CN109563138B

CN109563138B - 经改造的流感血凝素多肽的修饰

Info

Publication number: CN109563138B
Application number: CN201780048571.4A
Authority: CN
Inventors: T·斯卓内尔; E·奥卢; R·奥门
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2037-06-02
Also published as: SG11201810758WA; AU2017275663B2; MX2018014887A; MA45159A; CA3026094A1; CN115746107A; AU2022201514B2; MX2023008256A; JP2022153591A; US11116832B2; JP2020141703A; SG10201913650WA; EP3464327A1; KR20230061583A; EA201892385A1; IL263416A; CN109563138A; JP7479424B2; US20220054623A1; KR20190039065A

Abstract

本发明尤其提供了具有扩宽的免疫原性谱的经修饰的重组HA多肽，其将覆盖范围扩展至抗原性不同的流感毒株，以及其制备和使用方法。

Description

经改造的流感血凝素多肽的修饰

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2016年6月3日提交的美国临时申请62/345,502的优先权，所述美国临时申请整体在此以引用的方式并入。

背景技术

流感在大流行病、地方流行病、复苏和爆发方面具有悠久的历史。疫苗已成为针对流感最有效的防御。然而，由于流感继续跨越全球引起严重的健康问题，所以设计和制造逐年诱导毒株特异性免疫的疫苗的努力一直很困难。实际上，目前上市的流感疫苗必须基于即将到来的季节中将存在于人群中的预测毒株每年进行更新。

目前的流感疫苗基于诱导对流感病毒的表面上存在的血凝素抗原的免疫。血凝素(HA)是负责通过与其膜上的含唾液酸结构的相互作用将流感病毒与细胞结合的糖蛋白。由于病毒的持续突变和通过宿主的免疫压力，它跨越流感毒株是高度可变的。HA 分子中的可变性(也称为抗原漂移)导致基于HA多肽的疫苗一般仅对相关循环病毒的小亚集反应。随着时间过去，随着病毒继续突变，交叉反应毒株的数目降低。因而，当HA分子的变异使得现有疫苗不再有效时，定期修饰流感疫苗的HA组合物。在目前针对流感疫苗接种的策略中，通用疫苗的开发有希望增加目前毒株特异性疫苗的宽度和对抗原漂移的耐受性。通用流感疫苗具有保护人和动物不受广泛范围的流感类型、亚型和毒株(包括大流行和/或季节性毒株)的潜力。设计通用流感抗原的几种方法是本领域已知的。然而，现有方法经常导致HA多肽仍然偏向季节性或大流行毒株。

发明内容

本发明提供了具有扩宽的免疫原性谱的改进的经修饰的重组HA多肽，其将覆盖范围(即，引发针对HA多肽的免疫原性应答的能力)扩展至抗原性不同的流感毒株，例如新的或另外的大流行和/或季节性流感株。本发明部分基于从循环流感毒株中的序列变异的计算机芯片分析推导的修饰，HA的抗原区域的绘制，和/或HA肽的表位模式和结构分析。随后可以在具有已知免疫谱的HA多肽的各种氨基酸残基位置和/ 或特定区域处引入靶向修饰，以产生具有改善的和更平衡的免疫谱的新型HA多肽。如下文详细描述的，包括实例部分，本发明人已尤其开发了用于改造HA多肽以扩展季节性应答谱以覆盖大流行毒株的各种不同策略，或反之亦然。这些策略扩展了跨越抗原性不同毒株的序列(或进化枝)簇的免疫谱；随着时间过去，它们可以应用于经改造的重组HA分子，使得它继续引发针对抗原漂移的循环季节性毒株的免疫应答。在所有情况下，该策略被设计为一般保留宿主HA多肽的受体结合位点(RBS)的特定残基，其具有在RBS附近的区域中改造的修饰。类似的策略可以用于扩展大流行应答谱，以覆盖季节性毒株。本发明的组合物和方法适用于广泛多样的重组HA多肽，包括通过各种方法改造的那些和包含基本上野生型序列的那些。

因此，在一个方面，本发明提供了重组血凝素(HA)多肽，其包含源自具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽的经改造的头区或其区段和源自大流行毒株的茎区。在一些实施例中，经改造的头区或其区段包含与对应于SEQ ID NO:1的位置135 –269、125–277、或63–278的氨基酸至少95％、96％、97％、98％、99％或更相同的序列。在一些实施例中，经改造的头区或其区段包含与对应于SEQ ID NO:1 (SMARt_DO2a序列)的位置135–269、125–277、或63–278的氨基酸相同的序列。

在一些实施例中，茎区源自天然存在的或野生型大流行毒株。在一些实施例中，合适的天然存在的大流行毒株选自A/California/07/2009、A/New Jersey/10/1976或 A/South Carolina/1/1918。在一些实施例中，茎区源自具有大流行性免疫谱的经改造的 HA多肽。

在一些实施例中，具有大流行性免疫谱的经改造的HA多肽通过以下进行改造：计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)技术、拼接技术、基于共有区的流感毒株组合、结构域的缺失和/或重排、结构域交换或者多个流感毒株中的中和或交叉反应表位的组合。

在另一个方面，本发明提供了包含经改造的头区的重组流感血凝素(HA)多肽，所述经改造的头区源自具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽，并且包含在由NxS/Ty的共有序列限定的一个或多个推定的N联糖基化位点处的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其中x和y不是脯氨酸(P)，使得一个或多个推定的N联糖基化位点被破坏。在特定实施例中，一个或多个氨基酸取代、缺失或插入中的每一个源自大流行毒株中的相应序列。

在另外一个方面，本发明提供了包含经改造的头区的重组流感血凝素(HA)多肽，所述经改造的头区源自具有占优势的大流行性免疫谱的HA多肽，在其内已插入由 NxS/Ty的共有序列限定的一个或多个经改造的推定的N联糖基化位点，其中x和y不是P。在特定实施例中，一个或多个经改造的推定的N联糖基化位点中的每一个通过基于季节性毒株中的相应序列的氨基酸取代、缺失或插入进行改造。

在一些实施例中，血凝素对应于A型流感。在一些实施例中，A型流感是H1N1 亚型。

在一些实施例中，一个或多个推定的N联糖基化位点对应于位置142-145和/或177-179(与A/California/07/2009HA(SEQ ID NO:2)的标准化序列比对；“CA09编号”)。在一些实施例中，一个或多个推定的N联糖基化位点在受体结合位点(RBS) 的15埃内，其中所述RBS定义为在三维(3-D)结构中对应于W167(CA09编号)的位置15埃内的所有氨基酸残基。可替代地，RBS可以定义为由单克隆抗体CH65的互补位结合的表位，并且一个或多个氨基酸取代邻近(例如，在100个氨基酸残基内、在 75个氨基酸残基内、在50个氨基酸残基内、在40个氨基酸残基内、在30个氨基酸残基内、在25个氨基酸残基内、在20个氨基酸残基内、在15个氨基酸残基内、在10 个氨基酸残基内、在5个氨基酸残基内等)CH65的表位发生。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代、缺失或插入选自本文提供的列表或表，例如表4或表5。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代、缺失或插入包括将共有序列NxS/Ty修饰为z¹z²z³z⁴，其中z¹是N、D、K或S；z²是Y或不变；z³是E、D或N；并且z⁴是I、 L、P、S或T，或者不变。

在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代、缺失或插入源自其的大流行毒株或季节性毒株是循环流感毒株。在一些实施例中，循环流感毒株选自A/California/07/2009 和A/South Carolina/1/1918。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失或插入包含在 NxS/Ty共有序列的1-5个氨基酸内(例如，在1-4、1-3、1-2个氨基酸内)赖氨酸(K) 或精氨酸(R)残基的插入。在一些实施例中，赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基在NxS/Ty共有序列的3'的1-5个氨基酸内(例如，在1-4、1-3、1-2个氨基酸)内。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代、缺失或插入包含在对应于残基147(CA09编号)的位置处的插入。在一些实施例中，在对应于残基147的位置处的插入包括赖氨酸(K)或精氨酸(R)的插入。

在一个进一步方面，本发明提供了包含经改造的头区的重组流感HA多肽，所述经改造的头区源自具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽，并且包含在对应于(CA09 编号)的60和291的位置之间的一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代中的每一个源自大流行毒株中的相应序列。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代选自本文提供的列表或表，例如表6。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代在对应于137和262(CA09编号)的位置之间，并且其中所述一个或多个氨基酸取代选自表7。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代包含选自表3或表4的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸取代。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代包含选自表6或表7的至少2、3、4、5、6、7、8、9或 10个连续取代。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代在对应于137、144、145、 154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213、214、244、245和/或 262(CA09编号)的位置处发生。

在相关方面，本发明提供了包含经改造的头区的重组流感HA多肽，所述经改造的头区源自具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽，并且包含在受体结合位点(RBS)的 15埃内的一个或多个氨基酸取代，其中所述RBS定义为在三维(3-D)结构中对应于 W167(CA09编号)的位置15埃内的所有氨基酸残基，其中所述一个或多个氨基酸取代中的每一个源自大流行毒株中的相应序列。可替代地，RBS可以定义为由单克隆抗体CH65的互补位结合的表位，并且一个或多个氨基酸取代邻近(例如，在100个氨基酸残基内、在75个氨基酸残基内、在50个氨基酸残基内、在40个氨基酸残基内、在30个氨基酸残基内、在25个氨基酸残基内、在20个氨基酸残基内、在15个氨基酸残基内、在10个氨基酸残基内、在5个氨基酸残基内等)CH65的表位发生。

在一些实施例中，大流行毒株是循环流感病毒。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代在受体结合位点(RBS)的10(例如，9、8、7、6、5等)埃内。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代包含选自表8的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸取代。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代包含选自表8的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续取代。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代在对应于137、144、145、154、155、156、157、158、159、 177、210、211、212、213和/或214(CA09编号)的位置处发生。

在另外一个方面，本发明提供了包含经改造的头区的重组流感HA多肽，所述经改造的头区源自具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽，并且包含选自表9的一种或多种氨基酸修饰(例如，选自表9的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种修饰)。

在一些实施例中，适合于本发明的具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽或具有占优势的大流行性免疫谱的HA多肽通过以下进行改造：计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)技术、拼接技术、基于流感共有序列的流感毒株组合、结构域的缺失和/或重排、结构域交换或者多个流感毒株中的中和或交叉反应表位的组合。

在一些实施例中，重组HA多肽引发针对季节性和大流行性流感病毒毒株两者的中和抗体。在特定实施例中，重组HA多肽引发针对流感病毒的一种或多种季节性毒株和一种或多种大流行毒株的中和抗体。在一些实施例中，重组HA多肽的特征在于针对季节性和大流行性流感病毒毒株两者的更平衡的免疫原性谱。

本发明尤其提供了编码本文所述的重组HA多肽的经分离的核酸和包含此类核酸的载体。在一些实施例中，本发明提供了含有此类载体或核酸的细胞。在一些实施例中，合适的细胞是人细胞。在特定实施例中，人细胞是HEK-293细胞。在一些实施例中，合适的细胞是猴细胞。在特定实施例中，猴细胞是Vero细胞。

在各种另外的方面，本发明提供了包含如本文所述的重组HA多肽的病毒样颗粒(VLP)。在一些实施例中，根据本发明的VLP还包含流感神经氨酸酶(NA)蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)gag蛋白或两者。本发明还提供了包含如本文所述的重组HA多肽或 VLP的药物组合物。此外，本发明提供了通过施用本文所述的药物组合物，在受试者中生成针对季节性和大流行性流感病毒的免疫应答(例如，免疫或疫苗接种)的方法。

在另一个方面，本发明提供了改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法。在一些实施例中，改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法包括：选择经改造的HA多肽的头区，并且用经改造的HA多肽的选择头区取代具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应头区，从而生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽。在一些实施例中，经改造的HA多肽具有占优势的季节性免疫谱，并且具有不同免疫原性谱的HA 多肽具有占优势的大流行性免疫谱。

在一些实施例中，具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽的选择头区对应于残基63-278、125-277或135-269(CA09编号)。在一些实施例中，具有不同免疫原性谱(其为占优势地大流行的)的HA多肽的相应头区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2[全长wt CA09(A/California/07/2009HA序列)序列]的残基63- 277、SEQ ID NO:3[全长wtSC1918序列]的残基63-277、SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列]的残基63-277、SEQ ID NO:2[全长wt CA09序列]的残基125-277、SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基125-277、SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列] 的残基125-277、SEQ ID NO:2[全长wt CA09序列]的残基135-269、SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基135-269、或SEQ ID NO:4[全长wtNJ1976序列]的残基 135-269。

在一些实施例中，具有不同免疫原性谱(其为占优势地大流行的)的HA多肽是来自野生型流感病毒的HA多肽。在一些实施例中，具有不同免疫原性谱(其为占优势地大流行的)的HA多肽是经改造的HA多肽。在一些实施例中，具有不同免疫原性谱(其为占优势地大流行的)的HA多肽包含SEQ ID NO:5(DO1A的全长序列)。

在一些实施例中，经改造的HA多肽具有占优势的大流行性免疫谱，并且具有不同免疫原性谱的HA多肽具有占优势的季节性免疫谱。在一些实施例中，具有占优势的大流行性免疫谱的经改造的HA多肽的选择头区选自：SEQ ID NO:2[全长wt CA09 (A/California/07/2009HA序列)序列]的残基63-277；SEQ ID NO:3[全长wt SC1918 序列]的残基63-277；SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列]的残基63-277；SEQ ID NO: 2[全长wt CA09序列]的残基125-277；SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基 125-277；SEQ ID NO:4[全长wtNJ1976序列]的残基125-277；SEQ ID NO:2[全长wt CA09序列]的残基135-269；SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基135-269；以及SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列]的残基135-269。在一些实施例中，具有不同免疫原性谱(其为占优势地大流行的)的HA多肽的相应头区包含SEQ ID NO:2 (SMARt_DO2A的全长序列)的残基63-278、125-277或135-269。

在一些实施例中，本发明提供了改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法，其包括以下步骤：鉴定与具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应头区相比，经改造的HA 多肽的头区中一个或多个推定的N联糖基化位点的存在或不存在；基于具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应序列，将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入经改造的 HA多肽的头区内，以破坏一个或多个推定的N联糖基化位点或插入另外的N联糖基化位点，从而生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽。在一些实施例中，一个或多个推定的或另外的N联糖基化位点由NxS/Ty的共有序列限定，其中x和y 不是P。在一些实施例中，经改造的HA多肽具有占优势的季节性免疫谱，并且具有不同免疫原性谱的HA多肽具有占优势的大流行性免疫谱，其中将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入经改造的HA多肽内，以破坏一个或多个推定的N联糖基化位点，并且其中经再改造的HA多肽被改变为更大流行性的。在一些实施例中，经改造的HA多肽具有占优势的大流行性免疫谱，并且具有不同免疫原性谱的HA多肽具有占优势的季节性免疫谱，其中将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入经改造的 HA多肽内，以插入一个或多个推定的另外的N联糖基化位点，并且其中经再改造的 HA多肽被改变为更季节性的。

在一些实施例中，本发明提供了改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法，其包括在受体结合位点(RBS)的15(例如，10、9、8、7、6、5等)埃内引入一个或多个氨基酸取代，其中所述RBS定义为在三维(3-D)结构中对应于残基W167(CA09编号)的位置15(例如，10、9、8、7、6、5)埃内的所有氨基酸残基；其中所述一个或多个氨基酸取代中的每一个包括将在特定位置处的氨基酸残基替换为在具有不同免疫原性谱的HA多肽中的相应位置处观察到的氨基酸残基，从而生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽。可替代地，RBS可以定义为由单克隆抗体CH65的互补位结合的表位，并且一个或多个氨基酸取代邻近(例如，在100个氨基酸残基内、在75个氨基酸残基内、在50个氨基酸残基内、在40个氨基酸残基内、在30个氨基酸残基内、在25个氨基酸残基内、在20个氨基酸残基内、在15个氨基酸残基内、在 10个氨基酸残基内、在5个氨基酸残基内等)CH65的表位发生。在一些实施例中，具有不同免疫原性谱的HA多肽源自循环季节性或大流行性流感毒株。在一些实施例中，经改造的HA多肽具有占优势的季节性免疫谱，并且具有不同免疫原性谱的HA 多肽具有占优势的大流行性免疫谱，并且其中经再改造的HA多肽被改变为更大流行性的。在一些实施例中，经改造的HA多肽具有占优势的大流行性免疫谱，并且具有不同免疫原性谱的HA多肽具有占优势的季节性免疫谱，并且其中经再改造的HA多肽被改变为更季节性的。

在一些实施例中，本发明提供了改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法，其包括将选自表4、表5、表6、表7、表8或表9中所示那些的一种或多种修饰引入经改造的HA多肽的一个或多个相应位置内，从而生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽。在一些实施例中，一种或多种修饰在对应于经改造的HA多肽(CA09 编号)的137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、 213、214、244、245和/或262的位置处发生。在一些实施例中，一种或多种修饰在对应于经改造的HA多肽(CA09编号)的137、144、145、154、155、156、157、 158、159、177、210、211、212、213和/或214的位置处发生。在一些实施例中，一种或多种修饰包含选自表4、表5、表6、表7、表8或表9中所示那些的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、或者十种或更多种修饰。在一些实施例中，一种或多种修饰包含选自表4、表5、表6、表7、表8或表9的至少2、3、4、5或10个连续取代。

在一些实施例中，本发明提供了改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法，其包括选择选自以下的两种或更多种修饰：

(i)选择经改造的HA多肽的头区，并且用经改造的HA多肽的选择头区取代具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应头区，

(ii)鉴定与具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应头区相比，经改造的HA多肽的头区中一个或多个推定的N联糖基化位点的存在或不存在，并且基于具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应序列，将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入经改造的HA 多肽的头区内，以破坏经改造的HA多肽中的一个或多个推定的N联糖基化位点或插入另外的N联糖基化位点，

(iii)在受体结合位点(RBS)的15(例如，10、9、8、7、6或5)埃内引入一个或多个氨基酸取代，其中所述RBS定义为在三维(3-D)结构中对应于W167(CA09编号) 的位置15埃内的所有氨基酸残基，其中所述一个或多个氨基酸取代中的每一个包括将在特定位置处的氨基酸残基替换为在具有不同免疫原性谱的HA多肽中的相应位置处观察到的氨基酸残基。可替代地，RBS可以定义为由单克隆抗体CH65的互补位结合的表位，并且一个或多个氨基酸取代邻近(例如，在100个氨基酸残基内、在75个氨基酸残基内、在50个氨基酸残基内、在40个氨基酸残基内、在30个氨基酸残基内、在25个氨基酸残基内、在20个氨基酸残基内、在15个氨基酸残基内、在10个氨基酸残基内、在5个氨基酸残基内等)CH65的表位发生，和

(iv)将选自表4、表5、表6、表7、表8或表9中所示那些的一种或多种修饰引入经改造的HA多肽的一个或多个相应位置内；

从而生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽。

在各种实施例中，根据本发明的方法还包括评价经再改造的HA多肽的表达和构象。

在各种实施例中，根据本发明的方法还包括确定经再改造的HA多肽是否引发针对季节性和/或大流行性流感病毒毒株的中和抗体的步骤。

在一些实施例中，生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽包括增加一种或多种抗头部单克隆抗体针对季节性和/或大流行性流感毒株的结合。在一些实施例中，生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽包括增加抗头部单克隆抗体针对大流行性流感毒株的结合宽度。在一些实施例中，生成具有改变的免疫原性谱的经再改造的HA多肽包括增加抗茎部单克隆抗体的结合宽度。此类实施例中，头区中的修饰诱导与抗茎部单克隆抗体的结合中的增加，证实在一个位置处的取代可以对远侧位置发挥远程别构效应。在一些实施例中，通过流式细胞术检测与哺乳动物细胞的表面上表达的经再改造的HA多肽结合的单克隆抗体，确定结合中的增加。在一些实施例中，定量与哺乳动物细胞的表面上表达的经再改造的HA多肽结合的单克隆抗体的水平。

在本专利申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。如在本专利申请中使用的，术语“包含(comprise)”和该术语的变体，例如“包含(comprising)”和 “包含(comprises)”，并不预期排除其它添加剂、组分、整数或步骤。如本专利申请中使用的，术语“约”和“大约”作为等价物使用。本专利申请中以及或不以及约/大约使用的任何数字意欲涵盖由相关领域的普通技术人员了解的任何正常波动。

在下述详细描述、附图和权利要求中，本发明的其它特征、目的和优点是显而易见的。然而，应该理解，详细描述、附图和权利要求虽然指出了本发明的实施例，但仅以说明性方式而非限制性方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

附图仅用于说明性目的，而不是限制。

图1显示了球状头部在其处截断的特定残基位点中不同的三个不同区域。

图2显示了用于证实流感HA多肽的正确折叠、表达和抗体结合能力的流式细胞术测定的示意图。

图3显示了流式细胞术测定结果，其证实通过将流感RBS的球状头区嫁接到受体HA茎上生成的重组HA多肽的正确折叠和表达。

图4显示了流式细胞术测定结果，其证实通过将流感RBS的球状头区嫁接到受体HA茎上生成的重组HA多肽的改善的季节性免疫谱(如通过增加的mAb结合所证实的)。

图5显示了通过将流感RBS的球状头区嫁接到受体HA茎上生成的重组HA多肽的增加的免疫宽度的数字表示。

图6显示了推定的N联糖基化位点(SEQ ID NO：32-35，分别按出现的顺序排列)、赖氨酸环插入位点(SEQ ID NO：36-37，分别按出现的顺序排列)和在RBS位点周围的残基修饰的图示。

图7显示了流式细胞术测定结果，其证实通过修饰推定的N联糖基化位点、赖氨酸环插入或球状头区中的氨基酸残基生成的重组HA多肽的正确折叠和表达。

图8显示了流式细胞术测定结果，其证实通过修饰推定的N联糖基化位点、赖氨酸环插入或球状头区中的氨基酸残基生成的重组HA多肽的免疫宽度增加。

图9显示了球状头区中氨基酸残基的图示，所述氨基酸残基可以进行修饰以改变重组HA多肽的免疫宽度。

图10显示了流式细胞术测定结果，其证实通过4K8与脱糖基化构建体结合的增加证实重组HA多肽的免疫宽度增加。

图11显示了用于免疫和随后的体内评估的示例性时间线。

图12显示了与原始SMARtDO2a相比，用下一代DO2a修饰免疫的动物的代表性卡普兰-迈耶存活曲线。

图13显示了与原始SMARtDO2a相比，用下一代DO2a修饰免疫的动物的代表性体重减轻曲线。

图14显示了在病毒攻击后的第4天时，与PBS相比用SMARtDO2a构建体免疫的动物的代表性病毒肺滴度。

图15显示了来自用SMARtDO2a构建体免疫的动物血清的代表性血细胞凝集抑制(HAI)测定结果。

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其它术语的另外定义在说明书各处阐述。

佐剂：如本文使用的，术语“佐剂”指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可包括在其上吸附抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或者油包水乳液，其中抗原溶液在矿物油(例如，

)中乳化，有时包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)，以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可以用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388； 6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如TLR配体的共刺激分子。示例性生物佐剂包括IL-2、 RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L 和41BBL。

动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中， “动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以为转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆。

抗体：如本文使用的，术语“抗体”指具有特定氨基酸序列的由B淋巴样细胞产生的免疫球蛋白分子。在一些实施例中，通过特异性抗原(免疫原)在人或其它动物中诱发抗体。抗体的特征在于以某种可证实的方式与抗原特异性反应，抗体和抗原各自按照另一种进行限定。术语“引发抗体应答”、“引发中和抗体”、“引发免疫原性应答”或语法等价物指抗原或其它分子诱导抗体产生的能力。在一些实施例中，术语“抗体”指用于体外测定例如HA筛选测定的任何重组抗体，包括基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽。此类抗体可以作为完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白种类(分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的片段存在。示例性抗体片段包括但不限于F(ab)’2、Fab'和单链Fv(scFv)。

抗原：如本文使用的，术语“抗原”指引发免疫应答的试剂；和/或(ii)当暴露或施用于生物时由T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)或抗体(例如，由B细胞产生)结合的试剂。在一些实施例中，抗原在生物中引发体液应答(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；可替代地或另外地，在一些实施例中，抗原在生物中引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。本领域技术人员将了解，特定抗原可以在靶生物(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或几个成员中引发免疫应答，但不在靶生物物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施例中，抗原在靶生物物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％成员中引发免疫应答。在一些实施例中，抗原结合抗体和/或T细胞受体，并且可以诱导或不诱导生物中的特定生理应答。在一些实施例中，例如，抗原可以在体外与抗体和/或T细胞受体结合，无论此类相互作用是否在体内发生。在一些实施例中，抗原与特异性体液或细胞免疫的产物反应，包括由异源免疫原诱导的那些。在公开的组合物和方法的一些实施例中，流感HA多肽或其免疫原性片段是抗原。

大约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、 13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的 100％)。

生物活性：如本文使用的，短语“生物活性”指由目的试剂或实体实现的可观察的生物效应或结果。例如，在一些实施例中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施例中，生物途径或事件的调节(例如，诱导、增强或抑制)是生物活性。在一些实施例中，通过检测由目的生物途径或事件产生的直接或间接产物来评价生物活性的存在或程度。在一些实施例中，HA多肽的生物活性指HA多肽引发中和抗体的能力。在这些情况下，术语“生物活性”与“免疫原性活性”可互换地使用。

California 09编号：如本文使用的，短语“California 09编号”或“CA09编号” 指标准化的生物序列比对，其允许比较查询序列(例如，本文所述的一种或多种修饰已应用于或将应用于其的经改造的HA多肽序列)与主题序列(例如， A/California/07/2009(H1N1)的多肽序列)，从而鉴定靶序列中对应于相同位置 A/California/07/2009(H1N1)的氨基酸残基，并且因此，每一个其它生物序列都类似地针对A/California/07/2009(H1N1)标准化。一般而言，靶序列和查询序列共享特征部分或特点，但在长度和/或序列同一性上略有不同。例如，可以基于A/California/07/2009 (H1N1)蛋白质序列鉴定且描述特定靶序列或靶向修饰中的残基编号。序列与 A/California/07/2009(NCBI登录号：ACP44189，NCBIgi号：227977172，566个氨基酸)的全长(包括信号肽、跨膜和胞质尾结构域)蛋白质序列比对。信号肽的N-末端甲硫氨酸是残基1。

载体：如本文使用的，术语“载体”指组合物与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在一些示例性实施例中，载体可以包括无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。在一些实施例中，载体是或包括一种或多种固体组分。

特征部分或特点：如本文使用的，术语“特征部分”或“特征特点”在最广泛的意义上，用于指其存在(或不存在)与物质的特定特点、属性或活性的存在(或不存在)相关的物质的一部分。在一些实施例中，物质的特征部分或特点是在物质和共享特定特点、属性或活性的相关物质中发现的部分或特点，但在不共享特定特点、属性或活性的那些中未发现。例如，术语“特征性大流行特点”是在至少一种参考大流行毒株中发现，而在至少一种非大流行毒株中未发现的特点。在一些实施例中，特征性大流行特点是在大流行毒株中通常发现，并且在非大流行毒株中很少发现的特点。类似地，术语“特征季节性特点”是在至少一种参考季节性毒株中发现，而在至少一种非季节性毒株中未发现的特点。在一些实施例中，特征性季节性特点是在季节性毒株中通常发现，并且在非季节性毒株中很少发现的特点。在一些实施例中，特征性部分或特点是“特征性序列元件”，其指在聚合物中(例如，在多肽或核酸中)发现的序列元件，其代表该聚合物的特征部分。在一些实施例中，特征性序列元件的存在与聚合物的特定活性或性质的存在或水平相关联。在一些实施例中，特征性序列元件的存在(或不存在)将特定聚合物限定为此类聚合物(例如，大流行或季节性)的特定家族或组的成员(或不是成员)。特征性序列元件通常包含至少两种单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施例中，特征性序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50种或更多种单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施例中，特征性序列元件包括由一个或多个间隔区间隔开的至少第一和第二段连续单体，所述间隔区的长度跨越共享序列元件的聚合物可以变化或不变化。在一些实施例中，特征性序列元件包括一个或多个推定的糖基化位点的存在或不存在。

计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)技术：如本文使用的，术语“计算优化的广泛反应性抗原”或“COBRA”技术指设计方法学和方法，及其所得到的化合物，经改造的重组流感HA抗原，如在授权前专利公开WO2012/036993、U.S.2015/0030628、 WO2013/119683、WO2013/148164、WO2014/085616和WO2013/122827中所述。这些申请以引用的方式整体并入本文。

对应于：如本文使用的，术语“对应于”经常用于指定目的多肽(例如HA多肽)中氨基酸残基的位置/同一性。本领域普通技术人员将了解，出于简化的目的，通常使用基于参考相关多肽的规范编号系统指定多肽中的残基，使得例如“对应于”在位置190处的残基的氨基酸，实际上不必是特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于参考多肽中的190处发现的残基；本领域普通技术人员容易了解如何使用例如各种序列比对工具鉴定“对应的”氨基酸。

经改造的：如本文使用的，术语“经改造的”描述了这样的多肽，其氨基酸序列已由本领域技术人员设计和/或其存在和产生需要本领域技术人员的动作(即“人为”)。例如，经改造的HA多肽具有的氨基酸序列不同于天然流感分离物中发现的 HA多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，经改造的HA多肽具有的氨基酸序列不同于 NCBI数据库中包括的HA多肽的氨基酸序列。

表位：如本文使用的，术语“表位”包括全部或部分被免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施例中，表位由抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施例中，当抗原采用相关的三维构象时，此类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施例中，当抗原采用此类构象时，此类化学原子或基团在空间上彼此物理上接近。在一些实施例中，当抗原采用替代构象(例如，线性化)时，至少一些此类化学原子是彼此物理上分离的基团。

赋形剂：如本文使用的，术语“赋形剂”指可以包括在药物组合物中的非治疗剂，例如以提供或促成所需的稠度或稳定效应。合适的药物赋形剂包括，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。

头区：如本文使用的，术语“头区”指由经改造的或野生型HA多肽的氨基酸残基59-292(CA09编号)涵盖的区段。在形态学上，头区可以定义为HA的球形结构域。

血凝素(HA)多肽：如本文使用的，术语“血凝素多肽”(或“HA多肽”)指其氨基酸序列包括HA的至少一个特征性序列的多肽。来自流感分离物的广泛多样的HA 序列是本领域已知的；实际上，美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)维护着一个数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/)，截至本专利申请提交时，所述数据库包括数据库(其中6974个是独特的)中来自A型流感(亚型H1N1)的至少15491个完整的HA多肽。参考该数据库，本领域普通技术人员可以容易地鉴定其为一般HA多肽和/或特定HA多肽(例如，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16多肽；或介导特定宿主感染的HA，所述特定宿主例如禽类、骆驼、犬、猫、果子狸、环境、马、人、豹、貂、小鼠、海豹、石貂 (stone martin)、猪、虎、鲸鱼等)的特征的序列。例如，在一些实施例中，HA多肽包括在流感病毒的天然分离物中发现的HA蛋白的残基约97至约185、约324至约 340、约96至约100、和/或约130至约230之间发现的一种或多种特征性序列元件。

H1N1HA多肽：如该术语在本文中使用的，“H1N1HA多肽”是其氨基酸序列包括至少一种序列元件的HA多肽，所述至少一种序列元件是H1N1的特征，并且将 H1N1与其它HA亚型区分开。如本领域技术人员将理解的，可以通过比对来确定代表性的此类序列元件。

宿主：术语“宿主”在本文中用于指其中存在目的多肽的系统(例如，细胞、生物等)。在一些实施例中，宿主是易患特定传染因子感染的系统。在一些实施例中，宿主是表达特定目的多肽的系统。

宿主细胞：如本文使用的，短语“宿主细胞”指外源DNA(重组或以其它方式) 已引入其内的细胞。例如，宿主细胞可以用于通过标准重组技术产生本文所述的经改造的流感血凝素多肽。阅读本公开内容后，技术人员将理解此类术语不仅指特定的主题细胞，还指这种细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后续几代中发生，所以这样的后代事实上可与亲本细胞不相同，但仍包括在如本文使用的术语 “宿主细胞”的范围内。在一些实施例中，宿主细胞包括适合于表达外源DNA(例如，重组核酸序列)的任何原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物 (单细胞或多细胞)的那些、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属物种 (Bacillus spp.)、链霉菌属物种(Streptomycesspp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF- 9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施例中，细胞为人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，细胞为真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、 BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如 BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、 SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞尔托利细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和源自前述细胞的细胞系。在一些实施例中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6^TM细胞)。

免疫应答：如本文使用的，术语“免疫应答”指免疫系统的细胞(例如B细胞、 T细胞、树突状细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激(例如，抗原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括涉及宿主防御应答的任何身体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。疫应答包括但不限于先天性和/或适应性免疫应答。如本文使用的，保护性免疫应答指保护受试者免于感染的免疫应答(预防感染或预防与感染相关的疾病的发展)。测量免疫应答的方法是本领域众所周知的，包括例如测量淋巴细胞 (例如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等等。

免疫原：如本文使用的，术语“免疫原”指在适当条件下能够在动物中刺激免疫应答(例如抗体的产生或T细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物内的组合物。如本文使用的，“免疫原性组合物”是包含免疫原(例如HA多肽)的组合物。如本文使用的，“免疫”意指致使受试者被保护不受传染病，例如通过疫苗接种。

在体外：如本文使用的，术语“在体外”指在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养等中，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

在体内：如本文使用的，术语“在体内”指在多细胞生物内，例如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的背景下，该术语可用于指在活细胞内(与例如体外系统相反)发生的事件。

流感病毒：如本文使用的，术语“流感病毒”指属于正粘病毒科的分段负链RNA 病毒。

流感疫苗：如本文使用的，术语“流感疫苗”指能够刺激免疫应答的免疫原性组合物，其施用用于预防、改善或治疗流感病毒感染。流感疫苗可以包括例如减毒或杀死(例如，裂解)流感病毒、病毒样颗粒(VLP)和/或抗原多肽(例如，本文所述的经改造的血凝素)或源自其的DNA、或此类免疫原性材料的任何重组形式。

分离的：如本文使用的，术语“分离的”指(i)在最初生产时(无论在自然界中和/或在实验环境中)，已与它结合的至少一些组分分开；或(ii)通过人为产生的试剂或实体。分离的试剂或实体可以与它们最初结合的至少约10％、至少约20％、至少约 30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约 90％或更多其它组分分开。在一些实施例中，分离的试剂是超过90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％纯的。

爆发：如本文使用的，流感病毒“爆发”指在给定年份内来自单个国家内的病毒分离物的集合。

大流行毒株或季节性毒株：“大流行性”流感毒株是已引起或有能力引起人群的大流行性感染的毒株。在某些情况下，大流行是疾病的全球爆发，当新病毒在人群中出现或“涌现”时，所述疾病发生，导致严重疾病，然后在全世界容易地在人之间传播。一般而言，大流行毒株跨越2009年至今，并且形成与A/California/07/2009在抗原上相似的遗传序列的单个簇。更一般地，大流行性流感毒株包括起于人和禽或猪流感病毒之间的重配(大约每20-30年发生的抗原转变)的那些，所述重配导致具有禽或猪起源的新型HA的病毒，人缺乏针对其的免疫力。换言之，人群视为幼稚的

由于先前疫苗接种或先前暴露，没有抵抗力或很少的抵抗力。大流行毒株和季节性毒株在抗原上是不同的，并且序列完全不同。一般而言，季节性流感毒株可以定义为从1986年直到2009年的循环毒株(包括并非大流行的2009年序列)和基本上相似的遗传序列编码抗原区的其它毒株(即，在抗原序列空间上相似)。示例性大流行毒株包括A/California/07/2009、A/California/04/2009、A/Belgium/145/2009、A/South Carolina/01/1918和A/New Jersey/1976。大流行亚型特别包括H5N1、H2N2、H9N2、 H7N7、H7N3、H7N9和H10N7亚型。示例性季节性毒株包括A/Texas/36/1991、 A/Singapore/1986、A/New Caledonia/20/1999、A/Solomon Islands/03/2006、以及 A/Brisbane/59/2007和A/Wisconsin/67/2005。

预防：如本文使用的，术语“预防”指预防，避免疾病表现，延迟发作，和/或降低特定疾病、病症或状况(例如，由流感病毒感染)的一种或多种症状的频率和/或严重性。在一些实施例中，基于群体评价预防，使得如果在对疾病、病症或状况敏感的群体中观察到疾病、病症或状况的一种或多种症状的发展、频率和/或强度中的统计学显著降低，则试剂视为“预防”特定疾病、病症或状况。

受体结合位点(RBS)：如本文使用的，术语“受体结合位点”或“RBS”包含流感 HA多肽的头区的连续或非连续氨基酸残基，其包括涉及在靶细胞受体蛋白质上的唾液酸的直接结合的氨基酸。负责受体结合的HA区域位于HA三聚体的每个单体的膜- 远侧尖端处，并且它具有几个主要结构特点。例如，结合位点侧面为是“220和130 环”，其含有与唾液酸或聚糖链的内部糖相互作用的氨基酸。该位点的膜远侧区域由 190螺旋形成，其也包括具有在受体上的唾液酸(残基194)或内部聚糖(大约残基 190和193)处接触受体的潜力的残基。该位点的碱基包含几个高度保守的残基，其形成广泛的氢键网络。构成流感HA多肽的“受体结合位点”或“RBS”的氨基酸残基可以由与唾液酸类似物复合的HA多肽的三维晶体结构描述，并且鉴定在与类似物的一定邻近内的氨基酸残基，或可以参考来自特定病毒株(例如，A/New Caledonia/20/99或A/California/07/2009)的HA多肽序列进行描述。因此，在一些实施例中，可以使用参考HA多肽序列测定如本文所述的经改造的HA多肽的“受体结合位点”或“RBS”。在一些实施例中，可以使用与人和禽类受体类似物(例如LSTa、 LSTc)复合的HA多肽序列的晶体结构，来确定如本文所述的经改造的HA多肽的 “受体结合位点”或“RBS”。与LSTc复合的HA多肽序列的示例性参考晶体结构包括A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)pdb|1RVZ。在一些实施例中，RBS可以定义为由广泛中和性单克隆抗体CH65结合的表位(参见例如，Whittle JR等人Broadly neutralizing human antibody thatrecognizes the receptor-binding pocket of influenza virus hemagglutinin. ProcNatl Acad Sci USA.2011；108:14216–21)。可替代地或另外地，RBS可以定义为包括在对应于(CA09 09编号)中的位置167的普遍保守的色氨酸的15埃内的所有氨基酸残基的区域(例如参见Xu,R等人Nat Struct Mol Biol.2013Mar；20(3):363- 70)。

重组体：如本文使用的，术语“重组体”预期指通过重组手段设计、改造、制备、表达、产生或分离的多肽(例如，如本文所述的HA多肽)，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的多肽，从重组组合的多肽文库分离的多肽，或者通过涉及将所选序列元件彼此剪接的任何其它手段制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施例中，在自然界中发现此类所选择的序列元件中的一种或多种。在一些实施例中，在计算机芯片上设计此类所选择的序列元件中的一种或多种。在一些实施例中，一种或多种此类所选择的序列元件来源于已知序列元件的诱变(例如在体内或体外)，所述已知序列元件例如来自天然或合成源。在一些实施例中，一种或多种此类所选择的序列元件来源于多种(例如，两种或更多种)已知序列元件的组合，所述序列元件并非天然存在于相同多肽中(例如，来自两种分开HA多肽的两个表位)。

重组流感疫苗：如本文使用的，术语“重组流感疫苗”指包含本文所述的经改造的流感血凝素的流感特异性免疫原性组合物，包括但不限于流感病毒、其亚单位制剂、病毒样颗粒、重组蛋白质(即由纯化至不同程度的重组HA组成的制剂)、以及基于DNA和病毒载体的疫苗。如本文所述的重组流感疫苗可以任选地含有一种或多种佐剂。

重组血凝素多肽：如本文使用的，术语“重组血凝素(HA)多肽指任何经修饰的血凝素多肽。特别地，该术语指进一步修饰或改造的血凝素多肽。

特异性：如本领域已知的，“特异性”是特定配体(例如，抗体、HA多肽等) 区分其结合配偶体(例如抗原，人HA受体，且特别是人上呼吸道HA受体)与其它潜在结合配偶体(例如，禽类HA受体)的能力的量度。

茎区：如本文使用的，术语“茎区”或“茎区域”可以指经改造的或野生型HA 多肽的不连续区域，所述区域包含大约氨基酸残基18-58和293-519(CA09编号)。在形态学上，茎区可以定义为自球状头部出现的细长结构域。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括人。在本发明的某些实施例中，受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施例中，使用术语“个体”或“患者”，并且预期可与“受试者”互换。本发明还考虑了药物组合物的施用和/或子宫内治疗方法的执行。

基本上：如本文使用的，术语“基本上”指显示出目的特征或性质的总体或接近总体程度或范围的定性条件。生物领域的普通技术人员应理解，生物学现象和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。术语“基本上” 因此在本文中用于捕获许多生物学现象和化学现象固有的潜在缺乏的完整性。

基本上相似的：如本文使用的，术语“基本上相似的”指两个实体之间的比较。一般而言，当实体共享足够的结构相似性(例如，特征性结构特点)以使它们具有共享一个或多个另外属性或特点的可比较的可能性时，实体视为彼此“基本上相似的”。举例来说，两种流感毒株之间相同或足够相似的特征例如糖基化位点模式，每种毒株的人类大流行风险是相同的。

基本序列同源性：短语“基本同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员应了解的，如果两个序列在相应位置含有同源残基，则它们一般视为“基本同源的”。同源残基可以为相同的残基。可替代地，同源残基可以是不相同的残基，具有适当相似的结构和/或功能特征。例如，如本领域普通技术人员众所周知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水”或“亲水”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸置换相同类型的另一种氨基酸可通常被视为“同源”置换。通常的氨基酸分类在表1和2中概括。

表1

-----------------------------------------------

丙氨酸	Ala	A	非极性	中性	1.8
						精氨酸	Arg	R	极性	阳性	-4.5
天冬酰胺	Asn	N	极性	中性	-3.5
						天冬氨酸	Asp	D	极性	阴性	-3.5
半胱氨酸	Cys	C	非极性	中性	2.5
						谷氨酸	Glu	E	极性	阴性	-3.5
谷氨酰胺	Gln	Q	极性	中性	-3.5
						甘氨酸	Gly	G	非极性	中性	-0.4
组氨酸	His	H	极性	阳性	-3.2
						异亮氨酸	Ile	I	非极性	中性	4.5
亮氨酸	Leu	L	非极性	中性	3.8
						赖氨酸	Lys	K	极性	阳性	-3.9
甲硫氨酸	Met	M	非极性	中性	1.9
						苯丙氨酸	Phe	F	非极性	中性	2.8
脯氨酸	Pro	P	非极性	中性	-1.6
						丝氨酸	Ser	S	极性	中性	-0.8
苏氨酸	Thr	T	极性	中性	-0.7
						色氨酸	Trp	W	非极性	中性	-0.9
酪氨酸	Tyr	Y	极性	中性	-1.3
						缬氨酸	Val	V	非极性	中性	4.2

表2

---------------------

如本领域众所周知的，可使用各种算法中的任一种比较氨基酸或核酸序列，所述算法包括可在商业计算机程序中获得的那些算法，例如用于核苷酸序列和BLASTP的BLASTN、缺口BLAST和用于氨基酸序列的PSI-BLAST。示例性的这种程序在以下中描述：Altschul等人，Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs”,Nucleic AcidsRes. 25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人，(编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press, 1999；所有上述内容均引入本文作为参考。除鉴定同源序列之外，上述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施例中，如果其相应残基的至少50％、至少55％、至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或更多在相关残基段上是同源的，则两个序列视为基本上同源的。在一些实施方案中，相关段是全序列。在一些实施例中，相关段是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少 125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500个或更多个残基。

基本同一性：短语“基本同一性”或“基本上相同”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员应了解的，如果两个序列在相应位置含有相同残基，则它们一般视为“基本相同的”。如本领域众所周知的，可使用各种算法中的任一种比较氨基酸或核酸序列，所述算法包括可在商业计算机程序中获得的那些算法，例如用于核苷酸序列和BLASTP的BLASTN、缺口BLAST和用于氨基酸序列的PSI- BLAST。示例性的这种程序在以下中描述：Altschul等人，Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology； Altschul等人，NucleicAcids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics: A Practical Guideto the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；和Misener等人， (编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132 卷)，Humana Press,1999。除鉴定相同序列之外，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关残基段上是相同的，则两个序列表示为基本相同。在一些实施方案中，相关段是全序列。在一些实施方案中，相关段是至少10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。在HA多肽的上下文中，提及“基本同一性”通常指具有与参考HA多肽(或HA表位)的那种至少90％、优选至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的HA多肽(或HA表位)。

疫苗接种：如本文使用的，术语“疫苗接种”或“接种疫苗”指预期生成例如针对致病因子的免疫应答的组合物施用。疫苗接种可以在暴露于致病因子之前、期间和/或之后施用，和/或在一种或多种症状的发展中施用，并且在一些实施例中，在暴露于试剂之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施例中，疫苗接种包括疫苗接种组合物在时间上适当地间隔开的多次施用。

病毒样颗粒(VLP)：如本文使用的，短语“病毒样颗粒”或“VLP”指类似病毒但缺乏任何病毒遗传材料，且因此不是感染性的颗粒。“病毒样颗粒”或“VLP”可以通过在各种细胞培养系统中的异源表达产生，所述细胞培养系统包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母和植物细胞。另外，VLP可以通过本领域已知的方法纯化。在一些实施例中，如本文所述的流感VLP包含血凝素(HA)多肽和神经氨酸酶(NA)多肽。在一些实施例中，如本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或病毒结构多肽(例如流感结构蛋白，例如流感M1)。在一些某些实施例中，如本文所述的流感VLP包含HA 多肽、NA多肽和/或M1多肽。在一些实施例中，如本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或HIVgag多肽。如技术人员所知，其它病毒结构蛋白可以用作本文示例的那些的替代物。流感VLP可以通过用编码HA和NA蛋白以及任选的HIV gag蛋白的质粒转染宿主细胞(例如哺乳动物细胞)来产生。在将转染的细胞温育适当的时间以允许蛋白质表达(例如大约72小时)后，可以从细胞培养上清液中分离VLP。在一些实施例中，如本文所述的流感VLP通过在哺乳动物细胞(例如人细胞)中的瞬时转染产生。在一些实施例中，通过使用一种或多种测定分析流感VLP。仅举几个例子，可以通过蛋白质染色分析流感VLP的血凝素活性、动态光散射和血凝素含量定量。在阅读本公开内容后，其它测定对于技术人员将是显而易见的。

野生型：如本领域所理解的，短语“野生型”一般指蛋白质或核酸的正常形式，如在自然界中发现的。例如，野生型HA多肽在流感病毒的天然分离物中发现。在NCBI 流感病毒序列数据库中可以找到各种不同的野生型HA序列，所述数据库可通过万维网在ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU处获得。

具体实施方式

本发明尤其提供了修饰经改造的HA多肽以改变免疫谱，并且增加对不同流感毒株的交叉反应性的方法。本发明的实施例提供了用于改造HA多肽以扩展季节性应答谱以覆盖大流行毒株的各种策略。在一些实施例中，该策略被设计为基于源自具有不同免疫原性谱的HA多肽的序列，在宿主HA多肽的受体结合位点(RBS)附近引入修饰。类似的策略可以用于扩展大流行应答谱，以覆盖季节性毒株。

可以改造HA多肽以引发特定的免疫原性应答谱。换言之，用于生成经改造的HA 多肽的各种设计策略可以被选择或碰巧导致HA多肽，其引起针对占优势的循环季节性(即地方性)流感毒株和/或历史或大流行性流感毒株的显著免疫应答(例如，中和抗体应答)。因此，术语“季节性应答谱”可以用于描述重组HA多肽，其生成更针对季节性流感毒株而不是大流行性流感毒株的交叉中和抗体。一般而言，季节性流感毒株可以定义为从1986年直到2009年的循环毒株(包括并非大流行的2009年序列)和基本上相似的遗传序列编码抗原区的其它毒株(即，在抗原序列空间上相似)。具体例子包括A/New Caledonia/20/1999和A/Wisconsin/67/2005。因此，“季节性应答谱”可以用于描述重组HA多肽，其生成针对一种或多种季节性流感毒株，而不是标准大流行毒株A/California/07/2009的交叉中和抗体。同样地，术语“大流行应答谱”可以用于描述重组HA多肽，其生成更针对大流行性流感毒株而不是季节性流感毒株的交叉中和抗体；“大流行应答谱”也可用于描述重组HA多肽，其产生针对一种或多种大流行性流感毒株但不是标准季节性毒株A/New Caledonia/20/1999的交叉中和抗体。一般而言，大流行毒株跨越2009年至今，并且形成与A/California/07/2009在抗原上相似的序列的单个簇。更一般地，大流行性流感毒株包括起于人和禽或猪流感病毒之间的重配 (大约每20-30年发生的抗原转变)的那些，所述重配导致具有禽或猪起源的新型HA 的病毒，人缺乏针对其的免疫力。换言之，人群视为幼稚的，由于先前疫苗接种或先前暴露，没有抵抗力或很少的抵抗力。因此，大流行毒株包括A/South Carolina/01/1918和A/New Jersey/1976，其通过序列和抗原距离不同于California 2009 序列簇。大流行亚型特别包括H5N1、H2N2、H9N2、H7N7、H7N3、H7N9和H10N7 亚型。

本文所述的修饰可以用于进一步定制或优化免疫原性谱，使得再改造经改造的HA多肽，以引发针对或多或少的季节性毒株的抗体(或证实改善的或更多的抗季节性的抗体应答)、或者或多或少的大流行毒株的抗体(或证实改善的或更多的抗大流行性抗体应答)。因此，这些修饰扩展了跨越抗原性不同毒株的序列(或进化枝)簇的免疫谱。它们可以应用于经改造的重组HA分子，使得它引发针对起于抗原转变的新的大流行毒株的免疫应答(即，使得它们覆盖跨越延长的时间线在遗传序列空间中远距离分开的抗原性不同的毒株)。它们还可以应用于解决在相对较短的时间段内发生的遗传变化，使得经改造的HA多肽通过引发针对抗原漂移的循环季节性毒株的免疫应答(例如，改善的季节性应答)而继续有效。在特定实施例中，可以使用本文描述的修饰：(1)将大流行样经改造的HA多肽的覆盖范围(即，引发中和免疫应答的能力)扩展到一种或多种季节性毒株(即，更季节性的免疫谱)；(2)将季节性样经改造的HA多肽的覆盖范围扩展到任何大流行毒株(以解决抗原漂移)；以及(3)将季节性样HA多肽的覆盖范围扩展到任何其它抗原性不同的季节性毒株(即，解决抗原漂移的改善的季节性免疫谱)。

在下述小节中进一步详细描述本发明的各个方面。小节的使用并不意欲限制本发明。每个小节可适合于本发明的任何方面。在本专利申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。

本发明并不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且除非另有说明，否则不预期是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语和短语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管现在描述优选的方法和材料，但与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物都以引用的方式并入本文。

标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书执行，或者如本领域通常实现的或如本文所述的执行。前述技术和程序一般可根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述执行。参见例如Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，所述参考文献以引用的方式并入本文用于任何目的。

经改造的HA多肽

本发明可以用于修饰任何经改造的血凝素(HA)多肽，包括使用各种重组技术生成的任何HA多肽。本发明的实施例可以应用于由本领域技术人员用于生成HA多肽的任何方法的产物，所述HA多肽具有用于疫苗目的的改善性质。生成用于本发明的实施例中的经改造的HA多肽的适用方法包括通过以下生成HA经改造的多肽：计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)技术、拼接技术、反向遗传学、蛋白质工程、基于流感共有序列的流感毒株组合、结构域的缺失和/或重排、结构域交换或者多个流感毒株中的中和或交叉反应表位的组合。这些先前的努力包括在62/005,670、 WO2012/177760、WO2013/148164、US 20140147459、WO2013/043729、US 20140286981、US 2014-0050759、US 8685410、WO2015/028478、US2010-0074915中描述的那些，所述专利各自以引用的方式并入本文。

然而，这些技术经常导致有意或以其它方式具有偏向季节性或大流行毒株的免疫原性谱的HA多肽。HA多肽的免疫原性谱可以定义为通过用HA多肽免疫诱导的中和抗体的谱。通常，HA多肽可以具有季节性或占优势的季节性免疫谱、大流行或占优势的大流行性免疫谱、或平衡的免疫谱。本发明尤其可以用于改善经改造的HA多肽的免疫原性谱，使得它能够引发针对季节性和大流行性流感病毒毒株两者的中和抗体，或者改善针对季节性毒株和/或大流行毒株的抗中和抗体的质量或数量。在一些实施例中，本发明可以用于改善经改造的HA多肽，使得它具有平衡的免疫原性谱。同样地，本发明的实施例可以用于改变具有平衡免疫谱的HA多肽的免疫谱，使得它变得或多或少季节性的，或者或多或少地大流行的。

如本文使用的，术语中和抗体指响应由特定抗原(免疫原)的刺激，由人或其它动物中的B淋巴样细胞产生的免疫球蛋白分子。例如，中和抗体可以由流感HA多肽诱导。由特异性HA多肽诱导的中和抗体通常能够中和(例如，阻断感染性)含有该特定流感HA多肽的流感病毒、或含有共享某些共同免疫原性特点的相关HA多肽的流感病毒。

如本文使用的，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发针对一种或多种季节性流感毒株的免疫应答(例如，引发中和抗体)。在一些实施例中，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽引发能够中和至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种季节性流感毒株的抗体。在一些实施例中，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽引发能够中和2种或更多种季节性循环流感毒株的抗体。在一些实施例中，具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽是引发不中和大流行性流感毒株的抗体的HA多肽。在一些实施例中，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽引发不中和A/California/07/2009的抗体。在一些实施例中，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽引发这样的抗体，其能够中和与大流行性流感毒株相比，更或基本上更季节性流感毒株。在一些实施例中，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽引发这样的抗体，其能够中和比大流行流感毒株多至少2、3、4、5等6、7、8、9或10种季节性流感毒株。在一些实施例中，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和两种或更多种季节性循环毒株而不是大流行毒株的抗体。

如本文使用的，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽是这样的HA 多肽，其引发针对一种或多种大流行性流感毒株的免疫应答(例如，引发中和抗体)。特别地，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽是引发能够中和 A/California/07/2009的抗体的HA多肽。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和A/California/07/2009、 A/South Carolina/01/1918、A/NewJersey/1976、或如本文定义的任何其它大流行性流感毒株中的一种或多种的抗体。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽引发能够中和至少1、2、3、4、5种等大流行性流感毒株的抗体。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽引发能够中和两种或更多种大流行性流感毒株的抗体。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽是引发不中和季节性流感毒株的抗体的HA多肽。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽引发不中和A/New Caledonia/20/1999的抗体。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽引发这样的抗体，其能够中和与季节性流感毒株相比，更大流行性流感毒株。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽引发这样的抗体，其能够中和比季节性流感毒株多至少2、3、4、5种等大流行性流感毒株。在一些实施例中，具有大流行或占优势的大流行性免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和两种或更多种大流行毒株而不是季节性毒株的抗体。

如本文使用的，具有平衡免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和季节性毒株和大流行毒株两者的抗体。在一些实施例中，具有平衡免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发的抗体能够中和至少1、2、3、4或5种季节性毒株(例如，A/New Caledonia/20/1999)，以及A/California/07/2009、A/South Carolina/01/1918、A/New Jersey/1976或如本文所述的任何其它大流行毒株中的一种或多种。在一些实施例中，具有平衡免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和至少1、2、3、4或5种季节性毒株以及A/California/07/2009的抗体。在一些实施例中，具有平衡免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和A/New Caledonia/20/1999和A/California/07/2009的抗体。在一些实施例中，具有平衡免疫谱的HA多肽是这样的HA多肽，其引发能够中和基本上相同数目的季节性毒株和大流行毒株的抗体。例如，由具有平衡免疫谱的HA多肽引发的抗体中和的季节性毒株和大流行毒株数目中的差异不大于1、2、3、4或5。

如本文使用的，短语“改善免疫原性谱”、“增加免疫谱的宽度(breath)”、“更平衡的免疫谱”、“更少偏向的免疫谱”、“更季节性”、“更少季节性”、“更大流行”、“更少大流行”或语法等价物，指示相对于参考HA多肽(例如本文所述的修饰之前的亲本HA多肽)的谱，由经修饰的HA多肽生成的中和抗体的谱。

修饰经改造的HA以改变免疫原性谱

本发明的实施例可以用于修饰或改变经改造的HA多肽的免疫原性谱，特别是拓宽经改造的HA多肽能够引发针对其的免疫应答的流感毒株的多样性(例如，中和抗体应答)。在一些实施例中，根据本发明的方法基于从循环流感毒株中的序列变异的计算机芯片分析推导的修饰，抗原区域的绘制，和/或HA肽相对于具有差异或不同免疫谱的HA多肽的表位模式和结构分析。基于源自具有不同免疫谱的HA多肽的相应序列，可以在具有已知免疫谱的HA多肽的各种氨基酸残基位置和/或特定区域处引入靶向修饰，以产生具有改善的和更平衡的免疫谱的新型HA多肽。可以选择且组合修饰的位置、类型和数目，以生成具有免疫原性谱的经再改造的HA多肽，所述免疫原性谱已被定制为引发特定的免疫应答(例如，平衡的免疫谱、针对大流行毒株的改善的“更大流行”应答等)。在一些实施例中，修饰策略被设计为一般保留宿主HA多肽的受体结合位点(RBS)的特定残基，其具有在RBS附近的区域中改造的修饰。示例性修饰策略在下文描述。

除非另有说明，否则靶HA多肽中的修饰(例如，氨基酸取代、缺失或插入)的具体位置通过参考下文提供的A/California/07/2009(H1N1)HA多肽序列(CA09编号)来确定：

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNG KLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFID YEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKK GNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKF KPEIAIRPKVRXXEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIIS DTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRG LFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIE KMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDS NVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKL NREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:2)

嫁接经改造的头区

在一些实施例中，改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法基于将具有已知免疫谱的HA多肽的球状头部的结构限定区域嫁接到具有不同免疫谱的HA多肽的茎区上。例如，根据本发明的方法可以涉及选择具有已知免疫谱的经改造的HA多肽的头区，并且用经改造的HA多肽的选择头区取代具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应头区。在一些实施例中，可以将具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽的选择头区嫁接到具有占优势的大流行性免疫谱的HA多肽的茎区上。相反，在一些实施例中，可以将具有占优势的大流行性免疫谱的经改造的HA多肽的选择头区嫁接到具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽的茎区上。

在一些实施例中，将具有已知免疫谱的HA多肽的球状头部的结构上限定的区域嫁接到具有不同免疫谱的HA多肽的区域上，其中所述区域包含具有不同免疫谱的HA 多肽的茎区加上头区的一小部分。在其它实施例中，将具有已知免疫谱的HA的整个球状结构域嫁接到具有不同免疫谱的HA分子的茎区上。一般而言，选择适合于嫁接的头区，以确保所得到的全长杂合分子的结构完整性的保留。通常，选择合适的头区以保留HA多肽的受体结合位点(RBS)。HA多肽的RBS一般可以定义为由CH65抗体识别的表位(参见例如Whittle JR等人Proc Natl Acad Sci USA.2011；108:14216– 21)。可替代地，RBS可以定义为包括在对应于(CA09编号)中的位置167的普遍保守的色氨酸的15埃内的所有氨基酸残基的区域(例如参见Xu,R等人Nat Struct Mol Biol.2013Mar；20(3):363-70)。基于二级结构的保留、脱离的RBS的紧密球状构型、以及受体茎分子中的供体RBS整合时界面接触的保留，可以选择包含RBS或由 RBS组成的合适头区，用于嫁接到茎受体上。实例1中描述了选自适合于嫁接的具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽的头区的非限制性例子。在一些实施例中，具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽具有与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADY EELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGL YPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEI AKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPM DKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEK MNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNR EKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:1)

在一些实施例中，选择合适的头区以含有对应于SEQ ID NO:1的残基63-278、125-277或135-269的氨基酸序列。如本文使用的，术语“对应于”用于指定目的HA多肽中氨基酸残基的位置/同一性。本领域普通技术人员将了解，出于简化的目的，使用基于参考相关多肽的规范编号系统指定HA多肽中的残基，使得例如“对应于”在位置 63的残基的氨基酸，实际上不必是特定氨基酸链中的第63个氨基酸，而是对应于参考多肽中的63处发现的残基；本领域普通技术人员容易了解如何使用例如各种序列比对工具鉴定“对应的”氨基酸。在一些实施例中，合适的头区可以含有与SEQ ID NO:1 的氨基酸残基63-278、125-277或135-269至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

然后选择的头区可以用于取代或替换具有不同免疫谱(即，大流行或占优势地大流行的)的HA多肽的相应头区。具有不同免疫谱(即，大流行或占优势地大流行的)的此类合适的HA多肽可以是天然存在的或经改造的，包括但不限于通过以下改造的那些：计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)技术、拼接技术、反向遗传学、蛋白质工程、基于流感共有序列的流感毒株组合、结构域的缺失和/或重排、结构域交换或者多个流感毒株中的中和或交叉反应表位的组合。

例如，选择的头区可以用于取代或替换选自以下的天然存在的大流行毒株的相应头区：SEQ ID NO:2[全长wt CA09(A/California/07/2009HA序列)序列]的残基63- 277、SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基63-277、SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列]的残基63-277、SEQ ID NO:2[全长wt CA09序列]的残基125-277、SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基125-277、SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列] 的残基125-277、SEQ ID NO:2[全长wt CA09序列]的残基135-269、SEQ ID NO:3[全长wt SC1918序列]的残基135-269、或SEQ ID NO:4[全长wt NJ1976序列]的残基 135-269。

在一些实施例中，选择的头区可以用于取代或替换经改造的HA多肽的相应头区，所述HA多肽具有其为占优势地大流行的不同免疫原性谱。作为非限制性例子，具有占优势地大流行的免疫谱的经改造的HA多肽具有的氨基酸序列与以下基本上相同：6

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG KLCKLKGIAPLQLGKCSVAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSPDNGTCYPGYFAD YEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNGVTASCPHAGAKSFYRNLLWLVKKG NSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGVHHPSTSADQQSLYQNANAYVSVVTSRYSRRFT PEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSDT PVHDCNTTCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMATGLRNIPSIQSRG LFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDGITNKVNSVIE KMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDS NVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNTCMESVKNGTYDYPKYSEESKL NREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI。选择合适的头区以含有对应于SEQ ID NO:6的残基63-278、125-277或135-269的氨基酸序列。

去除或改造推定的N联糖基化位点的修饰

在一些实施例中，改变经改造的HA多肽的免疫原性谱的方法基于对HA多肽的球状头区中预测或推定的N联糖基化位点相关的残基的修饰。通常，推定或预测的N 联糖基化位点由NxS/Ty的共有序列定义，其中x和y不是P。相对于大流行或大流行样HA多肽，季节性HA多肽通常含有在受体结合位点(RBS)区域中另外的N联糖基化位点。可以突变靶季节性或季节性样经改造的HA多肽中的特定氨基酸残基以取消糖基化位点，并且给予经改造的HA多肽更大流行性的糖基化谱。在具体实施例中，靶季节性或季节性样经改造的HA多肽中的特定氨基酸残基可以突变或取代为在大流行或大流行样HA多肽(例如，California/07/2009)中的相应位置处观察到的那些，以便将靶HA多肽的糖基化和免疫原性谱改变为更大流行性的。

因此，在一些实施例中，根据本发明的方法涉及鉴定与具有不同免疫原性谱的 HA多肽的相应头区相比，具有已知免疫谱的经改造的HA多肽的头区中一个或多个推定的N联糖基化位点的存在或不存在；基于具有不同免疫原性谱的HA多肽的相应序列，将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入经改造的HA多肽的头区内，以破坏一个或多个推定的N联糖基化位点或插入另外的N联糖基化位点。

在一些实施例中，将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽内，以破坏一个或多个推定的N联糖基化位点，使得经再改造的HA多肽被改变为更大流行性的。相反，在一些实施例中，将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入引入具有占优势的大流行性免疫谱的经改造的HA多肽内，以插入一个或多个推定的N联糖基化位点，使得经再改造的HA多肽被改变为更季节性的。

在一些实施例中，在受体结合位点(RBS)区域处或附近去除或添加推定的N联糖基化位点。在一些实施例中，推定的N联糖基化位点可以在受体结合位点(RBS)的15 (例如，10、9、8、7、6或5)埃内引入一个或多个氨基酸取代，其中所述RBS定义为在三维(3-D)结构中对应于残基W167(CA09编号)的位置15(例如，10、9、8、 7、6、5等)埃内的所有氨基酸残基。在具体实施例中，预测的N联糖基化位点可以对应于位置142-145和/或177-179(CA09编号)。

因此，可以通过氨基酸取代、破坏或缺失，以破坏或去除具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽中的N联糖基化位点，来生成引发平衡免疫谱的重组HA多肽。可替代地，可以通过氨基酸取代、破坏或缺失，以将N联糖基化位点引入具有占优势的大流行性免疫谱的HA多肽内，来生成引发平衡免疫谱的重组HA多肽。可以在表4或表5中找到可以执行以生成引发平衡免疫谱的重组HA多肽的氨基酸取代、破坏或缺失的例子。氨基酸取代、破坏或缺失可以源自循环流感毒株的相应区域。

N联糖基化位点中的靶向取代或缺失可以与一种或多种另外的修饰组合。例如，可以在RBS附近插入带正电的氨基酸残基，以产生具有更大流行性免疫谱的经再改造的HA多肽。在具体实施例中，通过在一个或多个推定的N联糖基化位点附近或邻近，或在结合RBS的构象环结构内(例如，在“220和130环”内；参见例如，Bradley, K.C.等人，J.Virol.,2011,85(23),12387-12398)插入一个或多个带正电的氨基酸，具有季节性或占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽可以制备为具有更大流行性的 (例如，更平衡的)免疫谱。在一些实施例中，将赖氨酸或精氨酸残基插入结合RBS 的一个或多个环内(“赖氨酸环插入”)。在一些实施例中，环插入可以包括在对应于靶经改造的HA多肽的残基147(CA09编号)的位置处或附近的赖氨酸(K)或精氨酸 (R)插入。例如，环插入可以包括在NxS/Ty共有序列的1-5个氨基酸内(例如，1-4、 1-3、1-2个氨基酸内)的赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基插入。在一些实施例中，赖氨酸 (K)或精氨酸(R)残基在NxS/Ty共有序列的5'或3'的1-5个氨基酸内(例如，1-4、1- 3、1-2个氨基酸内)。

对RBS区域中的残基的靶向修饰

在一些实施例中，改变经改造的HA多肽的免疫原性谱可以通过在RBS区域中或邻近RBS区域引入一个或多个氨基酸取代来实现。例如，可以在涵盖对应于靶经改造的HA多肽的60和291(CA09编号)的残基的区域内的氨基酸位置处引入一个或多个氨基酸取代。也可以在受体结合位点(RBS)的15(例如，10、9、8、7、6、5等)埃内引入一个或多个氨基酸取代，其中所述RBS定义为在三维(3-D)结构中对应于保守残基W167(CA09编号)的位置15(例如，10、9、8、7、6、5等)埃内的所有氨基酸残基。例如，在其中修饰在RBS的10埃内发生的实施例中，它们在距保守W167 15- 25埃之间发生。在一些实施例中，RBS可以通过广泛中和性单克隆抗体CH65结合的表位来定义(参见例如，Whittle JR等人Broadly neutralizinghuman antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virushemagglutinin.Proc Natl Acad Sci USA.2011；108:14216–21)。在此类实施例中，一个或多个氨基酸取代邻近(例如，在100个氨基酸残基内、在75个氨基酸残基内、在50个氨基酸残基内、在40个氨基酸残基内、在30个氨基酸残基内、在25个氨基酸残基内、在20个氨基酸残基内、在 15个氨基酸残基内、在10个氨基酸残基内、在5个氨基酸残基内等)CH65的表位发生，或在CH65表位的15埃内发生。在一些实施例中，每个氨基酸取代包括将在特定位置处的氨基酸残基替换为在具有不同免疫原性谱(例如，循环的季节性或大流行性流感毒株)的HA多肽中的相应位置处观察到的氨基酸残基。例如，通过基于在具有占优势的大流行性免疫谱的HA多肽的相应位置处出现的氨基酸残基，取代在特定位置处的氨基酸，具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA多肽可以被改变为更大流行性的。相反，通过基于在具有占优势的季节性免疫谱的HA多肽的相应位置处出现的氨基酸残基，取代在特定位置处的氨基酸，具有占优势的大流行性免疫谱的经改造的HA多肽可以被改变为更季节性的。

示例性氨基酸取代显示于表4、表5、表6、表7、表8或表9中。作为非限制性例子，一个或多个氨基酸取代可以在对应于137、144、145、154、155、156、157、 158、159、177、210、211、212、213、214、244、245和/或262(CA09编号)的靶 HA多肽中的位置处发生。在特定实施例中，一个或多个氨基酸取代可以在对应于 137、144、145、154、155、156、157、158、159、177、210、211、212、213和/或 214(CA09编号)的位置处发生。在一些实施例中，一种或多种修饰包含选自表4、表5、表6、表7、表8或表9中所示那些的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、或者十种或更多种修饰。在一些实施例中，一种或多种修饰可以包括选自表4、表5、表6、表7、表8或表9的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续取代。

本文描述的各种方法的组合可以用于改变经改造的HA多肽的免疫原性谱。例如，对RBS区域中的残基的靶向修饰可以与推定的N联糖基化位点和环插入的修饰组合使用。头区嫁接还可以与对RBS周围的残基的靶向修饰和/或对推定的N联糖基化位点和环插入的修饰组合使用。

经再改造的HA多肽的评估

在一些实施例中，可以评价根据本文所述的各种方法生成的经修饰的重组HA多肽的所需表达和构象。筛选方法是本领域众所周知的，并且包括无细胞测定、基于细胞的测定和动物测定。体外测定可以是固态或可溶性靶分子检测，可以通过本领域已知的多种方式实现，包括使用能够鉴定与靶分子(例如，免疫球蛋白)结合的经改造的HA多肽的标记或可检测基团。可检测标记可以与使用本发明的经改造的HA多肽的测定结合使用。例如，如通过于2015年5月29日提交的名称为“Expression and Conformational Analysis ofEngineered Influenza Hemagglutinin”的国际专利申请 PCT/US2015/033205中描述的测定确定的，可以基于表达和构象特征来选择如本文所述的重组HA多肽。

本发明提供了用于在动物宿主中测试根据本发明的重组HA多肽的方法。如本文使用的，“动物宿主”包括适合于流感研究的任何动物模型。例如，适合于本发明的动物宿主可以是任何哺乳动物宿主，包括灵长类动物、雪貂、猫、犬、牛、马、啮齿类动物如小鼠、仓鼠、兔和大鼠。在一些实施例中，用于本发明的动物宿主是雪貂。特别地，在一些实施例中，在根据本发明的结合剂(任选地在根据本发明的组合物中) 施用之前，动物宿主对于病毒暴露或感染是首次用于实验的。在一些实施例中，在根据本发明的重组HA多肽施用之前或同时，动物宿主用病毒进行接种、用病毒进行感染或以其它方式暴露于病毒。用于本发明的实践中的动物宿主可以通过本领域已知的任何方法用病毒进行接种、用病毒进行感染或以其它方式暴露于病毒。在一些实施例中，动物宿主可以鼻内用病毒进行接种、用病毒进行感染或暴露于病毒。

还可以在筛选测定中评价本发明的经修饰的重组HA多肽，以鉴定和/或选择可以在动物(例如，小鼠、雪貂或人)中引发针对季节性和大流行性流感病毒毒株两者的保护性(即，中和性)免疫应答抗体的那些。在特定实施例中，例如，通过使用一般已知的血细胞凝集抑制测定(HAI)作为流感疫苗功效的替代测量，可以确定保护性免疫应答的诱发。HAI测定可以使用鸡、火鸡或马红细胞用于检测对于H1N1特异性的抗体。在特定实施例中，通过引发大于1:40的平均HAI滴度来证实保护性免疫应答，其已与流感疾病的预防和减少相关联。在用灭活的人流感病毒疫苗免疫后，大约1:32至 1:40的HAI抗体滴度一般将保护约50％的受试者免于感染。参见Treanor,J.&Wright, P.F.Immune correlates ofprotection against influenza in the human challenge model.Dev. Biol.(Basel),2003,115:97–104；；以引用的方式并入本文)。在一些实施例中，可以通过血清转换率鉴定保护性免疫应答的引发。血清转换的保护水平可以定义为HAI滴度中的至少4倍上升，例如，小于1:10的施用前或接种疫苗前的HAI滴度以及大于或等于1:40的疫苗接种后滴度。换言之，血清转换的成功率可以定义为具有小于约1:10 的疫苗接种前HAI滴度以及大于约1:40的疫苗接种后HAI滴度、或大于约1:10的疫苗接种前HAI滴度以及疫苗接种后HAI抗体滴度中的最少四倍上升的受试者百分比。

首次用于实验的动物和/或接种的动物可以用于各种研究中的任一种。例如，此类动物模型可以用于如本领域已知的病毒传播研究。考虑在病毒传播研究中雪貂的使用可以充当用于人中的病毒传播的可靠预测因子。例如，从接种的动物(例如雪貂)到首次用于实验的动物的病毒性流感的空气传播是本领域已知的(Tumpey等人，2007, Science 315；655-59；以引用的方式并入本文)。病毒传播研究可以用于测试根据本发明的重组HA多肽。例如，可以将根据本发明的重组HA多肽施用于合适的动物宿主，以确定所述经改造的HA多肽在动物宿主中引发广泛免疫应答中的功效。使用从动物宿主中的研究收集的信息，可以预测重组HA多肽在人宿主中引发广泛保护的功效。

核酸构建与表达

可以使用本领域已知的分子生物学方法，从核酸分子产生如本文所述的重组流感HA多肽。将核酸分子插入在引入适当的宿主细胞内时能够表达HA多肽的载体内。适当的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体内的任何方法都可以用于构建在转录/翻译控制信号的控制下编码本发明的融合蛋白的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(参见Sambrook等人Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory；Current Protocols in Molecular Biology，编辑Ausubel等人， GreenePubl.Assoc.,Wiley-Interscience,NY)。

在一些实施例中，本发明提供了编码HA多肽或者HA多肽的特征或生物活性部分的核酸。在一些实施例中，本发明提供了与核酸互补的核酸，所述核酸编码HA多肽或者HA多肽的特征或生物活性部分。

在一些实施例中，本发明提供了与编码HA多肽或者HA多肽的特征或生物活性部分的核酸杂交的核酸分子。此类核酸可以用作例如引物或探针。仅举几个例子，此类核酸可以用作聚合酶链反应(PCR)中的引物、用于杂交(包括原位杂交)的探针、和 /或用于逆转录-PCR(RT-PCR)的引物。

在一些实施例中，核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链的。在一些实施例中，根据本发明的核酸可以包括一种或多种非天然核苷酸；在一些实施例中，根据本发明的核酸仅包括天然核苷酸。

可以通过第二核酸序列调节根据本发明的核酸分子的表达，使得分子在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，本发明的核酸分子的表达可以通过本领域已知的启动子和/或增强子元件来控制。

通过本领域已知的方法将本发明的核酸构建体插入表达载体或病毒载体内，并且核酸分子与表达控制序列可操作地连接。

将含有核酸分子的表达载体转化到合适的宿主细胞内，以允许产生由核酸构建体编码的蛋白质。示例性宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌(E.coli))和真核生物 (例如COS、293或CHO细胞)。用表达载体转化的宿主细胞在允许本发明的经改造的HA多肽产生的条件下生长，随后为经改造的HA多肽的回收。

可以通过本领域已知的任何技术纯化本发明的重组HA多肽。例如，不希望受理论束缚，经改造的HA多肽可以作为可溶性多肽或作为包涵体从细胞中回收，从所述包涵体中可以通过8M盐酸胍和透析定量地提取它们。为了进一步纯化本发明的重组 HA多肽，可以使用常规离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱或凝胶过滤。在由真核或原核细胞分泌后，也可以从条件培养基中回收本发明的重组HA多肽。

流感病毒样颗粒(VLP)

在一些实施例中，本发明提供了流感病毒样颗粒(VLP)，其包括如本文所述的经修饰的重组HA多肽。在一些实施例中，流感VLP一般由HA、NA和病毒结构(例如 HIV gag)蛋白组成。流感VLP的产生是本领域已知的，并且在阅读本公开内容后，对于技术人员将是显而易见的。例如，流感VLP可以通过用编码HA、NA和HIV gag 蛋白的质粒转染宿主细胞来产生。举例来说，合适的宿主细胞包括人细胞(例如， HEK293T)。在将转染的细胞温育适当的时间以允许蛋白质表达(例如大约72小时)后，可以从细胞培养上清液中分离VLP。在一些实施例中，如本文所公开的流感 VLP可以用作流感疫苗，以引发针对H1N1流感病毒的广泛中和性免疫应答。

药物组合物

在一些实施例中，本发明提供了药物组合物，其包括如本文所述的经修饰的重组HA多肽和/或相关实体。例如，在一些实施例中，经修饰的重组HA多肽、编码此类多肽的核酸、此类多肽或核酸的特征或生物活性片段、与此类多肽或片段结合和/或竞争的抗体、与此类多肽或结合其的聚糖相互作用或竞争的小分子等包括在根据本发明的药物组合物中。

在一些实施例中，本发明提供了通过施用根据本发明的此类药物组合物预防或治疗流感感染的方法。在一些实施例中，将根据本发明的药物组合物施用于患有或易患流感感染的受试者。在一些实施例中，受试者是动物，包括但不限于鸟类(例如鸡、鸭、火鸡等)、犬、马和猪。在一些实施例中，如果受试者展示通常与流感感染相关的一种或多种症状，则受试者视为患有流感感染。在一些实施例中，受试者已知或被认为已暴露于流感病毒。在一些实施例中，如果受试者已知或被认为已暴露于流感病毒，则受试者视为易患流感感染。在一些实施例中，如果受试者已与已知或怀疑已感染流感病毒的其它个体接触和/或如果受试者出现或已出现在其中流感感染已知或被认为普遍存在的地方，则受试者已知或被认为已暴露于流感病毒。

在一些实施例中，在根据本发明的药物组合物施用之前、期间或之后，测试患有或易患流感感染的受试者针对根据本发明的经修饰的重组HA多肽的抗体。在一些实施例中，不向具有此类抗体的受试者施用包含根据本发明的经修饰的重组HA多肽的药物组合物。在一些实施例中，基于此类抗体的检测(或其缺乏)，选择适当剂量的药物组合物和/或经修饰的重组HA多肽。

在一些实施例中，选择用于治疗的特定受试者、用于施用的特定经修饰的重组 HA多肽或组合物、和/或用于施用的特定剂量或方案，例如以书面、印刷或电子存储形式进行记录。

包含如所述的经修饰的重组HA多肽的组合物可以在流感感染的一种或多种症状发展之前或之后施用。在一些实施例中，可以在流感感染的一种或多种症状发展之前或之后，施用包含如本文所述的经修饰的重组HA多肽的流感VLP(或经修饰的重组 HA多肽本身)。

在一些实施例中，通过施用本文所述的经修饰的重组HA多肽，本发明提供了流感感染的治疗。在一些实施例中，通过施用包含如本文所述的经修饰的重组HA多肽的流感VLP来实现根据本发明的流感感染的治疗。在一些实施例中，通过施用疫苗来实现根据本发明的流感感染的治疗。迄今为止，虽然在流感疫苗的开发方面已取得了重大成就，但存在进一步改善的空间。本发明提供了包含根据本发明的经修饰的重组 HA多肽，并且特别包含经改造的HA多肽的疫苗，其引发针对经修饰的重组HA多肽的多个中和抗原决定簇(例如表位)广泛保护性免疫应答。

在一些实施例中，本发明提供了用于流感预防的如本文所述的流感VLP、流感疫苗、融合蛋白和/或经修饰的重组HA多肽。

在一些实施例中，本发明提供了免疫原性组合物(例如疫苗)和这些免疫原性组合物对人受试者的施用。在特定实施例中，人受试者是6个月或更大、6个月直到35 个月、36个月直到8岁、或者9岁或更大。在一些实施例中，免疫原性组合物是包含下述一种或多种的药物组合物：(1)灭活病毒，(2)减毒活流感病毒，例如复制缺陷型病毒，(3)病毒样颗粒(VLP)，(4)经修饰的重组HA多肽，(5)编码经修饰的重组HA多肽或者其特征或生物活性部分的核酸，(6)编码根据本发明的经修饰的重组HA多肽或者其特征或生物活性部分的DNA载体，和/或(7)表达系统，例如，表达用作抗原的一种或多种流感蛋白的细胞。

包含本文所述的经改造的和经再改造的HA多肽的全流感病毒可以通过基于质粒的反向遗传学产生(参见例如，Neumann,G.等人，Reverse Genetics of InfluenzaViruses, Methods Mol Biol.,2012,865:193-206；以引用的方式并入本文)和基于蛋的技术；例如包含如本文所述的计算优化的H1HA多肽的重组病毒、来自H1N1流感毒株的野生型NA多肽和来自供体病毒(例如，流感A/Puerto Rico/8/34(PR8))的内部蛋白质基因的主链，其赋予蛋中的高产率。例如，编码高生长流感A/Puerto Rico/8/34(PR8)供体病毒的内部蛋白质的六种质粒可以用编码如本文所述的计算优化的H1N1HA多肽和野生型神经氨酸酶(NA)糖蛋白的两种质粒共转染到合格的哺乳动物细胞(例如Vero细胞)内，随后为重组病毒的分离。本领域技术人员将了解，也可以使用12-质粒反向遗传学系统(参见例如，Pekosz,A.等人Reverse genetics of negative-strand RNA viruses: Closing thecircle.Proc.Natl.Acad.Sci.,1999,96,884-8806)。含有来自PR8病毒的内部蛋白质基因的重组病毒可以用于制备灭活的流感病毒疫苗(参见例如，Fodor,E.等人Rescue ofinfluenza A virus from Recombinant DNA.J.Virol.,1999,73,9679-9682；引入本文作为参考)。全流感病毒可以作为活减毒或裂解灭活疫苗的组分施用。

因此，在一些实施例中，本发明提供了灭活的流感疫苗。在一些实施例中，灭活的流感疫苗包含三种类型的抗原制剂之一：灭活的全病毒、其中纯化的病毒颗粒被洗涤剂或其它试剂破坏以溶解脂质包膜的亚病毒粒子(“裂解”疫苗)、或纯化的HA多肽(“亚单位”疫苗)。在一些实施例中，通过用甲醛、β-丙内酯、醚、醚与去污剂 (例如

)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和Triton N101、脱氧胆酸钠和三(正丁基)磷酸酯处理来灭活病毒。灭活可以在尿囊液(来自蛋中产生的病毒)澄清之后或之前发生；通过离心分离和纯化病毒粒子(Nicholson等人，编辑，1998, Textbook of Influenza,Blackwell Science,Malden,MA；以引用的方式并入本文)。为了评价疫苗的效力，可以使用单径向免疫扩散(SRD)测试(Schild等人，1975,Bull. World Health Organ.,52:43-50&223-31；Mostow等人，1975,J.Clin.Microbiol., 2:531；两者均以引用的方式并入本文)。

在一些实施例中，本发明的经改造的或经再改造的HA多肽用作季节性和/或大流行性流感疫苗的组分、或者作为预期赋予长效(多季节)保护的流感疫苗接种方案的部分。

在一些实施例中，用于疫苗中的流感病毒在蛋中生长，例如在含胚蛋中生长，在这种情况下，收获的材料是尿囊液。可替代地或另外地，流感病毒或经改造的/经再改造的血凝素多肽可以使用组织培养以生长病毒从任何方法产生。用于培养病毒或以其它方式重组产生经改造的或经再改造的血凝素多肽的合适细胞底物包括例如用于疫苗目的，可从商业源(例如，ATCC,Rockville,Md.)容易获得的犬肾细胞如MDCK或来自MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞、猴肾细胞如AGMK细胞包括Vero细胞、作为连续细胞系的培养的上皮细胞、293T细胞、BK-21细胞、CV-1细胞或适合于生产流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型(包括上呼吸道上皮细胞)。合适的细胞底物还包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞底物并不限于细胞系；例如，还包括原代细胞，例如鸡胚成纤维细胞。

经改造的或经再改造的血凝素多肽也可以在多种基于真核的表达系统中表达/产生，包括微藻(例如裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)；参见例如，Bayne,A-C.V.等人，PLOS ONE,8(4):e61790,April 2013)、基于植物的系统(例如，烟草植物；参见例如，Jul-Larsen,A.等人，Hum Vaccin Immunother.,8(5):653-61,2012)、酵母(参见例如，Athmaram,T.N.等人，Virol J.,8:524,2011)、以及真菌(参见例如，Allgaier,S. 等人，Biologicals,37:128-32,2009)。基于细菌的表达系统也由本发明涵盖(参见例如，Davis,A.R.等人，Gene,21:273-284,1983)。

在一些实施例中，根据本发明的疫苗还包含一种或多种佐剂。例如，铝盐 (Baylor等人，2002,Vaccine,20:S18；以引用的方式并入本文)和单磷酰脂质A (MPL；Ribi等人，1986,Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, PlenumPubl.Corp.,NY，第407页；以引用的方式并入本文)可以用作人疫苗中的佐剂。可替代地或另外地，新化合物作为人疫苗中的佐剂目前正在测试，例如 MF59(Chiron Corp.,http:// www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html)、 CPG 7909(Cooper等人，2004,Vaccine,22:3136；以引用的方式并入本文)、以及皂苷例如QS21(Ghochikyan等人，2006,Vaccine,24:2275；以引用的方式并入本文)。

另外，一些佐剂在本领域中已知增强流感疫苗的免疫原性，例如聚[二(羧基苯氧基)磷腈](PCCP；Payne等人，1998,Vaccine,16:92；以引用的方式并入本文))、干扰素-γ(Cao等人，1992,Vaccine,10:238；以引用的方式并入本文)、嵌段共聚物 P1205(CRL1005；Katz等人，2000,Vaccine,.18:2177；以引用的方式并入本文)、白介素-2(IL-2；Mbwuike等人，1990,Vaccine,8:347；以引用的方式并入本文)、以及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA；Kreuter等人，1981,J.Pharm.Sci.,70:367；以引用的方式并入本文)。

除免疫原性组合物(例如，包含具有本文所述的改造或经再改造的流感血凝素多肽的VLP的疫苗)之外，本发明还提供了可用于治疗病毒感染的其它治疗组合物。治疗组合物包括例如流感VLP、融合蛋白、以及如本文所述的经改造的或经再改造的 HA多肽本身。在一些实施例中，通过施用干扰HA多肽的表达或活性的试剂来完成治疗。

在一些实施例中，如本文所述的免疫原性组合物(例如，流感VLP或经改造的/ 经再改造的HA多肽本身)单独施用或者与一种或多种治疗剂组合施用，以增强免疫应答。例如，在一些实施例中，如本文所述的流感VLP可以与佐剂一起施用，所述佐剂例如弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂。在一些实施例中，一种或多种细胞因子，例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-a或IFN-γ，一种或多种生长因子，例如GM-CSF或G-CSF；一种或多种分子如OX-40L或41BBL，或这些分子的组合，可以用作生物佐剂(例如，Salgaller等人，1998,J.Surg.Oncol.68(2):122-38；Lotze等人，2000,Cancer J.Sci.Am.6(Suppl l):S61-6；Cao等人，1998,Stem Cells 16(Suppl l):251-60；Kuiper等人，2000,Adv.Exp.Med.Biol.465:381-90)。

在一些实施例中，本发明提供了药物组合物，其包含与提供的HA多肽相关的抗体或其它试剂。例如，本发明提供了含有抗体的组合物，所述抗体识别含有特定经改造的或经再改造的HA多肽的病毒颗粒、核酸(例如与HA序列互补的核酸序列，其可以用于RNAi)、竞争结合HA受体的聚糖、竞争聚糖-HA多肽相互作用的小分子或糖模拟物、或其任何组合。在一些实施例中，利用具有不同结构的不同试剂的集合。在一些实施例中，治疗组合物包含一种或多种多价试剂。在一些实施例中，治疗包括在暴露或怀疑暴露后不久的紧急施用。

在一些实施例中，本文所述的任何免疫原性组合物(例如疫苗)提供针对不同变种的流感病毒的广泛交叉保护。例如，在一些实施例中，本文所述的免疫原性组合物提供针对禽类、猪和/或人适应的A型流感病毒的交叉保护。在一些实施例中，本文所述的任何免疫原性组合物提供针对一种或多种A型流感病毒亚型的交叉保护。在一些实施例中，本文所述的免疫原性组合物提供针对A型流感H1亚型病毒的多种毒株的交叉保护(参见例如图4和5)。

一般而言，免疫原性和/或药物组合物包括治疗剂加上一种或多种非活性剂，例如无菌的生物相容性载体，包括但不限于无菌水、盐水、缓冲盐水或右旋糖溶液。可替代地或另外地，组合物可以含有各种添加剂中的任一种，例如稳定剂、缓冲剂、赋形剂(例如糖、氨基酸等)或防腐剂。

在一些实施例中，如本文所述的药物组合物包括单独或与药学可接受的载体组合的治疗有效量的流感VLP(包含如本文所述的经改造的或经再改造的HA多肽)。药学可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。在一些实施例中，载体和组合物是无菌的，并且制剂适合施用模式。在一些实施例中，药物组合物含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。在一些实施例中，药物组合物是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。在一些实施例中，药物组合物配制用于皮内注射、鼻内施用或肌内注射。可以使用任何常见的药物载体，例如无菌盐水溶液或芝麻油。在一些实施例中，介质还可以含有常规药物辅助材料，例如调节渗透压的药学可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等等。在一些实施例中，可以与本文提供的组合物和方法一起使用的其它介质是生理盐水和芝麻油。

在一些实施例中，存在于根据本发明的药物组合物中的治疗剂由如本文所述的一种或多种经改造的或经再改造的HA多肽组成。

在一些实施例中，药物组合物包括在脂质囊泡、生物可利用的和/或生物相容的和/ 或可生物降解的基质或其它微粒内包封、捕获或结合的治疗剂。在一些实施例中，免疫原性或药物组合物包含展示本文所述的经改造的或经再改造的血凝素多肽的纳米颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒是铁蛋白纳米颗粒(参见例如，美国授权前公布 2014/0072958)。

本发明的药物组合物可以单独施用或者与一种或多种其它治疗剂组合施用，所述其它治疗剂包括但不限于疫苗和/或抗体。“与……组合”并不意指试剂必须同时施用或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本发明的范围内。一般而言，每种试剂将以针对该试剂确定的剂量和时间表施用。另外，本发明涵盖根据本发明的药物组合物与试剂组合的递送，所述试剂可以改善其生物利用度、减少或修改其代谢、抑制其排泄或改变其在体内的分布。尽管本发明的药物组合物可以用于治疗(例如，疫苗接种) 任何有此需要的受试者(例如，任何动物)，但它们最优选用于治疗人。在一些实施例中，根据本发明的药物组合物和/或如本文所述的经改造的或经再改造的HA多肽与一种或多种抗病毒剂(例如，奥司他韦

扎那米韦

等)和/或唾液酸酶组合施用。

本发明的药物组合物可以通过各种途径施用，包括经口、静脉内、肌内、动脉内、皮下、心室内、透皮、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏、乳膏或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠内、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或作为口腔喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气溶胶。一般而言，最适当的施用途径取决于各种因素，包括试剂的性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)、患者的状况 (例如，患者是否能够耐经口施用)等。

在一些实施例中，通过注射实现肠胃外施用，例如皮下、静脉内或肌内施用。在一些实施例中，注射剂以常规形式制备为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式、或乳液。在一些实施例中，注射溶液和悬浮液由无菌粉末、颗粒和制备。在一些实施例中，如本文所述的流感VLP的施用是全身或局部的。

在一些实施例中，流感VLP或其组合物以任何合适的方式施用，例如与药学可接受的载体一起施用。如本领域技术人员所知，药学可接受的载体部分地由待施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法确定。相应地，存在如本文所述的药物组合物的广泛多样的合适制剂。

在一些实施例中，用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。示例性非水溶剂包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。示例性水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在一些实施例中，肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格或不挥发性油。在一些实施例中，静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的补充剂)等等。在一些实施例中，还可以存在防腐剂和/或其它添加剂。示例性防腐剂和/或其它添加剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。

在一些实施例中，组合物(流感VLP或以其它方式包含如本文所述的HA多肽) 作为药学可接受的酸-或碱-加成盐施用，所述盐通过与无机酸和有机酸反应形成，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸、所述有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸和富马酸，或通过与无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱如单-、二-、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺反应形成。

目前，经口或鼻喷雾剂或气溶胶途径(例如通过吸入)最常用于将治疗剂直接递送至肺和呼吸系统。然而，考虑到药物递送科学的可能进展，本发明涵盖通过任何适当的途径递送根据本发明的药物组合物。

在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂包含多个颗粒。在一些实施例中，此类制剂具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约 11、约12或约13微米的平均粒度。在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂配制为干粉。在一些实施例中，例如通过包含润湿剂，用于吸入或气溶胶递送的制剂配制为湿粉。在一些实施例中，润湿剂选自水、盐水或其它生理pH液体。

在一些实施例中，根据本发明的组合物作为滴剂施用于鼻腔或口腔。在一些实施例中，剂量可以包含多个滴剂(例如，1-100、1-50、1-20、1-10、1-5等)。

在一些实施例中，使用递送计量剂量的组合物(例如，经改造的或经再改造的 HA多肽)的装置施用根据本发明的组合物。

用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适装置包括短针装置，例如美国专利号4,886,499、美国专利号5,190,521、美国专利号5,328,483、美国专利号5,527,288、美国专利号4,270,537、美国专利号5,015,235、美国专利号5,141,496、美国专利号 5,417,662(所有这些专利以引用的方式并入本文)中所述的那些。皮内组合物还可以通过限制针进入皮肤内的有效穿透长度的装置，例如以引用的方式并入本文的 WO1999/34850中描述的那些，及其功能等价物进行施用。同样合适的是喷射注射装置，其经由液体喷射注射器或经由刺穿角质层且产生到达真皮的射流的针将液体疫苗递送至真皮的喷射注射装置。喷射注射装置例如在美国专利号5,480,381、美国专利号 5,599,302、美国专利号5,334,144、美国专利号5,993,412、美国专利号5,649,912、美国专利号5,569,189、美国专利号5,704,911、美国专利号5,383,851、美国专利号 5,893,397、美国专利号5,466,220、美国专利号5,339,163、美国专利号5,312,335、美国专利号5,503,627、美国专利号5,064,413、美国专利号5,520,639、美国专利号 4,596,556、美国专利号4,790,824、美国专利号4,941,880、美国专利号4,940,460、 WO1997/37705和WO1997/13537(所有这些专利以引用的方式并入本文)中描述。同样合适的是弹道粉末/颗粒递送装置，其使用压缩气体将粉末形式的疫苗加速通过皮肤的外层到达真皮。另外，常规注射器可以用于皮内施用的经典的mantoux方法中。

药物制剂的配制和制造中的一般考虑因素可以在例如Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中找到；以引用的方式并入本文。

根据本发明的药物组合物可以以适合于实现所需结果的任何剂量施用。在一些实施例中，所需结果是诱导针对多种流感毒株的持久适应性免疫应答。在一些实施例中，所需结果是流感感染的一种或多种症状的强度、严重性和/或频率中的减少和/或发作延迟。

在一些实施例中，根据本发明的药物组合物以单个剂量或多个剂量施用。在一些实施例中，根据本发明的药物组合物以在不同天时施用的多个剂量施用(例如，初免- 加强免疫接种策略)。在一些实施例中，根据本发明的药物组合物根据连续给药方案施用，使得受试者不经历介于治疗给药时期之间的小于治疗给药的时期。在一些实施例中，根据本发明的药物组合物根据间歇给药方案施用，使得受试者经历介于治疗给药的两个时期之间的小于治疗给药的至少一个时期。

在一些实施例中，施用于受试者的剂量应该足以随着时间过去在受试者中诱导有益的治疗应答，或者抑制或预防H1N1流感病毒感染。所需剂量将因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄、重量和一般状况，待治疗感染的严重性，待使用的特定组合物及其施用模式。

通过参考下述实例将更全面地理解本发明。所有文献引用都以引用的方式并入。

实例

实例1.受体结合位点嫁接改善经改造的HA多肽的季节性免疫谱(结合强度)

本实例描述了经改造的HA多肽的设计和测试，通过将流感HA蛋白的球状头区 (包括RBS)嫁接到受体HA茎上，所述经改造的HA多肽具有关于在免疫学谱增加的宽度。将显示出季节性免疫谱的HA多肽的球状头部的结构限定区域嫁接到来自大流行样毒株(NewJersey/1976、South Carolina/1918、California/07/2009和新型经改造的大流行HA)的HA分子的茎区上。就嫁接测试HA球状头部的三个不同区域(定义为RBS 00、RBS 01和RBS02，图1)。

出于本实例的目的，用于嫁接的三个含RBS的区域定义为G63-G277(CA09编号)、V125-G277(CA09编号)和P135-P269(CA09编号)。选择用于嫁接的这些 RBS区域基于以下标准加以选择：它们在RBS与HA分子的剩余部分脱离时，引起对整体蛋白质折叠的最小破坏。更具体地，以这样的方式选择RBS区域，使得(i)起始位置和终止位置位于界定RBS的环区域中，这帮助保留局部二级结构，(ii)保留所得到的脱离RBS的紧凑球状结构，并且(iii)在供体RBS整合到受体分子内时保留界面接触。

合成来自具有占优势的季节性免疫谱的经改造HA的供体RBS区域与来自大流行毒株的受体茎配对的十二种个别组合(表3)，并且使用如国际申请号 PCT/US2015/033205中所述且在图2中描绘的基于流式细胞术的测定，在体外测试细胞表面表达和正确的抗原构象，所述国际申请以引用的方式并入本文。该测定提供了稳健且快速的筛选测定，以鉴定产生用于通用疫苗的功能性流感血凝素(HA)抗原的设计。它利用中和抗体实验对象组，以分析表面展示的经改造的HA抗原的表达和构象。它不仅鉴定且验证正确表达和结构合理的经改造的HA抗原，而且还预测经改造的HA抗原的免疫原性的宽度和/或特异性。已知结合HA头部的构象表位(例如，接近于受体结合位点的表位)和HA茎的保守构象表位(例如A螺旋)的抗体可以用于抗体实验对象组中。作为非限制性例子，合适的抗头部中和抗体可以包括：CH65 (2009年大流行之前的当代季节性毒株)(Whittle,JRR等人PNAS 2011)、5J8(当代季节性毒株和历史毒株)(Krause,JC等人J.Virology 2011)、4K8(仅大流行毒株)(Krause,JC等人，J.Immunology 2011)、AH4和AH5。合适的抗茎部中和抗体可以包括：C179(组1HA)(Okuno,Y等人，J.Virology 1993))、AS2(组1 HA)、AS3(组1和组2HA)和AS4(组1HA)。

表3

*具有占优势的大流行免疫谱的经改造的HA

该测定由使用Lipofectamine用质粒DNA转染HEK293FT组成。转染后24小时，用

Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit标记细胞，以确定表面染色前的细胞活力。随后将重悬浮于染色缓冲液(0.1％BSA的PBS溶液)中的细胞用0.4微克指示的未标记的中和抗血凝素单克隆抗体(例如CH65、5J8、4K8、AS3、C179、AS2 或AS4)染色。

将染色的细胞洗涤并且重悬浮于100微升含有0.2微克Alexa

488抗人或抗小鼠IgG二抗(取决于一抗)的染色缓冲液中，并且在4℃下用二抗染色20分钟。最后，将染色的细胞重悬浮于固定溶液(1.75％甲醛的PBS溶液)中，并且在4℃下贮存 ≤1周。

流式细胞术分析

将固定的细胞洗涤并且重悬浮于200微升PBS中，然后转移至深孔96孔板，用于使用BD High-Throughput Sampler的样品采集。使用配备有488nm激光(用于 Alexa

488激发)和635nm激光(用于LIVE/DEAD远红外染料激发)的BD FACS Calibur流式细胞仪执行样品分析。用Alexa

488二抗但没有一抗染色的模拟转染的细胞样品用于确定最佳采集设置。特别地，调节前向散射FSC)放大增益、侧向散射(SSC)电压和FSC阈值，以按比例显示HEK293FT细胞群体且排除不需要的碎片。在FSC相对于SSC图中门控细胞群体，以进一步排除碎片。还使用仅用二抗染色的模拟转染的细胞调节荧光检测器设置。特别地，调节FL1检测器(用于检测 Alexa

488荧光)和FL4检测器(用于检测LIVE/DEAD远红外染料荧光)电压，以将门控细胞群体的荧光发射置于在第一对数十倍程中。这种荧光团组合不需要补偿调整，因为Alexa

488和LIVE/DEAD远红外染料之间不存在光谱重叠。使用与模拟对照相同的采集设置获取所有样品。对于每个样品计数FSC相对于SSC门内的至少10,000个细胞，并且将数据存储为FCS数据文件。

使用FlowJo软件执行数据分析。对应于仅用二抗染色的模拟转染细胞的FCS数据文件用于产生分析门。特别地，首先在FSC相对于SSC图中绘制包括完整细胞群体的门。然后在展示FL4荧光强度(LIVE/DEAD远红外染料荧光)相对于FSC的分开图中分析该门控细胞亚集。创建了涵盖具有低FL4荧光强度的细胞群体的新门。在展示FL1荧光强度(Alexa

488荧光)相对于FSC的分开图中进一步分析对应于完整活细胞的这种新细胞亚集。生成涵盖如由荧光值定义的具有阳性FL1荧光的细胞的新门，所述荧光值将95％的模拟转染的细胞留在阴性FL1级分中。使用相同的分析门分析所有FCS文件。将每个细胞样品的阳性FL1细胞亚集的中值荧光强度(MFI)和染色输出到excel文件中，并且用于计算抗体结合率。

首先通过扣除对应于仅用二抗染色的相同细胞样品的背景荧光来校正每个细胞样品的阳性FL1细胞亚集的MFI和染色。通过检查模拟转染细胞的背景校正MFI(阴性对照)和用野生型HA质粒DNA转染的细胞的背景校正MFI(阳性对照)，证实每种中和性抗血凝素单克隆抗体染色的特异性。如果对照的MFI落如预期值范围内，则每种经改造的HA质粒和中和性抗HA单克隆抗体的抗体结合率如下测定：

每种重组HA多肽是表面表达的(即，类似于在受感染细胞中产生的野生型流感抗原，能够细胞间加工)，并且保留茎折叠(与野生型毒株对照可比较或更好)，如通过在流式细胞术测定中结合抗茎部抗体实验对象组确定的(图3)。该实验还证实，在一些情况下，头区中的修饰诱导与抗茎部mAb的结合中的适度增加。因此，在一个位置处的取代可以对远侧位置发挥远程别构效应。同样地，通过季节性RBS-区域茎嫁接到大流行茎上生成的新的重组HA多肽令人惊讶地证实了改善的季节性免疫谱。这些经再改造的重组HA多肽证实季节性毒株中和抗体相对于初始经改造的HA 亲本分子(SMARt_DO2a)的结合增加。(图4)。在这些测定中，“增加的mAb结合” 是相对于对照结合经再改造的HA的抗体的平均荧光强度的量度：用于CH65和5J8抗体的未修饰的亲本经改造的HA(SMARt_DO2a)，以及用于4K8的野生型大流行毒株，A/California/7/2009H1N1。因此，“增加的mAb结合”是抗体亲和力的近似量度。在一些情况下，季节性免疫谱(如通过mAb结合测量的)改善超过亲本季节性经改造的HA分子2-3倍。(图5；比较第2列的季节性头部抗体结合(例如，CH65和5J8) 与第5和6列中的经再改造的构建体)。

由于嫁接抗原的RBS部分与具有占优势的季节性免疫谱的经改造的HA相同，因此相对于受体大流行毒株的宽度扩展来自经再改造的HA的非RBS部分。在体内实验而不是靶向RBS的抗体的HAI测定或结合测定中，宽度中的增加更显而易见。

实例2.N联糖基化位点和/或环插入的破坏增加了经改造的HA多肽的免疫宽度

本实例描述了通过修饰与预测的N联糖基化位点相关的残基，并且将赖氨酸引入结合RBS的环内，用于增加经改造的HA多肽的免疫宽度的第二种策略。与大流行毒株相比，季节性流感毒株含有另外的推定的N联糖基化位点。糖基化具有阻断HA内的抗原位点改变免疫应答的潜力。通过序列基序NxS/Ty鉴定此类糖基化位点，其中x 和y不是脯氨酸(P)。这种N联糖基化模式中的天冬酰胺可以在受体结合位点中对应于 142和177(CA09编号)的残基附近或处的HA多肽中发现(图6；左图证实野生型大流行H1N1毒株中的相关序列和示例性经改造的HA多肽中的相应糖基化序列， “DO2”)。

将赖氨酸插入预测N联糖基化位点的HA RBS区域内或附近的环内是大流行性A 型流感病毒的特点。插入在N联糖基化位点附近的环内(例如，插入赖氨酸或精氨酸残基)提供了在经改造的HA多肽内的大流行毒株特点(图6；中图)。

与CH65表位相邻的RBS位点周围的残基的修饰还掺入大流行性A型流感病毒的特点(图6；右图)。

为了证实通过修饰预测的N联糖基化位点和/或赖氨酸环插入而赋予经改造的HA多肽增加的免疫学宽度，将示例性经改造的HA多肽(“SMARt_DO2a”)中的特定氨基酸残基修饰为反映在大流行样HA多肽中观察到的那些。表4证实了可以在这些位点进行的潜在氨基酸取代，如从循环A型流感病毒中的每个位置处观察到的残基所确定的。

表4

为了证实N联糖基化位点的破坏对HA多肽的免疫宽度的作用，产生经改造的 HA分子，其破坏了两个N联糖基化基序位点。另外，产生成了两种经改造的HA多肽，其中N联糖基化基序位点被破坏，并且赖氨酸被插入限制RBS的环内(表5)。糖基化基序的单独破坏以及与赖氨酸环插入的组合破坏产生重组HA多肽，其如通过流式细胞术测定确定的是表面表达的且保留茎折叠(图7)。再一次，观察到头区中的修饰诱导与抗茎部mAb的结合中的适度增加；证实在一个位置处的取代可以对远侧位置发挥远程别构效应。基于由抗体实验对象组的识别，这些修饰还促成增加的免疫学宽度(图8)。更具体地，几种经再改造的抗原证实改善的季节性质(抗季节性头部抗体CH65和5J8的mAb结合增加)、以及通过抗大流行性头部抗体4K8的结合中的50-150％增加所证实的宽度增加两者(参见图8中的构建体DO2a_m1至m3)。

表5

实例3.对RBS区域和N联糖基化中的氨基酸残基的修饰增加经改造的HA多肽的免疫宽度

本实例描述了通过引入氨基酸取代对HA的RBS区域或附近的经改造的HA多肽的修饰。氨基酸取代是位置特异性的，并且源自由循环流感A型流感病毒中HA的头区分析鉴定的残基。表6描述了涵盖残基60至291(基于CA/09编号)的特定位置中的残基库，从其中选择特定氨基酸取代用于HA的球状头部的靶向修饰。在特定位置中的较小残基库涵盖残基137至262(基于CA/09编号)，从其中选择特定氨基酸取代用于HA的球状头部的靶向修饰，如表7中所述。表8描述了对于RBS的10埃内的残基，用于靶向修饰HA的免疫学谱的残基库。这些残基在图9中通过阴影指示。

表6

表7

表8

表9中描述了作为原理证据测试的具有季节性免疫谱的经改造的HA多肽中的残基修饰。这些修饰包括将上述RBS区域修饰与糖基化谱修饰(例如，糖基化位点的消除)组合。这些修饰导致正确折叠且表面表达的重组HA多肽(图7)。再一次，观察到头区中的修饰诱导与抗茎部mAb的结合中的适度增加；证实在一个位置处的取代可以对远侧位置发挥远程别构效应。经再改造的重组HA被大流行和季节性特异性抗体两者识别(图8)。有趣的是，单独的RBS修饰改善了季节性免疫谱(图8， DO2a_m4-m5；“经修饰的CH65”)，但对大流行谱具有很少的作用。然而，将RBS 区域修饰与糖基化修饰相结合显著改善了季节性和大流行性免疫谱两者。(图8， DO2a_m7-m9；“Δ糖基+mCH65”)。该数据指示修饰改善了季节性免疫谱(“增加的 mAb结合”)，并且赋予更大流行性的免疫谱(“增加的宽度”)，从而使整体更平衡的免疫谱能够解决示例性经改造的HA多肽(例如，SMARt_DO2a)中的抗原漂移和抗原转变。

表9

实例4.经改造的HA多肽的体内功效

该实例示出了根据本文所述方法修饰的经改造的HA多肽引发以针对几种流感毒株的广泛抗体应答形式的免疫应答。

含有经改造的拼接血凝素(HA)的病毒样颗粒(VLP)的制备

通过HEK293T细胞在无血清Freestyle293培养基中的三质粒瞬时转染来制备流感VLP。编码经改造的HA多肽序列的质粒以及NA和HIVgag的质粒以1:1:1的比率混合，并且用于瞬时转染HEK293T细胞。转染后120小时收获培养上清液，并且通过在 20％蔗糖垫上的超速离心使上清液中的VLP形成团块，并重悬浮于PBS中。

用表达经改造的HA的VLP免疫小鼠

为了评价经改造的拼接HA设计的免疫原性，用5μg流感VLP或单独的媒介物 (PBS)免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠组。将所有免疫配制为具有水包油佐剂的乳液，并且以100μl的总体积皮下递送。在初次免疫后21天，每组接受相同的加强剂量。分别在第0和35天时，从每只动物收集免疫前和免疫后血清。用于分析的血清库通过混合来自组内的每只动物的等体积血清来制备。

血细胞凝集抑制(HAI)测定

将来自每组的合并血清的重复连续稀释物与4个血细胞凝集单元的所示病毒混合，并且在圆底板中在室温下温育30分钟。然后将每种血清/病毒混合物与等体积的 0.5％火鸡红细胞在盐水中混合。当缺乏血清的对照孔证实完全血细胞凝集(～30分钟)时，对板进行评分。HAI滴度定义为导致在50％的测试孔中血细胞凝集的完全抑制的最大血清稀释度。

微量中和(MN)测定

将来自每组的合并血清的重复连续稀释物与100个50％组织培养感染剂量(TCID50)的病毒混合，并且在37℃下温育一小时。然后将每种血清/病毒混合物加入 madindarby犬肾(MDCK)细胞的汇合单层中，并且在37℃下温育24小时。然后固定单层，并且基于流感核蛋白的ELISA检测鉴定受感染的孔。MN滴度定义为导致50％的测试孔中病毒感染的完全中和的最高血清稀释度。

免疫原性测定

使用经修饰的重组HA多肽进行HAI测定，其中RBS区域嫁接到受体茎区上、去除或改造推定的N联糖基化位点的修饰、和/或对RBS区域中的残基的靶向修饰。这些经修饰的重组HA多肽引发更广泛的免疫应答。

实例5.示例性经修饰的重组HA多肽

该实例示出了使用本文所述的各种方法生成的经修饰的重组HA多肽的例子。

DO2aRBStrunc00_resG63_G278_graftedontDo1a(SEQ ID NO:7)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG KLCKLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFAD YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSDTP VHDCNTTCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMATGLRNIPSIQSRGL FGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDGITNKVNSVIEK MNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNR EKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc00_resG63_G277_graftedontoCal2009(SEQ ID NO:8)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNG KLCKLRGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFAD YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGAGSGIIISDTP VHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFG AIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNV KNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNRE EIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc00_resG63_G277_graftedontoSC1918(SEQ ID NO:9)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG KLCKLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFAD YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGSGSGIITSDAP VHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVR NLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc00_resG63_G277_graftedontoNJ1976(SEQ ID NO:10)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDRHNG KLCKLGGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFAD YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGSGSGIIISDAP VHDCNTKCQTPKGAINTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQRSTQNAIDGITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNV KNLYEKVRSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCDDTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNRE EIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoDo1a(SEQ ID NO:11)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG KLCKLKGIAPLQLGKCSVAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSPDNGTCYPGYFAD YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSDTP VHDCNTTCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMATGLRNIPSIQSRGL FGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDGITNKVNSVIEK MNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNR EKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoCal2009(SEQ ID NO:12)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNG KLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFID YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGAGSGIIISDTP VHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFG AIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNV KNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNRE EIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoSC1918(SEQ ID NO:13)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG KLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFID YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGSGSGIITSDAP VHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVR NLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc01_resV125_G277_graftedontoNJ1976(SEQ ID NO:14)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDRHNG KLCKLGGIAPLHLGKCNIAGWLLGNPECELLLTVSSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFIN YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGSGSGIIISDAP VHDCNTKCQTPKGAINTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQRSTQNAIDGITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNV KNLYEKVRSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCDDTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNRE EIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoDo1a(SEQ ID NO:15)

DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoCal2009(SEQ ID NO:16)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNG KLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFID YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFAMERNAGSGIIISDTP VHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFG AIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNV KNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNRE EIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoSc1918(SEQ ID NO:17)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG KLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFID YEELREQLSSVSSFEKFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALNRGSGSGIITSDAP VHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVR NLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

DO2aRBStrunc02_resP135_P269_graftedontoNj1976(SEQ ID NO:18)

MKAKLLVLLCTFTATYADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDRHNG KLCKLGGIAPLHLGKCNIAGWLLGNPECELLLTVSSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFIN YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFAMNRGSGSGIIISDAP VHDCNTKCQTPKGAINTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLF GAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQRSTQNAIDGITNKVNSVIEKM NTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNV KNLYEKVRSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCDDTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNRE EIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_NGlyMod(SEQ ID NO:19)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHDSN- GVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPKLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_NGlyMod+环插入(CA09)(SEQ ID NO:20)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADY EELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHDSNKGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPKLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAP MDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGL FGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEK MNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNR EKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMART_NC_DO2A_NGLYMOD+环插入(SC18)(SEQ ID NO:21)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADY EELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHETTKGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNG LYPKLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTP EIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAP MDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGL FGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEK MNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNR EKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope1(SEQ ID NO:22)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHTVT- GVSASCPHAGAKSFYRNLLWLTGKNGLYPNLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYQNADAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope2(SEQ ID NO:23)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVT- GVSASCPHAGAKSFYRNLLWLTGKNGLYPNLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outside_ch65_eptiope3(SEQ ID NO:24)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVT- GVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYQNADAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outside_ch65_eptiope1-noGly(SEQ ID NO:25)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHNTT- GVSASCPHAGAKSFYRNLLWLTGKNGLYPKLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYQNADAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope2-noGly(SEQ ID NO:26)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTT- GVSASCPHAGAKSFYRNLLWLTGKNGLYPKLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SMARt_NC_DO2a_mods_outstide_ch65_eptiope3-noGly(SEQ ID NO:27)

MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNILEDSHNGK LCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTT- GVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPKLS KSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYQNADAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRP KVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDKCD AKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPFIQSRGLFGAIA GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ FTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKID GVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

本专利申请还涵盖了经修饰的重组HA多肽，其具有与本文所述的任何一个序列至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

实例6.重组HA多肽的修饰以增加大流行特点

选择进一步的设计以测试DO2a脱糖基化/RBS修饰对Ab应答的宽度和对大流行 A/California/09攻击的保护的作用。SMARtDO2a RBS的再改造通过广泛中和抗体改善了识别，如通过在MFI测定中获得4K8与脱糖基化构建体的结合所证实的(图 10)。最初的SMARtDO2a设计是基于体内评估的季节性偏向的；我们修改了设计以将宽度扩展到大流行毒株。使用mAb实验对象组的体外测定指示大流行mAb与一些经修饰的设计的结合。在针对A/California/07/2009的小鼠攻击模型中评估了一部分设计。结果证实修饰的确改善针对大流行性A型流感的免疫谱。

用表达经再改造的HA的VLP免疫小鼠

为了评价经再改造的拼接HA设计的免疫原性，用3μg流感VLP或单独的媒介物(PBS)免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠组。将所有免疫配制为具有水包油佐剂的乳液，并且以100μl的总体积肌内递送，如表10中所示。在初次免疫后21天和42天，每组接受两个相同的加强剂量。在第0天时从每只动物收集免疫前血清。在第42、56 和69天时从每只动物收集免疫后血清。图11证实用于免疫的时间线和随后的体内评估。用于分析的血清库通过混合来自组内的每只动物的等体积血清来制备。

表10

用表达VLP的经再改造的HA免疫的小鼠的存活和体重

在第70天时用十倍大流行A/California/2009的LD₅₀攻击动物，并且在攻击后监测死亡率。用原始SMARtDO2a的免疫保护不受A/California/09攻击，其中与到攻击后第6天导致100％死亡率的单独用媒介物免疫的动物相比，80％的动物在攻击后存活 14天。与原始SMARtDO2a相比，下一代DO2a修饰改善了存活率，其中用 SMARtDO2a_m8的免疫有效保护100％的测试动物(图12)。

监测动物在病毒攻击后体重减轻的百分比。与原始SMARtDO2a相比，下一代 DO2a修饰改善了体重维持。SMARtDO2a_m8提供了针对病毒攻击诱导的体重减轻的最佳保护(图13)。

用表达经再改造的HA的VLP免疫的小鼠的病毒肺滴度

在攻击后第4天时进一步监测小鼠的病毒肺滴度。与PBS相比，用SMARtDO2a 构建体的免疫导致较低的病毒肺滴度。与PBS相比，SMARtDO2a_m8构建体导致肺滴度的10倍减少，以及显著低于所有其它DO2a构建体的病毒肺滴度(图14)

血细胞凝集抑制(HAI)测定

将来自每组的合并血清的重复连续稀释物与4个血细胞凝集单元的所示病毒混合，并且在圆底板中在室温下温育30分钟。然后将每种血清/病毒混合物与等体积的 0.5％火鸡红细胞在盐水中混合。当缺乏血清的对照孔证实完全血细胞凝集(～30分钟)时，对板进行评分。HAI滴度定义为导致在50％的测试孔中血细胞凝集的完全抑制的最大血清稀释度。SMARtDO2a_m8小鼠中的A/California/09HAI应答与PBS显著不同(P<0.001)，然而仅6/24只小鼠具有等于或高于1:40的HAI滴度(图15)。关于所有其它DO2a构建体的保护机制尚不清楚。

所有下一代修饰的DO2a构建体都能够在A/California/09攻击后部分地保护不受死亡。SMARtDO2a_m8显示死亡率、体重减轻和病毒肺滴度中的最佳减少。 SMARtDO2a_m8也是引发针对A/Cal/09毒株的HAI应答的唯一DO2a构建体，提示改善的保护可能与头部应答有关。如本文所证实的，下一代DO2a修饰成功地增加了不受大流行性A型流感攻击的保护。

等价方案

在权利要求中使用顺序术语例如“第一”、“第二”、“第三”等以修饰权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素超过另一个的任何优先权、优先或次序，或者其中执行方法动作的时间次序，而是仅用作标签来区分具有某个名称的一个权利要求元素与具有相同名称的另一个元素(但为了使用顺序术语)，以区分权利要求元素。

除非明确指出相反，否则如本文说明书和权利要求书中使用的冠词“一个”和“一种”应理解为包括复数指示物。如果组成员中的一个、多于一个或全部存在于给定产物或过程中、用于给定产物或过程中、或者以其它方式与给定产物或过程相关，则包括组中一个或多个成员之间的“或”的声明或描述视为满足的，除非另有相反说明或从上下文中显而易见。本发明包括这样的实施例，其中该组的恰好一个成员存在于给定产物或过程中、用于给定产物或过程中、或者以其它方式与给定产物或过程相关。本发明还包括这样的实施例，其中多于一个或整体组成员存在于给定产物或过程中、用于给定产物或过程中、或者以其它方式与给定产物或过程相关。此外，应理解本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中来自所列权利要求中的一个或多个的一个或多个限制、元素、条款、描述性术语等被引入另一个权利要求，取决于相同的基本权利要求 (或如相关的、任何其它权利要求)，除非另有说明或除非对于本领域普通技术人员显而易见的是将出现矛盾或不一致。当元素呈现为列表时(例如，以马库什组或类似格式)，应理解还公开了元素的每个子组，并且可从组中去除任何元素。应当理解，一般而言，当本发明或本发明的方面被称为包括特定元件、特征等时，本发明的某些实施例或本发明的方面由此类元素等组成或基本上由此类元素等组成。为了简单起见，这些实施例在本文中并非在每一种情况下都以如此多的词语具体阐述。还应当理解，无论是否在说明书中叙述了特定排除，本发明的任何实施例或方面都可明确地从权利要求中排除。描述本发明的背景并提供关于其实践的另外细节的本文引用的出版物、网站和其它参考材料在此以引用的方式并入。