JP2002541797A - 新規な組換えヘルペスウイルスおよび変異体ヘルペスウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、動物において活性な免疫を誘導するための方法および試薬を提供する。特に、本発明は、ヘルペスウイルスに対する免疫を誘導し得る外来ＤＮＡを有する組換えヘルペスウイルス、および／またはその外来ＤＮＡの供給源を提供する。本発明はまた、それらの欠失したゲノムの部分を有する変異体ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、鳥類ヘルペスウイルスのＵＬ５４．５オープンリーディングフレームまたはマレク病ウイルスのＵＬ４３オープンリーディングフレームにおいて、外来性ＤＮＡが導入されるか、またはゲノムの一部が欠失される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、動物のワクチン接種のためのウイルスベクターに関する。詳細には
、本発明は、外来ＤＮＡの導入のための遺伝子挿入部位を有するウイルスベクタ
ーに関する。

【０００２】 （発明の背景） マレク病は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起こされるニワトリの
リンパ球増殖性疾患である。ＭＤＶ（天然に存在するヘルペスウイルス）は、ニ
ワトリの嚢由来リンパ球および胸腺由来リンパ球に感染し、そして引き続き胸腺
由来リンパ球のリンパ腫を誘導し得る。ＭＤＶは、鳥類ヘルペスウイルスファミ
リーの１つの名称である。例えば、ＭＤＶ１は、ニワトリにおけるヘルペスウイ
ルスの病原性株であり、ＭＤＶ２は、ニワトリにおける自然に弱毒化されたヘル
ペスウイルス株であり、そしてＭＤＶ３は、シチメンチョウの非病原性ヘルペス
ウイルスである。

【０００３】 マレク病は、伝染病なので、特に大規模な飼育環境（例えば、養鶏業）におい
て、そのウイルスはニワトリの重要な病原体になっている。現在、マレク病は、
ふ卵の１７〜１９日目の胚または１日齢ニワトリ（ｏｎｅ−ｄａｙ−ｏｌｄ ｃ
ｈｉｃｋ）のワクチン接種によって制御される。

【０００４】 一般的に、動物ウイルスに対する組換えＤＮＡ技術の適用は、最近の歴史を有
する。操作されるべき第１のウイルスは、最も小さなゲノムを有するウイルスで
ある。例えば、パポバウイルスの場合において、これらのウイルスは、たいへん
小さく、そして多くの余分なＤＮＡを収容し得ないので、遺伝子工学におけるそ
れらの用途は、欠損レプリコンとしてであった。従って、これらのウイルスに由
来する外来ＤＮＡ配列発現は、野生型のヘルパーウイルスを必要とし、そして細
胞培養系に制限される。他方では、アデノウイルスについて、外来配列によって
置換され得る少量の非必須ＤＮＡが存在する。この技術はまた、鳥類のヘルペス
ウイルスにおけるヘルペスウイルスゲノムの部分に適用されている（Ｃｏｃｈｒ
ａｎらに対する米国特許第５，８５３，７３３号を参照のこと）。

【０００５】 ヘルペスウイルスへの遺伝子の欠失または挿入という実例が、組換えＤＮＡ技
術によって、ヘルペスウイルスゲノムを遺伝子的に操作することが可能であると
いうことを実証する。過去において、遺伝子を挿入するために使用されてきた方
法は、プラスミド内にクローン化されたウイルスＤＮＡと、同じ動物細胞内にト
ランスフェクトされた精製されたウイルスＤＮＡとの間の相同組換えを含む。し
かし、欠失の位置および外来ＤＮＡ配列の挿入のための部位を一般化し得る程度
が、これらのこれまでの研究から公知ではない。

【０００６】 鳥類のヘルペスウイルスにおける適切なＤＮＡ配列挿入部位の同定が、新たな
ワクチンの開発のために役立つ。しかし、（ｉ）適切なウイルスおよび（ｉｉ）
外来ＤＮＡ配列発現のためのベクターを作製するための挿入部位として使用する
ためのゲノムの特定部分の選択は、重要な課題をもたらす。詳細には、その挿入
部位は、ウイルスの生存可能な複製ならびに組織培養およびインビボにおけるそ
の作動のために非必須でなくてはならない。さらに、その挿入部位は、新たな遺
伝子材料を受容し得なければならないのと同時に、ウイルスが複製し続けること
を保証し得なければならない。

【０００７】 必要とされることは、新規なウイルスおよび新規なウイルスベクターの作製の
ための遺伝子挿入部位の同定である。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、ヘルペスウイルスゲノム内の部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含
む変異体および組換えヘルペスウイルスを提供する。１つの実施形態において、
その部位は、ウイルス複製のために非必須である。好ましい実施形態において、
外来ＤＮＡ配列は、組換えヘルペスウイルスおよびその発現物で感染された宿主
細胞において発現され得る。特に好ましい実施形態において、外来ＤＮＡ配列は
また、その外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。本発
明は、挿入または欠失のための特定部位に限定されない。１つの実施形態におい
て、欠失および／または挿入は、マレク病ウイルスのＵＬ５４．５オープンリー
ディングフレーム内に存在する。別の実施形態において、欠失および／または挿
入は、マレク病ウイルスのＵＬ４３オープンリーディングフレーム内に存在する
。好ましい実施形態において、挿入物は、１型マレク病ウイルスのゲノム内に存
在する。

【０００９】 挿入されたＤＮＡの特定の型に限定されないが、本発明の１つの実施形態にお
いて、ヘルペスウイルスゲノム内に挿入された外来ＤＮＡ配列はポリペプチドを
コードする。好ましくは、そのポリペプチドは、組換えヘルペスウイルスが導入
される動物に対して免疫原性である。好ましくは、この免疫原性ポリペプチドは
、抗体を産生するように動物を刺激する、１０個より多くのアミノ酸がペプチド
結合により連結された線状ポリマーである。好ましい実施形態において、この外
来ＤＮＡ配列はまた、検出マーカーをコードする。好ましくは、検出マーカーは
、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ−ガラクトシダーゼである。

【００１０】 好ましい実施形態において、この組換えヘルペスウイルスは、ニワトリ貧血ウ
イルス（ＣＡＶ）、伝染性ファルビキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）、マレク病ウ
イルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウ
イルス（ＩＬＴＶ）または伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、そのフラグメン
トおよび／または実質的に相同な配列に由来する免疫原性ポリペプチドをコード
する外来ＤＮＡ配列を含む。別の好ましい実施形態において、この外来ＤＮＡは
、サイトカインをコードする。本発明はまた、１つの抗原または複数の抗原をコ
ードする１つよりも多くの外来ＤＮＡ配列を有する組換えヘルペスウイルスを意
図する。

【００１１】 本発明の組換えヘルペスウイルスの外来ＤＮＡ配列が、伝染性ファルビキウス
病ウイルス（ＩＢＤＶ）由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、免疫原
性ポリペプチドが、ＩＢＶＤ、ＶＰ２、ＶＰ３もしくはＶＰ４タンパク質、その
フラグメントおよび／または実質的に相同な配列であることが好ましい。外来Ｄ
ＮＡ配列が、ＭＤＶ由来の免疫原性ポリペプチドをコードする場合、好ましくは
、その免疫原性ポリペプチドは、ＭＤＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、糖タンパク質
Ｄ（ｇＤ）、もしくは糖タンパク質Ａ（ｇＡ）、そのフラグメントおよび／また
は実質的に相同な配列である。

【００１２】 外来ＤＮＡ配列が、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来の免疫原性ポリ
ペプチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドは、ＮＤＶ融合（Ｆ）タンパ
ク質またはＮＤＶ血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、そのフラグメントおよ
び／または実質的に相同な配列であることが好ましい。

【００１３】 外来ＤＮＡ配列が、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）由来の免疫原性ポ
リペプチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドは、ＩＬＴＶ糖タンパク質
「Ｂ」（ｇＢ）、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、もしくはＩＬＴＶ糖タンパ
ク質Ｉ（ｇＩ）、そのフラグメントおよび／または実質的に相同な配列であるこ
とが好ましい。

【００１４】 外来ＤＮＡ配列が、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）由来の免疫原性ポリペ
プチドをコードする場合、免疫原性ポリペプチドは、ＩＢＶスパイクタンパク質
、ＩＢＶマトリックスタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、そのフラグメ
ントおよび／または実質的に相同な配列であることが好ましい。

【００１５】 挿入された外来ＤＮＡ配列の発現は、外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモ
ーターに制御され得る。好ましくは、そのプロモーターは、ヘルペスウイルスプ
ロモーターである。より好ましくは、そのプロモーターは、仮性狂犬病ウイルス
（ＰＲＶ）ｇＸプロモーター、ＭＤＶ ｇＢプロモーター、ＭＤＶ ｇＡプロモ
ーター、ＭＤＶ ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ
ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスウ
イルス（ＨＣＭＶ）最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーターお
よび／または実質的に相同な配列からなる群から選択される。

【００１６】 本発明は、ヘルペスウイルスゲノム内に外来ＤＮＡ配列を挿入することによっ
て組換えヘルペスウイルスを産生するための相同ベクターをさらに提供する。１
つの実施形態において、相同ベクターは、本質的に二本鎖外来ＤＮＡ配列からな
る二本鎖ＤＮＡ分子を含み、その外来ＤＮＡ配列の１つの末端において、ヘルペ
スウイルスゲノムの非必須部位の一方の側に位置するゲノムＤＮＡと相同である
二本鎖ＤＮＡを有し、そしてその外来ＤＮＡ配列のもう１つの末端において、同
じ部位のもう一方の側に位置するヘルペスウイルスゲノムＤＮＡ配列と相同であ
る二本鎖ＤＮＡを有する。そのような実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、１型
マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、３２１
２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメント内に存在するＤＮＡ配列と相
同であり得る。好ましくは、プロモーターに対応するＤＮＡ配列は、その外来Ｄ
ＮＡ配列の上流に位置し、その発現を制御する。同様に、外来ＤＮＡ配列は、免
疫原性ポリペプチドをコードすることが好ましい（例えば、上記のポリペプチド
）。

【００１７】 本発明の１つの実施形態において、二本鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ＭＤＶ
ヘルペスウイルスゲノムのＢａｍＨＩ「Ｂ」フラグメント内に存在するＤＮＡ配
列と相同である。好ましくは、その二本鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ヘルペス
ウイルスゲノムのＵＬ４３タンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ム内に存在するＤＮＡ配列と相同である。本発明の別の実施形態において、二本
鎖ヘルペスウイルスＤＮＡは、ヘルペスウイルスゲノムのＢａｍＨＩ「Ｍ」フラ
グメント内に存在するＤＮＡ配列と相同である。好ましくは、二本鎖ヘルペスウ
イルスＤＮＡは、ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ５４．５遺伝子コード領域内に
存在するＤＮＡ配列と相同である。

【００１８】 本発明は、免疫化に効果的な量の本発明の組換えヘルペスウイルスまたは変異
体ヘルペスウイルスおよび適切なキャリアを含むワクチンをさらに提供する。

【００１９】 本発明は、動物を免疫化する方法をさらに提供する。免疫化されるべき好まし
い動物は、ニワトリである。

【００２０】 本発明はまた、インビボにおいてニワトリを免疫化する方法を提供する。本発
明の目的のために、これは伝染性ファルビキウス病ウイルス、マレク病ウイルス
、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスまたは伝染性気管支炎
ウイルスに対して、ニワトリを免疫化することを含む。好ましくは、その方法は
、効果的に免疫化する本発明のワクチンの用量をニワトリに投与する工程を包含
する。そのワクチンは、当業者に周知の方法（例えば、筋肉内注射、皮下注射、
腹腔内注射または静脈内注射による）のいずれかによって投与され得る。あるい
は、そのワクチンは、鼻腔内、経口または眼内的に投与され得る。

【００２１】 本発明はまた、本発明の組換えヘルペスウイルスで感染された宿主細胞を提供
する。好ましくは、その宿主細胞は、鳥類の細胞である。

【００２２】 （定義） 本発明の目的では、「宿主細胞」は、ベクターおよびその挿入物を増幅するた
めに使用される細胞である。この細胞の感染は、当業者に周知の方法（例えば、
以下のＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １１）に記載されるような方
法）によって達成され得る。

【００２３】 用語「動物」とは、動物界における生物のことをいう。従って、この用語は、
ヒトならびに他の生物を含む。好ましくは、この用語は、脊椎動物をいう。より
好ましくは、この用語は鳥類である動物をいう。

【００２４】 本発明の組換えヘルペスウイルスの「免疫化有効量」は、１０²〜１０⁹プラー
ク形成単位（ＰＦＵ）／用量の範囲内である。

【００２５】 本発明の目的では、「相同性ベクター」は、ヘルペスウイルスのゲノム上の特
定の部位において外来ＤＮＡ配列を挿入するために構築されたプラスミドである
。

【００２６】 「外来ＤＮＡ配列」は、組換え技術を使用して別のＤＮＡ分子に結合されてい
るか、または結合されるＤＮＡのセグメントであり、ここでこの特定のＤＮＡセ
グメントは、天然において他のＤＮＡ分子に関連して見出されていない。このよ
うな外来ＤＮＡの供給源は、このＤＮＡが配置される生物とは、別の生物由来で
あってもよいし、そうでなくてもよい。この外来ＤＮＡはまた、ネイティブ遺伝
子とは異なるコドンを有する合成配列であり得る。組換え技術の例としては、Ｄ
ＮＡを繋ぎ合わせるための制限酵素およびリガーゼの使用が挙げられるが、これ
らに限定されない。

【００２７】 「挿入部位」は、ＤＮＡ分子における、外来ＤＮＡが挿入され得る制限部位で
ある。

【００２８】 「複製可能ウイルス」は、野生型のこの生物において見出されているように、
遺伝物質にウイルスの複製のために必要なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の全てが
含まれるウイルスである。従って、複製可能ウイルスは、複製をするためにウイ
ルスで欠損しているものまたはウイルスから欠けているものを補充する第２のウ
イルスも細胞株も必要としない。「ヘルペスウイルスゲノムにおける非必須部位
」は、ヘルペスウイルスゲノムにおいて、その領域のポリペプチド産物が、ウイ
ルスの感染にも複製にも必要ではない領域を意味する。

【００２９】 「ベクター」は、別のＤＮＡ配列が、結合したＤＮＡ配列の発現を達成するよ
うに結合され得る、プラスミド、ファージ、コスミドまたはウイルスのようなレ
プリコンである。

【００３０】 「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、その正常な二本鎖ヘリックスにおけるデオキシリ
ボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形
態をいう。この用語は、この分子の一次構造および二次構造のみをいい、そして
任意の特定の３次形態には限定されない。従って、この用語は、直鎖状ＤＮＡ分
子において見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば、ウイルス、プラスミドおよび染色
体由来のＤＮＡの制限フラグメント）を含む。

【００３１】 ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれる場合、インビボ
で転写およびポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は
、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コ
ドンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ由
来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列
、ウイルスＤＮＡ、およびさらに合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定さ
れない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、コード配列に対して３
’に配置され得る。

【００３２】 「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼまたは補助タンパ
ク質を結合し得、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調
節領域である。本発明の定義の目的で、プロモーター配列は、コード配列の翻訳
開始コドン（ＡＴＧ）が３’末端に近接しており、そしてバックグラウンドより
も上で検出可能なレベルでの転写を容易にするのに必要な最少の塩基数またはエ
レメントを含むように上流（５’方向）に広がっている。プロモーター配列内に
は、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメ
イン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物プロモーターはしばしば（し
かし、いつもではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを
含み、これらは、多くの真核生物のプロモーター領域において見出されている保
存配列である。

【００３３】 ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーター配列と直接的または間接的に相互作用し
、そしてコード配列のｍＲＮＡへの転写を生じ、次いで、ｍＲＮＡが、そのコー
ド配列によってコードされるポリペプチドへと翻訳される場合、コード配列は、
細胞において制御配列に「作動可能に連結」されているかまたは制御配列の「制
御下」にある。

【００３４】 ２つのポリペプチド配列は、この分子の規定された長さにわたって少なくとも
約８０％（好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも
約９５％）のアミノ酸が一致する場合、「実質的に相同」である。

【００３５】 ２つのＤＮＡ配列は、これらが同一であるか、またはそのヌクレオチドの４０
％より多く、より好ましくは、そのヌクレオチドの約２０％より多く、そして最
も好ましくはそのヌクレオチドの約１０％より多くにおいて異ならない場合、「
実質的に相同」である。

【００３６】 外来ＤＮＡ配列がそのゲノムに挿入されているウイルスは、「組換えウイルス
」であるが、一方、そのゲノムの一部が故意の欠失（例えば、遺伝子操作）によ
って除去されているウイルスは、「変異ウイルス」である。

【００３７】 用語「ポリペプチド」は、その最も広い意味で使用される（すなわち、ペプチ
ド結合によって結合されたアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチド以上））。従
って、用語「ポリペプチド」としては、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク
質フラグメント、アナログ、ムテイン、融合タンパク質などが挙げられる。

【００３８】 「抗原性の」とは、１つ以上のエピトープを含む分子の、動物免疫系またはヒ
ト免疫系を刺激して体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答
を起こす能力をいう。「抗原」は、抗原性ポリペプチドである。

【００３９】 組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワク
チンに対する宿主における細胞媒介免疫応答および／または抗体媒介免疫応答の
発生である。通常、このような応答は、目的の組成物またはワクチンに含まれる
抗原に特異的に指向される抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞
、および／または細胞傷害性Ｔ細胞が被験体によって産生されることからなる。

【００４０】 用語「免疫原性ポリペプチド」および「免疫原性アミノ酸配列」とは、ウイル
ス感染性を中和する、および／または抗体補体依存性細胞傷害性もしくは抗体依
存性細胞傷害性を媒介して免疫された宿主の防御を与える抗体を惹起するそれぞ
れポリペプチドまたはアミノ酸配列をいう。本明細書中で使用される場合、「免
疫原性ポリペプチド」は、所望のタンパク質またはその免疫原性フラグメントの
全長（または全長に近い）配列を含む。

【００４１】 「免疫原性フラグメント」によって、１つ以上のエピトープを含み、従って、
ウイルス感染性を中和する、および／または抗体補体依存性細胞傷害性もしくは
抗体依存性細胞傷害性を媒介して免疫された宿主の防御を与えるポリペプチドの
フラグメントを意味する。このようなフラグメントは通常、少なくとも約５アミ
ノ酸長、そして好ましくは少なくとも約１０〜１５アミノ酸長である。このフラ
グメントの長さには、臨界的な上限はなく、このフラグメントは、タンパク質配
列のほぼ全長を含み得るか、または２つ以上の抗原のフラグメントを含む融合タ
ンパク質さえ含み得る。

【００４２】 「感染性の」によって、細胞へウイルスゲノムを送達する能力を有することを
意味する。

【００４３】 用語「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、発現される場合
、特定の遺伝子についての、完全タンパク質および特定のポリペプチド鎖タンパ
ク質を産生し得る遺伝子コード領域として定義される。

【００４４】 用語「鳥類ヘルペスウイルス」は、鳥類宿主において複製し得、かつ他の宿主
動物において自然には複製しない、ヘルペスウイルスを意味する。

【００４５】 （発明の詳細な説明） この開示を通じて、種々の刊行物、特許および特許出願を参考とした。これら
の刊行物、特許および特許出願の開示は、本明細書中で参考として援用される。

【００４６】 本発明の方法および組成物は、挿入、欠失、１つまたは複数の塩基の変化によ
って、種々の原核生物供給源および真核生物供給源由来のクローン化ＤＮＡ配列
を改変する工程、および引き続くこれらの改変した配列をヘルペスウイルスのゲ
ノムに挿入する工程を包含する。１つの例は、ヘルペスウイルスＤＮＡの一部を
細菌におけるプラスミドにクローニングする工程、ウイルスＤＮＡが特定の配列
の欠失を含むようにクローン化状態においてウイルスＤＮＡを再構築する工程、
および／またはその上、その欠失の代わりか、もしくはその欠失以外の部位かの
いずれかに外来ＤＮＡ配列を付加する工程を包含する。本発明の方法および組成
物としてはまた、変異ウイルスを産生する、ヘルペスウイルスのゲノムの一部の
欠失を含む。

【００４７】 一般的に、外来遺伝子構築物は、全ヘルペスウイルスゲノムの一部だけに相当
するヌクレオチド配列にクローン化される。このヌクレオチド配列は、１つ以上
の適切な欠失を有し得る。このキメラＤＮＡ配列は通常、この配列の複数コピー
を産生する好首尾なクローニングを可能にするプラスミド中する。次いで、この
クローン化された外来遺伝子構築物は、例えば、ＤＮＡ媒介同時トランスフェク
ション技術後のインビボ組換えによって完全ウイルスゲノムに含まれ得る。複数
のコピーのコード配列または１つより多くのコード配列は、組換えベクターが、
１つより多くの外来タンパク質を発現し得るように挿入され得る。外来遺伝子は
、付加、欠失または置換を有して、発現したタンパク質の発現および／または免
疫学的効果を増強し得る。

【００４８】 遺伝子の好首尾な発現を起こすために、遺伝子は、エンハンサーエレメントお
よびポリアデニル化配列を含む適切なプロモーターとともに発現ベクターに挿入
され得る。哺乳動物細胞における外来遺伝子の好首尾な発現を提供する多数の真
核生物プロモーターおよびポリアデニル化配列ならびに発現カセットを構築する
方法は、当該分野で、例えば、米国特許第５，１５１，２６７号において公知で
ある。このプロモーターは、免疫原性タンパク質の最適な発現を与えるように選
択され、この免疫原性タンパク質は、次に公知の基準に従って体液性免疫応答、
細胞媒介性免疫応答および粘膜免疫応答を満足に引き起こす。

【００４９】 組換えウイルス感染細胞におけるインビボ発現によって産生される外来タンパ
ク質は、それ自体が免疫原性であり得る。１つより多くの外来遺伝子をウイルス
ゲノムに挿入し、１つより多くの効果的なタンパク質の好首尾な産生が得られ得
る。

【００５０】 従って、変異ヘルペスウイルスの使用または外来ＤＮＡ配列のヘルペスウイル
スのゲノムへの付加の１つの有用性は、動物を予防接種することである。例えば
、変異ウイルスを動物に導入して、その変異ウイルスに対する免疫応答を誘発し
得る。

【００５１】 あるいは、ポリペプチドをコードするゲノムに挿入された外来ＤＮＡ配列を有
する組換えヘルペスウイルスはまた、動物において外来ＤＮＡ配列、外来ＤＮＡ
配列によってコードされるポリペプチド、および／またはヘルペスウイルスに対
する免疫応答を誘発することに作用し得る。このようなウイルスをまた使用して
、外来ＤＮＡおよびその産物を宿主動物に導入して、宿主動物における欠損ゲノ
ム状態を軽減し得る。これらの組換えヘルペスウイルスは、宿主動物において外
来ＤＮＡを保有し得るウイルスである場合、ウイルスベクターといわる。

【００５２】 本発明は、特定のヘルペスベクターの使用に限定されない。ウイルスベクター
としての使用のために適切な１つの鳥類ヘルペスウイルスはＭＤＶである。マレ
ク病に対するベクターおよびワクチンとしてＭＤＶを提供するために、ＭＤＶゲ
ノム内に、ウイルスの複製および機能のために必須でなく、かつその中にＭＤＶ
抗原をコードする１つ以上の内因性遺伝子を挿入して、コードされた抗原に対す
る免疫応答をさらに刺激し得る部位を配置することが望ましい。他方で、多価ワ
クチンとして使用するためのウイルスベクターまたは発現ベクターとしてのＭＤ
Ｖを提供するために、ＭＤＶゲノム内に、ウイルスの複製および機能のために必
須でなく、かつその中にＭＤＶ以外の家きん類病原体の抗原をコードする１つ以
上の内因性遺伝子を挿入して、ＭＤＶおよびこのような他の家きん類病原体に対
する免疫応答をさらに刺激し得る部位を配置することが望ましい。あるいは、内
因性遺伝子のコピーおよび内因性遺伝子のコピーの組み合わせは、このようなウ
イルスベクターの非必須的な領域に挿入され得る。

【００５３】 ＭＤＶゲノムが使用される場合、弱毒化１型ＭＤＶ株を使用することが好まし
い。Ｒｉｓｐｅｎｓ ＣＶＩ−９８８は、ＭＤＶの非常に有毒な株に対する防御
を提供するために使用され得る、弱毒化１血清型ＭＤＶワクチン株である。

【００５４】 このＭＤＶゲノムは、２つの独特な領域（独特な短い領域（ＵＳ）、および独
特な長い領域（ＵＬ））からなる直鎖状１８０ｋｂ塩基対の二本鎖分子である。
各々の独特な領域は、逆方向反復（ＵＬについては、長い末端反復（ＴＲＬ）お
よび内部の長い逆方向反復（ＩＲＬ）、そしてＵＳについては、短い内部の逆方
向反復（ＩＲＳ）および短い末端反復（ＴＲＳ））に隣接している。

【００５５】 本発明は、特定のＤＮＡ欠失部位および／またはＤＮＡ挿入部位に限定されな
いが、一方、鳥類ヘルペスウイルスのＵＬ４３領域およびＵＬ５４．５領域は、
欠失および挿入のために適切な部位を含むことが発見されている。例えば、鳥類
ヘルペスウイルスのＵＬ４３領域内、特にＭＤＶゲノム内にＸｈｏＩ部位が存在
する。ＵＬ５４領域およびＵＬ５５領域に隣接しているオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）もまた存在する。ＵＬ５４．５と称されるこのＯＲＦは、欠失
および挿入のために適切なＮｄｅＩ部位を含む。

【００５６】 詳細には、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に
含まれる３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩの部分フラグメントがある。Ｂ
ａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる３２１２塩基対のＳａｃＩ〜Ｂ
ｇｌＩＩの部分フラグメント内の好ましい欠失部位および／または挿入部位は、
ヘルペスウイルスＵＬ４３をコードするオープンリーディングフレーム内に位置
し、そしてそのオープンリーディングフレーム内の好ましい挿入部分は、Ｘｈｏ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位である。

【００５７】 同様に、欠失および／または挿入は、ヘルペスウイルスゲノムのＢａｍＨＩ「
Ｍ」ゲノムフラグメント内に位置され得る。ＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメン
ト内の好ましい挿入部位は、ヘルペスウイルスＵＬ５４．５をコードするオープ
ンリーディングフレーム内に位置し、そしてそのオープンリーディングフレーム
内の好ましい挿入部位は、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。特に好
ましい実施形態において、ＵＬ５４．５オープンリーディングフレームの産物は
、ウイルスの複製のために必須ではない。

【００５８】 種々の外来ＤＮＡ配列またはコード配列（ウイルス、原核生物、および真核生
物）を、本発明に従ってヘルペスウイルスヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）
において挿入して、特に広範の疾患に対する防御を提供し得る。そして多くのこ
のような遺伝子は、当該分野ですでに公知である。任意の特定の外来ＤＮＡ配列
に限定されないが、代表的には、目的の外来ＤＮＡ配列は、家きん産業に経済的
な影響を有する疾患を鳥類において引き起こす病原体由来である。この遺伝子は
、既存のワクチンが存在する生物由来であり得、そしてベクター化（ｖｅｃｔｏ
ｒｉｎｇ）技術の新規の利点のために、このヘルペスウイルス由来ワクチンは優
れている。また、目的の遺伝子は、現在ワクチンはないが、疾患の制御が必要と
されている病原体由来であり得る。代表的には、目的の遺伝子は、病原体の免疫
原性ポリペプチドをコードし、そして表面タンパク質、分泌タンパク質および構
造タンパク質を示し得る。

【００５９】 ヘルペスウイルスベクター化のための標的である関連鳥類病原体は、伝染性喉
頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）である。ＩＬＴＶは、ヘルペスウイルス科のメン
バーであり、そしてこの病原体は、呼吸低下、伝染性気管支炎および観血性滲出
液の喀出によって特徴付けられるニワトリの急性疾患を引き起こす。

【００６０】 ヘルペスウイルスベクター化アプローチの別の標的は、ニューカッスル病であ
る。ニューカッスル病は、高伝染性でかつ消耗性の感染性疾患であり、ニューカ
ッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって引き起こされる。ＮＤＶは、パラミクソウ
イルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＮＤＶの種々の病原型（短潜伏期性、
亜病原性、レント原性）は、この疾患の重篤度、特異性、および症状に関しては
異なるが、ほとんどの型は、呼吸系および神経系に感染するようである。ＮＤＶ
科は、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の鳥類種に感染する。

【００６１】 本発明はまた、生物由来の特定のＤＮＡ配列の使用には限定されない。しばし
ば、ヘルペスウイルスゲノムへの挿入のための外来ＤＮＡ配列の選択は、それが
コードするタンパク質に基づく。好ましくは、外来ＤＮＡ配列は、免疫原性ポリ
ペプチドをコードする。本発明のウイルス系によって発現される好ましい免疫原
性ポリペプチドは、抗原をコードする全長（または全長に近い）配列を含む。あ
るいは、免疫原性である（すなわち、１つ以上のエピトープをコードする）より
短い配列が使用され得る。より短い配列は、中和エピトープをコードし得、この
エピトープは、インビトロアッセイにおいてウイルス感染性を中和する抗体を誘
発し得るエピトープとして定義される。好ましくは、このペプチドは、宿主にお
いて防御免疫応答（すなわち、感染から免疫された宿主を保護する抗体媒介性免
疫応答および／または細胞媒介性免疫応答）を惹起し得る防御エピトープをコー
ドするべきである。いくつかの場合、特定の抗原の遺伝子は、多数のイントロン
を含み得るか、またはＲＮＡウイルス由来であり得、これらの場合、相補ＤＮＡ
コピー（ｃＤＮＡ）が、使用され得る。

【００６２】 野生型生物において見出されたような完全配列ではなく、遺伝子のヌクレオチ
ド配列のフラグメントのみを、使用し得ることも可能である（これらが、防御免
疫応答を生成するのに十分である場合）。入手可能である場合、合成遺伝子また
はそのフラグメントもまた、使用され得る。しかし、本発明は、広範な種々の遺
伝子、フラグメントなどを用いて使用され得、そして本明細書中に記載の遺伝子
、フラグメントなどには、限定されない。

【００６３】 従って、本発明において使用される外来ＤＮＡ配列によってコードされる抗原
は、ネイティブまたは組換えの免疫原性ポリペプチドまたはフラグメントのいず
れかであり得る。それらは、部分配列、全長配列、または融合体（例えば、組換
え宿主に適切なリーダー配列を有するか、または別の病原体についてのさらなる
抗原配列を有する）でさえあり得る。

【００６４】 好ましい実施形態において、本発明の変異ウイルスおよびウイルスベクターは
、複製可能である。このように、ヘルペスウイルスゲノムからの欠失および／ま
たはこのゲノムへの挿入は、ヘルペスウイルスの複製能力を破壊しない。しかし
、欠失および／または挿入が、ヘルペスウイルスの複製能力を破壊または十分に
阻害する場合、本発明は、本発明のヘルペスウイルスを含む発現カセットを構築
し、そしてこのカセットで宿主細胞を形質転換して欠失または破壊されたＤＮＡ
配列によってコードされるタンパク質を発現する細胞株または培養物を提供する
ことによる組換え細胞株の使用を包含する。

【００６５】 これらの組換え細胞株は、複製コンピテントではない組換えヘルペスウイルス
が、その組換えヘルペスウイルス内にコードされる所望の外来ＤＮＡ配列または
そのフラグメントを複製および発現可能にすることができる。これらの細胞株は
また、インビボ組換え、続くＤＮＡ媒介同時トランスフェクションによって組換
えヘルペスウイルスを作製することに非常に有用である。

【００６６】 本発明の方法および組成物がワクチン接種に使用される場合、任意の特定の投
与に制限されない。１つの例は、非経口投与である。非経口投与される場合、ワ
クチンはワクチンキャリアの使用を含み得る。ワクチンキャリアは、当該分野で
周知である：例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（Ｈ
ＡＳ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＨＬＨ）。好ましいキャリア
タンパク質であるロタウイスルＶＰ６は、欧州特許公開第０２５９１４９号に開
示される。

【００６７】 ワクチンはまた、腸溶性投薬形態のような適切な経口キャリア中で、経口投与
され得る。経口処方物としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラク
トース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウ
ム（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、炭酸マグネシ
ウムなどのような通常使用される賦形剤が挙げられる。経口ワクチン組成物は、
溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり得
、約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を
含む。経口ワクチンは、全身性免疫と組み合わせた粘膜免疫を惹起することに好
ましくあり得、これは、病原体の胃腸管感染に対する防御に重要な役割を果たす
。

【００６８】 さらに、ワクチンは坐剤へと処方される。坐剤に関して、ワクチン組成物はポ
リアルカリグリコールまたはトリグリセリドのような従来の結合剤およびキャリ
アを含む。そのような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約
１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。

【００６９】 本発明のワクチン組成物を動物に投与するためのプロトコールは、本開示を考
慮して当業者の範囲内である。当業者は、免疫原性フラグメントに対して抗体お
よび／またはＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するのに有効な用量でワクチン組成物
の濃度を選択する。広い範囲において、この投薬量は、重要であると考えられて
いない。

【００７０】 代表的に、ワクチン組成物は、好都合な体積のビヒクル（例えば、約１〜１０
ｃｃ）中にて約１から約１０００μｇの間のサブユニット抗原を送達する様式で
投与される。好ましくは、単一免疫における投薬量は、約１から約５００μｇの
サブユニット抗原、より好ましくは約５〜１０から約１００〜２００μｇ（例え
ば、５〜２００μｇ）のサブユニット抗原を送達する。

【００７１】 投与の時期もまた、重要であり得る。例えば、一次接種は、好ましくは、必要
な場合、後のブースター接種が続き得る。必要に応じてではあるが、二次のブー
スター免疫を、最初の免疫の数週間から数ヶ月間後に、動物に投与することもま
た、好ましくあり得る。疾患に対する高レベルの防御の維持を確実にするために
は、一定の間隔（例えば、数年毎に１回）で動物にブースター免疫を再投与する
ことが有益であり得る。あるいは、最初の用量は経口投与され、続いて後に接種
され得るか、またはその逆もあり得る。好ましいワクチン接種プロトコールは、
慣用的なワクチン接種プロトコールの実験を介して確立され得る。

【００７２】 本発明の組換えヘルペスウイルスはまた、本発明のワクチンによってワクチン
接種された動物を、天然に存在する野生型伝染性ヘルペスウイルスまたは他の病
原体によって感染された動物から区別する方法を提供し得る。これは、組換えヘ
ルペスウイルスが、対応する病原体に対する防御免疫を与えるのに必要である上
記のウイルス由来の限定数の抗原をコードする外来ＤＮＡを含むので、可能であ
る。結果的に、これらの組換えヘルペスウイルスを用いてワクチン接種された宿
主動物は、野生型伝染性ファルビキウス病ウイルス（ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａ
ｓｅ ｖｉｒｕｓ）、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉
頭気管炎ウイルスまたは伝染性気管支炎ウイルスによって感染された宿主動物か
ら、野生型ウイルスに通常存在する抗原が存在しないことによって、区別され得
る。さらに、ヘルペスウイルスベクターが、免疫原性ポリペプチドをコードする
そのゲノムの部分の欠失を含む場合、欠失された部分の産物に対してワクチン接
種された動物からの免疫応答が欠失することによって、ワクチン接種された動物
が示される。

【００７３】 本発明はまた、遺伝子欠損を制御するための遺伝子治療が必要である動物に、
遺伝子治療を提供するための方法を含み、この方法は、この動物に、生組換えヘ
ルペスウイルス（これは、非欠失形態の上記遺伝子をコードする外来ヌクレオチ
ド配列を含む）を、組換えウイルスベクターのゲノムが、上記の哺乳動物のゲノ
ム中に組み込まれるかまたは独立して染色体外的に保持されるかして、標的器官
または組織において目的の遺伝子の発現を与える条件下で、投与する工程を包含
する。

【００７４】 欠失遺伝子またはその部分を置換するためのこれらの種類の技術は、当業者に
よって使用される。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第５，３９９，３４
６号）は、遺伝子治療に関する技術を記載する。さらに、好都合な遺伝子治療に
使用するために組み込まれ得る、外来ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列またはその
部分の例としては、嚢胞性線維症膜貫通調節遺伝子（ＣＦＴＲ遺伝子（ｃｙｓｔ
ｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃ
ｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅ））、ヒトミニジストロフィン遺伝子、α−
抗トリプシン遺伝子などが挙げられる。

【００７５】 組換えヘルペスウイルスの構築、選択および精製に関する方法は、以下の実施
例に詳述される。以下の実施例は、特定の好ましい実施形態および本発明の局面
を示すために役立ち、本発明の範囲を制限するを解釈されるべきではない。

【００７６】 （実施例） （実施例１） （マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）ストックの調製） マレク病ウイルスストックサンプルは、２ｍＭグルタミン、１００ユニット／
ｍｌ ペニシリン、１００ユニット／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＨＡＭ’
Ｓ Ｆ１０および１９９培地の１：１混合物（これらの成分は、Ｓｉｇｍａまた
は同等の供給者から得、そしてこれより後は、完全ＤＭＥ培地として呼ぶ）（１
％ウシ胎仔血清を含む）中、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で組織培養細胞
を感染させることによって調製した。細胞変性効果が完了した後、培地および細
胞を回収し、そして細胞を、臨床遠心分離機中、３０００ｒｐｍ、５分間でペレ
ットにした。感染された細胞は、２０％ウシ胎仔血清、１０％ ＤＭＳＯを含む
完全培地中に再懸濁し、そして−７０℃で凍結保存した。

【００７７】 （実施例２） （マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）ＤＮＡの調製） マレク病ウイルスの全ての操作は、菌株ＧＡ５（ＡＴＣＣ ＃６２４）または
Ｒｉｓｐｅｎｓ ＣＶＩ−９８８（Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ｌａｂｓ）を用いて行っ
た。感染された細胞の細胞質からのＭＤＶウイルスＤＮＡの調製に関して、初代
ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の過剰増殖前に、広範な細胞変性効果が起こるに
十分なＭＯＩで感染させた。全てのインキュベーションは、５％ ＣＯ₂空気中
の加湿インキュベーターにおいて、３９℃で行った。最高のＤＮＡ収量は、最大
に感染されたが、不完全な細胞溶解を示す単層を収集することによって得た（代
表的に５〜７日）。感染された細胞は、細胞スクレーパを用いて培地中に細胞を
こすり取ることによって収集した。この細胞懸濁液を、ＧＳ−３ローター中、３
０００ｒｐｍ、１０分間、５℃で遠心分離した。

【００７８】 生じたペレットを、冷ＰＢＳ（２０ｍｌ／ローターボトル）中に再懸濁し、そ
して冷やしながら３０００ｒｐｍで１０分間さらに遠心分離に供した。ＰＢＳを
デカントした後、その細胞ペレットをＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）の４ｍｌ／ローター
ボトル中に再懸濁した。ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０；Ｓｉｇｍａ）を
、時々混合しながら０．５％の最終濃度までサンプルに添加した。そのサンプル
を、冷やしながら１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、核をペレットにし、
そして細胞の細片を除去した。上清の流体を注意深く１５ｍｌのＣｏｒｅｘ遠心
分離チューブに移した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ ｐＨ ８．０）およびＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム；２０％保存）の両方を、それぞれ、最終濃度が５ｍＭお
よび１％までサンプルに添加した。１００μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（１０ｍｇ
／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をサンプル４ｍｌ当たりに
添加し、混合し、そして４５℃で１〜２時間インキュベートした。この期間の後
、等量の飽和フェノールをサンプルに添加し、そして手で穏やかに混合した。こ
のサンプルを臨床遠心分離機中、５分間、３０００ｒｐｍで回転させ、相を分離
させた。酢酸ナトリウム（保存溶液は３Ｍ ｐＨ５．２）を０．３Ｍの最終濃度
で水相に添加し、そして核酸を２．５容量の冷無水エタノールを添加した後に−
７０℃で３０分間沈澱させた。サンプル中のＤＮＡは、ＨＢ−４ローター中５℃
で、２０分間、８０００ｒｐｍで回転させることによってペレットにした。上清
を注意深く除去し、そしてＤＮＡペレットを２５ｍｌの８０％エタノールを用い
て１回洗浄した。ＤＮＡペレットを真空によって簡単に乾燥させ（２〜３分間）
、そして５０μｌ／感染された細胞のローターボトルのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。代表的には、ウイ
ルスＤＮＡの収量は、５〜１０μｇ／感染された細胞のローターボトルの間の範
囲であった。全てのウイルスＤＮＡは、約１０℃で保存した。

【００７９】 （実施例３） （ＤＮＡ配列決定） ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよ
びＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；
製造者らの指示書に従って）を用いた蛍光標識ジデオキシ配列決定反応をし、そ
して製造者らの指示書に従ってＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシークエンサーＭｏｄｅｌ ３７３Ａ上で電気泳
動することによって、実施した。ｄＧＴＰ混合物およびｄＩＴＰ混合物の両方を
用いた反応を、圧縮の領域を明確にするために実施した。あるいは、圧縮領域は
、ホルムアミドゲル上で分離させた。テンプレートは、二本鎖プラスミドサブク
ローンまたは一本鎖Ｍ１３サブクローンであり、そしてプライマーは、配列決定
される挿入物のちょうど外側のベクターか、または以前に得られた配列のいずれ
かに対して作製した。得られた配列を集め、そしてＤＮＡＳｔａｒソフトウェア
を用いて比較した。

【００８０】 （実施例４） （分子生物学的技術） 細菌およびＤＮＡの操作に関する技術（制限エンドヌクレアーゼを用いた消化
、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼを用いたリン酸化、
ホスファターゼを用いた処理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡを用いた細菌の形質転
換、および他の分子生物学的方法のような手順を含む）は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９
８９およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ’ｓ，Ｉｎｃ．
によって記載される。記載される以外、これらは、少し改変して使用した。

【００８１】 （実施例５） （ポリメラーゼフィルイン反応） ＤＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂および４００μＭの４つのデオキシヌクレオチド各々を含む緩衝液中
に再懸濁した。１０ユニットのＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を
添加し、そして反応を１５分間室温で進行させた。次いで、このＤＮＡをフェノ
ール抽出し、そして上記のようにエタノール沈殿した。

【００８２】 （実施例６） （ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング） ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、種々のＤＮＡの操作に簡便な制
限部位を導入した。使用した手順は、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ、８４−９１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，１９９０）によって記載される。一般的に、増幅されたフラグメン
トは、サイズが５００塩基対未満であり、そして増幅されたフラグメントの重要
な領域は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。各場合に使用したプライマーは、
以下の相同性ベクターの構築の説明に詳述する。

【００８３】 （実施例７） （感染された細胞の溶解物の調製） ２５ｃｍ²フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿中の、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
）ニワトリ胚線維芽細胞のコンフルエントな単層を、１００μｌのウイルスサン
プルを用いて感染させた。細胞変性効果が完全になった後、培地および細胞を収
集し、そして細胞を、臨床遠心分離機中、３０００ｒｐｍ、５分間でペレットに
した。この細胞ペレットを２５０μｌの破壊緩衝液（２％ ドデシル硫酸ナトリ
ウム、２％ β−メルカプトエタノール）中に、再懸濁した。このサンプルを、
氷上で３０秒間超音波処理し、そして−２０℃で保存した。

【００８４】 （実施例８） （ウエスタンブロット手順） 溶解物のサンプルおよびタンパク質標準物質を、Ｌａｅｍｎｌｉ，Ｕ．Ｋ．（
１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：６８０の手順に従ってポリアクリルアミドゲ
ル上で泳動した。ゲルを電気泳動した後、このタンパク質を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（１９８９）に従って、トランスファーし、そして処理した。一次抗体は、Ｔ
ｒｉｓ−塩化ナトリウムおよびアジ化ナトリウム（ＴＳＡ：１ｌのＨ₂Ｏ当たり
６．６１ｇ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．９７ｇ Ｔｒｉｓ塩基、９．０ｇＮａＣｌ
および２．０ｇ アジ化ナトリウム）中の５％脱脂粉乳を用いて１：１００希釈
した。二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合体化し、そしてＴＳＡを用いて
１：１０００希釈した。

【００８５】 （実施例９） （ｃＤＮＡクローニング手順） ｃＤＮＡクローニングとは、最新技術の手順に従ってＲＮＡ分子をＤＮＡ分子
に変換するために使用される方法をいう。出願人の方法は、（Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ
およびＢ．Ｊ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ ２５，２６３−２６９）に記載され
る。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、出願人によって使用された手順と非常に類似
し、そして我々の結果の再現に使用され得る試薬および手順のセットを含むｃＤ
ＮＡクローニングキットを設計した。

【００８６】 ウイルスｍＲＮＡ種のクローニングに関して、ウイルスによる感染に感受性な
宿主細胞株を、細胞当たり５〜１０プラーク形成単位で感染させた。細胞変性効
果が明白な場合であるが全て破壊する前に、培地を除去し、そして細胞を１０ｍ
ｌの溶解緩衝液（４Ｍ グアニジンチオシアネート、０．１％ アンチフォーム
Ａ（ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ７．０、０
．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１Ｍ β−メルカプトエタノール）中に溶
解した。細胞溶解物を滅菌したＤｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーに注ぎ、そして溶
液が均質になるまで、氷上で８〜１０分間ホモジナイズした。ＲＮＡ精製に関し
て、８ｍｌの細胞溶解液を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１遠心分離チューブ中、３
．５ｍｌのＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム
ｐＨ７．０）上に穏やかに重層した。サンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１
ローター中、２０℃で３６０００ｒｐｍ、１８時間遠心分離した。このチューブ
を氷上に置き、そしてチューブからの上清を注意深く吸引によって除去し、ＲＮ
Ａペレットを乱さないようにした。ペレットを４００μｌのガラス蒸留水中に再
懸濁し、そして２．６ｍｌのグアニジン溶液（７．５Ｍ グアニジン−ＨＣＬ、
２５ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ７．０、５ｍＭ ジチオトレイトール）に
添加した。０．３７容量の１Ｍ酢酸を添加し、続いて０．７５容量の冷エタノー
ルを添加し、そしてサンプルを−２０℃に１８時間置いてＲＮＡを沈澱させた。
沈澱物は、ＳＳ３４ローター中、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機で１０分間、４℃、
１００００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。そのペレットを１．０
ｍｌの滅菌水に溶解し、１３０００ｒｐｍで再び遠心分離し、そして上清を保存
した。ＲＮＡをそのペレットから上記のように０．５ｍｌの滅菌水を用いてさら
に２回再抽出し、そして、上清をプールした。０．１容量の２Ｍ 酢酸カリウム
溶液をサンプルに添加し、続いて２倍の冷エタノールを添加し、そしてサンプル
を−２０℃で１８時間置いた。沈澱したＲＮＡをＳＳ３４ローター中、４０℃、
１０分間、１００００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。そのペレッ
トを１ｍｌの滅菌水に溶解し、そして濃度は、Ａ２６０／２８０の吸収によって
得た。このＲＮＡは、−７０℃で保存した。

【００８７】 ポリアデニル化テイル（ｐｏｌｙ−Ａ）を含むｍＲＮＡを、オリゴｄＴセルロ
ース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＃２７ ５５４３−０）を用いて選択した。３ｍｇの
総ＲＮＡを煮沸し、そして冷却し、結合緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７
．５、０．５Ｍ ＬｉＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０、０．１％ ドデ
シル硫酸リチウム）中、１００ｍｇオリゴｄＴセルロースカラムに適用した。保
持されたポリ−Ａ ＲＮＡを、溶出緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、
１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて
カラムから溶出した。このｍＲＮＡを結合緩衝液中、オリゴｄＴカラムに再び適
用し、そして溶出緩衝液を用いて再び溶出した。このサンプルを２００ｍＭ酢酸
ナトリウムおよび２容量の冷エタノールを用いて−２０℃、１８時間で沈澱させ
た。このＲＮＡは、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。

【００８８】 １０μｇのポリ−Ａ ＲＮＡを、２０ｍＭの水酸化メチル水銀中、６分間、２
２℃で変性させた。β−メルカプトエタノールを７５ｍＭまで添加し、そしてそ
のサンプルを５分間、２２℃でインキュベートした。第１鎖のｃＤＮＡ合成のた
めの０．２５ｍｌの反応混合物は、１μｇ オリゴ−ｄＴプライマー（Ｐ−Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）もしくは１μｇの合成プライマー、２８ユニットの
胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｓ ＃５５１８ＳＡ）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、１４０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．８ｍＭ ＤＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰお
よびｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１００マイクロキューリーの³²Ｐ−標識
ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ＃ＮＥＧ−０１３Ｈ）な
らびに１８０ユニットのＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ＃ＭＧ １０１）を含んだ。こ
の反応液を４２℃で９０分間インキュベートし、次いで２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ８．０を用いて終了させた。このサンプルを、等量のフェノール／クロロホル
ム（１：１）を用いて抽出し、そして２Ｍ 酢酸アンモニウムおよび２容量の冷
エタノールを用いて−２０℃、３時間で沈澱させた。沈澱および遠心分離後、こ
のペレットを１００μｌの滅菌水に溶解した。サンプルを、緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）中、１５ｍｌ Ｇ−１００ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）上にロードした。抽出されたＤＮＡ画分の立ち上がり（ｌｅａｄｉｎｇ
ｅｄｇｅ）をプールし、そしてＤＮＡを、体積が約１００μｌになるまで凍結乾
燥することによって濃縮し、次いでＤＮＡを上記のように酢酸アンモニウムおよ
びエタノールを用いて沈澱させた。

【００８９】 第１鎖のサンプル全体を、５０μｇ／ｍｌ ｄＮＴＰ、５．４ユニットのＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＃６４２−７１
１）、および１００ユニット／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃２０５）（総体積 ５０μｌ）を使用する
以外はＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（前出）の方法に従う、第２鎖反応に
使用した。第２鎖合成の後、そのｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、
そして沈澱させた。ＤＮＡを１０μｌの滅菌水に再懸濁し、１μｇ ＲＮａｓｅ
Ａを用いて１０分間、２２℃で処理し、そして４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテー
ト ｐＨ ６．８５中、アガロースゲル（シグマ Ｔｙｐｅ ＩＩアガロース）
を介して電気泳動させた。そのゲルをエチジウムブロマイドを用いて染色し、そ
して予想のサイズの範囲のＤＮＡをゲルから切除し、そして８ｍＭ Ｔｒｉｓ−
アセテート ｐＨ ６．８５中で電気溶出した。電気溶出したＤＮＡを約１００
μｌまで凍結乾燥し、そして酢酸アンモニウムおよびエタノールを用いて上記の
ように沈澱させた。このＤＮＡを２０μｌの水に再懸濁した。

【００９０】 オリゴｄＣテールを、クローニングを容易にするために、そのＤＮＡに付加し
た。この反応は、そのＤＮＡ、１００ｍＭカコジル酸カルシウム（ｐＨ７．２）
、０．２ｍＭ ジチオスレイトール、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、８０μｍｏｌ ｄＣ
ＴＰ、および２５単位の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ＃Ｓ１００１）を、５
０μｌ中に含んだ。３７℃で３０分後、この反応を１０ｍＭ ＥＤＴＡで終了さ
せ、そしてそのサンプルを、上記のようにフェノール／クロロホルム抽出し、そ
して沈殿させた。

【００９１】 ｄＣテール化ＤＮＡサンプルを、２００μｌの０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７
．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中で、オリゴｄＧテ
ール（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ＃５３５５ ＳＡ／Ｓ
Ｂ）を含む２００ｎｇのプラスミドベクターｐＢＲ３２２に、６５℃で２分間、
次いで５７℃で２時間、アニーリングさせた。Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６６、５５７〜５８０、１９８３により記載され
るように、新鮮なコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ−１細胞を調製し、そして２
００μｌの細胞アリコート２０個においてこのアニールしたｃＤＮＡサンプルの
半分を使用して、形質転換した。形質転換した細胞を、１０μｇ／ｍｌテトラサ
イクリンを含むＬブロス寒天プレート上に配置した。コロニーを、Ａｍｐｓｃｒ
ｅｅｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ＃５５３７ ＵＡ）
を使用して、アンピシリン遺伝子へのインサートの存在についてスクリーニング
し、そして陽性コロニーを分析用に拾った。

【００９２】 （実施例１０） （組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション） この方法は、以下の改変を加えた、ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ、Ｍ
ｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２〜１１７４（１９８４）のポ
リブレン−ＤＭＳＯ手順に基づく。組換えＭＤＶウイルスの生成は、ＭＤＶウイ
ルスＤＮＡと、適切なヘルペスウイルスのクローン配列が隣接する所望の外来Ｄ
ＮＡを含むプラスミド相同性ベクターとの間の、相同組換えに依存する。トラン
スフェクションを、５０％コンフルエントな一次ニワトリ胚線維芽（ＣＦＦ）細
胞の６ｃｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｐｌａｓｔｉｃ）にて実行した。この細
胞は、４μｇ／ｍｌポリブレン（１×ＨＢＳＳ中４ｍｇ／ｍｌのストック）を含
む、ＣＥＦ増殖培地（１×Ｆ１０／１９９、５％ウシ胎仔血清、２％グルタミン
、１％非必須アミノ酸、および２％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に前日
に配置した。ＣＥＦ細胞への同時トランスフェクションのために、５μｇのイン
タクトＭＤＶ ＤＮＡを、３０μｇ／ｍｌポリブレン（１×ＨＢＳＳ中４ｍｇ／
ｍｌのストック）を含む１ｍｌのＣＥＦ培地中に懸濁した。次いで、このＤＮＡ
−ポリブレン懸濁物（１ｍｌ）を、培地を吸引したＣＥＦ細胞の６ｃｍプレート
に添加し、そして３９℃で３０分間インキュベートした。このプレートをこの時
間の間周期的に揺り動かし、接種物を再分布させた。この期間の後、４ｍｌのＣ
ＥＦ増殖培地を、プレートを洗浄するために直接添加し、そして３９℃でさらに
２．５時間インキュベートした。この時点で、この培地を各プレートから除去し
、そして細胞に、１×ＨＢＳＳ中３０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｊ
．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ
Ｊ）２ｍｌを用いて、室温で４分間ショックを与えた。この３０％ ＤＭＳＯを
注意深く除去し、そして単層を、室温にて、１×ＨＢＳＳで１回洗浄した。次い
で、細胞に、５ｍｌのＣＥＦ増殖培地を添加した後、３９℃でこの細胞をインキ
ュベートした。翌日、培地を交換して、ＤＭＳＯの最後の残渣まで取り除き、そ
して細胞増殖を刺激した。ウイルスからの細胞変性効果は、６日間以内に明らか
になる。高力価ストック（８０％〜９０％ ＣＰＥ）の生成は、通常は、この日
から１週間以内に行い得る。ＭＤＶストックサンプルを、２０％ウシ胎仔血清、
１０％ ＤＭＳＯを含むＣＥＦ増殖培地中に感染した細胞を再懸濁することによ
って調製し、そして−７０℃にて貯蔵した。

【００９３】 （実施例１１） （β−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリ
ーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＣアッセイ）またはβ−グルクロニダー
ゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃ
アッセイ）） Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組換えウ
イルスに組み込んだ場合、その組換え体を含むプラークを、簡単な２つの方法の
うちの１つにより視覚化した。第１の方法において、化学物質Ｂｌｕｏｇａｌ^TM （Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍ
Ｄ）を、プラークアッセイの間にアガロース重層物に組み込んだ（２００μｇ／
ｍｌ）。そして活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークは、青色に変化
した。次いで、この青色プラークを新鮮なＣＥＦ細胞へと拾い、そしてさらなる
青色プラーク単離により精製した。第２の方法において、ＣＰＲＧ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、プラークアッセイの間にアガロース重層物
に組み込んだ（４００μｇ／ｍｌ）。活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプ
ラークは、赤色に変化した。次いで、この赤いプラークを新鮮なＣＥＦ細胞へと
拾い、そしてさらなる赤色プラーク単離によって精製した。両方の場合において
、代表的には、ウイルスを、３回〜４回のプラーク精製により精製した。

【００９４】 Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子を組換えウ
イルスに組み込んだ場合、この組換えウイルスを含むプラークを、発色性基質Ｘ
−β−Ｄ−ｇｌｕＵＡ ＣＨＸ（Ｘ−ＧＬＵＣ；５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩；Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈ ＡＧ；Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、プラークアッセイの間にアガ
ロース重層物に組み込んだ（２００μｇ／ｍｌ）。そして活性なβ−グルクロニ
ダーゼを発現するプラークは、青色に変化した。次いで、その青色プラークを新
鮮なＣＥＦ細胞へと拾い、そしてさらなる青色プラーク単離によって精製した。

【００９５】 （実施例１２） （黒色プラークアッセイを使用する、組換えマレク病ウイルスにおける外来Ｄ
ＮＡ配列発現についてのスクリーニング） 組換えＭＤＶウイルスにより発現される外来抗原の発現を分析するために、Ｃ
ＥＦ細胞の単層を組換えＭＤＶに感染させ、栄養アガロース培地を重層し、そし
て３９℃で４〜５日間インキュベートする。一旦プラークが発色すると、アガロ
ース重層物をディッシュから除去し、単層を１×ＰＢＳでリンスし、室温で１０
分間１００％メタノールで固定し、そして細胞を風乾する。プレートをＰＢＳで
再水和した後、一次抗体を適切な希釈物までＰＢＳで希釈し、そして室温にて２
時間〜一晩、細胞単層とともにインキュベートする。次いで、非結合抗体を、Ｐ
ＢＳによる室温にて３回の洗浄によって細胞から除去する。アルカリホスファタ
ーゼ結合体化二次抗体をＰＢＳで希釈し、そして室温にて２時間細胞とともにイ
ンキュベートする。次いで、非結合二次抗体を、室温にてＰＢＳを用いて３回細
胞を洗浄することによって除去する。次いで、単層を発色緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中でリン
スし、次いで、新たに調製した基質溶液（発色緩衝液中、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｎ
ｉｔｒｏ Ｂｌｕｅテトラゾリウム＋０．１５ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルホスファターゼ）とともに、１０分間〜一晩、室温でイン
キュベートする。最後に、反応を、基質溶液をＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７．５／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に置換することによって停止する。正しい抗原を発
現するプラークは、黒色に染まる。

【００９６】 （実施例１３） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ５４．５に外来
ＤＮＡを挿入されたプラスミド） プラスミド４４０−２９．２を、１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）に外来
ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。このプラスミドは、１型マレク病ウイ
ルスの、約２５９６塩基対のＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメント（配列番号１
）を含む。このＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグメント中の３つのオープンリーディング
フレームは、ＵＬ５４（ＩＣＰ２７）ＯＲＦ（配列番号１の１位〜１３５３位）
、以前に未同定であったＯＲＦ（従ってＵＬ５４．５と名付けた）（配列番号１
の２１８７位〜１４８３位）およびＵＬ５５（配列番号１の２４５９位〜２５９
３位）のヘルペスウイルスホモログである（表１および表２を参照のこと）。Ｍ
ＤＶ−１ ＵＬ５４（ＩＣＰ２７）遺伝子に広がるＤＮＡ配列（１４９２塩基対
）は、公開されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４年１０月；２０４（１）：
２４２〜５０）。ＭＤＶ ＩＣＰ２７（ＨＳＶ−１ ＩＣＰ２７に対する有意な
類似性に基づく）は、１４１９ヌクレオチド長であり、かつ４７３アミノ酸（５
４．５ｋＤａ）をコードする。ＵＬ５５ ＯＲＦは短縮型であり、そしてこのタ
ンパク質の最初の４９アミノ酸のみしか含まない。ＵＬ５とＵＬ５５との間に位
置する潜在的ＯＲＦを同定した。このＯＲＦは、７０５塩基対長であり、そして
おそらく、サイズが２３５アミノ酸のタンパク質をコードする。このＵＬ５４．
５アミノ酸配列を使用してのタンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索によって
、ＭＤＶ−２中に類似の遺伝子を同定した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４年５月
１５日；２０１（１）：１４２〜６）。このＭＤＶ−２遺伝子が、１型ウマヘル
ペスウイルスの第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ−１）と低い相同
性を共有することが注目された。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ５４．
５タンパク質の類似性指標は、１７０アミノ酸のコンセンサス長にわたって、６
３％である。ＵＬ５４．５は、ＵＬ５４およびＵＬ５５に対して、反対の方向で
転写される。

【００９７】 ＵＬ５４．５ ＯＲＦは、非必須であり、そしてこのＯＲＦ中またはこれらの
ＯＲＦ間の遺伝子間領域に、外来ＤＮＡが挿入される。この領域中のすべての制
限部位が、外来ＤＮＡのための挿入部位として有用である。唯一ではないこの領
域中の制限酵素部位は、その部位を唯一の制限酵素認識配列へと変換するＤＮＡ
リンカーの挿入によって変更する。好ましくは、外来ＤＮＡの挿入のために使用
する制限酵素部位は、この２５９６塩基対のＢａｍＨＩ「Ｍ」ゲノムフラグメン
ト中約ヌクレオチド２５９６にある、ＮｄｅＩ部位である。この挿入部位は、Ｕ
Ｌ５４．５ ＯＲＦ中で、このオープンリーディングフレームのアミノ酸４とア
ミノ酸５との間にある。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）の約３０４５塩基対のＢａｍＨＩ制限フラグメントに由来した。フラグメン
ト１は、１型マレク病ウイルスの約２５９６塩基対の、ＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグ
メントである。プラスミド４４０−２９．２を使用して、組換えマレク病ウイル
ス中への外来ＤＮＡの挿入のための相同性ベクターを作製した。

【００９８】 （実施例１４） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ５４．５に伝染
性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡが挿入されたプラスミド） プラスミド９８０−８５．１を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）
中に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。このプラスミドは、ＭＤＶ−
１ ＤＮＡが隣接する、ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子、ならびに
Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組み込む。
これらの遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換した唯
一のＮｄｅＩ部位に挿入した。この外来ＤＡＮ配列の上流は、ＭＤＶ ＤＮＡの
約４２２塩基対フラグメントである。この外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ Ｄ
ＮＡの約２１７４塩基対フラグメントである。ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子および
ｇＩ遺伝子ならびにＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー
遺伝子の転写の方向は、ＭＤＶのＵＬ５４ ＯＲＦおよびＵＬ５５ ＯＲＦの転
写の方向と反対である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイルスを生成する
ためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）、ならびにβ−ガラクトシダ
ーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｂｌｕｏｇ
ａｌおよびＣＰＲＣアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマ
レク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１
１）に従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルス
が生じる。ＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、それらの遺伝子自身の各
内因性ＩＬＴＶプロモーターからの重複転写物として発現され、そしてそれらの
自身の内因性ポリアデニル化シグナルを共有し、そしてＥ．ｃｏｌｉ β−ガラ
クトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、ＰＲＶ ｇＸプロモーターから転
写され、それにＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。

【００９９】 プラスミド９８０−８５．１を、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、以下の
供給源由来の制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築
した。ＩＬＴ ｇＤ、ｇＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａ
ｃＺ）マーカー遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換
した唯一のＮｄｅＩ部位に、相同性ベクター４４０−２９．２へのカセットとし
て挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）の約３
０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。フラグメント１は
、ＭＤＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメントＭの、約４１８塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｎ
ｄｅＩ制限サブフラグメントである。フラグメント２は、ＩＬＴ Ａｓｐ ７１
８１ゲノムフラグメント＃８（１０．６ｋｂ）の、約３５５６塩基対のＳａｌＩ
〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント３は、ＰＲＶ Ｂ
ａｍＨＩ制限フラグメント＃１０の、約４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制
限サブフラグメントである。フラグメント４は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１
）の、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限サブフラグメントである
。フラグメント５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩゲノムフラグメント＃７の、約７５４
塩基対のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント６は、
ＭＤＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメントＭの、約２１７４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｂａ
ｍＨＩ制限サブフラグメントである。

【０１００】 （実施例１５） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ５４．５にニュ
ーカッスル病ウイルスＤＮＡが挿入されたプラスミド） プラスミド９８０−４６．７４を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１
）中に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。このプラスミドは、ＭＤＶ ＤＮＡが隣接する、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカ
ー遺伝子ならびにニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆ遺伝子を組み込む。Ｅ
．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子ならびにＮＤＶ Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換した唯一の
ＮｄｅＩ部位に、相同性ベクター４４０−２９．２（実施例１３）へのカセット
として挿入した。

【０１０１】 この外来ＤＡＮ配列の上流は、ＭＤＶ ＤＮＡの約４２２塩基対フラグメント
である。この外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ ＤＮＡの約２１７４塩基対フラ
グメントである。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺
伝子ならびにＮＤＶ Ｆ遺伝子の転写の方向は、ＭＤＶのＵＬ５４ ＯＲＦおよ
びＵＬ５５ ＯＲＦの転写の方向と反対である。このプラスミドを、組換えマレ
ク病ウイルスを生成するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）、な
らびにβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスク
リーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＣアッセイ）またはβ−グルクロニダ
ーゼを発現する組換えマレク病ウイルスについてのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕ
ｃアッセイ）（実施例１１）に従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードす
るＤＮＡを含むウイルスが生じる。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ最初期プロモ
ーターの制御下にあり、それにＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルが続く。Ｅ
．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、ＰＲＶ ｇ
Ｘプロモーターから転写され、ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。

【０１０２】 プラスミド９８０−８５．１を、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、以下の
供給源由来の制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築
した。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子ならび
にＮＤＶ Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位へと変換し
た唯一のＮｄｅＩ部位に、相同性ベクター４４０−２９．２（実施例１３）への
カセットとして挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）の約３０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。フラ
グメント１は、ＭＤＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメントＭの、約４１８塩基対のＢ
ａｍＨＩ〜ＮｄｅＩ制限サブフラグメントである。フラグメント２は、ＰＲＶ
ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃１０の、約４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ
制限サブフラグメントである。フラグメント３は、プラスミドｐＪＦ７５１の、
約３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメントである。フラグメ
ント４は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７の、約７５４塩基対のＮｄ
ｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント５は、ＨＣＭＶゲノ
ムのＸｂａＩ Ｅフラグメントの、約１１９１塩基対のＰｓｔＩ〜ＡｖａＩＩ制
限サブフラグメントである。フラグメント６は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクロ
ーン（Ｂ１株）の、約１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラグメント
である。フラグメント７は、ＨＳＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱの、約７８
４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。最後のフラグメン
トは、ＭＤＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメント「Ｍ」の、約２１７４塩基対のＮｄ
ｅＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。

【０１０３】 （実施例１６） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入され
た外来ＤＮＡを有するプラスミド） プラスミド９６２−８０．１を、１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）中に外
来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。これは、１型マレク病ウイルスのＢ
ａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ３２１２塩基対のＳａ
ｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメント（配列番号２）を含む。３２１２塩基対のＳ
ａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメント内の３つのオープンリーディングフレーム
は、ＵＬ４２ ＯＲＦ（配列番号２の３５位〜１１４４位）、ＵＬ４３（配列番
号２の１３０４位〜２５６６位）、およびＵＬ４４（ｇＣ）（配列番号２の２７
８６位〜３２２０位）のヘルペスウイルスホモログである（図３および図４を参
照のこと）。ＭＤＶ−１ ＵＬ４４（ｇＣ）遺伝子およびプロモーター領域にわ
たるＤＮＡ配列（７３２塩基対）が、公開されている（Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ
３，１２５〜１３７（１９８９））。ＭＤＶ−２ ＵＬ４２、ＵＬ４３および
ＵＬ４４遺伝子のＤＮＡ配列が、公開されている（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７
９（Ｐｔ ８），１９９７〜２００１（１９９８））。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ
−２由来のＵＬ４２タンパク質の類似性指数は、３６９アミノ酸のコンセンサス
長に対して７４パーセントである。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ４３
タンパク質の類似性指数は、４０１アミノ酸のコンセンサス長に対して５４パー
セントである。ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２由来のＵＬ４４タンパク質の類似性
指数は、１４５アミノ酸のコンセンサス長に対して４５パーセントである。ＭＤ
Ｖ−１ ＵＬ４３ ＯＲＦは、非必須であり、そして外来ＤＮＡを、このＯＲＦ
内に、またはＯＲＦ間の遺伝子間領域中に挿入する。この領域内の任意の制限部
位は、外来ＤＮＡの挿入部位として有用である。唯一ではないこの領域内の制限
酵素部位を、ＤＮＡリンカーの挿入によって変更する。このＤＮＡリンカーによ
って、この部位が唯一の制限酵素認識配列に変換される。好ましくは、外来ＤＮ
Ａの挿入に使用される制限酵素部位は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ
」ゲノムフラグメント内に含まれる３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブ
フラグメントにおけるおよそヌクレオチド１３８６でのＸｈｏＩ部位である。こ
の挿入部位は、ＵＬ４３ ＯＲＦ内に、このオープンリーディングフレームのア
ミノ酸２９と３０との間にある。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）のおよそ３０４５塩基対のＢａｍＨＩ制限フラグメントに由来した
。フラグメント１は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメ
ント内に含まれる、およそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメ
ントである。プラスミド９６２−８０．１を使用して、組換えマレク病ウイルス
中への外来ＤＮＡの挿入のための相同ベクターを作製した。

【０１０４】 （実施例１７） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入され
た感染性喉頭気管炎ウイルスＤＮＡを有するプラスミド） プラスミド９８０−８５．２２を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１
）に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。これは、ＩＬＴウイルスｇＤ
遺伝子およびｇＩ遺伝子ならびにＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ
Ｚ）マーカー遺伝子を、ＭＤＶ−１ ＤＮＡに隣接して組み込んでいる。これら
の遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用して、ＰａｃＩ部位に変換した唯一のＸ
ｈｏＩ部位に挿入した。外来ＤＮＡ配列の上流は、ＭＤＶ ＤＮＡのおよそ１３
８６塩基対のフラグメントである。外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ ＤＮＡの
およそ１８２６塩基対のフラグメントである。ＩＬＴウイルスｇＤ遺伝子および
ｇＩ遺伝子ならびにＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー
遺伝子の転写方向は、ＭＤＶ ＵＬ４２およびＵＬ４３ ＯＲＦと同じ転写方向
である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡト
ランスフェクション（実施例１０）およびβ−ガラクトシダーゼを発現する組換
えマレク病ウイルスのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣｐｒｇアッセイ
）、またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリー
ニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）に従って使用する場合、外来Ｄ
ＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じる。ＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子お
よびｇＩ遺伝子は、それら独自のそれぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターから重
複転写物として発現され、そしてそれら独自の内因性ポリアデニル化シグナルを
共有し、そしてＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝
子を、ＰＲＶ ｇＸプロモーターから転写して、そしてＰＲＶ ｇＸポリアデニ
ル化シグナルが続く。

【０１０５】 プラスミド９８０−８５．２２を、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して、以
下の供給源からの制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と連結することによって構
築した。ＩＬＴ ｇＤ、ｇＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌ
ａｃＺ）マーカー遺伝子を、唯一のＸｈｏＩ部位（これは、合成ＤＮＡリンカー
を使用してＰａｃＩ部位に変換された）にて、相同ベクター９６２−８０．１に
、カセットとして挿入した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のおよそ３０４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限
フラグメントに由来した。フラグメント１は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨ
Ｉ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ１３８６塩基対のＳａｃＩ〜
ＸｈｏＩ制限サブフラグメントである。フラグメント２は、ＩＬＴＡｓｐ７１８
Ｉゲノムフラグメント番号８（１０．６キロベース）のうちの、およそ３５５６
塩基対のＳａｌＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限サブフラグメントである。フラグメント
３は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメント番号１０のうちの、およそ４１３塩
基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラグメント４は、
プラスミドｐＪＦ７５１のうちの、およそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｖｕ
ＩＩ制限フラグメントである（１１）。フラグメント５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ
制限フラグメント番号７のうちの、およそ７５４塩基対のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制
限サブフラグメントである。フラグメント６は、１型マレク病ウイルスのＢａｍ
ＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、およそ１８２６塩基対のＸｈｏＩ
〜ＢｇｌＩＩ制限サブフラグメントである。

【０１０６】 （実施例１８） （オープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入された感染性喉頭気管炎ウイ
ルスＤＮＡを有する組換え１型マレク病ウイルス） Ｓ−ＭＤＶ−００６は、３つの外来ＤＮＡ配列を発現する１型マレク病ウイル
スである。ＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩの遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉ β
−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、唯一のＰａｃＩ制限部位（
１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれる、お
よそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメントのＵＬ４３ ＯＲ
Ｆ中の独特なＸｈｏＩ制限部位に挿入されたＰａｃＩリンカー）に挿入した。Ｉ
ＬＴＶ ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、それらの独自のそれぞれの内因性ＩＬ
ＴＶプロモーターから重複転写物として発現され、そしてそれら独自の内因性ポ
リアデニル化シグナルを共有し、そしてＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（
ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ ｇＸプロモーターから転写させ、そして
ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。Ｓ−ＭＤＶ−００６は、Ｓ−ＭＤ
Ｖ−００２（ＭＤＶ−１；ＣＶＩ−９８８ Ｒｉｓｐｅｎｓ）由来であった。組
換えマレク病ウイルスを作製するためのＤＮＡトランスフェクション手順（実施
例１０）において、相同ベクター９８０−８５．２２およびウイルスＳ−ＭＤＶ
−００２を利用して、これを達成した。同時トランスフェクションストックを、
β−グルクロニダーゼによってスクリーニングした（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（
実施例１１）。赤色プラーク精製の最終的な結果は、Ｓ−ＭＤＶ−００６と命名
される組換えウイルスであった。このウイルスを、実施例１１に記載されるよう
に青色プラークアッセイによってモニターされるβ−ガラクトシダーゼの発現、
純度、および複数の継代によるインサートの安定性についてアッセイした。最初
の４回の精製後に、観察された全てのプラークは、青色であり、このことは、こ
のウイルスが純粋であり、安定であり、そして外来ＤＮＡ配列を発現しているこ
とを示す。

【０１０７】 Ｓ−ＭＤＶ−００６を、黒色プラークアッセイを使用する組換えマレク病ウイ
ルスにおける外来ＤＮＡ配列の発現についてのスクリーニング（実施例１２）を
使用して、ＩＬＴ特異的抗原の発現についてアッセイした。ポリクローナルニワ
トリ抗ＩＬＴ血清（ＳＰＡＦＡＳ）は、Ｓ−ＭＤＶ−００６プラークと特異的に
反応し、そしてＳ−ＭＤＶ−００２陰性コントロールプラークと特異的に反応し
なかったことが示された。全てのＳ−ＭＤＶ−００６の観察されたプラークは、
ポリクローナル血清と反応し、このことは、このウイルスが、ＩＬＴ外来ＤＮＡ
配列を安定に発現していたことを示す。本明細書に記載されるアッセイを、ＣＥ
Ｆ細胞で行い、このことにより、ＣＥＦ細胞は、ＭＤＶ組換えワクチンの産生に
適切な培養基であることが示された。

【０１０８】 Ｓ−ＭＤＶ−００６は、ＩＬＴ ｇＤタンパク質およびｇＩタンパク質を発現
し、かつＩＬＴ感染におけるワクチンとして有用である、組換え１型マレク病ウ
イルスである。Ｓ−ＭＤＶ−００６もまた、ＩＬＴ ｇＤタンパク質およびｇＩ
タンパク質の発現に有用である。

【０１０９】 （実施例１９） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入され
たニューカッスル病ウイルスＤＮＡを有するプラスミド） プラスミド９８０−６０．０２を、組換え１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１
）に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ β−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）Ｆ遺伝子を、ＭＤＶ ＤＮＡに隣接して組み込んでいる。このＥ．ｃ
ｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺
伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位に変換された唯一のＸｈｏ
Ｉ部位に、相同性ベクター９６２−８０．１へのカセットとして挿入した。

【０１１０】 外来ＤＮＡ配列の上流は、ＭＤＶ ＤＮＡのおよそ１３８６塩基対のフラグメ
ントである。外来ＤＮＡ配列の下流は、ＭＤＶ ＤＮＡのおよそ１８２６塩基対
のフラグメントである。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マー
カー遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子の転写方向は、ＭＤＶ ＵＬ４２およびＵＬ
４３ ＯＲＦと同じ転写方向である。このプラスミドを、組換えマレク病ウイル
スを作製するためのＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）およびβ−ガラ
クトシダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング（Ｂｌｕｏｇ
ａｌおよびＣｐｒｇアッセイ）、またはβ−グルクロニダーゼを発現する組換え
マレク病ウイルスのスクリーニング（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）に
従って使用する場合、外来ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むウイルスが生じ
る。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあり、そして
ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルが続く。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダ
ーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ ｇＸプロモーターから転写させ、
そしてＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。

【０１１１】 プラスミド９８０−８５．１を、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して、以下
の供給源からの制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築
した。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子および
ＮＤＶ Ｆ遺伝子を、合成ＤＮＡリンカーを使用してＰａｃＩ部位に変換した唯
一のＸｈｏＩ部位にて、相同ベクター９６２−８０．１中にカセットとして挿入
した。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のおよそ３０
４５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに由来した。

【０１１２】 フラグメント１は、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメ
ント内に含まれる、およそ１３８６塩基対のＳａｃＩ〜ＸｈｏＩ制限サブフラグ
メントである。

【０１１３】 フラグメント２は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメント番号１０のうちの、
およそ４１３塩基対のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラ
グメント３は、プラスミドｐＪＦ７５１のうちの、およそ３０１０塩基対のＢａ
ｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメントである。フラグメント４は、ＰＲＶ Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメント番号７のうちの、およそ７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａ
ｌＩ制限サブフラグメントである。フラグメント５は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ
Ｅフラグメントのうちの、およそ１１９１塩基対のＰｓｔＩ〜ＡｖａＩＩ制限
サブフラグメントである。フラグメント６は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクロー
ン（Ｂ１株）のうちの、およそ１８１２塩基対のＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラ
グメントである。フラグメント７は、ＨＳＶ ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱの
うちの、およそ７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである
。最後のフラグメントは、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラ
グメント内に含まれる、およそ１８２６塩基対のＸｈｏＩ〜ＢｇｌＩＩ制限サブ
フラグメントである。

【０１１４】 （実施例２０） （オープンリーディングフレームＵＬ４３に挿入されたニューカッスル病ウイ
ルスＤＮＡを有する組換え１型マレク病ウイルス） Ｓ−ＭＤＶ−００４は、２つの外来ＤＮＡ配列を発現する１型マレク病ウイル
スである。ニューカッスル病ウイルス融合物（Ｆ）の遺伝子、およびＥ．ｃｏｌ
ｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、唯一のＰａｃＩ制限
部位（１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｂ」ゲノムフラグメント内に含まれ
るおよそ３２１２塩基対のＳａｃＩ〜ＢｇｌＩＩサブフラグメントのＵＬ４３
ＯＲＦ中の唯一のＸｈｏＩ制限部位に挿入したＰａｃＩリンカー）中に挿入する
。このＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあり、そし
てＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、ＰＲＶ
ｇＸプロモーターから転写させ、そしてＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナル
が続く。Ｓ−ＭＤＶ−００４は、Ｓ−ＭＤＶ−００２（ＭＤＶ−１；ＣＶＩ−９
８８ Ｒｉｓｐｅｎｓ）に由来する。組換えマレク病ウイルスを作製するための
ＤＮＡトランスフェクション（実施例１０）において、相同ベクター９８０−６
０．０２およびウイルスＳ−ＭＤＶ−００２を利用して、これを達成する。同時
トランスフェクションストックを、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えマレ
ク病ウイルスのスクリーニング（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣｐｒｇアッセイ）、ま
たはβ−グルクロニダーゼを発現する組換えマレク病ウイルスのスクリーニング
（Ｘ−Ｇｌｕｃアッセイ）（実施例１１）によってスクリーニングした。赤色プ
ラーク精製の最終的な結果は、Ｓ−ＭＤＶ−００４と命名される組換えウイルス
であった。このウイルスを、実施例１１に記載されるように青色プラークアッセ
イによってモニターされるβ−ガラクトシダーゼの発現、純度、および複数の継
代によるインサートの安定性についてアッセイする。最初の４回の精製後に、観
察された全てのプラークは、青色であり、このことは、このウイルスが純粋であ
り、安定であり、そして外来ＤＮＡ配列を発現していることを示す。

【０１１５】 Ｓ−ＭＤＶ−００４を、黒色プラークアッセイを使用する組換えマレク病ウイ
ルスにおける外来ＤＮＡ配列の発現についてのスクリーニング（実施例１２）を
使用して、ＮＤＶ特異的抗原の発現についてアッセイする。ＮＤＶ Ｆに特異的
なモノクローナル抗体は、Ｓ−ＭＤＶ−００４プラークと特異的に反応し、そし
てＳ−ＭＤＶ−００２陰性コントロールプラークと特異的に反応しないことが示
される。全てのＳ−ＭＤＶ−００４の観察されたプラークは、ポリクローナル血
清と反応し、このことは、このウイルスが、ＮＤＶ Ｆ遺伝子を安定に発現して
いることを示す。本明細書に記載されるアッセイを、ＣＥＦ細胞で行い、このこ
とにより、ＣＥＦ細胞は、ＭＤＶ組換えワクチンの産生に適切な培養基であるこ
とが示される。

【０１１６】 Ｓ−ＭＤＶ−００４は、ＮＤＶ Ｆタンパク質を発現し、ＮＤＶ感染における
ワクチンとして有用である、組換え１型マレク病ウイルスである。Ｓ−ＭＤＶ−
００４もまた、Ｆタンパク質の発現に有用である。

【０１１７】 （実施例２１） （１型マレク病ウイルスのオープンリーディングフレームＵＬ７、ならびに／
あるいはオープンリーディングフレームＵＬ８およびＵＬ７の間に挿入された外
来ＤＮＡを有するプラスミド） プラスミドを、１型マレク病ウイルス（ＭＤＶ−１）中に外来ＤＮＡを挿入す
る目的のために構築する。これは、１型マレク病ウイルスのＢａｍＨＩ「Ｇ」ゲ
ノムフラグメント内に含まれる、およそ７３１６塩基対のサブフラグメント（配
列番号３）を含む。７３１６塩基対のサブフラグメント内の５つのオープンリー
ディングフレームは、ＵＬ９ ＯＲＦ（配列番号３の１位〜４２５位）、ＵＬ８
（配列番号３の４３９位〜２７４８位）、ＵＬ７（ｇＣ）（配列番号３の３６９
９位〜２７８２位）、ＵＬ６（配列番号３の５７０４位〜３５３６位）、および
ＵＬ５（配列番号３の５７７２位〜７３１６位）のヘルペスウイルスホモログで
ある（図５および図６を参照のこと）。ＯＲＦ ＵＬ８およびＵＬ７（配列番号
３の２７４９位〜２７８１位）と、ＯＲＦ ＵＬ６と重複しないＯＦＲ７の部分
（配列番号３の２７８２位〜３５３５位）との間の領域は、ウイルス複製に必須
ではなく、そして変異ウイルスおよび／または組換えウイルスを作製するために
使用され得る。

【０１１８】 本発明の多くの改変およびバリエーションは、当業者に明らかなように、その
精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定
の実施形態は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の
範囲が権利を付す均等物の全範囲とともに、このような特許請求の範囲によって
のみ制限されるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素地図であり、特に「Ｍ」フラグメ
ントの位置を示している。

【図２】 図２は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ「Ｍ」フラグメントにおけるオープンリー
ディングフレームを示す地図である。

【図３】 図３は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素地図であり、特にＳａｃＩ−Ｂｇ
ｌＩＩＩフラグメントの位置を示している。

【図４】 図４は、ＭＤＶゲノムのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩＩフラグメントにおけるオープ
ンリーディングフレームを示す地図である。

【図５】 図５は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ制限酵素地図であり、特に「Ｇ」フラグメ
ントの位置を示している。

【図６】 図６は、ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ「Ｇ」フラグメントにおけるオープンリー
ディングフレームの地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/265 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ｃ１２Ｒ 1:93 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｔ Ｚ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA32 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 HA20 4B065 AA95X AA95Y AB01 AC20 BA01 CA43 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA01 CA53 MA17 MA22 MA23 MA31 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA58 MA59 MA66 NA14 ZB332 ZC612 4C085 AA03 BA59 BA81 BA82 BB15 DD62 DD88 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 MA17 MA22 MA23 MA31 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA58 MA59 MA66 NA14 ZB33 ZC61

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）のＵＬ５４．５オープンリーデ
   ィングフレームに挿入された外来性ＤＮＡ配列を含む、組換え鳥類ヘルペスウイ
   ルス。
2. 【請求項２】 前記外来性ＤＮＡがポリペプチドをコードする、請求項１に
   記載の組換えヘルペスウイルス。
3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが１０より多いアミノ酸を含有する、請求
   項２に記載の組換えヘルペスウイルス。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが抗原性である、請求項２に記載の組換え
   ヘルペスウイルス。
5. 【請求項５】 前記鳥類ヘルペスウイルスが、Ｉ型マレク病ウイルス（ＭＤ
   Ｖ−１）を含む、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルス。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換えヘルペスウイルスであって、ここで
   前記外来性ＤＮＡ配列が、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するヘルペスウイル
   スプロモーターの制御下にあり、そして、該外来性ＤＮＡ配列が、ＰＲＶ ｇＸ
   プロモーター、ＭＤＶ ｇＢプロモーター、ＭＤＶ ｇＡプロモーター、ＭＤＶ ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＩプロモータ
   ー、ＨＣＭＶ最初期プロモーター、および実質的に相同な配列からなる群より選
   択される、組換えヘルペスウイルス。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の組換えヘルペスウイルスであって、ここで
   前記外来性ＤＮＡ配列が、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイ
   ルス、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイル
   ス、伝染性気管支炎ウイルス、および実質的に相同な配列からなる群より選択さ
   れるウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする、組換えヘルペスウイルス
   、
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記外
   来性ＤＮＡ配列が、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、および実質的に相同な配列からな
   る群より選択される、伝染性ファルビキウス病ウイルス由来の抗原性ポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
9. 【請求項９】 請求項７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記外
   来性ＤＮＡが、Ｂ糖タンパク質、Ｄ糖タンパク質、Ａ糖タンパク質、および実質
   的に相同な配列からなる群より選択される、マレク病ウイルス由来の抗原性ポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
10. 【請求項１０】 請求項７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記
    外来性ＤＮＡ配列が、Ｆ、ＨＮ、および実質的に相同な配列からなる群より選択
    される、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ配列を含む、組換えヘルペスウイルス。
11. 【請求項１１】 請求項７に記載の組換えヘルペスウイルスであって、前記
    外来性ＤＮＡが、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリッ
    クスタンパク質、および実質的に相同な配列からなる群より選択される、伝染性
    気管支炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組
    換えヘルペスウイルス。
12. 【請求項１２】 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）のＵＬ５４．５オープンリー
    ディングフレームの少なくとも一部の欠失を含む、変異体鳥類ヘルペスウイルス
    。
13. 【請求項１３】 前記ＵＬ５４．５オープンリーディングフレームが完全に
    欠失している、請求項１２に記載の変異体ヘルペスウイルス。
14. 【請求項１４】 マレク病ウイルスのＵＬ４３オープンリーディングフレー
    ムに挿入されている外来性ＤＮＡ配列を含む、組換え鳥類ヘルペスウイルス。
15. 【請求項１５】 前記外来性ＤＮＡがポリペプチドをコードする、請求項１
    ４に記載の組換えヘルペスウイルス。
16. 【請求項１６】 前記ポリペプチドが１０より多いアミノ酸を含む、請求項
    １５に記載の組換えヘルペスウイルス。
17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが抗原性である、請求項１５に記載の組
    換えヘルペスウイルス。
18. 【請求項１８】 前記鳥類ヘルペスウイルスがＩ型マレク病ウイルス（ＭＤ
    Ｖ−１）を含む、請求項１７に記載の組換えヘルペスウイルス。
19. 【請求項１９】 請求項１４に記載の組換えヘルペスウイルスであって、こ
    こで前記外来性ＤＮＡ配列が、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するヘルペスウ
    イルスプロモーターの制御下にあり、そして、該外来性ＤＮＡ配列は、ＰＲＶ
    ｇＸプロモーター、ＭＤＶ ｇＢプロモーター、ＭＤＶ ｇＡプロモーター、Ｍ
    ＤＶ ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＩプロモ
    ーター、ＨＣＭＶ最初期プロモーター、および実質的に相同な配列からなる群よ
    り選択される、組換えヘルペスウイルス。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の組換えヘルペスウイルスであって、こ
    こで前記外来性ＤＮＡ配列が、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性ファルビキウス病
    ウイルス、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウ
    イルス、伝染性気管支炎ウイルス、および実質的に相同な配列からなる群より選
    択される、ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする、組換えヘルペスウ
    イルス。