JP2023539771A - Ｈａ抗体陽性ターゲットのためのｈａステムワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、インフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する既存の抗体を有するターゲットのためのインフルエンザウイルス感染または疾患に対するワクチンに関する。本発明は、ＨＡステムポリペプチドを発現する組換えベクター、ベクターまたは宿主細胞を前記ベクターと共に含むワクチン、ベクター、宿主細胞またはワクチンの使用、およびインフルエンザウイルス感染または疾患を軽減するための方法に関する。組換えベクターは、真核生物発現プラスミドまたはＲＮＡなどの核酸、ウイルス、またはレプリコン粒子（ＲＰ）であり得る。このワクチン接種は、既存の抗ＨＡヘッドドメイン抗体によって妨げられることなく、インフルエンザウイルス誘導感染または疾患に対する早期かつ効果的な免疫応答の誘導を可能にする。

Description

本発明は、ワクチン学の分野に関し、具体的には、インフルエンザに対するワクチンに関する。特に、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する既存の抗体を有するターゲットのためのインフルエンザウイルス感染または疾患に対するワクチンに関する。本発明は、ＨＡステムポリペプチドを発現する組換えベクター、ベクターまたは宿主細胞を前記ベクターと共に含むワクチン、ベクター、宿主細胞またはワクチンの使用、およびインフルエンザウイルス感染または疾患を軽減するための方法に関する。

インフルエンザウイルスは世界中で発生し、ヒトおよび動物の両方に感染する。引き起こされる疾患は、主に呼吸器のものであり、様々な付随する症状がある。病理は軽度から致死的まで様々なものがあり、多くの不快感および経済的損害をもたらす。さらに、感染した鳥またはブタによりヒトが共通伝染病に感染する可能性がある。

インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科由来のエンベロープウイルスであり、セグメント化された一本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノムを有する。インフルエンザウイルスＡ～Ｄは、そのファミリーの中の別個の属であり、それらの構造タンパク質（マトリックスおよび核タンパク質）に基づいて区別される。世界中で最も顕著なのは、インフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルスである。これらのうち、インフルエンザＡ属は、特定のターゲット種のみに感染するいくつかのウイルス株を包含するが、宿主の範囲が複数の種であるものも包含する。血清学的細分化を、発現されたウイルスエンベロープ糖タンパク質：赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて行う。現在、１８の異なるＨＡ抗原が知られており、Ｈ１～Ｈ１８および１１のＮＡ抗原：Ｎ１～Ｎ１１として示される。インフルエンザウイルスおよびそれが誘導し得る疾患に関する詳細は、以下のような周知のハンドブックに記載されている：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＬＷＷ ｐｕｂｌ．，ＩＳＢＮ：９７８１４５１１０５６３６）；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍａｎｕａｌ（２０１０，１０ｔｈ ｅｄ．，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）；およびＤｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ（２００８，１２ｔｈ ｅｄ．，Ｙ．Ｓａｉｆ ｅｄ．，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ－１０：０８１３８０７１８２）。家禽におけるインフルエンザ感染症は、家禽ペスト、鳥インフルエンザ（ａｖｉａｎ ｆｌｕ、またはｂｉｒｄ ｆｌｕ）とも呼ばれる。

ＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルスＡおよびＢの主要抗原であり、ウイルスの認識、結合、および宿主細胞の侵入の中心である。その天然の形態では、ＨＡタンパク質は、ウイルスのエンベロープ（または「コート」）および感染した宿主細胞の膜に提示されるホモ三量体である。各モノマーは、ステムドメインを介して膜貫通ドメインに接続された球状ヘッドドメインを有する。ヘッドドメインは三量体化をもたらし、宿主細胞の受容体との最初の接触を媒介する。ＨＡのステム（または柄）ドメインは、ウイルスのエンドサイトーシス後に、宿主細胞のエンドソーム膜との融合を誘導する。

未成熟膜融合を防止するために、ＨＡタンパク質は、本質的に、宿主プロテアーゼによってＨＡ１およびＨＡ２セクションに翻訳後切断される不活性プレタンパク質ＨＡ０（ＨＡゼロ）として発現される。ＨＡ１の中心部分は、ＨＡモノマーのヘッドドメインを形成する。ＨＡ２の主要部分は、ＨＡ１のＮ末端部分およびＣ末端部分と共にステムドメインを形成する。さらなるＨＡ２は、そのＣ末端に膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインを含有する。

ＨＡ抗原のうち、ヘッドドメインは免疫優性部分である。その結果、ターゲットが、ＨＡヘッドドメインまたはその抗原性部分、例えば全長ＨＡタンパク質、またはさらにはインフルエンザウイルス調製物全体を含む調製物で免疫化される場合、ターゲットにおいて生成される抗体は、主にＨＡヘッドドメインに向けられる。ヘッドドメインをコードするＨＡ遺伝子の一部は配列が可変であるので、これはインフルエンザウイルスの（季節性）変異体によって示される抗原ドリフトの大部分を説明する。その結果、ヒトと動物の両方をターゲットにした、インフルエンザウイルスに対する新規かつ更新されたワクチンが絶えず必要とされている。

インフルエンザのワクチン接種は、ヒトと獣医学医療の両方で日常的に適用されている。目標は、典型的には、臨床徴候の重症度および持続期間を減少させることであり、好ましくはまた、感染した宿主によるウイルス排出の量および持続期間を減少させることである。いくつかの異なるタイプのワクチンが、例えば弱毒の生ウイルスに基づいて、または不活化ウイルス、ウイルス調製物、例えば界面活性剤抽出物（いわゆる「スプリット」）ワクチン、またはＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質のサブユニットワクチンのアジュバント化製剤に基づいて、利用可能である。また、ワクチンは、例えば発現プラスミド、ｍＲＮＡ、ベクターウイルス、またはウイルス様粒子などの組換え産物に基づいてもよい。

獣医学的実践において、インフルエンザワクチンは、様々な動物種に対して利用可能である。そのようなワクチン接種は、アウトブレイクの状況における緊急のワクチン接種として、例えば家禽またはブタに偶発的に適用され得る。あるいは、インフルエンザウイルスによる感染の圧力が高い国では、ワクチン接種は、ブタおよび家禽、ならびに非常に若い年齢の子孫に日常的に適用され得る。

ワクチン接種されたターゲットのヒトまたは動物は、ターゲット自体またはその母親のいずれかの、ワクチン接種または野外感染からのウイルスとの事前の接触から生じるインフルエンザに対する（母体由来の）抗体を含有し得る。ターゲットのそのような既存の抗体は、インフルエンザワクチン接種の有効性を妨げることが知られている。これは、そのような抗体陽性ターゲットのインフルエンザワクチン接種の有効性を大幅に低下させ、それらを野外感染にさらしたままにする。この問題に対する有効な解決策はこれまで得られていない。

ＨＡヘッドドメインとは対照的に、ＨＡのステムドメインは、インフルエンザウイルス株の間でより保存されており、ＨＡヘッドドメインなし（すなわち、「ヘッドレス」）で投与された場合、広範なウイルス認識抗体を誘導するために使用することができる。これは１９９３年に既に認識されていた（Ｏｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．２５５２－２５５８）。それ以来、多くの研究が、万能のインフルエンザワクチンを提供する試みにおいて、いわゆる「ヘッドレスＨＡ」、「ミニＨＡ」または「ＨＡステム」ポリペプチドをワクチン抗原として使用してきた。これは、例えば、ＫｒａｍｍｅｒおよびＰａｌｅｓｅ（２０１３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．３，ｐ．５２１－５３０）およびＯｓｔｒｏｗｓｋｙら（２０２０，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．４０，ｐ．２８－３６）によって総説されている。

インフルエンザＨＡタンパク質の構造に関して多くの詳細が知られている。総説には、例えば、ＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ（２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６９，ｐ．５３１－５６９）ＳｒｉｗｉｌａｉｊａｒｏｅｎおよびＳｕｚｕｋｉ（２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．，Ｓｅｒ．Ｂ，ｖｏｌ．８８，ｐ．２２６－２４９）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（２０１６，Ｒｅｆ．Ｍｏｄｕｌｅ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－８０１２３８－３．９５７２１－０）がある。インフルエンザＡ ＨＡタンパク質の様々なドメインおよびセグメントの例示的なグラフ表示が、Ｌｕら（２０１４，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１，ｐ．１２５－１３０）の図１に提示されている。

国際公開第２０１１／１２３４９５号（第４９５号）は、インフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、およびワクチンとしてのそれらの使用について記載している。ＨＡステムポリペプチドは、ＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメント、ＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメントおよびＨＡ２を、場合により１つ以上のリンカーおよび三量体化ドメインと共に含む。第４９５号は、その図１および図２において、ＨＡアミノ酸配列の例示的な複数のアラインメントを提示し、その表１～７において、例示的なアミノ酸配列が、インフルエンザＡおよびＢの異なるＨＡ血清型に由来する様々なドメインについて記載されている。第４９５号は、膜貫通ドメインを含むまたは含まないＨＡ２のバージョンについて言及しているが、組換えベクターにおけるそのような構築物の開示を可能にするものはなく、ターゲットであるヒトまたは動物へのステムポリペプチドのいかなる接種においても、結果がもたらされていない。まして、いかなるワクチン接種・負荷実験について、言うまでもない。第４９５号はまた、母体由来またはその他の既存の抗インフルエンザＨＡ抗体のターゲットにおける使用を開示していない。実際、第４９５号には、若齢のターゲット、例えば６月齢未満のヒトの小児における使用は特に推奨されていない（第４９５号の３９７、４０４、４０５段落参照）。

国際公開第２０１３／０７９４７３号は、Ｈ１およびＨ３型インフルエンザウイルス由来のＨＡステム抗原の、広く防御されるワクチン抗原としての使用を記載している。安定性および免疫原性を高めるために、いくつかの変異をＨＡ２に導入した。リンカー配列およびシグナル配列を使用して、発現構築物を最適化した。ヘッドドメインの非存在下での多量体化をもたらすために、いくつかの構築物において、ＨＡステム抗原に三量体化ドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメインを設けた。ワクチン接種は、発現プラスミドを使用して特定の病原体非含有（ＳＰＦ）マウスで行い、時折、アジュバント添加可溶性タンパク質を使用してブースターワクチン接種を行い、場合によっては誘発感染を適用した。

Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏらによる論文（２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３４９，ｐ．１３０１－１３０６）は、ＳＰＦマウスおよび血清陰性マカクにおける可溶性ＨＡステム抗原（すなわち、ＴＭドメインなし）の試験によって、国際公開第２０１３／０７９４７３号の研究を追試した。

Ｓｕｎｗｏｏら（２０１８，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．６，ｐ．６４）は、インフルエンザウイルスに対する母体由来抗体（ＭＤＡ）を有する豚におけるワクチンとして、キメラＨＡタンパク質を使用した。これは、ワクチン増強呼吸器疾患とステム特異的抗体との関連を調べるためである。試験した抗原は、ヘッドドメインを変化させたがステムドメインを一定に保ったキメラ全長ＨＡタンパク質からなっていた。これらを、弱毒の生組換えインフルエンザウイルスとして、不活化ウイルスとして、またはウイルス抽出物（スプリットワクチン）として、Ｈ１ ＨＡ ＭＤＡ陽性豚に投与した。ワクチン接種後にステム特異的抗体を検出することはできなかったが、異種プライム・ブーストワクチン接種レジメンを使用して、誘発感染に対するある程度の防御が得られた。

国際公開第２０１１／１２３４９５号 国際公開第２０１３／０７９４７３号

Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＬＷＷ ｐｕｂｌ．，ＩＳＢＮ：９７８１４５１１０５６３６）；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍａｎｕａｌ（２０１０，１０ｔｈ ｅｄ．，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ） Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ（２００８，１２ｔｈ ｅｄ．，Ｙ．Ｓａｉｆ ｅｄ．，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ－１０：０８１３８０７１８２）。 Ｏｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．２５５２－２５５８）。 ２０１３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．３，ｐ．５２１－５３０ ２０２０，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．４０，ｐ．２８－３６ ２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６９，ｐ．５３１－５６９）Ｓｒｉｗｉｌａｉｊａｒｏｅｎ ２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．，Ｓｅｒ．Ｂ，ｖｏｌ．８８，ｐ．２２６－２４９ ２０１６，Ｒｅｆ．Ｍｏｄｕｌｅ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－８０１２３８－３．９５７２１－０ ２０１４，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１，ｐ．１２５－１３０）の図１に提示されている ２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３４９，ｐ．１３０１－１３０６ ２０１８，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．６，ｐ．６４

本発明の目的は、当該分野のニーズに対応し、ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットに有効なインフルエンザワクチンを提供することである。

驚くべきことに、インフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットのワクチン接種のために、膜貫通ドメインおよび三量体化ドメインを有するヘッドレスＨＡステムドメインを有するポリペプチドを発現することができる組換えベクターを使用することによって、この目的を満たすことができ、その結果、先行技術の１つ以上の欠点を克服することができることが見出された。

インフルエンザに対してニワトリにワクチン接種したとき、本発明者らは、国際公開第２０１３／０７９４７３号およびＩｍｐａｇｌｉａｚｚｏら（上掲）によって記載されているように、可溶性ＨＡステム抗原による単回ワクチン接種後にほとんど防御がなされなかったことを見出して失望した。明らかに、文献に記載されているようなＨＡステム抗原によって与えられる効果的かつ広範な防御は、抗体のない動物においてさえ、およびアジュバントを使用するときでさえ、容易に再現することができなかった。これをどのように変えることができるかは文献に示されていなかった。

ＨＡステム抗原が、組換えベクターからの発現によって送達され、膜貫通ドメインが設けられ、したがって宿主細胞の表面に発現された場合にのみ、ＨＡステム抗原は、単回ワクチン接種後でさえ、インフルエンザＭＤＡを有するターゲットにおいて良好なワクチン有効性をもたらした。これは、当技術分野で以前に開示されていない。

膜貫通ドメインを有するＨＡステムドメイン抗原は、異なるタイプの組換えベクター、例えば発現プラスミド、レプリコンＲＮＡ、組換えウイルスベクターの投与によって、またはレプリコン粒子（ＲＰ）として、ターゲットに発現され得る。これにより、ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する既存の抗体を有するターゲットのためのインフルエンザワクチンとして利用する広い機会が得られる。

ベクター発現および膜提示ＨＡステムドメインが、どのようにして、またはなぜ、既存のＨＡ抗体との関連において可溶性ＨＡステム抗原よりも抗原としてはるかに効果的であるかは知られていない。本発明者らは、これらの知見を説明し得るいかなる理論またはモデルにも拘束されることを望まないが、膜アンカーがＨＡステム抗原の高分子構造に影響を及ぼし、その結果、順次ターゲットの免疫系へのステム抗原のより効果的な提示がもたらされると仮定する。これにより、既存の抗ＨＡヘッドドメイン抗体によって妨げられることなく、ＨＡステムドメイン抗原によるワクチン接種ターゲットにおける早期かつ効果的な免疫応答の誘導が可能になる。

したがって、一態様において、本発明は、ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するのに使用するための、ターゲットにおいて組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドを発現することができる組換えベクターであって、前記ポリペプチドが、ヘッドレスインフルエンザウイルスＨＡステムドメインと、三量体化ドメインと、膜貫通ドメインとを含むことを特徴とする、組換えベクターに関する。

「ベクター」は、宿主細胞内などの適切な条件下でのその発現を可能にする適切なシグナルにより、ポリペプチドをコードするための遺伝情報（核酸配列）を伝送する分子構造として本発明の分野で周知である。本発明にとっての「発現」は、転写および／または翻訳による遺伝情報からのタンパク質の発現の周知の原理に関する。

そのようなベクターの多くの種類および変異体が公知であり、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子から、ウイルス様粒子およびレプリコン粒子などのより複雑な構造、ウイルスなどの組換え微生物の複製まで、本発明のために使用することができる。

使用されるベクターの種類に応じて、より多くのまたはより少ない発現シグナルを供給する必要があり、シス（すなわち、組換えベクターそのものの中に供給される）またはトランス（すなわち、別個の供給源から供給される）のいずれかでなされる。

本発明の「組換え」ベクターは、その遺伝的構成がその天然の対応物の遺伝的構成と完全には一致しないベクターである。したがって、そのようなベクターは、典型的には分子クローニングおよび組換えタンパク質発現技術によるその遺伝情報のインビトロでの操作によって変更された分子構成を有する。行われた変更は、ベクターおよび／またはそれが発現するタンパク質の発現、操作、精製、安定性および／または免疫学的挙動をもたらす、改善するまたは適合させるのに役立ち得る。これらの技術および他の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；およびＣ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０８７９６９６５４０）；および“ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，ｂｙ：Ｊ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ａｎｄ Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）、のような標準的なテキストに詳細に説明されている。

当業者は、本発明による使用のための組換えベクターが、適切な条件下で本発明のＨＡステムポリペプチドを「発現することができる」ようにするために、必要なシグナルを選択し、機能的な組み合わせに組み合わせる十分な能力を有する。構築およびクローニングを補助する要素、例えば制限酵素認識部位またはＰＣＲプライマーの隣に、周知の要素を、プロモーター、終止コドン、終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、７－メチルグアノシン（７ｍＧ）キャップ構造、ならびに機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンの１つまたは複数から選択することができる。

「インフルエンザウイルス」は、本発明の分野で周知であり、そのようなウイルスは、形態学的特徴、ゲノムの特徴、および生化学的特徴などのその分類上の群の特徴的な特性、ならびに生理学的、免疫学的、または病理学的挙動などの生物学的特徴を有する。

これらのウイルスに関する一般的な情報は、例えば、本明細書に示される参考文献のハンドブックから入手可能である。本発明で使用するためのインフルエンザウイルスの試料は、様々な供給源から、例えば、ヒトからの野外単離物として、または野生もしくは農場の動物からの野外単離物として、または様々な実験室、（寄託）機関、または（獣医）大学から得ることができる。インフルエンザウイルスは、日常的な血清学的、生化学的または分子生物学的ツールを使用して容易に同定することができる。さらに、インフルエンザウイルスに関する多くの配列情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬのＥＢＩなどの公開されている配列データベースにおいて、デジタルで利用可能である。さらに、ＨＡタンパク質に関する詳細な構造情報は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）ａｔ：ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ、およびＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｔ：ｗｗｗ．ｆｌｕｄｂ．ｏｒｇで入手可能である。

当技術分野でまた知られているように、特定の分類上の群における微生物の分類は、その特徴の組み合わせに基づく。したがって、本発明はまた、例えば亜種、株、単離体、遺伝子型、変異体、サブタイプまたはサブグループなどとして、何らかの方法でそこから亜分類されるウイルス種の変異体を含む。

さらに、本発明の特定のウイルスは現在その種に割り当てられ得るが、これは、新しい洞察が新しいまたは異なる分類上の群へ再分類されるに至る可能性があるため、時間的に変化し得る分類学的分類であるということが、本発明の分野の当業者にとって明白であろう。しかし、これはウイルス自体またはその抗原レパートリーを変化させず、その科学的名称または分類のみを変化させるので、そのような再分類されたウイルスは本発明の範囲内に留まる。

「赤血球凝集素」（ＨＡ）（ヘマグルチニンとも呼ばれる）は、ウイルスゲノムの第４のセグメントによってコードされる、インフルエンザＡまたはＢウイルスの周知のエンベロープ糖タンパク質である。インフルエンザＡ ＨＡ遺伝子は、サイズが約５６６アミノ酸（ａａ）のプレタンパク質をコードする。シグナル配列がなければ、成熟ＨＡ０タンパク質は約５５０ａａのサイズであり、ＨＡ１については約３２９ａａ、ＨＡ２部分については約２２１ａａである。

本発明について、インフルエンザＨＡタンパク質の様々なドメイン、セグメントおよびセクションの命名は、Ｌｕら（前出）に従う。さらに、異なるサブタイプのＨＡタンパク質のアミノ酸のナンバリングに関して、この技術分野で使用される標準的な均一なナンバリングは、いわゆる「Ｈ３ナンバリング」に基づく。これは、１９６８年の香港由来のインフルエンザウイルス単離物：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡが、その結晶構造を最初に完全に分析し、後に配列決定されたからである（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２８６，ｐ．７７１－７７６）。５６６ａａの全長Ｈ３ ＨＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションｎｒＡＡＡ４３１７８で表され、これにより、Ｈ３ナンバリングシステムは成熟ＨＡタンパク質に適用され、したがって１６ａａシグナルペプチドを含まない。このアプローチはまた、全てのＨＡサブタイプにわたって構造的および機能的に同等であるアミノ酸を同定することを可能にする、Ｂｕｒｋｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（１１）：ｅ１１２３０２）によって提案されたナンバリングスキームの基礎でもある。ＦｌｕＤＢウェブサイト（前出）は、ＢｕｒｋｅおよびＳｍｉｔｈによるこの出版物に基づいて、便利な「ＨＡサブタイプナンバリング変換」ツールさえ提供している。その結果、Ｈ３ナンバリングシステムを本明細書で使用して、ＨＡポリペプチドの特定のアミノ酸残基番号を同定する。

しかし、ＨＡタンパク質由来のドメイン、セグメントおよびセクションのサイズおよび配列を考慮する場合、様々なインフルエンザウイルス株由来のＨＡタンパク質の生物学的変異を考慮することができる。例えば、第１群のＨＡタンパク質（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、およびＨ１８）と第２群のＨＡタンパク質（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、およびＨ１５）との間にいくつかの違いが生じる。したがって、本明細書で使用されるサイズ表示について、「約」は、サイズが、表示されたａａ残基Ｈ３番号の前後１～５アミノ酸多いまたは少なく変動し得ることを意味する。

インフルエンザＢ ＨＡタンパク質にも同様の指標が適用され、そのコードＨＡ０のサイズは約５８５ａａであり、ＨＡ１については約３４５ａａ、ＨＡ２については約２２３である。

ＨＡタンパク質は、様々な方法、例えば生化学的または血清学的に特徴付けられ得、全て当業者に周知である。さらに、先行技術および共通の一般的知識から、本発明の当業者は、ＨＡタンパク質の異なるドメインおよび領域を知り、容易に認識するであろう。

インフルエンザＡ ＨＡの場合、ＨＡ２セクションは、ＨＡ０のタンパク質分解切断に使用されるＨ３番号３２９のａａ付近のアルギニンアミノ酸の後に始まり、アミノ酸配列ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ（配列番号１）、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するａａ配列、Ｈ３第３３０～３４０番のａａ付近を含有する「融合ペプチド」と命名された保存的アミノ酸配列で始まる。

ＨＡ２セクションのステムドメインにおいて、ＨＡ２からのａａ７５～９０程度の領域は、天然のステム三量体間の界面であり、これは、ナンバリング４０５～４２０のＨ３のａａ付近である。

インフルエンザＡ ＨＡ２は、そのＣ末端側に、約２７ａａの膜貫通ドメインを有し、Ｈ３のナンバリングはａａ５１４～５４０に亘り、また約１０ａａの細胞質ドメインを有し、Ｈ３のナンバリングは、ａａ５４１～５５０に亘る。

「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を指す。ポリペプチドは、天然もしくは成熟タンパク質、プレもしくはプロタンパク質、またはタンパク質の断片であり得る。したがって、タンパク質、ペプチドおよびオリゴペプチドは、これらが依然としてインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の示されたドメインを含有する限り、本発明のポリペプチドの定義の中に含まれる。

本発明の「ターゲット」は、インフルエンザウイルスによる感染を受け得る任意のヒトまたは動物である。動物は、例えば、鳥類、ブタ、イヌ、ウマ、またはイタチであり得る。

ターゲットは、本発明に従って使用するための組換えベクターによるワクチン接種に影響される任意の体重、性別または年齢であり得る。しかし、健康で感染していないターゲットを処置し、可能な限り早期に治療して、あらゆる野外感染およびその結果を予防することが明らかに好ましい。

したがって、組換えベクターは、それが発現することができるポリペプチドが、インフルエンザウイルスによる感染の確立および進行の両方を妨げることができる免疫応答を誘導することができるので、予防的処置または治療的処置のいずれかとして、またはその両方として使用することができる。

本発明の組換えベクターの「使用」は、ベクター発現ポリペプチドの免疫学的特性が使用されるヒトまたは獣医学的医療用途に関する。典型的には、これは、本明細書で以下に記載されるワクチンの活性成分としての組換えベクターによる免疫化を含む。

「減少させる」という用語は、感受性のあるターゲットの細胞および器官における、または疾患のその後の徴候における、インフルエンザウイルスによる増殖性感染の確立または増殖を、部分的または全体的に減少させることに関する。これは、例えば、ウイルス量を減少させるか、またはウイルス複製の期間を短縮することによって達成される。次に、これは、ターゲットの、ウイルス感染によって引き起こされる病変および疾患の関連する臨床徴候の数、強度、または重症度の低下をもたらす。

そのような感染または疾患の減少は、例えば、本発明に従って使用するための組換えベクターによるワクチン接種後の免疫学的応答を監視することによって、およびワクチン接種ターゲットの感染後の臨床症状または死亡率の出現を試験することによって、例えば、疾患のターゲットの徴候、臨床スコア、血清学的パラメータを監視することによって、または感染病原体の再単離によって、容易に検出することができる。動物では、これらの結果を、擬似ワクチン接種動物における感染誘発に対する応答と比較することができる。インフルエンザウイルス感染および疾患の症状を評価するための様々な方法が当技術分野で周知である。

「インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患」とは、インフルエンザウイルスによる感染、ならびにそのような感染が引き起こす感染または疾患のその後の周知の症状、ならびにそれらの福祉および経済的帰結を指す。

本発明による使用のための組換えベクターからの本発明のためのＨＡステムポリペプチドの発現によって誘導されるインフルエンザウイルス感染または疾患に対する防御は、ターゲットにそのベクターによる免疫化をもたらし、健康および経済でのパフォーマンスを改善する。これは、例えば、健康、生存率、成長率、食料転換および卵の生産の増加、ならびに（獣医学的）ヘルスケアのためのコスト削減などのパラメータから評価することができる。

本発明は、「ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有する」ターゲットにおける使用のためのものである。そのような既存の抗体は、全長インフルエンザウイルスＨＡタンパク質またはそのようなＨＡヘッドドメインの抗原性部分を含む免疫化を妨げる。しかし、本明細書に開示されるようなそのような抗体は、本発明のＨＡステムポリペプチドによる免疫化を妨げないか、または少なくともはるかに少ない。

ＨＡヘッドドメインに対して方向付けされる既存の抗体は、典型的には、ヘッドドメインが免疫優性であるので、ＨＡヘッドドメインまたはその一部を含有する抗原性調製物による感染または免疫化後に獲得される。そのような調製物は、全長ＨＡタンパク質、ＨＡヘッドドメインまたはその一部を含む、インフルエンザウイルス調製物全体または部分、生もしくは不活化または組換えワクチンであり得る。

ターゲットは、ターゲット自体のインフルエンザ感染または免疫化の後に、ＨＡヘッドドメインに対するそのような抗体を獲得した可能性がある。あるいは、そのような抗体は、抗体の接種または摂取によって受動的に得ることができる。ターゲットの母親から得られる場合、抗体は「母体由来抗体」（ＭＤＡ）である。ＭＤＡは、ヒトまたは動物のいくつかのタイプのターゲットに存在する。

哺乳動物では、ＭＤＡは、母から子への抗体の経胎盤移行に由来し得る。代替で、または加えて、ＭＤＡは、そのような抗体の摂取によって、例えば、母親の母乳含有抗体、いわゆる初乳の摂取によって誘導され得る。しかし、疾患に対する受動的な防御を得るための初乳の摂取は、若齢のターゲットに限定されず、より高齢のターゲットおよび交差種にも適用され得る。

鳥類では、ＭＤＡは卵黄に存在し、この卵黄は、生まれていない鶏が卵で成熟する間にその腹部に組み込まれる。

本発明の「抗体」は、任意の種類の免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＹ、またはその一部、例えば一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）もしくはＦｖ、Ｆ（ａｂ’）もしくはＦ（ａｂ’）２断片に関する。

免疫刺激または補充がなければ、ターゲットの抗体のレベル（いわゆる「力価」）は、それらの生物学的半減期が限られているため、経時的に低下する。これは、例えば、誕生後またはターゲットが母乳を摂取するために停止したときに、ターゲットに適用される。したがって、「ワクチン接種時」は、免疫化のタイミングを本発明に従って使用するための組換えベクターと、そのターゲットにおける抗ＨＡヘッドドメイン抗体の力価とを結び付けることを目的とする。この抗体レベルは、例えば、ＨＡヘッドドメインに対する抗体の力価を判定するために、ワクチン接種の前後にターゲットから血清試料を採取することによって決定することができる。

本発明の場合、ワクチン接種時のターゲットの抗体レベルは、ワクチン接種前後の±３日以内の期間の時点でのターゲットの抗体力価である。

しかし、これは、既存の力価の値の実際の決定自体、すなわちワクチン接種時の前後に採取された血清試料に対する血清学的試験の実施、および／またはその試験の結果の分析および解釈が、血清試料が十分に無傷の抗体を維持するための適切な条件下で保存された場合、例えば－２０℃またはそれより低温で保存された場合に、ワクチン接種の幾ばくかのかなりの時間の後に行われ得ることを排除するものではない。同様に、ワクチン接種時の既存の力価が計算され、経時的な抗体の力価の低下についてかなり正確なデータが利用可能であるなら、ワクチン接種の前または後にさらに時間をおいて採取された試料で判定されたレベルから外挿されることは妨げられない。

本発明の場合、ターゲットは、そのターゲットからの血清の抗ＨＡヘッドドメイン抗体の力価が、インフルエンザウイルスおよびインフルエンザ抗体に対してナイーブである同等のターゲットのヒトまたは動物で検出されるバックグラウンドレベルを超える場合、抗体を「有する」。動物では、これは、例えば、同じ年齢および種のＳＰＦ（特定病原体を含まない）動物の血清に存在する力価であり得る。

本発明の場合、ＨＡヘッドドメイン「に対する抗体」は、そのようなインフルエンザＨＡヘッドドメインを含むポリペプチド、例えばＨＡサブユニット抗原またはインフルエンザウイルスの調製物に特異的に結合する（すなわち、それに特異的である）抗体を指す。そのような特異性は、コーティングされたＨＡ抗原を使用する試験における抗血清の線形希釈によって、当業者によって、例えばＥＬＩＳＡにおいて容易に判定される。抗血清中の抗体が特異的である場合、試験は、検出された結合シグナルの漸進的かつ線形的な減少を示す。

「ＨＡヘッドドメイン」は、３Ｄ球状構造を形成することができ、当業者が知っており、容易に認識するであろうＨＡタンパク質のＨＡ１セクションの中心部分であることがこの分野で周知である。約５５０ａａの成熟インフルエンザＡ ＨＡ０タンパク質からカウントする場合、ヘッドドメインは、上記のＬｕらに与えられた指標に対応する、約ａａ番号４４から約ａａ番号２７４までのＨ３ナンバリングのアミノ酸配列を含むポリペプチドを構成する。ここでも、異なるインフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質では、特異的なサイズおよびａａ数の変動が起こり得る、例えば、血清型Ｈ１～Ｈ１６のインフルエンザＡ ＨＡ配列について国際公開第２０１１／１２３４９５号の図１Ａを参照され、またインフルエンザＡ Ｈ１ ＨＡ配列についての国際公開第２０１３／０７９４７３号の表７も参照されたい。

その結果、本発明の「ヘッドレス」ＨＡステムドメインポリペプチドは、上に定義されるインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対応するアミノ酸配列を含まない。

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの変形）という用語は、そのような要素または組み合わせが明示的に列挙されていなくても、この用語が使用されるテキストのセクション、段落、請求項などによって網羅されるかまたは含まれる、本発明について考えられる全ての要素および任意の可能な組み合わせを指すことを意図し、そのような要素または組み合わせのいずれも排除する意図はない。

したがって、そのような任意のテキストのセクション、段落、請求項などはまた、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」（またはその変形）が「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語で置き換えられる１つまたは複数の実施形態にも関連し得る。

「インフルエンザウイルスＨＡステムドメインポリペプチド」は、ＨＡタンパク質のＨＡ１部分からの２つの部分およびＨＡ２部分の主要な部分を含むことがこの分野で周知である。ステムポリペプチドは、例えば、様々なインフルエンザＨＡタンパク質のＨＡステムドメインに特異的な周知のモノクローナル抗体、例えば、全て周知で市販されているＦＩ６、ＣＲ９１１４およびＭＥＤＩ８５５２を使用することによって同定することができる。

具体的には、Ｌｕら（上掲）に示されている指標に基づいて、成熟インフルエンザウイルスＨＡ０タンパク質について、本発明のステムドメインは、
－約ａａ番号１から約ａａ番号４３までのＨ３ナンバリングで、シグナル配列の切断後に残った最初のアミノ酸から始まり、ヘッドドメインの開始まで続くＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメント、
－約ａａ番号２７６から約ａａ番号３２９までのＨ３のナンバリングで、ヘッドドメインの後から始まり、ＨＡ１およびＨＡ２の切断部位まで延びるＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメント、および
－約ａａ番号３３０から約ａａ番号５１３までのＨ３のナンバリングで、ＨＡ１およびＨＡ２の切断部位の後に始まり、膜貫通ドメインまで延びるＨＡ２外部ドメイン
を含む。

以下により詳細に記載されるように、Ｈ３ ＨＡでは、ＨＡ１のＮ末端ステムセグメントの長さは、５ａａを超えて逸脱し、約１０ａａ長い。その結果、Ｈ３の場合、これは、様々なドメインの「Ｈ３数」を１０ａａ上方にシフトさせる。

本発明のポリペプチドは１つの融合ペプチドとして発現されるので、その構成部分は、直接的に、または１つ以上の介在するスペーサーおよび／またはリンカーアミノ酸配列によって、１つのアミノ酸鎖に共有結合している。さらなる連結は、異なる部分のシステインアミノ酸の間に形成されたジスルフィド結合によってなされ得る。

ステムドメインポリペプチドの構成部分は、天然または異種であってもよく、本発明では、ポリペプチド部分は、本発明のポリペプチドにあるＨＡ２ステムドメインと比較して異なる供給源に由来する場合、「異種」である。１つまたはそれを超える異種エレメントの使用は、本発明用のポリペプチドのキメラ版を作り出し、これは本発明の範囲内である。

本発明の場合、「由来する」は、本発明のポリペプチドの起源、したがってその核酸コードを示す。これらは、生物学的供給源から単離され得るか、または配列情報に基づいて組換えにもしくは合成にて作製され得る。

ナイーブなＨＡステムドメインに対する本発明で使用するためのポリペプチドの変化、例えば天然シグナル配列を異種シグナル配列で置き換えること；ＨＡ１－ＨＡ２切断をシグナル伝達する塩基性アミノ酸を変化させること；および／または精製を容易にするタグ、例えば６ｘヒスチジンタグを付加することを含む。また、本発明のインフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドを構成する示されたドメイン間で、１つ以上のａａリンカー配列が使用され得る。

「三量体化ドメイン」は、それが結合しているホモマーポリペプチドの３倍の多量体化をもたらす周知のポリペプチドである。この分野では、様々なこのような三量体化ドメインが公知であり、利用可能である。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＣＮ４転写活性化因子のイソロイシンジッパー３ドメイン（「ＧＣＮ４ドメイン」）、およびバクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質のｆｏｌｄｏｎドメイン（「ｆｏｌｄｏｎドメイン」）がある。

三量体化ドメインは、本発明による使用のための組換えベクターによって、異なる方法で、例えば、本発明による使用のための組換えベクターを構成するセグメントおよびドメインの前、後または間に含まれ得る。

「膜貫通ドメイン」は、脂質二重層膜への付着および／または固定を提供することができる疎水性を有するアミノ酸配列であることがよく知られている。本発明のＨＡステムドメインポリペプチドに結合している膜貫通領域は、本発明による使用のための組換えベクターで使用されるＨＡ２ステムドメインのナイーブな膜貫通ドメインであり得るか、または異なるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質もしくは別のタンパク質由来の異種の膜貫通ドメインであり得る。

膜貫通ドメインは、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の細胞質ドメインを組み込んでも、組み込まなくてもよい。

フルＨ１ ＨＡを発現するＲＰワクチンを接種した豚からの経時的なＨＩ力価（Ｌｏｇ２）。仔豚は、実験開始時にＨ１ ＨＡについてＭＤＡ－またはＭＤＡ＋であった。詳細は実施例６．１に記載されている。

本発明の実施形態およびさらなる態様の詳細を以下に説明する。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患は、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスによって引き起こされる。好ましくは、疾患はインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるインフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドは、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスに由来する。好ましくは、ＨＡステムポリペプチドは、血清型Ｈ１～Ｈ１８のいずれか１つから選択されるインフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質に由来する。より好ましくは、ＨＡステムポリペプチドは、血清型Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９のいずれか１つから選択されるインフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質に由来する。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるＨＡステムポリペプチドのアミノ酸配列はコンセンサス配列である。

周知のように、そのようなコンセンサス配列を得るために、例えば、適切なコンピュータプログラムを使用していくつかのＨ９ ＨＡステムドメインヌクレオチド配列をアライメントすることによって、アミノ酸配列またはコードヌクレオチド配列のいずれかが比較され、コンセンサス配列がその比較から誘導される。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるＨＡステムポリペプチドの構成部分の一般的な順序は、Ｎ末端からＣ末端に向かって
・ＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメント、
・ＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメント、
・ＨＡ２外部ドメイン、
・膜貫通ドメイン、および
・細胞質ドメイン
である。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるＨＡステムポリペプチドは、
・ＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメントおよびＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメント、
・ＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメントおよびＨＡ２外部ドメイン、および
・ＨＡ２外部ドメインおよび膜貫通ドメイン
のうちの１つ以上の間にリンカー配列を含む：
本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるＨＡステムポリペプチドは、本明細書に記載の１つ以上のリンカーを含む。好ましくは、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧ（配列番号２）である。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるＨＡステムポリペプチドは三量体化ドメインを含有する。好ましくは、三量体化ドメインは、ＧＣＮ４ドメインであるか、またはフォールドンドメインである。より好ましくは、三量体化ドメインはＧＣＮ４ドメインである。さらにより好ましくは、ＧＣＮ４ドメインはＨＡ２外部ドメインの内側に配置される。さらにより好ましくは、ＧＣＮ４ドメインは、本明細書に記載されるような天然のステム・三量体界面の位置においてＨＡ２セクションの内側に配置される。

本発明の場合、ＨＡ２外部ドメイン内への三量体化ドメインのそのような配置は、置換または挿入を構成し得るように、その部分のアミノ酸の代わり、またはその部分のアミノ酸に加えたものであり得る。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるインフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０および１２のうちの１つから選択されるアミノ酸配列を有する。

当業者が認識するように、配列番号４、６、８、１０および１２のインフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドは全て同じ一般的なレイアウトを有し、これは表１Ａおよび１Ｂにさらに詳述されている。手短に言えば、
－ナイーブなＨＡタンパク質シグナル配列の１６ａａは、ＣＤ５由来のシグナル配列の２５ａａで置き換えられる、
－ＨＡヘッドドメインが欠損しており、代わりにＨＡ１のＮ末端およびＣ末端ステムドメインセグメントが配列番号２のａａリンカーによって連結されており、これによりＨＡ１のＮ末端セグメントがＨＡ１のＣ末端セグメントの前に（すなわち、それからのＮ末端に）配置される、
－ＨＡ１－ＨＡ２切断を防止するために、Ｈ３ナンバリング残基３２９のアルギニン残基をグルタミンに置き換えた、
－ＨＡ２外部ドメインの中央に、ＧＣＮ４三量体化ドメインを導入し、ＨＡ２のその部位のステム・三量体界面の１５個の対応するアミノ酸を欠失させた、および
－膜貫通ドメインとＨＡ２の細胞質ドメインの両方が含まれる。

配列番号４、６、８、１０および１２のＨＡステムポリペプチドにおいて、ＨＡステムドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインのセグメントは、それぞれＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９に特異的である。また、Ｈ１、Ｈ３およびＨ９ステムドメイン配列は、インフルエンザＡウイルスのいくつかの最近の分離株、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）分離株由来のＨ１およびＨ３、ならびに鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）分離株由来のＨ９をアライメントさせることから判定されるコンセンサス配列である。Ｈ５ ＨＡステム配列は、ＡＩＶ株：Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＷ９０１３４）から得、Ｈ７ ＨＡステム配列は、ＡＩＶ株：Ｈ７Ｎ９ Ａ／Ａｎｈｕｉ／１－ＹＫ＿ＲＧ０５／２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＵ４１０７９）から得た。

さらに、ポリペプチドを安定化するため、および／またはその溶解度を増加させるために、いくつかのａａ変異を導入した。これらを国際公開第２０１３／０７９４７３号に記載されているように適用した。

表１Ａに示される指標にわたって、Ｈ７ ＨＡステムポリペプチド（配列番号１０）には、ＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメントが１ａａ長く、ＨＡ２断片２が１ａａ短いという点で、配列番号４、８および１２（それぞれＨ１、Ｈ５およびＨ９ ＨＡステムポリペプチド）のものと比較してわずかな差がある。Ｈ３ ＨＡステムポリペプチド（配列番号６）は、ＨＡ２断片２において同じ小さい差異があるが、１０ａａ長いＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメントにおいてより重大な差異を有する。これを表１Ｂに示す。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ターゲットはヒトである。好ましくは、ヒトであるターゲットは、若齢、高齢、病気または免疫無防備状態のヒトである。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ターゲットは動物である。好ましくは、動物は、鳥類、ブタ、イヌ、ウマ、またはイタチからなる群から選択される。より好ましくは：
・鳥類は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、パートリッジおよびダチョウから選択される；
・ブタは、野生または家畜の豚、イノシシ、バビルサ、およびイボイノシシから選択される、；
・犬（ｃａｎｉｎｅ）は犬（ｄｏｇ）である；
・ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）はウマ（ｈｏｒｓｅ）である；
・イタチはフェレットおよびミンクから選択される。

さらにより好ましくは、ターゲットはブタまたはニワトリである。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体は、母体由来抗体（ＭＤＡ）である。

記載されるように、本発明に従って使用するための組換えベクターは、ＨＡステムポリペプチドをコードする核酸配列を含むので、本発明のインフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドを発現することができる。ほとんどの場合、コード核酸はベクターに対して異種である。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドをコードする核酸はコドン最適化されている。

コドン最適化は周知であり、ポリペプチドの起源とは異なる状況でＨＡステムポリペプチドの発現レベルを改善するために適用される。それは、意図されたアミノ酸をコードするためのヌクレオチド配列の適合を含むが、配列が発現される組換えベクター、宿主細胞、またはターゲット生物のコドン優先度（ｔＲＮＡレパートリー）に一致するヌクレオチド配列による。その結果、適用されるヌクレオチド変異はサイレントである。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ＨＡステムポリペプチドは、ターゲット生物に対してコドン最適化された核酸配列によってコードされる。好ましくは、ターゲット生物は、ヒト、鳥類、ブタ、イヌ、ウマ、およびイタチから選択される。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ＨＡステムポリペプチドが、配列番号３、５、７、９および１１のうちの１つから選択される核酸配列によってコードされる。

当業者が理解するように、配列番号３、５、７、９および１１に示されるヌクレオチド配列は、ＤＮＡ核酸を指し、「コード鎖」を指す。相補的ＤＮＡ鎖、「鋳型」鎖の場合、配列は逆相補体である。

また、自明であるように、本発明による使用のための組換えベクターがＨＡステムポリペプチドを発現するためのＲＮＡ核酸を含む場合、任意のＴがＵで置き換えられることを除いて、配列番号３、５、７、９および１１と同じコード配列が適用される。

さらに、配列番号３、５、７、９および１１、またはＲＮＡ核酸としての対応する配列は、それぞれ配列番号４、６、８、１０および１２のＨＡステムポリペプチドをコードする。

記載されるように、本発明に従って使用するための組換えベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子から、ウイルス様粒子およびレプリコン粒子などのより複雑な構造まで、ウイルスなどの組換え微生物の複製まで、様々な形態を有することができる。

したがって、実施形態では、本発明に従って使用するための組換えベクターは、核酸、ウイルスおよびレプリコン粒子（ＲＰ）から選択される。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ベクターは核酸である。

ベクターが核酸である、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、核酸は真核生物発現プラスミドである。

通常はＤＮＡの真核生物発現プラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターの操作制御下で、プラスミドに挿入される異種遺伝子の発現のための適切なシグナルを有する。次いで、プラスミドを、何らかのトランスフェクション方法、例えば、生化学物質を担体として使用することによって、機械的手段によって、またはエレクトロポレーションによって真核生物宿主細胞または宿主生物に挿入することができ、異種遺伝子挿入物の発現を開始させる。典型的には、そのような発現は、プラスミドが宿主細胞のゲノムへの安定な組み込みのためのシグナルを欠くので、一過性であろう。したがって、そのようなプラスミドは、典型的には、宿主または宿主細胞を形質転換または不死化しない。これらの材料および手順は全て当技術分野で周知であり、ハンドブックに記載されている。そのような真核生物発現プラスミドは、様々な供給業者、例えば、一連のプラスミド：ｐｃＤＮＡ（商標）、ｐＣＲ３．１（商標）、ｐＣＭＶ（商標）、ｐＦＲＴ（商標）、ｐＶＡＸ１（商標）、ｐＣＩ（商標）、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）、ｐＣＡＧＧＳなどから市販されている。

好ましい実施形態では、真核生物発現プラスミドは、ｐＦＲＴ（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはｐＣＡＧＧＳプラスミド（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐ．１９３－１９９）のプラスミドである。

真核生物発現プラスミドは、発現、精製などの調節のためのいくつかの特徴を含むことができる。１つの可能なシグナルは、構築およびクローニングプロセスの間の選択に使用することができる、抗生物質耐性遺伝子である。しかし、ヒトまたは動物であるターゲットへの投与を意図する場合、そのような抗生物質の選択は、抗生物質耐性を発生させる恐れのために望ましくない。

ベクターが核酸であり、核酸が真核生物発現プラスミドである、本発明に従って使用するための組換えベクターの好ましい実施形態では、プラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含有しない。

本発明による使用のための組換えベクターは、真核生物発現プラスミドの形態で、宿主細胞またはターゲット生物に送達することができ、宿主細胞において本発明のＨＡステムポリペプチドを発現する。発現プラスミドの送達は、いくつかの方法で、例えば、機械的または化学的手段によって、素のままのＤＮＡとして、またはタンパク質、多糖、脂質もしくはポリマーなどの適切な（ナノ粒子）担体でカプセル化することができる。核酸担体の周知の例は、デンドリマー、脂質ナノ粒子、カチオン性ポリマーおよびプロタミンである。

真核生物発現プラスミドとして本発明に従って使用するための組換えベクターの特別な形態は、プラスミドがレプリコンＲＮＡの送達をもたらす場合である。

したがって、ベクターが核酸であり、核酸が真核生物発現プラスミドである、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、プラスミドはレプリコンＲＮＡをコードする。

「レプリコンＲＮＡ」は、自己増幅ｍＲＮＡとしても知られており、本発明のＨＡステムポリペプチドをコードする核酸に加えて、レプリカーゼ遺伝子などのＲＮＡ複製に必要な要素を含む自己複製ＲＮＡである。しかし、レプリコン粒子（ＲＰ）とは異なり、レプリコンＲＮＡはウイルス構造タンパク質によってパッケージングされないため、宿主細胞への侵入効率が低い。

レプリコンＲＮＡをコードする発現プラスミドは、タンパク質発現プラスミドと同じ方法で宿主細胞に送達することができる。この場合、構造ウイルスタンパク質はトランスで共に供給されはしないので、レプリコンＲＮＡはＲＰにパッケージングされない。

レプリコンＲＮＡは増幅ステップを設けるので、レプリコンＲＮＡをコードする真核生物発現プラスミドでのワクチン接種は、タンパク質を発現する真核生物発現プラスミドでのワクチン接種よりも利点を与える。レプリカーゼの翻訳は、レプリコンＲＮＡに、ＨＡステムポリペプチドをコードするサブゲノムメッセンジャーＲＮＡを産生させる。これにより、本発明のＨＡステムポリペプチドが宿主細胞において、ターゲットにおいてそれぞれ大量に発現するに至る。

本発明に従って使用するための組換えベクターの好ましい実施形態では、ベクターが核酸であり、核酸が真核生物発現プラスミドであり、プラスミドがレプリコンＲＮＡをコードし、レプリコンＲＮＡがアルファウイルスベースのレプリコンＲＮＡである。より好ましくは、アルファウイルスベースのレプリコンＲＮＡはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ベースのレプリコンＲＮＡである。

ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡをコードする真核生物発現プラスミドの例は、例えば、ヒトＣＭＶ最初期遺伝子１プロモーターなどの真核生物プロモーターによって駆られるＶＥＥＶ非構造タンパク質遺伝子１～４を含むｐＶＡＸプラスミドである。

そのようなプラスミドの具体例は、配列番号１２に示されるように、ｐＶＡＸプラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、例えば「ｐＶＡＸ－ＣＭＶ－Ｔ７－ＨＨＲ－ＶＥＥＶ－ｄＰＳ－Ｒｅｐ」に基づく。この特定のプラスミドは１０．７０９塩基対を有し、その組成は表２に記載の通りである。

ベクターが核酸である、本発明に従って使用するための組換えベクターの代替の実施形態では、核酸はＲＮＡ分子である。

本発明のＲＮＡ分子は、異なる形態および機能を有することができ、例えばｍＲＮＡであってもよく、またはレプリコンＲＮＡであってもよい。

ＲＮＡ分子として本発明に従って使用するための組換えベクターは、様々な方法で、例えば機械的または化学的手段によってターゲットまたは宿主細胞に送達され得るか、または記載されるように、タンパク質、多糖、脂質もしくはポリマーなどの適切な（ナノ粒子）担体で被包され得る。ＲＮＡを安定化するために、特定の化学修飾を、例えばヌクレオチドもしくはその骨格に、またはヌクレオチド類似体の組み込みに適用することができる。

ベクターが核酸であり、核酸がＲＮＡ分子である、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ＲＮＡ分子はｍＲＮＡである。

「ｍＲＮＡ」は当技術分野で周知であり、典型的には５’７ｍＧキャップおよび３’ポリＡテールを有する。ｍＲＮＡは、トランスフェクションによって、および／または適切な担体、例えばポリマーもしくはカチオン性脂質を使用することによって、真核生物宿主生物または宿主細胞に送達することができる。

ベクターが核酸であり、核酸がＲＮＡ分子である、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ＲＮＡ分子はレプリコンＲＮＡである。

レプリコンＲＮＡは、例えば上記のｐＶＡＸ－ＣＭＶ－Ｔ７－ＨＨＲ－ＶＥＥＶ－ｄＰＳ－Ｒｅｐプラスミドを使用してインビトロで産生され、次いで任意の適切な方法を使用して宿主細胞またはターゲット生物に投与され得る。

複製組換えウイルスベクターの形態での異種抗原の発現および送達のための組換えベクターは、当技術分野で周知である。これらは、ウイルスベクターがターゲットにおいて複製および増幅するので、ワクチン接種の効率的な方法を提供する。組換えベクターウイルスの構築および改変は、標準的な分子生物学的技術を用いて日常的に行われている。

多くの異なるウイルス種が、組換えベクターとして、また様々なヒトおよび動物ターゲットのために、経時的に使用されてきた。

したがって、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、組換えベクターはウイルスである。

ベクターがウイルスである、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ウイルスは、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルスおよびアデノウイルスから選択される。

ヒトであるターゲットで使用するために、組換えベクターウイルスは、好ましくはアデノウイルス、ラブドウイルス、例えば水疱性口内炎ウイルス、またはパラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルスである。鳥類であるターゲットで使用するために、組換えベクターウイルスは、好ましくはヘルペスウイルス、より好ましくは血清型１または２の七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）またはマレック病ウイルスである。ブタであるターゲットで使用するために、組換えベクターウイルスは、好ましくはヘルペスウイルス、例えば仮性狂犬病ウイルス（Ｓｕｉｄヘルペスウイルス１）である。

組換えベクターウイルスは比較的大きいので、発現のための異種遺伝子の単一のインサートだけでなく複数のインサートでさえも可能である。インフルエンザＨＡ遺伝子を発現および送達する組換えウイルスベクターの例は、国際公開第２０１２／０５２３８４号および欧州特許第１９２１８８０４．３号のベクターとしてのＨＶＴについて記載されている。ベクターとしてのニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ；鳥パラミクソウイルス）については、国際公開第２００７／１０６８８２号に例が記載されている。

組換えウイルスベクターの構築のために、典型的には、発現カセットがベクターのゲノムの遺伝子座に挿入される。その挿入の軌跡および向きを制御するために、様々な技術が利用可能である。例えば、相同組換えプロセスによってカセットの統合を指示するためにベクターのゲノムからの適切な隣接セクションを使用することによって、例えば、米国特許第５，９６１，９８２号に記載されているように重複コスミドを使用することによる。あるいは、統合は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して行われてもよい。

「発現カセット」は、コードされるタンパク質の発現を可能にするために、少なくとも１つの異種遺伝子と、その遺伝子の転写を駆動するプロモーターとを含む核酸断片である。転写の終結は、カセットのゲノム挿入部位によって得られる配列によって得ることができるか、または発現カセット自体が転写ターミネーターなどの終結シグナルを含み得る。そのようなカセットでは、プロモーターおよびターミネーターの両方が、それらが発現を調節する遺伝子に近接している必要がある。これは「作動可能に連結されている」と呼ばれ、それによって、転写の効果的な開始、それぞれの終結に介在する有意な他の配列はそれらの間に存在しない。当業者に明らかなように、発現カセットは自己完結型発現モジュールであり、したがって、ベクターウイルスゲノムにおけるその配向は一般に重要ではない。

本発明による使用のための組換えベクターはまた、ビリオンに似た高分子構造によってターゲットに送達および発現させることができる。例は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはレプリコン粒子（ＲＰ）である。これらは、「単一サイクル」感染性粒子として知られており、宿主細胞に感染し、ポリペプチドをコードするそれが保有する異種遺伝子を発現するのに必要な特徴を含むが、組み込まれた安全性の特徴として、それらが構築されたウイルスゲノム（の関連部分）がないため、典型的には完全なウイルス複製ができない。

「ＲＰ」は周知であり、様々なタンパク質の発現および送達のためのプラットフォームとしていくつかのＲＰが開発されている。ＲＰの好ましい基礎は、その宿主領域が広く、迅速に複製することから、アルファウイルスである。もちろん、一部のアルファウイルスは野生型形態では病原性が高いため、そのようなＲＰの感染を軽減および制御するために適切な安全対策を講じる必要がある。総説については、Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１７２３－１７２７，ａｎｄ：Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１３，ｐ．１－９を参照されたい。

したがって、本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、ベクターはＲＰである。好ましくは、ＲＰはアルファウイルスＲＰである。より好ましくは、アルファウイルスＲＰはＶＥＥＶ ＲＰである。

好ましいアルファウイルスＲＰは、ヒト、ブタ、家禽および魚用の組換えベクターワクチンとして適用されているＶＥＥＶに基づく。ＶＥＥＶベースのアルファウイルスＲＰを構築、試験および使用するための方法およびツールは周知であり、入手可能である。例えば、Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３８９－４０１、および国際公開第２０１９／１１０４８１号を参照されたい。好ましいＶＥＥＶ ＲＰ技術は、ＳｉｒｒａＶａｘ^ｓｍ ＲＮＡ Ｐａｒｔｉｃｌｅの技術（Ｈａｒｒｉｓｖａｃｃｉｎｅ）である。

実施形態では、ｐＶＡＸ－ＣＭＶ－Ｔ７－ＨＨＲ－ＶＥＥＶ－ｄＰＳ－Ｒｅｐプラスミドを使用してＲＰを産生する：ＲＮＡはプラスミドから産生され、次いでＶＥＥＶ構造タンパク質をトランスでコードするヘルパーＲＮＡと共に宿主細胞にトランスフェクトされる。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、以下からなる群から選択される１つ以上の条件が適用される：
－インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスによって引き起こされる疾患；好ましくは、疾患はインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる；
－発現されるＨＡステムポリペプチドが、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスに由来する；好ましくは、ＨＡステムポリペプチドは、血清型Ｈ１～Ｈ１８のいずれか１つから選択されるインフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質に由来する；より好ましくは、ＨＡステムポリペプチドは、血清型Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９のいずれか１つから選択されるインフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質に由来する；
－発現されるＨＡステムポリペプチドがコンセンサス配列である；
－発現されるＨＡステムポリペプチドの構成部分の一般的な順序は、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
○ＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメント、
○ＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメント、
○ＨＡ２外部ドメイン、
○膜貫通ドメイン、および
○細胞質ドメインである；
－発現されるＨＡステムポリペプチドは、以下のうちの１つ以上の間にリンカー配列を含む：
○ＨＡ１ Ｎ末端ステムセグメントおよびＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメント；
○ＨＡ１ Ｃ末端ステムセグメントおよびＨＡ２外部ドメイン；および
○ＨＡ２外部ドメインおよび膜貫通ドメイン；
－発現されるＨＡステムポリペプチドは、本発明による１つ以上のリンカーを含む；好ましくは、リンカーアミノ酸配列はＧＧＧＧ（配列番号２）である；
－発現されるＨＡステムポリペプチドは三量体化ドメインを含有する；好ましくは、三量体化ドメインは、ＧＣＮ４ドメインであるか、またはフォールドンドメインである；より好ましくは、三量体化ドメインはＧＣＮ４ドメインである；さらにより好ましくは、ＧＣＮ４ドメインはＨＡ２外部ドメインの内側に配置される；さらに一層好ましくは、ＧＣＮ４ドメインは、本明細書に記載されるような天然のステム・三量体界面の位置においてＨＡ２部分の内側に置かれる；
－発現されるＨＡステムポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０および１２のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する；
－ターゲットはヒトである；好ましくは、ヒトであるターゲットは、若齢、高齢、病気または免疫無防備状態のヒトである；
－ターゲットは動物である；好ましくは、動物は、鳥類、ブタ、イヌ、ウマ、またはイタチからなる群から選択される；より好ましくは：
○鳥類は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、パートリッジおよびダチョウから選択される；
○ブタは、野生または家畜の豚、イノシシ、バビルサ、およびイボイノシシから選択される；
○犬（ｃａｎｉｎｅ）は犬（ｄｏｇ）である；
○ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）はウマ（ｈｏｒｓｅ）である；
○イタチがフェレットおよびミンクから選択される；
－ターゲットがブタまたはニワトリである；
－インフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体は、母体由来抗体（ＭＤＡ）である；
－ＨＡステムポリペプチドをコードする核酸がコドン最適化されている；
－ＨＡステムポリペプチドは、ターゲット生物に対してコドン最適化された核酸配列によってコードされる；好ましくは、ターゲット生物は、ヒト、鳥類、ブタ、イヌ、ウマ、およびイタチから選択される；
－ＨＡステムポリペプチドが、配列番号３、５、７、９および１１に示される核酸配列によってコードされる；および
－本発明に従って使用するための組換えベクターが、核酸、ウイルスおよびＲＰから選択される；好ましくは、
○核酸が真核生物発現プラスミドまたはＲＮＡ分子である；
○ウイルスが、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルスおよびアデノウイルスから選択される；または
○ＲＰはアルファウイルスＲＰである。

本発明に従って使用するための組換えベクターの実施形態では、発現されるＨＡステムポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０および１２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。ターゲットは、ブタまたはニワトリである。インフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体は、母体由来抗体である。ＨＡステムポリペプチドをコードする核酸は、ターゲットである生物に対してコドン最適化される。また、ベクターは、核酸、ウイルスおよびＲＰから選択される。

本発明による使用のための組換えベクターは、例えばターゲットにワクチン接種する方法として、本発明のインフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドをターゲットに送達し発現させるために有利に使用することができる。これは、ある段階で、そのベクターを適切な宿主細胞に導入することを含む。適用されるベクターの種類に応じて、宿主細胞へのその導入は、担体、何らかのトランスフェクション方法を必要とし得るか、または上記のようにベクター自体によって誘導され得る。それにもかかわらず、ベクターが宿主細胞の内部にあると、ＨＡステムポリペプチドが発現され、それによって組換えベクターに感染またはトランスフェクトされた宿主細胞自体を本発明に使用することができ、例えば感染またはトランスフェクトされた宿主細胞をターゲットのワクチン接種に使用することができる。

本発明の「宿主細胞」は、本発明による使用のための組換えベクターからの、例えばトランスフェクションまたは感染による前記宿主細胞へのそのベクターの導入後の、本発明のＨＡステムポリペプチドの発現を可能にする細胞である。

本発明の宿主細胞は、初代細胞、例えばターゲット生物の細胞、または懸濁液、単層もしくは組織のいずれかの細胞として、インビトロで維持される細胞であり得る。典型的には、初代細胞は、インビトロでは少数の限られた数の細胞分裂しか行うことができない。

あるいは、宿主細胞は、例えば、ほぼ無限に成長および分裂することができる確立された細胞株からのような不死化細胞であり得る。宿主細胞のタイプに応じて、本発明のＨＡステムポリペプチドの発現は、多かれ少なかれ広範囲の翻訳後プロセシング、例えばシグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化および／または脂質修飾を含むであろう。

初代または不死化宿主細胞は、本発明に従って使用するための組換えベクターのターゲットと同じまたは異なる種のものであり得る。

使用される宿主細胞の多くは線維芽細胞およびリンパ球である。本発明で使用するための組換えウイルスベクターとしてＨＶＴを使用する場合、宿主細胞は、好ましくは初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）であり、記載されるように使用および保存することができる。例えば、国際公開第２０１９／１２１８８８号を参照されたい。

本発明の宿主細胞は、好ましくは不死化トリ細胞である。いくつかの不死化鳥類細胞株が、例えば国際公開第９７／０４４４４３号および国際公開第９８／００６８２４号に記載されている。より好ましくは、本発明の不死化鳥類宿主細胞は不死化ＣＥＦである。さらにより好ましくは、国際公開第２０１６／０８７５６０号に開示されているような不死化ＣＥＦである。

記載されるように、本発明に従って使用するための組換えベクターおよび本発明の宿主細胞は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するために、ワクチンにおいて有利に使用することができる。

したがって、さらなる態様では、本発明は、ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するのに使用するためのワクチンであって、本発明による使用のための組換えベクター、または前記組換えベクターを含む宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。

「ワクチン」は、薬学的に許容される担体において免疫学的に活性な化合物を含む組成物であることが周知である。「免疫学的に活性な化合物」または「抗原」は、接種されたターゲットの免疫系によって認識され、ターゲットの体液性および／または細胞性免疫系から防御免疫応答を誘導する分子である。

本発明に従って使用するためのワクチンは、「インフルエンザに対する」ワクチンであり、本明細書において上部で記載されるように、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患の徴候の軽減をもたらす。

具体的には、本発明に従って使用するためのワクチンは、本明細書において上部で記載されるように、インフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する既存の抗体を有するターゲットにおいて有効である。

「薬学的に許容される担体」は、ターゲットに無害で忍容性が高いが、ワクチンの安定化および投与を助けることが周知である。そのような担体は、例えば、滅菌水または滅菌生理食塩水であり得る。より複雑な形態では、担体は、例えば、安定剤または保存剤などのさらなる添加剤を含むことができる緩衝剤であり得る。詳細および例は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）などの周知のハンドブックに記載されている。

本発明では、ワクチンが細胞関連ＨＶＴ組換えウイルスベクターを含む場合、薬学的に許容される担体は、好ましくは血清およびＤＭＳＯを含む培養培地の混合物である。この担体はまた、凍結および凍結保存をしている間にＨＶＴベクター感染宿主細胞の安定化をもたらす。血清は、例えば、胎児または新生仔ウシ血清であり得る。

同様に、本発明に従って使用するためのワクチンが核酸またはＲＰを含む場合、薬学的に許容される担体は単純な緩衝液、例えば５％ ｗ／ｖスクロースを含むリン酸緩衝液であり得る。

さらに、本発明に従って使用するための組換えベクターを安定化および／または送達するために、例えば、記載されるように、タンパク質、多糖、脂質またはポリマーなどの適切な（ナノ粒子）担体でカプセル化するために、さらなる担体を添加することができる。好ましくは、本発明のＲＰ用の追加の担体は、国際公開第２０１２／１６５９５３号に記載されている生分解性ポリアクリルポリマーであるナノゲルを含む。

本発明に従って使用するためのワクチンは、追加の免疫活性成分を含むことができる。これは、既に備えられている免疫防御を増強するか、または他の病原体にそれを拡大するのに機能し得る。

したがって、実施形態では、本発明に従って使用するためのワクチンは、少なくとも１つの追加の免疫活性成分を含む。

そのような「追加の免疫活性成分」は、抗原、免疫増強物質、サイトカイン、さらなるワクチン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。これは、コスト、効率および福祉の点で利点を与える。あるいは、本発明に従って使用するためのワクチンは、それ自体がワクチンに添加され得る。

本発明に従って使用するためのワクチンによる、ターゲットにおいてインフルエンザウイルスの負荷を減少させるさらなる有利な効果は、感染したターゲットによるウイルス排出の予防または減少、およびそれによって子孫に対して垂直に、および群れまたは集団の中、および地理的領域内で水平に、インフルエンザウイルスの拡散の予防または減少である。その結果、本発明に従って使用するためのワクチンの使用は、インフルエンザウイルスの有病率の低下をもたらす。

したがって、本発明のさらなる態様は、
－集団または地理的領域におけるインフルエンザウイルスの有病率を低下させるための、本発明に従って使用するためのワクチンの使用、および
－集団または地理的領域におけるインフルエンザウイルスの有病率を低下させるための本発明に従って使用するためのワクチン
である。

本発明に従って使用するためのワクチンは、例えば、本明細書に記載および例示されるような周知の方法によって調製され、例えば、本発明に従って使用するための組換えベクターまたは本発明の宿主細胞を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。

さらに、様々な他の化合物、例えば安定剤、担体、アジュバント、希釈剤、エマルジョンなどを本発明に従って使用するためのワクチンに添加することができる。そのような添加剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」および「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（両方とも上記）などの周知のハンドブックに記載されている。

このようにして、本発明に従って使用するためのワクチンの有効性は、日常的な技術を使用して、当業者によって必要とされるときにさらに最適化され得る。

医薬品製造のための周知の基準の下でワクチンの製造に適用される一般的な技術および考慮事項は、例えば、政府指令および規制（薬局方、９ＣＦＲ）ならびに周知のハンドブック（「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」、両方とも前出）に記載されている。一般に、そのようなワクチンは無菌で調製され、医薬品品質グレードの賦形剤を使用して調製される。

そのような調製物は、無菌性および外来性薬剤の非存在についての微生物学的試験を組み込むことになり、有効性および安全性を確認するためのインビボまたはインビトロでの研究を含み得る。品質、量、無菌性、安全性および有効性についての試験の完了後、ワクチンを販売用に放出することができる。これらは全て当業者に周知である。

本発明に従って使用するためのワクチンの適用経路に応じて、ワクチンの組成物を適合させることが必要な場合がある。これは十分に当業者の能力の範囲内であり、一般にワクチンの有効性または安全性の微調整を含む。これは、ワクチンの用量、分量、頻度、経路を適合させることによって、別の形態または製剤のワクチンを使用することによって、またはワクチンの他の成分（例えば、安定剤またはアジュバント）を適合させることによって、行うことができる。

好ましくは、本発明に従って使用するためのワクチンは、卵内、皮内、または非経口のいずれかでの注射に適した注射可能な液体として製剤化される。注射可能な液体は、例えば、懸濁液、溶液、分散液またはエマルジョンであり得る。

実施形態では、本発明に従って使用するためのワクチンは、非経口経路による投与用である。好ましくは、筋肉内または皮下経路による。

実施形態では、本発明に従って使用するためのワクチンは、皮内経路による投与用である。より好ましくは、皮内投与経路はブタのターゲットに適用される。

さらなる態様では、本発明は、ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するための、本発明に従って使用するための組換えベクター、または前記組換えベクターを含む宿主細胞、および／または本発明に従って使用するためのワクチンの使用に関する。

同様に、さらなる態様では、本発明は、ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減する方法であって、前記ターゲットに、本発明による使用のための組換えベクター、前記組換えベクターを含む宿主細胞、および／または本発明に従って使用するためのワクチンを投与することを含む方法に関する。

本発明による使用または本発明による感染症を軽減する方法の好ましい実施形態では、本発明に従って使用するためのワクチンは、さらに、全長ＨＡタンパク質を含むワクチンを含む。

この組み合わせにおいて、本発明に従って使用するためのワクチンは、ＭＤＡの状況においてインフルエンザに対する早期免疫を与えることができ、さらに、長期間のインフルエンザウイルス免疫を与えることができる。

本発明に従って使用するためのワクチンのターゲット用量あたりの体積は、意図された適用経路に従って最適化することができる。卵内接種は一般に約０．０１～約０．５ｍｌ／卵の用量で適用され、非経口注射は一般に約０．１～約１０ｍｌ／ターゲットの用量で行われる。

本発明に従って使用するためのワクチンの免疫学的有効量が何であるかの判定、または用量あたりのワクチンの体積の最適化は、いずれも十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明に従って使用するためのワクチンをターゲットの生物に適用するための投与レジメンは、ワクチンの製剤と適合する様式で、免疫学的に有効であるような量での単回または複数回の投与であり得る。

好ましくは、本発明に従って使用するためのワクチンを投与するためのレジメンは、ターゲットへのストレスを軽減し、労働コストを削減するために、ターゲットが必要とし得る他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに統合される。これらの他のワクチンは、それらの認可された使用に適合する様式で、同時、並行、または逐次の様式で投与することができる。

好ましくは、本発明に従って使用するためのワクチンは、単回注射として１回のみ投与される。

本発明に従って使用するための組換えベクターによる、前記ベクターを含む宿主細胞による、または本発明に従って使用するためのワクチンによる治療のためのターゲットが鳥類である場合、治療は、好ましくは非常に早い時期である孵化日（「１日目」）、または卵内、例えば胚発生の１８日間に適用され、全て当技術分野で周知である。

本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してこれから説明する。

［実施例］
［実施例１］
組換え構築物の調製
１．１．ＨＶＴワクチン：
ＨＶＴウイルスベクターワクチンは、本質的に国際公開第２０１２／０５２３８４号および国際公開第２０１６／１０２６４７号に記載されているように、トランスフェクション、組換え、選択および増幅のための方法を使用して調製した。ＨＶＴでは、フルＨ５ ＨＡ遺伝子およびＨ５ ＨＡステムをコードする構築物（配列番号７）をＰＲＶ ｇＢ遺伝子プロモーターによって駆動し、発現カセットをＨＶＴゲノムのＵｓ２遺伝子座に挿入した。

１．２．レプリコン粒子
ＶＥＥＶ ＲＰは、国際公開第２００５／１１３７８２号、国際公開第２００８／１５６８２９号およびＫａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１７２３－１７２７）に記載されているように、スプリットヘルパーシステムを使用して構築、製造および選択された。

ＲＰに使用したインサートは、ニワトリでの実験用のＨ５ ＨＡステムをコードする構築物（配列番号７）およびＨ９ ＨＡステムをコードする構築物（配列番号１１）、ならびにブタで使用するためのＨ１ ＨＡステムをコードする構築物（配列番号３）であった。ブタでの動物実験における使用の詳細は、国際公開第２０１９／１１０４８１号に記載されている通りであった。

１．３．プラスミド
ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡ試料は、ｐＦＲＴまたはｐＶＡＸ１シリーズの発現プラスミドをベクターとして使用してこれらを送達したことを除いて、ＨＶＴ実験およびＲＰの実験で使用した本質的に同じＨＡステムをコードするインサートを有していた。

ｐＦＲＴまたはｐＶＡＸプラスミドを含む形質転換大腸菌Ｋ１２をＬＢ培地で増幅した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、プラスミドＤＮＡの単離を行った。プラスミドＤＮＡを注射用水またはＴＥ緩衝液に溶出した。

［実施例２］
ＳＰＦおよびＭＤＡ＋ニワトリにおけるワクチン接種誘発実験
２．１．序論
２．１．１．目的
目的は、高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）Ｈ５Ｎ１ウイルスによる実験的誘発感染に対する１日齢のＭＤＡ＋またはＳＰＦのニワトリにおける防御を与える能力について、種々のタイプのインフルエンザワクチンを評価することであった。誘発は、既存の抗体および異なる力価を有するかまたは有さないターゲットにおけるワクチン有効性の様々な局面を判定するために、ＳＰＦのヒヨコについては２週間および３週間のｐ．ｖ．で、ＭＤＡ＋のヒヨコについては４週間または５週間のｐ．ｖ．（ｐ．ｖ．）で行った。

インフルエンザワクチンの有効性を試験するためのモデルとして、最も信頼できるパラメータは、ターゲット動物の死亡率ならびに誘発ウイルスの複製および排泄のスコアリングである。これは、例えば、ＯＩＥ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ａｎｉｍａｌｓ ２０１５，ｃｈａｐｔｅｒ ２．３．４Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａに記載されている。

２．１．２．試験設計
この研究のために、ｎ＝８０（＋ｎ＝４予備）の１日齢の健康なＭＤＡ＋およびｎ＝５５（＋ｎ＝４予備）の１日齢の健康なＳＰＦ産卵鶏のニワトリを使用し、研究の０日目、Ｄ８、Ｄ１４およびＤ２１に、契約研究機関（ＣＲＯ）に輸送した。ＳＰＦのヒヨコは、（とりわけ）インフルエンザウイルスに対する抗体について陰性であった。

この研究のために、ｎ＝２０羽の１日齢の健康なＭＤＡ＋ニワトリおよびｎ＝１０羽の１日齢の健康なＳＰＦ産卵鶏のニワトリを、０日目、７日目、１４日目および２１日目の採血に使用し、これらを研究のＤ０、Ｄ８、Ｄ１４およびＤ２１でＣＲＯに輸送した。

ヒヨコを１０の群に分け、表３に示すように到着日に免疫した。

研究の間、ニワトリを２つの動物室に収容し、処置群（Ｔ０１～Ｔ０５、Ｔ０６～Ｔ１０）ごとに別々の畜舎に入れ続けた。

誘発の日に、ニワトリを血清学のためにサンプリングした（研究３５日目）。全てのニワトリに、誘発ウイルスＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／０１／２００５（クレード２．２．１）を接種した。誘発感染後１０日間、ニワトリを臨床疾患および死亡率について１日少なくとも２回モニタリングし、誘発感染後（ｄｐｃｉ）１、２、３、５および７日目に、チョアナスワブを１日１回収集した。ｄｐｃｉ１０において、誘発感染から生き残った全てのニワトリを安楽死させることによって、研究を終了した。

研究はＤ４５で終了した。

２．２．材料および方法
２．２．１．試験物
ＨＶＴワクチンを、感染初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の懸濁液として使用した。材料を使用するまで液体窒素に保存し、次いで市販のＨＶＴ希釈緩衝液Ｓｏｌｖｅｎｔ ＣＡ（商標）（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）で希釈し、次いで周囲温度に保ち、再構成の１時間以内に使用した。

ＨＶＴワクチンを、０．２ｍｌの動物用量あたり２，０００ＰＦＵで使用し、研究の０、８、１４、または２１日目に、首に皮下（ｓｃ）投与した。処置群あたり１つの注射器および針を使用した。

試験物：ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ遺伝子インサートのベクターワクチン
使用したＨＶＴベクター構築物は、完全なＨ５ ＨＡ遺伝子を駆動する仮性狂犬病ウイルスｇＢ遺伝子プロモーター、およびヒトＣＭＶ最初期遺伝子１プロモーターを含み、ＮＤＶ Ｆ遺伝子、それによってＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｍを駆動する。＋ＨＡ遺伝子インサートは、国際公開第２０１２／０５２３８４号に記載されている通りで、ｈＣＭＶ ＩＥ１ ｐｒｏｍ＋Ｆ遺伝子インサートは、国際公開第２０１６／１０２６４７号に記載されている通りである。これらのそれぞれのプロモーター＋遺伝子のインサートは、ＨＶＴゲノムのＵｓ２遺伝子座にテールヘッドで挿入される。二重カセットは、ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子由来の下流転写ターミネーターを含む。

試験物：ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムのベクターワクチン
Ｈ５ ＨＡステムポリペプチドを送達および発現するために使用されるＨＶＴベクターは、本質的に国際公開第２０１２／０５２３８４号に記載されているような構築物であり、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされ、ＨＶＴゲノムのＵｓ２遺伝子座に挿入されたＨ５ ＨＡステムポリペプチドを駆動する仮性狂犬病ウイルスｇＢ遺伝子プロモーターを含み、転写ターミネーターが続いた。

誘発ウイルス：ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ ｓｔｒａｉｎ Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ ／１／２００５
誘発ウイルスを、０．２ｍｌ中で約６Ｌｏｇ１０ ＥＩＤ５０（つまり、５Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０の当量）に希釈するまで－８０℃に保った。接種材料を使用するまで氷上で維持し、残りの接種材料を逆滴定して、投与された実際の誘発用量を決定した。

誘発ウイルスを、０．１ｍｌの鼻腔内（一方の鼻孔）および０．１ｍｌの気管内として投与した。

ＮＢ：毒性インフルエンザウイルスの作業には、適切な許可およびバイオセーフティ予防措置が必要である。

２．２．２ 試験動物
１日齢で性が混合している１３５羽の白色レグホン産卵鶏のニワトリを研究に使用し、健康な動物のみをＣＲＯに輸送した。ニワトリは、到着時に健康状態が良好でないように見えた場合、この研究から除外した（研究０日目）。ワクチン接種の前に、ニワトリを入手したときに首にスワイフトタックのラベルを付けて識別し、表３に示すように番号を付けた。ＭＤＡ＋；研究内でｎ＝８０、Ｔ＝０およびＴ＝７の血液についてｎ＝２０、および予備ｎ＝４；ＳＰＦ：研究内でｎ＝５５、Ｔ＝１４およびＴ＝２１の血液についてｎ＝１０、予備ｎ＝４。

ＭＤＡ＋のヒヨコは、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／０１／２００５（クレード２．２．１）から調製した不活化アジュバント添加ＡＩＶワクチンをワクチン接種したＳＰＦ産卵鶏ニワトリの子孫であった。その結果、ＭＤＡは、最悪のシナリオを作り出すために、コードされたＨ５ ＨＡステムポリペプチドと相同であった。

到着日に１日齢のニワトリを免疫した。Ｔ０１、Ｔ０５およびＴ０８群のワクチン接種していないニワトリは、それぞれ１４、２８および３５日間の順化期間を有した。

物理的接触を防ぐために、ニワトリを適切な条件下で、処理群（最大ｎ＝１５）ごとに、閉じた壁を有する別々の畜舎に群で収容した。

２．２．３．実験手順
一般的な健康状態が、バイオ技術者によって１日に少なくとも１回観察され、文書化され、必要なときに獣医が呼ばれた。

インフルエンザの徴候についての臨床観察を、誘発ウイルス接種の日から接種後１０日まで毎日、動物技術者によって実施し、記録した。接種前に第１の観察を行った。臨床所見は、うつ病、鼻汁、くしゃみ、呼吸、皮膚の異常、浮腫、神経学的徴候、および下痢の徴候の重症度を増加させるためにスコア０～３のスコアリングシステムに従って実施した。

血清学のための血液試料（動物につきおよそ２ｍＬ）を、研究２０日目に全てのニワトリから翼静脈から採取した。凝固および遠心分離（１３００×ｇで１０分）後に血清を単離した。血清試料を－２０℃で保存した。

３６、３７、３８、４０、および４２日目に、全てのニワトリからチョアナエスワブ試料を収集した。綿棒（乾燥レーヨンチップ、Ｃｏｐａｎ １５５Ｃ）を用いて試料を収集した。サンプリング直後に、スワブを、抗生物質を補充した約２ｍＬのトリプトースリン酸緩衝液の中で撹拌し、実験室へ輸送している間は氷を融解させたままにした。死亡が発見されたニワトリはサンプリングせず、瀕死のニワトリは安楽死させる前にサンプリングした。実験室では、スワブを圧搾して除去し、試料を遠心分離し（１０分、１３００×ｇ）、上清を－８０℃で保存した。

ニワトリが最初の観察でうつ病、呼吸窮迫もしくは神経障害の重度の症状（スコア３）を示し、または２回目の観察でうつ病、呼吸窮迫もしくは神経障害の中等度の症状（スコア２）を示した場合、実験動物の人道的エンドポイントとしての臨床徴候の認識、評価および使用に関する基準に基づいて安楽死させた。

寿命期の完了後、インフルエンザの徴候についての臨床所見を動物および研究日ごとにまとめた。処置群ごとに、臨床スコアの中央値を計算し、経時的にグラフで表示した。また、重症度スコアの頻度（日数）、合計および分布を算出した。

ワクチン抗原および誘発抗原に相同なＨＡ抗原を使用して、血清試料に対して赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイを実施した。また、試料を特異的ＡＩＶ－Ｈ５ ＨＡ阻害ＥＬＩＳＡ（ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｈ５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ（ＩＤＶｅｔ））に供した。血清試料からのＨＩ力価およびＥＬＩＳＡスコアを動物および研究日ごとにまとめた。処置群ごとに、平均力価を計算した。

インフルエンザリアルタイムｑＰＣＲを行うために、チョアナエスワブ試料を使用した。Ｃｔ値を動物および研究日によりまとめた。処置群ごとに、平均Ｃｔ値を計算し、経時的にグラフで表示した。さらに、平均ピークＣｔ値および陽性のＰＣＲの結果が得られた日数を計算した。

試験が有効であることが判明するとき：１日齢のＳＰＦ幼体およびワクチン接種していないＳＰＦ幼体から採取した血清試料がＡＩＶ－Ｈ５に対する抗体を含まない場合。また、ワクチン接種されていない誘発されたニワトリは、誘発後１０日以内に死亡させる必要があった。

２．３．結果
実験中であるが誘発前に数羽のヒヨコが死亡した。原因は究明できなかったか、または試験とは無関係であった。

２．３．１．誘発
誘発用量を判定するために、非希釈誘発ウイルス、誘発前の希釈ウイルス、および誘発後に動物用施設から戻ってきた希釈誘発ウイルスを、ＴＣＩＤ５０アッセイに供した。希釈後（投与前および投与後）の力価の平均を使用して接種用量を計算し、これを動物あたり１０の３．９５乗のＴＣＩＤ５０で判定した。

誘発後、死亡率および罹患率を１０日間モニタリングした。全ての非免疫化ＳＰＦニワトリは、誘発前または誘発後２日目に死亡したか、または安楽死させなければならなかったので、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１の誘発は重度であり、非常に有効なものであった。孵化４週間後の非免疫化ＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物の誘発は７０％の死亡率をもたらし、これは、残留ＭＤＡ力価が依然として誘発された動物の部分的な防御をもたらしたことを示している。対照的に、孵化後５週間では、ＭＤＡ力価はもはや防御的ではなかった。

２．３．２．生存に対するワクチン接種の効果
ＳＰＦの動物では、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチン接種は、誘発させた動物において２週間および３週間のｐ．ｖ．で１００％の生存率をもたらした。したがって、ＳＰＦの動物におけるＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンの免疫開始（ＯＯＩ）は２週間未満である。ＳＰＦの動物におけるＨＶＴ－Ｈ５ＨＡステムワクチンの有効性は、その発症がわずかに遅れたため、３週間のｐ．ｖ．でのみ判定された。ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムは６０％の部分的な防御をもたらしたので、ＳＰＦの動物におけるその免疫開始は３週間を過ぎている。

しかし、ＳＰＦの動物での結果とは対照的に、ＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物では、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡは、４週間および５週間でそれぞれ４３％および４６％の防御しかもたらさなかった。驚くべきことに、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物において８６％および９３％の防御をもたらした。

２．３．３．誘発ウイルス複製
誘発後１、２、３、５および７日目に、非免疫化ニワトリ（ｎ＝５）および免疫化ニワトリ（ｎ＝１０）からチョアナスワブを採取し、気管内のＡＩＶ ＲＮＡ量を測定することによって、誘発ウイルス複製を判定するために使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、標準偏差（ＳＤ）を含むＰＣＲ等価ウイルス力価（ＥＩＤ５０当量）として示された。免疫化されていないＳＰＦニワトリは、誘発後１日目に、気管におけるウイルス複製負荷が高かった（平均１０の４．３乗のＥＩＤ５０当量）。非免疫化ＡＩＶ ＭＤＡ＋のニワトリでは、孵化後４週間および５週間で、力価はそれぞれ１０の３．２乗および１０の３．８乗のＥＩＤ５０当量であった。

ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡをワクチン接種したＳＰＦの動物における誘発ウイルスの力価は、２週間のｐ．ｖ．で２Ｌｏｇ１０、３週間のｐ．ｖ．で＞４Ｌｏｇ１０減少した。ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンによるＳＰＦの動物のワクチン接種は、誘発ウイルス複製の１Ｌｏｇ１０の減少しかもたらさなかった。

ＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物のワクチン接種は、特にＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンについて、生存に強い影響を及ぼしたが、気管における誘発ウイルス複製に対する影響はわずかであった。ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡによるＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物のワクチン接種も、わずかな効果しか有さず、ウイルス量の減少は１Ｌｏｇ１０未満であった。ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、４および５週のｐ．ｖ．両方で、１～２Ｌｏｇ１０の間での誘発ウイルス複製の減少をもたらした。

２．３．４．血清学的結果
２．３．４．１．赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価
誘発前に単離した血液からの血清を、ＨＡ抗原を使用するＨＩアッセイに使用した。ＨＩ力価を２連で判定した。予想通り、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ヘッドドメインに対する抗体のみが赤血球凝集を阻害することができるので、赤血球凝集阻害をもたらす抗体を誘導しなかった。

全てのＳＰＦ孵化交配体（対照、Ｔ＝０）は陰性であり、２週間のｐ．ｖ．で非免疫化ＳＰＦの動物と同じであった。ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチン接種は、２週のｐ．ｖ．で１４匹の動物のうち１２匹のセロコンバージョンをもたらし、平均ＨＩ力価は１０．２であった。３週のｐ．ｖ．で、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡは、１４匹の動物のうち１３匹のセロコンバージョンをもたらし、平均ＨＩ力価は５２．８であった。

全てのＡＩＶ ＭＤＡ＋孵化交配体（対照、Ｔ＝０）は、４６．９の平均力価でＨＩ試験において陽性であった。力価は、孵化後４週間および５週間で２未満の値に低下した（対照）。驚くべきことに、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡは、ワクチン接種時にＭＤＡ＋のヒヨコにおいて４および５週のｐ．ｖ．でいかなるセロコンバージョンも誘導することができなかった。

２．３．４．２．ＡＩＶ－Ｈ５特異的ＥＬＩＳＡ
市販の阻害ＥＬＩＳＡ試験キット（ＡＩＶ－Ｈ５ ＥＬＩＳＡ、ＩＤＶｅｔ）を製造者の説明書に従って使用して、実験中にヒヨコから得られた血清試料を試験した。

ワクチン接種前に採取したＳＰＦ孵化交配体由来の血清は、０％の阻害力価を示した。また、非免疫化ＳＰＦの動物（陰性対照）は、バックグラウンドレベルである７％の阻害を示した。

ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるワクチン接種後のＳＰＦの動物におけるＥＬＩＳＡ力価は、２～３週のｐ．ｖ．からゆっくりと増加した。阻害力価は２週のｐ．ｖ．での３５％から３週のｐ．ｖ．での５７％に至った。

ＳＰＦの動物で誘導されたこれらの比較的高い抗体力価とは対照的に、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるＭＤＡ＋の動物のワクチン接種は、４週間のｐ．ｖ．にわずか３２％の阻害および５週間のｐ．ｖ．に２２％の阻害をもたらした。これらのＨ５抗体力価は、非免疫化ＭＤＡ＋の動物で観察された阻害性抗Ｈ５力価と同等であった。その結果、ＨＶＴ－フルＨＡ Ｈ５ワクチンは、ワクチン接種時に存在するＭＤＡ力価によって重度に阻害された。

ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンによるＳＰＦの動物のワクチン接種は、３週間のｐ．ｖ．で３３％の阻害力価をもたらした。したがって、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＳＰＦのヒヨコにおけるフルＨＡベクターワクチンと比較して、ＳＰＦの動物において比較的低い力価を誘導する。

しかし、驚くべきことに、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンを接種したＭＤＡ＋の動物は、４週間のｐ．ｖ．に４１％、５週間のｐ．ｖ．に４４％の阻害Ｅｌｉｓａ力価を有していた。したがって、これらの力価は、３週間のｐ．ｖ．にＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチン接種ＳＰＦの動物と比較して高く、非ワクチン接種ＭＤＡ＋対照と比較してはるかに高かった。したがって、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ワクチン接種時に存在するＡＩＶ－Ｈ５ ＭＤＡ力価の影響を受けない。

２．４．結論
１日齢のＳＰＦおよびＡＩＶ ＭＤＡ＋のニワトリにおいて、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡおよびＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンを評価した。ＳＰＦの動物を２週間のｐ．ｖ．および３週間のｐ．ｖ．で同種のＨ５Ｎ１の誘発に供し、ＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物を４週間のｐ．ｖ．および５週間のｐ．ｖ．で誘発した。気管における血清学的応答、死亡率および誘発ウイルス複製を評価した。

ＳＰＦの動物では、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチン接種は、１００％の防御で２週間未満のＯＯＩをもたらした。誘発ウイルス力価は、２週間のｐ．ｖ．で２Ｌｏｇ１０減少し、３週間のｐ．ｖ．で＞４Ｌｏｇ１０減少した。１００％の防御は、２週間のｐ．ｖ．および３週間のｐ．ｖ．での高いＨＩ力価およびＨ５ ＥＬＩＳＡ力価と良好な相関関係があった。驚くべきことに、いくつかのニワトリはＨＩ力価が２未満であったが、これらは依然としてＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１誘発に対して防御された。したがって、ＨＩ力価は必ずしも防御と相関しない。

ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンと比較して、ＳＰＦのニワトリではあまり機能しなかった。３週間のｐ．ｖ．で、ニワトリの６０％のみが防御された。また、気管における誘発ウイルス複製の減少は、１Ｌｏｇ１０だけ減少した。

ＳＰＦの動物におけるＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによる良好な防御とは極めて対照的に、このワクチンはＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物において機能が非常に不良で、４週間のｐ．ｖ．および５週間のｐ．ｖ．での防御はそれぞれわずか４３％および４６％であった。この防御が不十分であることはまた、血清学的応答が不十分であることと、気管における誘発ウイルス複製に対する効果に限界があることと相関する。明らかに、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンは、高いＡＩＶ Ｈ５ ＭＤＡレベルによって激しく妨害される。

興味深いことに、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンはＳＰＦの動物では機能が不良であったが、ワクチンはＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物においてそれぞれ４週間および５週間のｐ．ｖ．で８６％および９３％の防御を誘発した。また、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンと比較して、気管内のウイルス力価をより効率的に低下させた。効率的な防御はまた、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチン接種ニワトリにおける誘発日のより高い抗体力価と相関する。

結論として、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンは、ＳＰＦの動物では２週間未満の免疫開始（ＯＯＩ）を有するが、ＭＤＡ力価によって強く損なわれる。ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＳＰＦの動物において３週間超のＯＯＩを有するが、４および５週間でインフルエンザＭＤＡの状況において高レベルの防御を誘発する。したがって、本発明のＨＡステムポリペプチドである抗原によるワクチン接種は、既存のインフルエンザ抗体によって影響されない。

［実施例３］
既存の抗体なしのニワトリにおける試験
上記の実施例２に記載されるような実験は、ＳＰＦのニワトリで行われ本発明者らによる最初の実験に成功した。それは、一部期待外れの結果をもたらした。上部の実施例２に記載したものと同じ一般的な設定およびパフォーマンスの実験において、異種ＡＩＶ Ｈ５Ｎ１株を使用して、３週間のｐ．ｖ．での重度のインフルエンザウイルス誘発感染に対する異なるＨＡステムポリペプチドの防御効力を試験した。最初の実験として、これを既存のインフルエンザ抗体のないターゲット動物、すなわちＳＰＦのニワトリで行った。試験した異なる種類のＨＡステムポリペプチドワクチンは、精製サブユニット、２種類のＨＶＴベクターワクチン、およびＲＰワクチンであった。

３．１．材料および方法
具体的には、ワクチンを以下のように調製した：
－サブユニットワクチンは、配列番号７と同じアミノ酸組成のＨ５ ＨＡステムポリペプチドを含有していたが、ａａ番号２７２までしか含有しておらず、したがって、ＨＡ２のＴＭおよび細胞質ドメインを含有していなかった。精製目的のために、それはＣ末端Ｆｌａｇタグ／ＥＫ切断部位を含み、その後に三重Ｓｔｒｅｐタグが続いた。サブユニットをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させ、精製し、油中水型エマルジョンとして製剤化した標準流動パラフィン鉱油でアジュバント化した。サブユニットを４μｇ／動物用量で投与した。

－ＨＶＴベクターワクチンは、配列番号７のＨ５ ＨＡステムポリペプチドを含むか、またはフルＨ５ ＨＡタンパク質を含有した。

－ＲＰは、配列番号７のＨ５ ＨＡステムポリペプチドを含むＶＥＥＶベースのＲＰであった。ＲＰを本質的に記載されるように調製し、精製した。ＲＰを水性緩衝液において１×１０の８乗のＲＰ／動物の用量で投与し、Ｏ／ＷエマルジョンとしてＸＳｏｌｖｅ（商標）アジュバント（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）を１：１でアジュバント化した。

本発明者らの意図の１つは、国際公開第２０１３／０７９４７３号およびＩｍｐａｇｌｉａｚｚｏ（上掲）による対応する論文に記載されているＨＡステムポリペプチドの防御特性を確認することであった。しかし、これは予想外に不良の結果をもたらした。

実施例２と同様に、ニワトリに、０．２ｍｌのＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステム、ＶＥＥＶ－Ｈ５ ＨＡステムＲＰ、またはアジュバント添加ＨＡステムサブユニットワクチンを、１日齢でｓｃ経路によりワクチン接種した。５羽のヒヨコの群は未処置のままであり、１０羽のヒヨコの群はワクチン接種していない誘発対照とした。血清試料をＴ＝０（ワクチン接種日）およびＴ＝２０（誘発の１日前）で採取し、ＨＩ試験およびＨ５特異的ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。Ｔ＝２１で、動物は致死量のＨＰＡＩ ＡＩＶ株：Ａ／ｄｕｃｋ／Ｂｉｄｄｉｎｇｈｕｉｚｅｎ／ＮＬ／２０１６（Ｈ５Ｎ８、クレード２．３．４．４）で誘発され、罹患率および死亡率を１０日間追跡した。誘発ウイルス複製を判定するために、気管スワブを採取し、インフルエンザウイルスＭ遺伝子特異的ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを用いて分析した。

３．２．結果
結果は、全ての対照が予想通りであったことを示した。全てのワクチン接種されていない誘発されたヒヨコは、誘発から２日目までに死亡したか瀕死であり、陰性対照は、ＨＩおよびＥＬＩＳＡにおいて血清陰性であった。さらに、フルＨＡタンパク質をワクチン接種した全てのヒヨコは強いＨＩ力価を示し、全ワクチン接種はバックグラウンドの値を上回るＥＬＩＳＡ力価を示し、全ワクチンが適切に投与されたことを示した。

誘発１０日後のワクチン接種群の誘発生存率の結果は以下の通りであった：
－ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ：１００％
－ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステム：７０％
－ＶＥＥＶ－Ｈ５ ＨＡステムＲＰ：８０％
－Ｈ５ ＨＡステム可溶性サブユニット：０％
ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンは、ワクチン接種３週間後に強いセロコンバージョンを誘導した。強い血清学的事象は、同種および異種誘発に対するＳＰＦのニワトリにおけるこのワクチンの１００％防御と良好に相関した。興味深いことに、このように、完全なＨＡタンパク質は、血清陰性動物においてワクチンとして非常によく機能した。既存のインフルエンザ抗体である動物に適用した場合、実施例２で見出された結果とはかなり対照的である。

驚くべきことに、ＨＡステムサブユニットワクチンは、ニワトリをＨＰＡＩ誘発から防御しなかった。死亡はある程度遅れたが、この群の全てのヒヨコは４日のｐ．ｃ．までに死亡したか瀕死であった。この結果は、公開時の陽性の報告とは純粋に対照的であった。

しかし、ＨＡステムポリペプチドにＴＭドメインが与えられた場合、ウイルスベクターによって送達された場合およびＲＰとして送達された場合の両方で、有意なレベルの防御があった。

使用したＨ５Ｎ８誘発株は、９１．７％のａａ配列同一性を有するため、ワクチンと異種であった。

３．２．１．血清学
市販の阻害ＥＬＩＳＡ試験キット（ＡＩＶ－Ｈ５ ＥＬＩＳＡ、ＩＤＶｅｔ）を製造者の説明書に従って使用して、実験中にヒヨコから収集された血清を試験した。

ワクチン接種前のＳＰＦの動物（孵化交配体）の血清は、バックグラウンドレベル範囲内であるわずか４％の阻害を示し、同じことが、３週間のｐ．ｖ．でのワクチン接種されていない対照の力価にも当てはまり、これはわずか２％の阻害を示し、ＳＰＦのヒヨコに抗Ｈ５ ＨＡ抗体が全く存在しないことを実証した。

ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるＳＰＦの動物のワクチン接種後、５８％の阻害力価が３週間のｐ．ｖ．で見られた。これは、実施例２に提示された結果と非常によく相関する。

同様に、本発明によるＨＡステムポリペプチドを発現するベクターワクチンでＳＰＦヒヨコをワクチン接種すると、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンでは３２％、ＶＥＥＶ－Ｈ５ ＨＡステムＲＰワクチンでは２８％の阻害力価が得られた。これらの結果はいずれも実施例２で見出されたものと一致する。

最後に、サブユニットワクチンとして可溶性ＨＡステム抗原をヒヨコにワクチン接種すると、ＥＬＩＳＡにおいてわずか９％の阻害で力価が誘導された。

これらのＥＬＩＳＡ力価は、この実験で見出された誘発・生存結果と非常によく整合する。また、それらは、本発明のＨＡステムポリペプチドを膜結合抗原（したがって、ＴＭドメインを有する）として、組換えベクターワクチンを介して発現させると、可溶性ＨＡステム抗原に基づくサブユニットワクチンと比較してより強力な免疫応答が誘導されることを示している。

［実施例４］
誘発防御の拡張試験
４．１．序論
上記の実施例２および３のようなさらなる実験で、既存のインフルエンザ抗体ありおよびなしのニワトリにおいて、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ ＡＩＶ誘発ウイルスに対する防御を再度試験した。しかし、より「野外様」の条件下でのワクチンの有効性を判定するために、ワクチン接種動物を誘発感染させ、ワクチン接種非誘発センチネル動物と共に収容する接触誘発モデルを使用した。対照として、非ワクチン接種動物も抗原刺激し、非ワクチン接種非誘発センチネルと一緒に収容した。誘発ウイルス複製を気管スワブを介して測定し、誘発ウイルス排出をクロアカスワブを介して試験した。

ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡおよびＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンを、ＳＰＦまたはＡＩＶ Ｈ５ ＨＡ ＭＤＡ＋（上記のような、ワクチン接種されたＳＰＦの子孫）のいずれかである１日齢のニワトリにおいて評価した。ワクチン接種対照ＳＰＦの動物または非ワクチン接種対照ＳＰＦの動物の半分を、５週間のｐ．ｖ．でＨ５Ｎ１誘発ウイルスによる誘発に供した。ＡＩＶ ＭＤＡ＋ワクチン接種動物または非ワクチン接種動物の半分を、同様の誘発に供したが、６週のｐ．ｖ．であった。誘発後８時間で、直接誘発した動物群にセンチネル鳥を加えた。気管における血清学的応答、死亡率および誘発ウイルス複製ならびにクロアカにおけるウイルス排出を評価した。

同様の防御レベルが実施例１および２に記載されているように見出され、本発明に従って使用するためのワクチンによる誘発ウイルスの伝染も良好に減少した。

４．２．セットアップ
実験開始前に、５匹のＳＰＦおよび１０匹のＭＤＡ＋のニワトリ孵化交配体から対照血液試料を採取して、０日目の抗体の状態を判定した。対照を除いて、ＳＰＦ群とＭＤＡ＋群の両方が７６羽のヒヨコを有し、これらを次に、種々の処置にわたって分けられた、非ワクチン接種／フルＨＡ／ＨＡステムワクチン、誘発／誘発なし、およびセンチネル／被験動物という別々の群に分けた。最低レベルでは、各試験群は６羽のヒヨコを有していた。ワクチンを１日目に、０．２ｍｌ中約２，０００ＰＦＵ／用量で、ｓｃ経路によって、意図した群に投与した。誘発直前に、３５日目（ＳＰＦ）および４２日目（ＭＤＡ＋）に、ＨＩ試験のためにそれぞれの動物の血液試料を採取した。誘発ウイルスは、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／０１／０５（クレード２．２．１）であった。投与された誘発用量は、それぞれ、１０の３．６乗、１０の３．２乗のＴＣＩＤ５０／動物であると判定された。誘発を受けた動物は、誘発の８時間後までセンチネルと組み合わせなかった。誘発したニワトリから１日目、２日目、３日目、４日目、６日目および８日目のｐ．ｃ．にクロアカスワブ試料を採取した。綿棒（乾燥レーヨンチップ、Ｃｏｐａｎ １５５Ｃ）を用いて試料を収集した。サンプリング直後に、スワブを、抗生物質を補充した約２ｍＬのトリプトースリン酸緩衝液の中で撹拌し、実験室へ輸送している間は氷を融解させたままにした。実験は、誘発の２週間後、それぞれ４９日目、５６日目に終了した。

４．３．結果
４．３．１．死亡
結果は再び、全ての対照が予想通りであることを示した。全てのワクチン接種されていない誘発されたヒヨコは、誘発から２日目までに死亡したか瀕死であり、陰性対照は、ＨＩおよびＥＬＩＳＡにおいて血清陰性であった。ワクチン接種されていない誘発されたＭＤＡ＋のヒヨコは、誘発後３日目～６日目の間に死亡したか、または安楽死させなければならず、平均死亡時間は４．３日であった。したがって、ＭＤＡレベルは、いくらかの防御を誘発したが、致死的攻撃に耐えるには十分ではなかった。フルＨＡタンパク質をワクチン接種した全てのヒヨコは強いＨＩ力価を示し、全ワクチン接種はバックグラウンドの値を上回るＥＬＩＳＡ力価を示し、全ワクチンが適切に投与されたことを示した。

ワクチン接種されておらず、誘発された動物と接触している全てのＳＰＦセンチネル動物は、死亡したか、または誘発後３日目から７日目まで安楽死させなければならなかった。また、誘発された動物と接触しているワクチン接種されていないＭＤＡ＋センチネル動物は全て、誘発後６日目から１１日目まで死亡したか、または安楽死させなければならなかった。その結果、誘発を受けた動物からセンチネル動物へのＨ５Ｎ１ ＴＴ０５ウイルスの伝達は非常に堅牢であった。

試験群の結果：
ＳＰＦの動物－ワクチン接種： 生存 センチネルへの伝播の減少
直接誘発：
－ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ： １００％ ８９％
－ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステム： ７２％ ７２％
センチネル：
－ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ： １００％ －－
－ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステム： １００％ －－
ＭＤＡ＋の動物－ワクチン接種：
直接誘発：
－ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ： ２２％ ５６％
－ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステム： ８３％ ８９％
センチネル：
－ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡ： ７８％ －－
－ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステム： １００％ －－
ＳＰＦの動物では、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチン接種は、５週のｐ．ｖ．で誘発動物を１００％防御した。この結果は、以前の試験で見られたものを確証させ、完全に一致した。

しかし、やはり、６週間のｐ．ｖ．で誘発したＭＤＡ＋の動物におけるＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンは、動物の２２％を死から防御することしかできなかった。これは、実施例２において４および５週のｐ．ｖ．で測定された４３％および４６％の防御と比べてかなり劣悪なものであった。

重度の誘発に対するＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンによって得られる防御は非常に効果的であり、６週間のｐ．ｖ．で８３％の生存率を与えた。これらの結果は、本発明によるＨＡステムポリペプチドを含むワクチンが、高いレベルの既存のインフルエンザＨＡ抗体によって妨害されないことを示す。

４．３．２ 誘発ウイルスの伝播の低減
誘発ウイルスは、非ワクチン接種ＳＰＦの動物およびＭＤＡ＋の動物から非ワクチン接種センチネルＳＰＦの動物およびＭＤＡ＋の動物に、効率的に伝播された。ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるＳＰＦの動物のワクチン接種は、誘発ウイルスの伝播を検出不能なレベルまで減少させた。対照的に、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるＭＤＡ＋の動物のワクチン接種は、ある程度の伝播を減少させただけであり、センチネル動物への誘発による伝播を防ぐことはできず、結果として死亡率は均一であった。

ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＳＰＦおよびＭＤＡ＋のニワトリの大部分を誘発による死亡から防御することができた。さらに、ＳＰＦの動物およびＭＤＡ＋の動物の両方において、誘発ウイルスの伝播が完全に阻止された。したがって、既存のインフルエンザ抗体を有する集団における本発明によるＨＡステムポリペプチドの使用は、ほとんどのターゲットを臨床疾患から防御し、ウイルスの伝播を完全に遮断する。

ワクチン接種動物およびセンチネル動物におけるウイルス複製の結果は同様のパターンを示し、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンはＳＰＦでは有効であるがＭＤＡ＋の動物では有効ではなく、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンについては逆の結果であった。

４．３．３．血清学
０日目のＭＤＡ＋孵化交配体におけるＨＩ力価は１５９であり、これは実施例２に記載される実験におけるＨＩ力価よりもかなり高かった。

市販の阻害ＥＬＩＳＡ試験キット（ＡＩＶ－Ｈ５ ＥＬＩＳＡ、ＩＤＶｅｔ）を製造者の説明書に従って使用して、実験中にヒヨコから得られた血清試料を試験した。

ワクチン接種前のＳＰＦの動物（孵化交配体）の血清は５％の阻害を示し、ワクチン接種していないＳＰＦの動物（陰性対照）は両方ともバックグラウンドのレベルで６％の阻害を示した。

ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるＳＰＦの動物のワクチン接種は、５週間のｐ．ｖ．で８２％の阻害力価をもたらした。ＳＰＦ動物におけるこれらの高い抗体力価とは対照的に、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンでワクチン接種したＡＩＶ－Ｈ５ ＭＤＡ＋動物は、６週間のｐ．ｖ．で血清を産生し、わずか３８％阻害であった。これらのＨ５抗体価は、ワクチン接種していないＭＤＡ＋動物で観察された２６％よりわずかに高いだけであり、これは、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンが、ワクチン接種日に既存のＡＩＶ－Ｈ５抗体価によって激しく妨害されたことを示している。

ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンによるＳＰＦの動物のワクチン接種は、５週間のｐ．ｖ．で４８％の阻害力価をもたらした。驚くべきことに、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンによるＡＩＶ－Ｈ５ ＭＤＡ＋動物のワクチン接種は、６週間のｐ．ｖ．で５３％の血清の阻害をもたらした。これらのＨ５抗体価は、５週ｐ．ｖ．のＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンＳＰＦ動物のものと比較して高く、非ワクチン接種ＭＤＡ＋動物のものと比較してはるかに高かった。したがって、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ワクチン接種時に既存のＨ５抗体の影響を受けない。

４．４．結論
１日齢のＳＰＦおよびＡＩＶ ＭＤＡ＋のニワトリにて、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡおよびＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンを評価した。ワクチン接種または非ワクチン接種の対照ＳＰＦ動物の半分を５週のｐ．ｖ．でＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ウイルスによる誘発に供した。ワクチン接種または非ワクチン接種のＡＩＶ ＭＤＡ＋動物の半分を６週のｐ．ｖ．で誘発感染に供した。誘発の８時間後、動物の残りの半分を群に加えて、直接誘発された動物からセンチネル動物への誘発ウイルスの伝播を判定した。気管における血清学的応答、死亡率および誘発ウイルス複製ならびにクロアカにおけるウイルス排出を評価した。

ＳＰＦ動物のＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチン接種は、動物の９７％のセロコンバージョンおよび誘発に対する１００％の防御をもたらした。口腔内の誘発ウイルス複製は、２～３Ｌｏｇ１０減少した。ウイルスＲＮＡの排出も、ほぼ検出不能なレベルまで大幅に減少した。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果に基づくと、直接的に誘発された鳥からセンチネル鳥への伝播は８９％減少したが、全センチネル鳥が臨床疾患から防御された。

ＡＩＶ Ｈ５ ＭＤＡ＋の動物のＨＶＴフルＨ５ ＨＡワクチン接種は、６週間のｐ．ｖ．で検出可能なＨＩ力価を誘導しなかった。不良のセロコンバージョンは、誘発後の２２％の不良の防御と相関していた。クロアカからのウイルスＲＮＡの排出は有意に減少したが、口腔内での誘発ウイルス複製は、約１Ｌｏｇ１０しか減少しなかった。しかし、この減少は、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果に基づくと、５６％の伝播率の低下しかなく、センチネル動物に直接誘発することによる伝播を妨げなかった。

ＳＰＦ動物のＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチン接種は、口腔内の誘発ウイルス複製を２Ｌｏｇ１０減少させ、これはＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンの場合よりわずかに効率が低かった。これは、致死的な誘発に対する７２％のわずかに低下した防御と相関していた。誘発を受けた動物からのクロアカからのウイルスＲＮＡの排出は約３Ｌｏｇ１０減少し、その結果、直接的に誘発を受けた鳥からセンチネル鳥への伝播は、ＲＴ－ｑＰＣＲ結果に基づくと、７２％減少した。

ＡＩＶ Ｈ５ ＭＤＡ＋の動物のＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチン接種は、６週間のｐ．ｖ．で８３％の防御をもたらしたが、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンによるワクチン接種後、鳥のわずか２２％しか防御されなかった。さらに、ＡＩＶ Ｈ５ ＭＤＡ＋動物のＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチン接種は、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果に基づくと、伝播を８９％減少させた。

結論として、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンは、伝播を効率的に阻止しながら、致死的なＨ５Ｎ１の誘発に対するＳＰＦのニワトリの防御において、非常に強力である。しかし、ＡＩＶ ＭＤＡ＋の動物では、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンの防御はわずか２２％で、直接誘発した動物とセンチネル動物との間で持続可能な伝播がまたあり、死亡率は２２％であった。これは、ＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンがＡＩＶ Ｈ５ ＭＤＡ力価によって強く影響されることを示す。以前に観察されたように、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは、ＳＰＦ動物において中程度の防御レベルを誘発する。しかし、ＡＩＶ Ｈ５ ＭＤＡ＋動物では、ＨＶＴ－Ｈ５ ＨＡステムワクチンは８３％の防御をもたらし、センチネル動物への伝播を非常に効率的に阻止する。したがって、本発明によるＨＡステムポリペプチドに基づくワクチンは、既存のインフルエンザＨＡ抗体によって影響されないようであり、したがって、この抗原は、ＭＤＡ＋ターゲットに適用された場合、フルＨＡタンパク質に基づくワクチンの免疫学的ギャップを埋めるための解決策であり得る。

［実施例５］
ＨＡステム混合ワクチンの試験
後続の実験において、試験した事柄には、本発明のＨＡステム－ポリペプチドおよびフルＨＡタンパク質とのワクチン併用接種が、これらの各々によって別々にもたらされる免疫防御を改善し得るかどうかということがあった。実験の設定は、ＡＩＶ Ｈ５ ＨＡ ＭＤＡ＋のヒヨコを使用して、大部分は上部の実施例２～４に記載の通りであった。

適用されたワクチン併用接種は、２０００ｐｆｕ／用量の０．２ｍｌ中のＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡをｓ．ｃ．経路で頸部に投与すること、および脚のｉ．ｍ．経路によりＸＳｏｌｖｅで、０．２ｍｌのＯ／Ｗエマルジョン中の１×１０の８乗／用量のＨ５ ＨＡステムポリペプチドのＶＥＥＶ ＲＰを投与することによるものであった。各ワクチンは、本質的に上部の実施例３に記載の通りであった。４０匹のＡＩＶ Ｈ５ ＨＡ ＭＤＡ＋産卵鶏の群に、１日齢のときに混合ワクチン接種を行った。２５羽のヒヨコの群をワクチン接種していないＭＤＡ＋対照とした。ワクチン接種後８週間まで、実験の様々な時点で血液試料を採取した。

５．１．ＥＬＩＳＡによる血清学
市販の阻害ＥＬＩＳＡ試験キット（ＡＩＶ－Ｈ５ ＥＬＩＳＡ、ＩＤＶｅｔ）を使用して、実験全体を通してヒヨコから得た血清試料を試験した。

ＭＤＡ＋孵化交配体から得た血清は、８９％の平均阻害で高いＨ５抗体力価を示した。これらのＭＤＡ力価は、非免疫化動物において、６および７～８週間でそれぞれ２２％および８％に減少した。

混合ワクチンは、ＭＤＡ＋の動物において非常に高い抗Ｈ５ ＨＡ抗体力価を誘導し、全てのヒヨコにおいて、および６、７、および８週のｐ．ｖ．で試験した全ての時点で＞６５％の阻害をスコアリングした。そのような高レベルの抗体は、異種Ｈ５株インフルエンザ感染に対してさえ１００％の防御と相関する。

このような高レベルのＨ５抗体力価は、ＨＡステムポリペプチドワクチンを用いず、確実にＨＶＴ－フルＨ５ ＨＡワクチンを用いない、ＡＩＶＨ５ ＨＡ ＭＤＡ＋の動物のワクチン接種後の前、本発明者らによって達成されなかった。

［実施例６］
ブタにおける試験
６．１．ＭＤＡ＋仔豚およびＭＤＡ＋仔豚におけるＳＩＶ Ｈ１ ＲＰワクチンの有効性。

ブタにおける全長ＨＡに対するＭＤＡの効果を試験するために、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）Ｈ１ ＨＡタンパク質を発現するＲＰワクチンを、Ｈ１ ＳＩＶについてＭＤＡ陰性およびＭＤＡ陽性の両方である幼若な豚に投与した。

ＭＤＡ＋の仔豚を生じるために、ＳＩＶに対して血清陰性の健康度の高い雌ブタに、ＸＳｏｌｖｅアジュバントと共にＯ／Ｗエマルジョンに配合されたＳＩＶパンデミックＨ１Ｎ１ウイルス：Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／Ａ０１４８３１７０／２０１４のガンマ線不活化ワクチンを、妊娠中に２回ワクチン接種した。雌ブタワクチンは、１０の６乗のＴＣＩＤ５０当量／ｍｌを有していた。

生後２週間で、ワクチン接種した雌ブタの全ての健康な仔豚から血液を採取した。ＳＩＶ ＭＤＡ力価を、標準的なＨＩプロトコルを使用して判定した。これらの結果に基づいて、６．６Ｌｏｇ２ＨＩの同じ群平均ＭＤＡ力価を有し、４～８のＬｏｇ２ＨＩの個々のＭＤＡ力価の等分である１０匹の仔豚の混合群を形成した。

１つはＭＤＡ－、１つはＭＤＡ＋である仔豚の２つの群に、ＰＢＳモックワクチンを投与した。１つはＭＤＡ－および１つはＭＤＡ＋であるさらに２つの群は、ＳＩＶ株：Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１０／２０１０（Ｈ１Ｎ１）の全長Ｈ１ ＨＡタンパク質を発現するＶＥＥＶ－ＲＰワクチンを投与された（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＲ７５９５６）。これは９７．５％のアミノ酸配列同一性を有する。ＲＰをＸＳｏｌｖｅアジュバントとのＯ／Ｗエマルジョンに配合した。

仔豚に２回、つまり５週齢でのプライムワクチン接種（実験１日目）および８週齢でのブースター（実験２１日目）、ワクチン接種した：。ＲＰワクチンを、１ｍｌで与えられる動物用量あたり５×１０の６乗の粒子で頸部に筋肉内投与した。

実験中に数回、血清単離のために血液試料を採取した。ＨＩ滴定の結果を図１に示す。

ワクチン接種していないＭＤＡ対照動物は、実験全体を通してＨＩ陰性のままであった。ワクチン接種していないＭＤＡ＋の対照動物では、ＭＤＡ力価は、１４日齢での約６．６Ｌｏｇ２ＨＩから約６５日齢でのバックグラウンドレベルまで低下し、実験終了までそのように維持された（Ｔ＝５６）。

ワクチン接種した仔豚では、ＭＤＡ－の動物はプライムワクチン接種後にＨＩ力価のわずかな増加を示したが、ブースター後に非常に強い増加を示した。追加免疫後９日目に到達した群平均力価は１０．２Ｌｏｇ２ＨＩであった。一方、ＭＤＡ＋の仔豚では、プライムワクチン接種後にＨＩ力価が最初にいくらか低下し、ブースター後に増加したが、ＭＤＡ－ブタで到達した力価と比較してはるかに低い６．８の群平均力価に至ったのみであった。

これは、ニワトリの場合と同様に、ブタの場合、フルＨＡタンパク質によるワクチン接種の有効性はまた、ワクチン接種時の既存の抗ＨＡヘッド抗体の存在によって深刻に妨げられることを実証している。

６．２．Ｈ１－ＨＡステムポリペプチドを用いた実験
本発明によるＨＡステムポリペプチドでのワクチン接種が既存のＨＡ抗体の作用を克服することができることを確証し、送達および発現のための異なるプラットフォームを比較するために、ブタにおけるさらなるワクチン接種誘発実験が準備中である。ＭＤＡ－の仔豚およびＭＤＡ＋の仔豚の両方に、Ｈ１ ＨＡステムポリペプチドおよびフルＨ１ ＨＡをワクチン接種し、生きたＨ１ ＳＩＶで誘発する。ワクチンは、油性アジュバントを含むＤＮＡプラスミド発現ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡおよびＶＥＥＶ ＲＰである。

ＳＩＶ Ｈ１ ＭＤＡ＋の仔豚を作り出し、セクション６．１に記載されているように群に分ける。ＭＤＡ＋の豚およびＭＤＡ＋の豚の両方が、５週齢および８週齢で、２回のワクチン接種を受ける。主な試験ワクチンは、フルＨ１ ＨＡ、または配列番号４に記載されているＨ１ ＨＡステムポリペプチドのいずれかの、ｐＶＡＸプラスミド送達のＶＥＥＶレプリコンＲＮＡである。対照は、上部のセクション６．１に記載されているように、ＭＤＡ＋のターゲットでの性能が低いと予想されるフルＨ１ ＨＡのＲＰワクチンである。

ＲＰワクチンは動物あたり５×１０の６乗の粒子の用量であり、プラスミドワクチンは動物あたり５０μｇの用量である。両方のワクチンタイプは、ＸＳｏｌｖｅアジュバントと共にＯ／Ｗエマルジョンに配合され、頸部に２ｍｌで筋肉内投与される。

誘発感染は、約１１週齢で与えられる。誘発ウイルスは、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／Ａ０１４８３１７０／２０１４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）であり、これを５ｍｌのＰＢＳ（１０ｍＭ）中、動物あたり１×１０の６乗のＴＣＩＤ５０で気管内投与し、必要な封じ込め措置をＢＳＬ２レベルで適用する。

誘発ウイルス複製をモニターするために、誘発前および誘発から３日間、全ての豚から鼻スワブを採取することになる。食欲不振、息切れ（呼吸困難）、発熱、咳および鼻汁などの感染の臨床徴候について観察を行う。

誘発の３日後、全動物を鎮静させ、肺の病変の死後調査のために採血する。巨視的スコアリングの次に、肺組織の試料を誘発ウイルス定量のために採取する。

［実施例７］
宿主細胞における発現の試験
宿主細胞におけるＨＡステムポリペプチドの発現を調べるために、宿主細胞への本発明によるポリペプチドの送達のための様々な形態を使用して一連の実験を行った。異なる染色技術を適用して、それらの発現の種類および位置を視覚化した。

７．１．Ｈｅｌａ細胞
１つのアプローチでは、Ｈｅｌａ Ｒ１９細胞にＨＡステム発現プラスミドを手短にトランスフェクトした。細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩培養して約８０％のコンフルエントに達した。翌日、ウェルあたり０．１μｇのプラスミドＤＮＡ、０．３μｌのＦｕＧＥＮＥＨＤ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）（非脂質）トランスフェクション試薬および４．６μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクション混合物を調製し、これを室温で１５分間インキュベートした。次に、これをＤＭＥＭ＋１０％ ｖ／ｖ血清中の細胞に添加したが、抗生物質は添加せず、一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を１％メタノールを含有する３，７％のホルムアルデヒドで固定した。このタイプの固定は、細胞膜が依然として無傷であることを保証し、その結果、観察されるシグナルはいずれも細胞表面に発現されなければならない。細胞を、標準的なＩＦＴプロトコルにおいてＦＩ ６（ヒト抗ＨＡステム）抗体および二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８抗体（分子プローブ、Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）で染色した。

結果は、Ｈ１ ＨＡステムおよびＨ９ ＨＡステムポリペプチドの両方がＨｅＬａ細胞の細胞表面で明確に検出可能であったが、モックトランスフェクト細胞は陰性のままであることを示した。これは、ＨＡステムポリペプチドが適切に発現され、本発明によるベクターでトランスフェクトされた宿主細胞の表面に提示されることを示す。

７．２．Ｖｅｒｏ細胞およびＣＨＯ細胞
同様の一連の実験において、Ｖｅｒｏ ＡｍｅｓおよびＣＨＯ－Ｋ１細胞を、本発明のＨ１またはＨ９ ＨＡステムポリペプチドを発現するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションおよびインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％ホルムアルデヒドで固定し、室温で１５分間インキュベートした。このタイプの固定は、細胞が依然として無傷であることを保証し、その結果、観察されるシグナルはいずれも細胞表面に曝されなければならない。いくつかの細胞を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含有するＰＢＳでさらに処理した。これは、細胞を透過処理して、抗原の細胞内および細胞外染色の両方を可能にする。次に、一次抗体としてＦＩ６を用いたＩＦＴアッセイを行った。

結果は、モックトランスフェクト細胞は陰性のままであるが、Ｖｅｒｏ細胞およびＣＨＯ細胞の両方において、Ｈ１およびＨ９ ＨＡステムポリペプチドが十分に発現されたことを示した。透過処理した細胞では、細胞全体に染色が見られた；また、透過処理なしでも、ＦＩ６抗体によってポリペプチドを明確に検出することができた。これは、ＣＨＯおよびＶｅｒｏ宿主細胞におけるこれらのポリペプチドの効率的な発現を実証する。さらに、これは、これらのタイプの宿主細胞においても、Ｈ１およびＨ９ ＨＡステムポリペプチドの細胞表面に提示があったことを示している。

続く実験では、Ｖｅｒｏ細胞を、本発明のＨ１、Ｈ５－およびＨ９ ＨＡステムポリペプチドを発現するプラスミド、またはＨ１、Ｈ５もしくはＨ９のフルＨＡタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。

トランスフェクションおよびインキュベーションの後、細胞をホルマリン／ＰＢＳで固定してそれらを無傷に保ち、第１の抗体としてＦＩ６を用いたＩＦＴアッセイで染色した。

結果は、（モック細胞は陰性であったが）フルＨＡタンパク質またはＨＡステムポリペプチドのいずれかを発現するＶｅｒｏ細胞は全て、細胞表面に明確な染色を示すことを示した。その結果、本発明のＨ１、Ｈ５およびＨ９ ＨＡステムポリペプチドは、フルＨＡタンパク質と同じように細胞表面に提示される。

［実施例８］
Ｈ９ ＨＡステムポリペプチドを用いた試験
インフルエンザウイルスのさらなる変異体を試験し、異なるベクタータイプを使用できることを実証するために、Ｈ９ ＨＡでの実験が準備中である。フルＨＡタンパク質とＨＡステムポリペプチドの両方をニワトリで、ＳＰＦおよびＨ９ ＭＤＡ＋の両方で、プラスミド送達レプリコンＲＮＡ分子として、およびＲＰとして試験する。プラスミド送達されたレプリコンＲＮＡとＲＰの両方は、最近のＨ９ ＡＩＶ分離株のコンセンサス配列である配列番号１２のＨ９ ＨＡステムポリペプチドの発現をもたらし、本明細書に記載される修飾：４ｘＧリンカーによって置換され、三量体化、ＴＭおよび細胞質ドメインを含むヘッドドメインの欠失を含む。コードするヌクレオチド（配列番号１１）をニワトリの転写プロファイルに対してコドン最適化し、いくつかの安定化変異を適用した。

Ｈ９ ＭＤＡ＋のヒヨコは、ＳＰＦの親に不活化Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶワクチンを接種することによって生じさせ、そのＨ９アミノ酸配列は、Ｈ９ ＨＡステムポリペプチドのものと９７％同一であり、したがって、相同に近いＭＤＡをもたらした。ワクチン接種は１日齢のときに行う。

誘発は、ＳＰＦのニワトリではワクチン接種後４週間で、ＭＤＡ＋の動物では５週間のｐ．ｖ．で適用される。誘発材料は、ＬＰＡＩ株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｖ１５２７／２０１８（Ｈ９Ｎ２）の卵から成長した尿膜腔液であり、そのＨ９ａａ配列は、使用したＨ９ ＨＡステムポリペプチドの配列と９４％同一である。これを、０．２ｍｌ中、動物あたり１０の６乗のＥＩＤ５０で鼻腔内投与することになる。

誘発後の最初の週に交換を行い、誘発後の２週間にわたって臨床徴候を監視する。

全長ＨＡに対するＭＤＡの作用を比較するために、同様のプラスミドおよびＲＰワクチンを使用して、同様の配列の全長Ｈ９ ＨＡによるワクチン接種を行うことになる。さらに、ＨＶＴ－Ｈ９ ＨＡ組換えウイルスベクターを追加のグループのヒヨコに皮下投与する。このＨＶＴベクターは、ＵＬ４４遺伝子とＵＬ４５遺伝子との間のＨＶＴゲノムに挿入されたＨＡ遺伝子を含み、ＰＲＶ ｇＢプロモーターによって駆動される。

レプリコンＲＮＡワクチンは、プラスミドとして投与され、０．２ｍｌ中１０μｇ／動物の用量で筋肉内投与される。１つの群は、プラスミド用量の効果を試験するために１μｇ／用量のみを受ける。プラスミドを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋５％トレハロース中２．５ｍｇ／ｍｌのポリアクリルポリマーナノゲル（２０Ｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に配合する。ＲＰはＶＥＥＶ ＲＰであり、アジュバント添加エマルジョン中０．２ｍｌの動物あたり１０の８乗のＲＰの用量で水性緩衝液で筋肉内投与される。

実験の前、全体、および最後に、初期および発達中の血清学的状態を監視するために、選択された動物から血液試料を採取する。また、動物をモニタリングし、臨床徴候を記録する。誘発株はＬＰＡＩのみであるため、死亡率または重篤な臨床徴候は予想されない。

Claims (7)

1. ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するのに使用するための、ターゲットにおいて組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドを発現することができる組換えベクターであって、前記ポリペプチドが、ヘッドレスインフルエンザウイルスＨＡステムドメインと、三量体化ドメインと、膜貫通ドメインとを含むことを特徴とする、組換えベクター。
2. 発現される前記インフルエンザウイルスＨＡステムポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０および１２のうちの１つから選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組換えベクター。
3. 核酸、ウイルスおよびレプリコン粒子（ＲＰ）から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のための組換えベクター。
4. －前記核酸が真核生物発現プラスミドまたはＲＮＡ分子である、
   －前記ウイルスが、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルスおよびアデノウイルスから選択される、または
   －前記ＲＰはアルファウイルスＲＰである
   ことを特徴とする、請求項３に記載の使用のための組換えベクター。
5. ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するのに使用するためのワクチンであって、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター、または前記組換えベクターを含む宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含むワクチン。
6. ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター、または前記組換えベクターを含む宿主細胞、および／または請求項５に記載の使用のためのワクチンの使用。
7. ワクチン接種時にインフルエンザウイルスＨＡヘッドドメインに対する抗体を有するターゲットにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染または疾患を軽減する方法であって、前記ターゲットに、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター、前記組換えベクターを含む宿主細胞、および／または請求項５に記載の使用のためのワクチンを投与することを含む、方法。

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