分泌的蛋白的筛选和它们作为融合配偶体在重组蛋白制备中应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BENJAMIN DÄLKEN等: "Maltose-Binding Protein Enhances Secretion of Recombinant Human Granzyme B Accompanied by In Vivo Processing of a Precursor MBP Fusion Protein", 《PLOS ONE》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110573173A (zh) * | 2016-09-30 | 2019-12-13 | 宾夕法尼亚大学理事会 | Tert免疫原性组合物及使用其的治疗方法 |
CN110205337A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-06 | 王跃驹 | 植物作为宿主表达人源端粒酶的应用 |
CN112921002A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-06-08 | 中山大学 | 一种以人内源性tert蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型及其制备方法和应用 |
CN113583141A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-11-02 | 江西农业大学 | 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 |
CN113583141B (zh) * | 2021-08-04 | 2023-03-03 | 江西农业大学 | 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 |
CN114107252A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-01 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | CL7蛋白质、高活性重组TET酶CL7-NgTET1、其原核表达载体及应用 |
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