CN104144941B - 以计算方式优化的人和禽h5n1流感的广泛反应性抗原 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于引起针对H5N1流感病毒分离株的广泛反应性免疫应答的优化的H5N1流感HA多肽的产生。基于人和禽H5N1分离株,通过一系列的HA蛋白比对和随后的共有序列产生,开发了优化的HA多肽。本文提供了优化的H5N1流感HA多肽以及包含所述HA多肽的组合物、融合蛋白和VLP。本文还提供了编码所述HA多肽的密码子优化的核酸序列。本公开内容还提供了在受试者中引起针对流感病毒的免疫应答的方法。

Description

以计算方式优化的人和禽H5N1流感的广泛反应性抗原

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2012年2月13日提交的美国临时申请No. 61 /597,998的优先权,所述 临时申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

[0003] 本公开内容涉及可引起针对人和禽H5N1流感病毒的广泛反应性的免疫应答的优 化的流感血凝素蛋白及其作为疫苗的用途。

背景技术

[0004] 流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的成员。有三个亚型的流感病 毒,命名为A型流感、B型流感和C型流感。所述流感病毒粒体含有分段的负义(negative sense) RNA基因组,所述基因组编码以下蛋白:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(Ml)、质 子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白I (PBl)、聚合酶碱性蛋白2 (PB2)、聚合 酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2(NS2)。说、财、11和12为膜相关蛋白,而即、?81、?82、?八和 NS2为核衣壳相关蛋白。Ml蛋白是流感颗粒中最丰富的蛋白质。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白, 负责病毒吸附和病毒颗粒侵入细胞,并且是用于病毒中和及保护性免疫的主要免疫显性表 位的来源。HA和NA蛋白都被认为是预防性流感疫苗的最重要组分。

[0005] 每年,季节性流感仅在美国就导致超过300,000例入院和36,000例死亡(Simonsen et aL· ,Lancet Infect Dis 7:658-66,2007)。2009年新型HlNl流感病毒的出现证明了新 的流感大流行可如何快速地横扫全球。

[0006] 目前在美国有两种获得批准的流感疫苗方法一一灭活的裂解疫苗和减毒活病毒 疫苗。灭活疫苗可有效地诱导体液免疫应答,但通常只有弱的细胞免疫应答。活病毒疫苗不 能给予免疫妥协的或怀孕的患者,因为这些患者具有增加的感染风险。因此,存在对广泛保 护性的流感病毒疫苗的需求。

发明内容

[0007] 本文公开了用于引起针对H5N1流感病毒的广泛反应性免疫应答的以计算方式优 化的H5N1HA多肽的产生。基于1989个人和禽H5N1流感分离株,通过一系列的HA蛋白比对和 随后的共有序列产生,开发了所述优化的HA多肽。

[0008] 本文提供了用于引起针对H5N1流感的广泛反应性免疫应答的具有优化的氨基酸 序列的重组流感HA多肽。在一些实施方案中,所述HA多肽包含与SEQ ID NO: 1至少99.8%相 同或与SEQ ID N0:3至少99.6%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述多肽的氨基酸 序列包含:与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3相比不多于2个或不多于1个置换。在一些实施方 案中,所述流感HA多肽没有N-末端的甲硫氨酸残基。

[0009] 本公开内容还提供了编码所述重组HA多肽的分离的核酸分子和载体。在一些实施 方案中,编码所述重组HA多肽的核酸分子和载体包含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的核苷酸 序列。还提供了包含所述载体的分离的细胞。

[0010] 还提供了包含本文公开的优化的HA多肽的流感病毒样颗粒(VLP)和融合蛋白。

[0011] 还提供了包括在可药用载体中的本文公开的优化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP 的组合物。本公开内容还提供了通过给予所公开的组合物、融合蛋白或VLP在受试者中引起 针对流感病毒的免疫应答的方法。

[0012] 还提供了通过给予受试者包含含有优化的HA多肽的VLP的组合物而使所述受试者 对流感病毒免疫的方法。

[0013] 根据以下参照附图进行的详细描述,本发明的上述和其他目的、特征和优点会变 得更加清楚。

附图说明

[0014] 图1的示意图概述了使用1989个人和禽H5N1流感病毒分离株来产生COBRA HA序列 的方法,在本文中称为“所有H5C0BRA” HA。

[0015] 图2的示意图概述了使用1213个人和禽H5N1进化枝2分离株来产生⑶BRA HA序列 的方法,在本文中称为“人-禽COBRA-2” HA。

[0016] 图3的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQIDN0:3)的VLP、含有人进化枝2流感病毒C0BRAHA序列(人⑶BRA-2) 的VLP或含有大天鹅(A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005)流感病毒HA的VLP接种小鼠后, 针对进化枝1、进化枝2和进化枝7攻击毒株的HAI滴度。在第0周时和第3周时在使用佐剂 (Imject™)的情况下进行疫苗接种(3yg)。

[0017] 图4的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用印度尼西亚进化枝2.1病毒(A/Indonesia/5/2005)攻击的动物的体重。在第0周时和第3 周时在使用佐剂(Imject™)的情况下进行疫苗接种(3yg);在第5周期间进行病毒攻击。

[0018] 图5的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒(A/Vietnam/1203/2004)攻击的动物的体重。在第0周时和第3周时在使 用佐剂(Imject™)的情况下进行疫苗接种(3yg);在第5周期间进行病毒攻击。

[0019] 图6的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人⑶BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLPs接种及随 后用大天鹅进化枝2.2病毒攻击的小鼠的肺中的病毒滴度(第3天)。在第0周时和第3周时在 使用佐剂(Imject™)的情况下进行疫苗接种(3yg);在第5周期间进行病毒攻击。

[0020] 图7的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南化枝1病毒攻击的小鼠的肺中的病毒滴度(第3天)。在第0周时和第3周时在使用佐剂 (Imject™)的情况下进行疫苗接种(3yg);在第5周期间进行病毒攻击。

[0021] 图8的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击的动物的体重。在第0周时在使用佐剂(Imject™)的情况下进行一 次疫苗接种(3yg),随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0022] 图9的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击的小鼠的肺中的病毒滴度。在第0周时在使用佐剂(Imject™)的情 况下进行一次疫苗接种(3yg),随后在第4周期间进行病毒攻击。D2 =第2天;D3 =第3天。

[0023] 图10的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击的动物的体重。在第0周时在不使用佐剂的情况下进行一次疫苗接 种(3yg),随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0024] 图11的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击的动物的存活百分数。在第0周时在不使用佐剂的情况下进行一次 疫苗接种(3yg),随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0025] 图12的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击的动物的体重。在第0周时在使用佐剂(Imject™)的情况下进行一 次0.6yg剂量的疫苗接种,随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0026] 图13的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击的小鼠的肺中的病毒滴度(第2天)。在第0周时在使用佐剂 (Imject™)的情况下进行一次0.6yg剂量的疫苗接种,随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0027] 图14的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用越南进化枝1病毒攻击后的小鼠的肺中的病毒滴度(第3天)。在第0周时在使用佐剂 (Imject™)的情况下进行一次0.6yg剂量的疫苗接种,随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0028] 图15的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用大天鹅进化枝2.2病毒攻击的动物的体重。在第0周时在使用佐剂(Imject™)的情况下进 行一次〇. 6yg剂量的疫苗接种,随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0029] 图16的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用大天鹅进化枝2.2病毒攻击的小鼠的肺中的病毒滴度(第2天)。在第0周时在使用佐剂 (Imject™)的情况下进行一次0.6yg剂量的疫苗接种,随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0030] 图17的图示出了用含有所有H5⑶BRA HA序列(SEQ ID NO: 1)的VLP、含有人-禽 C0BRA-2HA序列(SEQ ID N0:3)的VLP、含有人C0BRA-2HA序列的VLP或大天鹅VLP接种及随后 用大天鹅进化枝2.2病毒攻击的小鼠的肺中的病毒滴度(第3天)。在第0周时在使用佐剂 (Imject™)的情况下进行一次0.6yg剂量的疫苗接种,随后在第4周期间进行病毒攻击。

[0031] 序列表

[0032] 列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列是使用在37C.F.R. 1.822中定义的核苷酸 碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每条核酸序列的一条链,但是应 理解任何提及所示链时均包括其互补链。所述序列表以创建于2013年2月1日的14.7KB的 ASCII文本文件提交,以引用的方式纳入本文。在所附序列表中:

[0033] SEQ ID NO: 1为人和禽H5N1流感病毒分离株的⑶BRA氨基酸序列,在本文中称为 “所有!150»1^”拟(111!150»1^”拟)。

[0034] SEQ ID N0:2为编码SEQ ID NO: 1的H5N1流感COBRA HA的密码子优化的核酸序列。

[0035] SEQ ID NO: 3为人和禽H5N1进化枝2流感分离株的⑶BRA氨基酸序列,在本文中称 为“人-禽 C〇BRA-2”HA。

[0036] SEQ ID NO:4为编码SEQ ID NO:2的H5N1流感COBRA HA的密码子优化的核酸序列。

具体实施方式

[0037] I.缩写

[0038] COBRA:以计算方式优化的广泛反应性抗原

[0039] HA:血凝素

[0040] HAI:血凝抑制

[0041] HRP:辣根过氧化物酶

[0042] Ml:基质蛋白1

[0043] NA:神经氨酸酶

[0044] PFU:空斑形成单位

[0045] VLP:病毒样颗粒

[0046] II.术语和方法

[0047] 除非另有说明,技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见 于Benjamin Lewin,genesV,published by Oxford University Press,1994 (ISBN 0_19_ 854287-9) ;Kendrew et al. (eds.) , The Encyclopedia of Molecular Biology , published by Blackwell Science Ltd·,1994(ISBN 0-632-02182-9);和RobertA.Meyers (ed.) ,Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference , published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

[0048] 为了便于阅读本公开内容的各个实施方案,提供了以下对具体术语的解释:

[0049] 佐剂:非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括其上吸附有抗 原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬液;或其中抗原溶液乳化在矿物油中的油包水乳 剂(例如,弗氏不完全佐剂),有时包括灭活的分枝杆菌(mycobacteria)(弗氏完全佐剂)以 进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如,参 见美国专利号 6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;6,339,068;6, 406,705;和6,429,199)。佐剂还包括生物分子,例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括儿- 2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-l、B7-2、0X-40L和41BBL。

[0050] 给药:如本文使用的,给予受试者组合物是指给予、施用所述组合物或使其与所述 受试者接触。给药可通过许多途径中的任一种来完成,例如,局部、口服、皮下、肌内、腹膜 内、静脉内、鞘内和真皮内给药。

[0051] 抗体:由B淋巴细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗体在人或其 他动物中由特定抗原(免疫原)诱发。抗体是通过以某些可证明的方式与抗原进行特异性反 应来表征,抗体和抗原各自以对方来定义。“引起抗体应答”是指抗原或其他分子诱导抗体 产生的能力。

[0052] 抗原:可在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质,包括注射 或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源性免疫原诱导 的那些)反应。在所公开的组合物和方法的一些实施方案中,所述抗原为流感HA蛋白。

[0053] 密码子优化的:“密码子优化的”核酸是指已经被改变使得密码子最适于在具体系 统(例如具体物种或物种群)中表达的核酸序列。例如,核酸序列可被优化用于在哺乳动物 细胞中表达。密码子优化不改变所编码的蛋白质的氨基酸序列。

[0054] 融合蛋白:通过表达从编码两种不同(异源)蛋白质的至少一部分的核酸序列改造 的核酸序列而产生的蛋白质。为了产生融合蛋白,所述核酸序列必须在相同的读码框内并 且不包含内部的终止密码子。例如,融合蛋白可包括融合至异源蛋白的流感HA。

[0055] 血凝素(HA):流感病毒表面糖蛋白。HA介导病毒颗粒结合到宿主细胞和随后的病 毒进入所述宿主细胞。本领域已知并可公开获得许多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列, 例如通过NCBr流感病毒资源数据库(Bao et al·,J Virol 82:596-601,2008)。骱(和NA— 起)是两个主要的流感病毒抗原决定簇之一。

[0056] 免疫应答:免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物 (例如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可包括参与宿主防卫反应的机体的任何细胞,包括例 如,分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。如本 文所使用的,保护性免疫应答是指保护受试者免受感染(预防感染或预防与感染相关的疾 病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法在本领域中已知,包括例如测量淋巴细胞(例 如B细胞或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等等。

[0057] 免疫原:在合适的条件下能够刺激产生免疫应答(例如在动物中产生抗体或T细胞 应答)的化合物、组合物或物质,包括注射或吸收到动物中的组合物。本文所使用的“免疫原 性组合物”是包含免疫原(例如HA多肽)的组合物。

[0058] 免疫:使受试者受到保护免患传染性疾病,例如通过疫苗接种。

[0059] 流感病毒:属于正粘病毒科家族的分段的负链RNA病毒。有A、B和C三种类型的流感 病毒。A型流感病毒感染多种鸟和哺乳动物,包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。在动 物中,大多数A型流感病毒引起温和的呼吸道和肠道的局部感染。然而,高致病性A型流感毒 株(例如H5N1)引起家禽的全身感染,其中死亡率可达到100%。2009年,HlNl流感是人流感 的最常见病因。2009年出现的起源于猪的HlNl的新毒株,并被世界卫生组织宣布为大范围 流行的。该毒株被称为“猪流感”。HlNlA型流感病毒还是1918年的西班牙流感大流行、1976 年的迪克斯堡(Fort Dix)大爆发和1977-1978年的俄罗斯流感大流行的病因。

[0060] 分离的:“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质或病毒)已经基本上从其他生物组 分(例如细胞碎片,或其他蛋白质或核酸)中分离或纯化。已经被“分离的”生物组分包括那 些通过常规纯化方法纯化的组分。该术语还包括重组核酸、蛋白质或病毒(或VLP),以及化 学方法合成的核酸或肽。

[0061] 接头:在融合蛋白的两个多肽之间充当间隔物的一个或多个氨基酸。

[0062] 基质(Ml)蛋白:存在于病毒包膜中的流感病毒结构蛋白。Ml被认为在装配和出芽 中起作用。

[0063] 神经氨酸酶(NA):—种流感病毒膜糖蛋白。NA是通过在被感染细胞表面上的碳水 化合物部分切割末端的唾液酸残基,参与破坏病毒HA的细胞受体。NA还从病毒蛋白上切割 唾液酸残基,防止病毒聚集。NA (和HA—起)为两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。

[0064] 可操作地连接:当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能的关系放置时,所述第 一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如,如果启动子影响编码序列的转录或表达, 则所述启动子可操作地连接于所述编码序列。可操作地连接的DNA序列通常是连续的,并且 当需要连接两个蛋白编码区域时则位于相同的读码框中。

[0065] 优化的流感HA蛋白:如本文所使用的,“优化的流感HA蛋白”是指通过对人和禽 H5N1流感病毒分离株进行序列比对而产生的HA蛋白共有序列(如下文实施例1和2所描述)。 通过密码子优化和RNA优化(例如以增加RNA稳定性)将编码优化的HA蛋白的核苷酸序列进 一步优化以用于在哺乳动物细胞中表达。本文公开(并且如本文本文SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3所示)的优化的流感HA蛋白也称作“COBRA”似计算方式优化的广泛反应性抗原)序列。 设计优化的HA多肽以用于在受试者中引起广泛反应性免疫应答。在本公开内容的上下文 中,“广泛反应性”意指所述蛋白序列在受试者中引起足以抑制、中和或预防众多流感病毒 (例如特定亚型中的大多数或全部流感病毒)的感染的免疫应答。在一些实例中,所述优化 的流感HA蛋白能够引起针对大多数或全部H5N1流感病毒分离株的免疫应答,例如保护性免 疫应答。

[0066] 爆发:如本文所使用的,流感病毒“爆发”是指在给定年份中来自单个国家的病毒 分离株的集合。

[0067] 可药用载体:可在本公开内容中使用的可药用载体(carrier或vehicle)是常规 的。Remington’ s Pharmaceutical Sciences , by E.ff.Martin,Mack Publishing Co., Easton,PA,第15版,(1975),记载了适于一种或多种治疗组合物(例如一种或多种流感疫 苗)以及其他的药剂的药物递送的组合物和制剂。

[0068] 通常,所述载体的性质会取决于采用的具体给药模式。例如,肠胃外制剂常常包含 可注射流体作为载体,所述可注射流体包括可药用和生理上可接受的流体例如水、生理盐 水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如,粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂 形式),常规的无毒固体载体可包括,例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学 中性的载体之外,待给予的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质,例如润湿剂或乳化剂、 防腐剂和PH缓冲剂等,例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

[0069] 多肽:其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当所述氨基酸 为α-氨基酸时,可使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质” 意图包括任何氨基酸序列和包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”特别意欲覆盖天然存 在的蛋白质,以及重组或合成方法产生的那些。术语“残基”或“氨基酸残基”包括提及整合 入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。

[0070] 保守性氨基酸置换是当进行氨基酸置换时对原始蛋白质的性质有最少干扰的那 些置换,即,所述蛋白的结构,特别是功能是保守的,且没有被这些置换显著改变。保守性置 换的实例如下文所示。

[0071]

Figure CN104144941BD00091

[0072] 保守性置换通常保持了(a)在置换区域中多肽骨架的结构,例如,为片层或螺旋构 象,(b)在革E位点处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链体积。

[0073] 通常预期在蛋白质性质上产生最大变化的置换会是不保守的,例如发生如下改变 (a)亲水残基例如丝氨酰基或苏氨酰基置换(或置换为)疏水残基例如亮氨酰基、异亮氨酰 基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基;(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或置换为)任何其他残 基;(c)具有带正电荷的侧链的残基例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基置换(或置换为)带 负电荷的残基例如谷氨酰基、天冬氨酰基;或(d)具有庞大侧链的残基例如苯丙氨酸置换 (或置换为)没有侧链的残基例如甘氨酸。

[0074] 预防、治疗或减轻疾病:“预防”疾病是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指当疾病 已经开始发生后减轻疾病或病理病症的征象或症状的治疗干预。“减轻”是指减少疾病征象 或症状的数量或严重程度。

[0075] 启动子:启动子是指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括在转录起始 位点附近的必需核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件。“组成型启动 子”是连续地有活性且不受外部信号或分子调节的启动子。相反,“诱导型启动子”的活性受 外部信号或分子(例如转录因子)调节。在本文的一些实施方案中,所述启动子为CMV启动 子。

[0076] 纯化的:术语“纯化的”不需要绝对的纯净;而是意欲作为相对的概念。因此,例如, 纯化的肽、蛋白质、病毒、VLP或其他活性化合物是全部或部分从天然相关的蛋白质和其他 污染物中分离的。在某些实施方案中,术语“基本上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或 其他粗制品中分离且经过分级分离以去除最初制品的各种组分(例如蛋白质、细胞碎片和 其他组分)的肽、蛋白质、病毒、VLP或其他活性化合物。

[0077] 重组体:重组体核酸、蛋白质、病毒或VLP是具有非天然存在的序列或具有通过人 工组合两个原本独立的序列片段而产生的序列。该人工组合常常是通过化学合成,或通过 人工操纵分离的核酸片段(例如通过基因工程技术)完成。

[0078] 序列同一性:氨基酸或核酸序列之间的相似性被表示为所述序列之间的相似性, 或者称作序列同一性。序列同一性常以同一性(或相似性或同源性)百分数来度量;所述百 分数越高,两个序列越相似。当使用常规方法进行比对时,给定基因或蛋白质的同系物或变 体具有相对高的序列同一性程度。

[0079] 比对用于比较的序列的方法在本领域中是熟知的。多种程序和比对算法记载于: Smith and Waterman ,Adv.Appi.Math.2:482,1981;Needleman and ffunsch, J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444, 1988;Higgins和Sharp,Gene73:237-244,1988;Higgins and Sharp,CABI0S5:151-153, 1989;Corpet et al. ,Nucleic Acids Researchl6:10881-10890,1988以及Pearson and LipmanjProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988〇Altschul et al.,Nature Genet.6: 119-129,1994。

[0080] NCBI基础局部比对搜索工具(BLAST™) (Altschul et al. ,J.Mol .Biol .215:403-410,1990)可以从若干来源获得,包括美国国立生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和 互联网,用于与序列分析程序131&8丨口、131381:11、13138丨1、1:131381:11和1:13138丨1联合使用。

[0081] 受试者:活的多细胞脊椎生物一一包括人和非人哺乳动物(例如非人灵长类)的种 类。

[0082] 治疗有效量:足以在用该试剂治疗的受试者中达到所需效果的那种试剂的量。例 如,这可以是用于在受试者中引起免疫应答和/或用于预防由流感病毒引起的感染或疾病 的流感病毒疫苗的量。理想地,在本公开内容的上下文中,流感疫苗的治疗有效量是足以在 受试者中增加对流感病毒引起的感染的抵抗力、预防、减轻和/或治疗所述感染,而不会在 所述受试者中产生明显的细胞毒性效应的量。用于在受试者中增加对感染的抵抗力、预防、 减轻和/或治疗感染的流感疫苗的有效量会取决于,例如,被治疗的受试者、治疗组合物的 给药方式及其他因素。

[0083] 转化的:转化的细胞是已经通过分子生物学技术将核酸分子导入其中的细胞。如 本文所使用的,术语转化包括可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术,包括用病毒载体 转染、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂转染和基因枪加速导入裸露的DNA。

[0084] 疫苗:能够刺激免疫应答的免疫原性材料制品,其被给予用于预防、减轻或治疗疾 病,例如传染性疾病。所述免疫原性材料可包括,例如,弱化或灭活的微生物(例如弱化的病 毒),或来自它们的抗原性蛋白质(包括VLP)、肽或DNA。疫苗可引起预防性的(prophylactic 或preventative)和治疗性的应答。给药方法根据所述疫苗有所不同,但可包括接种、食入、 吸入或其他给药形式。接种可通过许多途径(包括非肠胃外途径)中的任一种递送,例如静 脉、皮下或肌内。疫苗可与佐剂一起给药以加强免疫应答。

[0085] 载体:载体是允许插入外源核酸而不会破坏所述载体在宿主细胞内的复制和/或 整合的能力的核酸分子。载体可包含这样的核酸序列,即所述核酸序列使其能够在宿主细 胞内复制,例如复制起点。插入型载体能够将自身插入宿主核酸中。载体还可包括一种或多 种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是含有必需调控序列以允许转录和翻译插入 的一个或多个基因的载体。在本公开内容的一些实施方案中,所述载体编码流感HA、NA或Ml 蛋白。在一些实施方案中,所述载体是PTR600表达载体(美国专利申请公开No. 2002/ 0106798;Ross et al.,Nat Immunol. I (2):102-103,2000;Green et al.,Vaccine20:242-248,2001)〇

[0086] 病毒样颗粒(VLP):由一个或多个病毒结构蛋白组成,但没有病毒基因组的病毒颗 粒。由于VLP没有病毒基因组,他们是非传染性的。此外,VLP经常可通过异源表达产生且可 容易地被纯化。大多数VLP至少包括驱动颗粒从宿主细胞出芽和释放的病毒核心蛋白。这类 核心蛋白的一个实例是流感Ml。在本文的一些实施方案中,流感VLP包含HA、NA和/或Ml蛋 白。流感VLP可通过使用编码HA和NA蛋白和任选的Ml蛋白的质粒转染宿主细胞来产生。将所 述转染的细胞孵育适当的一段时间以使得蛋白表达(例如约72小时)后,可从细胞培养物上 清液中分离VLP。实施例3提供了从细胞上清液中纯化流感VLP的示例性方案。在这个实施例 中,通过低速离心(以去除细胞碎片)、真空过滤以及通过20%甘油的超速离心来分离VLP。 其他产生流感VLP的方法在本领域中已知(见,例如,美国专利申请公开号2006/0263804; 2008/0031895;2010/0166769;和2010/0239610)。

[0087] 除非另有说明,本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开内容所属领 域的普通技术人员通常所理解的含义相同。除非上下文中另有明确说明,单数术语“一”、 “一个”和“所述”包括复数指代对象。类似地,除非上下文中另有明确说明,词语“或”意欲包 括“和”。因此,“包含A或B”意指包括A,或B,或者A和B。还应该理解,对于核酸或多肽给出的 全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值,并且用于表述目的。 虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实施或测 试,但适合的方法和材料在下文描述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考 文献以引用的方式全文纳入本文。如果出现冲突,以本说明书(包括对术语的解释)为准。另 夕卜,材料、方法和实施例仅是示例性的,不意欲进行限制。

[0088] III.若干实施方案概述

[0089] 本文公开了用于引起针对H5N1流感病毒的广泛反应性免疫应答的以计算方式优 化的H5N1HA多肽的产生。基于1989个人和禽H5N1流感分离株,通过一系列的HA蛋白比对和 随后的共有序列产生,开发了所述优化的HA多肽。用于产生优化的HA共有序列的方法记载 于实施例1和2中并示出于图1和2中。2种具体的HA多肽的氨基酸序列在本文中示出为SEQ ID N0:1(所有H5C0BRA)和SEQ ID N0:3(人-禽C0BRA-2)。本文还公开了编码所述优化的HA 多肽的密码子优化的核酸序列。两个示例性的密码子优化的HA核酸序列在本文中示出为 SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。

[0090] 本文提供了用于引起针对H5N1流感的广泛反应性免疫应答的具有优化的氨基酸 序列的重组流感HA多肽。在一些实施方案中,所述HA多肽包含与SEQ ID NO: 1的2-566位残 基至少99.8%相同或与SEQ ID N0:3的2-567位残基至少99.6%相同的氨基酸序列。在具体 的实例中,所述HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1的2-566位残基或SEQ ID NO: 3的2-567位残基的氨基酸序列或由其组成。

[0091] 在其他实施方案中,所述重组HA多肽包含与SEQ ID NO: 1至少99.8%相同或与SEQ ID NO: 3至少99.6%相同的氨基酸序列。在一些实例中,所述HA多肽的氨基酸序列的同一性 高于上文所述的百分比同一性。在其他实例中,所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的氨基酸序列或由其组成。在具体的实例中,所述HA多肽没有N-末端的甲硫氨酸残基。

[0092] 在一些实施方案中,所述HA多肽的氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO: 1不多于1个 氨基酸置换。在其他实施方案中,所述HA多肽的氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO: 3不多于 2个或不多于1个氨基酸置换。在一些实例中,所述氨基酸置换是保守性置换。在其他实例 中,相对于所鉴定的序列的置换数量少于以上鉴定的置换数量。

[0093] 还提供了编码本文公开的重组流感HA多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案 中,对所述核酸分子进行密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。还任选地将所述核酸 分子进一步优化以用于RNA稳定性。

[0094] 在一些实施方案中,编码所述HA多肽的核酸分子的序列与SEQ ID N0:2的4-1698 位核苷酸或与SEQ ID N0:4的4-1701位核苷酸至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或 至少99%相同。在具体的实例中,编码所述HA多肽的核酸分子的序列包含SEQ ID N0:2的4-1698位核苷酸或SEQ ID N0:4的4-1701位核苷酸或由其组成。

[0095] 在其他的实施方案中,编码所述HA多肽的核酸分子的序列与SEQ ID N0:2的1-1698位核苷酸或与SEQ ID NO:4的1-1701位核苷酸至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或至少99%相同。在具体的实例中,编码所述HA多肽的核酸分子的序列包括SEQ ID N0:2的1-1698位核苷酸或SEQ ID N0:4的1-1701位核苷酸或由其组成。

[0096] 在其他实施方案中,编码所述HA多肽的核酸分子的序列与SEQ ID N0:2或与SEQ ID NO:4至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。在具体的实例中,所述 核酸分子的序列包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或由其组成。

[0097] 本公开内容还提供了包含编码重组HA多肽的核酸分子的载体。所述载体可以是任 何适用于表达所述H A多肽的载体,例如哺乳动物表达载体。在具体实例中,所述载体为 PTR600表达载体(美国专利申请公开No. 2002/0106798,以引用的方式纳入本文;Ross et al.,Nat Immunol. I (2):102-103,2000;Green et al.,Vaccine 20:242-248,2001)〇

[0098] 在一些实例中,所述载体包括可操作地连接至编码所述HA多肽的核酸序列的启动 子。在具体实例中,所述启动子为CMV启动子。

[0099] 还提供了包含所公开的载体的分离的细胞。在某些情况下,所述细胞为任何适用 于产生和表达VLP的细胞类型,例如哺乳动物细胞。

[0100] 还提供了包含本文公开的优化的HA多肽的流感VLP。所述流感VLP还可包括形成所 述病毒颗粒所必需的任何其他流感蛋白。在一些实施方案中,所述流感VLP还包括流感神经 氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(Ml)蛋白或其两者。

[0101] 还提供了包含本文公开的流感HA多肽的流感VLP,所述流感VLP是通过在足以允许 所述HA、Ml和NA蛋白表达的条件下用编码所述HA多肽的载体、编码流感NA蛋白的载体和编 码流感Ml蛋白的载体转染宿主细胞而产生。

[0102] 本公开内容还提供了包含优化的流感HA多肽的融合蛋白。

[0103] 本文还提供了这样的组合物,即其包含本文公开的优化的流感HA蛋白、或包含所 述优化的流感HA蛋白的融合蛋白或VLP。在一些实施方案中,所述组合物还包含可药用载体 和/或佐剂。例如,所述佐剂可为明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(例 如CpG寡核苷酸)。

[0104] 还提供了一种通过给予如本文所公开的优化的流感HA蛋白、含有优化的流感HA的 融合蛋白、含有优化的流感HA的VLP、或其组合物,在受体中引起针对流感病毒的免疫应答 的方法。在一些实施方案中,所述流感病毒为H5N1流感病毒。在一些实施方案中,可使用任 何适合的给药途径(例如,肌内、鼻内或口服)给予所述HA蛋白、HA融合蛋白或VLP。在一些实 施方案中,所述HA蛋白、融合蛋白或VLP作为还包含可药用载体和/或佐剂的组合物被给予。 例如,所述佐剂可为明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷 酸)。

[0105] 还提供了通过给予受试者含有本文公开的优化的流感HA蛋白的VLP或给予其组合 物,而使所述受试者对流感病毒免疫的方法。在所述方法的一些实施方案中,所述组合物还 包含可药用载体和/或佐剂。例如,所述佐剂可为明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激 性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。在一些实施方案中,所述VLP (或其组合物)通过肌内给予。

[0106] 在引起免疫应答或免疫受试者的方法的一些实施方案中,给予所述受试者约1-约 25yg的含有优化的HA蛋白的VLP。在具体实例中,给予所述受试者约5-约20yg的所述VLP,或 约10-约15yg的所述VLP。在一个具体的非限制性的实例中,给予所述受试者约15yg的所述 VLP。然而,本领域技术人员能够确定待给予受试者的VLP的治疗有效量(例如提供针对H5N1 流感病毒感染的保护作用的量)。

[0107] IV.流感

[0108] 流感病毒是属于正粘病毒科家族的分段的负链RNA病毒。有A、B和C三种类型的流 感病毒。A型流感病毒感染多种鸟类和哺乳动物,包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。 在动物中,大多数A型流感病毒引起温和的呼吸道和肠道的局部感染。然而,高致病性A型流 感毒株(例如H5N1)引起家禽的全身感染,其中死亡率可达到100%。感染A型流感的动物常 充当流感病毒的库(reservoir),并且某些亚型已经被证明可跨越物种屏障而感染人。

[0109] 基于编码表面糖蛋白(即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),其是病毒吸附和细胞释 放所必需的)的两个基因的抗原性区域中的等位基因变异,可将A型流感病毒分为多个亚 型。目前,已知A型流感病毒的16个HA亚型(H1-H16)和9个NA (N1-N9)抗原性变体。以前,已知 只有3个亚型在人中传播(HlNl、H1N2和H3N2)。然而,近些年,如在1997年和2003年香港所记 录的,已经报道A型禽流感的致病性H5N1亚型跨越物种屏障并感染人,导致一些患者的死 亡。

[0110] 2009年,HlNl流感是人流感的最普遍病因。猪来源的HlNl的新毒株在2009年出现, 并被世界卫生组织宣布为大范围流行。该毒株称作“猪流感”。HlNlA型流感病毒也是1918年 的西班牙流感大流行、1976年的迪克斯堡爆发和1977-1978年的俄罗斯流感大流行的病因。

[0111] 所述流感病毒分段基因组含有8个负义RNA(nsRNA)基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、 NS、HA和NA),所述8个负义RNA基因片段编码至少10个多肽,包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白 (PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA1和HA2亚基)、基质蛋白(Ml和M2) 和非结构蛋白(NS1 和NS2) (Krug et al.,In“The Influenza Viruses,”R.M.Krug,ed·, Plenum Press,N.Y.,1989,ρρ·89152) 〇

[0112] 流感病毒引起广泛传播的疾病的能力是由于其通过产生抗原改变而逃避免疫系 统的能力,该过程被认为发生在宿主同时感染动物流感病毒和人流感病毒时。在宿主中的 突变和重排过程中,所述病毒可将来源于另一病毒的HA和/或NA表面蛋白基因整合到其基 因组中,从而产生新的流感亚型并逃避免疫系统。

[0113] HA是病毒表面糖蛋白,一般包括约560个氨基酸并占总病毒蛋白的25%。它负责在 感染早期病毒颗粒吸附及侵入宿主细胞。病毒HAO前体切割为HAl和HA2亚片段是所述病毒 感染细胞的必需步骤。因此,需要切割以将宿主细胞内的新病毒颗粒转化成能够感染新细 胞的病毒粒子。已知切割发生在完整的HAO膜蛋白从受感染细胞的内质网转运至质膜的过 程中。在转运过程中,血凝素经历一系列的共翻译和翻译后修饰,包括前体HA被蛋白水解切 割为氨基末端片段HAl和羧基末端HA2。在原代组织培养物或已建立的细胞系中培养流感病 毒株的主要困难之一,源于需要在所述宿主细胞对流感血凝素内进行蛋白水解切割活化。

[0114] 虽然已知未切割的HA可介导病毒吸附于细胞表面上其含有神经氨酸的受体,但其 不能够进行感染周期的下一个步骤,即融合。已经报道,需要通过切割暴露HA2的疏水氨基 末端,以使其可被插入至靶细胞,从而形成病毒和靶细胞膜之间的桥接。这个过程之后,所 述两种膜的融合以及病毒进入靶细胞中。

[0115] HA的蛋白水解活化包括由胰蛋白酶样内切蛋白酶在精氨酸残基处进行切割,所述 胰蛋白酶样内切蛋白酶常为钙依赖的且具有中性PH最适条件的细胞内酶。由于所述活化的 蛋白酶为细胞酶,被感染细胞的类型决定HA是否被切割。哺乳动物流感病毒和非致病性禽 流感病毒的HA仅在有限数量的细胞类型中对蛋白水解性切割敏感。另一方面,在H5和H7亚 型中的致病性禽病毒的HA被存在于很多不同宿主细胞中的蛋白酶切割。因此,由于与病毒 的致病性质相关的血凝素切割能力不同,导致了宿主范围的不同。

[0116] 神经氨酸酶(NA)是流感病毒的第二膜糖蛋白。已经证明,病毒NA的存在对于产生 针对传染性病毒的多面性的保护性免疫应答是重要的。对于大多数A型流感病毒,NA的长度 为413个氨基酸,且由具有1413个核苷酸的基因编码。在流感病毒中已经鉴定了 9个不同的 NA亚型(、呢川3、财、阳、呢、阶、_和册),所有这些嫩亚型已经在野生鸟类中发现。祖通过 从受感染细胞表面的碳水化合物部分切割末端神经氨酸(也称唾液酸)残基,参与破坏病毒 HA的细胞受体。NA还从病毒蛋白上切割唾液酸残基,防止病毒的聚集。利用这种机制,假定 NA通过如下方式促进病毒子代的释放:阻止新形成的病毒颗粒沿着细胞膜聚积,以及通过 促进所述病毒通过存在于粘膜表面上的粘液的转运。NA是发生抗原变异的重要抗原决定 簇。

[0117] 除了所述表面蛋白HA和NA之外,流感病毒包括6种其他的内部基因,其产生8种不 同蛋白质,包括聚合酶基因PB1、PB2和PA,基质蛋白Ml和M2,核蛋白(NP)及非结构蛋白NSl和 NS2 (Horimoto et al.,Clin Microbiol Rev.14 (I):129-149,2001)〇

[0118] 为了组装成子代病毒颗粒,病毒RNA作为由三种流感病毒聚合酶蛋白、核蛋白(NP) 和病毒RNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体,与流感病毒基质I (Ml)蛋白和核输出蛋白相结 合,被从核中转运(Marsh et al. J Virol,82:2295-2304,2008)。位于包膜内的Ml蛋白被 认为在装配和出芽方面发挥作用。有限数量的M2蛋白被整合入病毒粒子中(Zebedee, J. Virol. 62: 2762-2772,1988)。它们形成具有H+离子通道活性的四聚体,且当被核内体中 的低pH激活时,它们将酸化病毒粒子的内部,促进其脱壳(Pinto et al. ,Cell 69:517-528,1992)。金刚烷胺是一种抗流感药,其通过干扰M2离子通道活性从而抑制病毒脱壳,来 预防病毒感染。

[0119] NSl--—种非结构蛋白一具有多重功能,包括调控细胞mRNA的剪接和出核转运以 及刺激翻译。NSl的主要功能似乎是抵消宿主的干扰素活性,因为在干扰素无缺陷的细胞 中,NSl敲除的病毒虽然有活力,但其生长效率比亲本病毒低(Garcia-Sastre ,Virology 252:324-330,1998)。

[0120] 已经在病毒颗粒中检测到NS2 (Richardson et al ·,Arch · Virol · 116 : 69-80, 1991;Yasuda et al. ,Virology 196:249-255,1993)。估计病毒颗粒中的NS2蛋白的平均数 量为130-200个分子。体外结合测定法证明在Ml和NS2之间有直接的蛋白-蛋白接触。还已经 通过在病毒感染的细胞的溶胞产物中的免疫沉淀检测到NS2-M1复合体。NS2蛋白被认为通 过与Ml蛋白的相互作用,在RNP从核的输出中起作用(Ward et al. ,Arch.Virol.140:2067-2073,1995)。

[0121] V.流感VLP及其给药

[0122] 本文提供了包含优化的HA (例如具有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的氨基酸 序列的HA)的流感VLP。所述流感VLP—般由HA、NA和Ml蛋白组成。流感VLP的产生已经在本领 域中描述,且在本领域普通技术人员的能力范围内。例如,可以通过使用编码所述HA、NA和 Ml蛋白的质粒转染宿主细胞来产生流感VLP。将所述转染的细胞孵育适当的时间(例如约72 小时)以使蛋白表达后,可从细胞培养物上清液中分离VLP。下文的实施例3提供了从细胞上 清液中纯化流感VLP的示例性方案。在该实施例中,通过低速离心(以去除细胞碎片)、真空 过滤和通过20 %甘油的超速离心,来分离VLP。

[0123] 本文公开的流感VLP可用作流感疫苗,以引起针对人和禽H5N1流感病毒的保护性 免疫应答。

[0124] 可通过通常用于将重组病毒导入受试者中的任何途径,将流感VLP或其组合物给 予受试者。给药方法包括,但不限于,真皮内、肌内、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、阴道、直 肠、鼻内、吸入或口服。肠胃外给药(例如皮下、静脉内或肌内给药)一般通过注射完成。注射 剂(injectable)可以以常规的形式制备,为液体溶液或悬液、适合用于注射前液体中的溶 液或悬液的固体形式,或为乳剂形式。可由之前所描述的那些种类的无菌粉剂、粒剂和片剂 来制备注射溶液和悬液。给药可以是全身的或局部的。

[0125] 以任何合适的方式(例如与可药用载体一起)给予流感VLP或其组合物。可药用载 体部分地由被给予的具体组合物,以及用以给予所述组合物的具体方法来确定。因此,有多 种本公开内容的药物组合物的合适制剂。

[0126] 用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳剂。非水性溶剂 的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载 体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬液,包括盐水和缓冲介质。肠胃外的载体包括氯化钠溶液、 林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补 充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂 例如,抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

[0127] —些组合物可潜在地作为可药用的酸加成盐或碱加成盐被给予,所述酸加成盐是 通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸,以及有机酸例如甲酸、 乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸和延胡索酸反应而形成,所 述碱加成盐是通过与无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾,以及有机碱例如单烷基 胺、二烷基胺、三烷基胺和芳香基胺及取代的乙醇胺反应来形成。

[0128] 可通过单剂量或多剂量来完成给药。在本公开内容的上下文中给予受试者的剂量 应足以随着时间的推移在受试者中诱导有益的治疗反应,或足以抑制或预防H5N1流感病毒 感染。所需剂量根据受试者的物种、年龄、重量和综合状况、所治疗的感染的严重性、所使用 的具体组合物及其给药方式而在各个受试者之间不同。本领域普通技术人员仅使用常规实 验即可确定适当的剂量。

[0129] 本文提供了包括治疗有效量的单独的或与可药用载体组合的流感VLP的药物组合 物。可药用载体包括,但不限于,盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇,及其组合。所述载 体和组合物可为无菌的,且所述制剂适合所述给药方式。所述组合物还可含有较少量的润 湿剂或乳化剂,或PH缓冲剂。所述组合物可为液体溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持 续释放制剂或粉剂。所述组合物可与惯常的粘合剂和载体(例如甘油三酯)制成栓剂。口服 制剂可包括标准载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸 镁。可使用任何常见的药物载体,例如无菌盐溶液或芝麻油。所述介质还可含有常规的药物 辅助物质例如,用于调整渗透压力的可药用盐、缓冲液、防腐剂等。可与本文提供的组合物 和方法共同使用的其他介质为生理盐水和芝麻油。

[0130] 本文描述的流感VLP可单独给予或与其他治疗剂组合给予以增强抗原性。例如,所 述流感VLP可与佐剂(例如弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂)一起给予。

[0131] 任选地,一种或多种细胞因子,例如 IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-aS IFN-γ,一种或多种生长因子,例如GM-CSF或G-CSF;—种或多种分子例如0X-40L或41BBL, 或这些分子的组合,可用作生物佐剂(参见,例如,Salgaller et al. ,1998, J.Surg.0ncol.68⑵:122_38;Lotze et al.,2000,Cancer J.Sci.Am.6(Suppl 1):S61_6; Cao et a I . , 1998, Stem Cells 16 (Suppl I) :251-60;Kuiper et al.,2000, Adv.Exp.Med.Biol.465:381-90)。可将这些分子全身性(或局部性)给予宿主。

[0132] 已知很多在体外和体内诱导细胞应答的方式。脂质已经被鉴定为能够协助引发针 对多种抗原的体内CTL的试剂。例如,如美国专利No. 5,662,907所描述,棕榈酸残基可结合 到赖氨酸残基的α和ε氨基上,然后连接(例如,通过一个或多个连接残基,例如甘氨酸、甘氨 酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)到免疫原性肽上。然后可将所述脂质化的肽以微团 形式直接注射、整合到脂质体或乳化于佐剂中。在另一实例中,大肠杆菌(E. coli)脂蛋白 (例如三棕榈酰基-S -甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸(1:1^?311]1;[1:071-3-glycerylcysteinlysery 1-serine),当其共价结合到适当的肽上时,可用于引发肿瘤特异 性的CTL (参见,Deres et al. ,Nature 342:561,1989)。此外,因为中和抗体的诱导还可使 用缀合至展示出适当表位的肽上的相同分子来引发,所以当认为需要时可以组合两种组合 物,以引起体液和细胞介导的应答。

[0133] 虽然本文举例说明了给予含有优化的HA蛋白的VLP,但是本领域技术人员应理解, 还可以给予所述优化的流感HA蛋白本身(无病毒颗粒的情况下)或作为融合蛋白给予,以在 受试者中引起免疫应答。在一些实施方案中,给予所述HA蛋白的片段,例如HAl或HA2亚片 段。

[0134] 提供了以下实施例以举例说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被 解释为将本公开内容限制在所描述的具体特征或实施方案中。

[0135] 实施例

[0136] 实施例I :H5N1流感COBRA序列的产生

[0137] 本实施例描述了通过使用1989个人和禽Η5ΝΓ流感HA序列来产生Η5ΝΓ流感HA COBRA共有序列。所得的COBRA序列被称为“所有H5C0BRA”。

[0138] 为了产生最终的H5N1流感HA COBRA序列,使用了三个层级的共有序列(图1)。对于 第一层级,产生每一个H5N1进化枝和亚进化枝(subclade)(进化枝0、1、2.1. 1、2.1.2、 2·1·3、2·2、2·3·1、2·3·2、2·3·3、2·3·4、2·4、2·5、3、4、5、6、7、8和9)的共有序列。第二层级 包括进化枝2的五个亚进化枝(2.1、2.2、2.3、2.4和2.5)中每一个的共有序列。对于第三层 级,通过使用10个进化枝(0、1、2、3、4、5、6、7、8和9)中每一个的共有序列而产生最终共有序 列。根据该方法产生的H5N1C0BRA序列如下文所示并在本文中示出为SEQ ID NO: 1。

[0139] 所有H5C0BRA HA(SEQ ID N0:1)

Figure CN104144941BD00171

[0141] 对所述最终COBRA氨基酸序列进行反向翻译,并进行优化以在哺乳动物细胞中表 达,包括密码子使用和RNA优化(^GeneArt; Regensburg,Germany)。所述密码子优化的基因序 列在下文提供并在本文中示出为SEQ ID NO:2。

[0142] 密码子优化的所有H5C0BRA HA基因序列(SEQ ID N0:2)

[0143]

Figure CN104144941BD00172

Figure CN104144941BD00181

[0144] 所述密码子优化的构建体能够被插入到PTR600表达载体中(美国专利申请公开 No.2002/0106798;Ross et al.,Nat Immunol.l(2):102-103,2000;Green et al·, Vaccine 20:242-248,2001)并如下文实施例3所论述用于产生VLP。。

[0145] 实施例2:人/禽进化枝2H5N1C0BRA序列的产生

[0146] 本实施例描述了通过使用1213个人和禽H5N1进化枝2流感HA序列而产生H5N1流感 HA COBRA共有序列。所得的COBRA序列被称为“人/禽C0BRA-2”。

[0147] 为了产生所述最终的人/禽流感HA COBRA序列,使用了两个层级的共有序列(图 2)。对于第一层级,使用H5N1进化枝2的10个亚进化枝(亚进化枝2.1.1、2.1.2、2.1.3、2.2、 2.3.1、2.3.2、2.3.3、2.3.4、2.4和2.5)而产生5个共有序列。进化对于第二层级,使用第一 层级产生的5个共有序列(进化枝2.1、进化枝2.2、进化枝2.3、进化枝2.4和进化枝2.5)产生 最终共有序列。根据该方法产生的人/禽H5N1进化枝2C0BRA序列如下所示并在本文中示出 为SEQ ID NO:3。

Figure CN104144941BD00182

[0150] 对所述最终COBRA氨基酸序列进行反向翻译,并进行优化以在哺乳动物细胞中表 达,包括密码子使用和RNA优化(^GeneArt; Regensburg,Germany)。所述密码子优化的基因序 列在下文提供并示出为SEQ ID N0:4。

[0151] 密码子优化的人/禽C0BRA-2HA基因序列(SEQ ID N0:4)

[0152]

Figure CN104144941BD00183

Figure CN104144941BD00191

[0153] 所述密码子优化的构建体能够被插入到pTR600表达载体中(美国专利申请公开 No.2002/0106798;Ross et al.,Nat Immunol.l(2):102-103,2000;Green et al·, Vaccine 20:242-248,2001)并如下文实施例3所论述用于产生VLP。

[0154] 实施例3:制备流感VLP并使用流感VLP进行免疫

[0155] 以下方法可用于产生和表征包含COBRA HA的流感VLP。免疫小鼠、雪貂和猕猴的示 例性方法也如下所述(也参见,Giles and Ross,Vaccine 29(16) :3043-3054,2011)。

[0156] 疫苗制备

[0157] 使用表达M1、NA和优化的HA的质粒瞬时转染293T细胞,在37°C下孵育72小时。所述 编码MUNA和HA的序列可被密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。收集上清液,通过低 速离心及随后通过〇.22μπι无菌滤器进行真空过滤来去除细胞碎片。通过在4 °C下超速离心 (100,OOOxg通过20 %甘油,重量/体积)4小时来纯化VLP。然后将所得沉淀重悬于pH 7.2的 PBS中,并以单次使用的等分试样保存于-80°C直至使用。使用Micro BCA™蛋白测定试剂盒 (Pierce Biotechnology ,Rockford, IL ,USA)确定总蛋白浓度。

[0158] 剂量确定

[0159] 可通过蛋白质印迹和密度测定法(densitometry assay)来确定HA具体含量。以标 准总蛋白量制备纯化的重组COBRA HA和纯化的VLP,将其在10%SDS-PAGE凝胶上电泳,并转 移至PVDF膜。将所述印迹用来源于流感感染的小鼠的小鼠多克隆抗血清探测,使用缀合有 辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG (Southern Biotech;Birmingham,AL,美国)检测 HA-抗体复合体。用化学发光底物(Pierce Biotechnology;Rockford IL,美国)检测HRP,曝 光到X-光片(ThermoFisher; Pittsburgh ,PA,美国)。用ImageJ软件(NIH)确定条带密度。重 组HA条带的密度用于计算标准曲线,并且使用所述重组HA的结果内插所述纯化VLP的密度。

[0160] 小鼠研究

[0161] BALB/c小鼠(小家鼠(Mus muscul i s),雌性,6-8周龄)可购自 Harlan Sprague Dawley (Indianapolis,IN,美国)。小鼠饲养在微隔离单元(microisolator unit)中,自由 取食食物和水,并根据USDA的用于实验室动物的指导管理。在0周时,基于密度测定法获得 的HA含量,通过肌内注射,用纯化的COBRA HA VLP的一个选定剂量(例如3 .Oyg、1.5yg、0.6μ g、0.3yg或0.06yg)接种小鼠,然后在第3周时用相同剂量加强。每个剂量的疫苗都用明矾佐 剂(Imject Alum,Pierce Biotechnology;Rockford, IL,美国)、CpG寡核苷酸或单独的载体 配制。每次疫苗接种后的14-21天,从麻醉的小鼠中经眶后丛收集血液,并转移至微量离心 管中。将管离心,移出血清,并将其冷冻于-80 ± 5°C。在第5周时,使用代表性的重排病毒 (reassortant virus)或COBRA HA VLP来确定每个疫苗组的血凝抑制(HAI)血清抗体滴度。

[0162] 末次接种后三周,用50μ1体积的致病性H5N1流感病毒对小鼠进行鼻内攻击。感染 后,在感染后的14天内,每天监测小鼠的体重减轻、疾病征象和死亡。接种后,每天记录每组 的个体体重、疾病评分(Toapanta and Ross,Respiratory Research 10 ⑴:112,2009)和 死亡。

[0163] 雪貂研究

[0164] 艾融雪紹(Fitch ferret,Mustela putorius furo,雌性,6-12月龄),未感染过流 感且去臭腺((16-8〇61^6(1),可购自马歇尔农场(337^,?4,美国)。雪紹成对饲养于含有 Sani-chipsLaboratory Animal Bedding (P.J.Murphy Forest Products,Montville,NJ, USA)的不锈钢笼子(Shor-line, Kansas City, KS,USA)中。无限制地给雪紹提供 TekladGlobal Ferret Diet (Harlan Teklad,Madison,WI ,USA)和淡水。用ρΗ7·2的PBS稀释 所述⑶BRA HA VLP至终浓度。在0周时,基于通过密度测定法确定的HA含量,通过以0.25ml 的体积,用纯化的⑶BRA HA VLP的两个剂量(15yg、3yg)之一在四头肌处肌内注射免疫雪 貂,然后在第3周时用相同剂量加强。疫苗在使用前在-80°C下保存,用明矾佐剂(Imject Alum;Pierce Biotechnology ,Rockford, IL,USA)配制后立即使用。在接种方案期间每周监 测动物的不利事件,包括体重减轻、体温、活动减少、流涕、打喷嚏和腹泻。接种之前,通过 HAI测定确认动物对于传播的A型流感和B型流感病毒是血清反应阴性的。每次接种后14-21 天,从麻醉的雪貂中经前腔静脉收集血液,并转移至微量离心管中。将管离心并移出血清, 将血清冷冻于-80±5°C。第5周时,使用有代表性的重排病毒或COBRA HA VLP,确定每个疫 苗组的HAI血清抗体滴度。

[0165] 末次接种后三周,用Iml体积的致病性H5N1流感病毒对雪貂进行鼻内攻击。感染 后,在感染后的14天内,每天监测雪貂的体重减轻、疾病征象和死亡。接种后,每天记录每组 的个体体重、患病评分和死亡。接种后的7天内,每天通过将3ml的PBS滴入麻醉的雪貂的鼻 孔内,来进行鼻洗涤。收集洗涤物并保存于_80°C直至使用。

[0166] 灵长类免疫接种

[0167] 短尾称猴(Cynomolgus macaques)(食蟹猴(Macaca fascicularis),雄性,3-5岁) 可购自Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN,美国)。在0周时,基于密度测定法获得 的HA含量,通过肌内注射,用纯化的COBRA HA VLP (15yg)接种猕猴,然后在第3周和第6周时 用相同剂量加强。疫苗用明巩佐剂(Imject Alum;Pierce Biotechnology ,Rockford, IL, USA)配制后立即使用。每次接种后21天,从麻醉的猕猴经股静脉收集血液,并将血液转移至 血清分离管中。使管中血液凝结,然后离心,移出血清并将血清冷冻在-80 ± 5°C下。在第5周 时,使用有代表性的重排病毒或COBRA HA VLP确定每个疫苗组的终点IgG滴度和HAI血清抗 体滴度。

[0168] 末次接种后三周,用Iml体积的致病性H5N1流感病毒通过鼻内、气管内和眼窝接种 对猕猴进行攻击。感染后,在感染后的5天内,每天监测猕猴的体重减轻、疾病征象和死亡。 接种后,每天记录每组的个体体重、患病评分和死亡。

[0169] 实施例4:含有COBRA HA的VLP的免疫原性和保护效能

[0170] 本实施例描述了5个在小鼠中进行的研究以测试所有H5⑶BRA VLP和人-禽COBRA-2VLP的免疫原性和保护效能。

[0171] COBRA 研究 IA

[0172] 进行该研究以测试所有H5C0BRA和人-禽C0BRA-2的免疫原性以及针对进化枝1和 进化枝2攻击的保护效能。使用含有人进化枝2C0BRA HA的VLP (人C0BRA-2VLP)进行比较。用 3yg的含有所述所有H5C0BRA HA序列(SEQ ID N0:1)的VLP、含有所述人-禽⑶BRA-2HA序列 (SEQIDN0:3)的VLP、含有所述人C0BRA-2HA序列的VLP或含有大天鹅(WhooperSwan)(A/ Whooper Swan/Mongolia/244/2005)流感病毒HA的VLP肌内接种小鼠。在第0周时和第3周时 在使用佐剂(Imject™)的情况下进行疫苗接种。在第5周期间用5000PFU的印度尼西亚进化 枝2 · 1 病毒(A/Indonesia/5/2005)或用5000PFU的越南进化枝 1 病毒(A/Vietnam/1203/ 2004) 攻击小鼠。在第3周和第5周收集血液样品。在攻击后的第3天(D3)收获肺用于测定病 毒滴度。

[0173] 图3示出了在接种的小鼠中针对所有H5C0BRA VLP (阳性对照)、越南进化枝1病毒、 印度尼西亚进化枝2.1.3病毒、大天鹅进化枝2.2病毒、土耳其进化枝2.2病毒(Tk/Tk/05)、 两个埃及进化枝2.2.1病毒(Eg/321/07和Eg/3300/08)、安徽进化枝2.3.4病毒(Anhui/1/ 2005) 、暗绿绣眼鸟(Japanese white eye)进化枝2.3.4病毒(JWE/1038/06)和鸡越南进化 枝7病毒(Ck/VN/08)的HAI滴度。结果表明用含有所有H5C0BRA和人-禽C0BRA-2HA的VLP进行 的疫苗接种可引起能够识别进化枝1和进化枝2流感病毒的抗体应答。图4和图5分别示出了 用印度尼西亚进化枝2.1和用越南进化枝1攻击后直至第14天(D14),接种的小鼠和未接种( naiive)的小鼠的体重。随着时间的推移,所有接种的小鼠在体重上都表现出极小的变化, 但是未接种的小鼠却展示出显著的体重减轻。另外,用大天鹅进化枝2.2病毒(图6)或越南 进化枝1病毒(图7)攻击后,未接种的小鼠中病毒滴度明显高于攻击后接种的小鼠中的病毒 滴度。

[0174] COBRA 研究 2A

[0175] 进行本研究以测试在用含有所有H5C0BRA、人-禽C0BRA-2、或人C0BRA-2HA的VLP对 小鼠的一次接种后针对进化枝1攻击的保护效能。用3yg的所有H5⑶BRA VLP、人-禽COBRA-2VLP、人C0BRA-2VLP或大天鹅VLP通过肌内接种小鼠。在使用佐剂(Imject™)的情况下进行 疫苗接种。在第4周期间用5000PFU的进化越南进化枝1病毒攻击小鼠。在第3周时收集血液 样品。在攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定病毒滴度。

[0176] 如图8所示,在用越南进化枝1病毒攻击后,接种的小鼠的体重未明显改变,而未接 种的小鼠展示出显著的体重减轻。与接种的小鼠相比,未接种的小鼠中第2天(D2)和第3天 (D3)的病毒滴度也显著更高(图9)。

[0177] COBRA 研究 4A

[0178] 进行本研究以测试在不含佐剂的情况下在一次接种后针对进化枝1病毒的保护效 能。用3yg的所有H5C0BRA VLP、人-禽C0BRA-2VLP、人C0BRA-2VLP、或大天鹅VLP通过肌内接 种小鼠。在第4周期间用5000PFU的越南进化枝1病毒攻击小鼠。在第3周时收集血液样品。在 攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定病毒滴度。

[0179] 如图10中所示,所有在不使用佐剂的情况下接种的小鼠的体重在进化枝1攻击后 最初发生了降低,但是攻击后的第10天恢复到正常。相反,未接种的小鼠的体重显著降低且 未恢复。未接种的小鼠到第7天都死于感染,而40-60%的接种的小鼠在攻击后14天仍存活 (图11)。尤其是,60%的用所有H5C0BRA VLP或人C0BRA-2VLP接种的小鼠在攻击后仍存活, 40 %的用人-禽C0BRA-2VLP或大天鹅VLP接种的小鼠在攻击后仍存活。

[0180] COBRA 研究 5A

[0181] 进行本研究以测试在以较低剂量的VLP (0.6yg)与佐剂(Imject™)进行一次接种 后,针对进化枝1病毒的保护效能。用〇.6yg的所有H5⑶BRA VLP、人-禽⑶BRA-2VLP、人 C0BRA-2VLP或大天鹅VLP通过肌内接种小鼠。在第4周期间用5000PFU的越南进化枝1病毒攻 击小鼠。在第3周时收集血液样品。在攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定测病 毒滴度。

[0182] 如图12所示,接种的小鼠的体重在病毒攻击后轻微地降低但是到第10天恢复到正 常值。相反,未接种的小鼠的体重显著降低并且所述小鼠未恢复。和接种的小鼠相比,在未 接种的小鼠中第2天(D2)和第3天(D3)的病毒滴度也更高(图13和图14)。

[0183] COBRA 研究 9A

[0184] 进行本研究以测试在以较低剂量的VLP (0.6yg)与佐剂(Imject™)进行一次接种 后,针对进化枝2.2病毒的保护效能。用0.6yg的所有H5⑶BRA VLP、人-禽⑶BRA-2VLP、人 0»1^-2¥1^或大天鹅¥1^通过肌内接种小鼠。在第4周期间用5000??1]的大天鹅进化枝2.2病 毒攻击小鼠。在第3周时收集血液样品。在攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定 病毒滴度。

[0185] 如图15所示,接种的小鼠的体重在病毒攻击后轻微地降低但是到第10天恢复到正 常水平。相反,未接种的小鼠的体重显著降低并且所述小鼠不会恢复。与接种的小鼠相比, 在未接种小鼠中第2天(D2)和第3天(D3)的病毒滴度也增加(图16和图17)。

[0186] 鉴于所公开的发明的原理可应用于许多可能的实施方案,应认识到,所示出的实 施方案只是本发明的优选实例,不应被认为是对本发明范围的限制。而是,本发明的范围是 由以下的权力要求书限定。因此,申请人要求保护落入这些权利要求的范围和主旨的所有 发明。

Claims (20)

1. 一种重组流感血凝素(HA)多肽,其中所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO: 1或SEQID NO:3组成。
2. 编码权利要求1的流感HA多肽的分离的核酸分子。
3. 权利要求2的分离的核酸分子,其中所述核酸分子被密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。
4. 权利要求3的核酸分子,包含SEQ ID N0:2的1-1698位核苷酸或SEQ ID N0:4的1-1701位核苷酸。
5. 权利要求3的核酸分子,包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
6. 包含权利要求2-5中任一项的核酸分子的载体。
7. 权利要求6的载体,还包含可操作地连接至编码所述流感HA多肽的核酸序列的启动 子。
8. 包含权利要求6或权利要求7的载体的分离的细胞。
9. 包含权利要求1的流感HA多肽的流感病毒样颗粒(VLP)。
10. 权利要求9的流感VLP,还包含流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质蛋白Ml或其两 者。
11. 包含权利要求1的流感HA多肽的流感VLP,其通过在足以使所述HA、M1和NA蛋白表达的条件下,使用编码所述HA多肽的载体、编码流感NA蛋白的载体和编码流感Ml蛋白的载体转染宿主细胞来产生。
12. 包含权利要求1的流感HA多肽的融合蛋白。
13. —种组合物,其包含权利要求1的流感HA多肽、权利要求9-11中任一项的VLP或权利要求12的融合蛋白,以及可药用载体。
14. 权利要求1的流感HA多肽、权利要求9-11中任一项的VLP、权利要求12的融合蛋白或权利要求13的组合物用于制备在受试者中引起针对流感病毒的免疫应答的药剂的用途,包括给予所述药剂。
15. 包含权利要求9-11中任一项的VLP和可药用载体的组合物用于制备针对流感病毒免疫受试者的药剂的用途,包括给予所述受试者所述药剂。
16. 权利要求15的用途,其中所述组合物还包含佐剂。
17. 权利要求15的用途,其中所述组合物通过肌内给予。
18. 权利要求16的用途,其中所述组合物通过肌内给予。
19. 权利要求15-18中任一项的用途,其中所述组合物包含I -25yg的所述VLP。
20. 权利要求19的用途,其中所述组合物包含15yg的所述VLP。
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