CN103370079B

CN103370079B - 针对家禽中禽流感的火鸡疱疹病毒作为载体的疫苗

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Publication number: CN103370079B
Application number: CN201180061002.6A
Authority: CN
Inventors: P.J.A.宋德梅杰; I.弗施特根
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2031-10-17
Also published as: MX344069B; PL2629794T3; ES2635019T3; WO2012052384A1; HUE033739T2; CN103370079A; MX2013004303A; US8986987B2; US20130230556A1; EP2629794A1; EP2629794B1

Abstract

本申请涉及兽医疫苗领域，尤其是用于家禽针对禽流感的疫苗。疫苗基于表达流感病毒的血细胞凝集素蛋白的重组病毒载体，其中所述载体是火鸡疱疹病毒(HVT)并且所述血细胞凝集素基因由来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白B基因启动子驱动。包含该HVT+HA载体的疫苗可用于在家禽中诱导针对禽流感的保护性免疫应答，并降低AIV的传播。本发明还涉及HVT+HA载体的方法、用途和疫苗。

Description

针对家禽中禽流感的火鸡疱疹病毒作为载体的疫苗

本申请涉及兽医疫苗领域，尤其是用于家禽针对禽流感的疫苗。疫苗基于表达流感病毒的血细胞凝集素蛋白的重组病毒载体，其中载体是火鸡疱疹病毒(HVT)并且血细胞凝集素基因由来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白B基因启动子驱动。包含该HVT+HA载体的疫苗可用于在家禽中诱导针对禽流感的保护性免疫应答，并降低AIV的传播。本发明还涉及涉及HVT+HA载体的方法、用途和疫苗。

在1970年左右将火鸡疱疹病毒(HVT)描述为感染火鸡的疱疹病毒，并具有与马立克病病毒(MDV)相同的抗原特征。尽管MDV对于鸡是高致病的，但HVT对于鸡是非致病的并且可以用于针对由MDV导致的感染和疾病的有效接种(Okazaki等, 1970, Avian Diseases,第14卷, 第413-429页)。从那时起，通过使用HVT对鸡针对MDV的接种已成为每年世界范围内产生的数十亿只鸡的标准接种程序的一部分。与MDV不同，HVT例如可以通过超声处理从其产生的宿主细胞中纯化出来，并可以作为冷冻干燥稳定的疫苗进行销售，这一发现在这方面是非常有帮助的。

HVT在鸟类的淋巴细胞尤其是外周血淋巴细胞(PBL's)中复制，因此它是全身性病毒。它诱导长期的免疫应答，其主要针对细胞免疫系统，而非体液免疫系统。

HVT疫苗可以在早期向鸡应用，其是HVT的非致病性质以及它对针对MDV或HVT的母体来源抗体的相对不敏感性的组合结果。因此，HVT疫苗可以在从蛋中孵化的那天(第一天)或甚至在孵化之前同时仍在蛋中时向雏鸡接种。该后一种方法在蛋中接种(in ovovaccination)通常在胚胎发育(ED)第18天(其约为孵化前3天)应用。

目前将HVT分类于α疱疹病毒亚科中，并也公知为：

Meleagrid疱疹病毒1、火鸡疱疹病毒或马立克病病毒血清型3。

HVT病毒体具有典型疱疹病毒的所有特征，并且在它的包膜形式下大小为约160nm。在衣壳内，它包含线性双链DNA的大基因组。从2001年起，公知了约为159 kb的病毒基因组的完整序列(Genbank登录号AF291866)。

然而，在此之前很长时间，已研究并操作了HVT基因组；尤其它的非致病性特性已引起了对HVT作为病毒载体的用途的研究，所述病毒载体用于多种蛋白的表达和向接种了HVT重组体的宿主鸡的递送。实例是编码来自其它家禽病原体的抗原的基因的表达，如：传染性法氏囊病病毒(IBDV) (Darteil等, 1995, Virology, 第211卷, 第481-490页)和新城疫病毒(NDV) (Sondermeijer等, 1993, Vaccine, 第11卷, 第349-358页)。但是还描述了寄生虫抗原(Cronenberg等, 1999, Acta Virol., 第43卷, 第192-197页)或细胞因子(WO 2009/156,367; Tarpey等, 2007, Vaccine, 第25卷, 第8529-8535页)的表达，来操作鸡的免疫应答。

已研究了异源基因在合适的非必需基因座上插入HVT基因组的很多位置，如在HVT基因组的独特的短区(EP 431,668)内；或在独特的长区(EP 794,257)内。

已描述了异源核酸插入HVT的几种方法：使用同源重组(Sondermeijer等,见上文)、黏粒再生(US 5,961,982)或杆粒(细菌人工染色体)(Baigent 等, 2006, J. of Gen.Virol., 第87卷, 第769-776页)。

对于大规模生产，HVT通常在体外在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)的培养物中产生。这些是通过鸡胚的胰蛋白酶消化来制备的原代细胞。将CEF’s铺为单层并用HVT感染。尽管在体内HVT在淋巴样细胞中复制，但是随后它在这些成纤维细胞中复制。

目前许多包含表达异源抗原的HVT载体的商品化疫苗产品是可获得的。例如：NDVF抗原：Innovax®-ND-SB (MSD Animal Health)和Vectormune® HVT-NDV (Ceva)；IBDVVP2抗原: Vaxxitek® HVT+IBD (Merial)和Vectormune® HVT-IBD (Ceva)；或来自传染性喉气管炎病毒的抗原: Innovax®-ILT (MSD Animal Health)。

向家禽应用此类HVT载体疫苗将产生针对表达的异源基因以及针对HVT/MDV的免疫应答。由于MDV野毒株的毒力已随时间增加，因此目前针对MDV的一般接种整合了除了HVT病毒或载体外的其它MDV疫苗组分，例如MDV血清型1或2疫苗株，如分别为MDV Rispens或MDV SB1株。

流感病毒(IV)是对许多宿主种具有传染性的正黏病毒。从流感颗粒本身不能完全确定它已经感染或将来会感染何种宿主类型。因此，实际上，尽管向其它物种的交叉感染的确经常发生，例如：从水禽向鸡；从鸡向猪、猫或人；从人向马等，但通常将可以感染某一物种并在其中复制的流感病毒指作属于该物种。因此，禽流感病毒(AIV)涉及能够感染禽类的病毒。AIV会导致疾病：禽流感(AI)，其也公知为“禽瘟”或“禽流感”，并且在许多国家是应具报疾病。根据感染性AIV的致病型和受感染的鸟的免疫状态，疾病可以从亚临床的、至轻度呼吸的、至高度致死性的结果而变化。

在世界上AIV是地方病的那些地区，如在亚洲和中东，通常通过接种来对抗商品化家禽中的禽流感。在其它地区，如欧洲和北美，接种是受政府管理的并仅在爆发的情况下被允许，并且与检疫和根除措施结合起来。

所谓的高致病性(HP)型AIV病毒受到特别关注，这是由于它们造成从鸟类向包括人在内的其它物种传播的重要的人兽互传风险。HP AIV具有在HA蛋白的HA1和HA2部分的切割位点上包含大量碱性氨基酸的HA蛋白。这些碱性氨基酸的存在使得经切割的HA蛋白的激活可以通过蛋白酶来完成，这还存在于低致病AIV复制的呼吸道之外的器官中。这导致了更加全身性病毒血症和HP AIV感染的严重性。

流感A型病毒体如AIV包含由负极性的单链RNA组成的基因组，分为8段，编码10个蛋白。与免疫目的最为相关的病毒蛋白是血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(N)。HA是主要抗原，其可以诱导保护性体液免疫应答。通过它们的HA和N蛋白的血清型变体将AIV分类：到目前为止已描述了H1 - H16和N1 - N9。HP AIV总是H5或H7亚型。

尽管流感颗粒不限于感染一种特定物种，但在某些物种中的确似乎存在某些IV血清型的流行：猪中的IV血清型H1和H3；马中的H3和H7；狗中的H3；猫中的H5；火鸡中的H7和H9；以及鸡中的H5、H7和H9。

由于针对流感的免疫应答是血清型特异的，因此针对流感的疫苗通常匹配在野外传播的IV的免疫亚型。商品化的AI疫苗包含在油-佐剂化的乳剂中的完全灭活的AIV或活的减毒的AIV疫苗株。

尽管如此，发生了IV野外病毒中随时间的变化，也公知为“遗传漂变”。实际上，与现存毒株在其HA蛋白的氨基酸序列同一性上具有多于90％的差异的IV毒株将被指定为新的抗原类，并将获得新的“进化枝”编号。该现象可能会面对具有从最后一次感染或接种后已或多或少改变了其免疫概况的IV的目标群。这可能使得现存的疫苗即使是正确的亚型的时候，也会随时间而效率不足，因此需要疫苗病毒的升级。在其它原因中，已开发了基于重组DNA技术的流感疫苗来促进这样的升级。例如通过杆状病毒表达载体系统表达的IV-HA亚基的疫苗。必要时，通过常规分子生物学技术可以将表达的H5 HA基因交换为更近期的基因。

类似地，已开发在活载体微生物的背景下表达HA蛋白的AI的载体疫苗。此类载体的实例是病毒如：传染性喉气管炎病毒(ILTV) (Lüschow等, 2001, Vaccine, 第19卷, 第4249-59页); 牛瘟病毒(Walsh等, 2000, J. Virol., 第74卷, 第10165-10175页); 水疱性口腔炎病毒(Roberts等, 1998, J. Virol., 第247卷, 第4704-4711页); 禽痘病毒(Swayne等, 2000, Vaccine, 第18卷,第1088-1095页);腺病毒(Toro等, 2010, AvianDiseases, 第54卷,第224-231页); 和NDV (Veits等, 2006, PNAS USA, 第103卷, 第8197-8202页)。

其中，基于禽痘载体的Trovac® AIV-H5疫苗(Merial)是商品化的。

用于家禽的AI疫苗理所应当旨在保护接种的动物免于禽流感症状，并免于未来再次感染。然而，疫苗降低野生型病毒在环境中的传播(如向其它羊群、向迁徙或本地野生鸟类或向其它动物物种)的能力与如AIV的具有人兽互传及广泛流行潜力的病毒病几乎同样相关。可以通过在接种的鸟中诱导非常有效的免疫应答来获得病毒传播的降低。

是亚基或载体疫苗的AI疫苗具有这样的优点，它们可以用于DIVA技术：“感染的和接种的动物的差异”中，也公知为：‘标记疫苗’。其进行应用是由于重组疫苗仅仅针对表达的病毒蛋白而不会针对其它病毒蛋白(这在全病毒感染的情况下会发生)诱导抗体。DIVA对于需要保持并保证无AIV状态如为了出口目的的那些国家或经济区来说是重要的。

目前在佐剂化的油-乳剂中基于完全灭活的AIV的疫苗无法通过DIVA进行区分。在最坏情况下，接种有此类疫苗的家禽将携带针对AIV的广谱的抗体，但是如果这些不是完全保护性的，尽管将不会引起注意，但鸟可能仍然是活的感染性AIV的携带者。

用于表达和递送异源抗原的活重组病毒载体必须能够克服对其稳定性和效力的许多生物应激：首先是在转染后产生后代的能力。这表明重组病毒是有活力的。随后，体外在宿主细胞系中复制多个周期而保持异源基因的表达的能力。这表明重组体没有由于插入而减毒，并且该插入是稳定复制并表达的。然后，体内复制和表达。这表明重组体可以克服在活动物中的显著的选择压力，如由免疫系统所产生的选择压力。通常，外源基因表达的丧失倾向于在动物中更快的复制；此类“逃避突变体”在外源基因中已获得了突变或主要缺失，并且它们比完整载体生长更快。最终，动物中的复制需要能够产生有效保护已接种动物的免疫应答。

关于体内效力，在已具有抗体的动物中病毒载体疫苗的行为受到了特别关注；针对载体和/或它表达的异源基因。对于小动物来说，这些抗体主要来自于它们的母亲，其已针对普通病原体进行了充分接种；因此将它们命名为母体来源抗体(MDA)。由于它们能够刺激动物的免疫系统以(非目的性的)清除载体疫苗，因此此类抗体能够干扰载体的复制和/或外源基因的表达。

已描述了具有IV-HA基因插入片段的HVT载体的重组病毒载体构建体：CEVA公司已在互联网网址(http://www.ceva.com/en/Responsibility/Contributions)上宣布了“VECTORMUNE HVT-A1”产品，但还无法获得细节。

Lan等(2009, Acta Microbiologica Sinica, 第49卷, 第78-84页)描述了通过使用改进的杆粒重组技术产生的具有H5 IV-HA基因插入片段的HVT载体。从该论文的翻译(其为中文)和关于用于MDV的重组技术的相应论文(Cui等, 2009, J. of Virol. Meth.,第156卷, 第66-72页)来看，明显Lan等通过向HVT的Us2基因插入表达盒来构建了他们的重组HVT；表达盒包含在人巨细胞病毒即时早期基因(IE-hCMV)启动子的控制下的IV H5 HA基因。该盒包含克隆和选择过程需要的额外元件。Lan等的论文仅仅描述了HVT+H5重组体的克隆和拯救；没有报道动物试验，也没有报道来自体外或体内试验的任何效力或稳定性数据。

或者，Zhou等(2010, Vaccine, 第28卷, 第3990-3996页)提到了从MDV1的Us10基因座上gB启动子用于IBDV VP2表达的用途。值得注意的是，该特征在摘要中简单提及，但论文的其余部分描述了MDV1载体的构建和用途，所述MDV1载体从Us2基因座上表达由hCMV-IE启动子驱动lacZ和VP2?

Sonoda等(2000, J. of Virol., 第74卷, 第3217-3226页)描述了从MDV1的Us10基因座上MDV1 gB基因启动子驱动NDV F基因表达的用途。

Takekoshi等(1998,Tokai J. Exp. Clin. Med., 第23卷, 第39-44页)描述了来自hCMV的gB基因启动子在hCMV中用于表达异源基因的用途。

US2008/0241188描述了在HVT载体中CMV IE基因启动子驱动AIV HA基因的用途。

WO2007/022151描述了在人腺病毒载体中hCMV早期基因启动子驱动AIV HA基因的用途。

WO01/05988描述了在HVT载体中mCMV IE基因启动子和SV40启动子驱动来自禽类白血病病毒(avian leokosis virus)的基因的用途。

Sonoda等(J. of Virol., 第74卷,第3217页)描述了在MDV1载体中MDV1 gB基因启动子驱动NDV F基因的用途。

WO2010/119112描述了(实施例23-25中)在HVT载体背景下CMV IE基因启动子驱动来自AIV的H5型HA基因表达的用途。

本发明的目的是产生基于HVT载体的AI疫苗；载体疫苗应在家禽中诱导针对由AIV导致的感染和疾病的有效免疫保护。

对于此类免疫学上和经济上可行的载体疫苗产品的主要要求是它在载体复制和插入的异源基因的表达上均是稳定的。当载体疫苗在接种后的宿主动物中复制时，该组合允许体外复制大量轮次(其对于大规模生产是必需的)以及插入的外源基因的持续表达和呈递至宿主免疫系统。此外，该稳定性会允许载体疫苗达到非常高的安全性和生物稳定性的标准，向领域中引入的重组病毒必须达到所述标准，以获得来自国家政府部门的市场授权。

发明人惊奇地发现已在先前技术中用于在HVT中驱动异源基因表达的启动子无法在HVT载体背景下用于表达IV HA基因。

检测了几种启动子在HVT基因组的Us10基因座上驱动IV H5 HA基因的表达：劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(RSV LTR)启动子(如EP 431,668中所描述:来自pRSVcat(Gorman 等, 1982, PNAS USA, 第79卷, 第6777-6781页)); 和hCMV IE基因启动子(来自pI17: Cox等, 2002, Scand. J. Immunol., 第55卷, 第14-23页)。具有hCMV IE启动子的载体在转染后的确产生噬斑，但是它们无法被扩增多个循环；具有LTR启动子的HVT载体的确产生能够被扩增的噬斑，但是它们仅显示出非常弱的HA表达，并且当作为重组病毒HVP142在动物中检测时，在2-3周内不提供明显的保护效果(见实施例)。

在这种情况下，完全出人意料的是来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子(之前还没有描述所述启动子在HVT中驱动异源基因表达或IV HA基因的表达)可以用于构建表达IV HA基因插入片段的HVT载体疫苗，其有利地显示出载体复制的稳定性和外源基因表达的免疫效力。

不想被理论所束缚，发明人推测来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子当用于在HVT载体背景下表达IV HA基因时，提供了在异源基因表达强度和毒株将其施加在重组HVT的复制能力之间刚刚好的平衡。

因此，本发明涉及包含异源核酸的HVT载体，所述核酸包含能够编码IV HA蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列与来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白B(gB)基因启动子可操作连接。

本发明的HVT载体在复制中是稳定的，并且在体外和体内提供插入的IV HA基因的持续表达。当用于家禽疫苗中时，HVT+HA载体诱导了强力的免疫应答，所述免疫应答能够保护鸟类免患由严重AIV攻击感染导致的疾病，并显著降低攻击病毒向环境的传播。

本发明的“载体”是活的重组载体微生物，此处：HVT。

本发明的“异源核酸”是这样的核酸，所述核酸不会在用于产生本发明的重组HVT载体的亲本HVT中出现。

本发明的“蛋白”是氨基酸的分子链。必要时，例如可以通过例如糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、聚乙二醇化或在空间折叠上改变而在体内或体外对蛋白进行修饰。蛋白可以是生物或合成来源的。蛋白可以是天然或成熟蛋白、前蛋白或原蛋白、或蛋白的功能片段。尤其，免疫活性肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定义中。

众所周知“启动子”是生物的基因组中指导下游编码区转录的功能区。因此启动子是DNA片段，其位于可读框(通常为基因)的上游，即5'侧。

众所周知，启动子起始它控制的基因从‘转录起始位点’(TSS)开始mRNA合成。产生的mRNA从基因起始密码子开始依次翻译成为蛋白，所述起始密码子是可读框中的第一个ATG序列(mRNA中的第一个AUG)。通常TSS位于起始密码子上游30-40个核苷酸处。可以通过对基因mRNA的5'端测序(例如通过RACE技术)来确定TSS。

启动子不具有特定的长度，但是通常启动子包含于起始密码子的A的位置上游1000个核苷酸内，所述起始密码子通常表示为A+1；大部分启动子位于-500和A+1之间，通常在核苷酸-250和A+1之间。

而且，启动子不具有固定的核苷酸序列，但是它们的确包含许多可识别的、保守的序列元件；这些元件参与结合转录因子和指导RNA聚合酶，但也参与调控随后转录的时间、持续时间、条件和水平。通过这种方式，启动子对来自调控元件如增强子的信号或者DNA结合因子如药物、激素、代谢物等作出响应。众所周知的保守启动子元件是TATA框，通常位于TSS上游50个核苷酸之内，一般为TSS上游约30 nt。保守启动子元件的其它实例是一般位于TSS上游约75 nt处的CAAT框和一般位于TSS上游约90 nt处的GC盒。

可以使用标准试验(如通过亚克隆的怀疑的启动子的更小或更大区域表达标记基因)来方便地确定启动子的位置和大小。以类似的方法，通过检测标记基因的表达(通过检测RNA或蛋白产生)，可以测定并比较不同启动子的相对强度。

实际上，可以通过这样的方法简单地挑选出启动子，所述方法包括亚克隆两个相邻基因之间的区域，如从上游基因的聚腺苷酸信号至下游基因的TSS，随后在合适时修整克隆区域。

由于启动子与在天然背景下它控制表达的基因相邻，因此知道了基因的位置或它的mRNA的转录起始自然就公开了它伴随的启动子的位置。这也适用于本发明，其中“来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子”指驱动疱疹病毒gB基因表达并且紧挨着位于该gB基因上游的启动子。在正常疱疹病毒复制中，gB蛋白参与细胞进入和细胞传播。由于gB基因是如此详细记载并清楚易识别的基因，并且由于已经测序了许多疱疹病毒科的基因组(全部或部分地)，因此技术人员可以通过常规技术容易地鉴定并获得这样的启动子。

Perreira发表了疱疹病毒gB蛋白的综述(1994, Infect. Agents Dis., 第3卷,第9-28页)。Pederson等详细研究了HSV1 gB基因的启动子(1992, J. of Virol., 第66卷,第6226-6232页)。然而，这些均未描述或暗示疱疹病毒gB启动子在HVT或任何其它表达载体系统中驱动异源基因表达的用途。

对于本发明而言，来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子需要能够驱动HA基因的表达。这通常指作启动子与基因“可操作连接”，或：基因在启动子的“控制之下”。这通常表示在最终的HVT载体构建体中gB基因启动子和HA基因以有效邻近连接到相同的DNA上，并且在它们之间不存在会干扰有效转录和翻译的信号或序列。

在本发明的载体构建体中，通过HA基因提供起始密码子。而且，产生的载体构建体尽可能的简洁，表明除了一些限制性酶且位点之外，在重组载体构建体中没有实质的外源元件，如具有重组体的克隆或选择必需的异源元件的表达盒。

尽管不是严格必需，但在优选的实施方案中，构建HA基因包含下游聚腺苷酸信号，例如来自SV40的下游聚腺苷酸信号。此类信号可以提供转录更完整的终止以及转录物进行翻译的多聚腺苷化作用。

可以通过众所周知的分子生物学技术包括克隆、转染、重组、选择和扩增来完成HVT+HA载体构建体的产生。

本发明的“哺乳动物疱疹病毒”涉及通常感染哺乳动物物种并在哺乳动物物种中复制的疱疹病毒。优选它们来自α疱疹病毒亚科的分类学亚科。例如：人疱疹病毒1(单纯疱疹病毒1)、牛疱疹病毒1、猫疱疹病毒1、马疱疹病毒1(EHV)或伪狂犬病病毒(PRV，也为：猪疱疹病毒1)。

来自此类哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子有利地用于本发明。

因此，在优选的实施方案中，本发明的来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子来自PRV或EHV。

证实包含这些gB基因启动子的HVT载体在体外和体内都十分稳定，并且当用于家禽疫苗中时，对于保护家禽免患AI并降低AIV传播在免疫学上是非常有效的。

此类启动子可以方便地从现有技术中获得，如从Genbank中，例如：

- PRV，来自Genbank登录号: BK001744,区域 20139 - 19596 (PRV gB基因是Ul27或gII)，或

- EHV，来自Genbank登录号: AY665713,区域 60709 - 61570 (EHV1 gB基因是ORF33)。

此外，Genbank登录号pfam00606方便地代表一簇疱疹病毒gB蛋白。

如实施例中描述的载体构建体HVP311包含EHV gB基因启动子(SEQ ID NO: 1)，并且显示出体外和体内的稳定性。当用作疫苗时，该构建体显示出良好的免疫保护和病毒传播的降低，见实施例。

为了更进一步改善本发明来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子的效力，在保持它的稳定性的同时修改了启动子。该修改是启动子序列的延长，使得目前它不在 A+1之前结束，而是延伸至gB基因起始密码子A+1的下游，进入通常翻译成蛋白的gB基因的编码区。

结果是延长的启动子目前包含一个或多个ATG密码子，即原始的起始密码子和可能的其它甲硫氨酸编码三联体。在启动子中的TATA框下游位置上的此类ATG密码子可以被细胞转录机制作为起始密码子而翻译，产生不希望的早熟的翻译起始。因此，通过突变对位于gB基因启动子的TATA框下游的ATG密码子(其目前包含在延长的启动子序列中)进行修饰，以使得此类ATG失去作为潜在起始密码子的功能。这允许本发明的gB启动子整合跨过天然gB起始密码子并延伸入gB基因翻译区内的核苷酸，但是这些额外的核苷酸不能被翻译，而是充当延长的前导序列。

因此，构建包含来自原始A+1下游的gB编码区的核苷酸的启动子序列。

因此，在更优选的实施方案中，来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子包含来自所述gB基因翻译区的核苷酸序列，其中对任何ATG核苷酸序列进行了改变。

本发明延长的启动子中ATG核苷酸序列的‘改变’优选通过突变来产生。原则上可以将ATG核苷酸序列改变为任何其它三联体，只要这不会降低复制中的稳定性或来自载体构建体的表达。

优选改变是通过单个核苷酸，优选从ATG变为TTG。

包含于本发明延长的gB启动子中的ATG下游的核苷酸数目是至少10，优选至少20、30、50、75或100，这是优先的顺序。实际上，A+1下游待整合至本发明延长的启动子中的核苷酸数目可以方便地从A+1最多至(但不包括)下一个下游的ATG密码子的序列中得到。在那种情况下，只有一个ATG序列(起始密码子的那个)需要通过突变来改变。

如实施例中描述的载体构建体HVP310包含延长至A+1后129 nt的PRV gB基因启动子。包含于延长序列中的唯一的ATG序列来自原始的起始密码子，通过突变将其改变为TTG。该载体显示在体外与未修改的EHV gB基因启动子相似的效力和稳定性，但在体内具有大大改善的效力，见实施例。

延长的PRV gB基因启动子如SEQ ID NO: 2中表示。

因此，在本发明来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子的进一步优选的实施方案中，启动子具有如SEQ ID NO: 2或其同等物中的核苷酸序列。

包含于本发明的HVT载体中的HA基因原则上可以是任何流感病毒HA基因，因此原则上来自任何IV，并且是任何血清型H1 - H16的HA基因，或下文中描述的相似的HA基因。

对于基于本发明的HVT载体的针对AI的家禽疫苗的最佳效力，插入的HA基因优选为高致病性(HP)型HA基因，因此在HA1-HA2切割位点上包含碱性氨基酸。HP HA基因的表达提供了针对HP型AIV感染有效接种家禽并且降低向环境中进一步传播的可能性。

因此，在本发明HVT载体的进一步优选的实施方案中，能够编码IV HA蛋白的核苷酸序列来自HP IV。

本领域中众所周知何种IV有资格作为HP，并且许多序列是可以公开获得的。而且，使用常规分子生物学技术如RT-PCR可以从来自不同物种的宿主的HP IV野外分离株中容易地获得用于本发明中的HP HA基因。

优选地，本发明的HP型HA获自HP AIV。

NB:操作活HP AIV分离株将需要合适防护水平的实验室设施。

为了进一步改善包含本发明HVT载体的家禽疫苗的效力，对包含于该载体中的HA基因进行密码子优化。密码子优化的方法在本领域是众所周知的，并且涉及修改编码蛋白的核苷酸序列来编码与原始编码序列相同的氨基酸，但它具有其它的核苷酸；即，突变实质上是沉默的。这改善了编码序列在与表达基因来源不同的背景下表达的水平。例如当在重组表达系统的新背景下表达某一基因时，修改后的密码子使用随后适应新系统的密码子偏好。实际上，这将表示尽管大部分氨基酸将保持相同，但编码核苷酸序列可能与原始序列有相当大的不同(最高达25％的同一性)。

对于本发明，用于本发明中的IV HA基因的cDNA的编码序列对于在真核生物病毒载体如HVT中的表达进行了优化。

已对本发明进行了密码子优化的来自HP型AIV的HA基因序列的实例是：分别来自H5和H7 HA基因的SEQ ID NO’s: 3和3，和SEQ ID NO: 4和6中对应的编码的HA蛋白。众所周知，处于与这些基因的氨基酸序列90％的同一性之内的HA蛋白通常认为是相同的抗原类型。

因此，在能够编码用于本发明HVT载体的IV HA蛋白的核苷酸序列的更优选实施方案中，所编码的AIV HA蛋白与SEQ ID NO 4或6中的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。甚至更优选95、96、97、98、99或100 %，这是优先的顺序。

在进一步优选的实施方案中，能够编码本发明IV HA蛋白的核苷酸序列具有与SEQID NO: 3或5中的核苷酸序列具有至少90 %的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。甚至更优选95、96、97、98、99或100 %，这是优先的顺序。

本发明最优选的HVT载体包含异源核酸，所述核酸包含来自PRV的延长的gB基因启动子(如SEQ ID NO: 2)和H5型的密码子优化的AIV HA基因(如SEQ ID NO: 3)，由此该异源核酸插入到HVT基因组的Us2基因座上。

这样的HVT+HA载体病毒的实例由HVP310载体构建体所代表(见实施例)，其提供了免疫中的最高效力和测定到的病毒传播的降低。

可以通过常规技术用于装配这样的重组HVT+HA载体病毒的异源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7中表示。序列可以方便地整合至如从pUC系列商品化的标准载体质粒中。所获的质粒随后通常指为“转移载体”，并适合用于转染方案中。

如所描述的，本发明的 HVT+HA载体构建体可以通过本领域众所周知的标准技术来产生。对于这些技术重要的是将异源核酸整合入HVT的基因组中，所述异源核酸包含本发明的来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子和本发明的IV HA基因。

因此，本发明的另一方面涉及本发明HVT载体的制备方法，其包括将包含能够编码IV HA蛋白的核苷酸序列的异源核酸整合入HVT基因组中，其中所述核苷酸序列与来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子可操作连接。

本发明的HVT +HA载体的有益用途是在针对AI的家禽疫苗中；保护鸟类以及它们的环境免受由AIV导致的感染和疾病。

因此，在另一方面，本发明涉及本发明的HVT载体或通过本发明的方法可获得的HVT载体，其用于针对AI的家禽接种中。

通过使用包含本发明的HVT载体的疫苗组合物来有利地完成本发明接种中的此类用途。

因此，在另一方面，本发明涉及本发明的HVT载体或通过本发明的方法可获得的HVT载体，其用于针对家禽中AI的疫苗中。

本发明载体的此类用途体现在家禽疫苗中。

因此，在另一方面，本发明涉及针对家禽中AI的疫苗，其包含本发明的或通过本发明的方法可获得的HVT载体，和药学上可接受的载体。

众所周知疫苗是在药学上可接受的载体中包含免疫活性化合物的组合物。‘免疫活性化合物’或‘抗原’是由目标的免疫系统识别并且诱导免疫应答的分子。应答可以从先天或获得性免疫系统引发，并且可以是细胞和/或体液类型。对于本发明，抗原是蛋白。

通常，疫苗诱导免疫应答，所述免疫应答有助于预防、改善、降低对由微生物感染导致的疾病或病症的敏感性或治疗由微生物感染导致的疾病或病症。作为施用至少一种来自微生物的抗原的结果实现了保护。这将使目标动物显示出由微生物引起的临床体征数目或强度的降低。这可能是由降低的微生物侵入、集落形成或感染率的结果，其引起由微生物或由针对微生物的靶应答导致的损伤和作用的数目或严重性的降低。

“药学上可接受的载体”旨在帮助化合物的有效施用，而不对它施用的动物的健康产生(严重的)副作用。此类载体例如可以是无菌水或无菌的生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体例如可以是缓冲剂，其可以包含其它的添加剂，如稳定剂或防腐剂。细节和实例例如描述于众所周知的手册如：“Remington: the science and practice of pharmacy”(2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)，和: “Veterinary vaccinology” (P.Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)。

本发明的疫苗通过本文描述的方法从本发明活的HVT+HA病毒载体颗粒来制备，所述方法对于本领域技术人员是容易应用的。例如，通过转染和重组构建本发明的HVT+HA载体并且如本文描述选择期望的重组HVT载体。下一步HVT载体病毒以更小或更大体积进行工业化生产。尽管在宿主动物中生产是可能的，但优选在体外培养物中如在CEF’s中增殖。在收获包含病毒的悬浮液(全细胞或细胞超声处理物)后，将该悬浮液配制为疫苗并且包装最终产物。在广泛检测质量、数量和无菌度之后，此类疫苗产品准予销售。

用于疫苗学的普通技术和考虑在本领域是众所周知的并且例如描述于管理规程(Pharmacopoeia)中和手册如：“Veterinary vaccinology”和: “Remington”(均见上文)中。

如果接种的HVT+HA载体病毒能够建立保护性感染，本发明的HVT+HA载体疫苗原则上可以通过不同的施用途径并且在它们寿命的不同时间点上给予目标家禽。

然而，由于AIV感染可能在非常小的年龄已经建立，因此尽可能早地应用本发明的疫苗是有利的。因此，本发明的疫苗优选在孵化当天(“第1天”)或在蛋中，如ED第18天应用。此外，应用优选通过大量接种的方法。这提供了最早的可能保护，同时将劳动成本降到最低。

在早期可应用的此类大量应用途径的众所周知的方法是：通过在第1天粗喷雾或向蛋中自动注射。工业规模应用的合适设备是商品化的。

因此，在进一步优选的实施方案中，本发明的疫苗可以在蛋中应用。

已知不同的在蛋中接种途径，如向卵黄囊中、向胚胎中或向尿囊液腔中；这些可以根据需要来优化。优选向尿囊液腔中接种。

或者，当本发明的疫苗与其它抗原成分组合时，可能需要肠胃外应用，例如通过注射入或经过皮肤：如肌内的、腹膜内的、皮下的注射等。

适合注射的本发明的疫苗制剂是例如悬浮液、溶液、分散体或乳剂。

当通过喷雾接种应用时，所用的微滴大小是重要的：通常应用粗喷雾(微滴大小超过50 µm)，其有效地是经口、鼻和/或眼睛途径的应用。

本发明疫苗的应用途径，可能需要改变疫苗组合物。这完全属于技术人员能力范围之内，并且通常涉及疫苗效力或安全性的微调。这可以通过改变疫苗剂量、数量、频率、途径，通过使用另一种形式或制剂的疫苗，或通过改变疫苗其它成分(如稳定剂或佐剂)来完成。

例如，为了适合在蛋中应用，疫苗组合物需要非常温和，以不会降低蛋的孵化率。孵化率的某些降低是可以接受的，例如降低10％，更优选5、4、3、2、1或0 %，这是优先的顺序。

通常，通过使用已确定的安全HVT疫苗毒株如PB1或FC126 HVT毒株作为本发明载体构建体的亲本HVT病毒来提供本发明疫苗的安全性。这些通常是可获得的并且公知适合于在蛋中接种。异源核酸的整合不可能增加它的毒力或致病性(相反)，并且未恢复毒力是可以接受的。

由于HVT载体疫苗会自我复制并且因此在宿主体内繁殖高至生物学上可以忍受的病毒血症的水平，因此本发明的HVT载体病毒在疫苗剂量中的准确量不象它对于灭活乳剂型疫苗那么关键。疫苗剂量只需要足以产生这样的产毒性感染。更高的接种物剂量很难减少它在宿主体内达到最佳病毒血症所需的时间；非常高的剂量是无效的，这是由于确立的病毒血症无法比天然最佳条件更高，而且由于经济原因，这样非常高的接种物剂量也是没有吸引力的。

优选的接种物剂量因此为1x10^0－1x10^6蚀斑形成单位(pfu)/每动物剂量，更优选1x10^1－1x10^5 / pfu剂量，甚至更优选1x10^2－1x10^4 / pfu剂量；最优选500－5000pfu/剂量的HVT载体病毒。

本发明疫苗的免疫有效量的测定完全在技术人员的能力范围之内，例如通过监测接种后或攻击感染后的免疫应答，例如通过病原体的再分离、或通过监测疾病的目标临床体征或血清学参数，并且将这些与未接种动物中观察到的应答相比较。

向目标生物应用本发明的疫苗的剂量方案可以是单一或多次剂量，其可以以与疫苗制剂相容的方式并且以将为免疫有效的量同时或连续给予。

本发明的疫苗可以用于预防性和治疗性处理，因此干扰了感染或它的疾病临床症状的建立和/或进展。

本发明的疫苗可以有效地用作引发接种，其可以随后伴随并且通过加强接种扩增，例如用经典的灭活的全病毒、佐剂疫苗。

本发明疫苗的施用方案理想地整合入现有的其它疫苗的接种程序表中。

优选本发明的疫苗在孵化当天或在蛋中仅应用一次。

每一动物剂量本发明的HVT+HA载体疫苗的体积可以根据预计的应用途径来优化：在蛋中接种通常以0.05－0.5 ml/蛋的体积应用，而肠胃外注射通常以0.1－1 ml/鸟的体积来完成。

剂量体积的测定和优化完全在技术人员能力范围之内。

将本发明的疫苗配制为联合疫苗是非常有效的，由于以这种方式，多种免疫药剂可以一次施用，实现了时间和劳动成本的降低，并且减少了接种的目标动物的不适感。除了本发明的疫苗之外，联合疫苗包含另一种抗原化合物。原则上这可以是任何活的或已杀死的微生物或亚基产物，只要它不降低复制中的稳定性或来自HVT+HA载体构建体的表达。一种或多种额外的免疫活性组分可以是抗原、免疫增强物质、细胞因子和/或疫苗。

或者，可以将本发明的疫苗本身添加至疫苗。

因此，在进一步优选的实施方案中，本发明的疫苗特征在于疫苗包含一种或多种额外的免疫活性组分。

在更优选的实施方案中，本发明的疫苗是联合疫苗，包含至少一种来自对家禽致病的微生物的额外抗原。

优选来自对家禽致病的微生物的额外抗原选自：

－病毒：传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、腺病毒、减蛋综合征病毒、传染性法氏囊病病毒(即Gumborovirus)、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽肺炎病毒和呼肠孤病毒；

－细菌：大肠杆菌、沙门氏菌种(Salmonella spec.)、鼻气管鸟杆菌(Ornitobacterium rhinotracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilis paragallinarum)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、丹毒种(Erysipelas spec.)、支原体种(Mycoplasma spec.)和梭菌种(Clostridium spec.)；

－寄生虫：艾美球虫属种(Eimeria spec.)；和

－真菌：如曲霉种(Aspergillus spec.)。

最优选为MDV、ILTV、IBDV和NDV。

对于本发明的疫苗应用的优选的家禽目标动物是鸡。所述鸡可以是蛋鸡、种鸡、联合品种或任何此类鸡品种的亲本品系。

尽管接种健康目标并且尽可能早接种以防止任何野外感染是明显有利的，但待接种的家禽的年龄、重量、性别、免疫状态和其它参数并不是关键性的。

本发明的疫苗有利地作为‘标记疫苗’用于DIVA方法中。公知标记疫苗为允许区分接种的和野外感染的受试者的疫苗。这可以方便地通过血清学测定如ELISA或免疫荧光测定来检测。

因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗是标记疫苗。

如描述地，根据期望的应用途径、抗原组合等，存在能够组成并配制本发明疫苗的多种方式。

因此，在另一方面，本发明涉及本发明的HVT载体或通过本发明的方法可获得的HVT载体用于制备针对家禽中AI的疫苗的用途。

或者，在另一方面，本发明涉及本发明的疫苗的制备方法，所述方法包括将本发明的HVT载体或通过本发明的方法可获得的HVT载体与药学上可接受的载体混合。

由于HVT的有利特性，根据本发明的用途或方法生产的疫苗可以以不同形式存在，尤其是以无细胞或细胞相关形式存在。为了获得细胞相关形式，将HVT+HA载体病毒与它的宿主细胞(它在其中产生)如CEF’s一同收集。在无细胞形式中，在稳定剂溶液中将宿主生产细胞超声处理，并且以超声处理的上清液收集无细胞HVT。

可以制备本发明的疫苗以包含一种或多种有助于本发明的HVT载体的生存力和质量的组分，从而促进了目标家禽中生产性复制和保护性感染的建立。

因此，在优选的实施方案中，根据本发明的用途或方法制备的疫苗包含稳定剂。

稳定剂是在贮存、操作和如通过注射或摄取的接种过程中稳定本发明的HVT载体的数量和质量的化合物。通常，这些化合物是高分子量的大分子，如脂质、碳水化合物或蛋白质；例如奶粉、明胶、血清白蛋白、山梨醇、海藻糖、亚精胺、葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮。

还可以加入防腐剂，如硫汞撒(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物或庆大霉素。

在优选的实施方案中，用于制备本发明的疫苗组合物的化合物是无血清的(即没有动物血清)；无蛋白的(没有动物蛋白，但可以包含其它动物来源的组分)；无动物化合物的(ACF；不包含任何来自动物的组分)；或甚至“化学确定的”，这是优先的顺序。

无需说明，向本发明的疫苗中混合其它化合物如载体、稀释剂、乳剂等，也是在本发明范围之内的。这些添加物在众所周知的手册如:“Remington”和“VeterinaryVaccinology”中有所描述(均见上文)。

由于稳定性或经济性的原因，本发明的疫苗可以以冷冻干燥形式制备。通常，这将能够在高于0℃的温度下如4℃下延长储存。冷冻干燥程序对于本领域技术人员是已知的，并且不同规模的冷冻干燥设备是商品化的。

因此，在进一步优选的实施方案中，根据本发明的用途或方法制备的疫苗为冷冻干燥形式。

为了重构冷冻干燥疫苗组合物，它通常在生理学上可接受的稀释剂中悬浮。此类稀释剂例如可以像无菌水或生理盐溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)一样简单；或者如EP 382,271中描述，稀释剂可以包含佐剂化合物如生育酚。在更复杂的形式中，例如如EP 1,140,152中描述的，冷冻干燥疫苗可以悬浮在乳剂中。

如所描述的，本发明的疫苗可以通过接种方法如通过喷雾、接种或在蛋中应用来有利地向家禽应用。

因此，在另一方面，本发明涉及针对禽流感的家禽接种方法，其包括用本发明的疫苗接种所述家禽的步骤。

本发明现在将参考以下非限制性实施例来进一步描述。

附图说明

图1：

MDA+鸡在1日龄时接种，且随后攻击。相对于乳剂接种的和对照接种的鸡，由疫苗载体HVP310诱导的病毒释放的降低在攻击后第2天为250倍。

实施例

1.载体构建体的装配

1.1. HVP142

HVP142的HVT载体病毒携带由RSV LTR启动子驱动的H5 IV基因作为异源插入片段。使用同源重组技术将转染盒插入至HVT毒株PB1的US10基因座上。H5基因获自来自1998年的H5N2 AIV分离株。

转染、重组、选择和扩增的方法基本如Sondermeijer 等, 2003 (上文)和EP 431,668中描述。

用于选择HA表达噬斑的抗血清是针对H5N6型AIV毒株的多克隆鸡抗血清。

1.2. HVP310

HVP310载体病毒包含密码子优化的H5基因(SEQ ID NO: 3)，其由已延伸至gB基因ATG起始密码子下游的PRV gB基因启动子(SEQ ID NO: 2)驱动。通过使用黏粒克隆再生技术将异源构建体插入至毒株FC126的HVT基因组的Us2基因座中。完整的表达构建体如SEQID NO: 7所表示。

H5基因起源自2005年从亚洲猫取得的 HP H5N1分离株。这已通过密码子使用优化进行了修改用于在病毒表达载体系统中表达。

转染、重组、选择和扩增的方法基本如US 5,961,982中描述。将重组后转染的CEF细胞接种至10 cm组织培养板中；大约1周后噬斑变得清晰可见。用伊文思蓝对噬斑复染，并且可以直接从平板上挑取噬斑。通过限制性酶切分析对来自重组HVT载体病毒的DNA常规检查HA基因和启动子的重组和插入的正确性。

通过在微量滴定板中使用H5N6鸡多克隆抗血清的免疫荧光测定来处理整合的HA基因的表达。

1.3. HVP311

HVP311载体病毒包含密码子优化的H5基因，其由EHV gB基因启动子(SEQ ID NO:1)驱动。构建、重组和选择与用于HVP310病毒的类似。而且，使用相同的密码子优化的H5 HA基因插入片段。

1.4. 体外稳定性试验

为了测定体外稳定性，重组HVT载体病毒HVP142、310 和311在CEF单细胞层上至少传代15次。挑取一个噬斑后，扩增15轮次。

最后，接种10 cm平板并在孵育后，用鸡H5N6抗血清染色进行免疫荧光试验(IFT)。对显示出阳性免疫荧光的噬斑数目/每噬斑总数进行计数。由于100％的噬斑展示出阳性荧光，所以发现所有检测的重组体在体外培养物中是完全稳定的。这表示，第一，HA插入片段经过多于15次细胞培养传代已正确复制，并且第二，HA基因仍然完整并正确表达。

2.SPF鸡中的动物试验

2.1. 动物试验的设定

设定动物实验来测定一天龄无特定病原体(SPF)肉鸡接种后HVT+HA重组体的效力。接种后(p.v.)两周或三周时通过用HPAI H5N1病毒攻击感染来评价保护效力。每日观察雏鸡禽流感感染的临床体征的发生或死亡率。此外，收集气管和泄殖腔拭子来通过PCR评价攻击病毒排泄。

将10只SPF肉鸡组置于中央兽医研究所(Lelystad, NL)的高防护性设施内的负压隔离装置中。在试验(trail)过程中每周取血样。

检测的疫苗是重组HVT载体病毒HVP142、310和311，随后是H5型的常规灭活乳剂疫苗，以及仅接受PBS的模拟接种组。已经按细胞相关制剂以大约5x10^5 pfu/ml制备重组HVT疫苗，其贮存在液氮中直至使用。

放入鸡，分别标记并接种；以2000 pfu/鸡和0.2 ml/剂量肌内施用HVT。

两周或三周后，用每只雏鸡10^6.0 EID50的HP AIV H5N1攻击病毒(H5N1 火鸡/火鸡/01/05进化枝2.2)攻击雏鸡，0.1 ml经鼻途径以及0.1 ml经气管内途径。

攻击后，每日观察鸡的AI体征。对于典型的AI症状如抑郁、口鼻流涕、呼吸性窘迫、神经系统体征、腹泻等给予0－3分(无－严重)的临床评分。对严重的病鸡进行安乐死。通过组织病理学检测死鸡的死亡原因。

主要使用HPAI H5型攻击病毒通过血凝抑制(HI)实验测定来自攻击前和来自攻击后14天的血清样品。

对于攻击病毒传播的评价，在攻击后2、3、4、7和14天对每一只鸡的气管和泄殖腔拭子取样。逐一通过Q-PCR对拭子检测AIV Matrix蛋白基因来比较是否存在和有多少(Ct值)攻击病毒由接种的和对照的鸡流出。

2.2. 结果

SPF鸡中的试验结果显示在表1-3中。

关于‘保护免于临床体征’，如表2中表示的，仅将不显示任何AI临床体征的那些动物评为受保护的。

在表3中，‘病毒再分离阳性’表示从哪些动物中可以再分离到病毒；只有当动物连续两天是阳性的，才将它列为病毒再分离阳性。由于没有泄殖腔拭子样品一直是阳性的，所以仅显示气管拭子结果。

表1：攻击前HI滴度，在肌内注射接种的一天龄SPF鸡中

^*) 当用其它H5型抗原在HI检测中检测时，存在血清转化的明确证据，接种后2周和3周时分别具有6.7和8.6的HI滴度。

表2：在肌内注射接种的一天龄SPF鸡中，用HP AIV H5N1致死攻击后(<48 h)保护免于AI临床体征。

表3：在肌内注射接种的一天龄SPF鸡中，用HP AIV H5N1致死攻击后(<48 h)保护免于病毒再分离。

^*) 由于攻击后48小时内均死亡，稀释剂组中的动物无法进行拭子取样。

3.MDA+鸡中的动物试验

3.1. 动物试验的设定

MDA+肉鸡中动物试验的设计大部分与SPF鸡试验中的相同，除了：不包括HVP142载体疫苗。MDA+肉鸡来自已用常规灭活H5N2乳剂疫苗接种两次的亲代；鸡具有5－6的起始H5HI滴度。

3.2. 结果

MDA+鸡中的试验结果显示在表4-6中。

对于表5和6，使用与上文表2和3相同的附注。

表4：攻击日的HI滴度，在肌内注射接种的一天龄MDA+鸡中

表5：在肌内注射接种的一天龄MDA+鸡中，用HP AIV H5N1致死攻击后(<120 h)保护免于AI临床体征。

表6：在肌内注射接种的一天龄MDA+鸡中，用HP AIV H5N1致死攻击后(<120 h) 保护免于病毒再分离。

3.3. 通过Q-PCR定量

在MDA+鸡受攻击的动物试验中，通过在攻击后第2天和第3天气管拭子取样来获得病毒再分离样品。随后提取核酸，并如Maas等(2007,Emerging Infectious Diseases, 第13卷, 第1219-1221页)描述进行实时RT-PCR测定。将阈值(Ct)表示为相对拷贝数并与在没有接种(对照)或用乳剂疫苗接种的鸡中测定的值比较。将该组中对应最低Ct值的拷贝数人为设定成1000。

图1显示了结果：用毒株HVP310时，攻击病毒的复制降低约250倍。

4.动物试验结果总结

4.1. 概述：

- HVP142在SPF试验中缺少效力并且不包括在MDA+试验中。

- HVP310和311载体病毒在SPF和MDA+鸡中均复制良好，表明它们稳定的、有活力的构成。如产生的高度有效的免疫应答所显示，插入的HA基因的表达同样稳定和有效。

- 考虑到所有对照以及许多常规乳剂疫苗接种的鸡的死亡，因此所用的攻击感染证明是非常剧烈的。然而，这使得HVT+HA载体疫苗展示出它们在最严格条件下的保护能力。

4.2. SPF试验：

- 在SPF鸡中诱导的临床保护让人印象非常深刻：用HVP310和311接种的SPF鸡在接种已两周之后，仍被完全保护免患任何和所有的AI临床体征，然而乳剂疫苗仅提供了部分保护，并且未接种的鸡在48小时内死亡。

- 如病毒再分离结果显示的，SPF鸡还几乎完全受到保护免于攻击病毒的传播；对于HVP 311和310分别达到80和90％病毒分离的降低，而乳剂疫苗无法实现病毒传播的降低。

- 因此HVP310和311载体在SPF鸡中的效力仅在最小程度上有所不同。

4.3. MDA+试验：

- 攻击后保护MDA+鸡免于AI临床体征在接种后3周要远好于在接种后2周。HVP310能够保护90％的MDA+鸡免于出现任何临床体征；HVP311仅达到45％的保护，而乳剂疫苗没有保护。所有未接种的MDA+鸡均在120小时内死亡。

- 在试验的苛刻条件下，HVP310载体疫苗仍然能够在接种后3周在MDA+鸡中实现降低病毒传播30％，而HVP311或乳剂疫苗无法实现病毒传播的任何降低。

- 相对于乳剂接种的和对照接种的鸡，由疫苗载体HVP310诱导的病毒释放的降低在攻击后第2天为250倍。

5.再分离疫苗病毒的稳定性试验

HVP310和HVP311载体疫苗将在接种后2周和3周从鸡中再分离出。病毒将会被接种在CEF的10 cm皿上，并留待感染。在第5－7天，如描述用鸡H5N6抗血清通过IFT将噬斑染色。噬斑数目相比于荧光阳性噬斑数目将显示是否所有病毒仍包含并表达插入的HA基因。

6.在蛋中接种使用的安全性

为了检测HVT载体疫苗HVP310和311在蛋中使用的安全性，其将在蛋中使用。

实验开始前三天(t= -3天)，将用载体疫苗HVP310和311接种三组40只18天龄的含胚鸡蛋，如下：

接种前，将蛋进行对光检查。将用70％乙醇对18天龄含胚蛋的圆头进行消毒。将使用蛋钻孔器在蛋壳上钻孔。将通过垂直插入针头(Becton & Dickinson Plastipak® 1 ml注射器和Microlance® 23G, 0.6x25针头)至蛋中并注射0.05 ml疫苗对蛋进行接种。随后用胶将孔封上并将蛋放置于培养箱中的合适条件下。

随后蛋将在动物设施中的三个培养箱中孵化。孵化后，将每组25只鸡加上标签并置于组1-3中(t=1天)，并分别在三个隔离装置中饲养，并再观察一周。

将监测孵化出的鸡的产量数和健康来测定在蛋中接种HVT载体疫苗HVP310和311是否对孵化率或健康产生了任何影响。

7.当用于HVT载体中时，来自禽类疱疹病毒或来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子特性上的差异：

当检测不同启动子在HVT病毒载体背景下是否适合驱动异源基因表达时，证实了来自MDV1的gB基因启动子在HVT中是无效的。另一方面，来自马疱疹病毒(EHV)的gB基因启动子在HVT中是有效的。

用于该目的的构建体基本如实施例1中描述进行装配，并且包含来自柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)寄生虫的基因Etsc2基因。该基因编码约37 kDa的抗原，其是例如描述于EP 775.746中的堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina)的Easc2抗原的同系物。构建了转移载体构建体，其包含在来自EHV1(在转移载体构建体pVEC102中)或来自MDV1(构建体pVEC103)的gB基因启动子的控制下的Etsc2基因。

通过转染和同源重组产生了重组HVT，并如所描述的将其接种至CEF单细胞层上。挑取重组HVT噬斑，并通过在96孔板上用CEF细胞单层免疫荧光测定来检测这些噬斑Etsc2抗原的表达。从两个构建体中检测了两个噬斑，并且每一噬斑一式两份(in duplo)检测。将兔抗Etsc2抗血清用作一级抗体，随后用FITC缀合的二级抗体。该初期筛选显示了pVEC102重组体的弱阳性荧光，但没有来自pVEC103重组体的荧光。

随后扩增了所有4个噬斑，并且重复IFA。这次所有来自pVEC102的噬斑(使用EHVgB基因启动子)对Etsc2抗原表达均为清楚的阳性；然而，即使HVT噬斑清楚可见，但pVEC103重组噬斑仍保持Etsc2抗原表达阴性。

结论是在重组HVT载体病毒背景下MDV1 gB基因启动子是无效的，而EHV gB基因启动子是有效的。

序列表

<110> Intervet

<120> 针对家禽中禽流感的火鸡疱疹病毒作为载体的疫苗

<130> 2010-025-EP-PD

<160> 7

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> 马疱疹病毒1

<400> 1

ggcgactgcg gatgcttcgc agcgcaggcg catgtacgcg gagcgtctgt caaagcgttc 60

catcgccagt ttggggcgct gcgtgcgcga acagcgaaga gaactagaaa aaaccctgag 120

agttaacgtg tatggcgaag tgctgctaca tacgtacgta tcgtcctaca acgggttttg 180

cgccaggcgc gggttttgcg cggcggtgag tcgagcgggt accatcatag ataaccgctc 240

tagcacgtcc gcgttcgact cgcatcagtt catgaaggcg gcgctgcttc gccaccccat 300

tgaccagtcg ctcatgccgt ccataacaca caagtttttc gagctgatca acgggcccgt 360

gtttgacaac gctggccaca actttgcgca gccgccaaac acggcattat attacagcgt 420

tgaaaacgtt gggttgttac cgcatctcaa ggaggaacta gctcggttta tgattactgc 480

ggctaaaggt gattggtcaa ttagcgagtt tcaaaggttt tattgctttg agggagtgac 540

aggtgtgacg gccacgcagc ggctggcgtg gaaatatatc ggggagctca tcctagccgc 600

cgcagtattc tcctcggttt tccactgtgg agaggtgcgc ctcctgcgcg cagatcgtac 660

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<213> 伪狂犬病病毒

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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cgtgtccccg gcattaaaca ggaaagcgtt aaagtttttg aatgttaggt cacaggtaca 120

aacataaatg tttgtacaaa caggtaacag gtacaaacat aaatgccccg gcataaatgt 180

cccttacggc ggatcgaaac gacattaggc atactcgggt accattttgc attccgatca 240

gcacggatga aattaggcag gaatgcggtt tatattatgc ggcattggac aaacgatatg 300

gcattgattg gcagtttatg aatgtcttca tgttgggcgt aaacggattc ctattggttc 360

agaagacaac gacgatatat ttagagagaa aaagctaccc agcataggat aaacacacat 420

tgagcattga gagacatagg tatcggtatg gatgggaaaa ctacacacgt gaacaccaaa 480

cgacttatat actcgagcgg tgatactact gagcaagaat gcactgcatc tgagccactg 540

aatgaagact gtgatgaaaa tgtgaccatc gatggaattg gagaagaata tgcgcagttc 600

ttcatgtccc cgcaatgggt cccaaatcta catcgcttga gcgaggatac caaaaaggta 660

taccgatgta tggtttccaa cagactcaat tattttccct attatgaggc gttcaggcgg 720

tctttgtttg atatgtatat gctaggtcgg ttggggcgtc gacttaagcg atctgactgg 780

gagactatta tgcatctgtc accaacgcaa agtcggcgtc tacatagaac tttaagattt 840

gtggagcgta gaattatccc atctaacagt tatatacgca catcgggcca cgttccgcct 900

tcgagggcac ttccgacaga tacgaattta aagatggatg aataattaaa ttggaaagag 960

taactacatt aatcgagcgt catgacggcg tcccgtgaaa atgggaattt tctactcgaa 1020

acaccgtgac atttgacaga cctggaattg ttattctgat atatagtggg tgtgtctggc 1080

cggcaacata cataatgtgc atgcgaaacc actttttcag tgtacgctga cattgtgcaa 1140

cacggagggg tagcatctac atacaatata tgttgattaa tgattggaga aaaaactatg 1200

cagctcgccg atcatatggc taactcgcct tcgtctatat ggcggacccc gcgggaaaaa 1260

tcgacgtacc atctgattta caacaccagt aatgaacatg tcgcatccct gcccagatct 1320

gtgcgcccat tggcgcggat cgttgtgaat gccgccgaaa cacttcaggt cggtatgaga 1380

gccgggaggc cgccatcagc aggagtttgg cgagaggtgt ttgatagaat gatgacagcc 1440

ttccgtgacc acgagcctac tgcgacattt aatgctgcaa atcccattag aaaaatggtc 1500

gagacagttc tacagaataa tgaagagccc ccgcggacgc atgctgaaat gggtaatcgc 1560

cttatgaaca ttatgtactg gtgttgcttg ggacacgcag gacaatgctc gatatggcag 1620

ttgtacgaga cgaatcaggc cattttaagt ttattagatg aagtggttat cggcacaaca 1680

aatccctttt gcaccctcga gcaatactgg aagccattat gcaccgcaat cgccaacaag 1740

gggacctcat cgcttgttga ggatgccaaa gtggccgagt acctggttag catgcgcaaa 1800

ttgatataac ataggcacgc tctgatgtta cagaccacaa taccgcatac atttattgta 1860

aggttgttaa taaaggttta ttctatgtaa gactacaata ctttcgacat tgcttgtata 1920

catattaaat actttctcaa gttcctatta cataaaatgg gatctatcat tacattcgtt 1980

aagagtctgg ataattttac tgtttgccag cttcgatctt ggaacgtact gtggatagtg 2040

ccttacttgg aatcgtgaaa atttgaaacg tccattattt ggatatcttc cggttgtccc 2100

atatcccgcc ctggtaccgc tcggatacct tgcccgtatg gattcgtatt gacagtcgcg 2160

caatcgggga ccaacaacgc gtgggtccac actcattcgg aaattttccg atgattctga 2220

atatttattg ccgctcgtta cgagtcgttg gacatatctg taatacattt cttcttctga 2280

aggatcgctg cacatttgat ctatacattg gccaggatgt tcaagtctca gatgttgcat 2340

tctggcacag cacaacttta tggcatttcc gatgtaatcg tccggcagcc ctgggggagt 2400

tctatattcg catattggga tggtaaggac aatagcagat ctcgcaacct ccagggaggc 2460

tataataacg tttttaaagg atggatttct cataaaaatc tgtcgcaaat tacactgaga 2520

atatccttta ctagcgccga ttgagagcat cgtcgtccaa ttttctaaat ggaaagaaaa 2580

caaggcgggc aagagtgttc caaacatttt cattttcggc gaatctctca aatcccatgg 2640

cgtgcaattg attgcaaaat tggcacttcc gttcacgttt gtatctccaa actctaagac 2700

acttttaatt gaaaaactac gttctagtgt ggaaagaaac ctataggcag accatagaac 2760

tatttgacac cacatatctt tttgtatgtc aaactgacca tgatcgtatg ttgctgaatg 2820

cactagggca attcgctcgc gcgactccat acattgaata attccacacg tcagctcatc 2880

ggttagcaag gtccagtagt tgaagtcatt tatttttccc cgcggctggc caaatctacc 2940

tctgggaata tccaagttgt cgaatatgat cgcaccggct ctggtcatgg tgaaggaact 3000

gtagcataaa gacgcaggta tcataggggt aatatttttt tattcactca catactaaaa 3060

gtaacgcata ttagcaccat gtatgggcta tcaattgaca tttgcgtagc actacatcac 3120

gattatgtac aacataatgg gacaacatat ggcaagtaga tgcaatttcc tcacactagt 3180

tgggtttatc tactattgaa ttttccccta tctgtgatac acttgggagc ctctacaagc 3240

atattgccat catgtacgtt tttatctact gtcttaacgc ccatgggaac ggaggcgtcg 3300

tcgtcatgta ttggacggca acataggcag caacacaaat tgcgtttagg tggggtgcat 3360

gtggactcga taccaagccc ctgcagctgg ggaacgtctg gtggagagcc gataatttga 3420

tatacgcacg ccatattact gtcgttgaag tacgccttat cttctatgtt ttcaaattta 3480

ggttcccaag tggacgtgag aagtgtttgt atctcacatg gaatggccca aggcattcca 3540

gcccaggtgc ctggtacttt aatggcaaac aaacgttttg gtagaggtat tgattctatt 3600

gcagttctgc agatatctgc agccccgagt atccacaggc tatacgatac gttatcggag 3660

gcaagcttgg cgcgccggat ctcgctgctg cacacgtacg tggcggtggc cgccgggttc 3720

cgcgcacggc gcgcgttctg cgaggccgcc gcgcgcgcgg gcaccgtcgt ggacgagcgc 3780

gagacgggct gcttcgacgc gcacagcttc atgaaggcca cggtgcagcg ccaccccgtg 3840

gacgccgcgc tcctcccggc gctcacgcac aagttcttcg agctcgtcaa cgggccgctc 3900

ttcgcgcacg acacgcacgc cttcgcccag tcccccaaca cggcgctcta ctttgcggtg 3960

gagaacgtgg gcctcctgcc gcacctgaag gaggagctgg cgcgcttcat ggtggcccgc 4020

gattggtgcg tcagtgagtt ccgcggcttc taccgcttcc agacggccgg cgtaaccgcc 4080

acccagcggc aggcctggcg atatatccgc gagctggtgc tggcggttgc agtcttcagg 4140

tccgtcttcc actgcgggga cgtcgaggtc ctccgcgcgg atcgcttcgc cggacgcgac 4200

gggctgtacc tgacctacga ggcgtcttgc cccgctggtg gcggtctttg gcgcgggccc 4260

cgcgggcatc ggcccgggca ccacggcggt gctggcctcg gacgtctttg gcctgctcca 4320

caccacgctg ctgctgcgcg gggcgccgtc gcgctagaga tccaagatat caaagccatg 4380

gagaagatcg tcctcctgct ggctatcgtc tccctggtca agagcgacca gatctgcatc 4440

ggctaccacg ccaacaactc taccgagcag gtggacacca tcatggagaa gaacgtgacc 4500

gtcactcacg cccaggacat cctcgagaag actcacaacg gaaagctctg cgacctcgac 4560

ggcgtcaagc ctctgatcct gcgtgactgc tccgtggctg gttggctcct gggcaacccc 4620

atgtgcgacg agttcctcaa cgtgcccgag tggtcctaca tcgtcgagaa gatcaacccc 4680

gccaacgacc tgtgctaccc tggcaacttc aacgactacg aggagctcaa gcacctgctc 4740

tcccgtatca accacttcga gaagatccag atcatcccca agtcctcctg gtccgaccac 4800

gaggcttcta gcggtgtgtc cagcgcttgc ccctaccagg gccgctccag cttcttccgc 4860

aacgtcgtgt ggctgatcaa gaaggacaac gcttacccaa ctatcaagcg cagctacaac 4920

aacactaacc aggaggacct gctggtgctg tggggcatcc accaccctaa cgacgccgct 4980

gagcagactc gtctctacca gaaccctact agctacatct ccgtgggaac ctctaccctg 5040

aaccagaggc tggtgcccaa gatcgctacc aggtccaagg tcaacggtca gtctggtagg 5100

atggagttct tctggactat cctgaagccc aacgacgcta tcaacttcga gtctaacggt 5160

aacttcatcg ctcctgagaa cgcctacaag atcgtcaaga agggtgactc tactatcatg 5220

aagtctgagc tggagtacgg taactgcaac accaagtgcc agacccctat cggtgccatc 5280

aactcctcta tgcctttcca caacatccac cccctgacca tcggtgagtg ccctaagtac 5340

gtcaagtcta accgtctggt cctggctact ggactgcgta actctcccca gggtgagcgc 5400

cgtcgtaaga agaggggcct cttcggtgcc atcgctggct tcatcgaggg tggatggcag 5460

ggcatggtgg acggctggta cggttaccac cacagcaacg agcagggctc cggttacgct 5520

gccgacaagg agtctaccca gaaggctatc gacggcgtca ccaacaaggt gaactccatc 5580

atcgacaaga tgaacaccca gttcgaggct gtgggcaggg agttcaacaa cctggagcgt 5640

cgtatcgaga acctgaacaa gaagatggag gacggtttcc tggacgtctg gacttacaac 5700

gccgagctcc tggtgctgat ggagaacgag cgcaccctgg acttccacga ctccaacgtg 5760

aagaacctct acgacaaggt ccgcctccag ctccgcgaca acgctaagga gctgggtaac 5820

ggttgcttcg agttctacca caggtgcgac aacgagtgca tggagtccgt gcgtaacggc 5880

acctacgact acccccagta ctccgaggag gcccgtctca agagggagga gatctccggt 5940

gtgcgcctgg agagcatcgg tacttaccag atcctctcca tctactccac cgtcgccagc 6000

tccctcgccc tggctatcat ggtggctggc ctctccctgt ggatgtgctc caacggcagc 6060

ctgcagtgca agatctgcat ctaactggat atcaaggatc tctcgaggat atcctgcagg 6120

tcgactctag gaagcttgcc tccgattcta gcattacata gccggtcagt agatcctgcc 6180

attcggtagc gcaaccggct acatcttcaa acagtctcac gataaatgca tctctcgttc 6240

ctgccaatcc ggaaccgggc ataccactcc cgcctgccga tttaattctc acaattgggc 6300

gatgccggcg gggcaaaacg aatgtggatt tggcaaaccg acacaggtct gctgtacgga 6360

ctaatatggg cacacccaca tcattcttca gatgctccat gcattgttct atgagaaaga 6420

tccatagggt ggaggcagcg tcacgagatc gcccaggcaa tcgatcgcat tcgtctagta 6480

aagtgacgag agttatcatg cacacaccca tgcccacgcc ttccgaataa ctggagctgt 6540

ggaagatcgg aaacgtcttt ttgactgccg gtctcgtact actttcgcac aggtgtatac 6600

ccggacgcgt actatatatt ttatatcatc caacgtccga aattacatac gtggcggcga 6660

tggaagtaga tgttgagtct tcgaaagtaa gtgcctcgaa tatgggtatt gtctgtgaaa 6720

atatcgaaag cggtacgacg gttgcagaac cgtcgatgtc gccagatact agtaacaata 6780

gcttcgataa cgaagacttc cgtgggcctg aatacgatgt ggagataaat accagaaaat 6840

ctgctaatct tgatcgtatg gaatcttcgt gccgtgaaca acgagcggcg tgcgaacttc 6900

gaaagtgttc gtgtcctacg tctgccgtgc gcatgcaata cagtattctt tcatctctcg 6960

ctccgggttc agagggtcat gtatatatat gtactagata cggggacgcg gaccaaaaaa 7020

aatgcatagt gaaggcagtc gttggaggaa agaatcccgg gagggaagtg gatattttaa 7080

aaaccatctc acataaatca attataaaat taatccatgc ctataaatgg aaaaatgttg 7140

tgtgtatggc aatgcgtgta tatcgttatg atcttttcac atatattgac ggagtcggcc 7200

ctatgcccct tcaacagatg atctatattc aacgtggact actagaggcg ctagcataca 7260

tacatgaaag gggcatcatt caccgagacg taaagacgga gaatatattc ttggataatc 7320

acgaaaatgc agttttgggt gacttcggtg ctgcatgcca actaggagat tgtatagata 7380

cgccccaatg ttacggttgg agcggaactg tggaaacaaa ttcgccggaa ttatctgcac 7440

ttgatccgta ttgcacaaaa acagatattt ggagtgccgg attggttcta tatgagatgg 7500

caattaaaaa tgtaccattg tttagtaagc aggtgaaaag ttcgggatct cagctgagat 7560

ccataatacg gtgcatgcaa gtgcatgaac tggagtttcc ccgcaacgat tctaccaacc 7620

tctgtaaaca tttcaaacaa tatgcggttc gtgtacgacc gccttatacc attcctcgag 7680

ttataagaaa tggggggatg ccaatggatg ttgaatatgt catttctaaa atgcttacgt 7740

ttgaccagga gttcagacct tctgctaagg aaatattgaa tatgccccta tttactaagg 7800

cgccgattaa cctgcttaat atcacaccct ctgacagtgt ctaacggtat acaggcggga 7860

gcgggtcgtg gcgtcatcat caccacttga gaatttatat tttgaattgt tgattgataa 7920

attaacctga ttcattgaga actgaaacgc catattggtt tcttggatat gtctacaaca 7980

attagttaaa ttgctatgtt ctactgcgag taacatttga taagttgtaa gagacgggcg 8040

actcatgtcg aagttgacga atataaagta cataacgtgt ttagaatacc cagaatccga 8100

atagtccgcg ggggcgtctt ctcgcgtgag taccaaatac tgagttgaac ttgaaaatgc 8160

taaatctgtg acactctttg tgtgatgatt attgtcacca cttcgaagat ggcttcgaca 8220

ttcatgatgt tctggtgttt gtttggaatc gtaatagcgc ttgtttcgtc caagtctgac 8280

aacaaagaaa atctgaagaa ttatatcacg gataagtcaa ccaatattag aatacccacg 8340

ccattatttg tatcaacgga aaactcttat cccacaaaac atgtaatcta cgatgaaaac 8400

tgtggcttcg ctgtactcaa tcctataagt gaccccaaat atgtcctttt gagccagctt 8460

ctaatgggaa ggcgcaaata tgatgcgacg gtcgcgtggt ttgttctcgg taaaatgtgt 8520

gccagattaa tatatttgcg cgaattttat aactgctcga caaatgagcc ttttggcaca 8580

tgttctatga gctctcctgg atggtgggac aggcgctacg tctcaaccag tttcatttct 8640

cgcgacgaat tacagctggt ttttgcagcg ccgtcccgag aattagatgg tttatatacg 8700

cgcgtagtag ttgtcaacgg ggactttact acggccgata taatgtttaa tgttaaagtg 8760

gcatgtgcct tttcaaagac tggaatagaa gatgatacat tatgcaaacc ctttcatttc 8820

tttgccaatg caacattgca caatttaacc atgattagat cggtaactct tcgagcgcac 8880

gaaagccatt taaaggaatg ggtggcacgg agaggtggta acgtccctgc agtgctactt 8940

gagtctacca tgtatcatgc atccaatctg cctagaaatt tcagggattt ctacataaag 9000

tctccagatg attataagta taatcaccta gatgggccat ctgtaatgct catcactgac 9060

agacctagtg aagatttgga tgggaggctc gttcaccaaa gtgacatttt tactactaca 9120

agtcctataa aacaggtccg gtatgaagag catcagtcac atacaaagca gtatcctgta 9180

aacaaaatac aagctataat ttttttgata gggttaggct cgttcattgg aagcatattc 9240

gtagttttgg tagtatggat tatacgcaga tattgcaatg gagcgcggag tgggggaacg 9300

ccccccagtc ctcgccggta tgtgtatacc aggctatgat cacgtgtgaa acttgggcgg 9360

acctgtatca tatgtacacc gtccctattc gtttatagcc agtacgtgtt atctgcacat 9420

agaggaacat gtgtcatact gggatcgcat gcatggtatg tgtgactcta atattattct 9480

gtatcataat aaaaacacag tgcatggtat atagaggatc gctggtaagc actacggtag 9540

accaatcggc tcagattgca ttctttggca tcgataccgt tgttaattta tatggcaaag 9600

tcttgttcat gggagatcag tatttggagg aaatatactc tggaacgatg gaaatactca 9660

aatggaatca agctaaccgc tgctattcta ttgcgcatgc aacatattac gccgactgtc 9720

ctataatcag ttctacggta ttcagaggat gccgggacgc cgttgtttat actaggcccc 9780

acagcagaat tc 9792

Claims

1.包含异源核酸的火鸡疱疹病毒(HVT)载体，所述异源核酸包含能够编码流感病毒(IV)血细胞凝集素(HA)蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列与来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白B(gB)基因启动子可操作连接，其中所述来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子来自伪狂犬病病毒(PRV)或马疱疹病毒1(EHV1)。

2.权利要求1的HVT载体，其特征在于所述来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子包含来自所述gB基因的翻译区的核苷酸序列，其中改变了任何ATG核苷酸序列，其中所述来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子由如SEQ ID NO: 2中的核苷酸序列组成。

3.权利要求1-2中任一项的HVT载体，其特征在于所述能够编码IV HA蛋白的核苷酸序列源自高致病性AIV。

4.权利要求3的HVT载体，其特征在于所述能够编码AIV HA蛋白的核苷酸序列编码由如SEQ ID NO: 4或6中的氨基酸序列组成的AIV HA蛋白。

5.权利要求3的HVT载体，其特征在于所述能够编码AIV HA蛋白的核苷酸序列具有由如SEQ ID NO: 3或5中的核苷酸序列组成的核苷酸序列。

6.权利要求1-5中任一项的HVT载体的制备方法，其包括将包含能够编码IV HA蛋白的核苷酸序列的异源核酸整合入HVT基因组中，其中所述核苷酸序列与来自哺乳动物疱疹病毒的gB基因启动子可操作连接。

7.权利要求1-2中任一项的或通过权利要求6的方法可获得的HVT载体，其用于针对禽流感的家禽接种中。

8.权利要求1-2中任一项的或通过权利要求6的方法可获得的HVT载体，其用于针对家禽中禽流感的疫苗中。

9.针对家禽中禽流感的疫苗，包含权利要求1-5中任一项的或通过权利要求6的方法可获得的HVT载体，和药学上可接受的载体。

10.权利要求9的疫苗，其特征在于所述疫苗可以在蛋中应用。

11.权利要求1-5中任一项的或通过权利要求6的方法可获得的HVT载体在制备针对家禽中禽流感的疫苗中的用途。

12.制备权利要求9或10的疫苗的方法，所述方法包括将权利要求1-5中任一项的或通过权利要求6的方法可获得的HVT载体和药学上可接受的载体混合。