TWI537385B - 產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法 - Google Patents

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Description

產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法
本發明係與病毒相關，且特別是與製備具有簡單聚醣之病毒顆粒有關。具體而言，本發明係關於具有簡單醣基化之流感病毒顆粒的製備。特定地，本發明係關於製備單醣基化流感病毒顆粒之方法。
交互參考之相關申請案
本案係主張於2010年11月4日申請之美國臨時申請案第61/410,257號之優先權，其名稱為「製備單醣基化流感病毒血球凝集素之方法」，其係以全文併入本文中作為參考文獻。
本發明於此揭露單醣化流感病毒之製備方式做為一示例。吾人可推想的是，該相同之方法亦可被用以製備其他帶有簡單聚醣結構之病毒，包含反轉錄病毒，如：人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus，HIV)及黃病毒科，如：登革病毒、西尼羅病毒(West Nile virus)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)等。
流行性感冒係由正黏液病毒科家族之RNA病毒所造成。該等病毒可分為三類型，且該三類型造成三種不同類型之流行性感冒：A、B及C型。A型流感病毒感染哺乳類動物(人類、豬、貂、馬)及鳥類。此病毒對人類而言極為重要，係因此類型之病毒曾造成世界性的大流行。B型流感病毒(亦常簡稱為B型流感)僅會感染人類。此病毒偶而會造成地區性爆發的流行感冒。C型流感病毒亦僅會感染人類。此病毒大多感染年幼者且很少造成嚴重的身體不適。
A型流感病毒感染許多不同之哺乳類動物，包含人類、馬、豬、貂及鳥類。其中人類病原菌係與地區性流行及世界大流行有關連。至少包含15種已知的血球凝集素(H，hemagglutinin)血清型及9種已知的神經氨酸酶(N，neuraminidase)血清型。豬及鳥類被認為是特別重要之帶原容器，因其會產生一群基因性及抗原性變異的病毒，該病毒可藉由人類及動物之間近距離接觸後回傳給人類。B型流感病毒則僅會感染人類且造成疾病，但通常不會像A型如此嚴重。不同於A型病毒，B型流感病毒不具有可區分性的血清型。C型流感病毒亦僅會感染哺乳動物，但極少造成疾病。此種C型流感病毒於基因上及型態上與A及B型不同。
流感病毒有4種抗原，血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、核殼體(NA)、基質蛋白(M，matrix)及核鞘蛋白(NP，nucleocapsid proteins)。NP為一種類型專一的抗原，其存在於A、B、及C三種型態之流感病毒中，該NP提供了人類流感病毒分類上之依據。基質蛋白(M蛋白)環繞於核殼體周遭，且該基質蛋白組成了顆粒質量之35-45%。兩個表面醣蛋白於表面呈現像是桿狀凸起物。血球凝集素(HA)一開始合成為三聚體的前驅物(HA0)，該前驅物包含三個相同之蛋白鏈，每一條蛋白鏈可被蛋白性分解為兩個次單位，HA1及HA2，該兩個次單位係藉由單一雙硫鍵共價鍵結在一起。HA係用以調節病毒與細胞受器間之貼附。於病毒封套中，神經氨酸酶(NA)分子的數量是相較較少的。該些循環不絕之人類病毒株之所以惡名昭彰，是因為該等病毒株傾向於累積每年之突變以造成再發性之地區性流行。
於真核生物，醣基常與四種不同之胺基酸基連結。該等胺基酸基被分類為O-連結的(絲氨酸、蘇胺酸、及羥離胺酸)及N-連結的(天門冬醯胺酸)。該等O-連結的醣類係於高基氏體或粗糙內質網(ER，Endoplasmic Reticulum)中自核苷酸醣合成。該等N-連結的醣是從共同之前驅物合成，並進行後續之處理。習知添加N-連結的碳水化合物鏈對於醣蛋白折疊之穩定、於內質網之降解的預防、寡分子化、生物活性、及運輸是重要的。將N-連結的寡醣添加至特定Asn基在調控病毒成熟蛋白之活性、穩定性或抗原性上扮演重要角色(Opdenakker G. et al FASEB Journal 7,1330-1337 1993)。亦有報導指出N連結的醣化作用對於醣蛋白之折疊、運輸、細胞表面之表現、分泌(Helenius,A.,Molecular Biology of the Cell 5,253-265 1994)、保護其免於被蛋白性降解及增強醣蛋白之可溶性(Doms et al.,Virology 193,545-562 1993)是必須的。病毒的表面醣蛋白不僅對於蛋白質正確的折疊是必須的，其亦提供病毒保護如一「聚醣屏障」以抵抗中和抗體。因此，特定宿主的選擇常與可能的N-連結醣基化作用之密碼子位置有關。也因此，N-連結醣基化作用之位置傾向於跨不同病毒株及不同演化分支間被保留下來。
A型流感病毒之爆發持續造成全世界廣泛的發病率及死亡。單獨於美國而言，估計5至20%之人口每年被A型流感病毒所感染，造成將近200,000住院病患及36,000死亡案例。全面性之接種政策已有效地控制流行感冒之發病率。然而，由於該病毒之基因的常變性，以致每年需重新調整疫苗之配方，因此，可能導致現行疫苗內之病毒株與正在流行者無法匹配。因此，抗病毒療法對於控制疾病嚴重度及傳播為一重要之工具。
自2003年以來，該高致病性之H5N1流感病毒於禽類及野鳥造成爆發流行(Li K S et al.(2004) Nature 430:209-213)。截至2010年2月，該病毒不僅感染禽類亦感染了超過478個人類，其中286個案例證實是致死的(www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html)。該高致病性H5N1及2009年之豬源A型流感病毒(H1N1)已造成全球之爆發，且引起相當大的隱憂，擔心該等病毒會進一步改變，將可能帶來死亡性的全世界大流行(Garten R J,et al.(2009) Science 325:197-201,Neumann G,et al.(2009) Nature 459:931-939)。此外，另一相當大之隱憂在於該流感病毒可能獲得於人類間可有效傳播之能力，此將導致全世界大流行之威脅。因此，流感疫苗必須為任何流行預防計畫中之一組成部分。
為了明瞭流感病毒之感染方式，於血球凝集素(HA)之研究有一重要之貢獻，該病毒外套醣蛋白會於呼吸道中與一特定之唾液酸化聚醣受器結合，使得病毒得以進入細胞(Kuiken T,et al.(2006) Science 312:394-397;Maines TR,et al.(2009) Science 325:484-487;Skehel JJ,Wiley DC(2000) Ann Rev Biochem 69:531-569;van Riel D,et al.(2006) Science 312:399-399)。為了跨越物種之屏障及感染人類族群，禽類之HA必須改變它的受器結合之偏好，從終端唾液酸化聚醣(terminally sialylated glycan)，其包含「α2,3(禽類)-結合的」變成「α2,6(人類)-結合的」唾液酸單元(Connor RJ,et al.(1994) Virology 205:17-23)，並且此種改變僅僅透過兩個突變即可發生，如同1918的大流行危害(Tumpey TM,et al.(2007) Science 315:655-659)。因此，瞭解何種因素會影響流感病毒結合至聚醣受器，此舉對於研發如何控制將來任何跨種且可能造成大流行之流感病毒株是重要的。
流感病毒血球凝集素(HA)係為一同源三聚體之跨膜蛋白，且具有由一球狀體及一莖幹區所組成的胞外結構(Kuiken T,et al.(2006) Science 312:394-397)。該兩個區域皆攜帶N-連結的寡醣(Keil W,et al.(1985) EMBO J 4:2711-2720)，該寡醣會影響HA之功能性(Chen ZY,et al.(2008) Vaccine 26:361-371;Ohuchi R,et al.(1997) J Virol 71:3719-3725)。HA為病毒粒子之表面醣蛋白，其可將病毒貼附至宿主細胞之受器，並使得病毒封套與胞吞泡囊(endocytic vesicles)之膜融合，以誘發感染之進行(Crecelius D. M.,et al.(1984) Virology 139,164-177)。該病毒粒子之組成亦會刺激保護性抗體的形成。HA之醣化的性質及程度，與受器結合特性的改變、增強的細胞致病性(Aytay S.,Schulze I. T.(1991) J. Virol. 65,3022-3028)及毒力(Deshpande K. L.,et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84,36-40)之病毒變種的出現、以及遮蔽病毒之抗原性位置(Skehel J. J.,et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81,1779-1783)有所關連。HA醣基化位置之突變缺失可影響病毒受器之結合能力(Gunther I,et al.(1993) Virus Res 27:147-160)。
HA之胺基酸序列及N-醣基化位置係由病毒基因體決定。該等寡醣之結構應由他們於HA上之位置所決定(Keil W.,et al.(1985) EMBO J. 4,2711-2710)，以及由病毒寄宿生長之宿主細胞所提供之生物合成的及修剪的酵素所決定。由於病毒基因體之可塑性以及宿主特定的醣基化機轉可共同產生許多病毒群；相較於該兩因素單獨作用時，兩者共同作用時可使得該病毒群之結構及功能更為不同。此種多樣性被認為是導致該等病毒存活之原因，以及致使該等病毒具有抵抗中和抗體及抗病毒因子之抑制作用的能力。
HA似乎於某些區域是必須被醣基化的，某些其他區域是必須不具有寡醣的，以及另外的其他區域則可能對於病毒之存活是有助益或有害的。自各種動物及人類中分離出來的A型流感病毒之HA上的特定位置之醣基化位置為高度保存的，且似乎對於功能性之HA的形成及/或維持是必須的(Gallagher P. J.,et al.(1992) J. Virol. 66,7136-7145)。相反地，於HA之某些區域製造醣基化位置會降低病毒被運送至細胞表面，及病毒之穩定性及/或功能(Gallagher P.,et al. (1988) J. Cell Biol. 107,2059-2073)。有些區域之醣基化不是被禁止的、或是對於形成功能性HA是不必要的，寡醣多樣性對此具有主要之選擇效果，此取決於該病毒預期於何種特定環境生長。
在胜肽序列中改變於或接近醣基化位置可能會改變HA之3D結構，進而改變其與受器結合的專一性及親和性。的確，來自不同H5N1亞型之HAs具有不同之聚醣結合模式(Stevens J,et al.(2008) J Mol Biol 381:1382-1394)。先前研究亦於全病毒系統中對於H1及H3之醣基化位置進行突變分析(Chandrasekaran A,et al.(2008) Nat Biotechnol 26:107-113;Deom CM,et al.(1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:3771-3775)。於醣基化作用進行改變可影響受器結合專一性及親和性，對於最致病性之H5N1 HA而言其影響更為明顯。
血球凝集素之較不高度醣基化或無醣基化區域持續進行突變以逃脫宿主的免疫系統。採用單醣基化的HA之疫苗設計已由美國專利公開號2010/0247571(Wong et al.)所揭露。因此，亟需一創新且有效之方法用以生產單醣基化的流感病毒顆粒。
本發明於此提供製備單醣基化流感病毒之示例性實例。該揭露之方法可相同地應用於生產於結構蛋白上具有簡單聚醣之病毒。一旦帶有高度醣基化的結構蛋白之保守區域的醣基化模式被簡化為單、雙、三或其他程度，疫苗設計上即可以該等區域為目標。
具體而言，於目前及未來製備疫苗時，極需一交叉性中和單株抗體，其可用以設計及驗證疫苗生產過程中，是否維持或增強交叉性中和抗原決定基之品質及抗原性。如果抗體結合至抗原可反映出結構之完整性及抗原的潛力，吾人即可嘗試交叉性中和抗體之結合力，如：單醣基化之HA多胜肽，並量化評估該等抗原抗體間之交叉性中和能力。抗流感病毒HA之單醣基化衍生物所衍生之疫苗可增強免疫原性以對抗廣泛之抗原決定基。
將病毒醣蛋白上之醣部分地移除，以露出醣基化位置(該等醣基化位置為高度保守，且不會突變或不會劇烈突變)，以及同時保留適當之醣以維持該醣蛋白之三度結構以生成抗原。藉由將醣蛋白進行部分去醣基化作用，以使得特定醣基化位置保留一、二或三個醣單元，以生成部分醣基化之病毒醣蛋白。於其他態樣中，該部分醣基化之醣蛋白亦可藉由提供一蛋白或胜肽，其之一或多個特定醣基化位置是未醣基化的，並將單、二或三個醣類與該等醣基化位置結合而生成。
本發明所提供之疫苗包含至少一部分醣基化之HA醣蛋白，及醫藥上可接受之載劑。於一些實施例中，該部分醣基化之HA醣蛋白係選自由部分醣基化之流感病毒H1、H3、及H5所組成之群組。
本發明所提供之方法包含投予易感染流行性感冒之對象一疫苗，該疫苗包含至少一去醣基化之HA醣蛋白及醫藥上可接受之載劑。於一些實施例中，該去醣基化之HA醣蛋白係選自由H1、H3、及H5所組成之群組。
於一些實施例中，該去醣基化作用於該醣蛋白上之一或多個醣基化位置進行單醣基化(剩下一個醣)。於某些實施例中，該去醣基化作用於該醣蛋白上之至少一個醣基化位置進行雙醣基化(剩下兩個醣)。於某些實施例中，該去醣基化作用於該醣蛋白之一或多個醣基化位置進行三醣基化(剩下三個醣)。於某些實施例中，該去醣基化作用於該醣蛋白之至少一個醣基化位置進行單醣基化、雙醣基化、及三醣基化中至少一者。
於部分具體實施例中，該流感病毒HA抗原係於細胞培養中重組製備。該細胞培養包含MDCK細胞、Vero細胞、或PER.C6細胞。基福尼辛(kifunensine)係被添加至該宿主細胞，該宿主細胞帶有一重組的流感病毒HA抗原。
於部分態樣中，抑制α-甘露醣苷酶I會導致醣蛋白具有Man9(GlcNAc)2。
於其他具體實施例中，該流感病毒HA抗原包含一全流感病毒。該全流感病毒係於生長於一無特定病原菌(SPF，specific pathogen free)之雞胚卵宿主中。
接著，將基福尼辛(kifunensine)添加於一無特定病原菌(SPF)之雞胚卵之尿囊腔中。
於部分實例中，該基福尼辛(kifunensine)係以0.005至0.5 mg/ml之濃度添加。
該回收的流感病毒HA抗原係以約0.1至約100 μg/mL Endo H處理。
於部分態樣中，該單醣基化流感病毒係由一方法所分離，該方法包含密度梯度超高速離心。
於部分態樣中，該方法進一步包含藉由一方法純化該單醣基化流感病毒HA抗原，該方法包含超過濾。於部分具體實施例中，該超過濾包含使用0.2 μm之濾膜。
於部分態樣中，該方法進一步包含以電子顯微鏡分析該單醣基化流感病毒。
於部分態樣中，該方法進一步包含藉由一方法定量該單醣基化流感病毒，該方法包含以PNGase處理。於部分態樣中，該方法進一步包含藉由一方法定量該單醣基化流感病毒，該方法包含SDS-PAGE電層析法(electrochromatography)。
於部分態樣中，該方法進一步包含藉由一方法分析該分離之單醣基化流感病毒的聚醣組成，該方法包含質譜分析。
本發明係與任何於此揭露之方法所製備之單醣基化流感病毒HA抗原(全病毒或重組的)相關。
本發明係與任何於此揭露之方法所製備之單醣基化流感病毒HA抗原(全病毒或重組的)之用途相關，係用以製備疫苗。
該等及其他態樣將透過下述之較佳具體實施例及佐以以下圖式得以明晰；即使於其中可能有變動或修飾之影響，但並不背離本發明所揭露之創新觀念之精神及範疇。
於本說明書中所使用之術語，於現有技藝中、於本發明之上下文中、及各個術語被使用之特定文段中，一般具有其通常含意。某些用以描述本發明之術語討論於下，，或於本說明書之其他位置，其係用以提供施行者關於本發明之描述的額外導引，。為了方便起見，特定術語可能被突顯，如使用斜體及/或引號時。使用突顯標記並不影響術語之範圍及意義；於相同內文中，無論該術語有無被突顯，該術語之範圍及意義皆為相同。需了解的是，相同事物可以多於一種之方式來描述。
因此，其他語言及同義詞可被使用於任何一個或多個於此討論的術語；無論一術語是否於此被詳盡說明或討論，皆非代表其特別重要。對於特定術語之同義詞於本文中亦有提供。當使用一或多個同義詞用以說明時，並不排除其他同義詞使用的可能性。於本說明書中任一處所使用之示例，包括任何本文使用之示例術語，僅用以闡述，並不限制本發明或任何示例性術語之範疇及意義。同樣地，本發明並不受限於本發明所提供之各種具體實施例。
除非另有定義，所有於此使用之技術性及科學性術語皆具有與該發明相關領域中具有通常技藝者所普遍瞭解的意義相同。若有抵觸時，以本文獻，包含定義，為主。以下之參考文獻提供該領域之人本發明所使用術語之一般性定義：Singleton等人之微生物及分子生物學字典(第二版1993)；科學及技術之劍橋字典(Walker ed.,Cambridge University Press. 1990)；遺傳學辭典第五版，R. Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；以及Hale & Margham之哈珀柯林斯之生物學字典(1991)。
一般而言，與本處所描述之細胞及組織培養、分子生物學、及蛋白、及寡或多核苷酸化學、及雜交相關所使用之命名及其技術係屬該領域習知且常用的。重組DNA、寡核苷酸合成、以及組織培養及轉形(如：電穿孔、脂轉染法(lipofection))皆使用標準技術。酵素性反應及純化技術皆根據製造商之使用說明書來進行、或依該技藝中一般之施行方式、或於於此所述之方式施行。除非另有特定指出不同者，本發明之實行將使用該技術領域中病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學、及重組DNA技術之傳統方法；該等方法將描述於下，其僅做為闡述之目的。該等技術於文獻中有詳細解釋說明。請參閱，如：Sambrook等人之分子選殖：實驗室之操作手冊(第二版1989)；Maniatis等人之分子選殖：實驗室之操作手冊(1982)；DNA選殖：實務操作，vol. I & II(D. Glover,ed.)；寡核苷酸合成(N. Gait,ed.,1984)；核酸雜合(B. Hames & S. Higgins,eds.,1985)；轉錄及轉譯(B. Hames & S. Higgins,eds.,1984)；動物細胞培養(R. Freshney,ed.,1986)；Perbal,分子選殖之實務導引(1984)。
術語「流感病毒A亞型」或「A型流感病毒亞型」使用時是可互換地，且其係指以血球凝集素(H)病毒表面蛋白為其特徵的A型流感病毒變異株，並因此藉一H號碼標示，像是例如，H1、H3、及H5。此外，該亞型或許可藉由神經氨酸酶(N)病毒表面蛋白以進一步特徵化，係藉由指出其N號碼，像是例如，N1及N2。如此，一個亞型可能由H及N號碼所指稱代表，像是例如：H1N1、H5N1、及H5N2。該等術語皆特定地包括在每一亞型內的所有病毒株(包括已滅絕之病毒株)，該等病毒株通常係由突變所造成，且展現出不同之致病圖譜。該等病毒株亦將以病毒性亞型之各種「分離株」指稱，包括所有過去、現在及未來之分離株。因此，於本文中，術語「株」及「分離株」可互換地使用。亞型包含依據A型流感病毒之抗原。該抗原可依據血球凝集素之病毒表面蛋白，且可被稱為「HA抗原」。於部分實例中，該等抗原係以特定亞型之蛋白為依據，像是例如，H1亞型及H5亞型，其分別可以H1抗原及H5抗原稱呼。
當於本發明使用時，術語「去醣基化」或「部分醣基化」蛋白表示從完全醣基化狀態之蛋白的聚醣結構上移除一或多個醣，且該蛋白質實質上維持其原來之構形/折疊。「去醣基化」蛋白包括部分醣基化蛋白，其去醣基化過程中於醣蛋白之一或多個醣基化位置進行單醣基化、雙醣基化、或三醣基化。
「部分醣基化」蛋白包括「去醣基化」蛋白，其中每個醣基化位置保留一或多個醣；以及相較於完全醣基化狀態之醣蛋白的位置，該「部分醣基化」蛋白之每個部分醣基化位置包含較小之聚醣結構(包含較少之醣單元)，且該部分醣基化蛋白仍實質地保留其原本的構形/折疊。「部分醣基化」蛋白係藉由將完全醣基化狀態之醣蛋白的至少一個醣基化位置之聚醣結構進行部分去醣基化而生成。「部分醣基化」蛋白亦可藉由於蛋白之未醣基化位置引入醣基化作用而生成，所加入之醣基化序列係小於該醣蛋白之完全醣基化狀態之位置上的聚醣結構。「部分醣基化」蛋白亦可藉由合成病毒醣蛋白序列，或其片段，於該序列之醣基化位置引入醣基化之胺基酸單元(如：GlcNAc-精胺酸部分)，而生成；該等被加入之聚醣結構係小於該醣蛋白之完全醣基化狀態之位置上的聚醣結構。
病毒之傳播始於醣蛋白之血球凝集素(HA)與含有聚醣之唾液酸(SA，sialic acid)間之重要交互作用，該血球凝集素位於流感之病毒外套；該唾液酸位於宿主之細胞表面。為了闡述HA醣基化於此重要交互作用之角色，製備各種已定義之HA醣型，並藉由使用合成的SA微陣列研究他們的結合能力及專一性。HA上之N-聚醣結構的截斷會增加SA之結合能力，同時降低了對不同SA配體之專一性。SA配體結構內之每個單醣及硫基對於HA之結合能量的影響係被量化地分析。結果發現，硫基使SA與完全醣基化HA之結合能量增加約100倍(2.04 kcal/mol)，對雙觸聚醣結合至單醣基化HA醣型亦同。相較於完全醣基化之HA所誘發之抗體，於每個醣基化位置僅帶有一個N連結的GlcNAc之HA蛋白所誘發的抗體具有較佳之抗流感亞型之親和性及中和活性。因此，將病毒表面醣蛋白上非結構必要之聚醣移除，對於抵抗流感及其他人類病毒之疫苗的設計為一非常有效且通常之手段。
多胜肽之醣基化作用典型地為N連結的或O連結的。N連結的係指醣類部分貼附於天冬醯胺酸殘基之側鏈。「序列肽段(sequon)」係指於一蛋白中之三個連續胺基酸序列，其可被當作多醣(糖)之貼附位置，稱作N連結的聚醣。其係指多醣經由在天冬醯胺酸(Asn)之側鏈中的氮原子連結至蛋白。一個序列肽段(sequon)可為Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr，其中Xaa為除了脯胺酸以外之任何胺基酸。因此，於多胜肽中若出現該等三胜肽序列中之一者，即可創造出可能之醣基化位置。O連結的醣基化作用係指N-乙醯基半乳醣胺、半乳醣、或木醣中之一醣類貼附於羥基胺基酸，其大多為絲胺酸或羥丁胺酸，雖然羥脯胺酸或5-羥離胺酸亦可能被使用。雖然序列肽段Asn-X-Ser/Thr對於N連結的寡醣貼附於醣蛋白時是絕對必須的(Marshall RD,Biochemical Society Symposia 40,17-261974)，但該序列肽段存在時，並不一定導致醣基化，且醣蛋白中某些序列肽段仍可能維持未醣基化的狀態(Curling EM,et al.,Biochemical Journal 272,333-3371990)。
於本發明之一態樣中，係提供一種用以製備非天然且具有簡單醣類結構之醣蛋白的方法。
因此，該方法可應用於反轉錄病毒，諸如HIV；黃病毒，諸如C型肝炎病毒、登革病毒、及西尼羅病毒(West Nile virus)，及其類似病毒。
人類免疫不全病毒(HIV)之受器結合封套蛋白gp120，其約一半之分子量係由N連結的聚醣所組成。近乎一半之該等聚醣係為高甘露醣類型。該等高甘露醣聚醣於病毒表面提供充裕之甘露醣殘基，使得HIV成為其與免疫系統之甘露醣專一性之凝集素間交互作用的一主要目標。
C型肝炎病毒(HCV)封套醣蛋白係為高度醣基化的，通常於E1及E2上分別帶有4及11個N連結的聚醣。於HCVcc組裝及/或感染性上，許多聚醣扮演重要之角色。於E2上至少5個聚醣(稱為E2N1、E2N2、E2N4、E2N6、及E2N11)可強力地減低HCV對抗體中和反應之敏感性(Helle F et al.,J Virol. 2010 Nov;84(22):11905-15)。
多數黃病毒之E蛋白係於殘基153/154進行Asn連結的醣基化作用修飾，以及於四個登革病毒(DENV，dengue virus)血清型中，於殘基67位置進行第二個聚醣的修飾。於登革病毒，該於E蛋白之N連結的聚醣為高甘露醣及複合聚醣之混合。西尼羅病毒之封套(E)蛋白於殘基154位置具有單一個N連結的醣基化位置。由於將聚醣從該等位置移除可顯著地降低但不會根絕感染性，針對以簡單醣基化呈現之保守位置為標的之疫苗可產生對於病毒之各種突變具有較低敏感性的有效療法。
醣苷酶抑制劑
醣苷水解酶(亦稱為醣苷酶或醣苷基水解酶)催化醣苷鍵結之水解，以釋放出較小之醣類。他們為常見之酵素，其於自然界中之角色包括：降解生物質，如纖維素及半纖維素；用於抗細菌之防禦方式(如：溶菌酵素)；參與於致病機制中(如：病毒性之神經氨酸酶)，以及參與於平常之細胞功能中(如：參與N連結的醣蛋白生物合成作用，以調節甘露醣苷酶)。醣苷轉移酶、及醣苷酶一同形成主要之催化性機器，用以合成及降解醣苷鍵結。
醣基化作用之抑制劑皆被考量以用於本發明之方法中。示例性之抑制劑包括基福尼辛(kifunensine)、奧司徹林(Australine)、栗精胺(Castanospermine)、去氧諾加利黴素(Deoxynojirimycin)、去氧甘露基力黴素(Deoxymannojirimycin)、苦馬豆素(Swainsoninne)、甘露史塔丁(mannostatin)A及其類似物。
奧司徹林(Australine)為一多羥基化吡啶生物鹼，係為α-葡醣苷酶(glucosidase)、葡萄苷澱粉水解酶(amyloglucosidase)(於5.8 microM時，具有50%抑制率)之良好的抑制劑，但它無法抑制β-葡醣苷酶、α-或β-甘露醣苷酶(mannosidase)、或α-或β-半乳醣苷酶。栗精胺(castanospermine)為一吲哚生物鹼，其可抑制α-葡醣苷酶活性，並改變肝醣之分佈。栗精胺可抑制登革病毒之感染(Whitby K et al.,J Virol. 2005 July;79(14): 8698-8706)。
生物合成各種形式之N連結的寡醣結構牽涉到兩系列之反應：1)形成脂質連結的醣前驅物，Glc3Man9(GlcNAc)2-焦磷酸化-多萜醇，其係藉由於多萜醇-P(dolichol-P)逐步加入GlcNAc、甘露醣及葡萄醣而形成；以及2)藉由結合於膜上之醣苷酶以移除葡萄醣及甘露醣，並藉由位於高基氏體之醣苷轉移酶將GlcNAc、半乳醣、唾液酸、及海藻醣加入，以產生不同複合之寡醣結構。
使用於不同步驟阻礙修飾反應的抑制劑會造成細胞產生帶有變異醣類結構之醣蛋白。一群類似生物鹼之化合物已被辨識出可作為參與醣蛋白處理過程時之葡醣苷酶及甘露醣苷酶之專一性抑制劑。取決於抑制之位置，藉由該等化合物所形成之醣蛋白，會帶有含葡萄醣之高甘露醣結構，或不同的高甘露醣或雜合鏈(Elbein AD FASEB J. 1991 Dec;5(15):3055-3063)。
作用於N連結的醣蛋白之處理過程的前四個酵素為醣苷酶。GlcNAc-磷酸轉移酶可催化甘露醣6-磷酸決定因子之合成中的第一步驟。一個適當之醣結構非常有助於GlcNAc-磷酸轉移酶進行有效的磷酸化。醣類結構之磷酸化係為在GAA分子上合成甘露醣6-磷酸訊號所必須的，該GAA分子為高甘露醣之N聚醣。
已知有許多作用於甘露醣苷酶之抑制劑。苦馬豆素(swainsonine)，係為自紫雲英(瘋草)分離而得之高基氏體甘露醣苷酶II之有效抑制劑，但對於甘露醣苷酶I則不具效力(James,L. F.,Elbein,A. D.,Molyheux,R. J.,and Warren,C. D.(1989) Swainsonine and related glycosidase inhibitors. Iowa State Press,Ames,Iowa)。去氧甘露基力黴素(Deoxymannojirimycin)係為鼠肝甘露醣苷酶I之有效抑制劑。於正常細胞中，去氧甘露基力黴素會阻礙複合形式之N連結的寡醣的合成，且造成帶有Man7-9(GlcNAc)2結構之醣蛋白的累積，其中係以Man9(GlcNAc)2寡醣佔多數(Elbein,A. D.,et al.(1984) Arch. Biochem. Biophys. 235,579-588)。曼諾士他汀A(Mannostatin A)為微生物，輪枝鏈黴菌(Streptoverticillium verticillus)，所產生之代謝物；且該化合物被報導係為鼠附睪的α-甘露醣苷酶之有效抑制劑(Aoyagi,T.,et al.(1989) J. Antibiot. 42,883-889)。
基福尼辛(Kif)最早是從放線菌，北里孢菌屬基福尼辛放線菌(Kitasatosporia kifunense)No. 9482，中分離而得(M. Iwami,O. et al. J. Antibiot.,40,612,1987)，且其係1-胺基-甘露基力黴素之環狀草醯胺衍生物。基福尼辛會抑制動物的高基氏體酵素，甘露醣苷酶I。當把基福尼辛以1μg/ml或更高之濃度加入培養之哺乳動物細胞時，藉由持續抑制甘露醣苷酶I之抑制作用，可使得N連結的寡醣結構完全的位移，從複合鏈位移成Man9(GlcNAc)2結構。另一方面，去氧甘露基力黴素即便在50 μg/ml，也不能完全避免所有複合鏈之形成(Elbein,A. D.,et al.(1984) Arch. Biochem. Biophys. 235,579-588)。因此，基福尼辛為最有效之醣蛋白處理抑制劑中之一者。
基福尼辛亦展現出對於α-甘露醣苷酶可能之免疫調節活性。基福尼辛之合成已由藤澤藥品公司(H. Kayakiri,et al.,Tetrahedron Lett.,31,225,1990;H. Kayakiri,et al.,Chem. Pharm. Bull.,39,1392,1991)及Hudlicky等人(J. Rouden及T. Hudlicky,J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1,1095,1993;J. Rouden,T. et al.,J. Am. Chem. Soc.,116,5099,1994)報告過。
對細胞施予基福尼辛(Kif)可抑制該等細胞之醣蛋白處理過程(Elbein et al(1991) FASEB J(5):3055-3063；及Bischoff et al(1990) J. Biol. Chem. 265(26):15599-15605)。Kif藉由阻礙複合醣之貼附以修飾蛋白。然而，若使用充足之Kif去完全抑制於溶酶體水解酶之醣蛋白處理過程，則所得之水解酶具有甘露醣-9結構，其對於GlcNAc磷酸轉移酶而言，並非最有效率之受質。
因此，Kif係以至少0.01 μg/ml至約至少500 μg/ml之量投遞給細胞，該量包括0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.25、9.5、9.75及所有其間之數值。
基福尼辛抑制了於N醣基化作用路徑之α-甘露醣苷酶I之功能，且使得醣蛋白帶有Man9GlcNAc2組成。
複合醣類結構之程度及/或類型可藉由習知方法測量。例如：醣蛋白及與其關連之寡醣的特徵，在於使用內切醣苷酶(endoglycosidases)以區分高甘露醣及複合形式之寡醣(Maley et al(1989) Anal. Biochem. 180:195-204)。胜肽-N4-(N-乙醯-1-β-葡萄醣胺)天冬醯胺醯胺酶(PNGaseF)可在β-天冬胺醯基葡萄醣胺鍵水解天冬醯胺連結的(N-連結的)寡醣，以得到氨、天冬氨酸及於還原端帶有完整的雙-N-乙醯殼二醣(di-N-acetylchitobiose)之寡醣。PNGase之專一性是很廣泛的，係因高甘露醣、雜的、雙-、三-、及四觸複合物、硫的、及多聚唾酸寡醣皆為其受質。此外，如α1,6-甘露醣臂具有另一個貼附之甘露醣，則內-β-N-乙醯基葡萄醣胺酶H(EndoH)可有效地在三個甘露醣殘基處水解雜的及含甘露醣N連結的寡醣處理過程中的殼質雙醣(chitobiose)單元。複合醣類可抵抗EndoH之酶切。
為了要將呈現於醣蛋白之N連結的寡醣之類型特徵化，可於還原環境下使用PNGaseF(0.5% SDS、1% β-巰乙醇、50 mM NP-40、50 mM磷酸鈉，pH 7.5)或EndoH(0.5% SDS、1% β-巰乙醇、50 mM檸檬酸鈉，pH 5.5)將一等分之蛋白酶切。接著將天然的及酶切過的蛋白於還原環境下，以SDS-聚丙烯醯胺電泳分析，並比較其相對之移動能力。若該醣蛋白僅帶有高甘露醣寡醣，則經PNGaseF及EndoH處理過之樣本，相較於未處理過之蛋白質，將有較佳之移動能力。由於每個N連結的醣基化位置留有單一個N-乙醯基葡萄醣胺，該EndoH處理過之蛋白將具有一稍微較高之分子量。若該醣蛋白僅含有複合形式之寡醣，則經EndoH處理過之蛋白，相較於未處理之蛋白，則不會有位移之變動。若存在著複合形式及高甘露醣寡醣，則相較於未處理之醣蛋白，經EndoH處理過之蛋白將較小，但大於PNGaseF處理過之蛋白。其間之差異將比藉由剩餘之N-乙醯基葡萄醣胺所計算的更加大。
為了於目標醣蛋白上生成簡單聚醣，係採用內切醣苷酶(endoglycosidases)。內切醣苷酶為可將寡醣自醣蛋白或醣脂質釋放的酵素。或其僅切斷介於殘基間之多醣鏈，該殘基非終端之殘基，雖然自共軛的蛋白質及脂質分子中釋放寡醣較為常見。它可破壞於一聚合物中之兩個醣單體間之醣苷鍵。內切醣苷酶之例子包括，但不限於內切醣苷酶D、內切醣苷酶F、內切醣苷酶F1、內切醣苷酶F2、內切醣苷酶H、及內切醣苷酶S。
製備單醣基化流感病毒
為了製備具有高甘露醣醣蛋白之蛋白，將攜有流感病毒之細胞暴露於Kif中(及/或DMJ)以抑制醣蛋白之處理。為了製備單醣基化流感病毒，將該病毒與甘露醣苷酶抑制劑，如基福尼辛，一同注入無病原菌之雞胚卵的尿囊腔中。
基福尼辛會抑制N-醣基化路徑中之酵素α-甘露醣苷酶I之作用，並使得醣蛋白帶有Man9(GlcNAc)2組成。用以抑制血球凝集素之醣基化作用的基福尼辛濃度範圍介於5、10、25、50、75、100、200、500 μg/mL、及最高到500 μg/mL、以及所有其間之數值。
經過1至3天之培養後，收集經基福尼辛處理過之尿囊液，並將之以內切醣苷酶(Endo H)酶切，以移除高甘露醣型之聚醣，如：可自Man9(GlcNAc)2轉化為單一GlcNAc之濃度。於尿囊液中用以製備單醣基化血球凝集素之Endo H的濃度範圍至少約為每1 mL之尿囊液中有0.1、0.5、1、2、5、7、10、20、30、40、50、60、75、100、150、200、500 μg或更高。
接著，回收及純化單醣基化病毒。
單醣基化流感病毒的用途
於此所揭露之單醣基化流感病毒抗原可被用於免疫，以抵抗流感病毒之感染。衍生抗原之特定病毒可能與提供保護抵抗之特定病毒相同或不同，係因於已知流感病毒不同分離株之間會發生交叉保護作用，特別是在同一種病毒亞型內。
目前使用的流感疫苗被指為全病毒(WV，whole virus)疫苗或亞病毒(SV，subvirion)(亦稱為「裂解的」、或「純化的表面抗原」)。該WV疫苗含有完整的去活性病毒；然而，該SV疫苗含有純化之病毒，其藉由清潔劑以溶解含脂質之病毒封套而破壞；接著將剩餘之病毒進行化學性去活性。用以抗流感之減毒病毒疫苗亦在研發中。有關於如何製備傳統疫苗之方法的討論可參閱Wright,P. F. & Webster,R. G,FIELDS VIROLOGY,4d Ed.(Knipe,D. M. et al. Ed.),1464-65(2001)。
當疫苗包括多於一種流感病毒株時，該不同病毒株一般皆為分開培養，並於收集病毒後再予以混合，以製得抗原。或者，流感病毒不同分離株之不同區段，可被結合在一起以生成一多重功效之疫苗。用於本發明之製程中的流感病毒可為基因重組株、及/或藉由反向遺傳學技術而獲得。該病毒可為減毒的。該病毒可為對溫度敏感的。該病毒可為適冷性的。一可使用之基因重組株包含來自一具致病性病毒株之HA及/或NA病毒片段，且剩下之六個或七個片段是來自一非具致病性病毒株。
根據本發明用於免疫組合物之流感病毒抗原可為活病毒，或較佳者為去活性病毒的形式。病毒之去活性典型地牽涉化學物之處理如福馬林或β-丙內酯。當使用去活性病毒時，該抗原可為全病毒、裂解的病毒、或病毒次單位。裂解的病毒可藉由將病毒粒子以清潔劑(如：乙醚、聚山梨醇酯80、去氧膽酸、N-磷酸三丁酯、Triton X-100、Triton N101、溴化十六基三甲銨等)處理而獲得，以製備亞病毒組合物。次單位疫苗包含流感病毒之表面抗原血球凝集素及神經氨酸酶中一者或兩者。流感病毒抗原亦可以病毒小體之形式呈現。
當抗原是從流感病毒製得時(即不是指透過重組的或合成系統所製得者，該等系統不涉及流感病毒之生長)，該病毒可於雞蛋或細胞培養中生長。於無特定病原菌之胚卵中培養流感病毒為供疫苗製備之傳統培養病毒的方式；而細胞培養則為較現代之發展。當採用細胞培養時，該流感病毒疫苗典型地係於哺乳動物細胞上生長，例如：MDCK細胞、Vero細胞、或PER.C6細胞。該等細胞株係為廣泛易於取得者，如：自美國菌種庫(ATCC，American Type Cell Culture)、或自Coriell細胞庫(Coriell Cell Repositories)。舉例而言，ATCC提供各種不同之Vero細胞，其具有編碼CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586及CRL-1587；以及ATCC提供之MDCK細胞，其編碼為CCL-34。於禽類細胞株生長，包括衍生自母雞之細胞株，如：雞胚纖維母細胞(CEF，chicken embryo fibroblasts)亦是可能的。
同樣的，病毒(如HIV、HCV、登革病毒、流感病毒、黃病毒等)可於一或多個醣苷酶抑制劑(如基福尼辛、奧司徹林、栗精胺、去氧諾加利黴素、去氧甘露基力黴素、苦馬豆素、甘露史塔丁A等)存在之細胞培養中生長。用以培養該等病毒之細胞培養系統係為習知技藝。西尼羅病毒(West Nile virus)可於猴子腎上皮細胞或雞胚細胞組織中培養。HIV可於週邊血液單核細胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)中培養。HC可生長於衍生自人類肝瘤細胞株Huh-7之細胞中。
本發明之免疫性及藥物組合物是適合施予病患的。此可藉由許多方式達成，包括但不限於：皮內注射、經皮投予、及局部投予。此等方式可結合皮膚擦刮一起使用，如：藉由使用砂紙或微磨料。
本發明之免疫性及藥物組合物較佳地係以疫苗方式呈現。
本發明之組合物可包括佐劑。可用於流感疫苗之佐劑包括鋁鹽、幾丁聚醣、CpG寡去氧核苷酸，如：CpG 7909、水包油乳化劑，如：MF59、水包油包水乳化劑、大腸桿菌不耐熱之毒素、及其去毒化之突變物、單磷脂A及其3-O-去醯基衍生物、百日咳毒素突變物、胞壁二胜肽等。
實施例
根據本發明具體實施例以下所提供之示例性器具、裝置、方法及其相關之結果，並非意欲用以限制本發明之範圍。需注意的是，用於實施例之標題或次標題係供讀者方便閱讀，非用以限制本發明之範圍。再者，特定的理論於此被建議及揭露，然而，無論其為正確或錯誤，只要本發明是根據本發明所揭露之內容而實施且無須考量任何特定之理論或行動方案，其皆非用以限制本發明之範圍。
實施例1：完全醣基化及單醣基化病毒之製備
將A型流感病毒，NIBRG-14(H5N1)(Nicolson C,et al.(2005) Vaccine 23(22):2943-2952)，(於200μl之PBS中有1000TCID50(50%之組織培養感染劑量))注入10天大之無特定病原菌(SPF)之受精雞卵之尿囊腔中，以製備完全醣基化之病毒(WHO(2005) WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance.(世界衛生組織，日內瓦))。
為了製備單醣基化病毒，將該病毒及0.2 mg/ml基福尼辛(Cayman Chemical)注入尿囊腔中。基福尼辛會抑制N-醣基化路徑中之酵素α-甘露醣苷酶I的作用，並使得醣蛋白帶有Man9GlcNAc2組成(Elbein AD,et al.(1990) J Biol Chem 265(26):15599-15605)。
分析用以抑制血球凝集素之醣基化的基福尼辛之濃度依賴性(圖1A)。經培養3天後，收集尿囊液，並以3,000 g離心10分鐘去除碎片。經基福尼辛處理後之尿囊液接著以內切醣苷酶Endo H(每毫升之尿囊液加20 μg)酶切，於4℃酶切12小時，以移除高甘露醣類型之聚醣，即從Man9GlcNAc2至單一GlcNAc。分析在尿囊液中用以製備單醣基化血球凝集素的Endo H之濃度依賴性(圖1B)。
接著，該單醣基化病毒以46,000 g進行超高速離心90分鐘而沈澱。將之以PBS重新懸浮，並藉由不連續之蔗醣密度梯度(25%、40%)，於270,000 g、90分鐘純化。收集該梯度中之病毒並將之以120,000 g進行超高速離心90分鐘而沈澱。最後，將該沈澱物重新懸浮於PBS中，並將之以0.22 μm濾膜過濾(CDC(1982) Concepts and Procedures for Laboratory-based Influenza Surveillance(U.S. Dept. of Health and Human Services.,Washington,DC)。相較於純化後的完全醣基化病毒，純化後之單醣基化病毒於HA1及HA2具有明顯之下位移(圖1C)。
實施例2：完全醣基化及單醣基化病毒之電子顯微鏡分析
將病毒溶液置於一膠棉-碳-包覆表面的銅網格(Electron Microscopy Sciences)。過多之液體係以濾紙移除，接著將2%甲胺鎢酸鹽(Ted Pella,Inc.)加入以進行染色30秒。過多之液體係以濾紙移除，並以水清洗30秒。接著，將該網格風乾4小時，以穿透式電子顯微鏡(Hitachi H-7000)進行病毒顆粒之拍攝。該完全醣基化及單醣基化流感病毒NIBRG-14之大小及型態皆相似(圖2)。
實施例3：病毒中血球凝集素之定量
將病毒與變性緩衝液(5% SDS及10% β-巰乙醇)混合，並煮沸10分鐘，接著將10% NP-40加入樣品中並於25℃以PNGase(New England Biolabs)過夜處理。於注膠前，先將樣品與SDS-PAGE樣本緩衝液混合並加熱至95℃、10分鐘。該膠體係以蛋白螢光染料(Sypro ruby，Invitrogen)染色，並以Versa Doc影像系統(Bio-rad)分析。SDS-PAGE分析前先以PNGase F處理係為了在完全醣基化的病毒樣品中自NP蛋白分離HA1分。藉此可在供病毒之血球凝集素之定量的SDS-PAGE上比較完全醣基化及單醣基化病毒之HA1蛋白的強度(圖3)。
實施例4：以LC-MS-MS進行醣胜肽分析
質譜儀係用以分析該單醣基化病毒之聚醣組成。於注膠前，先將該病毒溶液與非還原樣本緩衝液混合，並加熱至95℃、10分鐘。將該膠體以Commassie blue進行染色。將該HA0條帶切成小塊，並以胰蛋白酶進行膠內胰蛋白酶酶切。酶切後，將樣品以LC-MS-MS進行分析(Wu Y,et al.(2010) Rapid Commun Mass Spectrom 24(7):965-972)(Agilent Technologies,Thermo Scientific)。於流感病毒NIBRG-14上有6個N-醣基化位置。除了小的百分比之比例在殘基295出現高甘露醣形式之聚醣(~10% Man6(GlcNAc)2)，及於殘基489出現高甘露醣形式之聚醣(~10% Man7-9(GlcNAc)2)，其餘全部之聚醣皆為單醣基化的，且帶有單一GlcNAc醣殘基(圖4)。
所有於本發明中所提及之文獻及專利申請案，皆以參考文獻併入本文中，如同每一個別文獻或專利申請案被特定地及個別地提及其係以參考文獻併入。
雖然前述發明已以某些詳述之說明及示例方式描述以使人清晰瞭解，對於該領域具有通常技藝者於本發明之教示下，將立即明白在不背離所附申請專利範圍之精神及範圍下可作某些變化及修飾。
以下圖式為此說明書之一部分，其係被含括以進一步證實本發明之特定態樣；藉由參閱一或多個圖式，並結合此處呈現的特定具體實施例中之詳細說明，得以更瞭解本發明。
圖1顯示單醣基化之NIBRG-14病毒之製備。(圖1A)該病毒係於不同濃度之N-醣基化處理過程之抑制劑，基福尼辛(kifunensine)，中生長。(圖1B)高甘露醣醣基化病毒係由不同濃度之Endo H酶切為單醣基化病毒。(圖1C)相較於純化之完全醣基化病毒，純化之單醣基化病毒之HA1及HA2皆具有明顯之下位移。該等樣本係使用抗H5之HA兔子抗血清以西方墨點分析法分析。
圖2顯示完全醣基化及單醣基化病毒之電子顯微照片。(圖2A)完全醣基化之NIBRG-14。(圖2B)單醣基化之NIBRG-14。該病毒顆粒係以2%甲胺鎢酸鹽(methylamine tungstate)染色，並以穿透式電子顯微鏡分析。
圖3顯示血球凝集素之量化。NIBRG-14病毒之血球凝集素之數量，係以PNGase F去醣基化之HA1於SDS-PAGE上之強度決定。
圖4顯示單醣基化之NIBRG-14血球凝集素之醣胜肽分析。(圖4A)NIBRG-14血球凝集素之醣基化位置以胺基酸殘基號碼標示。該結構係由PDB code 1jsm所繪製，其醣基化位置係以紅色表示。(圖4B)單醣基化之NIBRG-14血球凝集素的醣胜肽分析。經過Endo H酶切後，多數之醣基化位置皆為單醣基化的，除了於醣基化位置295及489處仍為部分(<10%)高甘露醣醣基化的。

Claims (22)

  1. 一種用以製備供製備免疫組合物的單醣基化流感病毒的方法，該方法包含：a)以有效量之甘露醣苷酶抑制劑，於一適當之宿主中培養包含血球凝集素(HA)抗原之流感病毒；其中該甘露醣苷酶抑制劑之濃度足以抑制於N-醣基化路徑中之α-甘露醣苷酶I，其中該適當之宿主係無特定病原菌(SPF)之雞胚卵；b)回收a)製備的該流感病毒；c)將於b)回收的該流感病毒與內切醣苷酶(Endo H)接觸以製備具有單醣基化HA抗原的該流感病毒，其中該Endo H之濃度足以移除高甘露醣形式之聚醣；以及d)分離具有該單醣基化流感病毒HA抗原的該流感病毒。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該HA抗原係衍生自致病性之H5N1流感病毒。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該致病性之H5N1流感病毒為NIBRG-14。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該甘露醣苷酶抑制劑為基福尼辛(kifunensine，Kif)或去氧甘露基力黴素(deoxymannojirimycin，DMJ)。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該Kif或DMJ係添加於該無特定病原菌之雞胚卵之尿囊腔中。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該Kif係以0.005至0.5mg/ml之濃度添加。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟b)係以下述方式進行：在該抑制劑存在下培養該無特定病原菌(SPF)之雞胚卵一段足夠之時間以生長該流感病毒；接著 分離出含有該流感病毒之該無特定病原菌(SPF)之雞胚卵之尿囊液。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在步驟c)中，該Endo H之濃度為約0.1至約100μg/mL。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟d)係由一方法進行，該方法包含密度梯度超高速離心。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，進一步包含藉由一方法純化具有該單醣基化流感病毒HA抗原的該流感病毒，該方法包含超過濾。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該超過濾包含使用0.2μm之濾膜。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，進一步包含藉由電子顯微鏡或一包含質譜分析法的方法分析具有該單醣基化流感病毒HA抗原的該流感病毒。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，進一步包含藉由一包含以PNGase處理的方法或一包含SDS-PAGE電層析法的方法定量具有該單醣基化流感病毒HA抗原的該流感病毒。
  14. 如申請專利範圍第1-13項中任一項之方法，其中該流感病毒係選自由流感病毒H1、H3及H5所組成之群組。
  15. 一種單醣基化流感病毒，其係由申請專利範圍第1-14項中任一項之方法製備而得。
  16. 一種免疫組合物，其包含由申請專利範圍第1-14項中任一項之方法製備而得的單醣基化流感病毒。
  17. 一種如申請專利範圍第15項之單醣基化流感病毒用以製備疫苗之用途。
  18. 一種用以製備包含具有單醣基化聚醣之病毒抗原的免疫組合物的方法，該方法包含：a)以有效量之醣基化作用抑制劑，於一適當之宿主中製備來自於病毒的抗原；其中該醣基化作用抑制劑之濃度 足以抑制於N-醣基化路徑中的醣苷酶，b)回收a)中製備的該病毒抗原；c)將b)中回收的該病毒抗原與內切醣苷酶接觸以製備具有單醣基化聚醣之該病毒抗原；d)分離具有該單醣基化聚醣之該病毒抗原；並e)將具有該單醣基化聚醣之該病毒抗原調配成免疫組合物。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該病毒係選自由正黏液病毒、反轉錄病毒、及黃病毒所組成之群組。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該病毒係選自由HIV、HCV、登革病毒、西尼羅病毒及流感病毒所組成之群組。
  21. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該醣苷酶抑制劑係選自由基福尼辛、奧司徹林(Australine)、栗精胺(castanospermine)、去氧諾加利黴素、去氧甘露基力黴素(deoxymannojirimycin)、苦馬豆素(swainsoninne)、及甘露史塔丁(mannostatin)A所組成之群組。
  22. 如申請專利範圍第18-21項中任一項之方法，其中該病毒抗原係於細胞培養中所重組製備的或包含於體外生長之完整病毒中。
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