MXPA01010273A - Novedosos herpesvirus recombinantes y mutantes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos y reactivos para inducir inmunidad en animales; en particular, la presente invencion provee virus recombinantes del herpes que tienen ADN extrano y son capaces de inducir inmunidad al virus M herpes y/o la fuente del ADN extrano; la presente invencion provee tambien un virus mutante del herpes que tiene suprimidas porciones de su genoma, preferiblemente, se introduce ADN extrano o se suprimen porciones del genoma, en el marco de lectura abierta de UL54.5 de virus del herpes en aves o el marco de lectura abierta de UL43 del virus de la enfermedad de Marek.

Description

NOVEDOSOS HERPESVIRUS RECOMBINANTES Y MUTANTES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vectores virales para vacunación de animales. En particular, la presente invención se refiere a vectores virales que tienen sitios de inserción de genes para la introducción de ADN ajeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Marek es una enfermedad linfoproliferativa de pollos ocasionada por el virus de enfermedad de Marek (MDV). MDV, un herpesvirus natural, infecta linfocitos derivados de bolsa y timo en pollos, y puede inducir posteriormente un linfoma de linfocitos derivados de timo. MDV es una designación de una familia de herpesvirus de aves. Por ejemplo, MDV1 es una cepa virulenta de herpesvirus en pollos, MDV2 es una cepa de herpesvirus naturalmente atenuada en pollos, y MDV3 es un herpesvirus no patógeno de pavo. Debido a que la enfermedad de Marek es contagiosa, el virus se ha convertido en un patógeno importante de pollos, particularmente en un ambiente de reproducción a gran escala tal como en la industria de aves de .<&.___- . corral. Actualmente, la enfermedad de Marek se controla mediante vacunación de embriones a los 17-19 días de incubación, o pollos de un día de nacidos. La aplicación de técnicas de ADN recombinante a virus animales en general tiene una historia reciente. Los primeros virus a manipular han sido aquellos con los genomas más pequeños. Por ejemplo, en el caso del papovavirus, debido a que estos virus son muy pequeños y no pueden alojar mucho ADN adicional, su uso en manipulación genética ha sido como replicones defectuosos. De esta forma, la expresión de secuencia de ADN ajeno a partir de estos virus requiere un virus auxiliar de tipo silvestre y se limita a sistemas de cultivo de células. Por otro lado, para adenovirus, existe una pequeña cantidad de ADN no esencial que se puede reemplazar por secuencias ajenas. Esta técnica también ha sido aplicada a porciones del genoma de herpesvirus en un herpesvirus característico de las aves (véase patente de E.U.A. No. 5,853,733 para Cochran et al). Los casos de deleción o inserción de genes en herpesvirus demuestran que es posible manipular genéticamente genomas de herpesvirus mediante técnicas de ADN recombinante. En el pasado, los métodos que han sido utilizados para insertar genes involucran recombinación homologa entre el ADN viral clonado en plásmidos y ADN viral purificado transfectado en la misma célula animal. Sin embargo, el grado en el cual se puede generalizar el lugar de la deleción y los sitios para inserción de secuencias de ADN ajenas no se conoce a partir de estos estudios anteriores. ¡,< ^ _.< _ .- , -*...,_ _.. ___. . .. . . . __ ..m J__j*_*__. . . .*-» *_.___•. i .

La identificación de sitios de inserción de secuencia de ADN adecuados en herpesvirus característicos de aves es valiosa para el desarrollo de nuevas vacunas. La selección de (i) un virus adecuado y (ii) la porción particular del genoma para utilizarse como un sitio de inserción para crear un vector para expresión de secuencia de ADN ajeno, sin embargo, representan un reto importante. En particular, el sitio de inserción debe ser no esencial para la replicación factible del virus, así como su operación en cultivo de tejido e in vivo. Más aún, el sitio de inserción debe ser capaz de aceptar nuevo material genético, mientras asegura que el virus continúa replicándose. Lo que se necesita es la identificación de novedosos virus y sitios de inserción de genes para la creación de nuevos vectores virales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee herpesvirus mutantes y recombinantes que comprenden una secuencia de ADN ajeno insertado en un sitio en el genoma de herpesvirus. En una modalidad, el sitio no es esencial para replicación viral. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN ajeno es capaz de ser expresada en una célula hospedera infectada con el herpesvirus recombinante y su expresión. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de ADN ajeno también está bajo control de un promotor localizado corriente arriba de la secuencia de ADN ajeno.

La presente invención no está limitada a sitios particulares para inserción o deleción. En una modalidad, la deleción y/o inserción está en el marco de lectura abierto UL54.5 de un virus de enfermedad de Marek. En otra modalidad, la deleción y/o inserción está en el marco de lectura abierto UL43 de un virus de enfermedad de Marek. En una modalidad preferida, la inserción está en el genoma del virus de enfermedad de Marek tipo 1. Aunque no se limita a tipos particulares de ADN insertado, en una modalidad de la presente invención, la secuencia de ADN ajeno insertado en el genoma de herpesvirus codifica para un polipéptido. De preferencia, el polipéptido es inmunogénico al animal en el cual se introduce el herpesvirus recombinante. Preferiblemente, este polipéptido inmunogénico es un polímero lineal de más de 10 aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos lo cual estimula que el animal produzca anticuerpos. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN ajeno también codifica para un marcador detectable. De preferencia, el marcador detectable es B-galactosidasa de E. coli. En modalidades preferidas, el herpesvirus recombinante contiene una secuencia de ADN ajeno que codifica para un polipéptido inmunogénico derivado de virus de anemia de pollo (CAV), virus de enfermedad infecciosa de bolsa (IBDV), virus de enfermedad de Marek (MDV), virus de enfermedad de Newcastle (NDV), virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV), o virus de bronquitis infecciosa (IBV), fragmentos de los mismos y/o secuencias sustancialmente homologas. En otra modalidad preferida, el ADN ajeno codifica para una citocina. La presente invención también contempla herpesvirus recombinantes que tienen más de una secuencia de ADN ajeno que codifica para un antígeno o antígenos. Cuando la secuencia de ADN ajeno del herpesvirus recombinante de la presente invención codifica para un polipéptido inmunogénico derivado de virus de enfermedad infecciosa de bolsa (IBDV), se prefiere que el polipéptido inmunogénico sea proteína de IBDV VP2, VP3 o VP4, fragmentos de las mismas y/o secuencias sustancialmente homologas. Cuando la secuencia de ADN ajeno codifica para un polipéptido ¡nmunogénico de MDV, de preferencia, el polipéptido inmunogénico es glucoproteína B de MDV (gB), glucoproteína D (gD), o glucoproteína A (gA), fragmentos de las mismas y/o secuencias sustancialmente homologas. Cuando la secuencia de ADN ajeno codifica para un polipéptido inmunogénico de virus de enfermedad de Newcastle (NDV), se prefiere que el polipéptido inmunogénico sea proteína de fusión (F) de NDV o hemaglutinina-neuraminidasa de NDV (HN), fragmentos de las mismas y/o secuencias sustancialmente homologas. Cuando la secuencia de ADN ajeno codifica para un polipéptido inmunogénico de virus de laringotraqueítis infecciosa (I LTV), se prefiere que el polipéptido ¡nmunogénico sea glucoproteína "B" de ILTV (gB), glucoproteína D ILTV (gB), o glucoproteína I de ILTV (gl), fragmentos de las mismas y/o secuencias sustancialmente homologas. Cuando la secuencia de ADN ajeno codifica para un polipéptido inmunogénico de virus de bronquitis infecciosa (IBV), se prefiere que el b& * .. Í . i>._.?. __,**_____> .&. «.»_. . _ . _. . .„ - - •»•-» . - ... • . T . !_s¡itlt__h polipéptido inmunogénico sea proteína de punta de IBV, proteína de matriz de IBV, proteína de nucleocápsíde, fragmentos de las mismas y/o secuencias sustancialmente homologas. La expresión de la secuencia de ADN ajeno insertado puede estar bajo control de un promotor localizado corriente arriba de la secuencia de ADN ajeno. De preferencia, el promotor es un promotor de herpesvirus. Preferiblemente, el promotor se selecciona de un grupo que consta de promotor gX de virus de pseudorabias (PRV), promotor gB de MDV, promotor gA de MDV, promotor gD de MDV, promotor gB de ILTV, promotor gD de ILTV, promotor gl de ITLV, promotor precoz inmediato de virus de citomegalovirus humano (HCMV), y/o secuencias sustancialmente homologas. La presente invención provee además un vector de homología para producir un herpesvirus recombinante al insertar una secuencia de ADN ajeno en el genoma del herpesvirus. En una modalidad, el vector de homología comprende una molécula de ADN de doble cadena que consta esencialmente de una secuencia de ADN ajeno de doble cadena, que presenta en un extremo de la secuencia de ADN ajeno, un ADN de doble cadena homólogo con el ADN genómico localizado en un lado de un sitio no esencial del genoma del herpesvirus, y en el otro extremo de la secuencia de ADN ajeno, ADN de doble cadena homólogo a la secuencia de ADN genómico del herpesvirus localizado en el otro lado del mismo sitio. En dicha modalidad, el ADN de doble cadena puede ser homólogo a una secuencia de ADN presente dentro de un subfragmento BgA\ a Sacl de 3212 pares de bases _a_«j___fc.__?»»L_l- tta-.Jtj-t.a-t, contenido dentro del fragmento genómico "B" de BamH\ de un virus de enfermedad de Marek de tipo 1. De preferencia, una secuencia de ADN correspondiente a un promotor está localizada corriente arriba de la secuencia de ADN ajeno y controla su expresión. Asimismo, es preferible que la secuencia de ADN ajeno codifique para un polipéptido inmunogénico (por ejemplo, aquéllos antes descritos). En una modalidad de la invención, el ADN de herpesvirus de doble cadena es homólogo a secuencia de ADN presente dentro del fragmento "B" de ßamHI del genoma de herpesvirus de MDV. De preferencia, el ADN de herpesvirus de doble cadena es homólogo a secuencias de ADN presentes dentro del marco de lectura abierto que codifica para la proteína UL 43 del genoma de herpesvirus. En otra modalidad de la invención, el ADN de herpesvirus de doble cadena es homólogo a secuencias de ADN presentes dentro del fragmento "M" de ßamHI de un genoma de herpesvirus. Preferiblemente, el ADN de herpesvirus de doble cadena es homólogo a secuencia de ADN presente dentro de la región de codificación de genes UL54.5 de un genoma de herpesvirus. La invención provee además una vacuna la cual comprende una cantidad inmunizante efectiva de un herpesvirus recombinante o mutante en la presente invención y un vehículo adecuado. La presente invención provee además un método para inmunizar un animal. Un animal preferido a inmunizar es un ave.

La presente invención provee además un método para inmunizar un ave in ovo. Para los propósitos de esta invención, ésta incluye inmunizar un ave contra virus de enfermedad infecciosa de bolsa, virus de enfermedad de Marek, virus de enfermedad de Newcastle, virus de laringotraqueítis infecciosa o virus de bronquitis infecciosa. De preferencia, el método comprende administrar al ave una dosis inmunizante efectiva de la vacuna de la presente invención. La vacuna se puede administrar a través de cualquiera de los métodos bien conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante inyección intramuscular subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Alternativamente, la vacuna se puede administrar de manera intranasal, oral o intraocular. La presente invención también provee una célula hospedera infectada con un herpesvirus recombinante de la presente invención. De preferencia, la célula hospedera es una célula característica de las aves.

Definiciones Para los propósitos de esta invención, una "célula hospedera" es una célula utilizada para propagar un vector y su inserto. La infección de la célula se puede realizar a través de métodos bien conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se establece a continuación en transfección de ADN para generar herpesvirus recombinante 11. El término "animal" se refiere a organismos en el reino animal. De esta forma, este término incluye humanos, así como otros organismos. De i?._.^_éá. _.__.j_JI_KAA. _.. ....... í. ,ti_,_ preferencia, el término se refiere a vertebrados. Preferentemente, el término se refiere a aves. Una "cantidad inmunizante efectiva" de herpesvirus recombinante de la presente invención está dentro de la escala de 102 a 109 de unidades formadoras de placas (PFU)/dosis. Para los efectos de esta invención, un "vector de homología" es un plásmido construido para insertar secuencia de ADN ajeno en un sitio específico en el genoma de un herpesvirus. Una "secuencia de ADN ajeno" es un segmento de ADN que ha sido o que será unido a otra molécula de ADN utilizando técnicas recombinantes, en donde ese segmento particular de ADN no se encuentra en asociación con la otra molécula de ADN en la naturaleza. El origen de dicho ADN ajeno puede o no ser a partir de un organismo separado que aquel en el que se colocó. El ADN ajeno también puede ser una secuencia sintética que tiene codones diferentes al gen nativo. Ejemplos de técnicas recombinantes incluyen pero no se limitan al uso de enzimas de restricción y ligasas para unir ADN. Un "sitio de inserción" es un sitio de restricción en una molécula de ADN en el cual se puede insertar un ADN ajeno. Un "virus competente de replicación" es un virus cuyo material genético contiene todas las secuencias de ADN o ARN necesarias para replicación viral tal como son encontradas en un tipo silvestre del organismo. De esta forma, un virus competente de replicación no requiere un segundo virus o una línea de células para suministrar algo defectuoso en o que falta en el virus con el fin de replicar. Un "sitio no esencial en el genoma de herpesvirus" significa una región en el genoma de herpesvirus, cuyo producto polipeptídico no es necesario para replicación o infección viral. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, cósmido o virus, al cual se puede unir otra secuencia de ADN a modo de que se ocasione la expresión de la secuencia de ADN unida. Una "molécula de ADN de doble cadena" se refiere a la forma polimérica de desoxirribunucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su hélice normal de doble cadena. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. De esta forma, este término incluye ADN de doble cadena encontrado en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmento de restricción de ADN de virus, plásmidos y cromosomas). Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN la cual se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en la terminal amino hacia el extremo 5' y un codón sin sentido de traducción en la terminal carboxi hacia el extremo 3'. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómicas de ADN eucariótico (por ejemplo, mamíferos), ADN viral, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de ?¿... terminación de transcripción y señal de poliadenilación puede estar ubicada hacia el extremo 3' de la secuencia de codificación. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa o una proteína auxiliar en una célula e iniciar transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (hacia el extremo 3'). Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora está en cercana proximidad con la terminal hacia el extremo 3' mediante el codón de inicio de traducción (ATG) de una secuencia de codificación y se extiende corriente arriba (hacia el extremo 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para facilitar la transcripción en niveles detectables por encima del contexto. Dentro de la secuencia promotora, se encontrará un sitio de iniciación de transcripción, así como dominios de unión a proteína (secuencia consenso) reponsables de la unión de ARN polimerasa. Con frecuencia, pero no siempre, los promotores eucarióticos, contendrán cuadros "TATA" y cuadros "CAAT", secuencias conservadas encontradas en la región promotora de muchos organismos eucarióticos. Una secuencia de codificación está "operablemente enlazada a" o "bajo el control de" secuencias de control en una célula, cuando ARN polimerasa interactúe con la secuencia promotora directa o indirectamente y dé como resultado la transcripción de la secuencia de codificación en ARNm, lo cual luego se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia de codificación.

Dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homologas" cuando por lo menos aproximadamente 80% (preferiblemente por lo menos aproximadamente 90%, y de preferencia por lo menos aproximadamente 95%) de los aminoácidos coinciden con una longitud definida de la molécula. Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homologas" cuando son idénticas o no difieren en más de 40% de los nucleótidos, de preferencia cerca de 20% de los nucleótidos y preferiblemente cerca de 10% de los nucleótidos. Un virus que ha tenido una secuencia de ADN ajeno insertado en su genoma es un "virus recombinante", mientras que un virus que ha tenido una porción de su genoma removido por deleción intencional (por ejemplo, mediante manipulación genética) es una "virus mutante". El término "polipéptido" se utiliza en su sentido más amplio, es decir, cualquier polímero de aminoácidos (dipéptido o mayor) enlazado a través de enlaces peptídicos. Así, el término "polipéptido" incluye proteínas, oligopéptidos, fragmentos de proteína, análogos, muteínas, proteínas de fusión y similares. "Antigénicos" se refiere a la capacidad de una molécula que contiene uno o más epítopes para estimular un sistema inmune animal o humano para hacer una respuesta específica de antígeno humoral y/o celular. Un "antígeno" es un polipéptido antigénico.

Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedero de una respuesta inmune mediada por anticuerpo y/o célula a la composición o vacuna de interés. Normalmente, dicha respuesta consiste en el sujeto que produce anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxícas dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Los términos "polipéptido inmunogénico" y "secuencia de aminoácidos inmunogénicos" se refiere a un polipéptido o secuencia de aminoácidos, respectivamente, la cual produce anticuerpos que neutralizan infectividad viral y/o median anticuerpo-complemento o anticuerpo dependiente de citotoxicidad celular para proveer protección de un hospedero inmunizado. Un "polipéptido inmunogénico" como se utiliza en la presente, incluye la secuencia de longitud total (o casi de longitud total) de la proteína deseada o un fragmento inmunogénico de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se refiere a un fragmento de un polipéptido el cual incluye uno o más epítopes y de esta forma, produce anticuerpos que neutralizan infectividad viral y/o media anticuerpo-complemento o anticuerpo dependiente de citoxicidad celular para proveer protección de un hospedero inmunizado. Dichos fragmentos normalmente serán de aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, y preferentemente por lo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos de longitud. No existe límite superior crítico para la longitud del fragmento, el cual puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de proteínas o incluso una proteína de fusión que comprenda fragmentos de dos o más de los antígenos. Por "infeccioso" se refiere que tiene la capacidad de suministrar el genoma viral en células. El término "marco de lectura abierto u "ORF" se define como una región de codificación genética para un gen particular que, cuando es expresado, puede producir una proteína de cadena polipeptídica completa y específica. El término "herpesvirus característico de aves" connota un herpesvirus que es capaz de replicación en hospederos característicos de aves y que no se replica de manera natural en otros animales hospederos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un mapa de restricción de fíamHI de un genoma de MDV que señala particularmente el lugar de un fragmento "M". La figura 2 es un mapa que designa los marcos de lectura abiertos en el fragmento "M" de ßat>H1 de un genoma de MDV. La figura 3 es un mapa de restricción de fíat?H1 de un genoma de MDV que señala particularmente el lugar de fragmentos de Sacl-fís/lll. La figura 4 es un mapa que designa los marcos de lectura abiertos en el fragmento Sacl-Bg/lll de un genoma de MDV.

La figura 5 es un mapa de restricción de fíamHI de genoma de MDV que señala particularmente el lugar de fragmento "G". La figura 6 es un mapa de los marcos de lectura abiertos en el fragmento "G" de fíamHI de un genoma de MDV.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A través de esta descripción, se hace referencia a diferentes publicaciones, patentes y solicitudes de patente. Las descripciones de estas publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia. Los métodos y composiciones de la presente invención implican modificar secuencias de ADN clonado a partir de diferentes fuentes procarióticas y eucarióticas mediante inserciones, deleciones, cambios de base sencilla o múltiple, e inserciones subsecuentes de estas secuencias modificadas en el genoma de un herpesvirus. Un ejemplo incluye clonar partes de un ADN de herpesvirus en plásmidos en bacterias, reconstruir el ADN del virus mientras está en el estado clonado, de modo que el ADN contenga deleciones de ciertas secuencias, y/o además añadir secuencias de ADN ajeno ya sea en lugar de las deleciones o en sitios removidos de las deleciones. Los métodos y composiciones de la presente invención también involucran la deleción de una porción del genoma de un herpesvirus para producir un virus mutante.

Generalmente, la construcción de gen ajeno se clona en una secuencia de nucleótidos que representa solamente una parte de todo el genoma del herpesvirus, el cual puede tener una o más deleciones adecuadas. Esta secuencia de ADN quimérica está normalmente presente en un plásmido el cual permite la clonación exitosa para producir muchas copias de la secuencia. La construcción de gen ajeno clonado se puede entonces incluir en el genoma viral completo, por ejemplo, mediante recombinación in vivo seguido de una técnica de cotransfección mediada por ADN. Se pueden insertar múltiples copias de una secuencia de codificación o más de una secuencia de codificación, de modo que el vector recombinante pueda expresar más de una proteína ajena. El gen ajeno puede tener adiciones, deleciones o sustituciones para aumentar expresión y/o efectos inmunológicos de la proteína expresada. Con el fin de que ocurra expresión exitosa del gen, éste se puede insertar en un vector de expresión junto con un promotor adecuado que incluye elementos intensificadores y secuencias de poliadenilación. Un número de secuencias de poliadenilación y promotores eucarióticos los cuales proveen expresión exitosa de genes ajenos en células mamíferas y cómo construir cassettes de expresión, se conocen en la técnica, por ejemplo en la patente de E.U.A. número 5,151 ,267. El promotor es seleccionado para dar expresión óptima de proteína inmunogénica, la cual a su vez conduce de manera satisfactoria a respuestas inmunes humorales, mediadas por células y mucosa de acuerdo con criterios conocidos.

La proteína ajena producida mediante expresión in vivo en una célula infectada con virus recombinante puede ser por sí misma inmunogénica. Más de un gen ajeno se puede insertar en el genoma viral para obtener producción exitosa de más de una proteína efectiva. Por lo tanto, una utilidad del uso de un herpesvirus mutante o la adición de una secuencia de ADN ajeno en el genoma de un herpesvirus es vacunar a un animal. Por ejemplo, se puede introducir un virus mutante en un animal para producir una respuesta inmune para el virus mutante. De manera alternativa, un herpesvirus recombinante que tenga una secuencia de ADN ajeno en su genoma que codifica para un polipéptido, también puede servir para producir una respuesta inmune en un animal para la secuencia de ADN ajeno, polipéptido codificado por la secuencia de ADN ajeno y/o herpesvirus. Dicho virus también se puede utilizar para introducir ADN ajeno y sus productos en el animal hospedero para aliviar la condición genómica defectuosa en el animal hospedero. Estos herpesvirus recombinantes se refieren como vectores virales cuando éste sea un virus que puede portar el ADN ajeno en el animal hospedero. La presente invención no está limitada al uso de un vector de herpesvirus particular. Un herpesvirus característico de aves adecuado para uso como un vector viral es MDV. Para proveer MDV como un vector y vacuna contra enfermedad de Marek, es conveniente localizar un sitio dentro del genoma de MDV el cual no sea esencial para función y replicación viral; y en el cual se pueda insertar uno o más genes endógenos que codifican para un antígeno de MDV para estimular adicionalmente la respuesta inmune contra los antígenos codificados. Por otro lado, para proveer MDV como un vector viral o como un vector de expresión para uso como una vacuna multivalente, es conveniente localizar un sitio dentro del genoma de MDV el cual no sea esencial para función y replicación viral; y en el cual se pueda insertar uno o más genes exógenos que codifican para un antígeno de un patógeno de aves de corral diferente a MDV para estimular adicionalmente la respuesta inmune contra MDV y los otros patógenos de aves de corral. De manera alternativa, se puede insertar una combinación de copias de genes endógenos y genes exógenos en una región no esencial de dicho vector viral. Cuando se utiliza un genoma de MDV, se prefiere utilizar una cepa de MDV tipo 1. Rispens CVI-988 es una cepa de vacuna de MDV de serotipo 1 atenuado que se puede utilizar para proveer protección contra muchas cepas virulentas de MDV. Este genoma de MDV es una molécula de doble cadena lineal de 180 pares de kilobases que consta de dos regiones únicas: una única región corta (US), y una única región larga (UL). Cada una de las regiones únicas tiene a los lados repeticiones invertidas: una repetición de terminal larga (TRL) y repetición invertida larga interna (IRL) para UL, y una repetición invertida interna corta (IRS) y repetición de terminal corta (TRS) para US. Aunque la presente invención no está limitada a sitios particulares de inserción y/o deleción de ADN, se ha descubierto que la región UL43 y región UL54.5 de herpesvirus característicos de aves contiene sitios i , . _ <_ a_t?_Í8*d**MA - adecuados para deleción e inserción. Por ejemplo, existe un sitio Xhol dentro de la región UL43 de herpesvirus característicos de aves, y en particular dentro del genoma de MDV. También existe un marco de lectura abierto (ORF) que tiene a sus lados las regiones UL54 y UL55. Este ORF, designado como UL54.5, contiene un sitio Nde\ adecuado para deleción e inserción. En particular, existe un subfragmento de Sacl a fíg/ll de 3212 pares de bases contenido dentro del fragmento genómico fíamHI del virus de enfermedad de Marek de tipo 1. Un sitio preferido de deleción y/o inserción del subfragmento de Sacl a BglW de 3212 pares de bases contenidos dentro del fragmento genómico herpesvirus "B" de fíamHI reside dentro de un marco de lectura abierto que codifica para UL43, y un sitio preferido de inserción dentro de ese marco de lectura abierto es un sitio de endonucleasa de restricción Xhol. Asimismo, las deleciones y/o inserciones se pueden colocar en el fragmento genómico "M" de SamHI del genoma del herpesvirus. Un sitio de inserción preferido dentro del fragmento genómico "M" de fíamHI residen dentro de un marco de lectura abierto que codifica para herpesvirus UL54.5 y un sitio preferido de inserción dentro de ese marco de lectura abierto es un sitio de endonucleasa de restricción ?/del. En una modalidad particularmente preferida, el producto del marco de lectura abierto UL54.5 no es esencial para replicación viral. Varias secuencias de ADN ajeno o secuencias de codificación (virales, procarióticas, y eucarióticas) se pueden insertar en la secuencia de nucleótidos de herpesvirus, por ejemplo, ADN, de acuerdo con la presente invención, particularmente para proveer protección contra una amplia escala de enfermedades y muchos de dichos genes ya se conocen en la técnica. Aunque no se limita a alguna secuencia particular de ADN ajeno, normalmente la secuencia de ADN ajeno de interés se derivará de patógenos que en aves causan enfermedades que pueden tener un impacto económico en la industria de aves de corral. Los genes se pueden derivar de organismos para los cuales existen vacunas, y debido a las novedosas ventajas de la tecnología de vectores, las vacunas derivadas de herpesvirus serán superiores. Además, el gen de interés se puede derivar de patógenos para los cuales no existe actualmente vacuna, pero que existe un requisito para controlar la enfermedad. Normalmente, el gen de interés codifica para polipéptidos inmunogénicos del patógeno, y puede representar proteínas de superficie, proteínas secretadas y proteínas estructurales. Un patógeno característico de aves relevante que es un objetivo para vectores de herpesvirus, es el virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV). ILTV es un miembro de la familia de herpesviridiae, y este patógeno ocasiona una enfermedad aguda de pollos la cual está caracterizada por depresión respiratoria, jadeo y expectoración de exudado sanguíneo. Otro objetivo para el método de vectores de herpesvirus es la enfermedad de Newcastle, una enfermedad infecciosa debilitante y altamente contagiosa que es ocasionada por el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). NDV es un virus de ARN de cadena sencilla de la familia de _A._Mi_ i.tJ ífaramixovirus. Los diferentes patotipos de NDV (velogénico, mesogénico, lentogénico) difieren con respecto a la severidad de la enfermedad, la especificidad y síntomas, pero la mayoría de los tipos parecen infectar el sistema respiratorio y el sistema nervioso. NDV principalmente infecta pollos, pavos y otras especies de aves. La presente invención tampoco está limitada al uso de una secuencia de ADN particular de un organismo. Con frecuencia, la selección de la secuencia de ADN ajeno para inserción en un genoma de herpesvirus se basa en la proteína para la que codifica. De preferencia, la secuencia de ADN ajeno codifica para un polipéptido inmunogénico. El polipéptido inmunogénico preferido que será expresado por los sistemas de virus de la presente invención contienen secuencias de longitud completa (o casi de longitud completa) que codifica para antígenos. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias más cortas que son inmunogénicas (es decir, que codifican para uno o más epítopes). La secuencia más corta puede codificar para un epítope neutralizante, el cual se define como un epítope capaz de producir anticuerpos que neutralicen infectividad de virus en una prueba in vitro. Preferiblemente, el péptido debe codificar para un epítope protector que sea capaz de promover en el hospedero una respuesta inmune protectora; es decir, una respuesta inmune mediada por una célula y/o por un anticuerpo que proteja un hospedero inmunizado de infección. En algunos casos, el gen para un antígeno particular puede contener un gran número de intrones o puede ser afecte un virus de ARN, en estos casos, se puede utilizar una copia de ADN complementaria (ADNc). También es posible que se puedan utilizar solamente fragmentos de secuencias de nucleótidos de genes (cuando éstas sean suficientes para 5 generar una respuesta inmune protectora) más que la secuencia completa como se encuentra en el organismo de tipo silvestre. Cuando estén disponibles, se pueden también utilizar genes sintéticos o fragmentos de los mismos. Sin embargo, la presente invención se puede utilizar con una amplia variedad de genes, fragmentos y similares, y no se limita a aquéllos expuestos 0 en la presente. De esta forma, los antígenos codificados por las secuencias de ADN ajeno utilizados en la presente invención, pueden ser polipéptidos o fragmentos inmunogénicos ya sea nativos o recombinantes. Pueden ser secuencias parciales, secuencias de longitud completa o incluso fusiones (por 5 ejemplo, teniendo secuencias guía adecuadas para el hospedero recombinante, o con una secuencia de antígeno adicional para otro patógeno). En una modalidad preferida, los virus mutantes y vectores virales de la presente invención son competentes de replicación. De esta manera, la deleción y/o inserción en el genoma de herpesvirus no destruye su capacidad 0 de réplica. Sin embargo, si la deleción y/o inserción destruye o inhibe de manera significativa la capacidad del herpesvirus para replicarse, la presente invención contempla el uso de líneas de células recombinantes al construir un cassette de expresión que comprenda un herpesvirus de la presente invención iá¡>?¿ ... . . transformar células hospederas con los mismos para proveer líneas o cultivos de células que expresen proteínas codificadas por las secuencias de ADN suprimidas o interrumpidas. Estas líneas de células recombinantes son capaces de permitir 5 que un herpesvirus recombinante que no sea competente de replicación se replique y exprese la secuencia de ADN ajeno o fragmento de la misma la cual está codificada dentro del herpesvirus recombinante. Estas líneas de células también son extremadamente útiles para generar herpesvirus recombinantes, mediante recombinación in vivo seguido de contrasfección 10 mediada por ADN. Cuando los métodos y composiciones de la presente invención se utilicen para vacunación, esto no se limita a ninguna administración particular. Un ejemplo es administración parenteral. Cuando se administran parenteralmente, las vacunas pueden incluir el uso de un portador de vacuna. 15 Los portadores de vacuna se conocen en la técnica: por ejemplo, albúmina de suero de bovino (BSA), albúmina de suero humano (HSA) y hemocianina de lapa (KLH). Una proteína portadora preferida, rotavirus VP6, se describe en la publicación de patente europea No. 0259149. Las vacunas también se pueden administrar oralmente en un 0 vehículo oral adecuado, tal como en una forma de dosificación entérica revestida. Las formulaciones orales incluyen excipientes normalmente utilizados como por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, celulosa de sodio-sacarina, carbonato de magnesio, y similares. Las composiciones de vacuna oral pueden tener forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, que contienen de aproximadamente 10% a aproximadamente 95% del ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%. Se puede preferir una vacuna oral para promover inmunidad de la mucosa en combinación con inmunidad sistémica, lo cual juega un papel importante en protección contra patógenos que infectan el tracto gastrointestinal. Además, la vacuna se puede formular en un supositorio. Para supositorios, la composición de vacuna incluirá aglutinantes y portadores tradicionales, tales como glicoles polialcalinos o triglicéridos. Dichos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en la escala de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10% (p/p), de preferencia aproximadamente 1 % a aproximadamente 2%. Los protocolos para administrar a animales las composiciones de vacuna de la presente invención, dependerán del experto en la técnica considerando la presente descripción. Los expertos en la técnica seleccionarán una concentración de la composición de vacuna en una dosis efectiva para producir un anticuerpo y/o respuesta inmune mediada por células T hacia el fragmento inmunogénico. Dentro de amplios límites, la dosificación no se considera determinante. Normalmente, la composición de vacuna se administra de una manera la cual suministrará entre aproximadamente 1 ,000 microgramos del ¿áü . antígeno de subunidad en un volumen conveniente de vehículo, por ejemplo, aproximadamente 1-10 ce. De preferencia, la dosificación en una inmunización sencilla suministrará de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 microgramos de antígeno de subunidad, de preferencia aproximadamente 5-1 a aproximadamente 100-200 microgramos (por ejemplo, 5-200 microgramos). El tiempo de administración también puede ser importante. Por ejemplo, una inoculación primaria de preferencia puede ser seguida de inoculaciones intensificadoras subsecuentes, si fuera necesario. También se puede preferir, aunque es opcional, administrar una segunda inmunización intensificadora al animal de varias semanas a varios meses después de la inmunización inicial. Para asegurar altos niveles sostenidos de protección contra enfermedad, puede ser útil volver a administrar una inmunización intensificadora a los animales en intervalos regulares, por ejemplo una vez cada varios años. De manera alternativa, una dosis inicial se puede administrar oralmente seguido de inoculaciones posteriores, o viceversa. Los protocolos de vacunación preferidos se pueden establecer a través de experimentos de protocolos de vacunación de rutina. Un herpesvirus recombinante de la presente invención también puede proveer una forma para distinguir un animal vacunado con la vacuna de la presente invención de un animal infectado con un herpesvirus infeccioso de tipo silvestre, natural u otro patógeno. Esto es posible, debido a que el herpesvirus recombinante contiene ADN ajeno el cual codifica para un número limitado de antígenos de los virus antes mencionados que son necesarios para conferir inmunidad protectora a los patógenos correspondientes. En consecuencia, los animales hospederos vacunados con aquellos herpesvirus recombinantes, se pueden distinguir de aquéllos que han sido infectados con virus de enfermedad de bolsa infecciosa de tipo silvestre, virus de enfermedad de Marek, virus de enfermedad de Newcastle, virus de laringotraqueítis infecciosa o virus de bronquitis infecciosa por la ausencia de antígenos que normalmente están presentes en los virus de tipo silvestre. Más aún, cuando el vector de herpesvirus contiene una deleción de una porción de su genoma que codifica para un polipéptido inmunogénico, la falta de una respuesta inmune del animal vacunado al producto de la porción suprimida indicará un animal vacunado. La invención incluye además un método para proveer terapia génica para un animal en necesidad del mismo para controlar una deficiencia de genes, el cual comprende administrar a dicho animal un herpesvirus recombinante vivo que contiene una secuencia de nucleótidos ajenos que codifican para una forma no defectuosa de dicho gen bajo condiciones en donde el genoma de vector de virus recombinante se incorpora en dicho genoma de mamífero o se mantiene de manera independiente y extracromosómicamente para proveer expresión del gen requerido en el tejido u órgano objetivo. Estos tipos de técnica se utilizan por los expertos para reemplazar un gen defectuoso o porción del mismo. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,399,346 para Anderson et al describe técnicas para terapia génica. Además, ejemplos de secuencias nucleotídicas de secuencias de ADN ajeno o porciones de las mismas que se pueden incorporar para uso en una terapia génica convencional incluyen, fibrosis cística, gen regulador de conductancia transmembranal, gen de minidistrofina humana, gen alfal -antitripsina y similares. Los métodos para construir, seleccionar y purificar herpesvirus recombinante se detallan a continuación en los ejemplos. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la misma.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Preparación de solución concentrada de virus de enfermedad de Marek (MDV-1) Se prepararon muestras de solución concentrada de virus de enfermedad de Marek al infectar células de cultivo de tejido en una multiplicidad de infección de 0.091 PFU/célula en una mezcla 1 :1 de medio de HAM'S F10 y 199 que contiene 2 mM de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina (estos componentes se obtienen de Sigma o un proveedor equivalente, y en lo sucesivo se refieren como medio de DME completo) más suero fetal de bovino al 1%. Después de que se completó el efecto citopático, el medio y las células se cultivaron y las células se formaron en pellas a 3000 rpm durante 5 minutos en una centrifugadora clínica. Las células infectadas se resuspendieron en medio completo que contiene suero fetal de bovino al 20%, DMSO al 10% y se almacenaron congeladas a -70°C.

EJEMPLO 2 Preparación de ADN de virus de enfermedad de Marek (MDV-1) Todas las manipulaciones de virus de enfermedad de Marek se realizaron utilizando cepa GA5 (ATCC #624) o Rispens CVI-988 (Vineland Labs). Para la preparación de ADN viral de MDV a partir del citoplasma de células infectadas, se infectaron fibroblastos de embrión de pollo primario a un MOI suficiente para ocasionar efecto citopático extenso antes de que las células crecieran en exceso. Todas las incubaciones se realizaron a 39°C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 en aire. Los mejores rendimientos de ADN se obtuvieron al cultivar monocapas, las cuales se infectaron a nivel máximo, pero mostrando lisis de células incompletas (típicamente 5-7 días). Las células infectadas se cultivaron al raspar las células en el medio utilizando un raspador celular. La suspensión celular se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos a 5°C en un rotor GS-3.

La pella resultante se resuspendió en PBS frío (2 ml/botella giratoria) y se sometió a otra centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm en el frío. Después de decantar el PBS, la pella celular se resuspendió en 4 ml/botella giratoria de regulador de pH de RSB (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, y 1.5 mM MgCI2). Se añadió NP40 (Nonidet P-40; Sigma) a la muestra a una concentración final de 0.5% minutos con mezcla ocasional. La mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm en el frío para formar en pellas los núcleos y remover desechos celulares. El fluido del sobrenadante se transfirió cuidadosamente a un tubo de centrifugadora Corex de 15 ml. Se añadieron EDTA (0.5M pH 8.0) y SDS (dodeciisulfato de sodio; solución concentrada al 20%) a la muestra para concentraciones finales de 5 mM y 1 %, respectivamente. Se añadieron cien microlitros de proteinasa-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim) por 4 mililitros de muestra, se mezcló e incubó a 45°C durante 1-2 horas. Después de este período, se añadió un volumen igual de fenol saturado en agua a la muestra y se mezcló suavemente a mano. La mezcla se revolvió en una centrifugadora clínica durante 5 minutos a 3000 rpm para separar las fases. Se añadió NaAc a la fase acuosa para una concentración final de 0.3M (solución concentrada 3M pH 5.2), y el ácido nucleico se precipitó a -70°C durante 30 minutos después de la adición de 2.5 volúmenes de etanol absoluto frío. El ADN en la muestra se formó en pella al revolver durante 20 minutos a 8000 rpm en un rotor HB-4 a 5°C. El sobrenadante se removió cuidadosamente y la pella de ADN se lavó una vez con 25 ml de etanol a 80%. La pella de ADN se secó rápidamente al vacío (2- _¡ t.»i__l» -_ £^;>"¡a &*"' — - **?* . 3 minutos), y se resuspendió en 50 microlitros/botella giratoria de células infectadas de regulador de pH de TE (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA). Normalmente, los rendimientos de ADN viral se encontraron en la escala entre 5-10 microgramos/botella giratoria de células infectadas. Todo el ADN se almacenó a aproximadamente 10°C.

EJEMPLO 3 Secuenciación de ADN La secuencíación de ADN se realizó mediante reacciones de secuenciación didesoxi marcadas con fluorescente utilizando Equipo de Reacción Facilitada para Secuenciación de Ciclo de Terminador de Colorante ABI PRISM con polimerasa de ADN Amplitaq, FS (Perkin-Elmer; según las instrucciones del fabricante) y se sometió a electroforesis en un secuenciador de ADN automatizado de Perkin-Elmer/Applied Biosystems modelo 373A de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones que utilizan tanto mezclas de dGTP como las mezclas de dITP se realizaron para clarificar áreas de compresión. De manera alternativa, las áreas comprimidas se resolvieron en geles de formamida. Los moldes eran subclones de plásmidos de doble cadena o subclones de M13 de cadena sencilla, y los iniciadores se realizaron para el vector justo fuera del inserto a ser secuenciado o para la secuencia previamente obtenida. La secuencia obtenida se ensambló y comparó utilizando el programa y sistema de programación DNAStar.

EJEMPLO 4 Técnicas biológicas moleculares Las técnicas para la manipulación de bacterias y ADN, incluyendo dichos procedimientos como digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis de gel, extracción de ADN a partir de geles, ligación, fosforilación con cinasa, tratamiento con fosfatasa, crecimiento de cultivos bacterianos, transformación de bacterias con ADN, y otros métodos biológicos moleculares, se describen por J. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, 1989 y Current Protocols in Molecular Biology (1992) John Wiley & Son's, Inc. Con excepción de lo mencionado, éstas se utilizaron con variación menor.

EJEMPLO 5 Reacción de llenado de polimerasa Se resuspendió ADN en regulador de pH que contiene 50 mM Tris pH 7.4, 50 mM KCl, 5 mM MgCI2, y 400 micromolares cada uno de los cuatro desoxinucleótidos. Se agregaron diez unidades de ADN polimerasa Klenow (BRL) y la reacción se dejó continuar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego el ADN se extrajo en fenol y se precipitó en etanol como se mencionó anteriormente. ll &ÍÍ^^^ j^^ &£_^K EJEMPLO 6 Clonación con la reacción de cadena de polimerasa Se utilizó la reacción de cadena de polimerasa (PCR) para introducir sitios de restricción convenientes para la manipulación de diferentes ADN. Los procedimientos utilizados se describen por M. A. Innjis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, 84-91 , Academic Press, Inc., San Diego, 1990). En general, los fragmentos amplificados eran inferiores a 500 pares de bases de tamaño y las regiones críticas de fragmentos amplificados se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los iniciadores utilizados en cada caso se detallan en las descripciones de la construcción de vectores de homología más adelante.

EJEMPLO 7 Preparación de usados de células infectadas Se infectó una monocapa confluente de células de fibroblastos de embrión de pollo secundario en un matraz de 25 cm2 o una caja de Petri de 60 mm con 100 microlitros de muestra de virus. Después de que se completó el efecto citopático, el medio y las células se cultivaron y las células se convirtieron a pella a 300 rpm durante 5 minutos en una centrifuga clínica. Se resuspendió la pella de célula en 250 microlitros de regulador de pH de desintegración (dodeciisulfato de sodio al 2%, beta-mercapto-etanol al 2%).

Lá^ j_-___c__&__í_i___. . . A i . I i Se sometieron las muestras a sonido de alta frecuencia durante 30 segundos sobre hielo y se almacenaron a -20°C.

EJEMPLO 8 Procedimiento Western Blot Se manejaron muestras de usados y muestras de proteína sobre un gel de poliacrilamida de acuerdo con el procedimiento de Laemnli.R.V. (1970) Nature 277:680. Después de la electroforesis del gel, se transfirieron y procesaron las proteínas de acuerdo con Sambrook et al. (1989). Se diluyó el anticuerpo principal a 1 :100 con leche seca no grasa al 5% en cloruro de tris-sodio y azida de sodio (TSA: 6.61 g de Tris-HCl, 0.97 g de base Tris, 9.0 de NaCI y 2.0 g de azida de sodio por litro de H2O). El anticuerpo secundario fue fosfatasa alcalina conjugada y diluida a 1 :1000 con TSA.

EJEMPLO 9 Procedimiento de clonación de ADNc La clonación de ADNc se refiere a métodos usados para convertir moléculas de ARN a moléculas de ADN siguiendo procedimientos del estado de la técnica. Se describen métodos de los solicitantes en U.

Gubler y B. Hoffman, Gene 25, 263-269. Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, Md.) han designado un equipo de clonación de ADNc que es muy similar a los procedimientos usados por los solicitantes y contiene un conjunto de reactivos y protocolos que se pueden usar para duplicar nuestros resultados. Para clonar especies de ARNm de virus, se infectó una línea de célula hospedera sensible a la infección por virus, en unidades de formación de 5-10 placas por célula. Cuando el efecto citopático era evidente, pero antes de la destrucción total, se retiró el medio y se usaron las células en regulador de pH de lisis de 10 ml (tiocionato de guanidina a 4M, antiespuma A al 0.1 %, citrato de sodio a 25 mM, pH 7.0, N-laurilsarcosina al 0.5%, ß-mercaptoetanol a 0.1M). Se vertió el lisado de células a un homogeneizador Dounce esterilizado y se homogeneizó sobre hielo 8-10 veces hasta que la solución estuvo homogénea. Para la purificación de ARN, se estratificaron lentamente 8 ml de lisado de célula sobre 3.5 ml de solución de CsCI (CsCI a 5.7M, citrato de sodio a 25 mM, pH 7.0) en tubo centrífugo Beckman SW41. Se centrifugaron las muestras durante 18 horas a 20°C a 36000 rpm en un rotor Beckman SW41. Se pusieron los tubos sobre hielo y se retiraron cuidadosamente los sobrenadantes de los tubos por aspiración para dejar la pella de ARN intacta. Se resuspendió la pella en agua destilada en vaso de 400 microlitros y 2.6 ml de solución de guanidina (guanidina-HCL a 7.5 M, citrato de sodio a 25 mM, pH 7.0, ditiotritol a 5 mM) fueron añadidos. Se añadieron 0.37 volúmenes de ácido acético a 1 M, seguido por 0.75 volúmenes de etanol frío y se puso la muestra a 20°C durante 18 horas para precipitar el ARN. Se juntó el precipitado por centrifugación en una centrífuga Sorvall durante 10 minutos a 4°C a 10000 rpm en un rotor SS34. Se disolvió la pella en 1.0 ml de agua destilada, se recentrifugó a 13000 rpm y se guardó el sobrenadante. Se reextrajo ARN de la pella 2 veces más como antes, con 0.5 ml de agua destilada y se agruparon los sobrenadantes. Se añadió 0.1 volumen de solución de acetato de potasio a 2M a la muestra seguida por 2 volúmenes de etanol frío y se puso la muestra a -20°C durante 18 horas. Se reunió el ARN precipitado por centrifugación en un rotor SS34 a 40°C durante 10 minutos a 10000 rpm. Se disolvió la pella en 1 ml de agua destilada y se tomó la concentración por absorción A260/280. Se almacenó el ARN a -70°C. Se seleccionó el ARNm que contenía extremos de poliadenilato (poli-A) usando oligo-dT-celulosa (Pharmacia #27 5543-0). Se hirvió tres mg de ARN total y se enfrió y aplicó a la columna de 100 mg de oligo-dT-celulosa en regulador de pH de enlace (tris a 0.1 M pH 7.5, LiCl a 0.5M, EDTA a 5 mM pH 8.0, dodeciisulfato de litio al 0.1 %). Se eluyó el ARN con poli-A retenido procedente de la columna con regulador de pH de elución (tris a 5mM pH 7.5, EDTA a 1 mM pH 8.0, dodeciisulfato de sodio al 0.1 %). Se volvió aplicar este ARNm a una columna de oligo-dT en regulador de pH de enlace y se eluyó nuevamente en regulador de pH de elución. Se precipitó la muestra con acetato de sodio a 200 mM y dos volúmenes de etanol frío a -20°C durante 18 horas. Se resuspendió el ARN en 50 microlitros de agua destilada. Se desnaturalizó 10 microgramos de ARN con poli-A, en hidróxido de metilmercurio a 20 mM durante 6 minutos a 22°C. se añadió ß- mercaptoetanol a 75 mM y se incubó la muestra durante 56 minutos a 22°C.

"*- La mezcla de reacción para la síntesis de ADNc de la primera cadena en 0.25 ml contenía 1 microgramo de iniciador de oligo-dT (P-L Bio-chemicals) o 1 microgramo de iniciador sintético, 28 unidades de inhibidor de ribonucleasa placental (Bethesda Research Labs #5518SA), tris a 100 mM pH 8.3, KCl a 140 mM, MgCI2 a 10 mM, DATP a 0.8 mM, dCTP, dGTP y dTTP (Pharmacia), 100 microcuries dCTP marcado con 32P (New England Nuclear #NEG-013H) y 180 unidades de transcriptasa inversa AMV (Molecular Genetics Resources #MG 101 ). Se incubó la reacción a 42°C durante 90 minutos y se terminó luego con EDTA a 20 mM pH 8.0. Se extrajo la muestra con un volumen igual de fenol/cloroformo (1 :1) y se precipitó con acetato de amonio a 2M y 2 volúmenes de etanol frío a -20°C durante 3 horas. Después de la precipitación y la centrifugación, se disolvió la pella en 100 microlitros de agua destilada. Se puso la muestra sobre una columna de 15 ml de G-100 Sephadex (Pharmacia) en regulador de pH (tris a 100 mM pH 7.5, EDTA a 1 mM pH 8.0, NaCI a 100 mM). se agrupó el borde de ataque de las fracciones de ADN eluidas y se concentró el ADN por liofilización hasta que el volumen fue de aproximadamente 100 microlitros, se precipitó luego el ADN con acetato de amonio más etanol como antes. Se usó la muestra entera de la primera cadena para la segunda reacción de cadena que siguió el método de Gubler y Hoffman (mencionado anteriormente), excepto que se usaron 50 microgramos/ml de dNTP, 5.4 unidades de polimerasa I de ADN (Boerhinger Mannheim #642-711 ), y 100 unidades/ml de ligasa de ADN de E. coli (New England Biolabs #205) en un volumen total de 50 microlitros. Después de la segunda síntesis de cadena, se le extrajo el fenol/cloroformo al ADNc y se precipitó. Se resuspendió el ADN en 10 microlitros de agua destilada, se trató con 1 microgramo de ARNasa durante 10 minutos a 22°C y se sometió a electroforesis a través de un gen de agarosa (agarosa sigma del tipo II) en 3-acetato a 40 mM pH 6.85. Se liofilizó el ADN electroeluído a aproximadamente 100 microlitros y se precipitó con acetato de amonio y etanol como antes. Se resuspendió el ADN en 20 microlitros de agua. Se añadieron extremos de oligo-dC al ADN para facilitar la clonación. La reacción contenía el ADN cacodilato de potasio a 100 mm pH 7.2, ditiotreitol a 0.2 mm Cacl2 a 2 mM, 80 micromoles de dCTP y 25 unidades transferasa terminal de deoxinucleotidilo (Molecular Genetic Resources #S1001 ) en 50 microlitros. Después de 30 minutos a 37°C, se terminó la reacción con EDTA a 10 mM y se le extrajo el fenol/cloroformo a la muestra y se precipito como antes. Se recosió la muestra de ADN con extremo de dC a 200 ng de vector plasmídico pBR322 que contenía extremos de oligo-dG (Bethesda Research Labs #5355 SA SB) en 200 microlitros de tris a 0.01 M pH 7.5, NaCI a 0.1 M, EDTA a 1 mM pH 8.0 a 65°C durante 2 minutos y luego a 57°C durante 2 horas. Se prepararon y transformaron células DH-1 competentes nuevas de E. coli, como describe D. Hanahan, Molecular Biology 166, 557-580, 1983, usando la muestra de ADNc recocido en veinte alícoatas de 200 microlitros de células. Se colocaron las células transformadas sobre placas de *«# gar de caldo L más 10 microgramos/ml de tetraciclina. Se tamizaron colonias par ala presencia de materiales insertados al gen de amplicilina usando Ampscreen (Bethesda Research Labs #5537 UA), y se recogieron las colonias positivas para su análisis.

EJEMPLO 10 Transfección de ADN para generar virus recombinantes de la enfermedad de Marek El método se basó en el procedimiento mediante polibreno- DMSO de Kawai y Nishizawa, Mol. y Cell. Biol. 4:1172-1174 (1984) con las siguientes modificaciones. La generación del virus recombinante MDV es dependiente de la recombinación homologa entre el ADN viral de MDV y el vector de homología de plásmido que contiene el ADN extraño deseado flanqueado por las secuencias clonadas apropiadas de virus del herpes. Se llevaron a cabo las transfecciones en placas de 6 cm (plástico Comining) de células primarias confluentes de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Se secaron las células de las placas el día anterior en los medios de cultivo CEF (1X F10/199, suero de becerro fetal al 5%, glutamina al 2%, aminoácidos no esenciales al 1% y penicilina/estreptomicina a 2%) que contenían cuatro microgramos/ml de polibreno (provisión de 4 mg/ml en 1X HBSS). Se añadió luego la suspensión de ADN-plibreno (1 ml) a una placa de 6 cm de células CEF de las cuales se habían aspirado los medios e incubado a 39°C durante 30 minutos. Se agitaron las placas periódicamente durante este tiempo para distribuir el inoculo. Después de este período, se añadió 4 ml de medios de cultivo CEF directamente a la placa de lavado y se incubó durante 2.5 horas adicionales a 39°C. En este momento, se retiraron los medios de cada placa y se alteraron las células con 2 ml de DMSO al 30% (sulfóxido de dimetilo, J. T. Baker Chemical Co., Philipsburg, NJ) en HBSS 1X durante 4 minutos a temperatura ambiente. Se retiro cuidadosamente el DMSO al 30% y se lavaron las monocapas una vez con HBSS 1X a temperatura ambiente. Se incubaron con algunas células a 39°C después de la adición de 5 ml de medios de cultivo CEF. Al siguiente día se cambiaron los medios para retirar cualquier traza final de DMSO y para estimular el cultivo de las células. El efecto citopático del virus se hace evidente en el transcurso de 6 días. Se puede hacer usualmente la generación de un stock de lato título (CPE al 80%-90%) en el transcurso de una semana a partir de esta fecha. Se prepararon muestras de stock MDV resuspendiendo las células infectadas en los medios de crecimiento CEF que contenían suero de becerro fetal a 20%, DMSO al 10% y se almacenaron a -70°C.

EJEMPLO 11 Tamiz para virus recombinantes de la enfermedad de Marek gue expresa ß-galactosidasa (ensayos bluogal y CPRG ) o ß-blucoranidasa (ensavo X- Gluc) Cuando se incorporó el gen marcador ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli a un virus recombínante, se visualizaron las placas que contenían los recombinantes mediante uno de dos métodos sencillos. En el primer método, se incorporó (200 µg/ml) el bluogal™ QUÍMICO (Life Sciences Technology, Bethesda, MD) a la capa de agarosa durante el ensayo de placa y las placas que expresaban la ß-galactosidasa activa se pusieron azules. Se trasladaron luego las placas azules sobre células CEF frescas y se purificaron por aislamiento adicional de las placas azules. En el segundo método se incorporó (400 µg/ml) CPRG (Boehringer Mannheim) a la capa de agarosa durante el ensayo de placa y las placas que expresaban la ß-galactosidasa activa se pusieron rojas. Se trasladaron luego las placas rojas sobre células CEF frescas y se purificaron por aislamiento adicional en las placas rojas. En ambos casos, se purificaron típicamente los virus con tres a cuatros ciclos en purificación en plata. Cuando se incorporó el gel marcador de ß-glucuronidasa (uidA) de E. coli aún virus recombinante, se visualizaron las placas que contenían los recombinantes usando el substrato cromogénico, se incorporó (200 µg/ml) X- ß-D-gluUA CHX (X-GLUC; ácido 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-ß-D-glucurónico, sal de ciclohexilamonio; Biosynth AG; Suiza) a la capa de agarosa durante el ensayo en placas y las placas que expresaban la ß-glucuronidasa activa se pusieron azules. Se trasladaron luego las placas azules a las células CEF frescas y se purificaron por aislamiento adicional en las placas azules.

EJEMPLO 12 Tamiz para la expresión extraña de secuencias de ADN en virus recombinantes de la de Marek usando ensayos en placas negras Para analizar la expresión de antígenos extraños expresados por virus MDV recombinantes, se infectaron monocapas de células de CEF con MDV recombinante, se recubrieron con medios nutrientes de agarosa y se incubaron durante 4-5 días a 39°C. Una vez que las placas se han desarrollado, se retira la capa de agarosa del plato se enjuaga la monocapa 1X con PBS, se fija con metanol al 100% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se secan con aire las células. Después de rehidratar la plata con PBS, se diluye el anticuerpo primario a la dilusión apropiada con PBS y se incuba con la monocapa de células durante dos horas y hasta durante la noche a temperatura ambiente. Se retira luego el anticuerpo no unido de las células lavando tres veces con PBS a temperatura ambiente. Se diluye con PBS el anticuerpo secundario conjugado con fosfotasa alcalina y se incuba con las células durante 2 horas a temperatura ambiente. Se retira luego el anticuerpo secundario no unido t.» id ¡Í,-« _.a__¿. _ M¿i_a. lavando las células tres veces con PBS a temperatura ambiente. Enseguida, se enjuaga la monocapa al regulador de pH de desarrollo (Tris a 100mM pH 9.5/NaCI a 100mM/MgCI2b a 5 mM) y se incuba luego 10 minutos y hasta durante la noche a temperatura ambiente con solución de substrato preparada recientemente (0.3 mg/ml de tetrazolium nitro + 0.15 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-lndolilfosfatasa el regulador de pH de desarrollo de color). Finalmente, se detiene la reacción remplazando la solución de substrato con TE (tris a 10 mM, pH 7.5/EDTA a 1 mM). Las placas que expresan el antígeno correcto se teñirán de negro.

EJEMPLO 13 Plásmido gue tiene ADN extraño insertado al marco de lectura abierta de UL54.5 del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek Se construyo el plásmido con 240-29.2 con el propósito de insertar ADN extraño al tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (MDV-1 ). Comprende el fragmento génomico BamHI"M" de aproximadamente 2596 pares de base del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (SEQ ID NO:1 ). Los tres marcos de lectura abierta dentro del fragmento BamHI"M" son los homólogos del virus del herpes del ORF UL54 (ICP27) (posición 1 a 1353 de SEQ ID NO: 1 ), un ORF no identificado previamente llamado en lo sucesivo UL54.5 (Posición 2187 a 1483 de SEQ ID NO: 1 ) y UL55 (Posición 2459 a 2593 de SEQ ID NO: 1 ) (véanse las figuras 1 y 2). Se ha publicado la Í ? •> ?,sU?i.t, -- '* •** secuencia de ADN (1492 pares de base) que se extiende sobre el MDV-1 UL54 (ICP27) (Virologi 1994 Oct; 204(1 ):242-50). El MDV ICP27, con base en la significante similaridad al HSV-1 ICP27, es 1419 nucleotiodos de longitud y codifica a 473 aminoácidos (54.5 kDa). El ORF UL55 estaba troncado y contenía solamente los 49 primeros aminoácidos de esta proteína. Se identificó un ORF potencial entre UL54 y UL55. Este ORF es de 705 pares de base en longitud y codifica potencialmente una proteína de 235 aminoácidos de tamaño. Las investigaciones de BLAST sobre bases de datos de proteínas que usan las secuencia de aminoácido UL54.5 identifico un gen similar en MDV-2 (Virology 1994 Mayo 15.201 (1 ): 142-6) Se notó que el gen MDV-2 compartía poca homología con el tipo del virus del herpes equino en el primer marco de lectura abierta (ORF-1 ). El índice similiaridad de las proteínas UL54.5 de MDV-1 y MDV-2 es 63 por ciento mayor que una longitud de consenso de 170 aminoácidos. Se transcribe UL54.5 en la orientación opuesta en relación con UL54 y UL55. El ORF UL54.5 es no esencial y se inserta el ADN extraño dentro este ORF en la región intergénica entre los ORF. Cualquier sitio de restricción dentro de esta región es útil como sitio inserción para el ADN extraño. El sitio de enzima de restricción dentro de esta región que no es única se altera por inserción de un enlazador de ADN que convierte el sitio a una secuencia única de reconocimiento de enzima de restricción. Preferiblemente, este sitio de enzima de restricción para la inserción de ADN extraño es un sitio de Ndel aproximadamente en el nucleótido 2173 dentro del fragmento genómico yá??aAÍAÍv ? n? aiffit**».* ^t¡^A_ s_A^t^ ..M. ßamHI "M" de 2596 pares de base. El sitio de inserción está dentro del ORF UL54.5 entre los aminoácidos 4 y 5 del marco de lectura abierto. Se derivó el vector plasmídico de un fragmento de restricción ßamHI de aproximadamente 3045 pares de base de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un fragmento genómico ßamHI "M" de 2596 pares de base del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek. Se usó el plásmido 440-29.2 para hacer vectores de homología para la inserción de ADN extraño en el virus recombinante de la enfermedad de Marek.

EJEMPL0 14 Plásmido gue tiene ADN de virus infeccioso de laringotragueítis insertado al marco de lectura abierta de UL54.5 del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek Se construyó el plásmido 980-85.01 con el propósito de insertar ADN extraño al tipo 1 del virus recombinante de la enfermedad de Marek (MDV-1 ). Incorpora los genes gD y gl del virus ILT y el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli flanqueado por ADN de MDV-1. Se insertaron estos genes a un sitio único de Nde\ a un sitio Pací usando enlazadores sintéticos de ADN. Hacia el extremo 5' de la secuencia de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 422 pares de base de ADN de MDV. Hacia el extremo 3' de las secuencias de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 2174 pares de base de ADN de MDV. La dirección de la ?HMM ?A_?AÍÍ_¿. ¿*>___ .^.afafc^ . transcripción de los genes gD y gl del virus ILT y el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli es opuesta a la dirección de la transcripción de UL54 de MDV y los ORF de UL55. Cuando se usa el plásmido de acuerdo con la transfección de ADN para genera el virus recombinante 11 de la enfermedad de Marek y el tamiz para el virus recombinante de la enfermedad de Marek que expresa ß-galactosidasa (ensayos de bluogal y CPRG) o ß-glucoronidasa (ensayo X-gluc), (ejemplo 11 ), resultará un virus que contiene ADN que codifica las secuencias de ADN extraño. Se expresan los genes de gD y gl de ILTV como transcritos traslapantes de sus propios promotores de ILTV endógenos respectivos y comparten su propia señal de poliadenilación endógena y se transcribe el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli. desde el promotor gX de PRV y es seguido por la señal de poliadenilación de gX de PRV. Se construyó el plásmido 980-85.1 utilizando procedimientos regulares de ADN recombinante, uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de ADN sintético. Se insertó gD, gl y el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli de ILT como cassette al vector de homología 440-29.2 en el sitio único Nde\ que se convirtió al sitio Pací usando enlazadores de ADN sintético. Se derivó el vector plasmídíco de un fragmento de restricción Hind\\\ de aproximadamente 3045 pares de base de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de Bam \ a Ndel de aproximadamente 418 pares de base del fragmento de restricción M de fíamHI de MDV. El fragmento 2 es un subfragmento de fcát.ri. j . t. ¿S-Í.Í. __ .-.. _.._-. .. _ J_ ._. A .. . Í_______t_i____. restricción de Sa/I a Hind\\\ de aproximadamente 3556 pares de base del fragmento genómico #8 de ILTAsp718l (10.6 kilobases). El fragmento 3 es un subfragmento de restricción de Sa/I a fía/nHI de aproximadamente 413 pares de base del fragmento de restricción #10 de ßamHI de PRV. El fragmento 4 es un fragmento de restricción de BamHI a Pvull de aproximadamente 3010 pares de base del plásmido pJF751 (11). El fragmento 5 es un subfragmento de restricción de Ndel a Salí de aproximadamente 754 pares de base del fragmento de restricción #7 ßa HI de PRV. El fragmento 6 es un subfragmento de restricción de Ndel a BamHl de aproximadamente 2174 pares de base del fragmento de restricción M de ßamHI de MDV.

EJEMPLO 15 Plásmido gue tiene ADN del virus de la enfermedad de Newcastle insertado al marco de lectura abierta de UL54.5 de tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek Se construyó el plásmido 980-46.74 con el propósito de insertar ADN extraño al tipo 1 del virus recombinante de la enfermedad de Marek (MDV-1 ). Incorpora un gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli un gen F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) flanqueado por ADN de MDV. Se insertaron el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen F de NDV como cassette al vector de homología 440-29.2 (ejemplo 13) al sitio único Ndel convertido al sitio Pací usando enlazadores de ADN sintético.

Li» ti» i Í_ J_S_t.,:Í.Í-_____.. - Hacia el extremo 5' de las secuencias de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 422 pares de base de ADN de MDV. Hacia el extremo 3' de las secuencias de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 2174 pares de base de ADN de MDV. La dirección de transcripción del gel marcador de beta-galactosidasa (lacZ) de E.coli y el gen F de NDV es opuesta a la dirección de transcripción de los ORF de UL54 y UL55 de MDV. Cuando se usa el plásmido de acuerdo con la transcripción de ADN para generar el virus recombinante de la enfermedad Marek (ejemplo 10) y en tamiz para el virus recombinante de la enfermedad de Marek que expresa beta-galactosidasa (ensayos de bluogal y CPRG) o beta-glucuronidasa (ensayo de X-gluc), (ejemplo 11 ), resultará un virus que contiene ADN que codifica las secuencias de ADN extraño. El gen F de NDV está bajo el control de promotor temprano inmediato de HCMV y seguido por la señal de poliadenilación de TK de HSV. Se transcribe el gen marcador de beta-galactosidasa (lacZ) de E.coli a partir del promotor gX de PRV y es seguido por la señal de poli adenilación de gX de PRV. Se construyó el plásmido 980-85.1 utilizando procedimientos regulares de ADN recombinante, uniendo las fragmentos de restricción a partir de las siguientes fuentes con la secuencias de ADN sintético. Se insertaron el gen marcador de beta-galactosidasa (lacZ) de E. Coli y el gen F de NDV como cassette al vector de homología 440-29.2 (ejemplo 13) en el sitio único Ndel que se convirtió al sitio Pací usando en asadores de ADN sintético. Se derivó el vector plasmídico de un fragmento de restricción Hindlll de a_ _. -«toSS ... .a_ _fc _ _ i . aproximadamente 3045 pares de base de Psp64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de BamHI a Ndel de aproximadamente 418 pares de base del fragmento de restricción M BamHI de MDV. El fragmento 2 es un subfragmento de restricción de Salí a BamHI de aproximadamente 413 pares de base del fragmento de restricción número 10 BamHI de PRV. El fragmento 3 es un fragmento de restricción de BamHI a Pvull de aproximadamente 3010 pares de base del plásmido pJF751. El fragmento 4 4 es un subfragmento de restricción de Ndel A Salí de aproximadamente 754 pares de base del fragmento de restricción número 7 de BamHI de PRV. El fragmento 5 es un subfragmento de restricción de Pstl a Aval I de aproximadamente 1191 pares de base del fragmento Xbal E genómico de HCMV. El fragmento 6 es un fragmento de restricción de BamHI a Pstl de aproximadamente 1812 pares de base del clon de ADN de NDV F de longitud completa (cepa B1). El fragmento 7 es un subfragmento de restricción de Smal a Smal de aproximadamente 784 pares de base del fragmento de restricción Q BamHI de HSV. El último fragmento es un subfragmento de restricción de Ndel a BamHI de aproximadamente 2174 pares de base del fragmento de restricción "M" de BamHI de MDV. it.?.. _. .4«ijM ***&».. «a— . , „ ...^.Í&^.J,., , . . ___ _. ______ __-,_. i í S Üí=á EJEMPLO 16 Plasmido gue tiene ADN extraño insertado al marco de lectura abierta de UL43 del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek Se construyó el plásmido 962-80.1 con el propósito de insertar ADN extraño al tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (MDV-1 ). Comprende el subfragmento de Sacl a Bglll de aproximadamente 3212 pares de base contenidas dentro del fragmento genómico "B" de BamHI del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (SEQ ID NO: 2). Tres marcos de lectura abierta dentro del fragmento Sacl a Bglll de 3212 pares de base son los homólogos del virus del herpes del ORF UL42 (Posición 35 a 1144 de SEQ ID NO: 2), UL43 (Posición 1304 a 2566 de SEQ ID NO: 2) y UL44 (Ge) (Pocisión 2786 A 3220 de SEQ ID NO: 2) (véase las figuras 3 y 4). Se han publicado secuencias de ADN (732 pares de base) que se extienden sobre el gen UL44 (gC) de MDV-1 y la región promotora (virus genes 3, 125-137 (1989)) se ha publicado la secuencia de ADN de los genes MDV-2 UL42, UL43 y UL44 (J. Gen Viral, 79 (Pt 8), 1997-2001 (1998). El índice de similaridad de las proteínas UL42 de MDV-1 y MDV-2 está a 74 por ciento arriba de la longitud de consenso de 369 aminoácidos. El índice de similaridad de las proteínas UL42 de MDV-1 y MDV-2 está a 54 por ciento arriba de la longitud de consenso de 401 aminoácidos. El índice se símilaridad de las proteínas UL44 de MDV-1 y MDV-2 está a 45% arriba de la longitud de 145 aminoácidos. El ORF UL43 de Mdv-1 es no esencial y se inserta en ADN extraño dentro de este ORF o en la región Intergénica entre los ORF. Cualquier sitio de restricción dentro de esta región es útil como sitio de inserción para el ADN extraño. El sitio de enzima de restricción dentro de está región que no es única se altera por la inserción de un enlazador de ADN que convierte el sitio a una secuencia única de reconocimiento de enzima de restricción. Preferiblemente, el sitio de enzima de restricción usado para la inserción de ADN extraño es un sitio Xhol aproximadamente en el nucleótido 1386 dentro del fragmento de Sacl a Bgill de 3212 pares de base contenidos dentro del fragmento genómico "B" de BamHI del tipo 1 del virus de la enfermedad de marek. El sitio de inserción está dentro del ORF UL43 entre los aminoácidos 29 y 30 del marco de lectura abierto. Se derivó el vector del plásmido de un fragmento de restricción de BamHI de aproximadamente 3045 pares de base de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de Sacl a Bglll de aproximadamente 3212 pares de base contenido dentro de fragmento genómico "B" de ßamHI del tipo 1 del virus de enfermedad de Marek. Se uso el plásmido 962-80.1 para hacer vectores de homología para la inserción de ADN extraño en el virus recombinantes de la enfermedad de Marek.

EJEMPLO 17 Plásmido gue tiene ADN de virus infeccioso de Larynotraqueítis insertado al marco de abertura abierta de UL43 del tipo I del virus de la enfermedad de Marek Se construyo el plásmido 980-95.22 con el propósito de insertar ADN al tipo 1 del virus recombinantes de la enfermedad de Marek (MDV-1 ). Incorpora los genes gD y gl del virus ILT y el gel mortador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli blanqueado por ADN MDV-1. Se insertaron estos genes a un sitio Xhol único convertido a un sitio Pací usando en asadores de ADN sintético. Hacia el extremo 5' de la secuencia de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 1386 pares de base de ADN de MDV. Hacia el extremo 3' de las secuencias de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 1826 pares de base de ADN de MDV. La dirección de transcripción de los genes gD y gl del virus ILT y gen marcador de ß- glactosidase (lacZ) de E. coli es la misma dirección de transcripción de los ORF UI42 y UL43 de MDV. Cuando se usa el plásmido de acuerdo con la transfección ADN para general el virus recombinante de la enfermedad de Marek (ejemplo 10) y tamiz para virus recombinante de la enfermedad de Maker que expresa ß-galactosidasa (ensayos de Bluogal y Cprg) o ß- glucuronidasa (ensayo de X-Gluc), (ejemplo 11) como resultará un virus que contiene ADN que codifica secuencias de ADN extraño. Los genes de gD y gl de ILTV se expresan como transcritos translapantes sobre sus propios promotores I LTV endógenos respectivos y comparten su propia señal de poliadenilación endógena, y se transcribe el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E.colil a partir del promotor gX de PRV y es seguido por la señal de poliadenilación gX PRV. Se construyo el plásmido 980-85.22 usando procedimiento regulares de ADN recombinante, uniendo los fragmentos de restricción a partir de las siguientes fuentes con las secuencias de ADN sintético. Se insertaron los genes gD, gl y marcador ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli como cassette al vector de homología 962-80.1 en el sitio Pací usando enlazadores de ADN sintético. Se derivo el vector plasmídico de un fragmento de restricción de Hindlll de aproximadamente 3045 pares de base de pSP64 (Promega, Madison, Wl). El fragmento 1 es un sufragmento de restricción de Sacl a Xhol de aproximadamente 1386 pares de base contenido dentro del fragmento genómico "B" de fíamHI del tipo del virus de la enfermedad de Marek. El fragmento es un subfragmento de restricción de Salí a Hindlll de aproximadamente 3556 pares de base del fragmento genómico número 8 ILTAsp718l (10.6 kilobases). El fragmento tres es un subfragmento de restricción de Salí a fíamHI de aproximadamente 413 pares de base del fragmento de restricción número 10 de fíamHI de PRV del fragmento 4 es un fragmento de restricción de fíamHI a Pvull de aproximadamente 3010 pares de base del plásmído pJF751 (11 ). El fragmento 5 es un subfragmento de restricción de Ndel a Salí de aproximadamente 754 pares de base del fragmento de restricción número 7 de SamHI de PRV. El fragmento 6 es un subfragmento de restricción de Xhol a ßgll de aproximadamente 1826 pares de base contenido de otro fragmento genómico de "B" de ßamHI del tipo I del virus de enfermedad Marek.

EJEMPL0 18 Tipo 1 del virus recombinante de la enfermedad de Marek gue tiene ADN de virus infeccioso de Laringotracheitis insertado al marco de lectura abierta de UL43 S-MDV-006 es un virus de tipo 1 de la enfermedad de Marek dispersa tres secuencias de ADN extraño. Se insertaron los genes para gD y gl del virus ILT y el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli al sitio de restricción véase I único (se insertaron enlazadores véase I al sitio de restricción Xhol único en el ORF UL43 de subfragmento de Sacl a ßsljl de aproximadamente 3212 pares de base contenido dentro del fragmento genómico "B" de ßamHI del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek. Se expresa los genes gD y gl de I LTV como transcriptos translapantes a partir de sus propios promotores de ILTV endógenos respectivos y comparten su propia señal de poliadenilación endógena, y se transcribe el gen marcador ß- galactosidosa (lacZ) de E. coli a partir del promotor gX de PRV y es seguido por la señal de poliadenilación gX de PRV. Se derivo S-MDV-006 de S-MDV- 002 (MDV-1 ; CVI-988 Rispens). Se efectuó utilizando el vector de homología 980-85.22 y el virus S-MDV-002 en el procedimiento de transfección de ADN para generar virus recombinante de la enfermedad de Marek (ejemplo 10). El stock de cotransfección fue tamizado por ß-glucoronidasa (ensayo X-Gluc) (ejemplo 11 ). El resultado final de la purificación en placas rojas fue el virus recombinante designado S-MDV-006. Se ensayó este virus para su expresión con ß-galactosidasa, su pureza y su estabilidad de porción insertada mediante vías múltiples monitoreadas por el ensayo en placas azules como se describe en el ejemplo 11. Después de los cuatro ciclos iniciales de purificación, todas las placas observadas eran azules indicando que el virus es puro, estable y que expresa las secuencias de ADN extraño. Se ensayo el S-MDV-006 para su expresión de antígenos específicos de ILT usando el tamiz para la expresión de secuencias de ADN extraño en el virus recombinante de la enfermedad de marek usando ensayos en placas negras (ejemplo 12). Se demostró que el suero anti-ILT de pollo policlonal (SPAFAS) reacciona específicamente con placas de S-MDV-006 y no con placas de control negativas de S-MDV-002. Todas las placas observadas con S-MDV-006 reaccionaron con el suero policlonal indicando que el virus estaba expresando establemente las secuencias de ADN extraño de ILT. Se llevó a cabo el ensayo descrito aquí en células CEF, indicando que las células CEF serían o sustrato adecuado para la producción de vacunas recombinantes de MDV. El S-MDV-006 es un virus recombinante de tipo 1 de la enfermedad de marek que expresa las parotepinas gD y gl de ILT y es útil como vacuna en infección de ILT. El S-MDV-006 es también útil para la inspección de las proteínas gD y gl de ILT.

EJEMPLO 19 Plásmido que tiene ADN del virus de la enfermedad de Newcastle insertado al marco de lectura abierta de UL43 del tipo 1 del virus de la enfermedad de marek Se construyó el plásmido 980-60.02 con el propósito de insertar ADN extraño al tipo 1 del virus recombinante de la enfermedad de marek (MDV-1 ). Incorpora un gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) flanqueado por el ADN de MDV. Se insertaron el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen F de NDV como cassette al vector de homología 962-80.1 al sitio Xhol único convertido al sitio Pací usando enlazadores de ADN sintético. Así necesitamos 5' de la secuencia de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 1386 pares de base de ADN de MDV. Hacia el extremo 3' de las secuencias de ADN extraño está un fragmento de aproximadamente 1826 pares de base de ADN de MDV. La dirección de transcripción del gen marcador ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen F de NDV es la misma dirección de transcripción que los ORF UL42 y UL43 de MDV. Cuando se usa el plásmido de acuerdo con la transcripción de ADN para generar virus recombinante de la enfermedad de marek (ejemplo 10) y *Afa*Ít'!' ... -Ajñáár+i . ,_.___^__. t_?. „^. .. ....,- .... . .fi A. *,.A._. - . ,.._, .±A?&I ,. i..; tamiz para el virus recombinante de la enfermedad de marek que expresa ß-galactosidasa (ensayos de bluogal y Cprg) o ß-glucoronidasa (ensayos de X-Gluc) (ejemplo 11), resulta un virus que contiene ADN que codifica las secuencias de ADN extraño. El gen de F de NDV está bajo el control del promotor temprano inmediato de HCMV y es seguido por la señal de poliadenilación de TK de HSV. Se transcribe el gen marcador de ß-galactosídasa (lacZ) de E. coli a partir del promotor de gX de PRV y es seguido por la señal de poliadenilación de gX de PRV. Se construyó el plásmido 980-85.1 usando procedimientos regulares de ADN recombinante, uniendo fragmentos de retención a partir de las siguientes fuentes con las secuencias de ADN sintético. Se insertaron el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen F de NDV como cassette al vector de homología 962-80.1 en el sitio Xhol único que se convirtió al sitio Pací usando enlazadores de ADN sintético. Se derivó el vector plasmídico a partir de un fragmento de restricción de Hindlll de aproximadamente 3045 pares de base de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de Sacl a Xhol de aproximadamente 1386 pares de base contenido entre el fragmento genómico "B" de ßamHI del tipo 1 del virus de la enfermedad de marek. El fragmento 2 es un subfragmento de restricción de Salí a ßamHI de aproximadamente 413 pares de base del fragmento de restricción #10 de fíamHI de PRV. El fragmento 3 es un fragmento de restricción de Bam l a Pvull de aproximadamente 3010 pares de base del plásmido J.i. .á¿;?»«--iat¿ j>t_^. i...t___-.,_ _ 3í_ _. ._ %. ¡f«pJF751. El fragmento 4 es un subfragmento de restricción de Ndel a Salí de aproximadamente 754 pares de base del fragmento de restricción #7 de ßamHI de PRV. El fragmento 5 es un subfragmento de restricción Pstl a Avall de aproximadamente 1191 pares de base del fragmento Xoal genómico de HCMV. El fragmento 6 es un fragmento de restricción de ßamHI a Psfl de aproximadamente 1812 pares de base del clon de ADNc de F de NDV de longitud completa (cepa B1 ). El fragmento 7 es un subfragmento de restricción de Smal a Smal de aproximadamente 784 pares de base del fragmento de restricción Q de BanHI de HSV. El último fragmento es subfragmento de restricción de Xhol a Bglll de aproximadamente 1826 pares de base contenido dentro del fragmento genómico "B" de BamHl del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek.

EJEMPLO 20 TIPO 1 DEL VIRUS RECOMBINANTE DE LA ENFERMEDAD DE MAREK QUE TIENE ADN DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE INSERTADO AL MARCO DE LECTURA ABIERTA UL43 El S-MDV-004 es un virus de tipo 1 de la enfermedad de Marek expresan dos secuencias de ADN extraño. Se insertan el gen para la fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle y el gen marcador de ß- galactosidasa (lacZ) de E. coli a un sitio de restricción Pací único (enlazadores de Pací insertados a un sitio de restricción Xhol único en el ORF UL43 del ^ ¡£¡¡£¿¿^ ^^^^^^^ subfragmento de Sacl a Bgl II de aproximadamente 3212 pares de base contenidos dentro del fragmento genómico "B" de BamHl del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek). El gen F de NDV está bajo el control del promotor temprano e inmediato de HCMV y se transcribe el gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) de E. coli a partir de un promotor de gX de PRV y es seguido por la señal de poli adenilación de gX de PRV. Se deriva el S-MDV- 004 a partir del S-MDV-002 (MDV-1 : CV1-988 Rispens). Se efectúa esto utilizando el vector de homología 980-60.02 y el virus S-MDV-002 en la transfección de ADN para generar virus recombinante de la enfermedad de Marek (ejemplo 10). Se tamizó el stock de transfección con el tamiz para el virus recombinante de la enfermedad de Marek que expresa ß-galactosidasa (ensayos de Bluogal y Cprg) o ß-glucuronidasa (ensayo de X-Gluc), (ejemplo 11 ). El resultado final de purificación en placas rojas es el virus recombinante designado S-MDV-004. Se ensaya este virus para su expresión de ß- galactosidasa, su pureza y su estabilidad de porción insertada mediante vías múltiples monitoreadas por el ensayo de placas azules como se describe en el ejemplo 11. Después de cuatro ciclos iniciales de purificación, todas las placas observadas azules indicando que el virus es puro, estable y que expresa las secuencias de ADN extraño. Se ensaya el S-MDV-004 para su expresión de antígenos específicos de MDV usando el tamiz para la expresión de secuencias de ADN extraño en virus recombinante de la enfermedad de Marek usando ensayos en placas negras (ejemplo 12). Se demuestra que un anticuerpo monoclonal específico para NDV F reacciona específicamente con placas de SMDV-004 y no con placas de control negativas de S-MDV-002. Todas las placas observadas S-MDV-004 reaccionan con el suero policlonal, indicando que el virus se está expresando establemente con el gel F NDV. Se lleva a cavo el ensayo descrito aquí en células CEF, indicando que las células CEF serían un substrato adecuado para la producción de vacunas recombinantes de MDV. El S-MDV-004 es un virus recombinante de tipo 1 de la enfermedad de Marek que expresa la proteína F de NDV y es útil como vacuna en la infección de NDV. El S-MDV-004 es también útil para la expresión de la proteína F.

EJEMPLO 21 PLASMIDO QUE TIENE ADN EXTRAÑO INSERTADO AL MARCO DE LECTURA ABIERTO UL7 Y/O ENTRE LOS MARCOS DE LECTURA ABIERTA UL8 Y UL7 DEL TIPO 1 DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK Se construye un plásmido con el propósito de insertar ADN extraño al tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (MDV-1 ). Comprende el subfragmento de aproximadamente 7316 pares de base contenido dentro del fragmento genómico "G" de BamHl del tipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (SEQ ID NO:3). Cinco marcos de lectura abierta dentro del fragmento de 7316 pares de base son los homólogos del virus del herpes del marco UL9 ORF (posición 1 a 425 de SEQ ID NO:3), UL8 (posición 439 a 2748 de SEQ ID NO:3), UL7 (gC)(posición 3699 a 2782 de SEQ ID NO:3), UL6 (posición 5704 a 3536 de SEQ ID NO:3) y UL5 (posición 5772 a 7316 de SEQ ID NO: 3) (Véase las figuras 5 y 6). El área entre los ORF UL 8 y UL 7 (posición 2749 a 2781 de SEQ ID NO:3), y la porción de ORF 7 que no traslapa con el ORF UL 6 (posición 2782 a 3535 de SEQ ID NO:3) es no esencial para la replicación viral y se puede usar para crear virus mutantes y/o recombinantes. Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin desviarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Se ofrecen las modalidades específicas descritas en la presente a manera de ejemplo solamente y la invención ha de estar limitada solamente por los términos de las reivindicaciones anexadas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los cuales tales reivindicaciones tienen derecho. 'a,1f f^ - L- *MK . _ «-«t *. *_ .A._ .-aké - •• * — ^- "* *- LISTADO DE SECUENCIAS <110> Schering Corporation <120> Novedosos virus recombinantes y mutantes de herpes <130> SY0994 PCT <140> <141> <150> US 09/289,254 <151> 1999-04-09 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2596 <212> ADN <213> Virus 1 de la enfermedad de Marek <400> 1 ggatcctcct ccgatgaaaa tgccgaagtg actgaaatgg aaacatctgc aaaaacggct 60 aataacaaga atgaagtttt attcgcgcca ccgtgtacgc aggaactttt gaccgaacga 120 ccatctcctg attccaaaaa ttcgcaaggc gacgatgact caaattcaat atatggcaac 180 gtgattcgtg atgctcaaca ctcagcaagt cgatatgcta caaggtgtct tgacaatgca 240 ataccacgga aacgtctacg cttagctaat ttgacagtag attctgcatg catttcccaa 300 actaaacggc cgcacggtac aggcaatcgc aaacaatatc acagacgtaa ttttccgatg 360 tcaccgactt cacaagaaaa aattcatcta cgattgcaca accgacttgg atctcggagc 420 gaaaaacagc agcgcagtct aaattacgac cgacgtctgc aagaagggca tcaccgaaga 480 agattctaca gtgagagacg tatttatgat caaaatcata gtcaccatcg tacacacgat 540 atacgggtac cattggaaaa atatagagtt tccagacaac atgatctccc tgtccatgag 600 gaactaaacg aaatacttca aagagagaaa caccgtctgg cctctatttc aaatgagtgt 660 gattttcgcg tttcgagcaa aaatcgatgg gctgccgtat taacattttc aagcaacgcg 720 |»^^^^^^ gagagtacct tatgtggtcc tcagataaca tgggagtatt tattgcatgc gggtccagag 780 ctacgaaaca cgttcgaaat cagacctaga atatcgctac aagcaagtgc agcacgagaa 840 gccgtgttgc gaggtgaaag tttcattgcc gcattaggga gtgctgaaga aactctgtcg 900 tggttaaaac tacatgctgt tttaaagtta cgcctagtaa atcatgaccc gatttttaag 960 accgctggtg cggttttaga taacctcagg ctgaagctcg caccaataat gatgtgtaaa 1020 tatggaacag agaaacgctc catgggggat atgttaagaa gatctgctcc tgaagatata 1080 aacgattcct taactctgtg cttaattttg ttatcgcgca ttcgtcgtgt gatgcatcgc 1140 acatcgggca gcaaatacag ttatatgata gaccctagag gatgtatgat agactatgta 1200 cctggagaat gtatgacaaa tatactacgt tatgtagatg cgcatacgag gagatgttct 1260 gatcccgcat gtaacttgta tatcagctgc acactcatgc ctatttatat ccatggcagg 1320 tatttttact gcaatactct gtttggtatg taaatagtta tctaaaagac atcctatatt 1380 tagtattcta cacaatttct tctgacgata ttactaactc ctctaataaa gttaaataaa 1440 taaacgtctc agatatgtct tgttaaagtg tggttttatt atctatatat caccgacttt 1500 agatacggaa tatgaaaatg atggccctga aattgcacga acagctgtgg tgaagattcc 1560 gtcaaattta catttgaaat ttaagtatat aaattcaggt gatcctataa catcgttaaa 1620 caagctctcg agtagtttaa tgaacgctaa acattgaagt ccaccagggc gatcacaaag 1680 gcagttgact aacatgccat gcgctccagg attgtcgcga actgccgact cgcataaaca 1740 aataattttt ctcggatctc tcatttccag aaatctacgc gggtccatca gcaatgccgg 1800 ttttattcct ggaacacagt tagacgtaaa ctgctcgaaa actgttttaa gcacaaccgg 1860 gatgtctgca aaagccgatg atgcttcctt ataacagcgc tcagttagaa accataacag 1920 ttcttttggt agtatatttc ttcctagaaa ccatggcgtt cccatcgcta agaaccaagc 1980 atgtgttttc actgtatctt gtccaaagag ccctctattc ggagatgtat gttggagatc 2040 ggatgtccag agtactgctt tatctcgcat agatgaggtc gcagttacaa ttctcccttt 2100 ccagccaccc gtcaacatga tgtttattgg actaccaaca ttggtaatga gtactggtct 2160 ggcgactatt ccatatgcat tagtcattga aatttctcgt ggaatcagcc aaactggaga 2220 atctgcacat ctttattatt cgatgtggaa tgaccatgat cgctttgttg gtctgtaccg 2280 ttagcagaca tattcagagt aatgtcacga agacttaagg gtggctttca tttcaaacct 2340 ggagaacttg tagggttgta tagtcgacag gatgtaggtg gagacatgac gtctacaaag 2400 agacatccta taaggccatt cctgcagaaa cttataggtt tataccagag acgactcaat 2460 ggcagcaggg gcgatgtcat cgtcaacatt ggctcaaata ccgaatgtat accaagttat 2520 tgatccctta gcgattgata catcgtcgac atctacaaaa cgattactgg atgaacctgt 2580 accacacata ggatcc 2596 <210> 2 <211> 3222 <212> ADN ?*ií ástJÉ& A AJfcfc. Jfc fclMH <213> Virus 1 de la enfermedad de Marek <400> 2 gagctcctct aattccgata accggctgtt gtcaatggca ggaataacta tgggcagcga 60 acacatgtat gatgatacaa cgttcccaac aaacgatcct gagtcttcat ggaaaattgt 120 tttggctgga gagaaattta tgacagcatc ggctgcatta aaaacaatag taggttgcgt 180 gaagaaccca ttaattacat ttagcgacga cggactgatg atacagggca cggtttgcgg 240 tcaacgtatg tttgttccta tcgattgtac ttcattcagt gaatatgaat ggcgcgggcc 300 cacagcaata ttcctagctc ttaccgattc tagacgtacc ctcttagatg cattcaaatg 360 cgataagaaa aaagtagtag aagtttgttt tacctttcga ggagaaccac catgccgaca 420 tctaacacaa accgtcacat atgcaaatga tggatgctca ttttcgagta caatcgtcaa 480 atatgaatta tggagcgcat ccatcatttg tcctcaaaaa actccagatg ctacattttc 540 attaaacaaa caacaattga gcaaaattct aactgtagct gcaaaagtac aacatgaaga 600 attgatcttt gctttgaaag ctgaaggagg tttttatgcc ggaacgattt gtgatgtgat 660 aagttttgat atagatggaa gcgcaatggt ccaatatccc tataatgcaa caagtcatgc 720 ttcgtcagcc ctcatcgtgg catgtgggaa gaaaaaaaca aataaaagta tagctgtaac 780 tgcatacggc agcgggaaac ctttctgcct tgcactggaa gatactaacg catttagaaa 840 tgtcgtgcaa aaaattaaaa cgggagccgc tggggcggat ttgggatttt atacaacgtg 900 tgatccaccg atgctgtgtg tacgtccgca cgtgtttgga agtcccacgg cattcctgtt 960 ttgcaattca gactgtatgt caatatacga attggaagaa gtgagtgcag tatctggagc 1020 aataaagtcg aaacgcatca gcggatattt ccccaaagta tcaaatatcg gctcccggaa 1080 acggggacca tcttcacccc ccttcgaacg agaagggaaa cttgccaaag ttatcaacca 1140 atgagacttt cgtgaggacc tgtaagtatg tcatggagtg ggagggttca tttatattgc 1200 atgtaagcct tatagaggat acaccagaaa ctcatagttg tgccaattca aacgacaccg 1260 ttcatctgaa ctacaaaaca gaataccgct atcaaattgg aacatggatt ctgtcaacaa 1320 ctcatcatta cctccgtctt atacaaccac tggtagaaca tatggacatt gtctgcaaat 1380 gctcacatgc ctcgagccac cgtgtacaac aacaaatgga aacggaatat caaacaatcg 1440 atgtctaaaa tgtatcgtag taaccatgtg ttcgatattc tccattgcag ctcatttggc 1500 tatcaccctg tcatgtataa ccttgattca atttattgac caaaaaatta tctatataaa 1560 ctgtactatt tatgctatca ccggatttct aattgccttc atcgtgcgtc ttacgataaa 1620 atcgtcagaa gtgctgacat caattggcaa accggcacaa tttatatttg ctttaatctc 1680 atccatagca gatacgctta ttacaagaaa tatgttaatt gacagtaatc catcttatgt 1740 aaaaatattg agagcaatag agatgacatc tttgatgtgc tttgtcatgc ttggagcatt 1800 cattgcatcc taccactatg tctgcttggc aacgtctgga gatttaactt ggaaagctgg 1860 gtttttgata ttgaccgccg gaacaattat cggaatatca gctccatatg gaaacatttc 1920 ctccctattc ggatttctat ttctatatac tatattagcc ataaacgttg taagggatgc 1980 aagtaaagca ctgatgaata catgctatta tcgcatttgt cgtgcaacga ctctacgcca 2040 tccctctcgc ctcggctgcg gtcgtatgtc ctcgactcaa gatgtcaatg caacgcatga 2100 agaagccata tcaagcgcag atacgattga tggtcagatt cctatggtag ttatgagcca 2160 cgcgacaggc gtattaattc cagttgttat tgccttgcag aggtacatga caaaggagac 2220 tgttagtttg acatcgactg atatgttaca gggagtctgt ggcgttttag tgggggcgag 2280 tgtttcaata tttatcccgt cacgtcgcga cgaaagttta tcccgtccaa ttatcatttt 2340 attgtctata ataggagcaa tggccattac tttggcaggt tttggtttgg tactcgggcc 2400 aactttattt tccgcatgtg cagcagcttt gtcatgttat acctgcatta atataaggaa 2460 tgcaaataag ggaattaaac aattagcagc tgcctatgta gtgaaatcta tactgggatt 2520 tatcataact agtttacttg tttgtatatt agtagcgcta tcttgaccaa atcgttgttc 2580 acatcttggc catatacgta ttgatcgttg tttcgaaccg cgaataaaac tttcatacat 2640 actaaacgat ggagttgtgt tttatgagcg ttgaaaacaa aggtaccatc ggtttaaaac 2700 taagttgcat atcgtaatcc acaaaaatca ttttatacat catcccgaag agacaccaaa 2760 cgtaaccctc tacatatctt ccctcatgct cacgccgcgt gtgttacgag ctttggggtg 2820 gactggactc ttttttttgc ttttatctcc gagcaacgtc ctaggagcca gccttagccg 2880 ggatctcgaa acacccccat ttctatcctt tgatccatcc aacatttcaa ttaacggcgc 2940 gcctttaact gaggtacctc atgcaccttc cacagaaagt gtgtcaacaa attcggaaag 3000 taccaatgaa cataccataa cagaaacgac gggcaagaac gcatacatcc acaacaatgc 3060 gtctacggac aagcaaaatg cgaacgacac tcataaaacg cccaatatac tctgcgatac 3120 ggaagaagtt tttgttttcc ttaacgaaac gggaagattt gtttgtactc tcaaagtcga 3180 ccccccctcg gatagtgaat ggtccaactt tgttctagat ct 3222 <210> 3 <211> 7316 <212> ADN <213> Virus 1 de la enfermedad de Marek <400> 3 ggatccaaaa ttctcaccat agtcaaccat ccactcagag ccatgcagtg tctttattta 60 aagtcacatg ggagattctc ttcggactcc gcctcacaaa gagtacaaca acatttccgg 120 gtagaacaaa agtaaagaat ttacggaagg cggagataga agctctgtta gacggagcgg 180 gtattgatag aacgtcatgc aaaactcaca aggatctcta caccctcttg atgaaaagca 240 agtcattatt tcgcaatatg cgctatgata ttcgacgccc gaagtggtac gacctattaa 300 gatctcgttt agacaaagag ttgggtatat atcatgatct ggtagatttg gaatctgtgt 360 tggcggaaat tccgtcagca ctctggccac gcgtagaagg tgctgtagat tttcatcgtt 420 tataattatt ggaaccgaat gcgtcaaacc atatcaacga tggcagcatc gtcaaaaact 480 '-Úr....-i-A...íí¿tií¿tj_., .£. ,,,_ . . _ . _„,_-__,..-._, , . , « Se* -*„ aatatgatgc agataatgcg aggatgtatt tgttatacga ctgtgtatag aatttggact 540 aataaaaatc gtaccgaagg actcactgca ttatgctatc tactttttcg aaatacatgc 600 ggtcaatact cggcacaata ttctacagta aacctctccg gaaaatccat ggctaaactt 660 tggggcctga acccagatat gattactgat acaatgttag caggtatgac caattccgca 720 tctgtaaccg gattatggcc atcttgccct tcggaccaac acatgctatg gaaagcgtta 780 ctcactacga ctctagcaaa attaagacac cgtctgggat atcatgctta 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Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un virus recombinante de la enfermedad de Marek (MDV) que comprende una secuencia de ADN extraño insertada al marco abierto de lectura UL54.5 del genoma del virus en la enfermedad de Marek.

2.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho ADN extraño codifica un polipéptido.

3.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende más de 10 aminoácidos.

4.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho polipéptido es antigénico.

5.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de ADN extraño está bajo el control de un promotor activo del virus del herpes ubicado hacia el extremo 5' de dicha secuencia de ADN extraño y se selecciona del grupo que consta del promotor de gX PRV, el promotor de gB de MDV, el promotor de gA de MDV, el promotor de gD de MDV, el promotor de gB de ILTV, el promotor de gl de ILTV, el promotor temprano inmediato de HCMV y secuencias sustancialmente homologas.

6.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas secuencia de ADN extraño codifica un polipéptido antigénico de un virus seleccionado del grupo que consta de virus de anemia de pollo, enfermedad bursal infecciosa, virus en la enfermedad de Marek, virus en la enfermedad de Newcastle, virus infeccioso de la nicotraqueítis, virus infeccioso de la bronquitis y secuencias sustancialmente homologas.

7.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN extraño comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido antigénico a partir del virus de la enfermedad bursal infecciosa seleccionada del grupo que consta de VP2, VP3, VP4 y secuencias sustancialmente homologas.

8.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho ADN extraño comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido antigénico del virus en la enfermedad de Marek seleccionado del grupo que consta de glicoproteína B, glicoproteína D, glicoproteína A y secuencias sustancialmente homologas.

9.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho ADN extraño comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido antigénico del virus en la enfermedad de Newcastle seleccionado del grupo que consta de F, HN y secuencias sustancialmente homologas. . «{»- Í?.?* ±??t___?.. __**.,. , .... . ^j, » . . ..^.., , ^. , _ ._^_. ?___. iÁ t

10.- El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho ADN extraño comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido antigénico a partir de virus infeccioso de bronquitis seleccionado del grupo que consta de proteína de espiga, proteína de nucleocápsido, proteína de matriz y secuencias sustancialmente homologas.

11.- Un virus mutante de la enfermedad de Marek (MDV) que comprende una supresión por lo menos de una porción del marco de lectura abierta de UL54.5 del genoma del virus de la enfermedad de Marek.

12.- El virus mutante de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque se suprime completamente dicho marco de lectura abierta de UL54.5. U&-* . __ __l _. , ? i