CN101365783B

CN101365783B - 具有降低的o-糖基化的糖蛋白的产生

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Publication number: CN101365783B
Application number: CN2006800425908A
Authority: CN
Inventors: P·博布罗维奇; J·W·库克; W·克特
Original assignee: Glycofi Inc
Current assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2026-11-10
Also published as: AU2006316838A1; EP1954815A4; US8501438B2; WO2007061631A8; JP5284789B2; US20120237973A1; CN101365783A; CA2628725A1; WO2007061631A2; US20090170159A1; AU2006316838B2; US8795984B2; WO2007061631A3; ES2534465T3; US8206949B2; JP2009515963A; EP1954815B1; EP1954815A2; US20120322101A1

Abstract

描述了生产具有降低的O-连接的糖基化数量的蛋白质组合物的方法。所述方法包括在存在Pmt介导的O-连接的糖基化的抑制物的情况下和/或在存在一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的情况下培养的细胞中生产蛋白质。

Description

具有降低的O-糖基化的糖蛋白的产生

发明背景

(1)发明领域

本发明涉及生产具有特定糖基化模式的蛋白质的组合物和方法。特别地，本发明涉及生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的组合物和方法。

(2)相关技术的说明

糖蛋白在人类和其他哺乳动物中介导许多必需的功能，包括催化、信号转导、细胞-细胞通信，以及分子识别和缔合。在真核生物中糖蛋白构成了非胞质蛋白的主要部分(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.218：1-27)。在最近的二十年，许多糖蛋白已经被采用用于治疗目的，天然发生的糖蛋白的重组版本成为生物技术工业的主要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白质的实例包括促红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒毛膜促性腺激素(hCH)(Gumminget al.，1991，Glycobiology 1：115-130)。随着作为潜在的预防试剂和治疗试剂产生的重组蛋白接近临床，重组生产的糖蛋白的糖基化模式中的变化近来在科学界是大量关注的主题。

一般地，糖蛋白低聚糖的糖基化结构将取决于用来生产它们的宿主物种细胞而变化。在非人类宿主细胞中产生的治疗性蛋白可能含有非人类糖基化，其可能在人类中引发免疫原性反应，例如，酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185：440-470)；植物中的α(1，3)-海藻糖和β(1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau et al.，1999，Glycobiology，9：365-372)；中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi et al.，1995.J.Biochem.117：5-62)；以及，小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaeck etal.，1993，Immun.Today，14：477-479)。在动物细胞中与蛋白质结合的碳水化合物链包括与蛋白质中天冬酰胺(Asn)残基结合的N-糖苷键型碳水化合物链(也称为N-聚糖；或N-连接的糖基化)以及与蛋白质中丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基结合的O-糖苷键型碳水化合物链(也称为O-聚糖；或O-连接的糖基化)。

因为非人类哺乳动物产生的糖蛋白的低聚糖结构倾向于与人类糖蛋白的那些更紧密地相关，所以大多数商业的糖蛋白是在哺乳动物细胞中生产的。然而，哺乳动物细胞作为蛋白质生产的宿主细胞具有几个重要的缺点。除了费用高之外，在哺乳动物细胞中表达蛋白质的过程产生了糖形式的异质性群体，具有低的体积滴度，并且需要进行中的病毒防范和大量时间来产生稳定的细胞系。

要理解的是，蛋白质上的特定糖形式(glycoform)可能深刻地影响蛋白质的性质，包括它的药物动力学、药效、受体相互作用和组织特异性靶向性质(Graddis et al.，2002.Curr Pharm Biotechnol.3：285-297)。例如，已经显示了Ig的不同糖基化模式与不同的生物学性质相关联(Jefferis and Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65：111-128；Wright and Morrison，1997，Trends Biotechnol.，15：26-32)。进一步显示的是，糖蛋白的半乳糖基化可能随细胞培养条件而改变，其取决于糖蛋白上的特定半乳糖模式可能使得某些糖蛋白组合物是免疫原性的(Patel etal.，1992.Biochem J.285：839-845)。然而，由于不知道哪个特定的糖形式对期望的生物学功能做贡献，富集糖蛋白上的特定糖形式的能力是高度期望的。由于不同的糖形式与不同的生物学性质相关，富集具有特定糖形式的糖蛋白的能力可以用于阐明糖蛋白的特定糖形式和特定生物学功能之间的关系。并且，富集具有特定糖形式的糖蛋白的能力允许产生具有特定特性的治疗性糖蛋白。因而，产生对于特定糖形式富集的糖蛋白组合物是高度期望的。

虽然N-连接的糖基化的途径已经成为大量分析的目标，O-连接的糖基化的过程和功能还没有很好地了解。然而，已知的是，与N-连接的糖基化相比，O-糖基化是翻译后事件，其在cis-高尔基体中发生(Varki，1993，Glycobiol.，3：97-130)。虽然如同N-连接的糖基化那样对于O-连接的糖基化的共有受体序列看起来似乎不存在，几种糖蛋白的许多O-连接的糖基化位点周围氨基酸序列的比较显示了相对于糖基化残基的位置-1和+3处脯氨酸残基的提高的频率以及丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸残基的显著提高(Wilson et al.，1991，Biochem.J.，275：529-534)。在糖蛋白中丝氨酸和苏氨酸残基的延伸也可能是O-糖基化的潜在位点。

在O-连接的糖基化中起到作用的一个基因家族是编码Dol-P-Man：蛋白(Ser/Thr)甘露糖基转移酶(Pmt)的基因。这些高度保守的基因已经在高等真核生物例如人类、啮齿动物、昆虫等等和低等真核生物例如真菌等等中鉴定。酵母例如Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris编码多达七种编码Pmt同源物的PMT基因(在Wilier et al.Curr.Opin.Struct.Biol.2003Oct；13(5)：621-30中综述)。在酵母中，O-连接的糖基化开始于由七种O-甘露糖基转移酶基因之一在内质网中从多萜醇磷酸甘露糖向新生糖蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基添加起始的甘露糖。虽然在酵母中似乎有七种编码Pmt同源物的PMT基因，在酵母中分泌的真菌蛋白和异源蛋白的O-甘露糖基化主要取决于编码Pmt1和Pmt2的基因，Pmt1和Pmt2看起来作为异二聚体起作用。PMT1和PMT2以及它们分别的蛋白产物Pmt1和Pmt2看起来在物种之间是高度保守的。

Tanner等人在美国专利No.5,714,377中描述了Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母)的PMT1和PMT2基因，以及使用真菌细胞生产具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质的方法，在所述真菌细胞中一个或多个PMT基因被遗传地修饰，从而产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。

Ng等人在美国公开的专利申请NO.20020068325中公开了通过使用反义或共抑制、或通过酵母宿主菌株的工程化来抑制O-糖基化，所述酵母宿主菌株具有与O-连接的糖基化相关的基因、特别是一个或多个PMT基因方面的功能丧失突变体。

UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰基半乳糖基氨基转移酶(GalNAc-转移酶)涉及高等真核生物中发现的粘蛋白型O-连接的糖基化。这些酶启动了蛋白质中特定丝氨酸和苏氨酸氨基酸的O-糖基化，通过向这些氨基酸的羟基添加N-乙酰半乳糖胺，因而在所述羟基上甘露糖残基可以以分步的方式被添加。Clausen等人美国专利No.5,871,990和美国公开的专利申请NO.20050026266中公开了编码UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰基半乳糖基氨基转移酶(GalNAc-转移酶)的核酸家族。Clausen在美国公开的专利申请NO.20030186850中公开了使用GalNAc-β-苯甲基来选择性地抑制多肽GalNAc-转移酶的凝集素，并且不充当O-聚糖生物合成中涉及的其他糖基转移酶的底物，因而抑制O-糖基化。

已经描述了O-连接的糖基化的抑制物。例如，Orchard等人在美国专利No.7,105,554中描述了苯亚甲基噻唑烷二酮类(thiazolidinediones)和它们作为抗霉菌剂，例如抗真菌剂的用途。这些苯亚甲基噻唑烷二酮被报告抑制Pmt1酶，阻止O-连接的甘露蛋白质的形成并损害真菌细胞壁的完整性。最后结果是细胞肿胀和最终通过破裂而死亡。

Konrad等人在美国公开的专利申请NO.20020128235中公开了通过药理学地抑制组织或细胞中O-连接的蛋白质糖基化来治疗或预防糖尿病的方法。该方法依靠用结合O-连接的N-乙酰葡萄糖胺转移酶并因而抑制O-连接的糖基化的(Z)-1-[N-(3-氨基丙基)-N-(n-丙基)氨基]diazen-ium-1，2diolate或其衍生物治疗糖尿病个体。

Kojima等人在美国专利No.5,268,364中公开了利用化合物例如苯基-α-N-乙酰半乳糖胺用于抑制O-糖基化的治疗组合物，所述化合物抑制O-糖基化的延伸，引起O-α-GalNAc的积累，来阻断白细胞或肿瘤细胞的SLex或SLea表达，从而抑制这些细胞对内皮细胞和血小板的粘附。

Boime等人在美国专利No.6,103,501中公开了激素的变体，其中通过修饰糖基化位点处的氨基酸序列改变的O-连接的糖基化。

本发明人发现，对于真菌一般地是致命的、作为Pmt蛋白质的抑制物的特定化合物，可以以对于宿主细胞不致命的方式来使用，用于产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。这使得由真菌和酵母细胞产生的蛋白质的O-连接的糖基化可以被控制。发明人认为是PMT酶的非致命抑制物的其他类别的化合物，对于产生具有降低的O-连接的糖基化的改善的糖蛋白也是有用的。本发明人进一步发现了，单独地或与Pmt蛋白质的化学抑制剂组合地，向宿主细胞或细胞培养物添加某些种类的酶，即，α-1，2-甘露糖苷酶引起了O-糖基化的进一步的降低。

发明概述

本发明提供了生产具有特定糖基化模式的蛋白质和糖蛋白的方法。特别地，本发明提供了在宿主细胞中产生重组蛋白质组合物的方法，其中通过用所述宿主细胞中蛋白质的Pmt介导/O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述宿主细胞，或用一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶接触所述宿主细胞或所述重组蛋白质，或通过这两者，重组蛋白质的O-连接的糖基化被降低。与不存在所述抑制物的情况下所述宿主细胞中产生的重组蛋白质或糖蛋白的O-连接的糖基化的数量相比，重组蛋白或糖蛋白的O-连接的糖基化的数量被降低。

Pmt-介导的O-连接的糖基化是指一种O-连接的糖基化，其中甘露糖残基向蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基的转移由PMT基因或其同源物编码的蛋白-O-D-甘露糖基转移酶(Pmt)或同源物介导。Pmt-介导的O-连接的糖基化的抑制物包括抑制任何一种PMT基因的同源物的抑制物。在当前优选的方面中，所述抑制物至少抑制真菌和酵母的Pmt1和/或Pmt2活性，或在其他有机体，包括但不限于哺乳动物、植物和昆虫中相应同源物的活性。

当前，优选的是，O-连接的糖基化的数量通过使用化学抑制物，例如称为苯亚甲基噻唑烷二酮的化学物质种类所涵盖的化学抑制物来降低。在特定的实施方式中，所述化学抑制物选自由5-[[3，4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；3-羟基-4-(2-苯基乙氧基)苯甲醛；3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)-苯甲醛；5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸构成的组。

在进一步的方面，提供的是产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质组合物的方法，其使用O-连接的糖基化中涉及的Pmt蛋白质的一种或多种抑制物和/或一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。当前优选的α-1，2-甘露糖苷酶可以分离自真核细胞，包括哺乳动物和酵母细胞。在当前优选的实施方式中，α-1，2-甘露糖苷酶是由Trichoderma reesei、Saccharomyces sp.或Aspergillus sp.产生的那些。在其他当前优选的实施方式中，α-1，2-甘露糖苷酶可以从嵌合构建体产生，所述嵌合构建体包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的催化结构域的核酸序列，所述核酸序列与编码通常不与所述催化结构域相连的细胞靶向信号肽的核酸序列可操作地连接。在其他实施方式中，α-1，2-甘露糖苷酶可以单独地产生并添加到细胞培养物中，或可以通过与重组糖蛋白共表达α-1，2-甘露糖苷酶来产生。

在该方法的特定的方面，所述重组蛋白质组合物包含具有N-连接的糖基化的糖蛋白，其中所述重组糖蛋白包括至少一个主要N-糖形式(predominantN-glycoform)并具有降低的O-连接的糖基化。因此，进一步提供的是糖蛋白组合物，其包含主要种类的N-聚糖结构，并且与没有在Pmt-介导的O-连接的糖基化的抑制物或α-1，2-甘露糖苷酶的情况下孵育的宿主细胞中产生的糖蛋白的组合物相比，具有降低的O-连接的糖基化，所述α-1，2-甘露糖苷酶能够从聚糖结构上修整(trimming)超过一个甘露糖残基。在特定的方面，糖蛋白组合物包含具有选自由Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形式构成的组的主要N-聚糖结构的糖蛋白。所述方法的一个重要的方面是，它提供了包含降低的O-连接的糖基化并主要包含特定N-连接的糖形式的糖蛋白组合物，其中相对于从哺乳动物细胞培养物例如CHO细胞产生的相同糖蛋白的组合物，该重组糖蛋白可以展现提高的生物学活性和/或降低的非期望免疫原性。产生包含降低的O-连接的糖基化和主要N-连接的糖形式的糖蛋白组合物的其他益处是，它避免了产生非期望的或无活性的糖形式和异质混合物，其可能诱导非期望的效果和/或稀释更有效的糖形式。因而，主要包含，例如，Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形式，并具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白分子的治疗性药物组合物也可能在更低的剂量有效，因而具有更高的效力/效价。

因而，提供的是生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括提供编码蛋白质的核酸；将所述核酸导入宿主细胞中来提供宿主细胞的培养物；用Pmt介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物；以及分离在存在所述抑制物的情况下宿主细胞产生的糖蛋白来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

在所述方法的特定的方面，所述培养物生长足够的时间以提供具有所述核酸的大量宿主细胞(a multiplicity of the host cells)，之后用Pmt介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物，或者在培养物被建立之时在存在Pmt介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物的情况下生长所述培养物。

在所述方法的进一步的方面，编码蛋白质的核酸与可诱导的启动子可操作地连接。然后，所述培养物生长足够的时间以提供具有所述核酸的大量宿主细胞，之后用Pmt介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物和所述启动子的诱导物接触所述培养基以诱导所述蛋白质的表达，并分离在存在所述一种或多种抑制物和诱导物的情况下宿主细胞产生的蛋白质以产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质，或者所述培养物与所述启动子的诱导物接触来诱导所述蛋白质的表达一定时间，之后用O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物，并分离在存在所述抑制物和诱导物的情况下所述宿主细胞产生的蛋白质以产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

进一步提供的是生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括提供编码蛋白质的核酸；将所述核酸导入宿主细胞中来提供宿主细胞的培养物；用一种或多种(one or more)α-1，2-甘露糖苷酶接触所述培养物；以及分离在存在所述一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的情况下宿主细胞产生的蛋白质来产生具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白。

在所述方法的特定的方面，所述培养物生长足够的时间以提供具有所述核酸的大量宿主细胞，之后用一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶接触所述培养物。在其他方面，所述培养物在存在一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的情况下生长。

在所述方法的进一步的方面，提供编码一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的第二核酸并将所述第二核酸导入所述宿主细胞中。在特定的方面，提供可操作地连接到可诱导启动子的编码一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的第二核酸，将所述第二核酸导入所述宿主细胞中，所述培养物生长足够的时间以提供大量宿主细胞，之后诱导所述蛋白质和所述一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的表达来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质，或者所述蛋白质的表达被诱导一定时间，之后诱导所述一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的表达来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质，或者所述一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的表达被诱导一定时间，之后诱导所述蛋白质的表达来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

进一步提供的是生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括提供与可诱导启动子可操作连接的编码蛋白质的核酸；将所述核酸导入宿主细胞中并生长含有所述核酸的宿主细胞来产生宿主细胞的培养物；用Pmt介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物和一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶接触所述培养物；以及分离在存在所述一种或多种抑制物和所述一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的情况下所述宿主细胞产生的糖蛋白来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

在所述方法的特定的方面，所述培养物生长足够的时间以提供具有所述核酸的大量宿主细胞，之后用O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物，或者在培养物被建立之时在存在Pmt介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物的情况下生长所述培养物。

在使用Pmt蛋白的一种或多种抑制物的上述方法的进一步的方面，当前，优选的是，所述一种或多种抑制物选自包含苯亚甲基噻唑烷二酮的分子种类。当前，优选的是，所述一种或多种抑制物选自由5-[[3，4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸构成的组。

在使用α-1，2-甘露糖苷酶的上述方法的特定的方面，当前优选的是，所述α-1，2-甘露糖苷酶选自由Trichoderma reesei、Saccharomyces sp.、和Aspergillus sp.构成的组。当前，优选的是，α-1，2-甘露糖苷酶来自Trichoderma reesei。做为选择，除了编码蛋白质或糖蛋白的第一核酸之外，宿主细胞可以包括与可诱导启动子可操作连接的第二核酸，其编码α-1，2-甘露糖苷酶。α-1，2-甘露糖苷酶和蛋白质或糖蛋白的表达可以同时地诱导，或在α-1，2-甘露糖苷酶的表达之前诱导蛋白质或糖蛋白的表达，或者反之。

虽然所述方法可以使用产生具有O-连接的糖基化的蛋白质的任何宿主细胞来进行，在当前优选的方面中，所述宿主细胞是低等真核细胞，优选的是真菌细胞或酵母细胞。当前，优选的是，所述宿主细胞选自由来自K.lactis、Pichia pastoris、Pichia methanolica和Hansenula的细胞构成的组。具体地，在产生重组糖蛋白的进一步的实施方式中，所述宿主细胞是酵母或丝状真菌细胞，其已经被遗传修饰来产生主要具有特定N-聚糖结构的糖蛋白。在特别优选的方面，所述宿主细胞被遗传地修饰，从而它们表达重组糖蛋白，其中糖基化模式是像人类(human-like)的或人源化的。特别地，所述宿主细胞可以被修饰，从而它们表达主要具有特定的期望N-聚糖结构的重组糖蛋白。在此当与糖基化分布型(glycosylation profiles )连同地使用时，低等真核宿主细胞是指任何真核细胞，其通常生产含有高量甘露糖的N-连接的聚糖，并因而包括最典型的低等真核细胞，包括单细胞和多细胞的真菌和藻类细胞。

在此提及的所有公开物、专利、专利申请和其他参考文献通过引用将它们完整地合并。

附图的简要说明

附图1说明了在Pichia pastoris中Pmt抑制物对分泌的重组报告蛋白质的O-糖基化的影响。Pmt的化学抑制物将O-糖基化降低到与缺乏PMT1的菌株中观察的相类似的水平。利用抗多组氨酸抗体的Western印迹被用于检测野生型(泳道1-3)和pmt1(泳道4-5)菌株的生长培养基中人类血纤蛋白溶解酶原的His标签的人类Kringle 1-3结构域(K1-3)。更慢的迁移条带(在泳道1中对于K1-3作为更高分子量的弥散所见)表明O-糖基化的蛋白质。Pmti-1，PMT抑制物1。

附图2显示了Western印迹，其展现了T. reesei α-甘露糖苷酶和化学抑制物Pmti-2对免疫球蛋白轻链和重链多肽的O-糖基化的影响。T.reesei α-甘露糖苷酶和化学物质Pmt抑制物都降低了O-糖基化的水平。

发明的详细说明

本发明提供了在特定的宿主细胞中表达对于O-连接的糖基化敏感的重组蛋白质(包括多肽和糖蛋白)的方法，在该细胞类型中具有降低的O-连接的糖基化数量(包括没有O-连接的糖基化)。本发明的方法涉及在蛋白质的表达被诱导之时，在存在一种或多种Dol-P-Man：蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶(Pmt)蛋白或一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶、或这两者的情况下，在宿主细胞中诱导感兴趣的蛋白质的表达，在所述宿主细胞中所述蛋白质对于O-连接的糖基化是敏感的，所述Dol-P-Man：蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶(Pmt)蛋白涉及细胞中甘露糖向蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基的转移。与如果在缺乏所述抑制物或一种或多种α-1，2甘露糖苷酶、或这两者的情况下产生的蛋白质上将存在的O-连接的糖基化数量相比，在存在所述抑制物或一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶的情况下表达的蛋白质具有降低的O-连接的糖基化数量。所述方法是特别有用的，因为它提供了在宿主细胞例如低等真核生物，例如酵母和细菌中产生治疗相关的蛋白质的手段，其中期望的是所述蛋白质具有降低的O-糖基化数量，所述宿主细胞通常产生具有O-连接的聚糖、具有降低数量的O-连接的聚糖的蛋白质。然而，虽然所述方法特别适合于在低等真核生物中表达具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质，所述方法也可以在高等真核生物和细菌中实践。

对于在蛋白质对O-连接的糖基化敏感的宿主细胞中产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质，所述方法与先有技术相比有改进。例如，Tanner等在美国专利No.5,714,377中描述了利用真菌细胞例如酵母细胞产生重组的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，在所述细胞中编码Pmt蛋白的一种或多种PMT基因被遗传地修饰，从而产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。虽然在真菌宿主细胞中删除PMT1或PMT2基因之一允许在真菌宿主细胞中产生重组的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质，PMT1和PMT2基因的表达对于宿主细胞生长是重要的，任何一个单独的删除都不利地影响真菌宿主细胞生长的能力，因而使他难以产生足够数量的宿主细胞或具有降低的O-连接的糖基化数量的重组蛋白质。两个基因的删除看起来对于真菌宿主细胞是致命的。因此，在宿主细胞中PMT1和PMT2基因的遗传学消除似乎将是产生重组的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的非期望的手段。

相比之下，在本发明的方法中使用的宿主细胞中PMT基因没有被修饰或删除，其允许宿主细胞O-糖基化那些对于细胞生长重要的蛋白质，直到Pmt蛋白的活性被抑制之时。一般地，这允许宿主细胞生长到与如果删除PMT基因获得的水平相比更高的水平。此外，在特定的实施方式中，重组蛋白质在宿主细胞中的表达由可诱导的启动子控制，宿主细胞中的Pmt活性不被抑制，或添加一种或多种α1，2-甘露糖苷酶，或这两者，直到重组蛋白质的表达被诱导。这允许在诱导重组蛋白质的表达和添加Pmt抑制物和/或一种或多种α1，2-甘露糖苷酶之前在培养物中产生含有编码重组蛋白质的核酸的大量宿主细胞。与已经删除一种或多种PMT基因以及在培养中不良生长的宿主细胞所发生的相比，这允许在更短的时间内在培养物中产生更大数量的具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。

相对先有技术的这种改进还便于在已经被遗传地修饰以产生主要具有特定N-连接的聚糖结构的糖蛋白、但也O-糖基化该糖蛋白的宿主细胞中产生具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白。产生主要具有特定的N-连接的糖形式的各种各样糖蛋白的方法以及在美国专利No.7,029,872和美国公开的申请NO.20050170452、20050260729、20040230042、20050208617、20050208617、20040171826、20060160179、20060040353和20060211085中公开。在前述专利和专利申请中描述的任何一种宿主细胞都可以用于利用在此公开的方法产生主要具有特定N-连接的聚糖结构、并具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白。已经发现，与没有被修饰的宿主细胞相比，某些被遗传地修饰以产生主要具有特定N-连接的聚糖结构的糖蛋白的宿主细胞在特定条件下在培养物中生长得不那么好。例如，与没有遗传修饰的真菌或酵母细胞相比，特别是其中涉及超甘露糖基化的基因被删除、添加了产生特定哺乳动物或人类样N-连接的聚糖结构所需的其他基因的真菌和酵母细胞生长得没有那么好。在这些遗传修饰的真菌或酵母细胞中，进一步引入PMT1或PMT2基因的删除对于细胞都是致命的，或者不利地影响细胞在培养物中生长到足够数量的能力。通过在诱导重组糖蛋白表达和添加Pmt蛋白活性的抑制物或一种或多种α1，2-甘露糖苷酶或这两者之前容许细胞在培养物中生长到足够的数量，来产生主要具有特定N-连接的聚糖结构和降低的O-连接的糖基化的重组糖蛋白，此处的方法避免了删除PMT1和PMT2基因的潜在有害影响。

因而，所述方法的一个重要的方面是，它提供了包含降低的O-连接的糖基化并主要包含特定N-连接的糖形式的糖蛋白组合物，其中相对于从哺乳动物细胞培养物例如CHO细胞产生的相同糖蛋白的组合物，所述重组糖蛋白可以展现提高的生物学活性和/或降低的非期望免疫原性。产生包含降低的O-连接的糖基化和主要N-连接的糖形式的糖蛋白组合物的其他益处是，它避免了产生非期望的或无活性的糖形式和异质混合物，这可能诱导非期望的效果和/或稀释更有效的糖形式。因而，主要包含，例如，Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形式，并具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白分子的治疗性药物组合物也可能在更低的剂量有效，因而具有更高的效力/效价。

一般地，生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法包括用编码重组蛋白质或异源蛋白质的核酸转化宿主细胞，其中期望的是产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。编码所述重组蛋白质的核酸与容许重组蛋白质的表达的调节序列可操作地连接。这样的调节序列包括可诱导的启动子，任选地包括编码融合蛋白的核酸的上游或5′的增强子，以及编码重组蛋白质的核酸的3′或下游的转录终止位点。核酸一般地还编码具有核糖体结合位点的5′UTR区域和3′非翻译区。所述核酸通常是载体的部分，所述载体在表达重组蛋白质的细胞中是可复制的。载体也可以含有标记物以容许识别转化的细胞。然而，某些细胞类型，特别是酵母，可以用缺乏外来载体序列的核酸成功地转化。

编码期望的重组蛋白质的核酸可以从几个来源获得。可以使用针对保守区域的引物从已知表达该蛋白质的细胞系扩增cDNA序列(参见，例如Marks et al.，J.Mol.Biol.581-596(1991))。核酸也可以根据科学文献中的序列从头合成。核酸也可以通过跨越期望序列的重叠寡核苷酸的延伸来合成(参见，例如Caldas et al.，Protein Engineering，13，353-360(2000))。

在一个方面，编码蛋白质的核酸与可诱导启动子可操作地连接，所述启动子容许蛋白质的表达在期望时被诱导。在另一个方面，编码蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接。为了便于表达的蛋白质的分离，当前优选的是，蛋白质包括信号序列，所述信号序列指导蛋白质分泌到细胞培养介质中，因而在其中蛋白质可以被分离。在第一个方面，在向培养基添加O-连接的糖基化的一种或多种抑制物之前，转化的宿主细胞被培养足够的时间来产生足以产生期望数量的蛋白质的期望的大量宿主细胞。诱导物和抑制物可以同时地添加到培养物中，或者在添加一种或多种Pmt抑制物之前向培养物添加诱导物，或者在添加诱导物之前向培养物添加一种或多种Pmt抑制物。产生具有降低的O-连接的糖基化的诱导的蛋白质，可以从培养基中回收，或者对于不具有信号序列的蛋白质，通过裂解从宿主细胞中回收。在第二个方面，其中编码蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接，在培养物被建立的同时向培养基中添加O-连接的糖基化的一种或多种抑制物，产生的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质可以从培养基中回收，或对于不具有信号序列的蛋白质，通过裂解从宿主细胞中回收。说明利用可诱导启动子的方法的实例在实施例2中示出，说明利用组成型启动子的方法的实例在实施例3中示出。

对于产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质有用的抑制物是抑制一种或多种Pmt蛋白质的活性的化学物质或组合物。当宿主细胞是低等真核生物例如真菌或酵母时，期望的是所述抑制物抑制至少Pmt1或Pmt2、或这两者的活性。在高等真核生物中，期望的是所述抑制物抑制该高等真核生物中相应于Pmt1或Pmt2的同源物的活性。可以使用的化学抑制物包括在美国专利No.7,105,554中鉴定的噻唑烷二酮类，其包括5-[[3，4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；3-羟基-4-(2-苯基乙氧基)苯甲醛；3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)-苯甲醛；以及，5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸。可能有用的其他化合物是Voss等在WO 94/29287中公开的结构上相似的化合物，其公开了产生亚芳基-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷羧酸类的方法，公开了它们在糖尿病的晚期影响的预防和治疗以及动脉粥样硬化(atherosclerosis and arteriosclerosis)和动脉硬化的预防和治疗中是有用的，以及Esswein等在美国专利No.6,673,816中公开的结构上相似的化合物，其公开了产生若单宁羧酸(rhodaninecarboxylic acids)的衍生物的方法和它们用于代谢性骨骼失调的治疗的用途。

在实施例中，选自由5-[[3，4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸构成的组的化学抑制物被显示在具有完整的、功能性PMT1和PMT2基因的Pichiapastoris菌株中产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质方面是有效的。实施例2的表1显示了上述三种Pmt化学抑制物的任何一种在重组蛋白质的表达被诱导时添加到重组Pichia pastoris的培养物中，所述重组Pichia pastoris具有完整的功能性PMT1和PMT2基因并用编码重组可分泌Kringle 1-3蛋白质、与可诱导启动子可操作连接的核酸转化，与含有PMT1或PMT2基因之一的删除的Pichia pastoris细胞所见的O-连接的糖基化相比，产生了具有降低的O-连接的糖基化水平的重组蛋白质。上述Pmti抑制物已经以约0.03μM到20μM的数量使用来产生与缺乏Pmti抑制物的类似宿主细胞培养物中产生的蛋白质上的O-连接的糖基化数量相比、具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。在实施例3中显示的结果进一步显示了宿主细胞培养物可以在存在一定数量Pmti抑制物的情况下生长，所述数量足以抑制O-连接的糖基化而不杀死所述宿主细胞。

所述方法可以包括向含有一种或多种Pmt抑制物的培养基中添加一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶来产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。α-1，2-甘露糖苷酶是用于N-聚糖的成熟的真核酶的保守家族，其能够在酵母中将Man₉GlcNAc₂修整成Man₈GlcNAc₂。(Vallee et al.，2000，EMBO J.，19：581-588)。α-1，2-甘露糖苷酶也称为I类a-甘露糖苷酶，其已经在哺乳动物、低等真核物种和昆虫细胞中鉴定(Kawar et al.，2000，Glycobiology 10：347-355)。哺乳动物细胞已知具有几种I类α-甘露糖苷酶，其中一些能够修整多种甘露糖残基(Moremen et al.，1994，Glycobiology 4：113-125)，而酵母看起来具有更少的、更专门的α-1，2-甘露糖苷酶。例如，已经公开了Saccharomyces具有由MNN1编码的单个α-1，2-甘露糖苷酶，其移除一个特定的甘露糖残基(例如，Man₉GlcNAc₂到Man₈GlcNAc₂)(Herscovics，1999，Biochim Biophys Acta.，1473：96-107)。因而，在许多低等真核生物例如真菌和酵母中存在、并且不能从聚糖结构上除去多个甘露糖残基的内源的α-1，2-甘露糖苷酶，不能够允许具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的产生。因此，此处的方法需要向含有宿主细胞的培养基中引入能够从O-连接的聚糖上修整多个甘露糖残基的α-1，2-甘露糖苷酶，或向宿主细胞中引入编码能够从O-连接的聚糖上休整多个甘露糖残基的α-1，2-甘露糖苷酶的核酸。此处的α-1，2-甘露糖苷酶包括完整的、天然的α-1，2-甘露糖苷酶；被修饰以提高其α-1，2-甘露糖苷酶活性的α-1，2-甘露糖苷酶；被修饰以降低其α-1，2-甘露糖苷酶活性的α-1，2-甘露糖苷酶；以及，至少包含具有α-1，2-甘露糖苷酶活性的催化结构域的重组α-1，2-甘露糖苷酶(例如，包含具有α-1，2-甘露糖苷酶活性的催化结构域、融合到异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白)。

在特定的实施方式中，能够从O-连接的聚糖上修整多个甘露糖残基并被添加到细胞培养物中的α-1，2-甘露糖苷酶由Trichoderma sp.、Saccharomyces sp.、或Aspergillus sp.产生。当前，优选的α-1，2-甘露糖苷酶获自Trichoderma reesei、Aspergillus niger或Aspergillus oryzae。T.reesei也称为Hypocrea jecorina。在实施例3中，包含表达重组α-1，2-甘露糖苷酶的表达盒的转化的酵母被用于产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质，所述重组α-1，2-甘露糖苷酶包含与Saccharomycescerevisiea αMAT前信号序列(pre signal sequence)融合的Trichodermareesei α-1，2-甘露糖苷酶催化结构域。可以用于此处的方法来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的重组α-1，2-甘露糖苷酶的另一个实例是在Maras et al.，2000，J.Biotechnol.77：255-263中公开的重组Trichoderma reesei α-1，2-甘露糖苷酶，其中Trichoderma reesei α-1，2-甘露糖苷酶催化结构域被融合到Saccharomyces cerevisiea α-MAT前原信号肽(prepro-signal peptide)。

α-1，2-甘露糖苷酶也可以从嵌合核酸产生，所述嵌合核酸包含至少编码能够从O-连接的聚糖上修整多个甘露糖残基的α-1，2-甘露糖苷酶的催化结构域、与编码通常不与所述催化结构域相关的细胞靶向信号肽的核酸序列可操作连接的核酸序列。所述嵌合核酸可以与组成型启动子或可诱导启动子可操作地连接。嵌合核酸被转化到宿主细胞中来产生α-1，2-甘露糖苷酶，其然后被分离并在异源蛋白质的表达被诱导之时添加到含有细胞的细胞培养介质中，所述细胞用编码异源蛋白质的核酸转化。做为选择，用编码α-1，2-甘露糖苷酶的嵌合核酸和编码重组蛋白质的核酸转化宿主细胞，同时共表达所述α-1，2-甘露糖苷酶和重组蛋白质。在特定的实施方式中，边α-1，2-甘露糖苷酶的嵌合核酸和编码重组蛋白质的核酸都与可诱导启动子可操作地连接。在其他实施方式中，所述启动子之一或两者是组成型的。实施例3说明了所述方法，其中编码α-甘露糖苷酶和重组蛋白质的核酸可操作地连接到组成型启动子，被导入宿主细胞中，然后在存在一种或多种Pmt抑制物的情况下孵育宿主细胞的培养物来产生具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。实施例3进一步显示了，Pmt1抑制物和α-1，2-甘露糖苷酶适合协同地降低O-连接的糖基化的数量，与存在单独的任一种的情况下O-连接的糖基化的数量相比。

在特定的方面，降低的O-连接的糖基化可以通过向培养基仅添加一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶而非一种或多种Pmt抑制物来实现。在一个方面，编码重组蛋白质的核酸与可诱导启动子可操作地连接，其容许所述重组蛋白质的表达在期望时被诱导。在另一个方面，编码蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接。为了便于表达的重组蛋白质的分离，当前优选的是，所述蛋白质包括信号序列，所述信号序列指导重组蛋白质分泌到细胞培养介质中，因而在其中重组蛋白质可以被分离。

在第一个方面，在向培养基添加一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶之前，转化的宿主细胞被培养足够的时间来产生足以产生期望数量的重组蛋白质的期望的大量宿主细胞。诱导物和一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶可以同时地添加到培养物中，或者在添加一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶之前向培养物添加诱导物，或者在添加诱导物之前向培养物添加一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶。产生具有降低的O-连接的糖基化的诱导的重组蛋白质，可以从培养基中回收，或者对于不具有信号序列的蛋白质，通过裂解从宿主细胞中回收。

在第二个方面，其中编码重组蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接，在培养物被建立的同时向培养基中添加一种或多种α-1，2-甘露糖苷酶，产生的具有降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质可以从培养基中回收，或对于不具有信号序列的重组蛋白质，通过裂解从宿主细胞中回收。

在不使用Pmt介导的O-连接的糖基化的抑制物生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的再进一步的方面，用编码α-1，2-甘露糖苷酶的嵌合核酸和编码重组蛋白质的核酸转化宿主细胞，共表达α-1，2-甘露糖苷酶和所述重组蛋白质来产生降低的O-连接的糖基化的重组蛋白质。在特定的实施方式中，编码α-1，2-甘露糖苷酶的嵌合核酸和编码重组蛋白质的核酸都与可诱导启动子可操作地连接。在其他实施方式中，所述启动子之一或两者是组成型的。对于可诱导启动子来说，在诱导α-1，2-甘露糖苷酶和/或重组蛋白质的表达之前生长宿主细胞来产生期望的大量宿主细胞。实施例3说明了所述方法，其中编码α-1，2-甘露糖苷酶和重组蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接，被导入宿主细胞中，然后孵育所述宿主细胞的培养物一定时间来产生重组蛋白质，与在缺乏α-1，2-甘露糖苷酶的细胞中产生的重组蛋白质相比，所述重组蛋白质具有降低的O-连接的糖基化。

II.宿主细胞

虽然用于此处的方法的宿主细胞包括高等真核生物细胞和低等真核生物细胞，低等真核生物细胞例如丝状真菌或酵母细胞当前对于蛋白质的表达是优选的，因为它们可以被经济地培养，得到高产量的蛋白质，当适当地修饰时能够产生具有适合的糖基化模式的蛋白质。低等真核生物细胞包括酵母、真菌、环-鞭毛虫、小孢子虫、alveolates(例如，甲藻)、stramenopiles(例如，褐藻、原生动物)、红藻门(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、苔藓)和其他原生生物。酵母和真菌包括但不限于：Pichiasp.(例如Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichiakoclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia tkermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica)、Saccharomyces sp.(f例如Saccharomyces cerevisiea)、Hansenulapolymorpha、Kluyveromyces sp.(例如，Kluyveromyces lactis)、Candidaalbicans、Aspergillus sp(例如，Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae)、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucbiowense、Fusarium sp.(例如，Fusarium gramineum、Fusarium venenatum)、Physcomitrella patens和Neurospora crassa。特别地，酵母是当前优选的，因为酵母提供了确定的遗传学，容许快速转化、测试的蛋白质定位策略、以及便于基因敲除技术。适合的载体具有表达控制序列，例如启动子，包括2-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，复制起点、终止序列，等等，如所期望的。

各种酵母，例如K.lactis、Pichia pastoris、Pichia methanolica和Hansenula polymorpha对于细胞培养是当前优选的，因为它们能够生长到高细胞密度并分泌大量的重组蛋白质。同样地，丝状真菌，例如Aspergillus niger、Fusarium sp、Neurospora crass等等可以用于以工业规模产生重组蛋白质。

低等真核生物，特别是丝状真菌和酵母，以被遗传地修饰，从而它们表达蛋白质或糖蛋白，其中糖基化模式是像人类的或人源化的。这可以通过消除选定的内源糖基化酶和/或补充外源酶来实现，如Gerngross等在美国专利No.US7029872中、以及美国公开的专利申请Nos.20040018590、20050170452、20050260729、20040230042、20050208617、20040171826、20050208617、20060160179、20060040353和20060211085中所描述的。因而，宿主细胞可以另外地或可选择地被工程化来表达一种或多种酶或酶活性，其允许以高产量产生特定的N-聚糖结构。这样的酶可以被靶向宿主亚细胞器，在其中所述酶将具有最佳活性，例如，通过通常不与所述酶相关的信号肽的方式。宿主细胞也可以被修饰来表达糖核苷酸转运蛋白和/或核苷酸焦磷酸酶。转运蛋白和二磷酸酶改善了工程化的糖基化步骤的效力，通过在合适的区室中提供糖基化酶的合适底物、降低竞争性产物抑制作用、以及促进二磷酸核苷的消除。参见，例如Gerngross et al.的美国公开的专利申请No.20040018590以及Hamilton，2003，Science 301：1244-46和上述美国专利和专利申请。

举例来说，宿主细胞(例如，酵母或真菌)可以被选择或工程化来耗尽1，6-甘露糖基转移酶活性，其将在糖蛋白的N-聚糖上另外添加甘露糖残基，以及进一步包括用于α-1，2甘露糖苷酶活性的异位表达的核酸，其允许产生具有大于30摩尔百分比的Man₅GlcNAc₂N-聚糖的重组糖蛋白。当根据在此描述的方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有Man₅GlcNAc₂N-聚糖结构结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在进一步的方面，所述宿主细胞被工程化以进一步包括用于GlcNAc转移酶I活性的异位表达的核酸，其允许产生主要具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖结构的糖蛋白。当根据在此描述的方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在再进一步的方面，所述宿主细胞被工程化以进一步包括用于甘露糖苷酶II活性的异位表达的核酸，其允许产生主要具有GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖结构的糖蛋白。

当根据在此描述的方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在再进一步的方面，所述宿主细胞被工程化以进一步包括用于GlcNAc转移酶II活性的异位表达的核酸，其允许产生主要具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构的糖蛋白。当根据在此描述的方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在再进一步的方面，上述宿主细胞可以被进一步工程化来产生特定的杂交或复合的N-聚糖或人类样N-聚糖结构，通过以任意组合进一步包括涉及N-连接的糖基化的一种或多种高等真核生物基因，所述基因编码例如唾液酰基转移酶活性、II类和III类甘露糖苷酶活性、GlcNAc转移酶II、III、IV、V、VI、IX活性、和半乳糖转移酶活性。当前优选的是，所述细胞进一步包括编码UDP特异性二磷酸酶活性、GDP特异性二磷酸酶活性和UDP-GlcNAc转运蛋白活性的一种或多种核酸。

植物和植物细胞培养物可以用于表达在此教导的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质和糖蛋白(参见，例如，Larrick & Fry，1991，Hum.Antibodies Hybridomas 2：172-89)；Benvenuto et al.，1991，Plant Mol.Biol.17：865-74)；Durin et al.，1990，Plant Mol.Biol.15：281-93)；Hiatt et al.，1989，Nature 342：76-8)。优选的植物宿主包括，例如，Arabidopsis、Nicotiana tabacum、Nicotiana rustica和Solarium tuberosum。

昆虫细胞培养物也可以用于生产在此教导的具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白蛋白质和糖蛋白，例如基于杆状病毒的表达系统(参见，例如，Putlitz et al.，1990，Bio/Technology 8：651-654)。

虽然当前不像低等真核生物和原核生物那样经济地培养，哺乳动物组织细胞培养物也可以用于表达和产生在此教导的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质和糖蛋白(参见Winnacker，From Genes to Clones(VCHPublishers，NY，1987)。适合的宿主包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞，优选的骨髓瘤细胞系等等，或转化的B细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子(Queen et al.，1986I，mmunol.Rev.89：49-68)和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸位点和转录终止子序列。表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、巨细胞病毒等等的启动子。一般地，可选择标记，例如neoR表达盒被包括在表达载体中。

编码要表达的蛋白质的核酸可以通过常规方法转移到宿主细胞中，其取决于细胞宿主的种类而变。例如，磷酸钙处理、原生质体融合、自然孵育、脂转染、基因枪、基于病毒的转导或电穿孔可以用于细胞宿主。钨颗粒弹丸转基因对于植物细胞和组织是优选的。(一般地参见Maniatiset al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，1982))。

一旦被表达，具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质或糖蛋白可以根据本领域的标准方法来纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等。(一般地，参见，Scopes，R.，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982))。对于药物用途，至少约90到95％均质性的基本上纯的糖蛋白是优选的，98到99％或更为均质是最优选的。一旦被纯化，如所期望的部分地纯化或纯化到均质，所述蛋白质可以治疗地使用(包括体外地(extracorporeally))，或在开发或进行分析步骤、免疫荧光法染色等等方面使用。(一般地参见，Immunological Methods，Vols.I and II(Lefkovitsand Pernis，eds.，Academic Press，NY，1979and 1981)。

因此，进一步提供的是糖蛋白组合物，其包含主要种类的N-聚糖结构，并且与没有在Pmt介导的O-连接的糖基化的抑制物或α-1，2-甘露糖苷酶或这两者的情况下孵育的宿主细胞中产生的糖蛋白的组合物相比，具有降低的O-连接的糖基化，所述α-1，2-甘露糖苷酶能够从聚糖结构上修整超过一个甘露糖残基。在特定的方面，所述糖蛋白组合物包括具有选自由Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形式的主要N-聚糖结构的糖蛋白。

III.药物组合物

具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质和糖蛋白可以被掺入药物组合物中，所述药物组合物包含糖蛋白作为活性治疗试剂和多种其他药学上可接受的成分(参见Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期方式。取决于期望的制剂，组合物也可以包括药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂从而不影响组合的生物学活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其他载体、佐剂，或无毒的、非治疗性、非免疫原性的稳定剂，等等。

用于肠胃外施用的药物组合物是无菌的、基本上等渗的、无热原的，并根据美国食品与药物管理局或类似机构的的GMP来制备。糖蛋白可以作为在生理学地可接受的稀释剂中物质的溶液或悬浮液的可注射剂量来施用，具有可以是无菌液体例如水、油、盐水、甘油或乙醇的药物载体。另外，辅助剂物质，例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH值缓冲剂等等可以存在于组合物中。药物组合物的其他部分是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如，花生油、豆油和矿物油。一般地，乙二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。糖蛋白可以以储库注射或植入物制品的形式施用，其可以以允许活性成分的持续释放的方式来配制。一般地，这种组合物被制备为可注射的，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备为在注射之前适合于溶解于或悬浮于液体媒介物的固体形式。制品还可以乳化或密封在脂质体或微粒中，例如聚交酯、聚乙交酯或共聚物，用于增强的佐剂效果，如以上讨论的。(参见Langer，Science 249，1527(1990)and Hanes，Advanced DrugDelivery Reviews 28，97-119(1997)。

除非在此另外定义，与本发明关联使用的科学和技术术语和用语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步的，除非上下文另外需要，单数的术语应当包括复数，复数的术语应当包括单数。一般地，相关使用的命名，以及在此描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域公知和通常使用的。根据本领域公知的常规方法以及如各种一般的和更具体的参考文献的描述一般地进行本发明的方法和技术，除非另有陈述这些参考文献在本说明书中被引证和讨论。参见，例如，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，andSupplements to 2002)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor and Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol I，CRCPress(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol n，CRCPress(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1999)。

以下实施例意图促进本发明的进一步理解。

实施例1

这个实施例提供了制备各种Pt抑制物的方法。除非另外规定，所有的材料获自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)并按所收到的使用。所有中间物和最终产物的¹H NMR光谱与所公开的数据一致。

Pmti-1(5-[[3，4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3噻唑烷乙酸)的制备，如下。

操作改编自Orchard等人美国专利No.7,105,554中的。绕丹宁-3-乙酸(1g，5.20mmol，1eq.)、3，4-二苄氧基苯甲醛(2.04g，6.25mmol，1.2eq.)和醋酸钠(1.3g，15.6mmol，3eq.)在乙酸(30mL)中的溶液被加热到回流，搅拌过夜。随着反应混合物冷却到室温，产物被沉淀、过滤，并用乙酸、然后用石油醚洗涤。残余物溶于热DMSO中，过滤，通过添加水来沉淀。在冷却之时，沉淀物被过滤并从乙酸乙酯和石油醚中再结晶，来得到产物，产物被悬浮在水中并在真空中冻干过夜来得到蓬松黄色粉末的最终产物。

Pmti-2，2(5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸)的制备如下。

根据Orchard等在美国专利No.7,105,554中的指导合成这种产物。绕丹宁-3-乙酸(375mg，1.96mmol，1eq.)、3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)苯甲醛(680mg，1.96mmol、1eq.)和乙酸铵(453mg，3eq.)的溶液加热到70℃十分钟，然后冷却到室温并用乙酸乙酯(100mL)稀释。有机溶液用1M HCl(2×200mL)和盐水(200mL)洗涤，然后在硫酸钠上干燥并蒸发。使用填充了35-75μm C18(Alltech Associates，Deerfield，IL)的10×2.5cm玻璃柱的液相色谱纯化产物。采用梯度洗脱。缓冲液A是0.1％乙酸，缓冲液B是80％乙腈。梯度包括20％B三分钟、在40分钟内提高到75％B。流速是8mL/分钟。检测在280nm进行。合适的级分被合并，浓缩，并在真空中冻干来得到蓬松黄色粉末的产物。

Pmti-3，(5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸)，(Orchard et al.美国专利No.7,105,554)的制品在以下三个步骤中合成。

步骤1：(+)-(S)-2-乙酸基-1-溴-1-苯乙烷的产生。冷的HBr-乙酸在约五分钟内(12.4g，52.2mmol)滴加到(-)-(R)-1-苯乙烷-1，2-二醇(2.4g，17.4mmol)中，混合物在室温下搅拌40分钟。添加水(25mL)，用碳酸钠中和该溶液，用醚(3×30mL)提取。组合的提取物被干燥和蒸发来得到(+)-(S)-2-乙酸基-1-溴-1-苯乙烷(3.93mg，93％)，(d25 1.415g/mL，[x]₀24+93.5°(CCl₄中c 5.63)2.72(5H，s)，4.98(aH，dd，6.7和7.0Hz)和5.56(2H，d)。这个产物不被蒸馏。通过与1，2-双乙酸基-1-苯乙烷比较nmr光谱(没有PhCH*OAc共振)来确定同分异构均质性。(注意到，外消旋试剂被所列的光学异构体替代)。

步骤2：3-[(1-苯基-2-羟基)乙氧基]-4-(2-苯基乙氧基)-苯甲醛的生产。(2-乙酸基-1-溴乙基)苯(3.32g，13.67mmol，1.2eq)(步骤1的产物)搅拌下添加到3-羟基-4-(2-苯基乙氧基)-苯甲醛(2.76g，11.39mmol，1eq.)和碳酸铯(2.97g，9.11mmol，0.8eq.)在N，N-二甲基甲酰胺(15mL)中的溶液中。溶液在室温下搅拌19小时，然后在80℃搅拌21小时。通过在乙酸乙酯和水之间分配来开动反应(添加盐水来帮助破坏所形成的乳液)。再用水、盐水洗涤有机层两次，然后在硫酸钠上干燥并蒸发来得到深色油。残余物通过在硅胶上层析和用二乙基醚洗脱纯化来得到橙色油。这种油溶于甲醇(100ml)中，向该溶液添加氢氧化钠的水溶液(7mL，1M)。30分钟之后，混合物被蒸发(以除去甲醇)，在二氯甲烷和水之间分配残余物。有机层在硫酸钠上干燥并蒸发。残余物通过色谱法在硅胶上纯化，用石油醚∶二乙基醚(1∶2)洗脱，得到产物为米色的粉未。

步骤3：Pmti-3的产生。绕丹宁-3-乙酸(158mg，0.828mmol，1eq.)、3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)苯甲醛(300mg，0.828mmol，1eq.)(步骤2的产物)和乙酸铵(191mg，3eq)在甲苯(10mL)中的溶液加热到回流3.5小时，冷却到室温，用乙酸乙酯(50mL)稀释。有机溶液用1MHCl(2×200mL)和盐水(200mL)洗涤，然后在硫酸钠上干燥并蒸发。在处理之后，残余物通过层析在硅胶上纯化。使用乙酸乙酯洗脱得到黄色胶，其从二乙基醚和石油醚中再结晶来得到黄色粉末的产物。

实施例2

这个实施例显示了用编码kringle 1-3标记糖蛋白的表达载体转化并用Pmt抑制物处理的Pichia pastcris产生具有降低的O-糖基化的糖蛋白。

编码His标签的报告糖蛋白的质粒DNA被转化到野生型Pichiapastoris中来产生菌株yJC53，所述质粒DNA由处在Pichia pastoris醇氧化酶1(AOX1)启动子控制下的人类血纤蛋白溶解酶原结构域K1、K2和K3(Kringle 1-3蛋白质)构成。由结构域K1、K2、K3和K4构成的Kringle报告蛋白质已经在Duman et al.Biotechnol.Appl.Biochem.(1998)，v.28，p.39-45and only domain K3 in Choi et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(9)：5022-5027中讨论了。在该实施例中使用的Kringle 1-3蛋白质的氨基酸序列是

SECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHSRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDGGGHHHHHHHHH(SEQ ID NO：1).

Kringle 1-3蛋白在-1和+3含有符合声称的共有序列P的至少两个潜在的哺乳动物O-糖基化位点：O-糖基化的丝氨酸残基，在氨基酸序列“PPPSsgp”中是大写的，以及O-糖基化的苏氨酸残基，在氨基酸序列“lapTapp”中是大写的。在以上氨基酸序列中O-糖基化位点是下划线的。潜在的哺乳动物O-糖基化位点位于K1和K2结构域以及K2和K3结构域之间。然而，如在表1中所示，在酵母中，蛋白质具有约20个O-连接的糖基化位点。因而，没有通过此处的方法所示抑制O-连接的糖基化的情况下，O-连接的糖基化可能是在酵母中生产蛋白质的显著缺点。N-糖基化位点存在于K3结构域中，其通过用丝氨酸替换SEQ ID NO：1的位置208处的天冬酰胺来除去。因此，在Kringle 1-3蛋白质上仅有的聚糖将是O-糖基化的结果。

含有编码Kringle 1-3蛋白质的DNA的质粒使用正向引物K1-3/UP5′-CGGAA TTCTC AGAGT GCAAG ACTGG GAATA GAA-3′(SEQ IDNO：2)和反向引物K1-3/LP1(反向引物，3Gly+2His，与K1-3/UP配对)5′-ATGAT GATGA CCACC ACCGT CCTGG ACCAC AGGGGTTAG-3′(SEQ ID NO：3)制备来产生PCR产物，其然后使用反向引物K1-3/LP2(反向引物，3Gly+9His+终止密码子，与K1-3/UP配对)5′-TTAATGATGA TGATG ATGAT GATGA TGATG ACCAC CACC-3′(SEQ IDNO：4)PCR扩增。PCR条件如下：在作为变性步骤的95℃2分钟1个循环之后，PCR反应进行95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟的30个循环，然后72℃10分钟的1个循环。在PCR反应和PCR产物的柱纯化之后，PCR产物的核苷酸A突出物使用ExTaq来产生(72℃15分钟1个循环)。产生的PCR产物用于第二个PCR反应作为PCR模板，其中引物K1-3/UP和K1-3/LP2被用于扩增野生型Kringle 1-3+3Gly+9His，其被克隆到pCR2.1质粒载体(Invitrogen)中来产生pBK105。然后以下PCR引物用于产生Kringle 1-3蛋白质中位置208处的Asn到Ser突变来从氨基酸序列SRTP产生氨基酸序列NRTP：正向引物K3f(Asn到Ser)5’-ACCCCTCACACACATTCTAGGACACCAGAAAACTTC-3’(SEQ ID NO：5)和反向引物K3r 5’-CTGTGCACTCCAGTGCTGACAGGTGTG-3’(SEQ ID NO：6)。然后通过反向PCR在pBK105中产生Asn到Ser突变。PCR条件如下：在作为变性步骤的95℃2分钟1个循环之后，PCR反应进行95℃30秒、60℃30秒、72℃5分钟的30个循环，然后72℃10分钟的1个循环。连接产生的PCR产物来生产质粒pBK118，其被测序以确认突变。

质粒pBK118用EcoRI消化，DNA片段被凝胶纯化并克隆到pPICZaA(Invitrogen，La Jolla，CA)的EcoRI位点来产生pBK119(Pichia表达质粒)。质粒pPICZaA含有α-因子分泌信号，其容许大多数蛋白质从Pichia pastoris的有效的分泌；5′-AOX，含有AOX1启动子的942bp片段，其容许Pichia pastoris中可甲醇诱导的和高水平的表达；以及，ZEOCIN抗性基因，用于在E.coli和Pichia pastoris中的正选择。在转化到Pichia pastoris菌株中之前，质粒pBK119用PmeI线性化。质粒pBK被转化到Pichia pastoris菌株yJC53、野生型菌株和各种PMT敲除菌株中。

PMT敲除酵母菌株根据Gentzsch and Tanner，EMBO J.1996Nov1；15(21)：25752-5759中对于Saccharomyces cerevisiae所列的操作在Pichia pastoris中创建。Pichia pastoris PMT基因利用Saccharomycescerevisiae PMT基因的核苷酸序列通过同源性检索在获自IntegratedGenomics，Chicago，IL的Pichia pastoris基因组的核苷酸序列中鉴定。Pichia pastoris PMT(PpPMT)基因的删除如下。通过PCR重叠方法产生PpPMT删除等位基因(参见，例如Davidson et al.，2004，Glycobiology14：399-407；Ho et al.，1989，Gene 77：51-9；Horton et al.，1989，Gene77：61-8)。在第一PCR反应中，包含PMT基因的5′和3′侧翼区域和NAT或HYG抗性标记物(Goldstein and McCusker，1999，Yeast 14：1541-1553；Goldstein et al.，1999，Yeast 15：507-110)的核苷酸序列的DNA被PCR扩增。侧翼于PMT基因的区域的引物序列使用获自Integrated Genomics，Chicago，IL的Pichia pastoris基因组核苷酸序列作为指导来设计。Pichiapastoris基因组DNA被用作PpPMT侧翼区域PCR扩增的模板，而NAT和HYG片段使用(Goldstein，and McCusker，1999，ibid.；Goldstein et al.，1999，ibid.)中描述的质粒作为模板进行PCR扩增。然后，在第二PCR反应中，所有三种第一轮PCR产物被用作模板来产生含有所有三种片段的重叠产物作为单个的线性等位基因。然后直接采用最终的PCR产物用于转化。在含有200μg/mL匀霉素或100μg/mL诺尔丝菌素的YPD培养基上选择转化体。在每种情况下，通过PCR确认突变体等位基因的正确整合。创建的PMT敲除菌株是yJC51(pmt3Δ，pmt5Δ，pmt6Δ，)，yJC55(pmt1Δ)，yJC66(pmt2Δ)，和yJC65(pmt4Δ)。PMT敲除菌株各自用编码上述Kringle 1-3蛋白质的质粒pBK119转化。

转化的酵母菌株的Kringle 1-3蛋白质表达在摇瓶中在24℃使用缓冲的甘油-复合物培养基(BMGY)进行，所述培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM硫酸钾缓冲液pH 6.0、1.34％酵母氮源、4×10^-5％生物素和1％甘油组成。用于蛋白质表达的诱导培养基是缓冲的甲醇-复合物培养基(BMMY)，其由BMGY中1％甲醇代替甘油组成。甲醇中的Pmt抑制物Pmti-1、Pmit-2或Pmti-3添加到生长培养基中到达0.2μM、2μM或20μM的终浓度，此时添加诱导培养基。收获细胞，在2,000rpm离心五分钟。Pmt抑制物Pmti-1、Pmti-2和Pmti-3是基本上可互换的，在使用的容易度上具有很小的变化。例如，在所描述的细胞培养条件下，Pmti-3的溶解度大于Pmti-1和Pmti-2，因而是三者中最期望的。

来自用Pmti-1处理的yJC53培养物或yJC55的7μL上清液根据Laemmli，U.K.(1970)Nature 227，680-685通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后在硝化纤维膜(Schleicher & Schuell(现在Whatman，Inc.，Florham Park，NJ)上电印迹。Kringle 1-3蛋白质使用来自Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz，CA)的抗His抗体(H-15)在Western印迹上检测，使用ImmuunoPure Metal Enhanced DAB SubstrateKit(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)显色。如在附图1所示的Western印迹的泳道1所示，来自未处理的Pichia pastoris的Kringle 1-3蛋白质由于O-糖基化的存在跑动为弥散。然而，相比之下，来自yJC53的Kringle1-3蛋白质(用2或20μM Pmti-1处理的Pichia pastoris，分别为泳道2和3)由于缺乏O-糖基化展现了不同的条带，类似于从yJC55表达的Kringle 1-3(Pichia pastoris的pmt1Δ敲除突变体)(泳道4和5)。附图1进一步显示了Pmti-1降低的O-糖基化达到缺乏Pmt1的菌株中所观察到的类似水平。

为了测量Pmt抑制物的O-糖基化降低，使用镍螯合层析从生长培养基纯化Kringle 1-3蛋白质(Choi et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(9)：5022-5027)，通过碱消除(β-消除)(Harvey，1999 MassSpectrometry Reviews 18，349-451)从Krinngle 1-3蛋白质释放和分离O-聚糖。这种处理也降低了对甘露醇释放的O-聚糖(寡甘露糖或甘露糖)的新形成的还原末端。甘露醇基团因而充当了每个O-聚糖的独特的指示物。在100μL体积PBS缓冲液中含有的0.5nmole或更多的Kringle 1-3蛋白质是β消除所需的。样品用25μL碱性氢硼化物试剂处理，在50℃孵育16小时。添加约20μL阿拉伯醇内标准，随后添加10μL冰醋酸。样品然后离心穿过含有SEPABEADS和AG 50W-X8树脂并用水冲洗的Millipore过滤器。样品，包括洗出物，转移到塑料自动进样器小瓶中，在离心蒸发器中蒸发到干燥。150μl 1％AcOH/MeOH添加到样品中，样品在离心蒸发器中蒸发到干燥。这个最后的步骤再重复五次。添加200μL水，通过高pH阴离子交换层析伴随着脉冲电化学检测-DionexHPLC(HPAEC-PAD)来分析100μL样品。根据回收的甘露醇的数量测量平均O-聚糖占用。结果在表1中概述，其显示了在含有完整PMT1和PMT2基因的Pichia pastoris菌株中任一种Pmt化学抑制物将分泌的Kringle 1-3蛋白质的O-连接的糖基化降低到一定水平，所述水平与含有PMT1或PMT2基因的删除的细胞所见的O-连接的糖基化的水平是可比较的。表1还显示了虽然该蛋白质具有两个潜在的哺乳动物O-连接的糖基化位点，在酵母中该蛋白质保持了约20个O-连接的糖基化位点。

表1

实施例3

在这个实施例中，用编码T.reesei α-甘露糖苷酶的DNA转化的酵母细胞引起了具有降低的O-糖基化的蛋白质的产生，当细胞还在存在Pmt抑制物的情况下孵育时O-糖基化被进一步降低。

抗Her2单克隆抗体的H+L链在Pichia pastoris菌株GS115(WT)和遗传工程化以共表达T.reeseiα-甘露糖苷酶(+Trman)的GS 115中表达。GS115可从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得，除了HIS4突变以允许his4选择之外，具有基本上野生型的表型。H+L链作为来自质粒pJC284的两个独立的基因来表达，质粒pJC284来源于Invitrogen质粒pAO815。

H+L基因使用获自GenBank的抗Her2抗体序列产生。L链的GenBank登记号码是1N8Z A，H链可变区加CHI结构域的GenBank登记号码是1N8Z B。H链Fc区域的GenBank登记号码是BC092518。H和L链DNA序列都根据Pichia pastoris密码子利用率进行密码子优化以提高在Pichia pastoris中的翻译。在Pichia sp.中使用的密码子的优化是本领域公知的，已经在例如Outchkourove et al.，2002，Protein Expr.Purif.24：18-24；Sharp and Li，1987，Nucleic Acids Res.15：1281-95；Woo JH，Liuet al.，2002，Protein Expression and Purification 25：270-282和Nakamura，et al.，2000，Nucleic Acids Res.28：292中描述。H链(人类IgG1)和L链(人类Kappa)的恒定区由GeneArt Inc.，Regensburg，Germany合成。可变区利用购自IDT Inc.(Coralville，IA)的寡核苷酸以叠盖PCR方法自己制造。全长H和L链通过重叠PCR合成，产生的H和L链克隆到pCR2.1TOPO载体(Invitrogen，La Jolla，CA)中来分别产生pDX344和pDX349。来自pDX344和pDX349的H+L链与GAPDH启动子和AOX1终止子序列组合在载体pDX580(主干来自Invitrogen载体pGAPZA)中。最后，H+L链表达盒从pDX580亚克隆到载体pJC284中。编码轻链的密码子优化的DNA的核苷酸序列在SEQ ID NO：7中示出，编码重链的密码子优化的DNA的核苷酸序列在SEQ ID NO：8中示出。质粒pJC284具有GAPDH启动子，用于表达H+L基因，和完整的his4基因，用于在菌株GS 115和GS115(+Trman)中选择转化体。酵母菌株GS115和GS115(+Trman)用pJC285转化，具有在his4基因座整合到基因组中的质粒的转化体被分离来产生生产抗Her2抗体的菌株。

菌株GS115(+Trman)的构建如下。Trichoderma reesei α-1，2-甘露糖苷酶从质粒pJC285中的表达盒表达。质粒pJC285衍生自Invitrogen载体pGAPZA，其具有Zeocin抗性基因作为可选择标记，含有包含DNA的表达盒，所述DNA编码T.reesei α-1，2-甘露糖苷酶催化结构域(SEQ IDNO：9)，编码其信号序列的前84个碱基对被编码Saccharomycescerevisiea αMAT前信号序列的DNA(SEQ ID NO：10)替换，其仅编码ER靶向氨基酸，所述DNA在5′末端与包含Pichia pastoris GAPH启动子(SEQ ID NO：11)的DNA、在3′末端与包含Pichia pastoris AOX1转录终止序列(SEQ ID NO：12)的DNA可操作地连接。完整表达盒的核苷酸序列在SEQ ID NO：13中列出。酵母菌株GS 115用pJC285转化，具有在GAPDH基因座整合到基因组中的质粒的转化体被分离来产生菌株GS 115(+Trman)。

菌株的双份培养物在200mL缓冲的葡萄糖-复合物培养基(BMDY)中培养，所述培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM硫酸钾pH6.0、1.34％酵母氮源、.00004％生物素、2％葡萄糖以及有或没有0.3或0.03μM的Pmti-2组成。在生长72小时之后，收集培养物上清液，离心除去酵母细胞。在剩余的上清液(约200mL)级分中的抗体在蛋白A柱上纯化，并经历如实施例2所描述的O-聚糖分析。除了甘露醇分析之外，O-连接的甘露糖链的平均长度通过色谱分析在没有水解作用的情况下测量。结果在表2中概述。

在抗体上存在14个酵母O-聚糖位点。当在野生型GS 115菌株中产生抗体时，所有14个O-聚糖位点都具有聚糖结构，8％的位点仅有一个甘露糖，39％具有二甘露糖链，43％具有三甘露糖链，9％具有四甘露糖链(参见表2)。然而，当抗体在用化学抑制物Pmti-2处理的野生型细胞中生产时，14个O-聚糖位点的仅两个被占据，对于这两个位点中的76％，甘露糖链仅有一个甘露糖残基。两个位点中都没有三或四甘露糖残基的甘露糖链。要注意的是，该分析不能确定14个位点的哪两个被占据。每个抗体分子的两个O-聚糖位点的任何组合被占据，或者特定的O-聚糖位点被优先地占据。在后者的情况中，为了提供完全缺少O-聚糖的抗体(或其他蛋白质)，包含优选的O-聚糖位点的氨基酸序列可以被修饰成消除了所述位点的O-连接的糖基化的氨基酸序列。

表2进一步显示了当在包括编码Tricoderma reeseiα-1，2-甘露糖苷酶的DNA的细胞(菌株GS115(+Trman))中产生抗体时，14个O-聚糖位点的仅四个被占据，对于这四个位点的95％，甘露糖链仅有一个甘露糖残基。四个位点都没有三或四甘露糖残基的甘露糖链。如果特定的位点被优先地O-糖基化，为了提供完全缺少O-聚糖的抗体(或其他蛋白质)，包含优选的O-聚糖位点的氨基酸序列可以被修饰成消除了这些位点处的O-糖基化的氨基酸序列。

最后，表2显示了当抗体在包括编码Tricoderma reesei α-1，2-甘露糖苷酶的DNA的细胞中、在存在Pmti-2的情况下产生时，14个O-聚糖位点的仅一个被占据，对于91％的该位点，甘露糖链仅具有一个甘露糖残基。没有甘露糖链具有三或四甘露糖残基。如果仅有一个或仅有少数位点被优先地O-糖基化，为了提供完全没有O-聚糖的抗体(或其他蛋白质)，包含所述优选的O-聚糖位点的氨基酸序列可以被修饰成在该位点消除了O-糖基化的氨基酸序列。

表2进一步显示了0.3μM的Pmti抑制物足够降低占用约86％，76％的分子的链长度为一个甘露糖，同时容许培养物生长。包括入Tricodermareesei α-1，2-甘露糖苷酶容许Pmti抑制物的数量降低10倍，占用(occupancy)降低到93％，87％的分子的链长度为一个甘露糖。这些结果显示，使用不杀死细胞的数量的Pmti抑制物足够产生具有降低的O-连接的糖基化的糖蛋白。这些结果进一步显示，Pmti抑制物和α-甘露糖苷酶看来似乎协同地降低O-连接的糖基化的数量。

表2

菌株	占用	Man1	Man2	Man3	Man4
						GS115	14	8	39	43	9
GS115+0.3μM Pmti-2	2	76	24	0	0
						GS115(+Trman)	4	95	5	0	0
GS115(+Trman)+0.3μM Pmti-2	1	91	9	0	0
						GS115(+Trman)+0.03μM Pmti-2	1	87	13	0	0

上述每一种的7μL上清液被还原并经历SDS-PAGE和Western印迹，使用HRP结合的抗人类IgG(H & L)来检测H和L链。结果在附图2中示出。超O-糖基化的H链是附图2中第一对泳道中可见的迁移最慢的条带。附图2显示了当抗体与Tricoderma reesei α-1，2-甘露糖苷酶共表达时、或表达抗体的细胞在存在Pmti-2抑制物的情况下孵育时、或当抗体与Tricoderma reesei α-1，2-甘露糖苷酶共表达并且表达两种蛋白质的细胞在存在Pmti-2抑制物的情况下孵育时，存在着O-糖基化的重链数量的降低。

虽然在此参考说明性实施方式描述了本发明，要理解的是本发明不限于此。具有本领域的普通技术并且接受此处的教导的人员将认识到其他修改和实施方式处于其范围内。因而，本发明仅由此处附随的权利要求限制。

序列表

<110>GlycoFi，Inc.

Bobrowiza，Piotr

Cook，James W.

Kett，Warren

<120>具有降低的O-糖基化的糖蛋白的产生

<130>PCT GF0005Y

<150>60/737,108

<151>2005-11-15

<160>13

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>288

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Kringle 1-3蛋白

<400>1

Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser

1 5 10 15

Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro

20 25 30

His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys

50 55 60

Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu

65 70 75 80

Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys

85 90 95

Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln

100 105 110

Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn

115 120 125

Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp

130 135 140

Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro

145 150 155 160

Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu

165 170 175

Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val Ser

180 185 190

Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His Ser

195 200 205

Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys

210 215 220

Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser

225 230 235 240

Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro

245 250 255

Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro

260 265 270

Val Val Gln Asp Gly Gly Gly His His His His His His His His His

275 280 285

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物K1-3/UP

<400>2

cggaattctc agagtgcaag actgggaata gaa 33

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物K1-3/LP1

<400>3

atgatgatga ccaccaccgt cctggaccac aggggttag 39

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物K1-3/LP2

<400>4

ttaatgatga tgatgatgat gatgatgatg accaccacc 39

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物K3f(Asn到Ser)

<400>5

acccctcaca cacattctag gacaccagaa aacttc 36

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物K3r

<400>6

ctgtgcactc cagtgctgac aggtgtg 27

<210>7

<211>645

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码轻链的密码子优化序列

<400>7

gacattcaga tgacacagtc tccatcttct ttgtccgctt ccgtcggtga tagagttact 60

atcacctgta gagcttccca agacgtcaac accgctgtcg cctggtacca acagaagcca 120

ggtaaggctc caaaactttt gatctactct gcctctttct tgtactccgg tgttccatcc 180

agattttctg gttctagatc cggtaccgac ttcaccttga ccatctcttc cttgcaacca 240

gaagacttcg ctacctacta ctgtcaacaa cactacacta ctcctccaac tttcggtcaa 300

ggaactaagg ttgagattaa gagaactgtt gctgctccat ccgttttcat tttcccacca 360

tccgacgaac aattgaagtc tggtacagct tccgttgttt gtttgttgaa caacttctac 420

ccaagagagg ctaaggttca gtggaaggtt gacaacgctt tgcaatccgg taactcccaa 480

gaatccgtta ctgagcagga ttctaaggat tccacttact ccttgtcctc cactttgact 540

ttgtccaagg ctgattacga gaagcacaag gtttacgcat gcgaggttac acatcagggt 600

ttgtcctccc cagttactaa gtccttcaac agaggagagt gttaa 645

<210>8

<211>1353

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码重链的密码子优化序列

<400>8

gaggtccaat tggttgaatc tggtggaggt ttggtccaac caggtggatc tctgagactt 60

tcttgtgctg cctctggttt caacattaag gatacttaca tccactgggt tagacaggct 120

ccaggtaagg gtttggagtg ggttgctaga atctacccaa ccaacggtta caccagatac 180

gctgattccg ttaagggtag attcaccatt tccgctgaca cttccaagaa cactgcttac 240

ttgcaaatga actctttgag agctgaggac actgccgtct actactgttc cagatggggt 300

ggtgacggtt tctacgccat ggactactgg ggtcaaggta ccttggttac tgtctcttcc 360

gcttctacta agggaccatc cgtttttcca ttggctccat cctctaagtc tacttccggt 420

ggtactgctg ctttgggatg tttggttaag gactacttcc cagagcctgt tactgtttct 480

tggaactccg gtgctttgac ttctggtgtt cacactttcc cagctgtttt gcaatcttcc 540

ggtttgtact ccttgtcctc cgttgttact gttccatcct cttccttggg tactcagact 600

tacatctgta acgttaacca caagccatcc aacactaagg ttgacaagaa ggttgagcca 660

aagtcctgtg acaagacaca tacttgtcca ccatgtccag ctccagaatt gttgggtggt 720

ccatccgttt tcttgttccc accaaagcca aaggacactt tgatgatctc cagaactcca 780

gaggttacat gtgttgttgt tgacgtttct cacgaggacc cagaggttaa gttcaactgg 840

tacgttgacg gtgttgaagt tcacaacgct aagactaagc caagagagga gcagtacaac 900

tccacttaca gagttgtttc cgttttgact gttttgcacc aggattggtt gaacggaaag 960

gagtacaagt gtaaggtttc caacaaggct ttgccagctc caatcgaaaa gactatctcc 1020

aaggctaagg gtcaaccaag agagccacag gtttacactt tgccaccatc cagagatgag 1080

ttgactaaga accaggtttc cttgacttgt ttggttaaag gattctaccc atccgacatt 1140

gctgttgagt gggaatctaa cggtcaacca gagaacaact acaagactac tccaccagtt 1200

ttggattctg acggttcctt cttcttgtac tccaagttga ctgttgacaa gtccagatgg 1260

caacagggta acgttttctc ctgttccgtt atgcatgagg ctttgcacaa ccactacact 1320

caaaagtcct tgtctttgtc cccaggtaag taa 1353

<210>9

<211>500

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Pichia pastoris GAPDH启动子

<400>9

agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60

atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120

cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180

gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240

aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300

ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360

gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420

ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480

tatttcgaaa cgagggaatt 500

<210>10

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Saccharomyces cerevisiea alpha-MAT前信号序列

<400>10

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagct 57

<210>11

<211>1494

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Tricoderma reesei alph-1，2-甘露糖苷酶催化结构域

<400>11

cgcgccggat ctcccaaccc tacgagggcg gcagcagtca aggccgcatt ccagacgtcg 60

tggaacgctt accaccattt tgcctttccc catgacgacc tccacccggt cagcaacagc 120

tttgatgatg agagaaacgg ctggggctcg tcggcaatcg atggcttgga cacggctatc 180

ctcatggggg atgccgacat tgtgaacacg atccttcagt atgtaccgca gatcaacttc 240

accacgactg cggttgccaa ccaaggcatc tccgtgttcg agaccaacat tcggtacctc 300

ggtggcctgc tttctgccta tgacctgttg cgaggtcctt tcagctcctt ggcgacaaac 360

cagaccctgg taaacagcct tctgaggcag gctcaaacac tggccaacgg cctcaaggtt 420

gcgttcacca ctcccagcgg tgtcccggac cctaccgtct tcttcaaccc tactgtccgg 480

agaagtggtg catctagcaa caacgtcgct gaaattggaa gcctggtgct cgagtggaca 540

cggttgagcg acctgacggg aaacccgcag tatgcccagc ttgcgcagaa gggcgagtcg 600

tatctcctga atccaaaggg aagcccggag gcatggcctg gcctgattgg aacgtttgtc 660

agcacgagca acggtacctt tcaggatagc agcggcagct ggtccggcct catggacagc 720

ttctacgagt acctgatcaa gatgtacctg tacgacccgg ttgcgtttgc acactacaag 780

gatcgctggg tccttgctgc cgactcgacc attgcgcatc tcgcctctca cccgtcgacg 840

cgcaaggact tgaccttttt gtcttcgtac aacggacagt ctacgtcgcc aaactcagga 900

catttggcca gttttgccgg tggcaacttc atcttgggag gcattctcct gaacgagcaa 960

aagtacattg actttggaat caagcttgcc agctcgtact ttgccacgta caaccagacg 1020

gcttctggaa tcggccccga aggcttcgcg tgggtggaca gcgtgacggg cgccggcggc 1080

tcgccgccct cgtcccagtc cgggttctac tcgtcggcag gattctgggt gacggcaccg 1140

tattacatcc tgcggccgga gacgctggag agcttgtact acgcataccg cgtcacgggc 1200

gactccaagt ggcaggacct ggcgtgggaa gcgttcagtg ccattgagga cgcatgccgc 1260

gccggcagcg cgtactcgtc catcaacgac gtgacgcagg ccaacggcgg gggtgcctct 1320

gacgatatgg agagcttctg gtttgccgag gcgctcaagt atgcgtacct gatctttgcg 1380

gaggagtcgg atgtgcaggt gcaggccaac ggcgggaaca aatttgtctt taacacggag 1440

gcgcacccct ttagcatccg ttcatcatca cgacggggcg gccaccttgc ttaa 1494

<210>12

<211>486

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Pichia pastoris AOX1转录终止序列

<400>12

aagggcgaat tcaattcacg tggcccagcc ggccgtctcg gatcggtacc tcgagccgcg 60

gcggccgcca gcttgggccc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg 120

tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt tagccttaga catgactgtt cctcagttca 180

agttgggcac ttacgagaag accggtcttg ctagattcta atcaagagga tgtcagaatg 240

ccatttgcct gagagatgca ggcttcattt ttgatacttt tttatttgta acctatatag 300

tataggattt tttttgtcat tttgtttctt ctcgtacgag cttgctcctg atcagcctat 360

ctcgcagctg atgaatatct tgtggtaggg gtttgggaaa atcattcgag tttgatgttt 420

ttcttggtat ttcccactcc tcttcagagt acagaagatt aagtgagacc ttcgtttgtg 480

cggatc 486

<210>13

<211>2550

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Tricoderma reesei alpha-1，2-甘露糖苷酶表达盒

<221>启动子

<222>(1)...(507)

<223>GAPDH启动子序列

<221>sig_peptide

<222>(508)...(564)

<223>编码Saccharomyces cerevisiea alpha-MAT前信号序列

<221>CDS

<222>(565)...(2058)

<223>编码Tricoderma reesei alpha-1，2-甘露糖苷酶催化结构域

<221>终止子

<222>(2065)...(2550)

<223>Pichia pastoris AOX1转录终止序列

<400>13

agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60

atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120

cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180

gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240

aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300

ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360

gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420

ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480

tatttcgaaa cgagggaatt cgaaacg atg aga ttt cct tca att ttt act gct 534

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala

-15

gtt tta ttc gca gca tcc tcc gca tta gct cgc gcc gga tct ccc aac 582

Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Arg Ala Gly Ser Pro Asn

-10 -5 1 5

cct acg agg gcg gca gca gtc aag gcc gca ttc cag acg tcg tgg aac 630

Pro Thr Arg Ala Ala Ala Val Lys Ala Ala Phe Gln Thr Ser Trp Asn

10 15 20

gct tac cac cat ttt gcc ttt ccc cat gac gac ctc cac ccg gtc agc 678

Ala Tyr His His Phe Ala Phe Pro His Asp Asp Leu His Pro Val Ser

25 30 35

aac agc ttt gat gat gag aga aac ggc tgg ggc tcg tcg gca atc gat 726

Asn Ser Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Gly Ser Ser Ala Ile Asp

40 45 50

ggc ttg gac acg gct atc ctc atg ggg gat gcc gac att gtg aac acg 774

Gly Leu Asp Thr Ala Ile Leu Met Gly Asp Ala Asp Ile Val Asn Thr

55 60 65 70

atc ctt cag tat gta ccg cag atc aac ttc acc acg act gcg gtt gcc 822

Ile Leu Gln Tyr Val Pro Gln Ile Asn Phe Thr Thr Thr Ala Val Ala

75 80 85

aac caa ggc atc tcc gtg ttc gag acc aac att cgg tac ctc ggt ggc 870

Asn Gln Gly Ile Ser Val Phe Glu Thr Asn Ile Arg Tyr Leu Gly Gly

90 95 100

ctg ctt tct gcc tat gac ctg ttg cga ggt cct ttc agc tcc ttg gcg 918

Leu Leu Ser Ala Tyr Asp Leu Leu Arg Gly Pro Phe Ser Ser Leu Ala

105 110 115

aca aac cag acc ctg gta aac agc ctt ctg agg cag gct caa aca ctg 966

Thr Asn Gln Thr Leu Val Asn Ser Leu Leu Arg Gln Ala Gln Thr Leu

120 125 130

gcc aac ggc ctc aag gtt gcg ttc acc act ccc agc ggt gtc ccg gac 1014

Ala Asn Gly Leu Lys Val Ala Phe Thr Thr Pro Ser Gly Val Pro Asp

135 140 145 150

cct acc gtc ttc ttc aac cct act gtc cgg aga agt ggt gca tct agc 1062

Pro Thr Val Phe Phe Asn Pro Thr Val Arg Arg Ser Gly Ala Ser Ser

155 160 165

aac aac gtc gct gaa att gga agc ctg gtg ctc gag tgg aca cgg ttg 1110

Asn Asn Val Ala Glu Ile Gly Ser Leu Val Leu Glu Trp Thr Arg Leu

170 175 180

agc gac ctg acg gga aac ccg cag tat gcc cag ctt gcg cag aag ggc 1158

Ser Asp Leu Thr Gly Asn Pro Gln Tyr Ala Gln Leu Ala Gln Lys Gly

185 190 195

gag tcg tat ctc ctg aat cca aag gga agc ccg gag gca tgg cct ggc 1206

Glu Ser Tyr Leu Leu Asn Pro Lys Gly Ser Pro Glu Ala Trp Pro Gly

200 205 210

ctg att gga acg ttt gtc agc acg agc aac ggt acc ttt cag gat agc 1254

Leu Ile Gly Thr Phe Val Ser Thr Ser Asn Gly Thr Phe Gln Asp Ser

215 220 225 230

agc ggc agc tgg tcc ggc ctc atg gac agc ttc tac gag tac ctg atc 1302

Ser Gly Ser Trp Ser Gly Leu Met Asp Ser Phe Tyr Glu Tyr Leu Ile

235 240 245

aag atg tac ctg tac gac ccg gtt gcg ttt gca cac tac aag gat cgc 1350

Lys Met Tyr Leu Tyr Asp Pro Val Ala Phe Ala His Tyr Lys Asp Arg

250 255 260

tgg gtc ctt gct gcc gac tcg acc att gcg cat ctc gcc tct cac ccg 1398

Trp Val Leu Ala Ala Asp Ser Thr Ile Ala His Leu Ala Ser His Pro

265 270 275

tcg acg cgc aag gac ttg acc ttt ttg tct tcg tac aac gga cag tct 1446

Ser Thr Arg Lys Asp Leu Thr Phe Leu Ser Ser Tyr Asn Gly Gln Ser

280 285 290

acg tcg cca aac tca gga cat ttg gcc agt ttt gcc ggt ggc aac ttc 1494

Thr Ser Pro Asn Ser Gly His Leu Ala Ser Phe Ala Gly Gly Asn Phe

295 300 305 310

atc ttg gga ggc att ctc ctg aac gag caa aag tac att gac ttt gga 1542

Ile Leu Gly Gly Ile Leu Leu Asn Glu Gln Lys Tyr Ile Asp Phe Gly

315 320 325

atc aag ctt gcc agc tcg tac ttt gcc acg tac aac cag acg gct tct 1590

Ile Lys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe Ala Thr Tyr Asn Gln Thr Ala Ser

330 335 340

gga atc ggc ccc gaa ggc ttc gcg tgg gtg gac agc gtg acg ggc gcc 1638

Gly Ile Gly Pro Glu Gly Phe Ala Trp Val Asp Ser Val Thr Gly Ala

345 350 355

ggc ggc tcg ccg ccc tcg tcc cag tcc ggg ttc tac tcg tcg gca gga 1686

Gly Gly Ser Pro Pro Ser Ser Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Ser Ala Gly

360 365 370

ttc tgg gtg acg gca ccg tat tac atc ctg cgg ccg gag acg ctg gag 1734

Phe Trp Val Thr Ala Pro Tyr Tyr Ile Leu Arg Pro Glu Thr Leu Glu

375 380 385 390

agc ttg tac tac gca tac cgc gtc acg ggc gac tcc aag tgg cag gac 1782

Ser Leu Tyr Tyr Ala Tyr Arg Val Thr Gly Asp Ser Lys Trp Gln Asp

395 400 405

ctg gcg tgg gaa gcg ttc agt gcc att gag gac gca tgc cgc gcc ggc 1830

Leu Ala Trp Glu Ala Phe Ser Ala Ile Glu Asp Ala Cys Arg Ala Gly

410 415 420

agc gcg tac tcg tcc atc aac gac gtg acg cag gcc aac ggc ggg ggt 1878

Ser Ala Tyr Ser Ser Ile Asn Asp Val Thr Gln Ala Asn Gly Gly Gly

425 430 435

gcc tct gac gat atg gag agc ttc tgg ttt gcc gag gcg ctc aag tat 1926

Ala Ser Asp Asp Met Glu Ser Phe Trp Phe Ala Glu Ala Leu Lys Tyr

440 445 450

gcg tac ctg atc ttt gcg gag gag tcg gat gtg cag gtg cag gcc aac 1974

Ala Tyr Leu Ile Phe Ala Glu Glu Ser Asp Val Gln Val Gln Ala Asn

455 460 465 470

ggc ggg aac aaa ttt gtc ttt aac acg gag gcg cac ccc ttt agc atc 2022

Gly Gly Asn Lys Phe Val Phe Asn Thr Glu Ala His Pro Phe Ser Ile

475 480 485

cgt tca tca tca cga cgg ggc ggc cac ctt gct taa ttaaggaagg 2068

Arg Ser Ser Ser Arg Arg Gly Gly His Leu Ala *

490 495

gcgaattcaa ttcacgtggc ccagccggcc gtctcggatc ggtacctcga gccgcggcgg 2128

ccgccagctt gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata gcgccgtcga 2188

ccatcatcat catcatcatt gagttttagc cttagacatg actgttcctc agttcaagtt 2248

gggcacttac gagaagaccg gtcttgctag attctaatca agaggatgtc agaatgccat 2308

ttgcctgaga gatgcaggct tcatttttga tactttttta tttgtaacct atatagtata 2368

ggattttttt tgtcattttg tttcttctcg tacgagcttg ctcctgatca gcctatctcg 2428

cagctgatga atatcttgtg gtaggggttt gggaaaatca ttcgagtttg atgtttttct 2488

tggtatttcc cactcctctt cagagtacag aagattaagt gagaccttcg tttgtgcgga 2548

tc 2550

Claims

1.一种生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括：

(a) 提供与可诱导启动子可操作地连接的、编码蛋白质的核酸；

(b) 将所述核酸导入酵母宿主细胞或丝状真菌宿主细胞中来提供所述宿主细胞的培养物；

(c) 所述培养物生长足够的时间以提供大量的具有所述核酸的所述宿主细胞，之后用Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物；和

(d) 所述培养物与所述启动子的诱导物接触来诱导所述蛋白质的表达一定时间，之后或同时用所述Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物，

(e) 分离在存在所述一种或多种抑制物的情况下所述宿主细胞产生的糖蛋白来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种抑制物是苯亚甲基噻唑烷二酮。

3.权利要求2的方法，其中所述一种或多种抑制物选自由5-[[3,4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸构成的组。

4.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是Pichia pastoris或Saccharomyces cerevisiae。

5.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞已经被遗传修饰来产生具有主要N-聚糖糖形式的糖蛋白，所述主要N-聚糖糖形式的糖蛋白选自Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂。

6.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞已经被遗传修饰来产生糖蛋白，在所述糖蛋白中N-糖基化模式是像人类的或人源化的。

7.权利要求1的方法，其中以至少100 mg/升培养基的产量生产所述糖蛋白。

8.一种生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括：

(a) 提供与可诱导启动子可操作连接的、编码蛋白质的核酸；

(b) 将所述核酸导入酵母宿主细胞或丝状真菌宿主细胞中，并使含有所述核酸的宿主细胞来产生所述宿主细胞的培养物生长足够的时间以提供大量的具有所述核酸的所述宿主细胞，之后用所述Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物；

(c) 用Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物和任选地一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶接触所述培养物；以及

(d) 分离在存在所述一种或多种抑制物和所述一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的情况下所述宿主细胞产生的糖蛋白来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

9.权利要求8的方法，其中所述培养物在存在Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物的情况下生长。

10.权利要求8的方法，其中所述培养物在存在一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的情况下生长。

11.权利要求8的方法，其中提供编码所述一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的第二核酸并将所述第二核酸导入所述宿主细胞中。

12.权利要求8的方法，其中提供与可诱导启动子可操作连接的、编码所述一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的第二核酸并将所述第二核酸导入所述宿主细胞中。

13.权利要求12的方法，其中所述培养物生长足够的时间以提供大量的所述宿主细胞，之后诱导所述蛋白质和所述一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的表达来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

14. 权利要求12的方法，其中所述蛋白质的表达被诱导一定时间，之后诱导所述一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的表达来产生所述具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

15. 权利要求8的方法，其中所述一种或多种抑制物是苯亚甲基噻唑烷二酮。

16.权利要求8的方法，其中所述一种或多种抑制物选自由5-[[3,4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸构成的组。

17.权利要求8的方法，其中所述α-1,2-甘露糖苷酶来自Trichoderma reesei、Saccharomycessp.或Aspergillussp。

18.权利要求8的方法，其中所述α-1,2-甘露糖苷酶来自Trichoderma reesei。

19.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞包括与可诱导启动子可操作连接的第二核酸，其编码α-1,2-甘露糖苷酶。

20.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞选自由K. lactis、Pichia pastoris、Pichia methanolica和Hansenula构成的组。

21.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞是Pichia pastoris或Saccharomyces cerevisiae。

22.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞已经被遗传修饰来产生具有主要N-聚糖糖形式的糖蛋白，所述主要N-聚糖糖形式的糖蛋白选自Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂。

23.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞已经被遗传修饰来产生糖蛋白，在所述糖蛋白中N-糖基化模式是像人类的或人源化的。