JPH1028586A

JPH1028586A - アビポックスウイルスの非必須領域、それを用いた組み換えアビポックスウイルス及びワクチン

Info

Publication number: JPH1028586A
Application number: JP8207797A
Authority: JP
Inventors: Takanori Sato; 隆則佐藤; Hisashi Okuda; 尚志奥田
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1996-07-18
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 1998-02-03
Also published as: AU3462797A; WO1998003635A1

Abstract

(57)【要約】【課題】組み換えアビポックス作製用の新規な非必須
領域を提供する。【解決手段】アビポックスウイルスの増殖に非必須な
ゲノム領域であって、当該領域に大腸菌由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子がワクシニアウイルス７．５Ｋプロ
モーターとともに挿入された組み換えアビポックスウイ
ルスの鶏体内での増殖性が前記β−ガラクトシダーゼ遺
伝子挿入前のウイルスの鶏体内での増殖性と比して実質
的に低下していない組み換えアビポックスウイルスが得
られるゲノム領域。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、アビポックスウイルス
（以下、ＡＰＶという）の組み換え体及びそれから成る
ワクチンに関し、さらに詳しくは、外来遺伝子が挿入さ
れているが増殖性が低下していないＡＰＶ組み換え体及
びそれから成るワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】現在の養鶏分野においては、種鶏、産卵
鶏、及び肉用鶏の別を問わず、ワクチネーションによる
疾病予防は衛生管理の柱である。しかしながらワクチネ
ーションのプログラムは実に過密であり、これに要する
人手、時間ならびに経費は大きな問題となっている。こ
の解決策として、近年、組み換えＤＮＡ技術により、病
原体より免疫誘導に必要なタンパク質をコードする遺伝
子のみを取り出し、これを含む組み換えウイルスを構築
することが可能となった。このような組み換えウイルス
を組み換え生ワクチンとして接種することにより、挿入
した遺伝子がコードする抗原タンパク質に対する免疫を
誘導することが可能である。ポックスウイルスに属する
ＡＰＶはそのような組み換えウイルスの構築に用いるの
に好適なウイルスである。ファウルポックスウイルス
（以下、ＦＰＶ）や鳩痘ポックスウイルス（ＰＰＶ）に
代表されるこれらウイルスは、大きなゲノムＤＮＡを持
ち、その多くの領域がウイルス増殖に非必須であり、同
一ウイルスのこれらの非必須な領域に複数の抗原遺伝子
を挿入することができる。このような組み換えウイルス
ワクチンを鶏に接種すると液性免疫、細胞性免疫を誘導
できる。この方法は、従来、鶏痘に対する生ワクチンと
して使用されてきた弱毒化したＦＰＶまたはＰＰＶに遺
伝子工学的手法を用いて外来遺伝子を挿入した組み換え
ＡＰＶとして応用されてきた。弱毒化されたワクチン株
を親株として用いる理由は、無視しえる程の確率でしか
起こらないが、万が一、鶏体内で挿入された遺伝子が脱
落する場合でも強毒株にならないよう配慮している為で
ある。

【０００３】外来遺伝子として、鶏病ウイルスであるニ
ューキャッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶ）の抗原をコ
ードした遺伝子（以下、抗原遺伝子という）、マレック
病ウイルスの抗原遺伝子、鶏インフルエンザウイルスの
抗原遺伝子を挿入した組み換えＡＰＶが構築され、実験
的にＳＰＦ鶏に接種して、ワクチン効果が確認されてい
る（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，１７８，２９７−３００，１９９０；Ｎａｚｅｒ
ｉａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４
０９−１４１３，１９９２；Ｔａｙｌｏｒｅｔａ
ｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，６，５０４−５０８，１９８
８）。このように組み換えＡＰＶは、目的に応じて種々
の外来抗原遺伝子を挿入することができ、また同時に複
数の抗原遺伝子を挿入できるので１回接種で複数の病原
体に対して有効な多価ワクチンが可能になり、その結
果、前述の過密なワクチンプログラム問題の解決策と成
りうると有望視されている。

【０００４】しかしながら、親ウイルスとして弱毒化さ
れたウイルス（ワクチン株のウイルスなど）を用いた組
み換えＡＰＶウイルスには弱点があった。元来、外来遺
伝子が挿入された組み換え体は、親ウイルスよりも鶏体
内での増殖が低下する。一方、弱毒化された親ウイルス
は、それ自体増殖性がきわめて低いものである。従っ
て、弱毒化された親ウイルスに、外来遺伝子を挿入すれ
ば、当然得られた組み換えＡＰＶの増殖性は低下する。
このため、弱毒ウイルスを親ウイルスとしたワクチン
は、実際に生体内で十分な効果が得られないことが多か
った。この外来遺伝子挿入による弱毒化現象は他の組み
換えウイルスにおいても知られている現象である。ＡＰ
Ｖと同じポックスウイルス科に属するワクシニアウイル
ス（以下、ＶＶ）でも外来遺伝子挿入によって弱毒化す
ることが報告されている（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉ
ｒｏｌｏｇｙ６６巻２６１７〜２６３０頁（１９９
２））。また、本発明者らは本願の実施例にも示す如
く、ＡＰＶにおいても、外来遺伝子を挿入すると殆どの
場合に弱毒化することを経験した。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、外来遺
伝子が挿入されても鶏での増殖性が低下しない組み換え
体を作る方法を開発すべく鋭意研究した結果、外来遺伝
子の挿入によっても増殖低下を起こさない挿入部位の同
定に成功し、これに外来遺伝子を挿入することで弱毒化
しない組み換え体が作れることを見い出し、本発明を完
成するに到った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、アビポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
（以下、単に非必須領域という）であって、当該領域に
大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．
２３）遺伝子（ｌａｃＺ）がＶＶの７．５Ｋプロモータ
ーとともに挿入された組み換えアビポックスウイルスの
鶏体内での増殖性が挿入前のウイルス（以下、親ウイル
スという）の鶏体内での増殖性と比して実質的に低下し
ていない組み換えアビポックスウイルスが得られるゲノ
ム領域が提供され、また、当該ゲノム領域に外来遺伝子
を組み込んだ組み換えアビポックスウイルスが提供さ
れ、さらに、当該組み換えアビポックスウイルスを有効
成分とするワクチンが提供される。

【０００７】（１）非必須領域本発明の非必須領域は、大腸菌由来のβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子をＶＶ７．５Ｋプロモーターとともに挿入し
てもＡＰＶの増殖性を実質的に低下させない領域であ
り、ここでいう実質的に低下しないとは、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子挿入前のＡＰＶの増殖性に対して挿入後
の組み換えＡＰＶの増殖性が、通常９０％以上１１０％
以下、好ましくは９５％以上１０５％以下であるＡＰＶ
ゲノム領域であれば特に限定されない。また、鶏体内で
の増殖性はＡＰＶの増殖に伴い形成されるポックサイズ
から算出されるものであり、ポックサイズが小さくなる
ほど増殖性は低下したと判断される。ここで用いるβ−
ガラクトシダーゼはジーン・バンク（ＧｅｎｅＢａｎ
ｋ）のアクセション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃）Ｖ０
０２９６で公知の配列のものである。

【０００８】本発明においてポックサイズは、親ウイル
ス（外来遺伝子挿入前のＡＰＶ）または組み換えＡＰＶ
を鶏の翼膜に接種し、接種後３日おきにデジタルノギス
を用いて各個体のポックの縦・横・高さを測定し、これ
らの積として算出される値である。親ウイルスのポック
サイズを１００としたとき、組み換えＡＰＶのポックサ
イズが９０％以上１１０％以下、好ましくは９５％以上
１０５％以下であるものが本発明の非必須領域である。
本発明の非必須領域は、例えば特開平１−１６８２７９
号公報に記載のショットガンクローング法などの方法で
得られたゲノム領域に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を
ＶＶ７．５Ｋプロモーターとともに挿入し、ＡＰＶに相
同組み換えを起こさせて得られる組み換えＡＰＶの増殖
性が低下しない領域を選択することにより得られる。

【０００９】より具体的には、本発明の非必須領域は、
以下のような工程で得ることが出来る。（ａ）ＡＰＶゲ
ノムＤＮＡを制限酵素で切断し、ベクターにクローニン
グして、複数のクローンを得、（ｂ）各クローンのＡＰ
ＶゲノムＤＮＡ断片内に、ＶＶ７．５Ｋプロモーターと
ともにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入し、（ｃ）Ａ
ＰＶを感染させた細胞に（ｂ）で作製した各ベクターを
トランスフェクションし、（ｄ）各組換え体を純化し、
（ｅ）純化した各組み換え体および組み換え体の親株を
それぞれ同量、鶏に接種して接種後３週間にわたって発
痘の大きさを測定し、（ｆ）発痘の大きさが前述の条件
を満足する組み換え体を選択することによって、その組
み換え体を作製するのに使用した（ａ）のベクターが本
発明の非必須領域をクローニングしたものである。

【００１０】本発明の非必須領域の具体例としては、配
列番号１で示された鶏胎化鳩痘中野株（ＮＰ株）ゲノム
由来のＥｃｏＲＩ−５Ｋｂ断片が例示され、この非必須
領域に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子がＶＶ７．５Ｋプ
ロモーターとともに挿入された組み換えＡＰＶの増殖性
は親ウイルスと変わらない。

【００１１】（２）組み換えＡＰＶ本発明の組み換えＡＰＶは、ＡＰＶの増殖に非必須なゲ
ノム領域（本発明の非必須領域）に外来遺伝子が挿入さ
れた組み換えＡＰＶであり、例えば、以下のように調製
される。ベクターにクローニングされたＡＰＶの非必須
であり、かつ外来遺伝子が挿入されても生体内での増殖
低下が起こらないゲノム領域に、ＡＰＶで機能するプロ
モーターとともに他の病原体の抗原遺伝子を組み込む。
ＡＰＶ感染細胞に該ベクターを導入することにより、相
同組み換えを起こさせ、その結果生じたＡＰＶを選択、
純化する。

【００１２】（アビポックスウイルス）本発明で用いる
ＡＰＶは、鳥類に感染するものである限りいかなるウイ
ルスでもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの家禽類の細
胞中で増殖可能な、例えばフォウルポックスウイルス
（ＦＰＶ）、ピジョンポックスウイルス（ＰＰＶ）、カ
ナリーポックスウイルス、七面鳥ポックスウイルス、ク
エルポックスウイルス等が例示される。その具体例とし
ては、ＦＰＶではＡＴＣＣＶＲ−２５１、ＡＴＣＣＶ
Ｒ−２５０、ＡＴＣＣＶＲ−２２９、ＡＴＣＣＶＲ
−２２９、ＡＴＣＣＶＲ−２４９、ＡＴＣＣＶＲ−２
８８、西ヶ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワク
チン株由来のウイルスのうち、鶏胚繊維芽細胞（ＣＥ
Ｆ）に感染したとき大きいプラークを形成するものなど
のごとき狭義のＦＰＶや、鶏胎化鳩痘中野株（ＮＰ株）
等のごとき狭義のＦＰＶと近縁のウイルスであって鶏痘
生ワクチン株として使用されるウイルスなどが例示され
る。これらは、寄託機関、市販ワクチンとしてあるいは
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションなどの
機関から入手できる。

【００１３】（非必須領域を含有するベクター）本発明
の組み換え用ベクターの構築に用いられるウイルスの非
必須領域をクローニングするためのベクターは、特に限
定されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐ
ＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、λファ
ージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９等の
コスミドなどのベクターを適当な制限酵素で処理して、
前述した本発明の非必須領域を組み込めばよい。

【００１４】（マーカー遺伝子）本発明で用いるマーカ
ー遺伝子は組み換え体の選択や純化の際にその発現が容
易に検出されるものであれば特に限定されないが、例え
ば、大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子などが例示される。

【００１５】（抗原遺伝子）本発明でＡＰＶに組み込む
抗原遺伝子は、特に限定されない。ＡＰＶ中で転写、翻
訳されて抗原タンパク質として発現されるものであれば
よく、例えば、ＮＤＶのＨＮタンパク質をコードする遺
伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６
７、１９１７−１９２７（１９８６））、Ｆタンパク質
をコードする遺伝子（ＭｃＧｉｎｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓ．，５、３４３−３５６（１９８６））、マレ
ック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢをコードする遺伝子
（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１７
８９−１８０４（１９８８））、伝染性ファブリキウス
嚢病ウイルスの構造タンパクＶＰ２をコードする遺伝子
（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７
１、１３０３−１３１２（１９９０））等の感染防御に
関与した抗原をコードした遺伝子が好ましい。

【００１６】（組み換え用ベクター）本発明で用いる組
み換え用ベクターは、外来遺伝子が挿入されても生体内
での増殖低下が起こらないゲノム領域に抗原遺伝子とそ
れを支配するプロモーターが挿入されたものである。前
述の非必須領域を含有するベクターの非必須領域中に前
述の抗原遺伝子及びそれを支配するプロモーターを挿入
すればよい。さらに、組み換えＡＰＶの純化などの効率
化のために大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子などのマーカー
遺伝子をプロモーターとともに組み込んでもよい。

【００１７】（プロモーター）本発明で用いるプロモー
ターは、組み換えＡＰＶ感染宿主中でプロモーターとし
て機能するものであれば、特に限定されない。例えば、
ＶＶの７．５Ｋポリペプチドや、１１Ｋポリペプチド、
チミジンキナーゼをコードするＶＶ遺伝子のプロモータ
ーなどが例示されるほか、プロモーターとして機能する
限りにおいては、一部を削除するなどの改変したもので
あってもよく、また合成されたものでもよい。

【００１８】（組み換えウイルスの作製方法）組み換え
ＡＰＶの作製方法は特に限定されず、常法にしたがって
行えばよい。すなわち、あらかじめ、ＡＰＶを感染させ
た細胞に、例えば、リン酸カルシウム共沈法等により組
み換えベクターが導入されることにより、ベクターと感
染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み換え
が起こり、組み換えＡＰＶが構築される。得られた組み
換えＡＰＶは、イーグルＭＥＭなどの培地で培養された
宿主細胞に感染させ、組み込んだ抗原遺伝子をプローブ
とするハイブリダイゼーション法や、抗原遺伝子と共に
組み込んだマーカー遺伝子の発現等の方法により生育し
てくるプラークの中から候補株を純化し、組み込んだ抗
原遺伝子のコードするポリペプチドに対する抗体を使用
したイムノアッセイ等の方法により、目的の組み換えウ
イルスであることを確認すればよい。例えば、マーカー
遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換
えＡＰＶの場合、β-ガラクトシダーゼを発現する。よ
って、その基質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢ
ＣＯ−ＢＲＬ社製）存在下で青いプラークを形成するの
で、その性質を利用して選択、純化することができる。
宿主細胞としては、用いるＡＰＶが感染し、増殖するこ
とが可能なものであれば特に限定されず、例えば、ＦＰ
Ｖを用いた場合は、ＣＥＦ細胞や、発育鶏卵しょう尿膜
細胞等が挙げられる。

【００１９】（３）ワクチン本発明を利用する生ワクチンは、上述した本発明の組み
換えＡＰＶを１種類以上含有し、これが有効成分となっ
ているワクチンである。即ち、本発明の組み換えＡＰＶ
を単独、または２種類以上混合または併用して用いるこ
とができる。さらにこのほか、本発明のワクチンと他の
ワクチンとを組み合わせてもよい。ここで、組み合わせ
可能な他のワクチンとしては、たとえば特開平２−１５
７３８１号公報や特開平３−２７２８４号公報記載の抗
ＮＤＶワクチンとなる組み換えアビポックスウイルスや
特開平６−７８７６４号公報や米国特許出願第０８／４
９９，４７４号明細書に記載されている抗ＭＤＶワクチ
ンとなる組み換えアビポックスウイルスなどの組み換え
ワクチン、抗ＭＤＶワクチンとして用いられる七面鳥ヘ
ルペスウイルスワクチンなどが例示される。また、組み
換えＡＰＶ以外にも薬理学的に問題のないキャリアー、
例えば生理食塩水、安定剤などを含んでいてもよい。

【００２０】ワクチンの調製方法は特に限定されない。
例えば、本発明で組み換えＡＰＶが生育することのでき
る細胞を、本発明の組み換えＡＰＶで感染し、組み換え
ＡＰＶが増殖するまで培養する。その後、細胞を回収し
破砕する。この細胞破砕物を遠心分離機によって遠心分
離チューブ中で沈殿物と高力価の組み換えＡＰＶを含ん
だ上清とに分離する。本質的に宿主細胞を含まず、細胞
培養培地と組み換えＡＰＶを含んだこの遠心上清は、そ
のままワクチンとして使用できる。また、薬理学的に受
けいられる生理食塩水などのようなもので、希釈して使
用してもよい。遠心上清を凍結乾燥することにより凍結
乾燥ワクチンとしても利用できる。本発明のワクチン
は、ワクチン中の組み換えＡＰＶが家禽に感染して防御
免疫を引き起こすような方法であれば、どのような方法
で家禽に投与してもよい。例えば、翼膜穿刺や、皮膚に
引っかき傷をつけてワクチンを接種したり、注射針やそ
の他の器具で家禽の皮下にワクチン接種することができ
る。また、ワクチンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料
の固形物に混入して、経口接種させることも可能であ
る。さらに、エアロゾルやスプレーなどによるワクチン
を吸入させる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔
内接種法等を用いることもできる。接種量は、例えば、
鶏の場合、１羽あたり通常１０〜１０⁶プラーク形成単
位（ＰＦＵ）であり、好ましくは１０²〜１０⁴ＰＦＵで
ある。注射する場合には、この量を生理食塩水等の薬理
学的に受け入れられる液体で希釈して０．１ｍｌ程度に
すればよい。

【００２１】本発明の組み換えＡＰＶは鶏体内での増殖
性が低下しないため、移行抗体保有鶏に対しても、きわ
めて優れたワクチン効果を持続的に発揮することが出来
る。例えば、本発明のＡＰＶであって、外来遺伝子とし
てＮＤＶ（ニューカッスル病ウイルス）由来の遺伝子、
好ましくはＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を挿入した、ニュ
ーキャッスル病ウイルスに対する抗体を産生することが
できる組み換えＡＰＶは、ニューキャッスル病ウイルス
の赤血球凝集抑制抗体価が少なくとも４以上である３日
齢の雛鶏から成る当該価平均が１６以上３２以下である
鶏群に、前記組み換えウイルスを１×１０⁴プラーク・
フォーミング・ユニットを接種し、接種から３週間後に
強毒ニューカッスル病ウイルス佐藤株３×１０⁴プラー
ク・フォーミング・ユミットを鶏腿筋肉に接種し、その
２週間後の被攻撃鶏の生存率が８０％、好ましくは９０
％以上のワクチン性能を発揮する。特に非必須領域とし
て鶏胎化鳩痘中野株（ＮＰ株）由来のゲノム断片である
配列番号１記載のＥｃｏＲＩ断片中、第９６４番目の制
限酵素ＣａｌＩ切断部位や第３６９４番目と第４２７０
番目の制限酵素ＨｐａＩ切断部位の間にＮＤＶ由来の遺
伝子、好ましくはＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を挿入した
組み換えＡＰＶ（ＡＰＶは鶏胎化鳩痘中野株（ＮＰ株）
が望ましい）では、優れた効果を示す。尚、ここで赤血
球凝集阻止抗体（ＮＤＶ−ＨＩ抗体）価は、常法により
測定されるものであり、具体的には「鶏のワクチン」第
２版、発行元：（株）木香書房、平成４年発行、２８２
頁「ニューカッスル病診断用赤血球凝集抗原」の項に記
載された方法である。

【００２２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。（実施例１）ＡＰＶゲノムＤＮＡ断片を挿入したプラス
ミドの調製特開平１−１６８２７９号公報記載の実施例１に記載さ
れた方法に従って鶏痘生ワクチン株であるＮＰ株のゲノ
ムＤＮＡ１μｇを取得した。これを０．５μｇずつ二つ
に分けてそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動で２Ｋ
ｂｐ〜７ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。０．５μｇのｐ
ＵＣ１８（ファルマシア社）を同じく制限酵素ＥｃｏＲ
ＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、アルカリフォス
ファターゼ処理により５’−末端のリン酸を除去し、そ
の後フェノール・クロロホルム（１：１）で抽出しエタ
ノールで沈殿させて、開裂ｐＵＣ１８を回収した。これ
と先ほど調製した、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで
切断したＮＰ株のゲノムＤＮＡをリガーゼにより連結
し、コンピテントな大腸菌ＴＧ１を形質転換し、Ｘ−Ｇ
ａｌとアンピシリン存在下のＬＢ寒天培地で１５時間、
３７℃で培養した。白色のコロニー６０個を選択し、ア
ンピシリン存在下のＬＢ液体培地で培養した後、ビルン
ボイムとドーリーの方法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７巻、１５１３頁〜、（１９７
９）］でプラスミドを抽出し、それぞれＥｃｏＲＩまた
はＨｉｎｄＩＩＩで切断してゲノムＤＮＡ断片の挿入を
確認し、ｐＮＰ０１〜ｐＮＰ６０と命名した。

【００２３】（実施例２）実施例１で得たプラスミド
のＡＰＶゲノムＤＮＡ断片内にｌａｃＺ遺伝子をプロモ
ーターとともに挿入した組換え用プラスミドの調製ｐＵＣ１８にはＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩの制限
酵素切断部位が存在しないので、ｐＮＰ０１からｐＮＰ
６０を上記制限酵素で切断し、いずれかの制限酵素によ
ってクローニングされたゲノムＤＮＡのどこか１ヶ所で
切断されるものが容易に選択できた。それらは、ｐＮＰ
０３、ｐＮＰ０４、ｐＮＰ２５、ｐＮＰ２６、ｐＮＰ２
９、ｐＮＰ３２、ｐＮＰ３５、ｐＮＰ３６、ｐＮＰ３８
の９種類であった。これをそれぞれ、１ヶ所で切断され
ることがわかった制限酵素で切断し、ＣｌａＩで切断し
たプラスミドのみはＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平
滑にした。その後、アルカリフォスファターゼ処理によ
り５’−末端のリン酸を除去し、フェノール・クロロホ
ルム（１：１）で抽出しエタノールで沈殿させて、開裂
プラスミドを回収した。特開平１−１６８２７９号公報
の実施例３に記載されたｐＮＺ７６から同じく特開平１
−１６８２７９号公報の実施例４に記載されている方法
で、プロモーターとともにｌａｃＺ遺伝子が平滑末端の
形で得られるので、リガーゼを用いてこれを先に回収し
た開裂プラスミドと連結し、大腸菌ＴＧ１を形質転換し
た。アンピシリン存在下のＬＢ寒天培地に出現したコロ
ニーをアンピシリン存在下のＬＢ液体培地で培養した
後、ビルンボイムとドーリーの方法でプラスミドを抽出
し、ｌａｃＺ遺伝子が挿入されたプラスミドを選択し
た。こうして上記９種のプラスミドにそれぞれｌａｃＺ
遺伝子が挿入された組換え用プラスミドが得られ、それ
らをｐＮＰ１００３、ｐＮＰ１００４、ｐＮＰ１０２
５、ｐＮＰ１０２６、ｐＮＰ１０２９、ｐＮＰ１０３
２、ｐＮＰ１０３５、ｐＮＰ１０３６、ｐＮＰ１０３８
と命名した。

【００２４】（実施例３）ｌａｃＺ遺伝子を発現する
組換えＡＰＶの作製と純化単層になったＣＥＦ細胞にＮＰ株を０．１の感染多重度
で感染させ、３時間後、これらの細胞をトリプシン処理
で剥がし、細胞懸濁液とした。これを遠心分離で細胞を
分離しＳａｌｉｎｅＧ（０．１４ＭＮａＣｌ、０．
５ｍＭＫＣｌ、１．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．５ｍ
ＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１１％グルコース）で
２×１０⁷個／ｍｌの濃度に懸濁し、実施例２で作製し
た組み換え用プラスミドの数に分注した。この各懸濁液
にそれぞれ１種類の組み換え用プラスミド１０μｇずつ
加え、この混合物を室温において、ジーンパルサー（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓｅｃ条
件下でエレクトロポレーションした。プラスミドを導入
した細胞を、その後３７℃で７２時間培養し、３回の凍
結融解によって細胞を溶解した。放出された組み換えウ
イルスを次のように選別した。溶解した細胞から放出さ
れた子孫ウイルスを含んだ溶解液の１０倍段階希釈液を
ＣＥＦ細胞に感染させ、生育培地を含んだ１０ｍｌの寒
天培地を重層した。室温中で寒天を固めた後、典型的な
ＡＰＶのプラークが出現するまで３７℃で培養した。プ
ラークが大きくなる約１週間後に、Ｂｌｕｏ−ｇａｌを
６００μｇ／ｍｌ含んだ別の寒天培地をそれぞれの培養
プレートに重層し、さらに２４時間３７℃で培養した。
プレートから青色プラークを抜き取り、含まれているウ
イルスを回収した。形成する全てのプラークがＢｌｕｏ
−ｇａｌで青く染まるまで、同じ方法でさらに組み換え
ウイルスの純化を行った。通常この過程は４〜６回で終
了する。こうして純化された組換えウイルスをそれぞ
れ、ｆＮＰ１００３、ｆＮＰ１００４、ｆＮＰ１０２
５、fＮＰ１０２６、ｆＮＰ１０２９、ｆＮＰ１０３
２、ｆＮＰ１０３５、ｆＮＰ１０３６、ｆＮＰ１０３８
と命名した。

【００２５】（実施例４）実施例３で作製した組み換
え体の鶏免疫実験と弱毒化していない組換え体の選択組み換えＡＰＶおよび対照としてＮＰ株（親ウイルス）
の１０⁴ＰＦＵを、それぞれ各群１０羽ずつ４日齢のＳ
ＰＦ鶏の翼膜に穿刺針で接種した。接種後３、７、９、
１１、１４、１７、２１日目に各個体の発痘（ポック）
サイズを測定し、各群ごとの平均を算出した。ポックサ
イズは、デジタルノギスを用いて縦、横、高さを測定
し、その３つから計算した体積をポックサイズとした。
その各群の発痘の平均値の推移を図１に示す。図１から
明らかな様に、ｆＮＰ１０３５のみが親株と同様な発痘
の推移を示し、弱毒化していないことが判明した。一
方、他の組み換え体のポックサイズは、親株と比較する
と小さく、これらの組み換え体は弱毒化していることが
わかった。

【００２６】（実施例５）実施例４で選択した組み換
え体の挿入部位クローン（ｐＮＰ３５）の解析（１）制限酵素地図の作成実施例４で選択された組換え体ｆＮＰ１０３５を作製し
た組換え用プラスミドは、ｐＮＰ３５の非必須領域を挿
入部位とした。そこでこのｐＮＰ３５の詳細な制限酵素
地図を以下のように作製した。ｆＮＰ３５を制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｐａＩ、ＳａｃＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＣｌａＩをそれぞれ単独で用いて切断、または
二つの制限酵素で二重切断し、アガロースゲル電気泳動
を行い、切断されて出現するバンドの数と本数を調べ
た。二重切断の組み合わせを変えることで、上記制限酵
素の切断部位が図２（図２の（ａ）列）に示す位置であ
ることがわかった。

【００２７】（２）塩基配列分析図２（図２の（ｂ）列）に示すＥｃｏＲＩ−５Ｋｂｐ断
片中のサブクローンをそれぞれ常法に従いｐＵＣ１８に
クローニングした。また、ｐＮＰ３５の欠失変異クロー
ンをＨｅｎｉｋｏｆｆの方法（Ｇｅｎｅ，２８巻、３５
７頁〜（１９８４））に従って取得した。取得した欠失
変異クローンを図２（図２の（ｃ）列）に示す。図２の
（ｂ）列で示したクローンの塩基配列を塩基配列解析キ
ット（ＡＢＩＰＲＩＳＭＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙ
ＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ）とＡＢＩ全自動シークエン
サーで解読した。その解析データを配列番号１に記載す
る。

【００２８】（参考例１）組み換え体ｆＮＺ６９２７
ＲＬの作製（１）ｆＮＺ６９２７ＲＬ作製用プラスミドｐＮＺ６９
２７ＲＬの構築比較対照として用いる組み換え体ｆＮＺ６９２７ＲＬを
作製する為のプラスミドｐＮＺ６９２７ＲＬは、大腸菌
由来のｌａｃＺ遺伝子に鳩痘由来のプロモーターＰ１７
を接続したプラスミド、ｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎａｇ
ｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４０２−１４０
８（１９９２））を元にして、ｐＮＺ９８（特開平３−
２７２８４号公報）のＶＶの７．５Ｋプロモーターと連
結したＮＤＶのＦ遺伝子と、ｐＮＺ８７（特開平１−１
５７３８１号公報）のＶＶの７．５Ｋプロモーターを連
結したＮＤＶのＨＮ遺伝子を挿入して作製した。

【００２９】（２）ｆＮＺ６９２７ＲＬの作製と純化組み換え用ベクターとしてｐＮＺ６９２７ＲＬを用いる
こと以外は実施例３に記載したのと同一方法で組み換え
体ｆＮＺ６９２７ＲＬを作製・純化した。

【００３０】（実施例６）組み換え体ｆＮＰ６９３５
の作製（１）ｐＮＰ３５にＮＤＶのＨＮとＦ遺伝子を挿入した
組み換え用プラスミドｐＮＰ６９３５の構築ｐＮＰ６９３５はｐＮＰ３５をＣｌａＩで切断後、ＤＮ
Ａポリメラーゼで切断末端を平滑にし、アルカリフォス
ファターゼ処理により５’−末端のリン酸を除去し、フ
ェノール・クロロホルム（１：１）で抽出しエタノール
で沈殿させて開裂プラスミドを回収した。比較例１
（１）のｐＮＺ６９２７ＲＬをＨｉｎｄＩＩＩで切断
し、ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑にし、アガロ
ースゲルから約７．５ＫｂｐのｌａｃＺ遺伝子とＮＤＶ
のＨＮとＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。先に回
収した開裂プラスミドとこのＤＮＡ断片をライゲースで
連結し、常法に従ってプラスミドｐＮＰ６９３５を取得
した。このプラスミドとｐＮＺ６９２７ＲＬは外来遺伝
子が同一で、非必須挿入領域が異なるのみである。

【００３１】（２）組み換え体ｆＮＰ６９３５の作製と
純化組み換え用ベクターにｐＮＰ６９３５を用いること以外
は実施例３と同じ方法で、組み換え体ｆＮＰ６９３５を
作製・純化した。ｆＮＰ６９３５とｆＮＺ６９２７ＲＬ
の両組み換え体は、それぞれサザンハイブリダイゼーシ
ョン法により解析され、ＮＤＶのＦ、ＨＮ遺伝子とｌａ
ｃＺ遺伝子が予想通りの位置にあることが確認された。

【００３２】（実施例７）実施例６と比較例１で得ら
れた組み換え体を免疫した鶏の発痘サイズと強毒ＮＤＶ
による攻撃試験ニューキャッスル病ウイルスの赤血球凝集抑制抗体価が
少なくとも４以上の移行抗体を有する生後３日齢の鶏の
雛を５０羽用意した。これらの雛の赤血球凝集抑制抗体
価の平均値は２４．３であった。これらの鶏をそれぞれ
１４、１４、１３、９羽づつの群に分けた。そのうち、
１４羽の群ふたつ（接種群）については、上記実施例で
得た組み換えアビポックスウイルスｆＮＺ６９３４とｆ
ＮＺ６９２７ＲＬ（いずれも１×１０⁴プラーク・フォ
ーミング・ユミット（ＰＦＵ））を穿刺針で翼膜に接種
した。１３羽の群（採血群）の雛については心臓から全
採血して、その血清を４℃で保存した。また、９羽の群
（非接種群）は、何も接種せず、接種群と共に、鶏アイ
ソレーター内で３週間飼育した。３週間の飼育中、接種
群と非接種群の計３群の雛のポックサイズを実施例４と
同様の方法で測定し、３週間後の２４日齢に３×１０⁴
ＰＦＵの強毒ニューカッスル病ウイルス佐藤株を腿の筋
肉中に接種（攻撃）し、その後２週間観察して耐過した
ものを感染防御と見なした。

【００３３】また、免疫１週間後、２週間後、攻撃直前
に鶏から血液を部分採取し、免疫時に採血群より採血さ
れた血液と共に、その血清中に存在するＮＤＶに対する
ＮＤＶ−ＨＩ価を常法（「鶏のワクチン」第２版、発行
元：（株）木香書房、平成４年発行、２８２頁「ニュー
カッスル病診断用赤血球凝集抗原」の項に記載された方
法）に従って測定した。各群の鶏の発痘サイズの平均の
推移を図３に示す。また、ＮＤＶ−ＨＩ抗体価の平均値
の推移とＮＤＶ攻撃試験の結果を表１に示す。図３と表
１より明らかなように、本発明の組み換え体であるｆＮ
Ｐ６９３５は、ｆＮＺ６９２７ＲＬよりも発痘サイズが
大きく、ＮＤＶ攻撃試験の成績もＨＩ抗体の誘導も共に
ｆＮＺ６９２７ＲＬよりも優れたワクチンであることが
証明された。特に本発明の組み換え体を接種した群で
は、被攻撃鶏の９０％以上が生存し、本発明の組み換え
体が極めて高い生存率を示す有効、かつ実用的なワクチ
ンであることが判った。

【００３４】

【表１】

【００３５】（実施例８）ｐＮＰ３５のＨｐａＩ領域に
外来遺伝子が挿入された組み換え体の作製図１のｐＮＰ３５の非必須領域中に２ヶ所存在する制限
酵素ＨｐａＩ切断部位の中に外来遺伝子を挿入した組み
換え体が得られるかどうか調べる為に、ｐＮＰ３５をＨ
ｐａＩで切断し、アルカリフォスファターゼ処理により
５’−末端のリン酸を除去し、その後フェノール・クロ
ロホルム（１：１）で抽出しエタノールで沈殿させて、
開裂ｐＮＰ３５を回収した。実施例２で記載したように
ｌａｃＺ遺伝子をこの回収したｐＮＺ３５に連結し、ｐ
ＮＰ１０３５−Ｈを作製した。このプラスミドを用いて
実施例３と同様にして組み換え体ｆＮＰ１０３５−Ｈを
作製・純化した。実施例４と同様にしてＳＰＦ鶏に接種
してその発痘サイズを親ウイルスであるＮＰ株と比較し
たところ、ｆＮＰ１０３５と同様に、発痘の推移はＮＰ
株と同様であった。このことは、ｐＮＰ３５の非必須領
域の挿入部位としては、ＣｌａＩ以外に、ＨｐａＩも使
用できることを示しており、配列番号１に示された非必
須領域が外来遺伝子が挿入されても生体内での増殖低下
が起こらないゲノム領域として有用であることが再確認
された。

【００３６】

【発明の効果】かくして本発明によれば、外来遺伝子が
挿入されても生体内での増殖低下が起こらないゲノム領
域に外来遺伝子が挿入された組み換えＡＰＶが得られ、
この組み換えＡＰＶは移行抗体を保有する鶏に対しても
有効なワクチンとして機能する。

【００３７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：5055 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：鳩痘ウイルス株名：ＮＰ株（鶏痘生ワクチン株）配列 GAATTCTAGA TATTTCAGTA TTGCCATTTT CTATAGCGCA GTGCAAAAGA GAACACCCAT 60 ATTCATTAAT CATATTCGGG TCCGAGTCAT TGTCTTTTAA AGCTTTAATA ACATCAGAAA 120 CACAGCCAGA TTCGATAGCC TCAAATACCT CCATGTTGTG TAATATTAGT AGTATCCGTG 180 TATGTACACC GGATGTACCA AGCGATATAA AAATGATTAA AATTTCAATT TTTATTTAAC 240 ATTAGGATGT CTATTTCATA ATCCCGTTAT TAGTAGTTAG TGGTTAGTAA GTACCATATT 300 ACTACTAATA AGATAAAAAA TAAAACTGCT GATGTACAGT TTATACCCAT AATGAAATTA 360 TTTATAAAAT CCTCAGCCAT GGAAATAATG AAATGATACA ACCAATTCAT ATACAATGTT 420 TATTTATAGG ATCTATTATG AATTAATATT TTTTTACTTT TTAACTAAAC GCGATTTAAT 480 AAATCTACTA TAGTATCAAT ATTATTTCAA ATAATAAAAA AATATTATAC GGTTAGTAAT 540 GTACTTTAAT GTATACCAAA ATAAAATCTA ATAGAGTAAT GTCTTTTTAA TTTCATATAT 600 ATCATTAGGA TTTATACATT TAATTGGGTA TTCAGTTCCA TAACCTCTAT AATTATCATC 660 AGTAGCCTTA AACATTTCTT CTTTATTAAC ATACTTACAT TTATTGGTAT CGTTCATGTT 720 AGATTTCAAA TCGTCAGTAT ATACTAAAGG TGCCATTGCC AAACAGAACT CTTCTTGGGA 780 TAGTTCATCT ACATAAAATT TACCATCGCT GTCTACCATA CCAAGAAATT CATTTCTTGT 840 AGTATATTGG ATACATCCAG AAACATACTC TATATCAGAA TTTAAACATC CTATGAATAT 900 ATTCATTATA ATACATGATG TCATAAACTT ACATTTAGTG TCGTAATCGA ACACCTTTAA 960 TATCGATTCC GGAGTAGTTT TAGTTCCATT TACCTGCATG AATACCATGC TATCAGTAAC 1020 TGGAGTTACT GTATTAAAGC ATGATTTGAT TTCACTACTT ATTTCACGTA GTATAACCAT 1080 TATTGTAAAG TGTAGTAGTT ATATATTATT CTGTAATAAG GAATTAATTT GCTAGTTGGG 1140 TTATAAAACG TTCTAGATAA ATCTATTAAT AATTCATTTT TATATATGTT ACTCGGAAGA 1200 AATTACTATT TACTAGTTAA TTATAGAATA GATAAGTCTT AATAATTTAC TTTTAGTATT 1260 ACTCGGAAGA AATTACTATA GTTGACTGTA TAAACATTAT AAGAAAGAAT AAATTCAAAA 1320 ATATTTATAA AATAAATATT CTACCATCTT CCGTAAACAT CTTTATATTC TGTTACTAGG 1380 TATTCTTTTC CTACATATCT TACAGGAAAT TCTCTGGCGT GTGTATCATT AAGCCAATAT 1440 CTACAATATG GAATTTCGAC ATGGCCGATG ACACTTTCGT TTACCTTTAT ACTTGTGTAT 1500 CTGTAATCCA CCACATTTTG TGTGAAGCCC TGCGGTCTTT CGTATGACAT TACACCTCCT 1560 GTTACTATAC CGGTTACTCT CCATCTAGGA TTGCCGTAAT TACTTCCTAC GAAGCAAGTT 1620 ATCTTGGTTT CGTTTTCATG TTTTTCTAGT AGATAGGTTA TACCTTCTTT TTTAATTTCG 1680 ATACATCTTT GATACGTTTC CTCTTTCCCA GAAGCAGTAA GTAGTACACA GGTAAAGCAC 1740 AAACTTTGAG GACCTGTTTT TTTAACTGTA AAAGTAGAAG TATCTCCACT AACAGTTACT 1800 TCATATATAT CTCTATAAGG ACTAGGAACA TAATTGAAAG CGTTAAGTCC GTTACCTCCT 1860 ACCTGCTCTT GGGCTACCAT AATCCCATCG CTGCCTCTCC AAGTAGCTCT TGATATTCCT 1920 TCTCCGTATT CGGTTCTGCA TTGTAATTTT ACAGGGCTAC CCGGTACACC TTCTTCTCCA 1980 TAGATATTTT TCAAGCTAAA TGCTATTATA GTAATTGCTA GAAATAAATA ATTAGCCTTC 2040 ATCTTGATTG CTTTATATTA AACACTGGAT AATGTACGAG GATCACATAT AGTAGTTAAT 2100 ATACTTATTC ACTTTTTAAT TAAAAATGTA TTAATCTTAA AAAAATATCA AAAATTAAAC 2160 CAACCACCTC TTATAACGAG ATTTCTGTCC AGGTTCCATC AAAGATGATC CAGAGATCAG 2220 AACCACAGAA AGGTCCTGTA ATTTTTCATC GTAAGAAGTC ATAGATGCTA CATAATCTCT 2280 ACTTAGACCC AAGTAACTTA CCGTAAATAT TACTGTAGTA GTACAATCAG TGTAATTTGT 2340 ATTTGCTACT ATTTTTTTAC ATTCATTATC TTTCGAATAT TCTACCAATA CTTGAATATC 2400 TTCGTTCAAC TTCACACCAC CTGCTCTAAC ATCTACTTTT ACTTCGTGGT CTTCTATAGT 2460 TCTAGTCCTA TTTATTATAA AATCAATCAA ATCTTTATCT ACATTATCTA TAACATACGC 2520 ATCTACGTGA GGCATTACTC TGAGTTCTAT ACCGTGTCTG TAACTCTCTG TTCCGTTGTA 2580 ATAGAAGATA CATCTATAGC GACCTTCGTC ATTTCTGGAT GACCTTTTAG GAAGTTCAAC 2640 ATTATATTCT TTAACTGGAT CGTTACAATA GCATATACTG TCTTCTCCGG CATCATGTAT 2700 GTCAATAGTT GCCTTAAACG CGTTATTTTT CATGTTTCCT TTTACTACAA TCAGTTTAGT 2760 AGCGTGTCTG TCAGGTGGTA GAAGACAAGT CAAATTAACC ATTACATCGT TATGTACTAC 2820 CATAGTATAA GATCGACATT GTAGGAAGGT AGCCAATAAG AATAAAGAAA CTACGTACAC 2880 TTTTCCAGCC ATTATTTTTT TTACCAACTA CTAATAATGC TACACTAGTG TTAGTGTTAT 2940 ATTTATGTTT TTTCCTAATA ATATCTGGAA ATCGTTTTAA GATCTTCCAT AGATAAATTT 3000 GACAATATTA CTCTATGTAT CTCAGGAGAT AGTAGACACC ATCTGCTGCT ATGATCTTTA 3060 CTAGCGTATT CATTGATGAT CGATAACGTC AAGTCTATAG CTGTCTTCCT TTTTTCCATG 3120 TATTTTATAT GCTTCTTAAT AAAACAACGA AATATCCTTA TATTTTTAAG ATCTATCCTT 3180 CGTATACGTT TTATAGAATT AGTTAGACCA TCCAGTTTAT CTAATATCAG AACATCGTAC 3240 AAGGATATTT TCTTATCACC CGTATAAAAT ACATTGTCTT TCATAATGGA CAGTTCGTGT 3300 TCTATTTCAT CCTTTAATGC TTTGGTTTCT TTATAGTTGT TTACAAATCT CATATTACGT 3360 ATAAAACCTT GTTTCTTCTT TATAGAAGAG TCGTTTATCA CAGAAAAGTA TAAATATATT 3420 ACAGCAATGA ACACAGCAGG ATTATTACGG GCTTTATGAA TAGTGATGGG AGTATGAAAT 3480 CTATTCATAA AACACATATC CGCTCCGTGT TCTAACAGTA CGCGAGTACA TTCTTCACAC 3540 TTATTACGTA TAGCGTAAGT TAGTGCTGTA TTTTTATCAT AATCTGTTTG ATTAACGTCA 3600 GCTCCATTAG CTAATAAGTA TTTCATATTA CTTACTTTAC TTTCTCTAGA ACAAATCATT 3660 AAAGGTGTTA TCCCGTAATT ATCTAGTTTC GTTAACGTTA GCTCCGTTTT TTAGTAATAT 3720 CTTTATATTA CTAATCCTAG AGTACATACA GGCTAAATGT ATAGGTGTTT TACCGTATCT 3780 ATTTCTTACA TTAACATCAG CACCTTTATT AACAAGTAGT CTAGTAAGCC TAGAAGTATT 3840 TATAGAAACA GCCGCGTGTA TAGGGTACAT ATTACAAGCA TCGCATGATA CGTTTATATC 3900 CTTTATCTTC TTTAGCAGTT TTCTTGTAAT AGGTAAATTC CTTAATTCGT ATATACACAT 3960 GCAGAGTATA GAAATAGGTA GATAATGAAT AGGTAAACTA AGTATGTATG AGATAATACT 4020 ATAATACCTC TTACATATCG CTTCCATCAG TATATCGTTA CAACATCTTA TTTGAGCTCC 4080 GTGTTTAACT AGAATATTGA ATAATCTTAC ACCGTGTTTA CTAGACATTA TAGCGTATTT 4140 TAACATTGTA TATACATCTC CTATATCTGG ATCTGCGCCG TGGTTTAATA ATAAATTTAC 4200 CAGAGTAACA TTTTCTTGTT CTACAGCATG ATATAATGCA GTATGCGTGT TTTCGCATAT 4260 ACCCGTGTTA ACATCAACTC CTGCATCAAT GAATAACTTT ACTATTTTAG GACTATTAGT 4320 TTTAACGGCT TCTAAGAAAT AATCTTCTAA CATTGTATCT GTATCTACTA ATAAATTATT 4380 AGTTATAAAA TATTCTACTA GTTCTGTATT TCTAGCTCTA ATTGCGCACT TAATAGTAAT 4440 GTTTCGCATA TAATATAAAC TTGGATGTTT AGTTTCTTCC CATAGAATTT GACATAGGGG 4500 TATAGTACTA AAATATGAAT ATCCTGTAGC ATAACCGTTT TTAACACAAT ATGAACTACC 4560 CTTGTAAGAA TCTAATACGT AAGATCTACA CGCCATTTTC AAATCAGCGC CATGTTTTAT 4620 CAAAAGTTTT AGTATTTCTG TATATTTTTC TATATTATTT GCAGATGTTA GTAGACGCCT 4680 TATTCTTTTT TCGGGTTTAA CCGTTTTATT ATCATTATAT AACATCATCC TACCCCCTGC 4740 TAACACTATA GCTATGTTAA TGGGATGAGA TTTTATAGTT TCACCACCGT TAATAACCGC 4800 ACCGTTACCT AATAACATTT TTATTATATC TATATTCGAA TGTTCTATAG CAATATGTAA 4860 AGCAAGTAGT CTATTGCTAT CGTACATAAT TATTATGTCT TTATCTTCTT CTATCAATAC 4920 ACGAAGCCTG TCTACATTAT TTTCTTTTAA GATATTATGT AATGATAGCA AACGATCTGT 4980 AGCGTTGTGT CTGTAAACTA GCTTCATTTT TTCTGGAGTT ATACAAAGAT ACAGTGATTT 5040 TTAATATATG AATTC..... 5055

【００３８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｌａｃＺ遺伝子を発現する様々な組み換え体を
接種したＳＰＦ鶏での発痘サイズの推移を示したグラフ
である。

【図２】ｐＮＰ３５の非必須領域の制限酵素地図、サブ
クローン図、および欠失変異クローン図を示した説明図
である。

【図３】組み換え体で免疫したニューカッスル病に対す
る移行抗体保有鶏の発痘サイズの推移を示したグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アビポックスウイルスの増殖に非必須な
ゲノム領域であって、当該領域に大腸菌由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子がワクシニアウイルス７．５Ｋプロ
モーターとともに挿入された組み換えアビポックスウイ
ルスの鶏体内での増殖性が前記β−ガラクトシダーゼ遺
伝子挿入前のウイルスの鶏体内での増殖性と比して実質
的に低下していない組み換えアビポックスウイルスが得
られるゲノム領域。
【請求項２】アビポックスウイルスの増殖に非必須な
ゲノム領域であって、当該領域に大腸菌由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子がワクシニアウイルス７．５Ｋプロ
モーターとともに挿入された組み換えアビポックスウイ
ルスの鶏体内での増殖性が前記β−ガラクトシダーゼ遺
伝子挿入前のウイルスの鶏体内での増殖性を１００とし
たとき、その９０％以上である組み換えアビポックスウ
イルスが得られるゲノム領域。
【請求項３】アビポックスウイルスの増殖に非必須な
ゲノム領域が、配列番号１に示されたＥｃｏＲＩ断片で
ある請求項１または２のいずれかに記載されたゲノム領
域。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載されたア
ビポックスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に、外
来遺伝子を挿入した組み換えアビポックスウイルス。
【請求項５】アビポックスウイルスが鶏痘ワクチン株
であるところの請求項５記載の組み換えアビポックスウ
イルス。
【請求項６】アビポックスウイルスが鶏痘ワクチンの
鳩痘中野株であるところの請求項４または５記載の組み
換えアビポックスウイルス。
【請求項７】外来遺伝子が、鳥類の病原体の抗原タン
パク質をコードする遺伝子である請求項４〜６のいずれ
かに記載された組み換えアビポックスウイルス。
【請求項８】外来遺伝子がニューキャッスル病ウイル
スの抗原タンパク質をコードした遺伝子である請求項７
記載の組み換えアビポックスウイルス。
【請求項９】外来遺伝子がニューキャッスル病ウイル
スのＦ抗原とＨＮ抗原をコードした遺伝子である請求項
８記載の組み換えアビポックスウイルス。
【請求項１０】請求項４〜９のいずれかに記載された
組み換えアビポックスウイルスを有効成分とするワクチ
ン。
【請求項１１】ニューキャッスル病ウイルスに対する
抗体を産生する組み換えウイルスを有効成分とする抗ニ
ューキャッスル病ワクチンであって、ニューキャッスル病ウイルスの赤血球凝集抑制抗体価
が少なくとも４以上である３日齢の雛鶏から成る当該価
平均が１６以上３２以下である鶏群に、前記組み換えウイルスを１×１０⁴プラーク・フォー
ミング・ユニットを接種し、接種から３週間後に強毒ニューカッスル病ウイルス佐
藤株３×１０⁴プラーク・フォーミング・ユミットを鶏
腿筋肉に接種し、その２週間後の被攻撃鶏の生存率が８０以上％である
ことを特徴とする抗ニューキャッスル病ワクチン。
【請求項１２】組み換えウイルスが請求項９記載の組
み換えアビポックスウイルスである請求項１１記載の抗
ニューキャッスル病ワクチン。
【請求項１３】アビポックスウイルスゲノムを任意に
切断し、得られたゲノム領域に大腸菌由来のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子がワクシニアウイルス７．５Ｋプロモ
ーターとともに挿入されたベクターを用いて組み換えア
ビポックスウイルスを作製し、当該組み換えアビポック
スウイルスを鶏に接種し、接種鶏体内での当該組み換え
アビポックスウイルスの増殖性を指標として、前記β−
ガラクトシダーゼ遺伝子挿入前のウイルスの鶏体内での
増殖性と比して実質的に低下していない組み換えアビポ
ックスウイルスを与える組み換えアビポックスウイルス
の増殖に非必須なゲノム領域の選択方法。【０００１】