JP7337921B2 - 鳥インフルエンザウイルスｈ５亜型に対する免疫原性組成物 - Google Patents

Description

本発明は、獣医学の分野、特に鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型に対する免疫原性組成物に関する。

鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのタイプに属し、世界中で野生の水鳥の間で自然に発生し、哺乳動物を含めて、家禽類およびその他の鳥に感染し得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）というウイルスの表面上の２つのタンパク質に基づいて亜型に区分される。１８種のＨＡ亜型および１１種のＮＡ亜型が知られている。ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質の多くの異なる組合せが可能である。例えば、「Ｈ５Ｎ１ウイルス」は、ウイルスがＨＡ亜型５およびＮＡ亜型１を有することを意味する。
Ｈ５ウイルスの９種の亜型（Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８およびＨ５Ｎ９、本明細書で「Ｈ５Ｎｘ」と呼ばれる）が知られている。野鳥および家禽において世界中で同定されているほとんどのＨ５ウイルスは低病原性鳥インフルエンザウイルスであるが、一部のＨ５含有ウイルスは高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルスに属する。Ｈ５Ｎｘウイルスは急速に進化し、異なるＨ５系統間での進化的関係を明らかにする異なるクレード間での相当多様な抗原変異をもたらす。家禽がＨＰＡＩウイルスに感染すると、高い死亡率の重病を引き起こし得る。
地域的流行性Ｈ５Ｎｘウイルスを有する国々では、この病気を制御するためにワクチン接種が使用されている。ほとんどの一般的なＡＩＶワクチンは、全ウイルスの不活化および適切なアジュバントによる乳化によって調製される不活化全ウイルスを含有するワクチン（不活化ワクチン）である。しかしながら、不活化ワクチンは異なるクレードに対する広範な防御を提供することができない。ＡＩＶが急速に進化するために、人々は異なるクレードに対する新たなワクチンを絶えず開発しなければならない。さらに、不活化ワクチンの製造には大量の生きたＡＩＶが必要であるので、バイオセイフティーが深刻な問題となる。

ＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスの受容体結合および膜融合糖タンパク質である。ＨＡタンパク質は、防御抗体を誘発することができることが知られており、よって、研究者が組換えＨＡタンパク質に基づくサブユニットワクチンの開発に興味を持つようになっている。国際公開第２００７／０１９０９４号は、ＨＡ分子を、その受容体結合部位のアミノ酸置換を欠くＨＡ分子と比較してより抗原性にする、受容体結合部位のアミノ酸置換を含むＨＡ分子を開示している。国際公開第２００８／０５２１７３号は、いくつかのアミノ酸変異を含む鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニンタンパク質（以下「ＡＩＶ Ｈ５亜型のＨＡタンパク質」または「Ｈ５ ＨＡタンパク質」と呼ぶ）を開示しており、アジュバント付加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）Ｈ５ ＨＡタンパク質を含むワクチンが、Ａ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床疾患からの防御を提供することができる。しかしながら、上記開示は、異なるクレードのＡ型インフルエンザウイルスに対するより広範な防御に関連しない。
国際公開第２０１３／１４８１６４号は、ヒトＨ５Ｎ１およびブタＨ１Ｎ１インフルエンザ分離株に基づいて最適化Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを作製する方法を開示している。最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）も調製されている。実験結果は、ＶＬＰが、マウスで２つの異なるクレードのインフルエンザウイルスを認識することができる抗体応答を誘発することができるが、防御有効性がわずか４０～６０％であることを示している。
ＡＩＶ Ｈ５亜型に対する、家禽でのより広範で、より有効な、長期持続性で、早発性の防御を提供することができるワクチンを開発する必要がある。

本発明は、鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニンタンパク質を含む免疫原性組成物であって、ヘマグルチニンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、免疫原性組成物を提供する。
本発明はまた、免疫原性組成物を調製する方法であって、（ｉ）鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニンタンパク質を発現する発現ベクターを含有する細胞を培養するステップと；（ｉｉ）全細胞培養物を収穫するステップとを含み、ヘマグルチニンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、方法を提供する。

鳥インフルエンザウイルス、好ましくはＨ５Ｎｘによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、本発明の免疫原性組成物も提供される。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２および／またはＨ５Ｎ６である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ２である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ６である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１およびＨ５Ｎ２である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６である。
ＡＩＶに自然感染した動物と本発明の免疫原性組成物をワクチン接種した動物を区別する方法も提供される。
本発明の免疫原性組成物は、家禽でのより広範で、より有効な、長期持続性で、早発性の防御を提供することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、家禽でのより広範な防御を提供する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、家禽でのより有効な防御を提供する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、家禽での長期持続性の防御を提供する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、家禽での早発性の防御を提供する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニンタンパク質を含む免疫原性組成物であって、前記ヘマグルチニンタンパク質が、
配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、
（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに
（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基
を含む、免疫原性組成物。
〔２〕前記ヘマグルチニンタンパク質が、
（ａ）アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｎ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉ；
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列
を含む、前記〔１〕に記載の免疫原性組成物。
〔３〕前記ヘマグルチニンタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の免疫原性組成物。
〔４〕前記ヘマグルチニンタンパク質が配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の免疫原性組成物。
〔５〕前記ヘマグルチニンタンパク質が細胞培養物に含有されており、前記細胞培養物が、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に定義されるヘマグルチニンタンパク質を発現することができる発現ベクターを含有する細胞を培養することによって調製される、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔６〕前記発現ベクターが、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に定義されるヘマグルチニンタンパク質をコードする核酸分子を含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔７〕前記核酸分子が配列番号１０に示される、前記〔６〕に記載の免疫原性組成物。
〔８〕前記核酸分子が配列番号１１に示される、前記〔６〕に記載の免疫原性組成物。
〔９〕前記発現ベクターがバキュロウイルスであり、前記細胞が昆虫細胞である、前記〔５〕～〔８〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔１０〕前記細胞培養物が不活化ステップ、好ましくはバイナリエチレンイミンによる不活化ステップに供される、前記〔５〕～〔９〕に記載の免疫原性組成物。
〔１１〕前記細胞培養物の一部または全部を含む、前記〔５〕～〔１０〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔１２〕アジュバントをさらに含む、前記〔１〕～〔１１〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔１３〕前記アジュバントが油中水型エマルジョンである、前記〔１２〕に記載の免疫原性組成物。
〔１４〕単回投与もしくは複数回投与で投与される；および／または
皮下もしくは筋肉内投与される；および／または
１日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降もしくは２１日齢以降で動物に投与される、
前記〔１〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔１５〕鳥インフルエンザウイルス、好ましくはＨ５Ｎｘ、より好ましくはＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、前記〔１〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
〔１６〕免疫原性組成物の単回投与または複数回投与後に、鳥インフルエンザウイルス、好ましくはＨ５Ｎｘ、より好ましくはＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、前記〔１５〕に記載の免疫原性組成物。
〔１７〕免疫原性組成物の単回投与後に、鳥インフルエンザウイルス、好ましくはＨ５Ｎｘ、より好ましくはＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、前記〔１６〕に記載の免疫原性組成物。
〔１８〕鳥インフルエンザウイルスに自然感染した動物と前記〔１〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物を区別する方法であって、
（ａ）動物の試料を、前記免疫原性組成物には存在しないが、前記自然感染した動物には存在する鳥インフルエンザマーカーの存在について、酵素免疫測定法もしくは酵素結合免疫吸着測定法である免疫検査および／またはゲノム解析検査で分析するステップと、
（ｂ）前記試料が前記鳥インフルエンザマーカーについて陽性であるか陰性であるかを決定するステップと、
（ｃ）前記検査結果を前記検査動物の状態と相関させ、前記鳥インフルエンザマーカーについて陽性である動物は自然感染した動物であり、前記鳥インフルエンザマーカーについて陰性である動物は前記〔１〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物である、ステップと
を含む方法。
〔１９〕鳥インフルエンザウイルスに自然感染した動物と前記〔１〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物を区別する方法であって、
（ａ）動物の試料を、前記免疫原性組成物に特異的であるが、前記自然感染した動物には存在しない鳥インフルエンザマーカーの存在について、酵素免疫測定法もしくは酵素結合免疫吸着測定法である免疫検査および／またはゲノム解析検査で分析するステップと、
（ｂ）前記試料が前記鳥インフルエンザマーカーについて陽性であるか陰性であるかを決定するステップと、
（ｃ）前記検査結果を前記検査動物の状態と相関させ、前記鳥インフルエンザマーカーについて陽性である動物は前記〔１〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物である、ステップと
を含む方法。

一態様では、本発明は、Ｈ５ ＨＡタンパク質を含む免疫原性組成物であって、Ｈ５ ＨＡタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、免疫原性組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」とも呼ばれる、「免疫原性組成物」という用語は、組成物に対する免疫応答を誘発する少なくとも１つの抗原を含む組成物を指す。宿主は、新たな感染症に対する耐性が増強される、および／または臨床徴候の重症度が低減されるように、治療的または防御的免疫応答を示す。
Ｈ５ ＨＡタンパク質のアミノ酸配列は、一連のＨＡアミノ酸配列アラインメント、その後のコンセンサスアミノ酸配列の作製、および各位置で最も共通の残基の分析を通して設計される。本明細書で使用される場合、「本発明のヘマグルチニンタンパク質」、「ＡＩＶ Ｈ５亜型のＨＡタンパク質」および「Ｈ５ ＨＡタンパク質」という用語は互換的である。

本明細書で使用される場合、配列番号１は、Ａ／アヒル／中国／Ｅ３１９－２／０３株のものであるが、アミノ末端のシグナルペプチドを欠くＨＡタンパク質のアミノ酸配列を表す（Ａ／アヒル／中国／Ｅ３１９－２／０３株のＨＡタンパク質のアミノ酸配列は国際公開第２００８／０５２１７３号でも開示された）。配列番号１は、本発明のＨＡタンパク質のアミノ酸位置を決定するためのＨＡタンパク質の標準配列として使用される。

本明細書で使用される本発明のＨＡタンパク質のアミノ酸位置のナンバリングは、配列番号１に示されるアミノ酸位置を指す。例えば、「１２０Ｎまたは１２０Ｓ」という指定は、配列番号１の１２０位に対応する位置のＮまたはＳを意味する。「１５５Ｎ」は、配列番号１の１５５位に対応する位置のＮを意味する。「２２３Ｎまたは２２３Ｓ」は、配列番号１の２２３位に対応する位置のＮまたはＳを意味する。「６１Ｄ」は、配列番号１の６１位に対応する位置のＤを意味する。「８７Ｉ」は、配列番号１の８７位に対応する位置のＩを意味する。「９９Ａ」は、配列番号１の９９位に対応する位置のＡを意味する。「１０２Ａ」は、配列番号１の１０２位に対応する位置のＡを意味する。「１１０Ｎ」は、配列番号１の１１０位に対応する位置のＮを意味する。「１３６Ｓ」は、配列番号１の１３６位に対応する位置のＳを意味する。「１４０Ｄ」は、配列番号１の１４０位に対応する位置のＤを意味する。「１４９Ｓ」は、配列番号１の１４９位に対応する位置のＳを意味する。「１５６Ｔ」は、配列番号１の１５６位に対応する位置のＴを意味する。「１５７Ｐ」は、配列番号１の１５７位に対応する位置のＰを意味する。「１７０Ｎ」は、配列番号１の１７０位に対応する位置のＮを意味する。「１７２Ｔ」は、配列番号１の１７２位に対応する位置のＴを意味する。「１７８Ｒ」は、配列番号１の１７８位に対応する位置のＲを意味する。「１９０Ｖ」は、配列番号１の１９０位に対応する位置のＶを意味する。「１９１Ｌ」は、配列番号１の１９１位に対応する位置のＬを意味する。「２００Ａ」は、配列番号１の２００位に対応する位置のＡを意味する。「２２６Ｖ」は、配列番号１の２２６位に対応する位置のＶを意味する。「２４３Ｄ」は、配列番号１の２４３位に対応する位置のＤを意味する。「２６８Ｙ」は、配列番号１の２６８位に対応する位置のＹを意味する。「２７９Ａ」は、配列番号１の２７９位に対応する位置のＡを意味する。「２９８Ｉ」は、配列番号１の２９８位に対応する位置のＩを意味する。それだけに限らないが、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することによって実施されるアミノ酸アラインメントを含む、アミノ酸の位置を決定する方法が当技術分野で知られている。

本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が、６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択されるアミノ酸残基のいずれか１つを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が、６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が、６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される３つ、４つ、５つ、．．．．．．、または全てのアミノ酸残基を含む。天然に存在するＡＩＶ由来のＨＡタンパク質全体は約５６８アミノ酸残基長であり、アミノ酸５１４の上流の全てのアミノ酸残基はウイルス表面上に位置する。本発明の上記アミノ酸部位は、免疫原性エピトープのほとんどを含むと考えられているＨＡタンパク質のアミノ酸６０～３００の領域内に位置すると特定されている。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質がアミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓをさらに含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質がアミノ酸残基１２０Ｎ、１５５Ｎおよび２２３Ｎを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質がアミノ酸残基１２０Ｎ、１５５Ｎおよび２２３Ｓを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質がアミノ酸残基１２０Ｓ、１５５Ｎおよび２２３Ｎを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質がアミノ酸残基１２０Ｓ、１５５Ｎおよび２２３Ｓを含む。

本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が、アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｎ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が、アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｓ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｓ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が、アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｓ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｎ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉを含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が、アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｓ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉを含む。

本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。
本明細書で使用される場合、「本発明のＨ５ ＨＡタンパク質」という用語は、Ｈ５ ＨＡタンパク質の単離形態、またはＨ５ ＨＡタンパク質の非単離形態、例えば細胞培養物に含有されているＨ５ ＨＡタンパク質であり得る。本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質がＨ５ ＨＡタンパク質の非単離形態である。本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質がＨ５ ＨＡタンパク質の単離形態である。
本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が、Ｈ５ ＨＡタンパク質をコードする核酸分子を発現させることによって調製される。

一実施形態では、本発明の核酸分子が、細胞での発現のためにさらにコドン最適化され得る。本明細書で使用される「コドン最適化核酸分子」という用語は、コドンが特定の系（特定の種または種のグループなど）での発現に最適となるように選択された核酸分子を意味する。コドン最適化は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。一実施形態では、本発明の核酸分子が、昆虫細胞での発現のためにコドン最適化される。
一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１０に示される核酸配列を含む。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１０に示される核酸配列からなる。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１１に示される核酸配列を含む。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１１に示される核酸配列からなる。
本発明の核酸分子は発現ベクターに含まれ得る。一実施形態では、本発明の発現ベクターがウイルス、プラスミド、コスミドまたはファージである。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、好ましくはＤＮＡで構成され得る。

ベクターならびに発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用する方法は、特に米国特許第４６０３１１２号、同第４７６９３３０号、同第５１７４９９３号、同第５５０５９４１号、同第５３３８６８３号、同第５４９４８０７号、同第４７２２８４８号、同第５９４２２３５号、同第５３６４７７３号、同第５７６２９３８号、同第５７７０２１２号、同第５９４２２３５号、同第３８２４２５号、ＰＣＴ公開、国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号；Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈらの米国特許第４７４５０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；欧州特許第０３７０５７３号；１９８６年１０月１６日に出願された米国特許出願第９２０１９７号；欧州特許公開第２６５７８５号；米国特許第４７６９３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５５９１４３９号、同第５５５２１４３号；国際公開第９８／００１６６号; 共に１９９６年７月３日に出願されて認められた米国特許出願第０８／６７５５５６号および同第０８／６７５５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ国際公開第９１／１１５２５号；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561、Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；ならびに米国特許第５５９１６３９号、同第５５８９４６６号および同第５５８０８５９号ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；ＤＮＡ発現ベクターに関連するTang et al., NatureおよびFurth et al., Analytical Biochemistryに開示される方法により得るまたはこれらと同様であり得る。国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998（レンチウイルス発現系）；Ｓａｎｆｏｒｄらの米国特許第４９４５０５０号；Ｆｉｓｃｈｂａｃｈｅｔら（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）の国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)（ＤＮＡベクター系）；Ｓｚｏｋａらの米国特許第４３９４４４８号（ＤＮＡを生細胞に挿入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋらの米国特許第５６７７１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５９２８９１３号（遺伝子送達用のベクター）；ならびに本明細書で引用される他の文献も参照されたい。

一実施形態では、本発明の発現ベクターがウイルスベクターである。
一実施形態では、本発明の発現ベクターが、オーエスキー病ウイルス、ウマヘルペスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルスである。一実施形態では、本発明の発現ベクターがブタアデノウイルスなどのアデノウイルスである。一実施形態では、本発明の発現ベクターが、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルスまたはブタポックスウイルスなどのポックスウイルスである。

一実施形態では、ウイルスベクターが組換えバキュロウイルスである。一実施形態では、本発明の組換えバキュロウイルスが、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）から得られる。一実施形態では、本発明の組換えバキュロウイルスが、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得られる。一実施形態では、本発明の組換えバキュロウイルスが本発明のＨ５ ＨＡタンパク質をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、本発明の組換えバキュロウイルスが配列番号１０に示される核酸分子を含む。一実施形態では、本発明の組換えバキュロウイルスが配列番号１１に示される核酸分子を含む。
本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が細胞培養物に含有されている。本発明の細胞培養物は、ＨＡタンパク質を含有する細胞および培養培地、または細胞培養物の一部、例えば濾過または任意の他の分離ステップによって得られるＨＡタンパク質を含有する細胞培養物の一部を含む、細胞培養法から得られる全細胞培養物であり得る。

一実施形態では、細胞培養物が、配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含むＨ５ ＨＡタンパク質を含む。一実施形態では、細胞培養物が、アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｎ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉを含むＨ５ ＨＡタンパク質を含む。一実施形態では、細胞培養物が、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＨ５ ＨＡタンパク質を含む。一実施形態では、細胞培養物が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＨ５ ＨＡタンパク質を含む。

本発明の免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。一実施形態では、免疫原性組成物がアジュバント中で製剤化される。本明細書で使用される「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＧＰＩ－０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、バーミンガム、アラバマ州）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含むことができる。エマルジョンは特に、ライトリキッドパラフィン油（欧州薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド；アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化から得られる油；直鎖アルキル基を含む酸またはアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）またはプロピレングリコールジオレエート；分岐脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づき得る。油はエマルジョンを形成するために乳化剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタン、マンニド（例えば、アンヒドロマンニトールオレエート）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエトキシル化されていてもよいオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステル、およびポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にＰｌｕｒｏｎｉｃ製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)およびTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例示的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されるＳＰＴエマルジョンおよびこの同じ本の１８３頁に記載されるエマルジョンＭＦ５９である。

アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルと架橋したアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したこのようなアクリルポリマーを記載する米国特許第２９０９４６２号を参照することができる。好ましい基は、２～４個の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和基自体がメチルなどの他の置換基を含んでもよい。Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、オハイオ州、米国）という名称で販売されている製品が特に適切である。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋している。その中でも、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐが挙げられる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中には、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーであるコポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）がある。これらのポリマーを水に溶解すると酸溶液が得られ、これは、免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液を得るために、好ましくは生理的ｐＨに中和される。

さらに適切なアジュバントには、それだけに限らないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州アトランタ）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州エメリービル）、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質－アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（組換え体またはその他）由来の易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４もしくはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えのサイトカインもしくはその類似体、または内因性サイトカイン放出の刺激剤などが含まれる。

一実施形態では、免疫原性組成物が、適切なアジュバントで油中水型エマルジョンに製剤化される。アジュバントは油および界面活性剤を含むことができる。一実施形態では、アジュバントがＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ７１Ｒ ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃによって製造される、カタログ番号：３６５１８７）である。アジュバントは１用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量で添加され得る。さらにより好ましくは、アジュバントは１用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量で添加される。さらにより好ましくは、アジュバントは１用量当たり約５００μｇ～約５ｍｇの量で添加される。さらにより好ましくは、アジュバントは１用量当たり７５０μｇ～約２．５ｍｇの量で添加される。最も好ましくは、アジュバントは１用量当たり約１ｍｇの量で添加される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり約７部のアジュバントを含有する油相および約３部の本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含有する水相を含む。

驚くべきことに、本発明の免疫原性組成物が家禽でのより広範な防御をもたらすことができることが分かった。本明細書で使用される「家禽でのより広範な防御」という用語は、異なるＡＩＶ Ｈ５亜型に対する広範な防御を包含する。このような亜型は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２および／またはＨ５Ｎ６を包含する、またはさらなる実施形態によると、からなる。さらなる実施形態によると、「家禽でのより広範な防御」という用語はまた、ＡＩＶ Ｈ５亜型の異なるクレードに対する防御を包含する。このようなＡＩＶ Ｈ５クレードは、２．３．４．４、２．３．２．１、２．３．２．１ｄ、２．３．４．４ｄおよび／または７．２を包含する、またはさらなる実施形態によると、からなる。

さらに、本発明の免疫原性組成物によって提供される防御は早発性および長期持続性期間を有する。本明細書で使用される「早発性期間」または「早発性の防御」という用語は、感染性ＡＩＶ Ｈ５ウイルスに対する部分的防御がワクチン接種７日後に得られることを意味する。感染性ＡＩＶ Ｈ５ウイルスに対する完全な防御はワクチン接種１４日後に得られる。「長期持続性期間」または「家禽での長期持続性の防御」という用語は、ワクチン接種後少なくとも４２日間の防御期間を包含する。
本発明の免疫原性組成物は、異なる日齢のニワトリ、生まれたばかりのニワトリ、すなわち出生１日目のニワトリさえも防御を提供することができる。本発明の免疫原性組成物は、ある特定の投与経路に限定されてはならず、本発明の免疫原性組成物の防御有効性は異なる投与経路によって影響されない。

別の態様では、本発明はまた、免疫原性組成物を調製する方法であって、（ｉ）Ｈ５ ＨＡタンパク質を発現することができる発現ベクターを含有する細胞を培養するステップと；（ｉｉ）Ｈ５ ＨＡタンパク質またはＨ５ ＨＡタンパク質を含む全細胞培養物を収穫するステップとを含み、Ｈ５ ＨＡタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、方法を提供する。

本発明の方法の一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が、アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｎ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉを含む。一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｈ５ ＨＡタンパク質が配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の方法の一実施形態では、発現ベクターが、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスである。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１０に示される。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１１に示される。一実施形態では、組換えバキュロウイルスが、商標Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で販売されている市販の製品から得られる。一実施形態では、細胞が昆虫細胞である。一実施形態では、昆虫細胞がＳＦ＋細胞である。一実施形態では、ＳＦ＋細胞が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリデン、コネチカット州）によって販売されている市販の製品である。

本発明の方法の一実施形態では、本方法が、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製するステップを含む。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１０に示される。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１１に示される。一実施形態では、組換えバキュロウイルスが、商標Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で販売されている市販の製品から得られる。
本発明の方法の一実施形態では、本方法が、細胞を本発明の組換えバキュロウイルスに感染させるステップを含む。一実施形態では、細胞が昆虫細胞である。一実施形態では、昆虫細胞がＳＦ＋細胞である。一実施形態では、ＳＦ＋細胞が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリデン、コネチカット州）によって販売されている市販の製品である。

本発明の方法の一実施形態では、本方法が、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製するステップと、昆虫細胞を組換えバキュロウイルスに感染させるステップとを含む。一実施形態では、組換えバキュロウイルスが、商標Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で販売されている市販の製品から得られる。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１０に示される。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１１に示される。一実施形態では、昆虫細胞がＳＦ＋細胞である。一実施形態では、ＳＦ＋細胞が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリデン、コネチカット州）によって販売されている市販の製品である。

本発明の方法の一実施形態では、本方法が、（ｉ）本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製するステップと；（ｉｉ）昆虫細胞を組換えバキュロウイルスに感染させるステップと；（ｉｉｉ）昆虫細胞を培養培地で培養するステップと；（ｉｖ）本発明のＨ５ ＨＡタンパク質または本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む全細胞培養物を収穫するステップとを含む。一実施形態では、組換えバキュロウイルスが、商標Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で販売されている市販の製品から得られる。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１０に示される。一実施形態では、本発明の核酸分子が配列番号１１に示される。一実施形態では、昆虫細胞がＳＦ＋細胞である。一実施形態では、ＳＦ＋細胞が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリデン、コネチカット州）によって販売されている市販の製品である。

本発明の方法の一実施形態では、本発明の細胞を培養するための培養培地が当業者によって決定される。一実施形態では、培養培地が無血清昆虫細胞培地である。一実施形態では、培養培地がＥｘ－ＣＥＬＬ ４２０（昆虫細胞用のＥｘ－ＣＥＬＬ（登録商標）４２０無血清培地、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ１４４２０Ｃ）である。
本発明の方法の一実施形態では、昆虫細胞が、Ｈ５ ＨＡタンパク質の発現に適した条件下で培養される。一実施形態では、昆虫細胞が、最大１０日間、好ましくは約２日間～約１０日間、より好ましくは約４日間～約９日間、さらにより好ましくは約５日間～約８日間の期間にわたってインキュベートされる。一実施形態では、昆虫細胞を培養するのに適した条件が、約２２～３２℃の間、好ましくは約２４～３０℃、より好ましくは約２５～２９℃、さらにより好ましくは約２６～２８℃、最も好ましくは約２７℃の温度を含む。
本発明の方法の一実施形態では、本方法が、本発明の細胞培養物を不活化するステップをさらに含む。それだけに限らないが、化学処理および／または物理処理を含む、任意の慣用的な不活化方法を本発明の目的に使用することができる。

一実施形態では、不活化ステップが、好ましくは約１～約２０ｍＭ、好ましくは約２～約１０ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度の環化バイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含む。一実施形態では、不活化ステップが、ＮａＯＨ中で環化されてＢＥＩを形成する２－ブロモエチレンアミン臭化水素酸塩の溶液の添加を含む。
一実施形態では、不活化ステップが、２５～４０℃の間、好ましくは２８～３９℃の間、より好ましくは３０～３９℃の間、より好ましくは３５～３９℃の間で実施される。一実施形態では、不活化ステップが、２４～７２時間、好ましくは３０～７２時間、より好ましくは４８～７２時間実施される。一般に、不活化ステップは、ウイルスベクターの複製が検出できなくなるまで実施される。

本発明の方法の一実施形態では、本方法が、不活化ステップの後の中和ステップのステップをさらに含む。中和ステップは、溶液中の不活化剤を中和する当量の薬剤を添加することを含む。一実施形態では、不活化剤がＢＥＩである。一実施形態では、中和剤がチオ硫酸ナトリウムである。一実施形態では、不活化剤がＢＥＩである場合、当量のチオ硫酸ナトリウムが添加される。例えば、ＢＥＩが最終濃度５ｍＭまで添加される場合、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液が添加されて最終的な最小濃度５ｍＭを与えて、残留ＢＥＩを中和する。一実施形態では、不活化剤がＢＥＩである場合、中和ステップが、チオ硫酸ナトリウム溶液を１～２０ｍＭ、好ましくは２～１０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭまたは１０ｍＭの最終濃度まで添加することを含む。一実施形態では、ウイルスベクターの複製を検出することができないことを意味する、不活化ステップが完了した後に、中和剤が添加される。一実施形態では、不活化ステップが２４時間実施された後に、中和剤が添加される。一実施形態では、不活化ステップが３０時間実施された後に、中和剤が添加される。一実施形態では、不活化ステップが４８時間実施された後に、中和剤が添加される。一実施形態では、不活化ステップが７２時間実施された後に、中和剤が添加される。

本発明の免疫原性組成物に含有されるＨ５ ＨＡタンパク質の量は、当技術分野で知られている任意の慣用的な方法、例えば赤血球凝集アッセイ（OIE Terrestrial Manual 2015, Chapter 2.3.1 & 2.3.2, Avian Influenza (infection with avian influenza viruses)参照）を使用することによって定量化することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物に含有されるＨ５ ＨＡタンパク質の量が、ニワトリ赤血球を使用する赤血球凝集検査によって決定され、Ｈ５ ＨＡタンパク質の量が赤血球凝集アッセイ単位（ＨＡＵ）として表され得る。

「ＨＡＵ」という用語は赤血球（ＲＢＣ）を凝集させる活性の単位を指し、１ＨＡＵのヘマグルチニンタンパク質は、ヘマグルチニンをＲＢＣと混合した場合に凝集を引き起こす最小単位を指す。ＨＡＵは赤血球凝集価アッセイによって評価することができる。このアッセイでは、ヘマグルチニンタンパク質を含有する試料を９６ウェルプレートでの２倍系列希釈に供し、ＰＢＣ溶液をウェルに添加する。ＨＡＵの値は、ＲＢＣの完全な凝集をもたらす試料の最大希釈倍率である。例えば、２５μｌ試料の最大希釈倍率が２５６である場合、試料に含有されるヘマグルチニンタンパク質の量は２５μｌ当たり２５６ＨＡＵである。
本発明による有効な免疫応答を誘発するために、本発明の免疫原性組成物に含有されるＨ５ ＨＡタンパク質の量は１用量当たり少なくとも３２ＨＡＵである。よって、本発明の免疫原性組成物は、１用量当たり少なくとも３２ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも６４ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも１２８ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも２５６ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。

当業者は、単なる日常的な試験によってＨ５ ＨＡタンパク質の量の上限を決定することができる。一般に、当業者によって使用される上限は１用量当たり約１０２４ＨＡＵの範囲となるが、より高くてもよいだろう。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも３２～１０２４ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも６４～１０２４ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも１２８～１０２４ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物が、１用量当たり少なくとも２５６～１０２４ＨＡＵの本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含む。
バイオセイフティーレベル２または３（ＢＳＬ－２、ＢＳＬ－３）で製造されるために必要とされる従来の全ウイルス不活化ワクチンと比較して、Ｈ５ ＨＡタンパク質を製造するための上記製造方法は、バイオセイフティーレベル１要件に分類されている。
別の態様では、本発明はまた、ＡＩＶによって引き起こされる感染症を予防および／または処置する方法であって、有効量の本発明の免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。本発明はまた、ＡＩＶによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、本発明の免疫原性組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、最大でインフルエンザ感染症の臨床徴候の完全な予防を含む、このような臨床徴候の発生または重症度の減少を指す。免疫原性組成物の予防防御有効性は、異なるＡＩＶクレードに対するワクチン接種した対象の生存率に基づいて評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物の防御有効性が、本発明のワクチンを受けなかったが、感染レベルのＡＩＶに曝露された対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、なおより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％増加する。一実施形態では、免疫原性組成物の防御有効性が、異なるＡＩＶクレードに対してワクチン接種した対象で１００％である。

一実施形態では、それを必要とする対象が家禽、さらにより好ましくは鳥、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどであり得る。一実施形態では、対象がニワトリまたはアヒルである。
一実施形態では、ＡＩＶがＨ５亜型である。一実施形態では、ＡＩＶがＨ５Ｎｘである。一実施形態では、ＡＩＶが、主にアジア、中東およびアフリカで広がっているＨＰＡＩ Ｈ５Ｎｘである。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２および／またはＨ５Ｎ６である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ２である。一実施形態ではＨ５ＮｘがＨ５Ｎ６である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１およびＨ５Ｎ２である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６である。一実施形態では、ＡＩＶがクレード２、好ましくはクレード２．３、より好ましくはクレード２．３．４および２．３．２である。一実施形態では、ＡＩＶがクレード２．３．４．４、２．３．２．１、２．３．２．１ｄまたは２．３．４．４ｄである。一実施形態では、ＡＩＶがクレード７．２である。
亜型Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２および／またはＨ５Ｎ６のＨ５Ｎｘは当技術分野で周知である。

本明細書で使用される場合、「クレード」という用語は、１つの共通の祖先の全ての子孫を含む生物学的分類群（種など）を指す。Ａ／アヒル／広東／１／９６が全てのＨ５系統ウイルスの先祖であると考えられ、クレード０と指定された。この命名法が現在Ｈ５ ＨＡ遺伝子の変異群を区別するために使用されており、今までに約２０種の異なるクレードのウイルスが公式に同定されている。クレード０以外に、寄託された全ての配列に基づいて、さらに９種のクレード（１～９）が記載および定義された。しかしながら、ウイルスのクレードのほとんどは時間とともに絶滅した。Ｈ５系統ウイルスは、アジア、中東およびアフリカの一部で家禽および野鳥で広がり続けており、進化し続けている。いくつかの異なる国々で地域的流行性感染症をもたらしたほとんどの優勢なクレードがクレード２ウイルスであり、抗原連続変異から得られたさらなる亜系統が二次、三次、四次およびさらには五次クレードとして記載されている。命名法および出現したクレードは、WHO/OIE/FAO. Continuing progress towards a unified nomenclature for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses: divergence of clade 2.2 viruses. Influenza Other Respiration Viruses. Letter. 2009;3:59-62；WHO/OIE/FAO. Continued evolution of highly pathogenic avian influenza A (H5N1): updated nomenclature. Influenza Other Respiration Viruses 2012;6:1-5；およびWHO-OIE-FAO HNEWG. Revised and updated nomenclature for highly pathogenic avian influenza A (H5N1) viruses. Influenza Other Respiration Viruses 2014;8:384-388から見ることができる。

例えば、クレード２．３．４．４のＨ５Ｎｘは、Lee et al., Emerging Infectious Diseases, 2016; Volume 22(7) pp.1283-1284およびLee et al., Journal Veterinary Science 2017; Vol.(S1), pp.269-280に記載されている。Smith et al., Emerging Infectious Diseases, 2009; Volume 15(3), pp.402-407に記載される鳥インフルエンザ分離株Ａ／一般的なカササギ／香港／５０５２／２００７（Ｈ５Ｎ１）は、クレード２．３．２．１に属する。Ａ／ニワトリ／インド／ＣＬ０３４８５／２０１１（Ｈ５Ｎ１）またはＡ／ニワトリ／インド／ＣＡ０３０２／２０１１（Ｈ５Ｎ１）を含む、クレード２．３．２．１のさらなるＨ５Ｎｘ分離株は、例えばBhat et al., 2015, Microbial Pathogenesis; volume 88, pp.87-93に記載されている。２．３．２．１ならびに例えばＡ／アヒル／ベトナム／ＨＵ１－１５０７／２０１４（Ｈ５Ｎ６）またはＡ／アヒル／ベトナム／ＨＵ１－１１５１／２０１４（Ｈ５Ｎ６）などの２．３．４．４ｄを含む２．３．４．４のサブクレードのさらなるＨ５Ｎｘは、Nguyen et al., 2019, Scientific Reports 9; Article 7723, pp.1-13に記載されている。例えば（Ａ／ニワトリ／甘粛／６２０１２（Ｈ５Ｎ１））を含むクレード７．２のＨ５Ｎｘ分離株は、例えばLiu et al., Journal of Virology 2016, Volume 90(21), pp.9797-9804に記載され、特徴づけられている。

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が皮下（Ｓ．Ｃ．）または筋肉内（Ｉ．Ｍ．）投与を介して投与され得る。
本発明の免疫原性組成物の投与の時間は、実用上の要件に従って当業者によって決定され得る。例えば、その寿命が約４０～５０日間であるホワイトブロイラーについては、本発明の免疫原性組成物が１回で投与され得；その寿命が約７０日間であるイエローブロイラーについては、本発明の免疫原性組成物が２回で投与され得；その寿命が１年超またはそれより長い種鶏などのニワトリについては、本発明の免疫原性組成物が複数回で投与され得る。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が単回投与で投与される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回などの複数回投与で投与される。一実施形態では、２回の間の間隔が４週間、５週間または６週間などの約４～６週間である。

当業者はまた、実用的な要件に従って、いつ初回投与を行うかを決定することができる。例えば、ニワトリをワクチン接種する場合。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、１日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降または２１日齢以降で最初に投与され得る。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、１日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降または２１日齢以降で投与される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、単回投与で１日齢、７日齢、１０日齢、１５日齢または２１日齢から投与される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、単回投与で１日齢から投与される。

別の態様では、本発明はまた、ＡＩＶに自然感染した動物と本発明のワクチンまたは免疫原性組成物をワクチン接種した動物を区別する方法を提供する。本発明はまた、ＡＩＶに自然感染した動物とワクチン接種した動物を区別するための薬剤の調製における本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。

一実施形態では、本方法が、ａ）動物の試料を、免疫原性組成物には存在しないが、自然感染した動物には存在する鳥インフルエンザマーカーの存在について、酵素免疫測定法もしくは酵素結合免疫吸着測定法もしくは寒天ゲル内沈降アッセイもしくはウエスタンブロットアッセイである免疫検査および／またはゲノム解析検査で分析するステップと、ｂ）試料が鳥インフルエンザマーカーについて陽性であるか陰性であるかを決定するステップと、ｃ）検査結果を検査動物の状態と相関させ、鳥インフルエンザマーカーについて陽性である動物は自然感染した動物であり、鳥インフルエンザマーカーについて陰性である動物は本発明の免疫原性組成物またはワクチンをワクチン接種した動物である、ステップとを含む。
一実施形態では、本方法が、ａ）動物の試料を、免疫原性組成物に特異的であるが、自然感染した動物には存在しない鳥インフルエンザマーカーの存在について、酵素免疫測定法もしくは酵素結合免疫吸着測定法である免疫検査および／またはゲノム解析検査で分析するステップと、ｂ）試料が鳥インフルエンザマーカーについて陽性であるか陰性であるかを決定するステップと、ｃ）検査結果を検査動物の状態と相関させ、鳥インフルエンザマーカーについて陽性である動物は本発明の免疫原性組成物またはワクチンをワクチン接種した動物である、ステップとを含む。
一実施形態では、動物が家禽、さらにより好ましくは鳥、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどであり得る。一実施形態では、動物がニワトリまたはアヒルである。

一実施形態では、ＡＩＶがＨ５亜型である。一実施形態では、ＡＩＶがＨ５Ｎｘである。一実施形態では、ＡＩＶが、主にアジア、中東およびアフリカで広がっているＨＰＡＩ Ｈ５Ｎｘである。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２および／またはＨ５Ｎ６である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ２である。一実施形態ではＨ５ＮｘがＨ５Ｎ６である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ１およびＨ５Ｎ２である。一実施形態では、Ｈ５ＮｘがＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６である。
一実施形態では、ＡＩＶがクレード２、好ましくはクレード２．３、より好ましくはクレード２．３．４および２．３．２である。一実施形態では、ＡＩＶがクレード２．３．４．４または２．３．２．１、２．３．２．１ｄまたは２．３．４．４ｄである。一実施形態では、ＡＩＶがクレード７．２である。

本発明のＨ５ ＨＡタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物をワクチン接種した動物はこの特異的抗原に対する抗体応答を有するに過ぎず、他のウイルス構成要素に対する不の応答を有する。本発明のさらなる利点は、これがＡＩＶ感染動物とワクチン接種した動物を区別するための特異的ＥＬＩＳＡによるＤＩＶＡ概念に役立つことである。
別の態様では、本発明はまた、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、または本発明のワクチンもしくは免疫原性組成物を含むキットを提供する。一実施形態では、キットが、家禽、さらにより好ましくは鳥、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどの対象に使用され得る。一実施形態では、ニワトリがワクチン接種される場合、本発明のＨ５ ＨＡタンパク質、ワクチンまたは免疫原性組成物が、１日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降または２１日齢以降でワクチン接種に使用され得る。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、単回投与で１日齢、７日齢、１０日齢、１５日齢または２１日齢から投与される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物が、単回投与で１日齢から投与される。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、出願時に本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は明らかになるはずであるが、潜在的に曖昧である場合には、本明細書で提供される定義が辞書または外的定義より優先する。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書では、特に明言しない限り、「または（ｏｒ）」の使用が「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。本明細書で言及される全ての特許および刊行物は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の実施は、特に指示しない限り、当業者の技能の範囲内である、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学および免疫学の慣用的な技術を使用する。このような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。

本明細書で使用される用語法が、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのものに過ぎず、限定的であることを意図していないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」が複数指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は２つ以上の抗原の混合物を含み、「担体（ａ ｃａｒｒｉｅｒ）」への言及は２つ以上の担体の混合物を含む等々である。

条項
以下の条項もまた本明細書に記載され、本発明の開示の一部である：
１．鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニンタンパク質を含む免疫原性組成物であって、ヘマグルチニンタンパク質が、
配列番号１に示されるアミノ酸残基を参照したナンバリングによる、
（ａ）アミノ酸残基１２０Ｎまたは１２０Ｓ、１５５Ｎ、および２２３Ｎまたは２２３Ｓ；ならびに
（ｂ）６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基
を含む、免疫原性組成物。

２．ヘマグルチニンタンパク質が、
（ａ）アミノ酸残基６１Ｄ、８７Ｉ、９９Ａ、１０２Ａ、１１０Ｎ、１２０Ｎ、１３６Ｓ、１４０Ｄ、１４９Ｓ、１５５Ｎ、１５６Ｔ、１５７Ｐ、１７０Ｎ、１７２Ｔ、１７８Ｒ、１９０Ｖ、１９１Ｌ、２００Ａ、２２３Ｎ、２２６Ｖ、２４３Ｄ、２６８Ｙ、２７９Ａおよび２９８Ｉ；
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列
を含む、条項１に記載の免疫原性組成物。

３．ヘマグルチニンタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、条項１または２に記載の免疫原性組成物。
４．ヘマグルチニンタンパク質が配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、条項１または２に記載の免疫原性組成物。
５．ヘマグルチニンタンパク質が細胞培養物に含有されており、細胞培養物が、条項１～４のいずれか１項に定義されるヘマグルチニンタンパク質を発現することができる発現ベクターを含有する細胞を培養することによって調製される、条項１～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
６．発現ベクターが、条項１～４のいずれか１項に定義されるヘマグルチニンタンパク質をコードする核酸分子を含む、条項１～５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
７．核酸分子が配列番号１０に示される、条項６に記載の免疫原性組成物。
８．核酸分子が配列番号１１に示される、条項６に記載の免疫原性組成物。
９．発現ベクターがバキュロウイルスであり、細胞が昆虫細胞である、条項５～８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

１０．細胞培養物が不活化ステップ、好ましくはバイナリエチレンイミンによる不活化ステップに供される、条項５～９に記載の免疫原性組成物。
１１．細胞培養物の一部または全部を含む、条項５～１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１２．アジュバントをさらに含む、条項１～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１３．アジュバントが油中水型エマルジョンである、条項１２に記載の免疫原性組成物。
１４．単回投与もしくは複数回投与で投与される；および／または
皮下もしくは筋肉内投与される；および／または
１日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降もしくは２１日齢以降で動物に投与される、
条項１～１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

１５．１日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降または２１日齢以降で動物に投与される、条項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１６．２１日齢から動物に投与される、条項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１７．１５日齢から動物に投与される、条項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１８．７日齢から動物に投与される、条項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１９．１日齢から動物に投与される、条項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

２０．１日齢から動物に投与される、条項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２１．鳥インフルエンザウイルス、好ましくはＨ５Ｎｘ、より好ましくはＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２２．Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２３．Ｈ５Ｎ２鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２４．Ｈ５Ｎ６鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

２５．クレード２、好ましくはクレード２．３、より好ましくはクレード２．３．４または２．３．２のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２６．クレード２のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２７．クレード２．３のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２８．クレード２．３．４のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
２９．クレード２．３．４．４のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

３０．クレード２．３．４．４ｄのＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３１．クレード２．３．２のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３２．クレード２．３．２．１のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３３．クレード２．３．２．１ｄのＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３４．クレード７．２のＨ５Ｎｘ鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、条項１～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

３５．単回投与で投与される、条項１～３４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３６．単回投与として投与され、前記単回が鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、条項１～３４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３７．単回投与として投与され、前記単回がＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、条項１～３４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
３８．単回投与として投与され、前記単回が条項２２～３４で引用されるいずれかのＨ５Ｎｘによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、条項１～３４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

３９．鳥インフルエンザウイルスに自然感染した動物と条項１～１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物を区別する方法であって、
（ａ）動物の試料を、免疫原性組成物には存在しないが、自然感染した動物には存在する鳥インフルエンザマーカーの存在について、酵素免疫測定法もしくは酵素結合免疫吸着測定法である免疫検査および／またはゲノム解析検査で分析するステップと、
（ｂ）試料が鳥インフルエンザマーカーについて陽性であるか陰性であるかを決定するステップと、
（ｃ）検査結果を検査動物の状態と相関させ、鳥インフルエンザマーカーについて陽性である動物は自然感染した動物であり、鳥インフルエンザマーカーについて陰性である動物は条項１～１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物である、ステップと
を含む方法。

４０．鳥インフルエンザウイルスに自然感染した動物と条項１～１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物を区別する方法であって、
（ａ）動物の試料を、免疫原性組成物に特異的であるが、自然感染した動物には存在しない鳥インフルエンザマーカーの存在について、酵素免疫測定法もしくは酵素結合免疫吸着測定法である免疫検査および／またはゲノム解析検査で分析するステップと、
（ｂ）試料が鳥インフルエンザマーカーについて陽性であるか陰性であるかを決定するステップと、
（ｃ）検査結果を検査動物の状態と相関させ、鳥インフルエンザマーカーについて陽性である動物は条項１～１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種した動物である、ステップと
を含む方法。

配列概要
以下の配列を本発明でこれにより詳述および開示する：
配列番号１：アヒル／中国／Ｅ３１９－２／０３株のものであるが、アミノ末端のシグナルペプチドを欠くＨＡタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号２：Ｈ５Ｃｏｎ１のアミノ酸配列。
配列番号３：Ｈ５Ｃｏｎ３のアミノ酸配列。
配列番号４：Ｈ５Ｃｏｎ５のアミノ酸配列。
配列番号５：Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔのアミノ酸配列。
配列番号６：Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの６０～３００位のアミノ酸配列。
配列番号７：Ｈ５Ｃｏｎ１の最適化核酸配列。
配列番号８：Ｈ５Ｃｏｎ３の最適化核酸配列。
配列番号９：Ｈ５Ｃｏｎ５の最適化核酸配列。
配列番号１０：Ｈ５ＣｏｎＭｕｔの最適化核酸配列。
配列番号１１：Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの６０～３００位のアミノ酸配列をコードする最適化核酸配列。
以下の図面は本発明の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つまたは複数を参照することによってより良く理解され得る。

Ｈ５Ｃｏｎ１配列を１９９６～２０１２年に分離された４４４個の配列から連続法で作製したことを示す図である。 Ｈ５Ｃｏｎ３配列を１９９６～２０１２年に分離された特定のクレードの２９７個の配列から１ラウンド法で作製したことを示す図である。 Ｈ５Ｃｏｎ５配列を２００５～２０１２年に分離された１９６個の配列から１ラウンド法で作製したことを示す図である。 トランスファープラスミドｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの構築を示す図である。

以下の実施例は、本明細書に記載される本発明をさらに説明し、本発明の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施でうまく機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、よって、その実施のためのモードを構成するとみなすことができることが当業者によって認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、開示される具体的な実施形態で行われ、本発明の精神および範囲内にある同様のまたは類似の結果をなお得ることができることを認識するはずである。

（実施例１）
Ｈ５ ＨＡコンセンサスアミノ酸配列およびその突然変異体の作製
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列１の作製
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列１（Ｈ５Ｃｏｎ１）を作製するために、１９９６年～２０１２年に中国で分離された４４４個の鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡアミノ酸配列を収集および分析した。４４４個のＨＡアミノ酸配列は、クレード０、クレード２．２、クレード２．３．２、クレード２．３．２．１、クレード２．３．４、クレード２．４、クレード２．５、クレード３、クレード４、クレード５、クレード６、クレード７およびクレード９で構成される。図１は、１９９６～２０１２年に分離された４４４個のアミノ酸配列からＨ５Ｃｏｎ１を作製する連続法を示している。最初に、１３個の第１層コンセンサスアミノ酸配列を作製し、各層は、（１）３６個のクレード０配列；（２）３１個のクレード２．２配列；（３）８個のクレード２．３．２；（４）４９個のクレード２．３．２．１；（５）２個のクレード２．３．３；（６）２１０個のクレード２．３．４；（７）１８個のクレード２．４；（８）６個のクレード２．５；（９）９個のクレード３；（１０）５個のクレード４；（１１）８個のクレード５；（１２）３個のクレード６；（１３）３４個のクレード７；および（１４）２１個のクレード９を使用して個々のクレードを表す。最終コンセンサスアミノ酸配列は、ＭＥＧＡ ５．０ソフトウェアを使用して、全１３個の第１層コンセンサスアミノ酸配列を整列および分析することによって作製された第２層コンセンサスアミノ酸配列である。この最終コンセンサスアミノ酸配列をＨ５Ｃｏｎ１（配列番号２）として指定した。

Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサス配列３の作製
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列３（Ｈ５Ｃｏｎ３）を作製するために、１９９６年～２０１２年に中国で分離された２９７個の鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡアミノ酸配列を収集および分析した。２９７個のＨＡアミノ酸配列は、特定のクレードのみ、すなわち、クレード２．３．２．１、クレード２．３．４およびクレード７で構成される。図２は、１９９６～２０１２年に分離された特定のクレードの２９７個のアミノ酸配列からＨ５Ｃｏｎ３を作製する１ラウンド法を示している。最終コンセンサスアミノ酸配列は、ＭＥＧＡ ５．０ソフトウェアを使用して、（１）４９個のクレード２．３．２．１、（２）２１４個のクレード２．３．４；および（３）３４個のクレード７を整列および分析することによって作製した。この最終コンセンサスアミノ酸配列をＨ５Ｃｏｎ３（配列番号３）として指定した。

Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列５の作製
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列５（Ｈ５Ｃｏｎ５）を作製するために、２００５年～２０１２年に中国で分離された１９６個の鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡアミノ酸配列を収集および分析した。１９６個のＨＡアミノ酸配列は、クレード０、２．２、２．３．１、２．３．２、２．３．２．１、２．３．４、２．４、７および９のものである。図３は、２００５～２０１２年に分離された１９６個のアミノ酸配列からＨ５Ｃｏｎ５を作製する１ラウンド法を示している。合計１９６個のアミノ酸配列をＭＥＧＡ ５．０ソフトウェアを使用して同時に整列した。最終コンセンサスアミノ酸配列をＨ５Ｃｏｎ５（配列番号４）として指定した。
Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５を作製する戦略を表１に要約する。

Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列５突然変異体の作製
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＨＡコンセンサスアミノ酸配列５突然変異体（Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔ）を作製するために、２つのアミノ酸突然変異をＨ５Ｃｏｎ５のアミノ酸配列に導入した。アミノ酸１２０位および２２３位で、両方のセリン（Ｓ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させた、すなわち、Ｓ１２０ＮおよびＳ２２３Ｎとした。Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔのアミノ酸配列は配列番号５によって示された。

Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５の分析
表２は、Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５のコンセンサスアミノ酸配列と流行しているクレードの配列の同一性％を示している。表３は、Ｈ５ ＨＡタンパク質の一部の予想される抗原部位でのＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５のコンセンサスアミノ酸配列の各々のアミノ酸使用をさらに示している。

表２. H5Con1、H5Con3およびH5Con5のコンセンサスアミノ酸配列と流行しているクレードの配列の同一性%の要約

表３. H5 HAタンパク質の予想される抗原部位でのH5Con1、H5Con3およびH5Con5のコンセンサスアミノ酸配列の各々のアミノ酸使用の要約

Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５が流行しているクレードの各々の配列と比較してアミノ酸配列が異なり、また３つの異なる流行しているクレード間で抗原部位のいくつかのアミノ酸変化を有することが表２および表３から分かる。

（実施例２）
Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの核酸配列の最適化、組換えバキュロウイルス発現系の構築、ならびに昆虫細胞でのＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの発現
Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの核酸配列の最適化
より優れた発現のために最適化するために、実施例１で特定されるＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５のアミノ酸配列の各々を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアによって対応する核酸配列に逆推定し、バキュロウイルス発現系（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログＡＢＰ－ＢＶＰ－１０００２）の昆虫細胞での発現のために最適化した。Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５の最適化核酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州、米国）によって合成した。Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５の最適化核酸配列はそれぞれ配列番号７～９によって示された。Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの最適化核酸配列を、Ｈ５Ｃｏｎ５の最適化核酸配列に基づいて、部位特異的変異誘発用のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、カタログ番号２００５１８、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用することによって作製した。Ｈ５ＣｏｎＭｕｔの最適化核酸配列は配列番号１０によって示された。

組換えバキュロウイルス発現系の構築、ならびに昆虫細胞でのＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの発現
上で調製されるＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの最適化核酸配列の各々を、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルスＤＮＡおよびトランスフェクションキット（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログＡＢＰ－ＢＶＤ－１０００２）に含まれるバキュロウイルス発現系トランスファーベクターｐＶＬ１３９３に挿入して、それぞれｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ１、ｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ３、ｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ５およびｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔとして指定されるトランスファープラスミドを作製した。図４は、トランスファープラスミドｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの構築を例示的に示している。

次いで、ｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ１、ｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ３、ｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ５およびｐＶＬ１３９３－Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの各々を、線状化野生型Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルスＤＮＡ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルスＤＮＡおよびトランスフェクションキット；Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログＡＢＰ－ＢＶＤ－１０００２）と共にｓｆ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｂ８２５－０１、ロット番号１０３０６７２）にコトランスフェクトして、救済組換えバキュロウイルスを得た。Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの最適化核酸配列を含む組換えバキュロウイルスを、それぞれｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ１、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ３、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５およびｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔとして指定した。そして、組換えバキュロウイルスの各々を含有するトランスフェクトｓｆ９細胞を得た。
上で調製されるトランスフェクトｓｆ９細胞を２７℃インキュベーターで４日間培養し、細胞培養物の上清を収穫した。純粋な組換えウイルスを得るために、次いで、収穫した上清をプラーク精製に供した。３ラウンドのプラーク精製を行って、それぞれｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ１、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ３、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５およびｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含有するウイルスプラークを第３ラウンドのプラーク精製後にピックアップして、精製ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ１、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ３、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５およびｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを得た。

上記精製ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ１、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ３、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５およびｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの各々を、振盪フラスコ中の懸濁培養昆虫細胞株ＳＦ＋細胞（昆虫細胞用のＥｘ－ＣＥＬＬ（登録商標）４２０無血清培地、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ１４４２０Ｃ）でさらに増殖させた。手短に言えば、ＳＦ＋細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリデン、コネチカット州）を、振盪フラスコに１０⁶細胞／ｍｌの密度で播種し、上記精製ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ１、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ３、ｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５およびｒＢａｃＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの各々を、ＭＯＩ＝０．０１～ＭＯＩ＝１でＳＦ＋細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、メリデン、コネチカット州）に接種した。接種したＳＦ＋細胞を、２７℃、振盪速度８０～１２０ｒｐｍ／分で、ＥＸ－ＣＥＬＬ ４２０培地で３～７日間培養し、それぞれ発現したＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含有する細胞培養物懸濁液を次のステップのために後で収穫した。収穫した細胞培養物懸濁液は、０．５～１．５×１０⁶細胞／ｍｌの間の細胞数を含んでいた。

（実施例３）
細胞培養物懸濁液のＨＡＵの決定
それぞれＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含有する細胞培養物懸濁液のＨＡＵを、２倍系列希釈法により赤血球凝集アッセイ（OIE Terrestrial Manual 2015, Chapter 2.3.1 & 2.3.2, Avian Influenza (infection with avian influenza viruses)参照）によって試験した。手短に言えば、１０ｍｌのＲＢＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｅｎｔ Ｐｌａｎｔ、浙江省製）を５００ｇで２０分間遠心分離し、１体積の４％遠心分離ＲＢＣを３体積のＰＢＳに添加して１％ＲＢＣを調製した。２５μｌのＰＢＳを９６ウェルプレートのウェル１～ウェル１１に分注した。２５μｌの細胞培養物懸濁液の各々をウェル１～ウェル１１に添加し、次いで、１：２～１：２０４８倍の系列希釈に供した。２５μｌの１％ＲＢＣを全てのウェルに添加し、室温で約４０分間インキュベートした。
陰性ウェルはウェルの中心にドットとして現れ、陽性結果はウェルにわたって均一な赤みがかった色を形成した。希釈の終点は、ＲＢＣの完全な凝集をもたらす試料の最大希釈に対応する。結果は、Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの細胞培養物懸濁液のＨＡＵが７１．１ＨＡＵ／２５μｌ（２５６ＨＡＵ／９０μｌまたは２５６ＨＡＵ／用量に対応する）超であることを示した。

（実施例４）
免疫原性組成物の調製
ＨＡＵが２５６／用量超の収穫した細胞培養物懸濁液を、３７℃で７２時間、１０ｍＭバイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）溶液を添加することによるＢＥＩ処理にさらに供して、バキュロウイルスの感染力を不活化した。次いで、１０ｍＭの４℃チオ硫酸ナトリウム溶液を添加してＢＥＩ残留物を中和した。
不活化後、細胞培養物懸濁液のＨＡＵを再度評価し、ＨＡＵが２５６／用量超の不活化細胞培養物懸濁液を、アジュバントによる次の乳化手順に使用するための活性抗原成分として使用した。

Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの免疫原性組成物を油中水型エマルジョンに調製した。手短に言えば、油中水型エマルジョンは連続油相および分散水相からなる二相系であり、水相が油相に小液滴として分散している。免疫原性組成物を調製するために使用される油相は市販のアジュバントＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ７１Ｒ ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃ．によって製造されている、カタログ番号３６５１８７）であり、水相はＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの不活化細胞培養物懸濁液の各々を含有していた。各用量（０．３ｍｌ）の免疫原性組成物について、約３部の水相（９０μｌ）を約７部の油相（２１０μｌ）に添加し、低せん断速度（約１１０００ｒｐｍで１分間）下、室温で、次いで、氷水浴中、１６０００ｒｐｍの高せん断速度で２分間分散させた。Ｍｉｃｃｒａ分散機（分散機、カタログ番号：Ｍｉｃｃｒａ Ｄ－９、分散機ヘッド、カタログ番号：ＤＳ－１４／Ｐ）を使用して油中水中エマルジョンを調製した。Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの免疫原性組成物の各々について、Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの量は少なくとも２５６ＨＡＵ／用量とした。

（実施例５）
Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔについての交差反応性試験および選択
ＳＰＦニワトリ孵化卵をＳＰＡＦＡＳ Ｊｉｎａｎから購入した。孵化後、ＳＰＦニワトリをランダムに選び取り、指定される隔離飼育器で飼育した。Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの交差反応性試験では、Ｒｅ－４～Ｒｅ－８および０３Ｈ５（ＭｕｔＫ＋）を使用してＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの反応性試験を評価した。

Ｒｅ－４～Ｒｅ－８はそれぞれクレード７．２、２．３．４、２．３．２．１、７．２および２．３．４．４に対する全ＡＩＶ（Ｈ５亜型）の不活化ワクチンであり、これらはＨａｒｂｉｎ Ｗｅｉｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製の市販の製品である。０３Ｈ５（ＭｕｔＫ＋）は、さらに以下のアミノ酸の変化：Ｓ１２０Ｎ、Ｄ１５０Ｎ、Ｓ２２３ＮおよびさらにＫ３２８（国際公開第２０１３０２４１１３号参照）を有する、Ａ／アヒル／中国／Ｅ３１９－２／０３株由来のバキュロウイルス発現ＨＡタンパク質である。０３Ｈ５（ＭｕｔＫ＋）を、Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔと同じ方法を使用することによって、免疫原性組成物に製剤化した。

１０日齢の１０羽の特定病原菌不在（ＳＰＦ）ニワトリに、それぞれ皮下注射を介して、１用量（０．３ｍｌ）の上記Ｒｅ－４～Ｒｅ－８および免疫原性組成物をワクチン接種した。ワクチン接種したニワトリを隔離飼育器で絶えず飼育した。個々のニワトリの血清試料を、ワクチン接種前、ワクチン接種２週間後およびワクチン接種３週間後に収集した。さらに、赤血球凝集阻止（ＨＩ）試験（OIE Terrestrial Manual 2015, Chapter 2.3.4, Avian Influenza (infection with avian influenza viruses参照）を使用することによって、同じワクチン接種群内の１０羽のニワトリのプールから調製した血清試料を試験してＨ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの交差ＨＩ反応性を決定した。ＨＩ試験では、Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔと６つの異なるクレード（ｒＢａｃ０３Ｈ５はクレード２．３．２を表し、Ｒｅ４はクレード７．２を表し、Ｒｅ５はクレード２．３．４を表し、Ｒｅ６はクレード２．３．２．１を表し、Ｒｅ７はクレード７．２を表し、Ｒｅ８はクレード２．３．４．４を表す）の抗原の交差反応性を評価した。

Ｒｅ－４～Ｒｅ－８、０３Ｈ５（ＭｕｔＫ＋）、Ｈ５Ｃｏｎ１、Ｈ５Ｃｏｎ３、Ｈ５Ｃｏｎ５およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの交差ＨＩ反応性のスコアを表４に示した。表４中、「＋」は試験した血清が交差反応し得る異なるクレードに由来する異種抗原の数を表す。「＋＋＋＋」でスコアリングされた血清は４つの異なるクレードとの交差反応性を示し、「＋＋＋」でスコアリングされた血清は３つの異なるクレードとの交差反応性を示し、「＋＋」でスコアリングされた血清は２つの異なるクレードとの交差反応性を示し、「＋」でスコアリングされた免疫血清はただ１つのクレードとの交差反応性を示した。「＋」～「＋＋＋＋」のスコアはより広範な交差反応性を示す。「＋＋＋＋」スコアをもたらす抗原を次の実験に選択した。

交差反応性の結果に基づいて、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔがより広範な交差反応性を有すると決定することができる。

（実施例６）
ウイルス曝露および防御有効性試験
０３Ｈ５ＭｕｔＫ＋（クレード２．３．２）、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御有効性をこの実施例でさらに試験した。防御有効性試験では、Ｒｅ６＋７＋８、０３Ｈ５ＭｕｔＫ＋（クレード２．３．２）、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを評価した。Ｒｅ６＋７＋８は、クレード２．３．２．１、クレード７．２およびクレード２．３．４．４に対する三価ワクチン（Ｒｅ６＋Ｒｅ７＋Ｒｅ８の混合物）であり、Ｈａｒｂｉｎ Ｗｅｉｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。Ｒｅ６＋７＋８を各クレードの曝露ウイルスに対する防御有効性についての陽性対照ワクチンとして使用した。１）３８３株（クレード２．３．２．１）、２）１４０７９株（クレード２．３．４．４）および３）１３１４７株（クレード７．２）の３つの異なるクレードの高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）Ｈ５Ｎｘウイルスのストックを調製し、曝露試験に使用した。ＳＰＦニワトリに、１用量（０．３ｍｌ）のＲｅ６＋７＋８、ならびに０３Ｈ５ＭｕｔＫ＋（クレード２．３．２）、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物（それぞれ少なくとも２５６／用量の同等のＨＡＵを有する）を、２１日齢で皮下経路を介してワクチン接種した。ワクチン接種したニワトリをＡＢＳＬ３（動物生物学的安全性レベル３）施設で飼育した。

ワクチン接種３週間（２１日）後、ニワトリを試験１回当たり３種のＨ５Ｎｘ曝露ウイルスのうちの１つに点鼻によって曝露した。各ニワトリについての曝露量は６Ｌｏｇ₁₀ＥＩＤ５０（ＥＩＤ５０＝胚感染量の５０％、これは接種した孵化卵の５０％で感染を引き起こす感染性ウイルスの量を意味する）とした。ニワトリを曝露後２週間監視し、ニワトリの死亡率および罹患率を毎日記録した。各ニワトリの気管および総排出腔の綿スワブを曝露３日後、５日後および７日後に収集した。ウイルス排出を、ニワトリ胚ベースのウイルス分離を介して綿スワブ試料で試験した。

曝露ウイルスの各々に対する防御有効性の評価は、以下の基準に基づいた：１）１００％のワクチン接種したニワトリが２週間の監視期間中に生存する（死亡率０％）かどうか。
３回のワクチン接種／曝露動物試験を行い、表５はＲｅ６＋７＋８、０３Ｈ５ＭｕｔＫ＋（クレード２．３．２）、Ｈ５Ｃｏｎ３およびＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御有効性を示す。

Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物をワクチン接種したニワトリは、クレード２．３．４．４、クレード２．３．２．１およびクレード７．２のＨＰＡＩウイルスに曝露した場合、１００％の防御を示すことが実証された。すなわち、Ｒｅ６＋Ｒｅ７＋Ｒｅ８の混合物などの従来のワクチンと比較して、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物それ自体が、３つの異なるクレードのＡＩＶに対するより優れたより広範な防御を同時に提供した。

（実施例７）
異なるＨＰＡＩ Ｈ５亜型に対する防御有効性試験
異なるＨＰＡＩ Ｈ５亜型に対するＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御有効性をこの実施例でさらに試験した。
１ａ～５ａ群を、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを投与した免疫化群として設定し、１ｂ～５ｂ群を、ＨＰＡＩ曝露のみを実施した対照群として設定した。各群は１２羽の１０日齢ＳＰＦニワトリを含んでいた。試験日（Ｄ０）に、１ａ～５ａの群のニワトリに１用量（０．３ｍｌ）のＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物を皮下経路を介してワクチン接種した。２１免疫化後日数（ｄｐｉ）後、全ての群のニワトリを異なるＨＰＡＩ Ｈ５亜型に鼻腔内曝露し、曝露量は６Ｌｏｇ₁₀ＥＩＤ₅₀／２００μｌ／ニワトリとした。曝露後１４日間、各群のニワトリの罹患率および死亡率を毎日計算した。

ＨＡＰＩの臨床症状には、元気がない（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｐｉｒｉｔｓ）、乱れた羽毛、有意に低下した食欲、咳、鼻および目からの分泌物、顔の腫脹、チアノーゼ、下痢、神経症状が含まれる。少なくとも３つの臨床症状の出現を罹患率の計算に使用した。死亡率は死んだニワトリを数えることによって計算した。防御％は、防御されたニワトリを試験したニワトリの総量で割ることによって計算した。
曝露に使用したＨＰＡＩ Ｈ５亜型は以下の通りであった：

曝露株は、Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｕｓｈａｎ Ｒｏａｄ、Ｔｉａｎｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、広州、広東省、中国から入手し、上記のＨ５Ｎ１（クレード２．３．３．１（ｄ）および２．３．４．４）、Ｈ５Ｎ２（クレード７．２）およびＨ５Ｎ６クレード（２．３．４．４（ｄ））の代表的な分離株である。

異なるＡＩＶ Ｈ５亜型に対するＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの観察された防御有効性を表６に要約した。

表６は、各対照群で、曝露後１４週間の間に１００％の死亡率が観察されたので、２１ｄｐｉでの曝露が有効であり、ニワトリをＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６に曝露した場合、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔが１００％の防御を示すことを示した。このデータは、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔが異なるＨＰＡＩ Ｈ５亜型に対するより優れたより広範な防御有効性を提供することを実証した。

（実施例８）
Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御開始試験
ＨＰＡＩ曝露に対するＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御開始をこの実施例でさらに試験した。
１ａおよび２ａ群を、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを投与した免疫化群として設定し、１ｂおよび２ｂ群を、ＨＰＡＩ曝露（１４０７９株）のみを実施した対照群として設定した。各群は１２羽の１０日齢ＳＰＦニワトリを含んでおり、実験を２回繰り返した。試験日（Ｄ０）に、１ａおよび２ａ群のニワトリに１用量（０．３ｍｌ）のＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物を皮下経路を介してワクチン接種した。７免疫化後日数（ｄｐｉ）後、１ａおよび１ｂ群のニワトリを１４０７９株に鼻腔内曝露した。１４免疫化後日数（ｄｐｉ）後、２ａおよび２ｂ群のニワトリを１４０７９株に鼻腔内曝露した。曝露量は６Ｌｏｇ₁₀ＥＩＤ₅₀／２００μｌ／ニワトリとした。曝露後１４日間、各群のニワトリの罹患率および死亡率を毎日計算した。Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの観察された防御開始を表７に要約した。

表７は、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔが、早くも７ｄｐｉで防御を誘導し、１４ｄｐｉで防御１００％であることを実証した。このデータは、Ｈ５Ｃｏｎ５ＭｕｔがＨＰＡＩ曝露に対する迅速な早発性防御を提供することを実証した。

（実施例９）
Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御期間試験
ＨＰＡＩ曝露に対するＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御期間をこの実施例でさらに試験した。

１～３群を、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを投与した免疫化群として設定し、４群を、ＨＰＡＩ曝露（１４０７９株）のみを実施した対照群として設定した。各群は、１２羽の１０日齢ＳＰＦニワトリを含んでおり、実験を２回実施した。試験日（Ｄ０）に、１～３群のニワトリに１用量（０．３ｍｌ）のＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物を皮下経路を介してワクチン接種した。２８ｄｐｉ、３５ｄｐｉおよび４２ｄｐｉ後、１～３群のニワトリをそれぞれ１４０７９株に鼻腔内曝露した。対照群では、ニワトリを２８ｄｐｉ後に１４０７９株に鼻腔内曝露した。曝露量は６Ｌｏｇ１０ＥＩＤ₅₀／２００μｌ／ニワトリとした。曝露後１４日間、各群のニワトリの罹患率および死亡率を毎日計算した。Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの観察された防御期間を表８に要約した。

表８は、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔが少なくとも４２ｄｐｉ続く１００％防御を提供することを示した。このデータは、Ｈ５Ｃｏｎ５ＭｕｔがＨＰＡＩ曝露に対する長期持続性の有効な防御を提供することを実証した。

（実施例１０）
異なる日齢のニワトリでの防御試験
ＨＰＡＩ曝露に対する異なる日齢のニワトリでのＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御をこの実施例でさらに試験した。

１～２群を、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを投与した免疫化群として設定し、３群を、ＨＰＡＩ曝露（１４０７９株）のみを実施した対照群として設定した。各群は１２羽のＳＰＦニワトリを含んでおり、実験を２回実施した。１群では、１日齢のニワトリに１用量（０．３ｍｌ）のＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物を皮下経路を介してワクチン接種した。２群では、１０日齢のニワトリに１用量（０．３ｍｌ）のＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物を皮下経路を介してワクチン接種した。２１ｄｐｉ後、１～３群のニワトリをそれぞれ１４０７９株に鼻腔内曝露した。曝露量は６Ｌｏｇ１０ＥＩＤ₅₀／２００μｌ／ニワトリとした。曝露後１４日間、各群のニワトリの罹患率および死亡率を毎日計算した。異なる日齢のニワトリでのＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの観察された防御を表９に要約した。

表９は、Ｈ５Ｃｏｎ５ＭｕｔがＨＰＡＩ曝露に対する１００％防御を１日齢ニワトリに提供することを示した。このデータは、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔが新生仔からでさえニワトリでの優れた防御を提供することを実証した。

（実施例１１）
異なる投与経路の防御試験
異なる投与経路を介したニワトリでのＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御をこの実施例でさらに試験した。
１～２群を、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを投与した免疫化群として設定し、３群を、ＨＰＡＩ曝露（１４０７９株）のみを実施した対照群として設定した。各群は１２羽の１０日齢ＳＰＦニワトリを含んでおり、実験を２回実施した。試験日（Ｄ０）に、１～２群のニワトリに皮下（Ｓ．Ｃ．）または筋肉内（Ｉ．Ｍ．）投与を介して１用量（０．３ｍｌ）のＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔを含む免疫原性組成物を皮下経路を介してワクチン接種した。２１ｄｐｉ後、１～３群のニワトリをそれぞれ１４０７９株に鼻腔内曝露した。曝露量は６Ｌｏｇ１０ＥＩＤ₅₀／２００μｌ／ニワトリとした。曝露後１４日間、各群のニワトリの罹患率および死亡率を毎日計算した。異なる投与経路を介したニワトリでのＨ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの観察された防御を表１０に要約した。

表１０は、Ｈ５Ｃｏｎ５ＭｕｔがＳ．Ｃ．経路とＩ．Ｍ．経路の両方を介してニワトリで優れた防御を提供し、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔの防御有効性はある特定の投与経路に限定されないことを示した。柔軟な投与方法により、Ｈ５Ｃｏｎ５Ｍｕｔがほとんど筋肉のない新生仔などの異なる発育状態のニワトリに適したものとなることが可能になった。

本明細書に開示および請求される組成物および方法の全てが、本開示に照らして、不要な実験をすることなく調製および実行することができる。本発明の組成物および方法は例示される実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物および方法および方法のステップまたはステップの順序に変化を適用できることが当業者に認識されよう。より具体的には、化学的と生理的の両方で関連するある特定の薬剤が本明細書に記載される薬剤に置換し得るが、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかなこのような類似の代替物および修正の全てが、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の中にあるとみなされる。

Claims (15)

1. 鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニンタンパク質を含む免疫原性組成物であって、前記ヘマグルチニンタンパク質が、
   （ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
   （ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列
   を含む免疫原性組成物。
2. 前記ヘマグルチニンタンパク質が細胞培養物に含有されており、前記細胞培養物が、請求項１に定義されるヘマグルチニンタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含有する細胞を培養することによって調製される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 前記核酸分子が配列番号１０または１１に示される、請求項２に記載の免疫原性組成物。
4. 前記発現ベクターがバキュロウイルスであり、前記細胞が昆虫細胞である、請求項２～３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
5. 前記細胞培養物が不活化ステップに供される、請求項２～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
6. 前記細胞培養物の一部または全部を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
7. アジュバントをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
8. 前記アジュバントが油中水型エマルジョンである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
9. 単回投与もしくは複数回投与で投与される；および／または
   皮下もしくは筋肉内投与される；および／または
   １日齢以降、７日齢以降、１０日齢以降、１５日齢以降もしくは２１日齢以降で動物に投与される、
   請求項１～８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
10. 鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
11. 鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎｘによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
12. 鳥インフルエンザＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
13. 免疫原性組成物の単回投与または複数回投与後に、鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
14. 免疫原性組成物の単回投与または複数回投与後に、鳥インフルエンザＨ５Ｎｘによって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
15. 免疫原性組成物の単回投与または複数回投与後に、鳥インフルエンザＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ６のうちの１つまたは複数によって引き起こされる感染症の予防および／または処置に有効である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。