KR102529010B1 - 조작된 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩티드의 변형 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 무엇보다도, 항원적으로 구별되는 인플루엔자 균주까지 커버리지를 확장시키는 확장된 면역원성 프로파일로 변형된 재조합 HA 폴리펩티드, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.

Description

조작된 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩티드의 변형

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2016년 6월 3일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/345,502호의 우선권을 주장하며, 그 전체는 본원에 참조로서 통합된다.

인플루엔자는 유행병, 전염병, 재발 및 발병 등 오랜 역사를 가지고 있다. 백신은 인플루엔자에 대항하는 가장 효과적인 방어 수단이었다. 그러나, 인플루엔자가 전 세계적으로 지속적으로 상당한 건강 문제를 일으키고 있으므로, 매년 균주 특이적 면역력을 유도하는 백신을 설계하고 제조하려는 노력은 어려웠다. 실제로, 현재 판매되고 있는 인플루엔자 백신은 다가올 계절에 인간 개체군 중에 존재하게 될 예상 균주에 기초하여 매년 업데이트해야만 한다.

현재의 인플루엔자 백신은 인플루엔자 바이러스의 표면에 존재하는 헤마글루티닌 항원(hemagglutinin antigen)에 대한 면역력을 유도하는 것에 기초한다. 헤마글루티닌(HA)은 세포막 상의 시알산 함유 구조와의 상호 작용을 통해 세포에 대한 인플루엔자 바이러스의 결합을 담당하는 당 단백질(glycoprotein)이다. 이는 바이러스의 지속적인 돌연변이와 숙주에 의한 면역 압박으로 인해 인플루엔자 바이러스 균주에 걸쳐 매우 다양하다. HA 분자의 변이성(항원 변이로도 알려짐)은 관련된 순환하는 바이러스의 작은 하위 집합에 대해서만 일반적으로 반응하는 HA 폴리펩티드 기반의 백신을 생성시킨다. 시간이 흐를수록, 바이러스가 지속적으로 돌연변이를 일으킴에 따라 교차 반응성 균주의 수는 감소한다. 결론적으로, 인플루엔자 백신의 HA 조성물은 HA 분자의 가변성이 기존의 백신으로 더 이상 효과적이지 않게 될 때 정기적으로 변형된다. 인플루엔자에 대항하는 현재의 백신 접종 전략 중에서, 범용 백신의 개발은 현재의 균주 특이적 백신 및 항원 변이에 대한 내성의 폭을 증가시킬 가능성이 있다. 범용 인플루엔자 백신은 대유행성 균주 및/또는 계절성 균주를 비롯하여 다양한 범위의 인플루엔자 유형, 아형 및 균주에 대항해 인간과 동물을 보호할 가능성이 있다. 범용 인플루엔자 항원 설계에 대한 여러 가지 접근 방법이 당업계에 알려져 있다. 그러나, 기존의 접근 방법은 종종 계절성 균주나 대유행성 균주에 편향된 HA 폴리펩티드를 생성하게 된다.

본 발명은, 광범위한 면역원성 프로파일을 갖는 개선된 변형 재조합 HA 폴리펩티드로서, 항원적으로 구별되는 인플루엔자 균주, 예를 들어, 신규하거나 추가적인 대유행성 균주 및/또는 계절성 균주까지 커버리지가 확장된 변형 재조합 HA 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은, 순환하는 인플루엔자 균주의 서열 변이에 대한 가상 환경(in silico) 분석으로부터 추론된 변형, HA의 항원 영역의 맵핑, 및/또는 HA 펩티드의 에피토프 패턴 및 구조 분석에 부분적으로 기초한다. 표적화된 변형이 다양한 아미노산 잔기 위치 및/또는 알려진 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드의 특정 영역에 도입되어, 개선되고 보다 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 신규한 HA 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 실시예 섹션을 포함하여 아래에 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명인은, 무엇보다도, HA 폴리펩티드를 조작하여 계절성 반응 프로파일을 확장시켜 대유행성 균주를 커버하기 위한(또는 그 반대로 하기 위한) 다양한 구별되는 전략을 개발하였다. 이들 전략은 면역 프로파일을 항원적으로 구별되는 균주의 서열(또는 클레이드) 클러스터에 걸쳐 확장하고; 이들은, 조작된 재조합 HA 분자가 항원 변이된 순환하는 계절성 균주에 대항해 지속적으로 면역 반응을 유도하도록, 조작된 재조합 HA 분자에 적용될 수 있다. 모든 경우에, 상기 전략은 수용체 결합 부위(RBS) 근처 영역에서 변형이 조작된 숙주 HA 폴리펩티드 RBS의 특정 잔기를 대체로 보존하도록 설계된다. 유사한 전략이 사용되어, 계절성 균주를 커버하도록 대유행성 반응 프로파일을 확장시킬 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 매우 다양한 재조합 HA 폴리펩티드에 적용될 수 있는데, 이에는 다양한 방법에 의해 조작된 것들 및 실질적으로 야생형인 서열을 포함하는 것들이 포함된다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 재조합 헤마글루티닌(HA) 폴리펩티드로서, 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진 조작된 HA 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 헤드 영역 또는 이의 세그먼트, 및 대유행성 균주로부터 유래된 줄기 영역을 포함하는 재조합 HA 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 조작된 헤드 영역 또는 이의 세그먼트는 서열 번호 1의 위치 135~269, 125~277, 또는 63~278에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 헤드 영역 또는 이의 세그먼트는 서열 번호 1(SMARt_DO2a 서열)의 위치 135~269, 125~277, 또는 63~278에 상응하는 아미노산과 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 줄기 영역은 자연 발생적 대유행성 균주 또는 야생형 대유행성 균주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 적절한 자연 발생적 대유행성 균주는 A/캘리포니아/07/2009, A/뉴저지/10/1976, 또는 A/사우스캐롤라이나/1/1918로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 줄기 영역은 대유행성 면역 프로파일을 가지는 조작된 HA 폴리펩티드로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 대유행성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드는, 컴퓨터로 최적화된 광범위 반응성 항원(COBRA) 기술, 모자이크(mosaic) 기술, 공통 서열에 기초한 인플루엔자 균주의 조합, 구조 도메인의 결실 및/또는 재배열, 도메인 스와핑, 또는 다수의 인플루엔자 균주 중 중화 에피토프 또는 교차 반응성 에피토프의 조합에 의해 조작된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 헤드 영역을 포함하고, NxS/Ty의 공통 서열에 의해 정의된 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩티드를 제공한다(x 및 y는 프롤린(P)이 아니므로, 상기 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 파괴됨). 특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입 각각은 대유행성 균주에서의 대응 서열로부터 유래된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 헤드 영역을 포함하고, NxS/Ty의 공통 서열에 의해 정의된 하나 이상의 조작된 추정상 N-결합된 글리코실화 부위가 삽입된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩티드를 제공한다(x 및 y는 P가 아님). 특정 구현예에서, 하나 이상의 조작된 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 계절성 균주에서의 상응 서열에 기초하여 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 조작된다.

일부 구현예에서, 헤마글루티닌은 A 형 인플루엔자에 상응한다. 일부 구현예에서, A 형 인플루엔자는 아형 H1N1이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 위치 142~145 및/또는 177~179에 상응한다(A/캘리포니아/07/2009 HA (서열 번호 2)에 대한 정규화된 서열; "CA09 넘버링"). 일부 구현예에서, 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위(RBS)의 15 옹스트롬 이내에 있으며, RBS는 삼차원(3-D) 구조에서의 W167(CA09 넘버링)에 상응하는 위치의 15 Å 이내에 있는 모든 아미노산 잔기로서 정의된다. 대안적으로, RBS는 단클론 항체 CH65의 파라토프에 의해 결합된 에피토프로서 정의될 수 있고, 하나 이상의 아미노산 치환은 CH65의 에피토프에 인접하여 (예: 100 아미노산 잔기 이내, 75 아미노산 잔기 이내, 50 아미노산 잔기 이내, 40 아미노산 잔기 이내, 30 아미노산 잔기 이내, 25 아미노산 잔기 이내, 20 아미노산 잔기 이내, 15 아미노산 잔기 이내, 10 아미노산 잔기 이내, 5 아미노산 잔기 이내 등에서) 발생한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입은 본원에 제공된 목록이나 표(예: 표 4 또는 표 5)에서 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입은 공통 서열 NxS/Ty를 z¹z²z³z⁴로 변형하는 것은 포함한다(z¹은 N, D, K 또는 S이고; z²는 Y이거나 불변이고; z³은 E, D 또는 N이며; z⁴는 I, L, P, S 또는 T이거나, 불변임).

일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입이 유래되는 대유행성 균주 또는 계절성 균주는 순환하는 인플루엔자 균주이다. 일부 구현예에서, 순환하는 인플루엔자 균주는 A/캘리포니아/07/2009 및 A/사우스캐롤라이나/1/1918로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입은 리신(K) 잔기 또는 아르기닌(R) 잔기를 NxS/Ty 공통 서열의 1~5 아미노산(예: 1~4, 1~3, 1~2 아미노산) 이내에 삽입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 리신(K) 잔기 또는 아르기닌(R) 잔기는 NxS/Ty 공통 서열의 3'으로부터 1~5 아미노산(예: 1~4, 1~3, 1~2 아미노산) 이내에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입은 잔기 147(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에서의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 잔기 147에 상응하는 위치에서의 삽입은 리신(K) 또는 아르기닌(R)의 삽입을 포함한다.

추가적인 양태에서, 본 발명은, 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 헤드 영역을 포함하고, CA09 넘버링의 60 및 291에 상응하는 위치들 사이에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩티드를 제공한다(하나 이상의 아미노산 치환은 대유행성 균주에서의 상응하는 서열로부터 유래됨). 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 본원에 제공된 목록이나 표(예: 표 6)에서 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 137 및 262(CA09 넘버링)에 상응하는 위치들 사이에 존재하며, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 3 또는 표 4로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 6 또는 표 7로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 연속 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 214, 244, 245, 및/또는 262(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에서 발생한다.

관련된 양태에서, 본 발명은, 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 헤드 영역을 포함하고, 수용체 결합 부위(RBS)의 15 옹스트롬 이내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩티드를 제공한다(RBS는 3 차원(3-D) 구조에서 W167(CA09 넘버링)에 상응하는 위치의 15 옹스트롬 이내에 있는 모든 아미노산 잔기로서 정의되며, 하나 이상의 아미노산 치환 각각은 대유행성 균주에서의 상응하는 서열로부터 유래됨). 대안적으로, RBS는 단클론 항체 CH65의 파라토프에 의해 결합된 에피토프로서 정의될 수 있고, 하나 이상의 아미노산 치환은 CH65의 에피토프에 인접하여 (예: 100 아미노산 잔기 이내, 75 아미노산 잔기 이내, 50 아미노산 잔기 이내, 40 아미노산 잔기 이내, 30 아미노산 잔기 이내, 25 아미노산 잔기 이내, 20 아미노산 잔기 이내, 15 아미노산 잔기 이내, 10 아미노산 잔기 이내, 5 아미노산 잔기 이내 등에서) 발생한다.

일부 구현예에서, 대유행성 균주는 순환하는 인플루엔자 바이러스이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 수용체 결합 부위(RBS)의 10 (예: 9, 8, 7, 6, 5 등) 옹스트롬 이내에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 8로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 8로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 연속 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 및/또는 214(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에서 발생한다.

여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은, 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드로부터 유래된 조작된 헤드 영역을 포함하고, 표 9로부터 선택된 하나 이상의 (예: 표 9로부터 선택된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의) 아미노산 변형을 포함하는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩티드를 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는, 컴퓨터로 최적화된 광범위 반응성 항원(COBRA) 기술, 모자이크(mosaic) 기술, 공통 서열에 기초한 인플루엔자 균주의 조합, 구조 도메인의 결실 및/또는 재배열, 도메인 스와핑, 또는 다수의 인플루엔자 균주 중 중화 에피토프 또는 교차 반응성 에피토프의 조합에 의해 조작된다.

일부 구현예에서, 재조합 HA 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 계절성 균주 및 대유행성 균주 모두에 대항하는 중화 항체를 유도한다. 특정 구현예에서, 재조합 HA 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 계절성 균주 및 하나 이상의 대유행성 균주에 대항하는 중화 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 재조합 HA 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 계절성 균주 및 대유행성 균주 모두에 대항하는 보다 균형잡힌 면역원성 프로파일을 특징으로 한다.

무엇보다도, 본 발명은 본원에 기술된 재조합 HA 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 이러한 벡터 또는 핵산이 포함된 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 적절한 세포는 인간 세포이다. 특정 구현예에서, 인간 세포는 HEK-293 세포이다. 일부 구현예에서, 적절한 세포는 원숭이 세포이다. 특정 구현예에서, 원숭이 세포는 베로(vero) 세포이다.

다양한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 HA 폴리펩티드를 포함하는 유사 바이러스 입자(VLP)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 VLP는 뉴라미니다아제(NA) 단백질, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) gag 단백질, 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 HA 폴리펩티드 또는 VLP를 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에서 기술된 약제학적 조성물을 투여함으로써 대상에서 계절성 및 대유행성 인플루엔자 바이러스에 대항하는 면역 반응(예: 면역화 또는 백신 접종)을 생성하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법은: 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역을 선택하는 단계; 및 HA 폴리펩티드의 상응하는 헤드 영역에 대해 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역을 구별되는 면역원성 프로파일로 변경시켜, 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 우세한 계절성 면역 프로파일을 가지고, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 가진다.

일부 구현예에서, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역은 잔기 63~278, 125~277 또는 135~269(CA09 넘버링)에 상응한다. 일부 구현예에서, 구별되는 (우세한 대유행성인) 면역원성 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역은 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호 2[전장 wt CA09 (A/캘리포니아/07/2009 HA 서열) 서열]의 잔기 63~277, 서열 번호 2[전장 wt CA09 서열]의 잔기 125~277, 서열 번호 2[전장 wt CA09 서열]의 잔기 135~269.

일부 구현예에서, 구별되는 (우세한 대유행성인) 면역원성 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드는 야생형 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 구별되는 (우세한 대유행성인) 면역원성 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드는 조작된 HA 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 가지고, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 우세한 계절성 면역 프로파일을 가진다. 일부 구현예에서, 우세한 대유행성 면역 프로파일을 가진 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역은, 서열 번호 2[전장 wt CA09 (A/캘리포니아/07/2009 HA 서열) 서열]의 잔기 63~277; 서열 번호 2[전장 wt CA09 서열]의 잔기 125~277; 및 서열 번호 2[전장 wt CA09 서열]의 잔기 135~269로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 구별되는 (우세한 계절성인) 면역원성 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역은 서열 번호 2(SMARt_DO2A에 대한 전장 서열)의 잔기 63~278, 125~277 또는 135~269를 포함한다. 　

일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법으로서, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역과 비교하여 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역에서 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위의 존재 여부를 확인하는 단계; 및 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 도입하여 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하거나, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 서열에 기초하여 추가적인 N-결합된 글리코실화 부위를 삽입함으로써 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추정상 또는 추가적인 N-결합된 글리코실화 부위는 NxS/Ty의 공통 서열에 의해 정의된다(x 및 y는 P가 아님). 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 우세한 계절성 면역 프로파일을 가지고, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 가지며, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 조작된 HA 폴리펩티드 내에 도입되어 상기 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하고, 재조작된 HA 폴리펩티드는 변경되어 더 대유행성이 된다. 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 우세한 대 유행성 면역 프로파일을 가지고, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 우세한 계절성 면역 프로파일을 가지며, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 조작된 HA 폴리펩티드 내에 도입되어 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하고, 재조작된 HA 폴리펩티드는 변경되어 더 계절성이 된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법으로서, 수용체 결합 부위(RBS)의 15 옹스트롬 이내에 (예: 10, 9, 8, 7, 6, 5 옹스트롬 이내) 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하여 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는데, RBS는 삼차원(3-D) 구조에서의 잔기 W167(CA09 넘버링)에 상응하는 위치의 15 옹스트롬 이내에 (예: 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 옹스트롬 이내) 있는 모든 아미노산으로서 정의되고, 하나 이상의 아미노산 치환 각각은 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 위치에서 관찰된 아미노산 잔기로 특정 위치의 아미노산 잔기를 교체하는 것을 포함한다. 대안적으로, RBS는 단클론 항체 CH65의 파라토프에 의해 결합된 에피토프로서 정의될 수 있고, 하나 이상의 아미노산 치환은 CH65의 에피토프에 인접하여 (예: 100 아미노산 잔기 이내, 75 아미노산 잔기 이내, 50 아미노산 잔기 이내, 40 아미노산 잔기 이내, 30 아미노산 잔기 이내, 25 아미노산 잔기 이내, 20 아미노산 잔기 이내, 15 아미노산 잔기 이내, 10 아미노산 잔기 이내, 5 아미노산 잔기 이내 등에서) 발생한다. 일부 구현예에서, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 순환하는 계절성 또는 대유행성 인플루엔자 균주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 우세한 계절성 면역 프로파일을 가지고, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 가지되, 재조작된 HA 폴리펩티드는 더 대유행성이 되도록 변경된다. 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 우세한 대 유행성 면역 프로파일을 가지고, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 우세한 계절성 면역 프로파일을 가지되, 재조작된 HA 폴리펩티드는 더 계절성이 되도록 변경된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법으로서, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9에 도시된 것들로부터 선택된 하나 이상의 변형을 조작된 HA 폴리펩티드의 하나 이상의 상응 위치 내에 도입하여, 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 조작된 HA 폴리펩티드의 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 214, 244, 245, 및/또는 262(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 조작된 HA 폴리펩티드의 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 및/또는 214(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9에 도시된 것들로부터 선택된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9에 도시된 것들로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 10개의 연속 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법으로서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역을 선택하고, 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역을 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역으로 치환하는 단계;

(ii) 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역과 비교하여 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역에서 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위의 존재 여부를 확인하고, 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 도입하여 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하거나, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 서열에 기초하여 추가적인 N-결합된 글리코실화 부위를 조작된 HA 폴리펩티드에 삽입하는 단계; 및

(iii) 수용체 결합 부위(RBS)의 15 옹스트롬 이내에 (예: 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 옹스트롬 이내) 하나 이상의 아미노산을 도입하는 단계로서, RBS는 삼차원(3-D) 구조에서의 W167(CA09 넘버링)에 상응하는 위치의 15 옹스트롬 이내에 있는 모든 아미노산 잔기로서 정의되고, 하나 이상의 아미노산 치환 각각은 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 위치에서 관찰된 아미노산 잔기로 특정 위치에서의 아미노산 잔기를 교체하는 것을 포함하고, 대안적으로, RBS는 단클론 항체 CH65의 파라토프에 의해 결합된 에피토프로서 정의될 수 있고, 하나 이상의 아미노산 치환은 CH65의 에피토프에 인접하여 (예: 100 아미노산 잔기 이내, 75 아미노산 잔기 이내, 50 아미노산 잔기 이내, 40 아미노산 잔기 이내, 30 아미노산 잔기 이내, 25 아미노산 잔기 이내, 20 아미노산 잔기 이내, 15 아미노산 잔기 이내, 10 아미노산 잔기 이내, 5 아미노산 잔기 이내 등에서) 발생하는 것인, 단계; 및

(iv) 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9에 도시된 것들로부터 선택된 하나 이상의 변형을 조작된 HA 폴리펩티드의 하나 이상의 상응 위치에 도입하여,

변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성시키는 단계.

다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 재조작된 HA 폴리펩티드의 발현과 배좌를 평가하는 단계를 추가로 포함한다.

다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 재조작된 HA 폴리펩티드가 인플루엔자 바이러스의 계절성 및/또는 대유행성 균주에 대항하여 중화 항체를 유도하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성시키는 단계는 계절성 및/또는 대유행성 인플루엔자 바이러스에 대항하는 하나 이상의 항-헤드 단클론 항체의 결합을 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성시키는 단계는 계절성 및/또는 대유행성 인플루엔자 바이러스에 대항하는 항-헤드 단클론 항체의 결합 폭을 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성시키는 단계는 항-줄기 단클론 항체의 결합 폭을 증가시키는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에서, 헤드 영역에서의 변형은 항-줄기 단클론 항체에 대한 결합의 증가를 유도하여, 한 장소에서의 치환이 먼 위치에 대한 장거리 알로스테릭 효과(allosteric effects)를 나타낼 수 있다는 것을 입증한다. 일부 구현예에서, 결합의 증가는 포유류 세포의 표면에서 발현된 재조작된 HA 폴리펩티드에 결합된 단클론 항체를 유세포 분석으로 검출함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 포유류 세포의 표면에서 발현된 재조작된 HA 폴리펩티드에 결합된 단클론 항체의 레벨이 정량화된다.

본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, "또는(or)"은 "및/또는(and/or)"을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함(comprise)" 및 이 용어의 다양한 형태, 예컨대 "포함하는(comprising, comprises)" 등은 다른 다른 첨가물, 구성 요소, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은 동등하게 사용된다. 본 명세서에서, 약/대략과 함께 또는 약/대략이 없이 사용된 임의의 수치들은 당업자에게 이해되는 임의의 정상적인 변동을 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위에서 자명해진다. 하지만, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위가 본 발명의 구현예를 나타내지만, 이는 제한을 위해서가 아니라 단지 예시를 위해 주어지는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백해질 것이다.

도면은 단지 예시적인 목적이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 구형 헤드(globular head)가 절단된 특정 잔기 부위가 상이한, 3개의 상이한 영역을 도시한다.
도 2는 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 적절한 접힘, 발현, 및 항체 결합 능력을 입증하는 데 사용된 유세포 분석 검정의 개략도를 도시한다.
도 3은 인플루엔자 RBS의 구형 헤드 영역을 수혜자 HA 줄기 상에 이식하여 생성된 재조합 HA 폴리펩티드의 적절한 접힘 및 발현을 입증하는 유세포 분석 검정의 결과를 도시한다.
도 4는 인플루엔자 RBS의 구형 헤드 영역을 수혜자 HA 줄기 상에 이식하여 생성된 재조합 HA 폴리펩티드의 적절한 접힘 및 발현을 입증하는 유세포 분석 검정의 결과를 도시한다.
도 5는 인플루엔자 RBS의 구형 헤드 영역을 수혜자 HA 줄기 상에 이식하여 생성된 재조합 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭의 증가에 대한 수치적 표현을 도시한다.
도 6은 추정상 N-결합된 글리코실화 부위(보이는 순서대로 각각 서열번호 32-35), 리신 루프 삽입 부위(보이는 순서대로 각각 서열번호 36-37) 및 RBS 부위 근처에서 잔기의 변형에 대한 도해적 표현을 도시한다.
도 7은 추정상 N-결합된 글리코실화 부위, 리신 루프 삽입, 또는 구형 헤드 영역에서의 아미노산 잔기의 변형에 의해 생성된 재조합 HA 폴리펩티드의 적절한 접힘 및 발현을 입증하는 유세포 분석 검정 결과를 도시한다.
도 8은 추정상 N-결합된 글리코실화 부위, 리신 루프 삽입, 또는 구형 헤드 영역에서의 아미노산 잔기의 변형에 의해 생성된 재조합 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭의 증가를 입증하는 유세포 분석 검정 결과를 도시한다.
도 9는 재조합 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭을 변경시키도록 변형될 수 있는 구형 헤드 영역에서의 아미노산 잔기에 대한 도해적 표현을 도시한다.
도 10은 탈글리코실화된 작제물에 대한 4K8 결합의 증가로 입증된 재조합 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭의 증가를 입증하는 유세포 분석 검정 결과를 도시한다.
도 11은 면역화 및 후속하는 생체 내(in vivo) 평가를 위한 예시적인 일정표를 도시한다.
도 12는 원래 SMARtDO2a와 비교하여 차세대 DO2a 변형으로 면역화된 동물의 대표적인 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 도시한다.
도 13은 원래 SMARtDO2a와 비교하여 차세대 DO2a 변형으로 면역화된 동물의 대표적인 체중 감소 곡선을 도시한다.
도 14는 바이러스 접종 후 4일 차에 PBS와 비교하여 SMARtDO2a 작제물로 면역화된 동물의 대표적인 바이러스성 폐 역가(viral lung titers)를 도시한다.
도 15는 SMARtDO2a 작제물로 면역화된 동물 유래 혈청의 대표적인 혈구 응집 억제 (hemagglutination inhibition, HAI) 검정 결과를 도시한다.

정의

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의는 본 명세서를 통해 기재된다.

보조제(adjuvant): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보조제(adjuvant)"는 항원에 대한 면역 반응을 비특이적으로 강화시키는 물질 또는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 보조제는 항원이 흡착되는 미네랄(백반, 수산화 알루미늄, 또는 인산 알루미늄)의 현탁액; 또는 항원 용액이 광유에 유화된 기름 속의 물(예: MF59®)을 포함하며, 항원성을 더 강화하기 위해 가끔은 살해된 마이코박테리아(Freund의 완전 보조제)가 포함된다. 면역자극성 올리고뉴클레오티드(예: CpG 모티프를 포함하는 것들)가 보조제로서 사용될 수도 있다(예: 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 재6,239,116호; 재6,339,068호; 제6,406,705호; 및 제6,429,199호 참조). 보조제에는 생물학적 분자, 예컨대 TLR 리간드에 대한 공자극성 분자 등도 포함된다. 예시적인 생물학적 보조제는 IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L 및 41 BBL을 포함한다.

동물(animal): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 포유류(예: 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 동물은 유전자 도입 동물, 유전자 조작 동물 및/또는 클론일 수 있다.

항체(antibody): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 아미노산 서열을 갖는 B 림프구 세포에 의해 생성된 면역글루불린 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체는 특정 항원(면역원)에 의해 인간이나 다른 동물에서 유발된다. 항체는 일부 입증 가능한 방식으로 항원과 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하며, 항체와 항원은 서로에 관해서 각각 정의된다. 용어 "항체 반응 유도(eliciting an antibody response)", "중화 항체 유도(eliciting neutralizing antibody)", "면역원성 반응 유도(eliciting immunogenic response)", 또는 이들과 문법적으로 동등한 용어는 항체 또는 다른 분자가 항체의 생성을 유도하는 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "항체"는 HA 스크리닝 검정과 같은 체내 검정에 사용된 임의의 재조합 항체를 지칭하며, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 항체는 완전한 면역글로불린 또는 면역글로불린 분류의 단편, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 각각 존재할 수 있다. 예시적인 항체 단편은 F(ab)'2, Fab', 및 단쇄 Fv (scFv)를 포함하되 이에 한정되지 않는다.

항원(antigen): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원"은 면역 반응을 유도하는 제제; 및/또는 (ii) 유기체에 노출되거나 투여될 때 T 세포 수용체에 의해 (예를 들어, MHC 분자에 의해 제시될 때) 또는 항체(예: B 세포에 의해 생성된 항체)에 결합되는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원은 유기체에서 체액 반응(예: 항원 특이적 항체의 생성을 포함함)을 유도하며; 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 항원은 유기체에서 세포 반응(예: 항원과 특이적으로 반응하는 수용체를 가진 T 세포를 포함함)을 유도한다. 당업자는 특정 항원이 표적 유기체(예: 마우스, 토끼, 영장류, 인간) 중 하나 또는 여러 구성원에서 면역 반응을 유도할 수 있지만, 표적 유기체 종의 모든 구성원에 대해서는 그러지 않는다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 항원은 표적 유기체 종의 구성원 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%에서 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원은 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합되며, 유기체에서 특정 생리적 반응을 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항원은 이러한 상호 작용이 체내에서(in vivo) 발생하는지 여부와 상관없이 시험관 내에서(in vitro) 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 이종 면역원에 의해 유도된 것들을 포함하는 특정 체액성 또는 세포성 면역력 생성물과 반응한다. 개시된 조성물 및 방법에 대한 일부 구현예에서, 인플루엔자 HA 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편은 항원이다.

대략(approximately ): 본원에서 사용되는 바, 용어 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 진술되거나 달리 내용으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 말한다.

생물학적 활성(biological activity): 본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 활성(biological activity)"은 관심 제제 또는 관심 개체에 의해 달성된 관찰 가능한 생물학적 효과 또는 결과를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 특정 결합 상호 작용은 생물학적 활성이다. 일부 구현예에서, 생물학적 경로 또는 사건의 조절(예: 유도, 강화, 또는 억제)은 생물학적 활성이다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성의 존재 또는 범위는 관심 생물학적 경로 또는 사건에 의해 생성된 직접 또는 간접 생성물의 검출을 통해 평가된다. 일부 구현예에서, HA 폴리펩티드의 생물학적 활성은 중화 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드의 능력을 지칭한다. 이들 경우에, 용어 "생물학적 활성"은 "면역원성 활성(immunogenic activity)"과 상호 교환 가능하게 사용된다.

캘리포니아 09 넘버링 (California 09 numbering): 본원에서 사용되는 바와 같이, "캘리포니아 09 넘버링" 또는 "CA09 넘버링"이란 말은, 대상 서열(예: A/캘리포니아/07/2009 (H1N1)의 폴리펩티드 서열)에 대한 쿼리 서열(예: 본원에 기술된 변형 중 하나 이상이 적용되었거나 적용될 쿼리 서열)의 비교를 허용하여, 동일한 위치의 A/캘리포니아/07/2009 (H1N1)에 상응하고, 따라서 A/캘리포니아/07/2009 (H1N1)에 대해 유사하게 정규화된 다른 모든 생물학적 서열에 상응하는 표적 서열 내의 아미노산 잔기를 동정하는 정규화된 생물학적 서열 배열을 지칭한다. 일반적으로, 표적 서열 및 쿼리 서열은 특징부 또는 특징을 공유하지만, 길이 및/또는 서열 동일성에 있어서 약간 상이하다. 예를 들어, 특정 표적 서열에서의 잔기 또는 표적 변형에 대한 잔기의 넘버링은 A/캘리포니아/07/2009 (H1N1) 단백질 서열에 기초하여 동정되고 기술될 수 있다. 서열은 A/캘리포니아/07/2009 (NCBI 수탁 번호: ACP44189, NCBI gi 번호: 227977172, 566 아미노산)의 전장 (신호 펩티드, 막관통 도메인 및 세포질 테일 도메인 포함) 단백질 서열과 정렬된다. 신호 펩티드의 N-말단 메티오닌은 잔기 1이다.

담체 (carrier): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "담체(carrier)"는 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 일부 예시적인 구현예에서, 담체는 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일을 포함하는, 예를 들어, 물 및 오일과 같은 멸균 액체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 하나 이상의 고체 성분이거나 이를 포함한다.

특징부 또는 특징(characteristic portion or feature): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특징부(characteristic portion)" 또는 "특징(characteristic feature)"은 가장 넓은 의미로는, 물질의 존재(부재)가 물질의 특정 특징, 속성 또는 활성의 존재(또는 부재)와 상관되는 것인 물질의 일부를 지칭하도록 사용된다. 일부 구현예에서, 물질의 특징부 또는 특징은, 특정 특징, 속성 또는 활성을 공유하는 물질 및 관련 물질들에서 발견되지만 특정 특징, 속성 또는 활성을 공유하지 않는 것들에서는 발견되지 않는 부분 또는 특징이다. 예를 들어, 용어 "특징적인 대유행성 특징"은 적어도 하나의 기준 대유행성 균주에서 발견되고 적어도 하나의 비유행성 균주에서는 발견되지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 특징적인 대유행성 특징은 대유행성 균주에서 공통적으로 발견되고 비유행성 균주에서는 드물게 발견되는 것이다. 마찬가지로, 용어 "특징적인 계절성 특징"은 적어도 하나의 기준 계절성 균주에서 발견되고 적어도 하나의 비계절성 균주에서는 발견되지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 특징적인 계절성 특징은 계절성 균주에서 공통적으로 발견되고 비계절성 균주에서는 드물게 발견되는 것이다. 일부 구현예에서, 특징부 또는 특징은 중합체에서 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산에서) 발견되고 해당 중합체의 특징부를 나타내는 서열 요소를 지칭하는 "특징적 서열 요소"이다. 일부 구현예에서, 특징적 서열 요소의 존재는 중합체의 존재 또는 특정 활성의 레벨, 또는 속성과 상관된다. 일부 구현예에서, 특징적인 서열 요소의 존재(또는 부재)는 특정 중합체를 이러한 중합체(예: 대유행성 또는 계절성)의 특정 계열이나 군의 구성원(또는 비구성원)으로서 정의한다. 특징적인 서열 요소는 적어도 두 개의 모노머(예: 아미노산 또는 뉴클레오티드)를 일반적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 특징적인 서열 요소는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 이상의 모노머(예: 인접하게 연결된 모노머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 특징적인 서열 요소는, 길이가 서열 요소를 공유하는 중합체에 걸쳐 변하거나 변하지 않을 수 있는 하나 이상의 스페이서 영역에 의해 이격된 연속 모노머의 적어도 제1 및 제2 스트레치(stretch)를 포함한다. 일부 구현예에서, 특징적 서열 요소는 하나 이상의 추정상 글리코실화 부위의 존재 또는 부재를 포함한다.

컴퓨터에 의해 최적화된 광범위 반응 항원 기술(Computationally Optimized Broadly Reactive Antigens (COBRA) Technology): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "컴퓨터에 의해 최적화된 광범위 반응 항원" 또는 "COBRA" 기술은, 예를 들어, 등록전 출원 공개(pre-grant patent publications) 제WO2012/036993호, 제U.S. 2015/0030628호, 제WO2013/119683호, 제WO2013/148164호, 제WO2014/085616호, 및 제WO2013/122827호에 기술된 바와 같은 조작된 재조합 인플루엔자 HA 항원을 설계하는 방법론과 방법, 및 이의 생성 화합물을 지칭한다. 이들 출원은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.

상응하는(corresponding to): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상응하는(corresponding to)"은 종종 관심 폴리펩티드(예: HA 폴리펩티드)의 아미노산 잔기의 위치/동일성을 지정하는 데 사용된다. 당업자는, 간략화를 위해, 폴리펩티드 내의 잔기가 종종 기준 관련된 폴리펩티드에 기초한 정규 넘버링 체계를 사용해 지정되므로, 가령 위치 190에서의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 특정 아미노산 사슬에서 실제로 190번째 아미노산일 필요가 없고, 오히려 기준 폴리펩티드의 190에서 발견된 잔기에 상응한다는 것을 이해할 것이며; 당업자는, 예를 들어, 다양한 서열 정렬 도구를 사용해 "상응하는" 아미노산을 동정하는 방법을 쉽게 이해할 것이다.

조작된(engineered): 용어 "조작된(engineered)"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 당업자에 의해 설계된 아미노산 서열을 가지고/가지거나 존재 여부와 생성에는 당업자의 작용("수작업")이 요구되는 폴리펩티드를 설명한다. 예를 들어, 조작된 HA 폴리펩티드는 천연 인플루엔자 분리주(isolates)에서 발견되는 HA 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드는 NCBI 데이터베이스에 포함된 HA 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는다.

에피토프 ( epitope ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프(epitope)"는 전체적으로 또는 부분적으로 면역글로불린(예: 항체 또는 수용체) 결합 구성 요소에 의해 특이적으로 인식되는 임의의 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 복수의 화학 원자 또는 항원의 기로 이루어진다. 일부 구현예에서, 이러한 화학 원자 또는 기는 항원이 적절한 삼차원 배좌를 채택할 때 표면-노출된다. 일부 구현예에서, 이러한 화학 원자 또는 기는 항원이 이러한 배좌를 채택할 때 공간에서 물리적으로 서로 가깝다. 일부 구현예에서, 적어도 일부의 이러한 화학 원자 및 기는 항원이 대안적인 배좌를 채택할 때 (예를 들어, 선형화될 때) 물리적으로 서로 이격된다.

부형제( excipient): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제(excipient)"는, 예를 들어 원하는 지속 효과 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 비-치료적 제제를 지칭한다. 적절한 약제학적 부형제는, 예를 들어, 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 운모, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올 등을 포함한다.

헤드 영역(head region): 본원에서 사용되는 바와 같이, "헤드 영역"은 조작되거나 야생형인 HA 폴리펩티드의 아미노산 잔기 59~292(CA09 넘버링)로 둘러싸인 세그먼트를 지칭한다. 형태학적으로, 헤드 영역은 HA의 구형(globular shaped) 도메인으로서 정의될 수 있다.

헤마글루티닌 (HA) 폴리펩티드: 본원에서 사용되는 바와 같이, "헤마글루티닌 폴리펩티드 또는 HA 폴리펩티드"는, HA의 적어도 하나의 특징적 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 지칭한다. 인플루엔자 분리주 유래의 매우 다양한 HA 서열이 당업계에 알려져 있는데; 실제로, 미국 국립 생물공학 정보센터(NCBI)는, 본 출원의 출원 시점에, 인플루엔자 A(아형 H1N1) 유래의 적어도 15,491 개의 완전한 HA 폴리펩티드가 포함된 데이터베이스(이 중 6,974 개는 유일한 것임)를 유지하고 있다. 당업자는 이러한 데이터베이스를 참조하여, 일반적인 HA 폴리펩티드 및/또는 특정 HA 폴리펩티드(예: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16 폴리펩티드; 또는, 조류, 낙타, 개, 고양이, 사향 고양이, 환경, 말, 인간, 표범, 밍크, 마우스, 바다표범, 돌 흰털발제비(stone martin), 돼지, 호랑이, 고래 등과 같은 특정 숙주의 감염을 매개하는 HA)의 특징인 서열을 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, HA 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 천연 분리주에서 발견되는 HA 단백질의 잔기 약 97와 약 185 사이, 약 324와 약 340 사이, 약 96과 약 100 사이, 및/또는 약 130과 약 230 사이에서 발견되는 하나 이상의 특징적 서열 요소를 포함한다.

H1N1 HA 폴리펩티드: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "H1N1 HA 폴리펩티드"는, H1N1의 특성인 적어도 하나의 서열 요소를 포함하고 H1N1을 다른 HA 아형으로부터 구별하는 아미노산 서열을 가진 HA 폴리펩티드이다. 대표적인 이러한 서열 요소는 당업자가 이해할 수 있는 정렬에 의해 결정될 수 있다.

숙주(host): 용어 "숙주(host)"는 관심 폴리펩티드가 존재하는 시스템(예: 세포, 유기체 등)을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주는 특정 감염원에 쉽게 감염될 수 있는 시스템이다. 일부 구현예에서, 숙주는 특정 관심 폴리펩티드를 발현하는 시스템이다.

숙주 세포(host cell): 본원에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포(host cell)"이라는 용어는 외인성 DNA가 (재조합에 의하거나 달리) 도입된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포는 표준 재조합 기술에 의해 본원에 기술된 조작된 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩티드를 생성하도록 사용될 수 있다. 본 개시에 관한 당업자는 이러한 용어들이 특정 대상 세포만을 지칭하는 것이 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 특정 변형은 돌연변이나 환경적 영향에 의해 이어지는 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 외인성 DNA (예: 재조합 핵산 서열)을 발현하기에 적절한 원핵(prokaryotic cells) 및 진핵(eukaryotic) 세포를 포함한다. 예시적인 세포는, 원핵 및 진핵 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예: 대장균의 균주, 바실러스 종, 스트렙토마이세스 종 등), 마이코박테리아 세포, 균류 세포, 효모 세포(예: S. 세레비시아, S. 폼베, P. 파스토리스 등), 식물 세포, 곤충 세포(예: SF-9, SF-21, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포(baculovirus-infected insect cells), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는, 예를 들어, 하이브리도마(hybridomas) 또는 쿼드로마(quadromas)와 같은 세포 융합을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트, 또는 마우스의 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포이며, 다음의 세포로부터 선택된다: CHO (예, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예, COS-7), 망막 세포, 베로, CV1, 신장 (예, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예, BHK21), 저캇, 다우디, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 앞에 언급된 세포로부터 유도된 세포주. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 유전자(예, a PER.C6?? 세포)를 발현하는 망막 세포와 같은 하나 이상의 바이러스 세포를 포함한다.

면역 반응(immune response): 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역 반응(immune response)"은 면역 시스템의 세포, 예컨대, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식 세포, 또는 폴리모포뉴클레오사이테(polymorphonucleocyte) 등의 자극(예: 항원 또는 백신)에 대한 반응을 지칭한다. 면역 반응은, 예를 들어, 인터페론이나 사이토카인을 분비하는 상피 세포를 비롯하여, 숙주 방어 반응에 관여하는 신체의 임의의 세포를 포함할 수 있다. 면역 반응은 선천성 및/또는 적응성 면역 반응을 포함하되, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 보호 면역 반응은 대상을 감염으로부터 보호하는 (감염을 예방하거나 감염과 관련된 질환의 발병을 예방하는) 면역 반응을 지칭한다. 면역 반응의 측정 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 림프구(예: B 세포 또는 T 세포)의 확산 및/또는 활성, 사이토카인 또는 케모카인의 분비, 염증, 및 항체 생성 등을 측정하는 단계를 포함한다.

면역원( immunogen): 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역원(immunogen)"은 적절한 조건 하에서 항체의 생성, 또는 동물에서의 T 세포 반응과 같은 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질을 지칭하며, 동물 내에 주입되거나 흡수되는 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역원성 조성물(immunogenic composition)"은 면역원(예: HA 폴리펩티드)을 포함하는 조성물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역화(immunize)"는, 예를 들어 백신 접종에 의해 감염성 질환으로부터 보호된 대상을 제공하는 것을 의미한다.

생체외 (in vitro): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체외(in vitro)"는 다세포 유기체 내가 아니라 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.

생체내 (in vivo ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체내(in vivo)"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 생체외 시스템에 반대되는) 활세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스(Influenza virus): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인플루엔자 바이러스(influenza virus)"는 오르토믹소바이러스과에 속하는 세그먼트화된 음성-가닥 RNA 바이러스를 지칭한다.

인플루엔자 백신(influenza vaccine): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인플루엔자 백신(influenza vaccine)"은 면역 반응을 자극할 수 있고, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방, 완화, 또는 치료를 위해 투여되는 면역원성 조성물을 지칭한다. 인플루엔자 백신은, 예를 들어, 약독화되었거나 살해된 (예: 분열된) 인플루엔자 바이러스, 유사 바이러스 입자(VLP) 및/또는 항원성 폴리펩티드(예: 본원에서 기술된 조작된 헤마글루티닌) 또는 이들로부터 유래된 DNA, 또는 이러한 면역원성 재료의 임의의 재조합 버전을 포함할 수 있다.

단리된 (isolated): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된(isolated)"은 (i) 최초 생성시에 (천연 또는 실험 환경과 무관함) 결합되었던 성분의 적어도 일부로부터 분리되었거나; (ii) 사람의 손에 의해 생성된 제제 또는 개체를 지칭한다. 단리된 제제 또는 개체는 이들이 최초로 결합되었던 다른 성분의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 보다 더 순수하다.

발병(outbreak): 본원에서 사용되는 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 "발병(outbreak)"은 특정 해에 단일 국가 내로부터의 바이러스 분리주가 집합적으로 나타나는 것을 지칭한다.

대유행성 또는 계절성 균주(pandemic or seasonal strain): "대유행성" 인플루엔자 균주는 인간 개체군에 대한 대유행성 감염을 일으켰거나 일으킬 수 있는 능력을 가진 것이다. 일부 경우에, 대유행성은 새로운 바이러스가 인간 개체군 중에서 나타나거나 "출현(emerge)"할 때 발생하는 질환의 세계적 발병으로, 심각한 질병을 발생시킨 다음, 세계적으로 사람 대 사람의 경로로 쉽게 전파시킨다. 일반적으로, 대유행성 균주는 2009년부터 현재까지 이어져 있으며, A/캘리포니아/07/2009와 항원적으로 유사한 유전 서열의 단일 클러스터를 형성한다. 보다 일반적으로, 대유행성 균주는 조류 (또는 돼지) 기원의 신규한 HA를 가진 바이러스를 생성하는 조류 (또는 돼지) 인플루엔자 바이러스(인간에게는 대항 면역력이 없음)와 인간 바이러스 간의 재편성(대략 20~30년 주기로 발생하는 항원 변이)에 기인하는 것들을 포함한다. 달리 말해, 인간 개체군은 사전에 백신을 접종하거나 사전에 노출시키더라도 저항력이 없거나 거의 없는, 미처리 상태인 것으로 간주된다. 대유행성 및 계절성 균주는 항원적으로 구별되며 서열에 따라 매우 상이하다. 일반적으로, 계절성 인플루엔자 균주는 1986에서 2009(대유행성이 아닌 2009 서열을 포함함)까지의 순환 균주 및 항원 영역을 암호화하는 실질적으로 유사한 유전 서열인 기타 균주(항원 서열 공간이 유사함)로서 정의될 수 있다. 예시적인 대유행성 균주는 A/캘리포니아/07/2009, A/캘리포니아/04/2009, A/벨지움/145/2009, A/사우스캐롤라이나/01/1918 및 A/뉴저지/1976를 포함한다. 대유행성의 아형은, 특히, H5N1, H2N2, H9N2, H7N7, H7N3, H7N9 및 H10N7 아형을 포함한다. 예시적인 계절성 균주는 A/텍사스/36/1991, A/싱가폴/1986, A/뉴칼레도니아/20/1999, A/솔로몬제도/03/2006, 및 A/브리즈번/59/2007 및 A/위스콘신/67/2005을 포함한다.

예방(prevention ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방(prevention)"는 예방, 질병 발현의 회피, 발병 지연, 및/또는 특정 질환, 장애 또는 병태(예: 가령, 인플루엔자 바이러스의 감염)의 하나 이상의 증상의 빈도 및/또는 중증도에 있어서의 감소를 의미한다. 일부 구현예에서, 예방의 평가는 질환, 장애, 또는 병태에 걸리기 쉬운 개체군에서 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 전개, 빈도 및/또는 중증도에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우, 제제가 특정 질환, 장애 또는 병태를 "예방"하는 것으로 간주되도록, 개체군에 기초하여 수행된다.

수용체 결합 부위( RBS ): 본원에서 사용되는 바와 같이, "수용체 결합 부위(receptor-binding site 또는 RBS)"는 인플루엔자 HA 폴리펩티드 헤드 영역의 인접 또는 비-인접 아미노산 잔기를 포함하는데, 이에는 표적 세포 수용체 단백질 상에서 시알산(sialic acids)의 직접 결합에 관여하는 아미노산이 포함된다. 수용체 결합을 담당하는 HA 영역은 HA 트라이머의 각 모노머의 막-원위 팁(membrane-distal tip)에 상주하며, 몇 가지 주요 구조적 특징을 갖는다. 예를 들어, 결합 부위는 시알산 또는 글리칸 사슬(glycan chain)의 내부 당과 상호 작용하는 아미노산을 함유하는 "220 및 130 루프"가 측면에 위치한다. 상기 부위의 막-원위 영역은 시알산(잔기 194) 또는 수용체 상의 내부 글리칸(대략 잔기 190 및 193)에서 수용체와 접촉할 가능성이 있는 잔기를 포함하는 190 나선에 의해 형성된다. 상기 부위의 염기는 광범위 수소 결합 네트워크를 형성하는 몇 개의 고도로 보존된 잔기를 함유한다. 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 "수용체 결합 부위" 또는 "RBS"를 구성하는 아미노산 잔기는, 시알산 유사체와 복합체를 형성한 HA 폴리펩티드의 삼차원 결정 구조 및 상기 유사체의 특정 근위 내에 아미노산 잔기를 동정하여 기술되거나, 특정 바이러스 균주(예: A/뉴칼레도니아/20/99 또는A/캘리포니아/07/2009) 유래의 HA 폴리펩티드를 참조하여 기술될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 HA 폴리펩티드의 "수용체 결합 부위" 또는 "RBS"는 기준 HA 폴리펩티드 서열을 사용해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 HA 폴리펩티드의 "수용체 결합 부위" 또는 "RBS"는 인간과 조류 수용체의 유사체(예: LSTa, LSTc)와 복합된 HA 폴리펩티드 서열의 결정 구조를 사용해 결정될 수 있다. LSTc와 복합된 HA 폴리펩티드 서열의 예시적인 기준 결정 구조는 A/푸에르토리코/8/1934 (H1N1) pdb|1RVZ를 포함한다. 일부 구현예에서, RBS는 광범위한 중화 단클론 항체 CH65에 의해 결합된 에피토프로서 정의될 수 있다(예: Whittle JR 등의 Broadly neutralizing human antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:14216-21 참조). 대안적으로 또는 추가적으로, RBS는 위치 167(CA09 09 넘버링)에 상응하는, 범용적으로 보존된 트립토판의 15 옹스트롬 이내에 있는 모든 아미노산 잔기를 포함하는 영역으로서 정의될 수 있다(예: Xu, R 등의 Nat Struct Mol Biol. 2013 Mar;20(3):363-70 참조).

재조합(recombinant): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합(recombinant)"은 재조합 수단에 의해 설계되거나, 조작되거나, 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 폴리펩티드(예: 본원에 기술된 바와 같은 HA 폴리펩티드), 예컨대, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용해 발현된 폴리펩티드, 재조합체로부터 단리된 폴리펩티드, 조합 폴리펩티드 라이브러리, 또는 선택된 서열 요소를 서로 접합시키는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 폴리펩티드를 지칭하도록 의도된다. 일부 구현예에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 구현예에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 가상 환경에서(in silico)에서 설계된다. 일부 구현예에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 알려진 서열 요소(예: 천연 공급원 또는 합성 공급원 유래)의 돌연변이 유발(예: 체내 또는 체외)에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는 동일 폴리펩티드 내에 자연적으로 존재하지 않는 다수의 (예: 2개 이상의) 알려진 서열 요소의 (예: 2 개의 별도 HA 폴리펩티드 유래의 2 개의 에피토프의) 조합으로부터 생성된다.

재조합 인플루엔자 백신(recombinant influenza vaccine): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 인플루엔자 백신(recombinant influenza vaccine)"은 본원에 기술된 조작된 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하는 인플루엔자-특이적 면역원성 조성물을 지칭하며, 인플루엔자 바이러스, 이의 아형 제조물, 유사 바이러스 입자, 재조합 단백질 (다양한 순도로 정제된 재조합 HA로 이루어진 제조물), 및 DNA-기반 및 바이러스 벡터-기반 백신을 포함하되 이들로 한정되지 않는다. 본원에 기술된 바와 같은 재조합 인플루엔자 백신은 하나 이상의 보조제를 임의적으로 함유할 수 있다.

재조합 헤마글루티닌 폴리펩티드(recombinant hemagglutinin polypeptide): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 헤마글루티닌(HA) 폴리펩티드"는 임의의 변형된 헤마글루티닌 폴리펩티드를 지칭한다. 특히, 상기 용어는 더 변형되거나 조작된 헤마글루티닌 폴리펩티드를 지칭한다.

특이성( specificy ): 당업계에 공지된 바와 같이, "특이성(specificity)"은 특정 리간드(예: 항체, HA 폴리펩티드 등) 가 그의 결합 파트너(예: 항원, 인간 HA 수용체, 및 특히 인간 상부 기도 HA 수용체)를 다른 잠재적 결합 파트너(예: 조류 HA 수용체)로부터 구별하는 능력의 척도이다.

줄기 영역(stem Region): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "줄기 영역(stem region 또는 stalk region)"은 대략 아미노산 잔기 18~58 및 293~519(CA09 넘버링)를 포함하는, 조작되거나 야생형 HA 폴리펩티드의 불연속 영역을 지칭할 수 있다. 형태학적으로, 줄기 영역은 구형 헤드로부터 출현하는 세장형 도메인으로서 정의될 수 있다.

대상(subject): 본원에서 사용되는 바와 같이, "대상(subject)"은 인간을 포함하는 임의의 포유동물을 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 대상은 성인, 청소년, 어린이, 또는 영아이다. 일부 구현예에서는, 용어 "개체(individual)" 또는 "환자(patient)"가 사용되며, 이는 "대상"과 상호 교환 가능하도록 의도된다. 또한, 본 발명에 의해 약제학적 조성물들의 투여 및/또는 자궁내(in-utero) 치료 방법의 실행이 고려된다.

실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심 특징 또는 속성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정질적인(qualititave) 상태를 말한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/되거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전함의 잠재적 결핍을 담아내는 데 사용된다.

실질적으로 유사한(substantially similar): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 유사한(substantially similar)"은 두 개체 간의 비교를 지칭한다. 일반적으로, 개체가 충분한 구조적 유사성(예: 특징적 구조적 특징)을 공유하고, 개체가 하나 이상의 추가 속성이나 특징을 공유할 가능성이 비슷할 때, 개체는 서로 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 단지 하나의 예시로서, 예를 들어, 2 가지 인플루엔자 균주 사이에서 특성(예: 글리코실화 부위 패턴)이 동일하거나 충분히 유사하면, 각 균주의에 의한 인간 대유행성 위험이 동일하다.

실질적인 서열 상동성 (substantial sequence homology): 용어구 "실질적인 상동성(substantial homology)"은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열이 상응 위치에서 상동성 잔기를 포함하는 경우, 이들은 "실질적으로 상동성(substantially homologous)"인 것으로 간주된다. 상동인 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안으로, 상동인 잔기는 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 비-동일 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 전형적으로 특정 아미노산들은 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄들을 가지는 것으로서 분류된다. 　 하나의 아미노산을 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동성" 치환이라고 간주될 수 있다. 일반적인 아미노산 분류는 표 1 및 2에 요약되어 있다.

[표 1]

[표 2]

당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN, 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭(gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 예시적인 프로그램들은 Altschul, 등의 Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, 등의 Methods in Enzymology; Altschul, 등의 "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, 등의 Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener, 등의 (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있고, 이의 전술한 모든 내용은 본원에 참조로서 통합된다. 상동 서열을 동정하는 것에 추가하여, 상기 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성의 정도 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 두 개의 서열은 이들의 상응 잔기의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 이상이 잔기의 관련 신장부(stretch)에 걸쳐 상동인 경우 실질적으로 상동인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 신장부는 전체 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 신장부는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 325, 적어도 350, 적어도 375, 적어도 400, 적어도 425, 적어도 450, 적어도 475, 적어도 500 개 이상의 잔기이다.

실질적인 동일성(Substantial identity): 용어 "실질적인 동일성(substantial identity)" 또는 "실질적으로 동일한(substantially identical)"은 아미노산 서열들 또는 핵산 서열들 간의 비교를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 당업자라면 인정할 것으로, 두 개의 서열은 그들의 해당하는 위치에서 동일한 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 동일한(substantially identical)" 것으로 간주된다. 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 예시적인 프로그램들은 Altschul, 등의 Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, 등의 Methods in Enzymology; Altschul 등의 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 등의 Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley , 1998; 및 Misener , 등의(eds.), Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 동일한 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 동일성의 정도 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 두 개의 서열은 잔기들의 적절한 연장길이에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 동일한 경우라면 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 신장부는 전체 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 신장부는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개 이상의 잔기이다. HA 폴리펩티드의 맥락에서 "실질적인 동일성"에 대해서 언급하는 것은, HA 폴리펩티드(또는 HA 에피토프)가 기준 HA 폴리펩티드(또는 HA 에피토프)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가진다는 것을 일반적으로 지칭한다.

백신 접종(vaccination): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "백신 접종(vaccination 또는 vaccinate)"은 면역 반응을 생성하도록 의도된 조성물, 예를 들어 질환 유발 제제를 투여하는 것을 지칭한다. 백신 접종은 질환 유발 제제 및/또는 하나 이상의 증상의 전개에 노출시키기 전, 도중, 및/또는 후에 투여될 수 있고, 일부 구현예에서는, 상기 제제에 노출되기 전, 도중 및/또는 직후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신 접종에는 백신화 조성물의 다중 투여, 시간적으로 적절히 이격된 투여가 포함된다.

바이러스-유사 입자(Virus-like particle (VLP)): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스-유사 입자(virus-like particle 또는 VLP)"는, 바이러스 유전 물질이 없어서 감염성은 없지만 바이러스와 닮은 입자를 지칭한다. "바이러스-유사 분자" 또는 "VLP"는 이종 발현에 의해 포유류 세포주, 곤충 세포주, 효모, 및 식물 세포를 포함하는 다양한 세포의 배양 시스템에서 생성된다. 또한, VLP는 당업계에 알려진 방법에 의해 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 헤마글루티닌 (HA) 폴리펩티드 및 뉴라미니다아제 (NA) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 HA 폴리펩티드, NA 폴리펩티드 및/또는 바이러스 구조 폴리펩티드(예: 인플루엔자 M1과 같은 인플루엔자 구조 단백질)를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 HA 폴리펩티드, NA 폴리펩티드 및/또는 M1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 HA 폴리펩티드, NA 폴리펩티드 및/또는 HIVgag 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 본원에 예시된 것들에 대한 대안으로서 다른 바이러스 구조 단백질이 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 인플루엔자 VLP는 HA 및 NA 단백질, 및 선택적으로는 HIV gag 단백질로 숙주 세포(예: 포유류 세포)를 형질감염시켜 생성할 수 있다. 단백질이 발현될 수 있는 적당한 시간 동안 (예를 들어, 대략 72 시간 동안) 형질감염된 세포를 배양한 뒤, VLP를 세포 배양 상층액으로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 포유류 세포(예: 인간 세포) 내에서의 일시적 형질감염에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 VLP는 하나 이상의 검정 방법을 사용해 분석된다. 몇 가지 예를 들자면, 인플루엔자 VLP는 단백질 염색에 의해 헤마글루티닌 활성, 동적 광 산란, 및 헤마글루티닌 함량 정량화에 대해 분석될 수 있다. 다른 검정 방법들은 본 개시를 검토하는 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다.

야생형(wild type): 당업계에서 이해되는 바와 같이, 용어 "야생형(wild type)"은 자연에서 발견되는 정상적인 형태의 단백질 또는 핵산을 일반적으로 지칭한다. 예를 들어, 야생형 HA 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 천연 분리주(natural isolates)에서 발견된다. 다양한 상이한 야생형 HA 서열은 World Wide Web을 통해 ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU에서 이용할 수 있는 NCBI 인플루엔자 바이러스 서열 데이터베이스에서 확인할 수 있다.

특정 구현예의 상세한 설명

본 발명은, 무엇보다도, 면역 프로파일을 변경시키고 다양한 인플루엔자 균주에 대한 교차 반응성을 증가시키기 위해, 조작된 HA 폴리펩티드를 변형시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 구현예들은, 대유행성 균주를 커버하도록 계절성 반응 프로파일을 확장시키기 위해 HA 폴리펩티드를 조작하는 다양한 전략을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 전략은, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드에서 유래된 서열에 기초한 숙주 HA 폴리펩티드의 수용체 결합 부위(RBS) 근처에 변형을 도입하도록 설계된다. 유사한 전략이 사용되어, 계절성 균주를 커버하도록 대유행성 반응 프로파일을 확장시킬 수 있다.

HA 폴리펩티드는 특정 면역원성 반응 프로파일을 유도하도록 조작될 수 있다. 즉, 조작된 HA 폴리펩티드를 생성하는 데 사용되는 다양한 설계 전략은, 대유행성으로 순환하는 계절성 (유행성) 인플루엔자 균주 및/또는 과거의 또는 대유행성 인플루엔자 균주에 대항하여 유의한 면역 반응(예: 중화 항체 반응)을 유도하는 HA 폴리펩티드를 생성하도록 선택되거나, 만들어질 수 있다. 따라서, 용어 "계절성 반응 프로파일(seasonal response profile)"은 대유행성 인플루엔자 균주보다는 더 계절성인 인플루엔자 균주에 대항해 교차 중화 항체를 생성하는 재조합 HA 폴리펩티드를 기술하도록 사용될 수 있다. 일반적으로, 계절성 인플루엔자 균주는 1986에서 2009(대유행성이 아닌 2009 서열을 포함함)까지의 순환 균주 및 항원 영역을 암호화하는 실질적으로 유사한 유전 서열인 기타 균주(항원 서열 공간이 유사함)로서 정의될 수 있다. 특이적 예시에는 A/뉴칼레도니아/20/1999, 및 A/위스콘신/67/2005이 포함된다. 따라서, 용어 "계절성 반응 프로파일"은 하나 이상의 계절성인 인플루엔자 균주에 대항하지만 표준 대유행성 인플루엔자 균주 A/캘리포니아/07/2009에 대항하지 않는 교차 중화 항체를 생성하는 재조합 HA 폴리펩티드를 기술하도록 사용될 수 있다. 마찬가지로, 용어 "대유행성 반응 프로파일(pandemic response profile)"은 계절성 인플루엔자 균주보다는 더 대유행성인 인플루엔자 균주에 대항해 교차 중화 항체를 생성하는 재조합 HA 폴리펩티드를 기술하도록 사용될 수 있고; "대유행성 면역 프로파일"은 하나 이상의 대유행성인 인플루엔자 균주에 대항하지만 표준 계절성 균주 A/뉴칼레도니아/20/1999에 대항하지 않는 교차 중화 항체를 생성하는 재조합 HA 폴리펩티드를 기술하도록 사용될 수도 있다. 일반적으로, 대유행성 균주는 2009년부터 현재까지 이어져 있으며, A/캘리포니아/07/2009와 항원적으로 유사한 서열의 단일 클러스터를 형성한다. 보다 일반적으로, 대유행성 균주는 조류 (또는 돼지) 기원의 신규한 HA를 가진 바이러스를 생성하는 조류 (또는 돼지) 인플루엔자 바이러스(인간에게는 대항 면역력이 없음)와 인간 바이러스 간의 재편성(대략 20~30년 주기로 발생하는 항원 변이)에 기인하는 것들을 포함한다. 달리 말해, 인간 개체군은 사전에 백신을 접종하거나 사전에 노출시키더라도 저항력이 없거나 거의 없는, 미처리 상태인 것으로 간주된다. 따라서, 대유행성 균주는, 서열 및 항원 거리에 의해 캘리포니아 2009 클러스터의 서열로부터 구별되는 A/사우스캐롤라이나/01/1918 및 A/뉴저지/1976을 포함한다. 대유행성의 아형은, 특히, H5N1, H2N2, H9N2, H7N7, H7N3, H7N9 및 H10N7 아형을 포함한다.

본원에 기술된 변형은, 조작된 HA 폴리펩티드가 재조작되어 계절성 균주에 대해서만 대항하여 항체를 유도하거나(또는 개선된 계절성 항체 반응이나 더 항-계절성인 항체 반응을 입증하거나), 대유행성 균주에 대해서만 대항하여 항체를 유도하도록(또는 개선된 대유행성 항체 반응이나 더 항-대유행성인 항체 반응을 입증하도록) 면역원성 프로파일을 더 맞춤화하거나 최적화하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 이들 변형은 면역 프로파일을 항원적으로 구별되는 균주의 서열 (또는 클레이드) 클러스터에 걸쳐 확장시킨다. 이들은, 조작된 재조합 HA 분자가 항원 변이에 기인하는 새로운 대유행성 균주에 대항하여 면역 반응을 유도하도록 (즉, 장기간에 걸쳐 유전 서열 공간에서 멀리 떨어져 있는, 항원적으로 구별되는 균주가 변형에 의해 커버되도록), 조작된 재조합 HA 분자에 적용될 수 있다. 이들은, 조작된 HA 폴리펩티드가 항원 변이된 순환 계절성 균주에 대항해 면역 반응(예: 개선된 계절성 반응)을 유도함으로써 지속적인 효과를 나타내도록, 비교적 짧은 기간에 걸쳐 발생하는 유전적 변화를 다루는 데 적용될 수도 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 변형은: (1) 대유행성-유사 조작된 HA 폴리펩티드(대유행성 반응 프로파일)의 커버리지(중화 면역 반응을 유도하는 능력)를 하나 이상의 계절성 균주(더 계절성인 면역 프로파일)까지 확장시키고; (2) 계절성-유사 조작된 HA 폴리펩티드의 커버리지를 (항원 변이를 다루기 위해) 임의의 대유행성 균주까지 확장시키고; 및 (3) 계절성-유사 HA 폴리펩티드의 커버리지를 임의의 다른 항원적으로 구별되는 계절성 균주(항원 변이를 다루는 개선된 계절성 면역 프로파일)까지 확장시키도록 사용될 수 있다.

본 발명의 다양한 양태는 다음의 하위 섹션에서 더 상세히 기술된다. 하위 섹션을 사용하는 것은 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 각각의 하위 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, "또는(or)"은 "및/또는(and/or)"을 의미한다.

본 발명은 특정 방법, 및 기술된 실험 조건에 한정되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 달라질 수 있다. 또한, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예만을 기술하기 위한 것이고, 달리 명시되지 않는 한 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어 및 문구는 당업자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시와 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본원에 언급된 모든 문헌은 본원에 참조로서 통합된다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양과 형질 변환(예: 전기 천공, 리포펙션)에는 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 수행되거나, 당업계에 공통적으로 성취된 바와 같이 수행되거나, 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차는 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적 기준과 보다 특이적인 기준에서 기술된 바에 따라 일반적으로 수행될 수 있다. [예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조.]

조작된 HA 폴리펩티드

본 발명은 다양한 재조합 기술을 사용해 생성된 임의의 HA 폴리펩티드를 포함하는 임의의 조작된 헤마글루티닌 (HA) 폴리펩티드를 변형시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예는 당업자에 의해 사용되는 임의의 방법 생성물에 적용되어 백신용으로 개선된 속성을 갖는 HA 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 본 발명의 구현예에 사용하기 위한 조작된 HA 폴리펩티드를 생성하는 적절한 방법은, 컴퓨터로 최적화된 광범위 반응성 항원(COBRA) 기술, 모자이크(mosaic) 기술, 역유전학, 단백질 공학, 인플루엔자 공통 서열에 기초한 인플루엔자 균주의 조합, 구조 도메인의 결실 및/또는 재배열, 도메인 스와핑, 또는 다수의 인플루엔자 균주 중 중화 에피토프 또는 교차 반응성 에피토프의 조합을 포함한다. 이러한 이전의 노력에는 62/005,670, WO2012/177760, WO2013/148164, US 20140147459, WO2013/043729, US 20140286981, US 2014-0050759, US 8685410, WO2015/028478, US 2010-0074915에 기술된 것들이 포함되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 통합된다.

그러나, 이러한 기술은 종종 계절성 균주 또는 대유행성 균주 중 하나에 편향된 면역원성 프로파일을 의도적으로 또는 이와 달리 갖는 HA 폴리펩티드를 생성시킨다. HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일은 HA 폴리펩티드로 면역화하여 유도된 중화 항체의 스펙트럼으로서 정의될 수 있다. 일반적으로, HA 폴리펩티드는 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일, 또는 균형잡힌 면역 프로파일을 가질 수 있다. 무엇보다도, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드가 인플루엔자 바이러스의 계절성 및 대유행성 균주에 대항해 중화 항체를 유도할 수 있도록 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 개선하거나, 계절성 및/또는 대유행성 균주에 대항하는 중화 항체의 질이나 양을 개선하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 HA 폴리펩티드가 균형잡힌 면역원성 프로파일을 갖도록 조작된 HA 폴리펩티드를 개선하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 구현예들은 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 면역 프로파일을 변경시켜, 상기 HA 폴리펩티드가 다소 계절성이 되거나, 대소 대유행성이 되도록 하는 데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중화 항체"는 특정 항원(면역원)에 의한 자극에 반응하여 인간이나 다른 동물의 B 림프구 세포에 의해 생성되는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 중화 항체는 인플루엔자 HA 폴리펩티드에 의해 유도될 수 있다. 특정 HA 폴리펩티드에 의해 유도된 중화 항체는 일반적으로 상기 특이적 인플루엔자 HA 폴리펩티드를 함유하는 인플루엔자 바이러스 또는 특정 공통 면역원성 특징을 공유하는 관련 HA 폴리펩티드를 함유하는 인플루엔자 바이러스를 중화할 수 (예: 감염성을 차단할 수) 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 인플루엔자의 하나 이상의 계절성 균주에 대항해 면역 반응을 유도하는 (예를 들어, 중화 항체를 유도하는) HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 가지의 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 적어도 2 가지 이상의 계절성 순환 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 인플루엔자의 대유행성 균주를 중화시키지 않는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 A/캘리포니아/07/2009를 중화시키지 않는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 대유행성 인플루엔자 균주와 비교해 더 계절성이거나 실질적으로 더 계절성인 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 대유행성 인플루엔자보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 가지 더 많은 계절성 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 대유행성 균주보다 2 가지 이상 더 많은 계절성 순환 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 인플루엔자의 하나 이상의 대유행성 균주에 대항해 면역 반응을 유도하는 (예를 들어, 중화 항체를 유도하는) HA 폴리펩티드이다. 특히, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 A/캘리포니아/07/2009를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 A/캘리포니아/07/2009, A/사우스캐롤라이나/01/1918, A/뉴저지/1976, 또는 본원에서 정의된 대유행성 인플루엔자 균주 중 임의의 다른 것 중 적어도 하나 이상을 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 가지 등의 대유행성 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 2 가지 이상의 대유행성 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 인플루엔자의 계절성 균주를 중화시키지 않는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 A/뉴칼레도니아/20/1999를 중화시키지 않는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 계절성 인플루엔자 균주와 비교해 더 대유행성인 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 계절성 인플루엔자 균주보다 적어도 2, 3, 4, 5 가지 등의 더 많은 대유행성 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도한다. 일부 구현예에서, 대유행성 또는 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 계절성 균주보다 2 가지 이상 더 많은 대유행성 순환 인플루엔자 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 계절성 및 대유행성 균주 모두를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 가지의 계절성 균주(예: A/뉴칼레도니아/20/1999)뿐만 아니라 A/캘리포니아/07/2009, A/사우스캐롤라이나/01/1918, A/뉴저지/1976, 또는 본원에서 기술된 다른 대유행성 균주 중 임의의 다른 것 중 하나 이상도 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 가지의 계절성 균주뿐만 아니라 A/캘리포니아/07/2009도 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 A/뉴칼레도니아/20/1999 및 A/캘리포니아/07/2009를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 실질적으로 동일한 수의 계절성 및 대유행성 균주를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 HA 폴리펩티드이다. 예를 들어, 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드에 의해 유도된 항체에 의해 중화되는 계절성 및 대유행성 균주 수의 차이는 1, 2, 3, 4, 또는 5 이하이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성 프로파일을 증가", "면역 프로파일의 폭을 증가", "더 균형잡힌 면역 프로파일", "덜 편향된 면역 프로파일", "더 계절성인", "덜 계절성인", "더 대유행성인", "덜 대유행성인", 또는 문법적 등가물은 본원에서 기술된 변형 이전의 부모 HA 폴리펩티드와 같은 기준 HA 폴리펩티드의 스펙트럼에 대해 상대적으로, 변형된 HA 폴리펩티드에 의해 생성된 중화 항체의 스펙트럼을 나타낸다.

면역원성 프로파일을 변경시키기 위한 조작된 HA의 변형

본 발명의 구현예는 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변형하거나 변경하여, 특히, 조작된 HA 폴리펩티드 이에 대항해 면역 반응(예: 중화 항체 반응)을 유도할 수 있는 인플루엔자 균주의 다양성을 넓히는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 순환하는 인플루엔자 균주의 서열 변이에 대한 가상 환경(in silico) 분석으로부터 추론된 변형, HA의 항원 영역(들)의 맵핑, 및/또는 상이하거나 구별되는 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드에 대해 상대적으로 HA 펩티드의 에피토프 패턴 및 구조 분석에 기초한다. 구별되는 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드로부터 유래된 상응 서열에 기초하여, 표적화된 변형이 다양한 아미노산 잔기 위치 및/또는 알려진 면역 프로파일을 가진 HA 폴리펩티드의 특정 영역에 도입되어, 개선되고 보다 균형잡힌 면역 프로파일을 갖는 신규한 HA 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 변형의 위치, 유형 및 수가 선택되고 조합되어, 특정 면역 반응(예: 균형잡힌 면역 반응, 대유행성 균주에 대항하는 개선된 "더 대유행성" 반응 등)을 유도하도록 맞춤화 된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형 전략은 수용체 결합 부위(RBS) 근처 영역에서 변형이 조작된 숙주 HA 폴리펩티드 RBS의 특정 잔기를 대체로 보존하도록 설계된다. 예시적인 변형 전략은 아래에 기술된다.

달리 명시되지 않는 한, 표적 HA 폴리펩티드에서의 변형(예: 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)을 위한 특정 위치는 아래에 제공된 A/캘리포니아/07/2009 (H1N1) HA 폴리펩티드 서열을 참조하여 결정된다(CA09 넘버링):

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRXXEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (서열 번호 2).

조작된 헤드 영역의 이식

일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법은, 알려진 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 구형 헤드의 구조적으로 정의된 영역을 구별되는 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 줄기 영역에 이식하는 것에 기초한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법은, 알려진 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역을 선택하고, 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역을 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역으로 치환하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역은 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 줄기 영역 상에 이식될 수 있다. 이와 반대로, 일부 구현예에서는, 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 선택된 헤드 영역이 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 줄기 영역 상에 이식될 수 있다.

일부 구현예에서, 알려진 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 구형 헤드의 구조적으로 정의된 영역은 구별되는 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 영역 상에 이식되며, 상기 영역에는 줄기 영역 및 구별되는 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 헤드 영역의 분획이 포함된다. 다른 구현예에서, 알려진 면역 프로파일을 갖는 HA의 전체 구형 도메인이 구별되는 면역학적 프로파일을 갖는 HA 분자의 줄기 영역 상에 이식된다. 일반적으로, 이식에 적합한 헤드 영역은 생성되는 전장 하이브리드 분자의 구조적 무결성이 보전되는 것을 보장하도록 선택된다. 일반적으로, 적합한 헤드 영역은 HA 폴리펩티드의 수용체 결합 영역(RBS)을 보전하도록 선택된다. HA 폴리펩티드의 RBS는 CH65 항체에 의해 인식되는 에피토프로서 일반적으로 정의될 수 있다(예: Whittle JR, 등의 Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:14216-21 참조). 대안적으로, RBS는 위치 167(CA09 넘버링)에 상응하는, 범용적으로 보존된 트립토판의 15 옹스트롬 이내의 모든 아미노산 잔기를 포함하는 영역으로서 정의될 수 있다(예: Xu, R 등의 Nat Struct Mol Biol. 2013 Mar;20(3):363-70 참조). RBS를 포함하거나 RBS로 이루어지는 적합한 헤드 영역은 2차 구조의 보존, 분리된 RBS의 컴팩트한 구형 구성, 및 수혜자 줄기 분자 내 공여자 RBS의 통합시 계면 접촉의 보존에 기초하여 줄기 수혜자에 이식을 위해 선택될 수 있다. 이식에 적합한 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드로부터 선택된 헤드 영역의 비 한정적인 예시는 실시예 1에 기술된다. 일부 구현예에서, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드는 서열 번호 1에 도시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 　

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (서열 번호 1).

일부 구현예에서, 적합한 헤드 영역은 서열 번호 1의 잔기 63~278, 125~277 또는 135~269에 상응하는 아미노산 서열을 함유하도록 선택된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상응하는(corresponding to)"은 관심 HA 폴리펩티드에서의 아미노산 잔기의 위치/동일성을 지정하는 데 사용된다. 당업자는, 간략화를 위해, HA 폴리펩티드 내의 잔기가 기준 관련된 폴리펩티드에 기초한 정규 넘버링 체계를 사용해 지정되므로, 가령 위치 63에서의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 특정 아미노산 사슬에서 실제로 63번째 아미노산일 필요가 없고, 오히려 기준 폴리펩티드의 63에서 발견된 잔기에 상응한다는 것을 이해할 것이며; 당업자는, 예를 들어, 다양한 서열 정렬 도구를 사용해 "상응하는" 아미노산을 동정하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 적합한 헤드 영역은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 63~278, 125~277 또는 135~269와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 함유할 수 있다.

이어서, 선택된 헤드 영역은 구별되는 면역 프로파일을 갖는, 즉 대유행성 또는 우세한 대유행성인 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역을 치환하거나 교체하는 데 사용될 수 있다. 구별되는 면역 프로파일을 갖는 (즉, 대유행성 또는 우세한 대유행성인) 이러한 적합한 HA 폴리펩티드는 자연적으로 발생하거나, 조작될 수 있는데, 이에는 컴퓨터에 의해 최적화된 광범위 반응성 항원(COBRA) 기술, 모자이크 기술, 역유전학, 단백질 공학, 인플루엔자 공통 서열에 기초한 인플루엔자 균주의 조합, 구조 도메인의 결실 및/또는 재배열, 도메인 스와핑, 또는 다수의 인플루엔자 균주 중 중화 에피토프 또는 교차 반응성 에피토프의 조합에 의해 조작된 것들이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

예를 들어, 선택된 헤드 영역은, 서열 번호 2[전장 wt CA09 (A/캘리포니아/07/2009 HA 서열) 서열]의 63~277의 잔기, 서열 번호 2[전장 wt CA09 서열]의 잔기 125~277의 잔기, 또는 서열 번호 2[전장 wt CA09 서열]의 135~269의 잔기로부터 선택된 자연 발생 대유생성 균주의 상응 헤드 영역을 치환하거나 교체하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 선택된 헤드 영역은, 우세한 대유행성인, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역을 치환하거나 교체하는 데 사용될 수 있다. 비 한정적 실시예로서, 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드는 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산을 갖는다:

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCSVAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSPDNGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNGVTASCPHAGAKSFYRNLLWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGVHHPSTSADQQSLYQNANAYVSVVTSRYSRRFTPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSDTPVHDCNTTCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI. 적합한 헤드 영역은 서열 번호 6의 잔기 63~278, 125~277 또는 135~269에 상응하는 아미노산 서열을 함유하도록 선택된다. 　

추정상 N- 결합된 글리코실화 부위를 제거하거나 조작하기 위한 변형

일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법은 HA 폴리펩티드의 구형 헤드 영역 내의 예측된 또는 추정상 N-결합된 글리코실화 부위와 관련된 잔기의 변형에 기초한다. 일반적으로, 추정상 또는 예측된 N-결합된 글리코실화 부위는 NxS/Ty의 공통 서열에 의해 정의된다(x 및 y는 P가 아님). 일반적으로 계절성 HA 폴리펩티드는 대유행성 또는 대유행성-유사 HA 폴리펩티드에 대해 상대적으로 수용체 결합 부위(RBS)의 영역 내에 추가 N-결합된 글리코실화 부위를 함유한다. 표적 계절상 또는 계절상-유사 조작된 HA 폴리펩티드 내의 특정 아미노산 잔기가 돌연변이되어 글리코실화 부위를 제거하고, 조작된 HA 폴리펩티드에 더 대유행성인 글리코실화 프로파일을 부여할 수 있다. 특정 구현예에서, 글리코실화를 변경시키고 표적 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일이 더 대유행성이 되도록 변경시키기 위해서, 표적 계절상 또는 계절상-유사 조작된 HA 폴리펩티드 내의 특정 아미노산 잔기가 돌연변이되거나, 대유행성 또는 대유행성-유사 HA 폴리펩티드(예: 캘리포니아/07/2009) 내 상응 위치에서 관찰된 것들로 치환될 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 헤드 영역과 비교하여 알려진 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역에서 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위의 존재 여부를 확인하고; 조작된 HA 폴리펩티드의 헤드 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 도입하여 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하거나, 구별되는 면역원성 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 서열에 기초하여 추가적인 N-결합된 글리코실화 부위를 조작된 HA 폴리펩티드에 삽입하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드 내에 도입되어, 재조작된 HA 폴리펩티드가 더 대유행성이 되도록 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴한다. 이와 반대로, 일부 구현예에서는, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드 내에 도입되어, 재조작된 HA 폴리펩티드가 더 계절성이 되도록 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 삽입한다.

일부 구현예에서, 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위(RBS) 영역에서 또는 이의 부근에서 제거되거나 추가된다. 일부 구현예에서, 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위(RBS)의 15 옹스트롬 이내에 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 옹스트롬 이내에) 있으며, RBS는 삼차원(3-D) 구조에서의 W167(CA09 넘버링)에 상응하는 위치의 15 옹스트롬 이내에 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 옹스트롬 이내에) 있는 모든 아미노산 잔기로서 정의된다. 특정 구현예에서, 예측된 N-결합된 글리코실화 부위는 (CA09 넘버링의) 위치 142~145 및/또는 177~179에 상응할 수 있다.

따라서, 균형잡힌 면역 프로파일을 유도하는 재조합 HA 폴리펩티드가 아미노산 치환, 파괴 또는 결실을 통해 생성되어 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드 내의 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하거나 제거할 수 있다. 대안적으로, 균형잡힌 면역 프로파일을 유도하는 재조합 HA 폴리펩티드가 아미노산 치환, 파괴 또는 결실을 통해 생성되어 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드 내에 N-결합된 글리코실화 부위를 도입할 수 있다. 균형잡힌 면역 프로파일을 유도하는 재조합 HA 폴리펩티드를 생성하기 위해 수행될 수 있는 아미노산 치환, 파괴 또는 결실의 예시는 표 4 또는 표 5에서 확인할 수 있다. 아미노산 치환, 파괴 또는 결실은 순환 인플루엔자 균주의 상응 영역으로부터 유래될 수 있다.

N-결합된 글리코실화 부위에서의 표적화된 치환 또는 결실은 하나 이상의 추가 변형과 조합될 수 있다. 예를 들어, 양전하를 띤 아미노산 잔기가 RBS의 근처에 삽입되어 더 대유행성인 면역 프로파일을 갖는 재조작된 HA 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 계절성 또는 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드는 양전하를 띤 하나 이상의 아미노산을 RBS의 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위에 인접하게 또는 근처에 삽입하거나, RBS를 경계로 하는 배좌 루프 구조 내에 (예를 들어, "220 및 130 루프" 내에 (Bradley, K.C. 등의 J. Virol., 2011, 85(23), 12387-12398 참조)) 삽입함으로써 더 대유행성인 (예: 더 균형잡힌) 면역 프로파일을 가지도록 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 리신이나 아르기닌 잔기가 RBS를 경계로 하는 루프 또는 루프들 내에 삽입된다("리신 루프 삽입"). 일부 구현예에서, 루프 삽입은 표적 조작된 HA 폴리펩티드의 잔기 147(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에 또는 그 근처에 리신(K) 또는 아르기닌(R)을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 루프 삽입은 NxS/Ty 공통 서열의 1~5 아미노산 이내에 (예: 1~4, 1~3, 1~2 아미노산 이내에) 리신(K) 또는 아르기닌(R)을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R) 잔기는 NxS/Ty 공통 서열의 5' 또는 3'으로부터 1~5 아미노산(예: 1~4, 1~3, 1~2 아미노산) 이내에 존재한다.

RBS 영역 내 잔기에 대한 표적화된 변형

일부 구현예에서, 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 것은 RBS 영역 내에 또는 이에 인접한 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환이 표적 조작된 HA 폴리펩티드의 60 및 291(CA09 넘버링)에 상응하는 잔기를 포함하는 영역 내의 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환이 수용체 결합 부위(RBS)의 15 옹스트롬 이내에 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5 옹스트롬 이내에) 도입될 수도 있으며, RBS는 삼차원 (3-D) 구조에서 보존된 잔기 W167(CA09 넘버링)에 상응하는 위치의 15 옹스트롬 이내에 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5 옹스트롬 이내에) 있는 모든 아미노산 잔기로서 정의된다. 예를 들어, 변형이 RBS의 10 옹스트롬 이내에서 발생하는 구현예에서, 이들은 관찰된 W167로부터 15~25 옹스트롬 사이에서 발생한다. 일부 구현예에서, RBS는 광범위한 중화 단클론 항체 CH65에 의해 결합된 에피토프에 의해 정의될 수 있다(예: Whittle JR 등의 Broadly neutralizing human antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:14216-21 참조). 이러한 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 CH65의 에피토프에 인접하여 (예: 100 아미노산 잔기 이내, 75 아미노산 잔기 이내, 50 아미노산 잔기 이내, 40 아미노산 잔기 이내, 30 아미노산 잔기 이내, 25 아미노산 잔기 이내, 20 아미노산 잔기 이내, 15 아미노산 잔기 이내, 10 아미노산 잔기 이내, 5 아미노산 잔기 이내 등에서) 발생하거나, CH65의 에피토프의 15 옹스트롬 이내에서 발생한다. 일부 구현예에서, 각각의 아미노산 치환은 특정 위치에서의 아미노산 잔기를 구별되는 면역원성 프로파일(예: 순환하는 계절성 또는 대유행성 인플루엔자 균주)을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 위치에서 관찰된 아미노산 잔기와 대체하는 것을 포함한다. 예를 들어, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드는, 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 위치에서 발생하는 아미노산 잔기에 기초하여 특정 위치의 아미노산을 치환함으로써 더 대유행성이 되도록 변경될 수 있다. 이와 반대로, 우세한 대유행성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드는, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 HA 폴리펩티드의 상응 위치에서 발생하는 아미노산 잔기에 기초하여 특정 위치의 아미노산을 치환함으로써 더 계절성이 되도록 변경될 수 있다.

예시적인 아미노산 치환은 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9에 도시되어 있다. 비 한정적 예시로서, 하나 이상의 아미노산 치환은 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 214, 244, 245, 및/또는 262(CA09 넘버링)에 상응하는 표적 HA 폴리펩티드 내의 위치에서 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 및/또는 214(CA09 넘버링)에 상응하는 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9에 도시된 것들로부터 선택된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 또는 표 9로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 치환을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 다양한 방법의 조합이 조작된 HA 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, RBS 영역 내의 잔기에 대한 표적화된 변형이 추정상 N-결합된 글리코실화 부위에 대한 변형 및 루프 삽입과 조합하여 사용될 수 있다. 헤드 영역 이식도, RBS 주위의 잔기에 대한 표적화된 변형, 및/또는 추정상 N-결합된 글리코실화 부위에 대한 변형 및 루프 삽입과 조합하여 사용될 수 있다.

재조작된 HA 폴리펩티드의 평가

일부 구현예에서, 본원에 기술된 다양한 방법에 따라 생성된 변형된 재조합 HA 폴리펩티드가 원하는 발현 및 배좌에 대해 평가될 수 있다. 선별 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 무 세포, 세포 기반, 및 동물 검정을 포함한다. 체외 검정은 고체 분자 또는 가용성 표적 분자 검출일 수 있으며, 표적 분자(예: 면역글로불린)에 결합된 조작된 HA 폴리펩티드를 동정할 수 있는 표지 또는 검출 가능한 기의 사용을 포함하여 당업계에 알려진 다수의 방법으로 달성될 수 있다. 검출 가능한 표지가 본 발명의 조작된 HA 폴리펩티드를 사용하는 검정과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 HA 폴리펩티드는 "Expression and Conformational Analysis of Engineered Influenza Hemagglutinin"이라는 제목으로 2015년 5월 29일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/US2015/033205호에서 기술된 검정에 의해 결정된 바와 같이 발현 및 배좌 특성에 기초하여 선택될 수 있다.

본 발명은, 동물 숙주에서 본 발명에 따른 재조합 HA 폴리펩티드를 시험하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "동물 숙주(animal host)"는 인플루엔자 연구에 적합한 임의의 동물 모델을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 동물 숙주는 영장류, 페렛, 고양이, 개, 소, 말, 설치류(마우스, 햄스터, 토끼, 및 랫트 등)를 포함하는 임의의 포유류 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 적합한 동물 숙주는 페렛(ferret)이다. 특히, 일부 구현예에서, 동물 숙주는 본 발명에 따른 결합제의 투여 (선택적으로, 본 발명에 따른 조성물로서의 투여) 이전에는 바이러스 노출이나 감염에 대해 미처리 상태이다. 일부 구현예에서, 동물 숙주는 본 발명에 따른 재조합 HA 폴리펩티드의 투여 이전에 또는 투여와 동시에 바이러스로 접종되거나, 감염되거나, 달리 노출된다. 본 발명의 실시에 사용되는 동물 숙주는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 바이러스로 접종되거나, 감염되거나, 달리 노출된다. 일부 구현예에서, 동물 숙주는 비강을 통해 바이러스로 접종되거나, 감염되거나, 달리 노출된다.

본 발명의 변형된 재조합 HA 폴리펩티드도, 동물(예: 마우스, 페렛 또는 인간)에서의 인플루엔자 바이러스의 계절성 및 대유행성 균주 모두에 대항하는 예방 (중화) 면역 반응 항체를 유도할 수 있는 것들을 동정하고/하거나 선별하는 선별 검정에서 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 예방 면역 반응의 유도는, 예를 들어, 인플루엔자 백신 효능의 대리 측정 수단으로서 일반적으로 알려진 적혈구 응집 반응 억제 검정(HAI)을 사용해 확인될 수 있다. H1N1에 특이적인 항체를 검출하기 위해 닭, 칠면조 또는 말의 적혈구가 HAI 검정에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 예방 면역 반응은 1:40보다 큰 평균 HAI 역가를 유도함으로써 입증되며, 이는 인플루엔자 질병의 예방 및 감소와 상관 관계가 있다. HAI 항체 역가가 대략 1:32 내지 1:40이면 비활성화된 인간 인플루엔자 바이러스 백신으로 면역화된 대상의 약 50%가 감염으로부터 일반적으로 보호될 것이다. (참조: Treanor, J. & Wright, P. F. Immune correlates of protection against influenza in the human challenge model. Dev. Biol. (Basel), 2003, 115:97-104; 참조로서 본원에 통합됨). 일부 구현예에서, 예방 면역 반응의 유도는 혈청 전환률에 의해 확인될 수 있다. 혈청 전환의 예방 수준은 HAI 역가가 적어도 4 배 상승한 것으로 정의될 수 있는데, 예를 들어, 투여 또는 백신 접종 전의 HAI 역가는 1:10 미만이고, 백신 접종 후의 역가는 1:40 이상이다. 즉, 성공적인 혈청 전환률은, 백신 접종 전의 HAI 역가가 약 1:10 미만이고 백신 접종 후의 HAI 역가가 약 1:40보다 크거나, 백신 접종 전의 HAI 역가가 약 1:10 보다 크고 백신 접종 후의 HAI 항체 역가가 적어도 4 배 상승하는, 대상의 백분율로서 정의될 수 있다.

미처리된 동물 및/또는 접종된 동물은 임의의 다양한 연구를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 동물 모델은 당업계에 알려진 바와 같은 바이러스 전염 연구에 사용될 수 있다. 바이러스 전염 연구에 페렛을 사용하는 것은 인간의 바이러스 전염에 대한 신뢰할 수 있는 예측 인자로서의 역할을 할 것으로 예상된다. 예를 들어, 접종된 동물(예: 페렛)로부터 미처리 동물로의 바이러스 인플루엔자의 공기 전염은 당업계에 알려져 있다(Tumpey 등의 2007, Science 315; 655-59; 참조로서 본원에 통합됨). 바이러스 전염 연구는 본 발명에 따른 재조합 HA 폴리펩티드를 시험하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 재조합 HA 폴리펩티드는, 상기 조작된 HA 폴리펩티드가 동물 숙주에서 광범위한 면역 반응을 유도하는 효능을 결정하기 위해, 적합한 동물 숙주에 투여될 수 있다. 동물 숙주에서의 연구로부터 취합된 정보를 사용하면, 재조합 HA 폴리펩티드가 인간 숙주에서 광범위하게 예방적으로 유도하는 효능을 예측할 수 있다.

핵산의 작제 및 발현

본원에 기술된 바와 같은 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩티드는 당업계에 알려진 분자 생물학적 방법을 사용해 핵산 분자로부터 생성될 수 있다. 핵산 분자는, 적절한 숙주 세포 내에 도입될 때 HA 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터 내에 삽입된다. 적절한 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. DNA 단편을 벡터 내에 삽입하기 위한, 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용되어 전사/번역 제어 신호의 조절 하에 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합이 포함될 수 있다(참조: Sambrook 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, 등 Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).

일부 구현예에서, 본 발명은 HA 폴리펩티드 또는 HA 폴리펩티드의 특징부 또는 생물학적 활성부를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 HA 폴리펩티드 또는 HA 폴리펩티드의 특징부 또는 생물학적 활성부를 암호화하는 핵산에 대해 상보성인 핵산을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 HA 폴리펩티드 또는 HA 폴리펩티드의 특징부 또는 생물학적 활성부를 암호화하는 핵산에 대해 하이브리드화되는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산은, 예를 들어, 프라이머로서 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 몇 가지 예를 들자면, 이러한 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 사용될 수 있고, 하이브리드화(인시튜 하이브리드화 포함)를 위한 프로브로서 사용될 수 있고/있거나 역전사-PCR(RT-PCR)을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산은 천연 뉴클레오티드만을 포함한다.

본 발명에 따른 핵산 분자의 발현은, 재조합 DNA 분자로 형질 변환된 숙주 내에서 상기 분자가 발현되도록 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자의 발현은 당업계에 알려진 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer) 요소에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 핵산 작제물은 당업계에 알려진 방법에 의해 발현 벡터 또는 바이러스 벡터 내에 삽입되고, 핵산 분자는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.

핵산 분자가 함유된 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 형질 변환되어, 핵산 작제물에 의해 암호화된 단백질의 생성을 가능하게 한다. 예시적인 숙주 세포는 원핵생물(예: 대장균) 및 진핵생물(예: COS 세포, 293 세포 또는 CHO 세포)을 포함한다. 발현 벡터를 사용해 형질 변환된 숙주 세포는 본 발명에 따른 조작된 HA 폴리펩티드의 생성에 이어서 조작된 HA 폴리펩티드의 회수가 가능한 조건 하에 성장된다.

본 발명의 재조합 HA 폴리펩티드는 당업계에 알려진 임의의 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 조작된 HA 폴리펩티드는, 8M 염산 구아니디늄 및 투석에 의해 이들이 정량적으로 추출될 수 있는 세포로부터 수용성 폴리펩티드로서 또는 봉입체(inclusion bodies)로서 회수될 수 있다. 본 발명의 재조합 HA 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해, 통상의 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 또는 겔 여과가 사용될 수 있다. 본 발명의 재조합 HA 폴리펩티드는 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 분비된 후에, 컨디셔닝된 매질(media)로부터 회수될 수도 있다.

인플루엔자 바이러스-유사 입자( VLPs )

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 변형된 HA 폴리펩티드를 포함하는 인플루엔자 바이러스-유사 입자(VLPs)를 제공한다. 인플루엔자 VLP는, 일부 구현예에서는, HA, NA 및 바이러스 구조 단백질(예: HIV gag 단백질)로 이루어진다. 인플루엔자 VLP의 생성은 당업계에 알려져 있으며, 당업자가 본 개시를 읽으면 쉽게 자명해질 것이다. 예를 들어, 인플루엔자 VLP는 HA, NA 및 HIV gag 단백질을 암호화하는 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시켜 생성될 수 있다. 예를 하나만 들자면, 적합한 숙주 세포에는 인간 세포(예: HEK293T)가 포함된다. 단백질이 발현될 수 있는 적당한 시간 동안 (예를 들어, 대략 72 시간 동안) 형질감염된 세포를 배양한 뒤, VLP를 세포 배양 상층액으로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 H1N1 인플루엔자 바이러스에 대항해 광범위한 중화 면역 반응을 유도하는 인플루엔자 백신으로서 사용될 수 있다.

약제학적 조성물

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 변형된 재조합 HA 폴리펩티드 및/또는 관련 엔티티를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서는, 변형된 재조합 HA 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 이러한 폴리펩티드 또는 핵산의 특징적 단편 또는 생물학적 활성 단편, 이러한 폴리펩티드 또는 단편에 결합하고/하거나 경쟁하는 항체, 이러한 폴리펩티드 또는 이에 결합하는 글리칸과 상호 작용하거나 경쟁하는 소분자 등은 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이러한 약제학적 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인플루엔자 감염을 앓고 있거나, 감염되기 쉬운 대상에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상은 조류(예: 닭, 오리, 칠면조 등), 개, 말 및 돼지를 포함하되 이들로 한정되지 않는 동물이다. 일부 구현예에서, 대상은 대상 내의 인플루엔자 감염을 앓고 있고, 인플루엔자 감염과 공통적으로 관련이 있는 하나 이상의 증상을 나타내는 것으로 간주한다. 일부 구현예에서, 상기 대상은 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 알려져 있거나 여겨진다. 일부 구현예에서, 대상이 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 알려져 있거나 여겨지는 경우, 상기 대상은 인플루엔자에 감염되기 수운 것으로 간주한다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 알려져 있거나 감염이 의심되는 다른 개체와 대상이 접촉한 경우 및/또는 상기 대상이 인플루엔자 감염이 만연하는 것으로 알려져 있거나 여겨지는 장소에 있거나 있었던 경우, 상기 대상은 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 알려져 있거나 여겨진다.

일부 구현예에서, 인플루엔자 감염으로 앓고 있거나 감염되기 쉬운 대상은, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 전, 투여하는 동안, 또는 투여 후에 본 발명에 따른 변형된 재조합 HA 폴리펩티드에 대한 항체에 대해 시험된다. 일부 구현예에서, 이러한 항체가 있는 대상에게는 본 발명에 따른 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하지 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물 및/또는 변형된 재조합 HA 폴리펩티드의 적정 투여량은 이러한 항체의 검출(또는 결여)에 기초하여 선택된다.

일부 구현예에서, 치료를 위한 특정 대상, 투여를 위한 특정 변형된 재조합 HA 폴리펩티드 또는 조성물, 및/또는 투여를 위한 특정 투여량 또는 투여 방식의 선택은, 예를 들어, 손으로 기록되거나, 인쇄되어 기록되거나, 전자 저장 형태로 기록된다.

기술된 바와 같이 변형된 재조합 HA 폴리펩티드는 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상이 전개되기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 포함하는 인플루엔자 VLP는 (또는 변형된 재조합 HA 폴리펩티드 자체는) 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상이 전개되기 전 또는 후에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 변형된 재조합 HA 폴리펩티드의 투여에 의한 인플루엔자 감염의 치료를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 인플루엔자 감염의 치료는 본원에 기술된 바와 같은 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 포함하는 인플루엔자 VLP의 투여에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 인플루엔자 감염의 치료는 백신의 투여에 의해 달성된다. 지금까지, 인플루엔자 백신의 개발에 있어서 유의한 성취가 있었지만, 추가적인 개선의 여지가 있다. 본 발명은, 본 발명에 따른 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 포함하고, 변형된 재조합 HA 폴리펩티드의 중화 항체 결정인자(예: 에피토프)에 대해 광범위한 예방 면역 반응을 유도하는 조작된 HA 폴리펩티드를 특히 포함하는 백신을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 예방을 위한, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP, 인플루엔자 백신, 융합 단백질 및/또는 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 면역원성 조성물(예: 백신) 및 인간 대상에 대한 이들 면역원성 조성물의 투여를 제공한다. 특정 구현예에서, 인간 대상의 나이는 6 개월 이상, 6 개월 이상 35 개월 이하, 36 개월 이상 8 세 이하, 또는 9 세 이상이다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이다: (1) 불활화 바이러스, (2) 약독화된 생 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 복제 결손 바이러스(replication-defective virus), (3) 바이러스-유사 입자(VLP), (4) 변형된 재조합 HA 폴리펩티드, (5) 변형된 재조합 HA 폴리펩티드 또는 이의 특징부 또는 생물학적 활성부를 암호화하는 핵산, (6) 본 발명에 따른 변형된 재조합 HA 폴리펩티드 또는 이의 특징부 또는 생물학적 활성부를 암호화하는 DNA 벡터, 및/또는 (7) 발현 시스템, 예를 들어, 항원으로서 사용될 하나 이상의 인플루엔자 단백질을 발현하는 세포.

본원에 기술된 조작되고 재조작된 HA 폴리펩티드를 포함하는 전체 인플루엔자 바이러스는 플라스미드 기반의 역 유전학 (예: Neumann, G. 등의 Reverse Genetics of Influenza Viruses, Methods Mol Biol., 2012, 865:193-206 참조; 참조로서 본원에 통합됨)및 유정란 기반(egg-based) 기술에 의해 (예를 들어, 재조합 바이러스로서, 본원에 기술된 바와 같이 컴퓨터로 최적화된 H1 HA 폴리펩티드; H1N1 인플루엔자 균주 유래의 야생형 NA 폴리펩티드; 및 유정란(egg)에서 높은 수율을 수득하게 하는 공여자 바이러스(예: 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/34 (PR8)) 유래의 내부 단백질 유전자의 백본을 포함하는 것인, 재조합 바이러스에 의해) 생성될 수 있다. 예를 들어, 고성장 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/34 (PR8) 공여자 바이러스의 내부 단백질을 암호화하는 6 개의 플라스미드는, 본원에 기재된 바와 같이 컴퓨터로 최적화된 H1N1 HA 폴리펩티드 및 야생형 뉴라미니다아제 (NA) 당단백질을 암호화하는 2 개의 플라스미드와 함께 적격한 포유류 세포(예: 베로 세포) 내로 동시 형질감염될 수 있고, 재조합 바이러스의 단리가 이어질 수 있다. 당업자는 12-플라스미드 역 유전학 시스템이 사용될 수도 있다는 것을 이해할 것이다(예: Pekosz, A. 등의 Reverse genetics of negative-strand RNA viruses: Closing the circle. Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96, 884-8806 참조). PR8 바이러스 유래의 내부 단백질 유전자를 함유하는 재조합 바이러스가 불활화 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다(예: Fodor, E. 등의 Rescue of influenza A virus from Recombinant DNA. J. Virol ., 1999, 73, 9679-9682 참조; 참조로서 본원에 통합됨). 전체 인플루엔자 바이러스가 약독화된 생 백신 또는 분열된 불활화 백신의 성분으로서 투여될 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 불활화 독감 백신(inactivated flu vaccine)을 제공한다. 일부 구현예에서, 불활화 독감 백신은 세 가지 유형의 항원 제조 물질 중 하나를 포함한다: 불활화 전체 바이러스; 정제된 바이러스 입자가 세제나 다른 시약으로 파괴되어 지질 외피를 용해시키는, 서브비리온(sub-virion, "분열된(split)" 백신); 또는 정제된 HA 폴리펩티드("아단위(subunit)" 백신). 일부 구현예에서, 바이러스는 포름알데히드, 베타-프로피올락톤(beta-propiolactone), 에테르, 에테르와 세제(예: TWEEN-80^®), 세틸 트리메틸 암모늄 브롬화물(CTAB) 및 Triton N101, 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 트리(n-부틸) 포스페이트에 의해 불활화될 수 있다. 불활화(inactivation)는 (유정란에서 생성된 바이러스 유래의) 요막액(allantoic fluid)의 정화 전 또는 후에 발생할 수 있고; 비리온은 원심분리에 의해 단리되고 정제된다(Nicholson 등의, eds., 1998, Textbook of Influenza, Blackwell Science, Malden, MA; 본원에 참조로서 통합됨). 백신의 효능을 평가하기 위해, 일원 방사 면역확산(single radial immunodiffusion, SRD) 시험이 사용될 수 있다(Schild 등의 1975, Bull. World Health Organ., 52:43-50 & 223-31; Mostow 등의 1975, J. Clin. Microbiol., 2:531; 둘 모두는 본원에 참조로서 통합됨).

일부 구현예에서, 본 발명의 조작되거나 재조작된 HA 폴리펩티드가 계절성 및/또는 대유행성 인플루엔자 백신의 성분으로서 사용되거나, 지속적인 (다 계절) 방어를 제공하기 위한 인플루엔자 백신 접종 요법의 일부로서 사용된다.

일부 구현예에서, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스는 유정란에서, 예를 들어, 발육 계란(embryonated hen eggs)에서 성장되며, 이 경우 수확된 물질은 요막액이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 인플루엔자 바이러스 또는 조작된/재조작된 헤마글루티닌 폴리펩티드는 조직 배양을 사용하여 바이러스를 성장시키는 임의의 방법으로부터 생성될 수 있다. 바이러스를 성장시키기에 적합하거나, 조작되거나 재조작된 헤마글루티닌 폴리펩티드를 재조합적으로 달리 생성하기에 적합한 세포 기질은, 예를 들어, MDCK와 같은 개 신장 세포 또는 MDCK의 클론 유래의 세포, MDCK-유사 세포, AGMK와 같은 원숭이 신장 세포(베로 세포 포함), 연속 세포주로서 배양된 상피 세포, 293T 세포, BK-21 세포, CV-1 세포, 또는 백신 목적으로 인플루엔자 바이러스의 생성에 적합한 임의의 다른 포유류 세포 유형(상 기도 상피 세포)으로서, 손쉽게 상업적인 공급원(예: ATCC, Rockville, Md)으로부터 구할 수 있는 것을 포함한다. 적합한 세포 기질은 MRC-5 세포와 같은 인간 세포도 포함한다. 적합한 세포 기질은 세포주에 국한되지 않는다; 예를 들어, 닭 배아 섬유아세포도 포함된다.

조작되거나 재조작된 헤마글루티닌 폴리펩티드는 미세 조류(예: Schizochytrium sp.; Bayne, A-C.V. 등의 PLOS ONE, 8(4):e61790, April 2013 참조), 식물계 시스템(예: 담배; Jul-Larsen, A., 등의 Hum Vaccin Immunother., 8(5):653-61, 2012 참조), 효모(예: Athmaram, T.N. 등의 Virol J., 8:524, 2011 참조), 및 곰팡이(예: Allgaier, S. 등의 Biologicals, 37:128-32, 2009 참조)를 비롯한 다양한 진핵 생물 기반 발현 시스템에서 발현/생성될 수도 있다. 박테리아 기반 발현 시스템도 본 발명에 포함된다(예: Davis, A.R. 등의 Gene, 21:273-284, 1983 참조).

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 하나 이상의 보조제(adjuvants)를 추가로 포함한다. 예를 들어, 알루미늄 염(Baylor 등의 2002, Vaccine, 20:S18; 본원에 참조로서 통합됨) 및 모노포스포릴 지질 A(MPL; Ribi 등의 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p.407; 본원에 참조로서 통합됨)가 보조제로서 인간 백신에 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 새로운 조성물이 인간 백신의 보조제로서 현재 시험 중에 있는데, 이에는 MF59 (Chiron Corp., http://www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html), CPG 7909 (Cooper 등의 2004, Vaccine, 22:3136; 본원에 참조로서 통합됨), 및 QS21(Ghochikyan 등의 2006, Vaccine, 24:2275; 본원에 참조로서 통합됨)과 같은 사포닌 등이 포함된다.

또한, 일부 보조제는 인플루엔자 백신의 면역원성을 강화하는 것으로 알려져 있는데, 이에는 폴리[디(카복실아토페녹시)포스파젠] (PCCP; Payne 등의 1998, Vaccine, 16:92; 본원에 참조로서 통합됨), 인터페론-γ (Cao 등, 1992, Vaccine, 10:238; 본원에 참조로서 통합됨), 블록 공중합체 P1205 (CRL1005; Katz 등, 2000, Vaccine,. 18:2177; 본원에 참조로서 통합됨), 인터류킨-2 (IL-2; Mbwuike 등, 1990, Vaccine, 8:347; 본원에 참조로서 통합됨), 및 폴리메틸 메틸크릴레이트 (PMMA; Kreuter 등, 1981, J. Pharm. Sci., 70:367; 본원에 참조로서 통합됨) 등이 포함된다.

면역원성 조성물(예: 본원에 기술된 조작되거나 재조작된 인플루엔자 헤마글루틴 폴리펩티드를 갖는 VLP를 포함하는 백신) 외에도, 본 발명은 바이러스 감염의 치료에 유용한 다른 치료용 조성물을 제공한다. 치료용 조성물에는, 예를 들어, 인플루엔자 VLP, 융합 단백질, 및 본원에 기술된 바와 같이 조작되거나 재조작된 HA 폴리펩티드 자체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료는 HA 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 방해하는 제제의 투여에 의해 달성된다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물(예: 인플루엔자 VLP 또는 조작된/재조작된 HA 폴리펩티드 자체)이 단독으로 투여되거나 하나 이상의 치료제와 조합으로 투여되어 면역 반응을 강화시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP는 Freund의 불완전 보조제 또는 완전 보조제와 같은 보조제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-a, 또는 IFN-γ 등, 하나 이상의 성장 인자, 예컨대 GM-CSF 또는 G-CSF; 하나 이상의 분자, 예컨대 OX-40L 또는 41 BBL, 또는 이들 분자의 조합 등이 생물학적 보조제로서 사용될 수 있다(예: Salgaller 등, 1998, J. Surg. Oncol. 68(2): 122-38; Lotze 등, 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl l):S61-6; Cao 등, 1998, Stem Cells 16(Suppl l):251-60; Kuiper 등, 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90).

일부 구현예에서, 본 발명은 항체 또는 제공된 HA 폴리펩티드와 관련된 다른 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은, 조작되거나 재조작된 특정 HA 폴리펩티드, 핵산(예: HA 서열에 상보성인 핵산 서열로서, RNAi에 사용될 수 있는 핵산 서열), HA 수용체에 결합되기 위해 경쟁하는 글리칸, 글리칸-HA 폴리펩티드 상호 작용과 경쟁하는 소 분자 또는 글리코모방체(glycomimetics), 또는 이의 임의의 조합이 함유된 바이러스 입자를 인식하는 항체를 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 다양한 구조를 갖는 상이한 제제의 컬렉션이 사용된다. 일부 구현예에서, 치료적 조성물은 하나 이상의 다가 제제(multivalent agents)를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료에는 노출 직후 또는 노출 의심시의 긴급 투여가 포함된다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 면역원성 조성물(예: 백신)은 상이한 종의 인플루엔자 바이러스에 대항해 광범위한 교차 방어를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 조류, 돼지 및/또는 인간-적응형 인플루엔자 A 바이러스에 대항해 교차 방어를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 면역원성 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 A 아형에 대항해 교차 방어를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 인플루엔자 A H1-아형 바이러스의 다수의 균주에 대항해 교차 방어를 제공한다(예: 도 4 및 5 참조).

일반적으로, 면역원성 및/또는 약제학적 조성물은, 멸균수, 염수, 완충된 염수 또는 덱스트로스 용액을 포함하되 이에 한정되지 않는 멸균 생체 적합성 담체와 같은 하나 이상의 비활성 제제에 추가하여 치료제를 포함할 것이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 안정화제, 완충제, 부형제(예: 설탕, 아미노산 등), 또는 보존제와 같은 임의의 다양한 첨가제를 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 인플루엔자 VLP(본원에 기술된 바와 같이 조작되거나 재조작된 HA 폴리펩티드를 포함함)의 치료 유효량을 단독으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하되 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 담체 및 조성물은 무균 상태이며, 제제(formulation)는 투여 방식에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 미량의 습윤제나 유화제, 또는 pH 완충제를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 알약, 캡슐, 서방출(sustained release) 제형 또는 가루일 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 피내 주사, 비강내 투여, 또는 근육내 주사에 맞도록 제형화된다. 임의의 공통적인 약제학적 담체, 예컨대 멸균 염수 용액 또는 참기름 등이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 매질(medium)은 예를 들어 삼투압을 조절하기위한 약제학적으로 허용 가능한 염, 완충액, 방부제 등과 같은 통상적인 약제학적 부속 물질도 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 매질은 생리 식염수 및 참기름이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 내에 존재하는 치료제는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 조작되거나 재조작된 HA 폴리펩티드로 구성될 것이다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 지질 비히클, 생체 활용 가능하고/하거나 생체 적합하고/하거나 생분해성인 매트릭스, 또는 다른 미립자 내에 캡슐화되거나, 포획되거나 결합되는 치료제를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 면역원성 또는 약제학적 조성물은 본원에 기술된 조작되거나 재조작된 헤마글루티닌 폴리펩티드를 나타내는 나노 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 나노 입자는 페리틴(ferritin) 나노 입자이다(예: 미국 등록전 출원 공개 제2014/0072958호 참조).

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나, 백신 및/또는 항체를 포함하되 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. "조합하여(in combination with)"라는 것은, 비록 이러한 전달 방법이 본 발명의 범위 내에 있더라도, 제제가 동시에 투여되어야 한다거나, 동시 전달되도록 제형화되어야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 일반적으로, 각각의 제제는 해당 제제에 대해 결정된 투여 일정에, 결정된 투여량으로 투여될 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적 조성물을, 이의 생물학적 이용 가능성의 개선하거나, 이의 대사를 감소 또는 변형시키거나, 이의 배설을 억제하거나, 체내에서 이의 분포를 변형시킬 수 있는 제제와 조합하여 전달하는 것을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 임의의 대상(예: 임의의 동물)의 치료를 위해 사용될 수 있지만, 가장 바람직하게는 인간의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 조작되거나 재조작된 HA 폴리펩티드는 항바이러스제(예: Oseltamivir [TAMIFLU^®], Zanamavir [RELEZA^®] 등) 및/또는 시알리다아제(sialidase) 중 하나 이상과 조합하여 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 정맥, 근육 내, 동맥 내, 피하, 뇌실 내, 경피, 피부 간, 직장, 질 내, 복강 내, 국소 (분말, 연고, 크림 또는 드롭스에 의해), 점막, 비강, 협측, 창자, 설하를 포함하는 다양한 경로에 의해 투여되고; 기관 내 점적, 기관지 점적, 및/또는 흡입에 의해 투여되고/되거나; 구강 분무, 비강 스프레이, 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 제제의 성질(예: 위장관 환경에서 제제의 안정성), 환자의 상태 (예: 환자가 경구 투여를 견딜 수 있는지 여부) 등을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.

일부 구현예에서, 피하 투여, 정맥 내 투여, 또는 근육 내 투여와 같은 비경구 투여는 주사에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 주사제는 액체 용액이나 현탁액, 주사 전에 액체의 용액 또는 현탁액으로 만들기에 적합한 고체 형태로서, 또는 유화액으로서, 통상적인 형태로 제조된다. 일부 구현예에서, 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립으로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 VLP의 투여는 전신 투여 또는 국부 투여이다.

일부 구현예에서, 인플루엔자 VLP, 또는 이의 조성물은 임의의 적합한 방식으로, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여된다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 투여되는 특정 조성물에 따라 부분적으로 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 따라 부분적으로 결정된다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물에 대한 적합한 제형은 매우 다양하다.

일부 구현예에서, 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 예시적인 비수성 용매는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 올레산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 예시적인 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 비롯하여 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 일부 구현예에서, 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유를 포함한다. 일부 구현예에서, 정맥 내 비히클은 유체와 영양 보충제, 전해질 보충제(예: 링거 덱스트로스에 기초한 것들) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 방부제 및/또는 기타 첨가물이 존재할 수도 있다. 예시적인 방부제 및/또는 기타 첨가물은 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스 등을 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물(인플루엔자 VLP, 또는 본원에 기술된 바와 같은 HA 폴리펩티드를 포함하는 조성물)은 무기 산(예: 염산, 브롬화 수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산) 및 유기 산(예: 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산)과의 반응에 의해 형성되거나, 무기 염기(예: 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨) 및 유기 염기(예: 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민)와의 반응에 의해 형성된 약제학적으로 허용 가능한 산- 또는 염기-부가 염으로서 투여된다.

현재, 구강 또는 비강 분무 경로 또는 에어로졸 경로(예: 흡입)가 치료제를 폐와 호흡기에 직접 전달하는 데 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 약물 전달 과학의 가능한 진보를 고려한 임의의 적절한 경로에 의해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 전달하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 흡입용 제제 또는 에어로졸 전달용 제제는 복수의 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 제제는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 또는 약 13 미크론의 평균 입자 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 흡입용 제제 또는 에어로졸 전달용 제제는 건조 분말로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 흡입용 제제 또는 에어로졸 전달용 제제는, 예를 들어, 습윤제의 포함을 통해 습윤 분말로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 습윤제는 물, 염수, 또는 생리학적 pH의 기타 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 드롭스(drops)로서 비강 또는 구강에 투여된다. 일부 구현예에서, 투여량은 복수의 드롭스(예: 1~100, 1~50, 1~20, 1~10, 1~5 등)를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 계량된 투여량의 조성물(예: 조작되거나 재조작된 HA 폴리펩티드의 조성물)을 전달하는 장치를 사용해 투여된다.

본원에 기술된 약제학적 조성물의 피내 전달에 사용하기에 적합한 장치는 짧은 바늘 장치, 예컨대 미국 특허번호 제4,886,499호, 미국 특허번호 제5,190,521호, 미국 특허번호 제5,328,483호, 미국 특허번호 제5,527,288호, 미국 특허번호 제4,270,537호, 미국 특허번호 제5,015,235호, 미국 특허번호 제5,141,496호, 미국 특허번호 제5,417,662호(이들 모두는 본원에 참조로서 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 피내 투여용 조성물은, 바늘의 피부 내 유효 침투 길이를 제한하는 장치, 예컨대 본원에 참조로서 통합된 제WO1999/34850호에 기술된 것들 및 이들의 기능적 균등물에 의해 투여될 수도 있다. 액체 제트 주사기를 통하거나, 각질층을 관통하고 진피에 도달하는 제트를 생성하는 바늘을 통해 진피에 액체 백신을 전달하는 제트 주사 장치도 적합하다. 제트 주사 장치는 예를 들어, 미국 특허번호 제5,480,381호, 미국 특허번호 제5,599,302호, 미국 특허번호 제5,334,144호, 미국 특허번호 제5,993,412호, 미국 특허번호 제5,649,912호, 미국 특허번호 제5,569,189호, 미국 특허번호 제5,704,911호, 미국 특허번호 제5,383,851호, 미국 특허번호 제5,893,397호, 미국 특허번호 제5,466,220호, 미국 특허번호 제5,339,163호, 미국 특허번호 제5,312,335호, 미국 특허번호 제5,503,627호, 미국 특허번호 제5,064,413호, 미국 특허번호 제5,520,639호, 미국 특허번호 제4,596,556호, 미국 특허번호 제4,790,824호, 미국 특허번호 제4,941,880호, 미국 특허번호 제4,940,460호, 제WO1997/37705호, 및 제WO1997/13537호(이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨)에 기술되어 있다. 압축 가스를 사용해, 피부 외층을 통해 진피까지 대해 분말 형태의 백신을 가속화시키는 탄도 분말/입자 전달 장치도 적합하다. 또한, 피내 투여의 고전적인 망투(mantoux) 방법에는 통상적인 주사기가 사용될 수 있다.

약제학적 제제의 제형화 및 제조에 있어서의 일반적인 고려 사항은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995(본원에 참조로서 통합됨)에서 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 원하는 성과를 달성하기에 적절한 임의의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 원하는 성과는 다수의 인플루엔자 균주에 대항해 지속적인 적응성 면역 반응을 유도하는 것이다. 일부 구현예에서, 원하는 성과는 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상의 강도, 중증도 및/또는 빈도의 감소, 및/또는 발병의 지연을 유도하는 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 상이한 날에 투여되는 다중 투여량으로 투여된다(예: 프라임 부스트 백신 접종 전략(prime-boost vaccination strategies)). 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 연속 투여 방식에 따라 투여되므로, 대상은 치료 투여량이 투여되는 기간 사이에 더 적은 치료 투여량이 투여되는 기간을 겪지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 간헐적 투여 방식에 따라 투여되므로, 대상은 치료 투여량이 투여되는 두 기간 사이에 더 적은 치료 투여량이 투여되는 적어도 한 번의 기간을 겪는다.

일부 구현예에서, 대상에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 대상에서 유익한 치료 반응을 유도하거나, H1N1 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하거나 예방할 정도로 충분해야 한다. 요구 투여량은 대상의 종, 나이, 체중 및 일반적인 상태, 치료 중인 감염의 중증도, 사용되는 특정 조성물 및 이의 투여 방식에 따라 대상마다 달라질 것이다.

본 발명은 다음의 실시예들을 참조함으로써 보다 완전하게 이해될 것이다. 모든 인용 문헌들은 참조로써 통합된다.

실시예

실시예 1. 수용체 결합 부위 이식은 조작된 HA 폴리펩티드의 계절성 면역 프로파일(결합 강도)를 개선한다

본 실시예는, RBS를 비롯하여 인플루엔자 HA 단백질의 구형 헤드 영역을 수혜자의 HA 줄기에 이식함으로써 면역학적 프로파일과 관련된 폭을 증가시킨, 조작된 HA 폴리펩티드의 설계 및 시험을 기술한다. 계절성 면역 프로파일을 나타내는 HA 폴리펩티드의 구형 헤드 영역 중 구조적으로 정의된 영역을 대유행성-유사 균주(뉴저지/1976, 사우스캐롤라이나/1918, 캘리포니아/07/2009 및 신규한 조작된 대유행성 HA) 유래의 HA 분자의 영역 상에 이식하였다. HA 구형 헤드의 3 가지 상이한 영역(RBS 00, RBS 01 및 RBS 02로서 정의됨, 도 1)을 이식에 대해 시험하였다.

본 실시예의 목적을 위해, 이식에 사용된 3 가지 RBS 함유 영역을 G63~G277(CA09 넘버링), V125~G277(CA09 넘버링), 및 P135~P269(CA09 넘버링)로서 정의하였다. 이식을 위해 선택된 이러한 RBS 영역은, RBS가 HA 분자의 나머지로부터 분리될 때 전체 단백질 접힘에 대해 최소한의 파괴를 야기하는 기준에 기초하여 선택되었다. 보다 구체적으로, RBS 영역은, (i) 시작 및 끝 위치가 RBS를 경계로 하는 루프 영역 내에 위치하여, 국부 2차 구조를 보존하는데 도움을 주게 되고, (ii) 분리된 RBS의 컴팩트한 구형 구조가 유지되고, (iii) 계면 접촉은 공여자 RBS가 수혜자 분자 내에 통합될 때 보존되게 하는 방식으로 선택하였다.

대유행성 균주 유래의 수혜자 줄기와 짝을 이루는, 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 유래의 공여자 RBS 영역의 12 가지 개별 조합을 합성하고(표 3), 본원에 참조로서 통합되고 도 2에 도시된 국제 특허출원 번호 제PCT/US2015/033205호에 기술된 바와 같이 유세포 계측법에 기초한 검정을 사용하여 세포 표면 발현 및 적절한 항원 배좌에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 상기 검정은 범용 백신을 위한 기능성 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원을 생성하는 디자인을 확인하기 위한 강력하고 신속한 선별 검정을 제공합니다. 이는 중화 항체 패널을 사용하여 표면이 표시된 조작된 HA 항원의 발현 및 배좌를 분석한다. 이는, 적절히 발현되고 구조적으로 튼튼한 조작된 HA 항원을 동정하고 검증할 뿐만 아니라, 조작된 HA 항원의 면역원성의 폭 및/또는 특이성도 예측한다. HA 헤드의 입체적 에피토프(예: 수용체 결합 부위에 인접한 에피토프)에 결합되는 것으로 알려진 항체 및 HA 줄기의 보존된 입체적 에피토프(예: A 나선)는 항체 패널에 사용될 수 있다. 비 한정적 실시예로서, 적절한 항-헤드 중화 항체는, CH65 (2009 대유행 이전, 동 시대의 계절성 균주) (Whittle, JRR, 등의 PNAS 2011); 5J8 (동 시대 계절성 및 역사적 균주) (Krause, JC, 등의 J. Virology 2011); 4K8 (대유행성 균주) (Krause, JC, 등의, J. Immunology 2011); AH4; 및 AH5 를 포함할 수 있다. 적절한 항-줄기 중화 항체는, C179 (그룹 1 HA) (Okuno, Y 등의 J. Virology 1993); AS2 (그룹 1 HA); AS3 (그룹 1 및 그룹 2 HA); 및 AS4 (그룹 1 HA)를 포함할 수 있다.

[표 3]

상기 검정은 형질감염 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용해 HEK293FT를 플라스미드 DNA로 형질감염시키는 것으로 이루어진다. 형질감염 24시간 후, 표면 염색에 앞서 LIVE/DEAD® Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit으로 세포를 표지하여 세포의 생존력을 확인하였다. 이어서, 염색 완충액 (PBS 중 0.1% BSA) 내에 재현탁시킨 세포를 0.4 μg의 표지되지 않은 중화 항-헤마글루티닌 단클론 항체(예: CH65, 5J8, 4K8, AS3, C179, AS2 또는 AS4)로 염색하였다.

염색된 세포를 세척하고, 0.2 μg의 Alexa Fluor® 488 항-인간 또는 항-마우스 IgG 2차 항체가 함유된 (1차 항체에 따라 다름) 100 μL의 염색 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 20분 동안 2차 항체로 염색하였다. 마지막으로, 염색된 세포를 고정 용액(PBS 중 1.75% 포름알데히드)에 재현탁시키고, 4℃에서 = 1 주일 저장하였다.

유세포 계측 분석

고정된 세포를 세척하고 200 μL의 PBS에 재현탁시킨 다음, BD High-Throughput Sampler를 사용해 샘플을 수득하기 위해 deep-well 96-웰 플레이트에 옮겼다. 488 nm 레이저(Alexa Fluor® 488 여기용)와 635 nm 레이저(LIVE/DEAD 원적외선 염료 여기용)가 장착된 BD FACS Calibur 유세포 계측기를 사용해 샘플 분석을 수행하였다. Alexa Fluor® 488 2차 항체로 염색되었지만 1 차 항체가 없는 모의-형질감염된 세포 샘플을 사용해 최적의 수득 설정을 결정하였다. 특히, 전방 산란(FSC) 증폭 게인, 측방 산란(SSC) 전압 및 FSC 임계치를 조정하여 HEK293FT 세포 개체군을 등급별로 표시하고 불필요한 찌꺼기를 배제시켰다. FSC 대 SSC 플롯에서 세포 개체군을 게이팅하여 찌꺼기를 더 배제시켰다. 2차 항체만으로 염색된 모의-형질감염 세포를 사용해 형광 검출기 설정도 조정하였다. 특히, FL1 검출기(Alexa Fluor® 488 형광 검출용) 및 FL4 검출기(LIVE/DEAD 원적외선 염료 형광 검출용)의 전압을 조정하여 게이팅된 세포 개체군의 형광 방출을 첫 번째 log decade에 위치시켰다. Alexa Fluor® 488과 LIVE/DEAD 원적외선 염료 사이에는 스펙트럼 겹침이 없으므로, 본 형광체 조합에 대해서는 보상 조정이 필요하지 않았다. 모의 대조군과 동일한 수집 설정을 사용해 모든 샘플을 수집하였다. FSC 대 SSC 게이트 내에서 적어도 10,000 개의 세포를 각각의 샘플에 대해 계수하고, 데이터를 FCS 데이터 파일로 저장하였다.

FlowJo 소프트웨어를 사용해 데이터 분석을 수행하였다. 2차 항체로만 염색된 모의-형질감염 세포에 상응하는 FCS 데이터를 사용해 분석 게이트를 생성하였다. 특히, 온전한 세포 개체군을 포함하는 게이트를 FSC 대 SSC 플롯에 먼저 그렸다. 그런 다음, 게이팅된 이 세포의 서브세트를, FL4 형광 강도(LIVE/DEAD 원적외선 염료 형광) 대 FSC를 표시하는 별도의 플롯에서 분석하였다. 낮은 FL4 형광 강도를 갖는 세포 개체군을 포함하는 새로운 게이트를 생성하였다. 온전한 활 세포에 상응하는 이러한 새로운 세포의 서브세트를 FL1 형광 강도(Alexa Fluor® 488 형광) 대 FSC를 표시하는 별도의 플롯에서 추가로 분석하였다. 음성 FL1 분획에서 모의-형질감염 세포의 95%를 남기는 형광 값에 의해 정의된 바와 같이, 양성 FL1 형광을 갖는 세포를 포함하는 새로운 게이트를 생성하였다. 동일한 분석 게이트를 사용해 모든 FCS 파일을 분석하였다. 각각의 세포 샘플 및 염색에 대한 양성 FL1 세포 서브세트의 중앙 형광 강도(MFI)를 엑셀 파일로 내보내고, 이를 사용해 항체 결합 비를 계산하였다.

각각의 세포 샘플 및 염색에 대한 양성 FL1 세포 서브세트의 MFI는, 2차 항체만으로 염색된 동일한 세포 샘플에 상응하는 백그라운드 형광을 공제함으로써 먼저 보정하였다. 중화 항-헤마글루티닌 단클론 항체 각각을 사용하는 염색의 특이성은 모의-형질감염 세포(음성 대조군)의 백그라운드 보정된 MFI 및 야생형 HA 플라스미드 DNA로 형질감염된 세포(양성 대조군)의 백그라운드 보정된 MFI를 검사하여 확인하였다. 대조군에 대한 MFI가 예상 값 범위 내에 있는 경우, 조작된 각각의 HA 플라스미드 및 중화 항-HA 단클론 항체에 대한 항체 결합 비를 다음과 같이 결정하였다:

MFI (HA x, 1차 ab y) - MFI (HA x, 2차 ab만)

항체 결합 비(ABR) = -------------------------------------------------------------------------------------------------------

MFI (야생형 HA, 1차 ab y) - MFI (야생형 HA, 2차 ab만)

재조합 HA 폴리펩티드 각각은 표면 발현되었으며 (즉, 감염된 세포에서 생성된 야생형 인플루엔자 항원과 유사한 세포 간 처리가 가능함) 유세포 분석 검정에서 항-줄기 항체 패널의 결합에 의해 결정된 바와 같이 줄기 접힘을 유지하였다(야생형 균주 대조군과 유사하거나 더 양호함)(도 3). 또한, 이 실험은, 일부 경우에는, 헤드 영역의 변형이 항-줄기 mAbs에 대한 결합을 약간 증가시켰음을 입증한다. 따라서, 한 장소에서의 치환이 먼 위치에 대한 대한 장거리 알로스테릭 효과를 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 대유행성 줄기에 계절성 RBS-영역 줄기를 이식하여 생성된 새로운 재조합 HA 폴리펩티드는 놀랍게도 계절성 면역 프로파일이 개선되었음을 입증하였다. 이러한 재조작된 재조합 HA 폴리펩티드는 최초의 조작된 HA 부모 분자(SMARt_DO2a)에 비해 계절성 균주 중화 항체의 결합이 증가하였음을 입증하였다. (도 4). 이러한 검정에서, "mAb 결합의 증가"는 대조군에 대해 상대적으로 재조작된 HA에 결합된 항체의 평균 형광 강도의 척도이다: CH65 및 5J8 항체에 대해 미변형된 조작된 부모 HA(SMARt_DO2a), 및 4K8에 대해 야생형 대유행성 균주인 A/캘리포니아/7/2009 H1N1. 따라서, "mAb 결합의 증가"는 항체 친화성(affinity)의 대략적인 척도이다. 일부 경우, (mAb 결합에 의해 측정된 바와 같이) 계절성 면역 프로파일은 계절성 조작된 부모 HA 분자에 비해 2~3 배 개선되었다. (도 5; 컬럼 2의 계절성 헤드 항체 결합(예: CH65 및 5J8)을 컬럼 5 및 6의 재조작된 작제물과 비교함).

이식된 항원의 RBS 부분이 우세한 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA의 RBS 부분과 동일하므로, 수혜자 대유행성 균주에 대해 상대적인 폭의 확장은 재조작된 HA의 비-RBS 부분에서 유래한다. 폭의 증가는 HAI 검정 또는 RBS를 표적으로 하는 항체에 대한 결합 검정에서보다는 생체내 실험에서 보다 분명해진다.

실시예 2. N- 결합된 글리코실화 부위 및/또는 루프 삽입의 파괴는 조작된 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭을 증가시킨다

본 실시예는, 예상 N-결합된 글리코실화 부위와 관련된 잔기를 변형하고, RBS를 경계로 하는 루프 내에 리신을 도입함으로써, 조작된 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭을 증가시키기 위한 제2 전략을 기술한다. 계절성 인플루엔자 균주는 대유행성 균주와 비교하여 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 추가로 함유한다. 글리코실화는 면역 반응을 변경시키는 HA 내의 항원 부위를 차단할 가능성이 있다. 이러한 글리코실화 부위는 서열 모티프 NxS/Ty에 의해 확인된다(x 및 y는 프롤린(P)이 아님). 이러한 N-결합된 글리코실화 패턴의 아스파라긴은 수용체 결합 부위의 142 및 177(CA09 넘버링)에 상응하는 잔기에서 또는 그 부근의 HA 폴리펩티드에서 발견될 수 있다(도 6; 좌측 패널은 야생형 대유행성 H1N1 균주에서의 관련 서열, 및 예시적인 조작된 HA 폴리펩티드 "DO2"에서의 상응하는 글리코실화 된 서열을 입증함).

HA RBS 영역 내 또는 그 근처의 루프 내에 리신을 삽입하는 것은 N-결합된 글리코실화 부위가 대유행성 인플루엔자 A 바이러스의 특징이라는 것을 예측한 것이다. N-결합된 글리코실화 부위 근처의 루프 내로 삽입하면 (예를 들어, 리신이나 아르기닌 잔기를 삽입하면) 조작된 HA 폴리펩티드에 내에 대유행성 균주 특징이 제공된다(도 6; 중앙 패널).

CH65 에피토프에 인접한 RBS 부위 주변의 잔기를 변형시키면 대유행성 인플루엔자 A 바이러스의 특징이 더 통합된다(도 6; 우측 패널).

예측된 N-결합된 글리코실화 부위를 변형시키고/시키거나 리신을 루프에 삽입함으로써, 조작된 HA 폴리펩티드에 부여된 면역학적 폭의 증가를 입증하기 위해, 예시적인 조작된 HA 폴리펩티드("SMARt_DO2a") 내의 특정 아미노산 잔기를 변형시켜 대유행성-유사 HA 폴리펩티드에서 관찰된 것들을 반영하였다. 표 4는 순환하는 인플루엔자 A 바이러스의 각 위치에서 관찰된 잔기로부터 결정된 바와 같이, 이들 부위에서 일어날 수 있는 잠재적인 아미노산 치환을 입증한다.

[표 4]

N-결합된 글리코실화 부위의 파괴가 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭에 미치는 영향을 입증하기 위해, 2 개의 N-결합된 글리코실화 모티프 부위를 파괴하여 조작된 HA 분자를 생성하였다. 또한, N-결합된 글리코실화 모티프 부위가 파괴되고 RBS를 경계로 하는 루프 내에 리신이 삽입된, 2 개의 조작된 HA 폴리펩티드를 생성하였다(표 5). 리신을 루프에 삽입하는 것과 조합하는 경우는 물론이고, 글리코실화 모티프를 파괴하는 것 만으로도, 표면 발현되고 (유세포 계측 검정에 의해 확인된 바와 같이) 줄기 접힘을 유지하는 재조합 HA 폴리펩티드를 생성하였다(도 7). 다시 한 번, 헤드 영역의 변형으로 항-줄기 mAbs에 대한 약간의 결합 증가가 유도되었음이 관찰되었으며; 이는 한 장소에서의 치환이 먼 위치에 대한 장거리 알로스테릭 효과(allosteric effects)를 나타낼 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 변형은 또한 항체 패널에 의한 인식에 기초하여 면역학적 폭의 증가에 기여하였다(도 8). 보다 구체적으로, 재조작된 항원 중 몇 가지는, 계절성 속성의 증가(항-계절성 헤드 항체 CH65 및 5J8의 mAb 결합 증가); 및 항-대유행성 헤드 항체 4K8(도 8의 작제물 DO2a_m1 to m3 참조)의 결합을 50~150% 증가시킴으로써 입증된 폭의 증가 등 둘 모두를 입증하였다.

[표 5]

실시예 3. RBS 및 N- 결합된 글리코실화 영역에서 아미노산 잔기의 변형은 조작된 HA 폴리펩티드의 면역학적 폭을 증가시킨다

본 실시예는, 아미노산 치환의 도입에 의한, HA의 RBS 영역 또는 이에 인접한 영역에서의 조작된 HA 폴리펩티드에 대한 변형을 기술한다. 아미노산 치환은 위치 특이적이며, 순환하는 인플루엔자 A 바이러스에서 HA 헤드 영역의 분석을 통해 확인된 잔기로부터 유래한다. 표 6은 특정 아미노산 치환이 HA의 구형 헤드의 표적화된 변형을 위해 선택되었던 (CA/09 넘버링에 기초한) 잔기 60 내지 291을 포함하는 특정 위치에서의 잔기 풀을 기술한다. 표 7에서 기술된 바와 같이, 특정 아미노산 치환이 HA의 구형 헤드의 표적화된 변형을 위해 선택되었던 (CA/09 넘버링에 기초한) 잔기 137 내지 262를 포함하는 특정 위치에서의 잔기 풀은 더 작다. 표 8은 RBS의 10 옹스트롬 이내에 있는 잔기에 대해 HA의 면역학적 프로파일의 표적화된 변형을 위해 사용된 잔기 풀을 기술한다. 이러한 잔기들은 도 9에서 음영으로 표시되어 있다.

[표 6]

[표 7]

[표 8]

원칙의 증명으로서 시험된, 계절성 면역 프로파일을 갖는 조작된 HA 폴리펩티드의 잔기의 변형이 표 9에 기술되어 있다. RBS 영역 변형을 전술한 글리코실화 프로파일 변형(예를 들어, 글리코실화 부위의 제거)과 조합하는 것을 이러한 변형에 포함시켰다. 이러한 변형을 통해 적절히 접히고 표면 발현된 재조합 HA 폴리펩티드를 생성하였다(도 7). 다시 한 번, 헤드 영역의 변형으로 항-줄기 mAbs에 대한 약간의 결합 증가가 유도되었음이 관찰되었으며; 이는 한 장소에서의 치환이 먼 위치에 대한 장거리 알로스테릭 효과(allosteric effects)를 나타낼 수 있다는 것을 입증한다. 재조작된 재조합 HA를 대유행성 및 계절성 특이적 항체 모두에 의해 인식하였다(도 8). 흥미롭게도, RBS 변형만으로도 계절성 면역 프로파일을 개선하였지만(도 8, DO2a_m4-m5; "변형된 CH65"), 대유행성 프로파일에는 거의 영향을 미치지 못했다. 그러나, RBS 영역 변형과 글리코실화 변형과의 조합은 계절성 및 대유행성 면역 프로파일 모두를 상당히 개선하였다. (도 8, DO2a_m7-m9; △글리코실 + mCH65"). 이 데이터는, 변형이 계절성 면역 프로파일을 개선하였고("mAb 결합 증가"), 더 대유행성인 면역 프로파일을 부여함으로써("폭 증가"), 예시적인 조작된 HA 폴리펩티드(예: SMARt_DO2a)에서 항원 변이와 항원 교대를 다룰 수 있는 전체적으로 더 균형잡힌 면역 프로파일을 만든다는 것을 나타냈다.

[표 9]

실시예 4. 조작된 HA 폴리펩티드의 생체내 효능

본 실시예는, 본원에 기술된 방법에 따라 변형된, 조작된 HA 폴리펩티드가 여러 가지 인플루엔자 균주에 대항해 광범위한 항체 반응의 형태로 면역 반응을 유도한다는 것을 예시한다.

조작된 모자이크 헤마글루티닌(HA)을 함유하는 바이러스-유사 입자( VLP )의 제조

인플루엔자 VLP는 무혈청 Freestyle293 배지에서 HEK293T 세포의 3-플라스미드 일과성 형질감염에 의해 제조된다. 조작된 HA 폴리펩티드 서열을 암호화하는 플라스미드뿐만 아니라 NA, 및 HIVgag에 대한 플라스미드를 1:1:1의 비율로 혼합하고, HEK293T 세포를 일과성으로 형질감염하는 데 사용하였다. 형질감염 후 120 시간만에 배양 상청액을 수확하고, 상청액 중의 VLP를 20% 수크로오스 상에서의 초원심 분리에 의해 펠렛화 하고, PBS에 재현탁한다.

조작된 HA를 발현하는 VLP로 마우스 면역화하기

조작된 모자이크 HA 디자인의 면역원성을 평가하기 위해, 6~8 주령의 암컷 BALB/c 마우스 그룹을 5 μg의 인플루엔자 VLP 또는 비히클 단독으로(PBS) 면역화한다. 모든 면역화제는 수중 유적형(oil-in-water) 보조제와 함께 유화제로서 제형화하고, 총 100 μL 부피를 피하 전달한다. 면역 개시일로부터 21일 차에 각각의 그룹에 동일한 추가 투여량을 투여한다. 0일 차 및 35일 차에, 각각의 동물로부터 면역 전 및 면역 후 혈청을 각각 수집한다. 분석에 사용되는 혈청 풀은 그룹 내 각각의 동물 유래의 혈청을 동일 부피로 혼합하여 준비한다.

헤마글루티닌 억제 ( HAI ) 검정

각 그룹에서 모은 혈청의 순차 희석액을 바이러스가 표시된 4 개의 헤마글루티닌 유닛과 혼합하고, 실온에서, 둥근 바닥 플레이트에서 30 분 동안 항온 배양한다. 그런 다음, 각각의 혈청/바이러스 혼합물을 염수 중 0.5% 칠면조 적혈구와 동일한 부피로 혼합한다. 혈청이 결핍된 대조 웰이 완전한 적혈구 응집 반응(~30 분)을 나타낼 때 플레이트에 점수를 매긴다. HAI 역가는, 시험한 웰의 50%에서 적혈구 응집 반응을 완전히 억제하는 최대 혈청 희석액으로서 정의한다.

미세중화 (MN) 검정

각각의 그룹에서 모은 혈청의 순차 희석액을 바이러스의 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50) 100과 혼합하고, 37℃에서 1 시간 동안 항온 배양한다. 그런 다음, 각각의 혈청/바이러스 혼합물을 madin darby canine kidney (MDCK) 세포의 융합 단일층에 첨가하고, 37℃에서 24 시간 동안 항온 배양한다. 그런 다음, 단일층을 고정시키고, 감염된 웰을 인플루엔자 핵단백질의 ELISA 검출에 기초하여 확인한다. MN 역가는, 시험된 웰 중 50%에서 바이러스 감염을 완전히 중화시키는 혈청의 최고 희석액으로서 정의한다.

면역원성 검정

HAI 검정은, RBS 영역이 수혜자 줄기 영역에 이식된 변형된 재조합 HA 폴리펩티드, 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 제거하거나 조작하기 위한 변형, 및/또는 RBS 영역의 잔기에 대한 표적화된 변형을 사용해 수행한다. 이들 변형된 재조합 HA 폴리펩티드는 더 광범위한 면역 반응을 유도한다.

실시예 5. 예시적인 변형된 재조합 HA 폴리펩티드

본 실시예는 본원에 기술된 다양한 방법을 사용해 생성된 예시적인 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 예시한다.

DO2aRBStrunc00_resG63_G278_graftedontDo1a (서열 번호 7)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSDTPVHDCNTTCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc00_resG63_G277_graftedontoCal2009 (서열 번호 8)

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DO2aRBStrunc00_resG63_G277_graftedontoSC1918 (서열 번호 9)

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DO2aRBStrunc00_resG63_G277_graftedontoNJ1976 (서열 번호 10)

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DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoDo1a (서열 번호 11)

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DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoCal2009 (서열 번호 12)

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DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoSC1918 (서열 번호 13)

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DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoNJ1976 (서열 번호 14)

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DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoDo1a (서열 번호 15)

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DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoCal2009 (서열 번호 16)

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DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoSc1918 (서열 번호 17)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFEKFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALNRGSGSGIITSDAPVHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVRNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoNj1976 (서열 번호 18)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDRHNGKLCKLGGIAPLHLGKCNIAGWLLGNPECELLLTVSSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFAMNRGSGSGIIISDAPVHDCNTKCQTPKGAINTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQRSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVRSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCDDTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_NGlyMod (서열 번호 19)

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SMARt_NC_DO2a_NGlyMod+loopInsertion(CA09) (서열 번호 20)

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SMART_NC_DO2A_NGLYMOD+LOOPINSERTION(SC18) (서열 번호 21)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHETTKGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPKLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope1 (서열 번호 22)

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SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope2 (서열 번호 23)

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SMARt_NC_DO2a_mods_outside_ch65_eptiope3 (서열 번호 24)

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SMARt_NC_DO2a_mods_outside_ch65_eptiope1-noGly (서열 번호 25)

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SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope2-noGly (서열 번호 26)

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SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope3-noGly (서열 번호 27)

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본 출원은 또한 본원에 기술된 서열 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 변형된 재조합 HA 폴리펩티드를 포함한다.

실시예 6. 대유행성 특징을 증가시키는 재조합 HA 폴리펩티드의 변형

추가적인 디자인을 선택하여, DO2a 탈글리코실화/RBS 변형이 Ab 반응의 폭 및 대유행성 A/캘리포니아/09 접종에 대항하는 예방력에 미치는 효과를 시험하였다. MFI 검정에서 탈글리코실화 작제물에 결합하는 4K8의 게인에 의해 입증된 바와 같이, SMARtDO2a RBS의 재조작은 항체를 광범위하게 중화함으로써 인식을 개선하였다(도 10). 원래의 SMARt DO2a 디자인은 생체내 평가에 기초하여 계절성으로 편향되었는데; 대유행성 균주까지 폭이 확대되도록 디자인을 수정하였다. mAbs의 패널을 사용하는 시험관내 검정에서는, 수정된 디자인의 일부에 대한 대유행성 mAbs의 결합이 나타났다. 디자인의 서브세트를 A/캘리포니아/07/2009에 대항하는 생쥐 접종 모델에서 평가하였다. 그 결과, 변형이 대유행성 인플루엔자 A에 대항하는 면역 반응 프로파일을 개선한다는 것이 입증되었다.

재조작된 HA를 발현하는 VLP로 마우스 면역화하기

재조작된 모자이크 HA 디자인의 면역원성을 평가하기 위해, 6~8 주령의 암컷 BALB/c 마우스 그룹을 3 μg의 인플루엔자 VLP 또는 비히클 단독으로(PBS) 면역화한다. 모든 면역화제는 수중 유적형(oil-in-water) 보조제와 함께 유화제로서 제형화하고, 도 10에 도시된 바와 같이, 총 100 μL 부피를 근육 내 전달한다. 면역 개시일로부터 21일 차 및 42일 차에 각각의 그룹에 동일한 추가 투여량을 2 번 투여한다. 0일 차에 각각의 동물로부터 면역 전 혈청을 수집한다. 42일 차, 56일 차, 및 69일 차에 각각의 동물로부터 면역 후 혈청을 수집한다. 도 11은 면역화 및 후속하는 생체 내(in vivo) 평가를 위한 일정표를 도시한다. 분석에 사용되는 혈청 풀은 그룹 내 각각의 동물 유래의 혈청을 동일 부피로 혼합하여 준비한다.

[표 10]

재조작된 HA를 발현하는 VLP로 면역화된 마우스의 생존율 및 체중

70일 차에, 동물들에게 대유행성 A/캘리포니아/2009의 LD₅₀을 10 배로 접종하고, 접종 후 사망률을 모니터링하였다. A/캘리포니아/09 접종에 대항해 접종 후 14 일 동안 동물의 80%가 생존했던, 원래의 SMARtDO2a를 이용한 면역화는, 비히클만으로 면역화한 동물들의 100%가 접종 후 6 일 차에 사망한 것과 비교해 예방적이었다. 차세대 DO2a 변형은, SMARtDO2a_m8를 이용한 면역화가 시험된 동물의 100%를 보호하는 데 효과가 있었던 원래의 SMARtDO2a와 비교해 생존률을 개선하였다(도 12).

바이러스 접종 후 동물들의 체중 감소율을 모니터링하였다. 차세대 DO2a 변형은 원래의 SMARtDO2a와 비교해 체중 유지를 개선하였다. SMARtDO2a_m8은 바이러스 접종으로 유도된 체중 감소에 대해 최선의 예방을 제공했다(도 13).

재조작된 HA를 발현하는 VLP로 면역화된 마우스의 바이러스 폐 역가

접종 후 4 일 차에 바이러스 폐 역가에 대해 마우스를 추가로 모니터링하였다. SMARtDO2a 작제물을 이용한 면역화는 PBS와 비교해 바이러스 폐 역가가 더 낮았다. SMARtDO2a_m8 작제물은 PBS와 비교해 폐 역가를 10 배 감소시켰고, 모든 다른 DO2a 작제물보다 바이러스 폐 역가가 상당히 낮았다(도 14).

헤마글루티닌 억제 (HAI) 검정

각 그룹에서 모은 혈청의 순차 희석액을 바이러스가 표시된 4 개의 헤마글루티닌 유닛과 혼합하고, 실온에서, 둥근 바닥 플레이트에서 30 분 동안 항온 배양한다. 그런 다음, 각각의 혈청/바이러스 혼합물을 염수 중 0.5% 칠면조 적혈구와 동일한 부피로 혼합한다. 혈청이 결핍된 대조 웰이 완전한 적혈구 응집 반응(~30 분)을 나타낼 때 플레이트에 점수를 매긴다. HAI 역가는, 시험한 웰의 50%에서 적혈구 응집 반응을 완전히 억제하는 최대 혈청 희석액으로서 정의한다. SMARtDO2a_m8 마우스에서의 A/캘리포니아/09 HAI 반응은 PBS (P<0.001)와 상당히 달랐지만, 24 마리 중 6 마리에서만 HAI 역가가 1:40 이상이었다(도 15). 모든 다른 DO2a 작제물에 대한 예방 메커니즘은 명확하지 않다.

모든 차세대 변형 DO2a 작제물은 A/캘리포니아/09 접종시 사망률을 부분적으로 예방할 수 있었다. SMARtDO2a_m8이 사망률, 체중 감소 및 바이러스 폐 역가에 있어서 최선의 감소를 나타냈다. 또한, SMARtDO2a_m8은 A/캘리포니아/09 균주에 대항해 HAI 반응을 유도하는 유일한 DO2a 작제물이었는데, 이는 예방의 개선이 헤드 반응과 관련되었을 수 있다는 점을 시사한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 차세대 DO2a 변형은 대유행성 인플루엔자 A 접종에 대항하는 예방력 증가에 성공적이었다.

균등물

청구범위에서 "제1", "제2", "제3"등과 같은 서수 용어를 사용해 청구항 요소를 변경하는 것은 그 자체로 어떠한 우선 순위, 선행관계, 또는 하나의 청구항이 다른 청구항에 우선하는 것, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간적 순서를 의미하지 않으며, 단지 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 요소를 동일한 명칭을 갖는 다른 요소와 구별하기 위해 (서수 용어의 사용이 없었더라면) 표지로서 사용되어 청구항 구성요소들을 구별하기 위한 것이다.

본 명세서 및 청구항에서 사용되는, 단수 표현은 분명하게 반대로 가리키지 않는 경우라면 복수의 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 한 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 '또는'을 포함하는 청구항 또는 기술내용은 그룹 구성원 중 하나, 하나 이상, 또는 모두가 존재하거나 적용되는 경우, 또는 달리 정반대로 표시되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명백한 경우가 아닌 한 주어진 산물 또는 공정에 적절한 경우, 만족되는 것으로 고려된다. 본 발명은 정확히 그룹의 한 구성원이 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 공정에 적절한 구현예를 포함한다. 또한 본 발명은 그룹의 하나 이상 또는 구성원 전부가 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 공정에 적절한 구현예도 포함한다. 또한, 본 발명은 달리 표시되지 않는 한 또는 반박이나 불일치가 나올 수 있는 기술분야의 당업자에게 자명한 경우가 아닌 한 하나 이상의 나열된 청구항으로부터 나온 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 기술적 용어 등이 동일한 기초 청구항(또는 적절한 다른 청구항)에 의존하는 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형, 조합, 및 치환을 포괄하는 것으로 이해된다. 요소가 리스트로서 나타내는 곳에서는(예컨대, 마쿠쉬(Markush) 그룹 또는 유사한 형식), 요소의 각 하위그룹도 역시 개시되고 또한 임의의 요소(들)이 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 양태는 특정한 요소, 특징 등을 포함하는 것으로서 언급되는 곳에서는, 본 발명의 특정 구현예 또는 본 발명의 양태는 이러한 요소, 특징 등으로 구성되거나 이로 필수적으로 구성되는 것으로 이해되어야 한다. 간략하게 기술하기 위해, 이러한 구현예는 모든 경우에 있어 본 명세서에서 많은 말로서 상세하게 개시되지 않았다. 또한 본 발명의 임의의 구현예 또는 양태는 특정한 배제가 본 명세서에 재인용되는지 여부와는 상관없이, 청구항로부터 명확하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본원에서 참조된 출판물, 웹사이트, 및 기타 다른 참고물은 참조로써 본원에 의해 포함된다.

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Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr 195 200 205 His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 225 230 235 240 Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala 260 265 270 Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285 Asp Lys Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ile Pro Phe Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 27 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 27 Met Lys Ala Lys Leu Leu 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Claims (102)

1. 조작된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩티드의 면역원성 프로파일을 변경시키는 방법으로서:
   a) 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 헤드 영역 내에서 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위의 존재 또는 부재를 확인하는 단계로서, 헤드 영역이 서열 번호 1의 잔기 63-278, 125-277 또는 135-269에 상응하는 위치에서 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 세그먼트인, 단계;
   b) 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 헤드 영역 내로 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 도입하여 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하거나 추가의 N-결합된 글리코실화 부위를 삽입하는 단계; 및
   c) 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 수용체 결합 부위(RBS) 영역 내에 또는 이에 인접한 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하고/하거나 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 RBS를 경계로하는 루프 또는 루프들에 리신(K) 또는 아르기닌(R) 잔기의 삽입을 도입하는 단계를 포함하며,
   이로써 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드와 비교하여 변경된 면역원성 프로파일을 갖는 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드 생성하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위 또는 추가적인 N-결합된 글리코실화 부위는 NxS/Ty의 공통 서열에 의해 정의되고, 여기서 x 및 y는 프롤린(P)이 아닌, 방법.
3. 제2항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드는 NxS/Ty 공통 서열의 1-5개 아미노산 내에 삽입된 리신(K) 또는 아르기닌(R) 잔기를 포함하는, 방법.
4. 제2항에 있어서, 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위를 파괴하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 공통 서열 NxS/Ty를 z¹z²z³z⁴로 변형시키는 것을 포함하며,
   z¹은 N, D, K 또는 S이고;
   z²는 Y이거나 불변이고;
   z³은 E, D 또는 N이고; 그리고
   z⁴는 I, L, P, S 또는 T이거나, 불변인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추정상 N-결합된 글리코실화 부위는 서열 번호 2의 위치 142-145 및/또는 177-179에 상응하는 위치에 있는, 방법.
6. 제1항에 있어서, RBS가 단클론 항체 CH65의 파라토프에 의해 결합된 에피토프를 포함하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드가 서열 번호 2의 잔기 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 214, 244, 245 및/또는 262에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드가 서열 번호 2의 잔기 137, 144, 145, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 177, 210, 211, 212, 213, 및/또는 214에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 면역원성 프로파일은 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드보다 더 대유행성인, 방법.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 면역원성 프로파일은 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드보다 더 계절성인, 방법.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 발현 및 배좌를 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드가 인플루엔자 바이러스의 계절성 및 대유행성 균주 모두에 대항하는 중화 항체를 유도하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 변경된 면역원성 프로파일이 계절성 및/또는 대유행성 인플루엔자 균주에 대항하는 하나 이상의 항-헤드 단클론 항체의 결합을 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드의 변경된 면역원성 프로파일이 대유행성 인플루엔자 균주에 대항하는 항-헤드 단클론 항체의 결합 폭을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
15. 제13항에 있어서, 결합의 증가가 포유동물 세포의 표면 상에 발현된 재조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드에 결합된 단클론 항체의 유세포 분석 검출에 의해 결정되는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 단클론 항체 결합 수준을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 인플루엔자 HA 폴리펩티드가 컴퓨터에 의해 최적화된 광범위 반응성 항원(COBRA) 기술, 모자이크 기술, 구조 도메인의 결실 및/또는 재배열, 도메인 스와핑, 또는 다수의 인플루엔자 균주 중 중화 또는 교차 반응성 에피토프의 조합에 의해 조작되는, 방법.
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