ES2582324T3 - Nanogeles - Google Patents

Nanogeles

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ES2582324T3
ES2582324T3 ES12725548.7T ES12725548T ES2582324T3 ES 2582324 T3 ES2582324 T3 ES 2582324T3 ES 12725548 T ES12725548 T ES 12725548T ES 2582324 T3 ES2582324 T3 ES 2582324T3
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ES
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Johannes Franciscus Joseph Engbersen
Arkadi Vladimirovich Zinchenko
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20MED Therapeutics BV
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Abstract

Polímero según las fórmulas (1) y (2):**Fórmula** donde: A es independientemente seleccionado de un enlace simple de carbono-carbono directo (10 es decir una estructura donde A está ausente), O, N(R1) y S; R1 se selecciona independientemente de H y CH3; R2 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en: (a) alquileno C1 - C40, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo alquileno se interrumpe por uno o varios grupos -S-S-; (b) cicloalquileno C3 - C40, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo cicloalquileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S- fuera del anillo; (c) arileno C6 - C40, donde el grupo arileno es opcionalmente sustituido; (d) heteroarileno C6 - C40, donde el grupo heteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarileno es opcionalmente sustituido; (e) alquilarileno C7 - C40, donde el grupo alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno se interrumpe por uno o varios grupos -S-S-; (f) alquilheteroarileno C7 - C40, donde el grupo alquilheteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno se interrumpe por uno o varios grupos -S-S-; y (g) un grupo donde dos grupos (hetero)arileno C7 - C40 y/o grupos alquil(hetero)arileno C7 - C40 están conectados entre sí por un grupo -S-S-, donde la parte alquilo del grupo alquil(hetero)arileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; R3 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en: b) alquilo C1 - C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (c) cicloalquilo C3 - C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (d) arilo C6 - C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido; (e) heteroarilo C6 - C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido; (f) alquilarilo C7 - C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y (g) alquilheteroariloC7 - C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Nanogeles
5 Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere al diseño y la preparación de nanoportadores de núcleo-recubrimiento híbridos poliméricos cuyos núcleos están diseñados para enlazar carga útil terapéutica (nucleótidos, péptidos, proteínas, y fármacos de molécula pequeña preferiblemente terapéuticos) y el recubrimiento está diseñado para proteger la carga útil terapéutica, estabilizar el nanoportador, proporcionar biocompatibilidad al sistema, permitir que sean objetivo células específicas y tejido, y proporcionar la liberación intracelular eficaz de la carga útil terapéutica del nanoportador.
[0002] Más en particular, la presente invención se refiere a polímeros PA, nanopartículas y nanogeles obtenidos a partir de dichos polímeros PA, donde dichos nanogeles pueden comprender un componente biológicamente activo
15 seleccionado del grupo de ARN (en particular ARNsi o ARNmi) o derivados o fragmentos del mismo, ADN o derivados o fragmentos del mismo, (oligo)péptidos y derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas.
Antecedentes de la invención
[0003] La presente invención está en el campo de la entrega de ARNsi (ARNsi se refiere a ARN pequeño de interferencia que es también conocido como ARN corto de interferencia o ARN de silenciamiento) y entrega de ARNmi (ARNmi se refiere a micro ARN).
[0004] La interferencia de ARN (ARNi) representa una estrategia prometedora para afectar la expresión de genes
25 patógenos debido a su capacidad para silenciar la expresión génica de una manera específica de la secuencia. La selección de diferentes secuencias ARNsi resultó en la identificación de diferentes oligonucleótidos terapéuticos potenciales para usos terapéuticos diferentes. Sin embargo, la entrega de ARNsi es un gran problema. El ARNsi desnudo es rápidamente degradado por nucleasas en el líquido biológico (la vida media es del orden de minutos), y generalmente se requiere un portador que proporcione protección suficiente contra la degradación en el ambiente extracelular y asegure el cruce eficaz de barreras celulares durante la absorción intracelular y el tratamiento. En particular, el ARNsi cargado altamente negativo puede pasar las membranas celulares solo con gran dificultad. Además, una vez en el fluido intracelular, el desembalaje eficaz de ARNsi a partir del portador es requerido para mostrar su actividad terapéutica. Como consecuencia, varios portadores no víricos poliméricos para la entrega eficaz de ARN, ADN y ARNsi han sido investigados.
35 [0005] La US 2002/0131951 (ahora US 6.998.115), US 2004/0071654 (ahora US 7.427.394), US 2005/0244504 y US 2010/0036084, todas incorporadas por referencia, revelan polímeros de poli(amino éster) obtenidos a partir de bisacrilamidas y aminas primarias funcionalizadas. En su forma catiónica, los polímeros de poli(amino éster) forman complejos con moléculas de ADN o fragmentos de las mismas.
[0006] La US 2008/0242626, incorporada por referencia, divulga polímeros de poli(amino éster) basados en bisacrilamidas y aminas primarias funcionalizadas, donde los polímeros de poli(amino éster) se someten a una modificación de extremo. Donde el polímero de poli(amino éster) es aminosustituido, el polímero de poli(amino éster) se reacciona con un electrófilo. Donde el polímero de poli(amino éster) es acrilatosustituido, el polímero de poli(amino
45 éster) se reacciona con un nucleófilo. Estos polímeros de poli(amino éster) modificados en el extremo se usan para la entrega de ADN y ARN.
[0007] La WO 2010/065660, incorporada por referencia, divulga aminas de polidisulfuro biodegradables y complejos de las mismas con por ejemplo ARN, ADN, ARNsi y otros oligonucleótidos.
[0008] La US 2010/0041739, incorporada por referencia, divulga polímeros de imina de polialquileno que se pueden usar para la entrega de por ejemplo ADN.
[0009] La US 2010/0028445, incorporada por referencia, divulga polímeros de poli(amido amina) que comprenden
55 grupos de disulfuro colgantes, grupos de tiol colgantes o grupos de tiol activado colgantes y un método para la preparación de tales polímeros de poli(amino amina), donde los monómeros de bisacriloilo se reaccionan con una amina primaria y/o una diamina secundaria donde una de las aminas contiene un grupo disulfuro. Los polímeros de poli(amino amina) se pueden convertir en hidrogeles formando grupos disulfuros entre las cadenas de poli(amino amina).
[0010] C. Lin et al., Bioconjug. Chem. 18, 138 -145, 2007, incorporada por referencia, divulga poli(amido amina)s que contienen enlaces disulfuros que se preparan por una adición de Michael de aminas primarias y N,N'-cistamina bisacrilamida que contiene disulfuro.
[0011] L.J. van der Aa et al., J. Control. Release 148, e85, 2010, incorporada por referencia, revela poli(amido amina)s 65 que contienen enlaces disulfuros que se preparan por una adición de Michael de aminoalcoholes primarios, N,N'cistamina bisacrilamida que contiene disulfuro y 1,2-diaminoetano.
imagen2
[0012] R. Namgung et al., Biotechnol. Lett. 32, 755, 2010, incorporada por referencia, divulga poli(amido amina)s que contienen enlaces disulfuros que se preparan por una adición de Michael de 4-amino-1-butanol y N,N'-cistamina bisacrilamida que contiene disulfuro.
5 [0013] P. Vader et al., Pharm. Res. 28, 1013, 2011, incorporada por referencia, divulga poli(amido amina)s que contienen enlaces disulfuros que se preparan por una adición de Michael de 4-amino-1-butanol, N,N'-cistamina bisacrilamida que contiene disulfuro y 1,2-daminoetano.
10 [0014] D. Vercauteren et al., Biomaterials 32, 3072, 2011, incorporada por referencia, divulga poli(amido amina)s que contienen enlaces disulfuros que se preparan por una adición de Michael de 4-amino-1-butanol y N,N'-cistamina bisacrilamida que contiene disulfuro.
[0015] Los sistemas poliméricos catiónicos conocidos del estado de la técnica tienen todavía varias desventajas. En
15 particular, la necesidad de presencia de exceso de polímero (citotóxico) en la formulación terapéutica, la manipulación frecuentemente baja y la estabilidad de almacenamiento de los nanogeles terapéuticamente cargados, al igual que eficiencias limitadas en escape endosomal y desembalaje citosólico de la carga útil terapéutica (nucleótido) a partir del complejo son todavía desafíos importantes en este campo.
20 Resumen de la invención
[0016] La presente invención se refiere a un polímero PA (PoliAcril) según las fórmulas generales (1) y (2):
imagen3
donde:
A se selecciona independientemente de un enlace simple de carbono-carbono directo (es decir, una estructura donde A está ausente), O, N(R1) y S;
30 R1 se selecciona independientemente de H y CH3;
R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en:
35 (a) alquileno C1 -C40, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo alquileno es interrumpido por uno o varios grupos S-S-; (b) cicloalquileno C3 -C40, donde el grupo de cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S, y/o donde el grupo de cicloalquileno es interrumpido por uno o varios grupos S-S-fuera del anillo;
imagen4
5 (c) arileno C6 -C40, donde el grupo de arileno es opcionalmente sustituido;
(d)
heteroarileno C6 -C40, donde el grupo de heteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo de heteroarileno es opcionalmente sustituido;
(e)
alquilarileno C7 -C40 donde el grupo de alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de
10 alquilo del grupo de alquilarileno es lineal o ramificado y es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo de alquilarileno es interrumpida por uno
o varios grupos S-S-;
(f)
alquilheteroarileno C7 -C40, donde el grupo alquilheteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos
15 independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo de alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo de alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo de alquilheteroarileno es interrumpida por uno o varios grupos -S-S; y
20 (g) un grupo donde dos grupos (hetero)arileno C7 -C40 y/o grupos alquil(hetero)arileno C7 -C40 están conectados entre sí por un grupo S-S-, donde la parte de alquilo del grupo alquil(hetero)arileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
25 R3 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es
opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres 30 heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(c)
cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(d)
arilo C6 -C12, donde el grupo de arilo es opcionalmente sustituido;
35 (e) heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S, y donde el grupo de heteroarilo es opcionalmente sustituido;
(f) alquilariloC7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente
40 interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; y
(g) alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente
45 (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
R4 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
50 (a) H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado;
(c)
cicloalquilo C3 -C12;
(d)
arilo C6 -C14;
(e) heteroarilo C6 -C14, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos 55 independientemente seleccionados de O, N y S;
(f)
alquilarilo C7 -C14; y
(g)
alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S;
60 R5 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
alquileno C1 -C12, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S:
(b)
cicloalquileno C3 -C12, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(c)
arileno C6 -C12, donde el grupo arileno es opcionalmente sustituido;
imagen5
5 (d) heteroarileno C6 -C12, donde el grupo heteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarileno es opcionalmente sustituido;
(e) alquilarileno C7 -C12, donde el grupo alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo de alquilarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente
10 seleccionados de O, N y S; y
(f) alquilheteroarileno C7 -C12, donde el grupo alquilheteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos,
15 donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; POL representa un núcleo polimérico que tiene un peso medio molecular en peso Pm de aproximadamente 300 a aproximadamente 25000;
a = 2 -64; y 20 b = 1 -50.
[0017] La presente invención se refiere además a una nanopartícula según las fórmulas generales (3) y (4):
imagen6
donde R1, R2, R3, R4, R5, A, POL, a y b son tal y como se ha definido anteriormente, y donde R6 es seleccionado del grupo que consiste en:
30 (a) alquileno C1 -C40, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S, y/o donde el grupo alquileno es interrumpido por uno o varios grupos S-S-; o
(b) cicloalquileno C3 -C40, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente
35 (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S, y/o donde el grupo cicloalquileno es interrumpido por uno o varios grupos S-S-fuera del anillo; y
FG es un grupo funcional.
40 [0018] La presente invención se refiere además a un nanogel que comprende un polímero PA (PoliAcril) según las fórmulas generales (1) o (2), donde el nanogel se forma por reticulación del polímero PA.
imagen7
[0019] La presente invención se refiere además a nanogeles que tienen una superficie modificada.
[0020] La presente invención se refiere además a nanogeles que comprenden un componente biológicamente activo.
5 [0021] La presente invención se refiere además al uso de los nanogeles y al uso de los nanogeles en la entrega de un componente biológicamente activo a un mamífero.
[0022] La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden el nanogel y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0023] La presente invención se refiere además a un método para entregar un componente biológicamente activo a un mamífero, donde un nanogel o una composición que comprende tal nanogel se administra a un mamífero.
Descripción de las figuras 15 [0024]
La figura 1 muestra la capacidad de los polímeros PA para enlazar ARNsi como se establece en un ensayo de EtBr (etidio bromuro). Una señal de fluorescencia baja es indicativa de blindaje eficaz (protección) de ARNsi. La figura 2 muestra la capacidad de los nanogeles que comprenden un polímero PA para enlazar y blindar ARNsi como se establece en un ensayo de EtBr (etidio bromuro). La figura 3 muestra que los nanogeles tienen una capacidad más alta para enlazar y blindar ARNsi que los polímeros PA (compárese las muestras nº.: 12 vs. 4 y 13 vs. 3 en proporción de polímero/ARNsi más alta). La figura 4 muestra el gen que silencia la eficiencia en células H1299 de polímeros PA. Las barras gris oscuro
25 muestran el porcentaje de expresión de luciferasa. Las barras gris claro son los controles con ARNsi insensible. La figura 5 muestra el gen que silencia la eficiencia en células H1299 de polímeros PA. La figura 6 muestra el gen que silencia la eficiencia de algunos nanogeles con composición de núcleo diferente. La figura 7 muestra curvas de viabilidad celular de células H1299 para un polímero PA (muestra nº 4) y un nanogel (muestra nº 12) como función de concentración. La figura 8 muestra silenciamiento de luciferasa de células H1299 bajo condiciones de suero por nanogeles cargados con ARNsi en diferentes proporciones de polímero/ARNsi (p/p) y dosis diferentes de ARNsi (ng por 100 µL de medio de transfección). La figura 9 muestra silenciamiento de luciferasa de células H1299 bajo condiciones de suero por nanogeles cargados con ARNsi (ARNsi 72 nM) en proporciones de mezcla de polímero/ARNsi diferentes.
35 La figura 10 muestra silenciamiento de luciferasa de células H1299 por un nanogel cargado con ARNsi (muestra nº 12) que tiene su superficie modificada con cantidad de PEG (% en peso con respecto al polímero del nanogel). La figura 11 muestra silenciamiento de luciferasa de células H1299 por un nanogel cargado con ARNsi (muestra nº 12), utilizando una solución de ARNsi-nanogel recién preparada, una solución de ARNsi-nanogel congelada y descongelada y una solución de ARNsi-nanogel liofilizada, respectivamente. La barra negra da la expresión de luciferasa (establecida en 100%) de los experimentos de control, usando ARNsi codificante antisentido. Se muestra que las tres formulaciones diferentemente tratadas con ARNsi antisentido muestran actividad de silenciamiento de luciferasa igual.
Descripción detallada de la invención
45 [0025] El verbo "comprender", como se usa en esta descripción y en las reivindicaciones y sus conjugaciones, se utiliza en su sentido no limitativo para decir que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos que no se mencionan específicamente no están excluidos. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad que haya más de uno de dicho elemento, a menos que el contexto especifique claramente que hay uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" así normalmente significa "al menos uno".
[0026] El término "ARNsi" abarca también "ARNmi" (micro ARN).
55 El polímero PA
[0027] Según la presente invención, se prefiere que el polímero según las fórmulas (1) y (2) tenga un peso molecular medio en peso Pm en el rango de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 1.000.000, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 500.000 g/mol.
[0028] Según una forma de realización preferida, A es N(R1) u O, de la forma más preferible N(R1).
[0029] Según otra forma de realización preferida de la presente invención, R1 es H.
65 [0030] Según otra forma de realización preferida, R2 se selecciona de: (a1) alquileno C1 -C20, preferiblemente alquileno C2 -C12, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo alquileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S-;
imagen8
5 (b1) cicloalquileno C3 -C20, preferiblemente cicloalquileno C5 -C12, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende 1, 2 o 3 heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo cicloalquileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S-fuera del anillo; (c1) arileno C6 -C20, preferiblemente arileno C6 -C12, donde el grupo arileno es opcionalmente sustituido;
10 (d1) heteroarileno C6 -C20, preferiblemente heteroarileno C6 -C12, donde el grupo heteroarileno comprende 1, 2 o 3 heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarileno es opcionalmente sustituido; (e1) alquilarileno C7 -C20, preferiblemente alquilarileno C7 -C12 donde el grupo alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente
15 (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por 1, 2 o 3 heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S-; (f1) alquilheteroarileno C7 -C20, preferiblemente alquilheteroarileno C7 -C12, donde el grupo alquilheteroarileno comprende 1 -3 heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo
20 alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo de alquilheteroarileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S-; y (g1) un grupo donde dos grupos (hetero)arileno C7 -C20 y/o grupos alquil(hetero)arileno C7 -C20, preferiblemente
25 dos grupos (hetero)arileno C7 -C12 y/o grupos alquil(hetero)arileno C7 -C12, están conectados entre sí por un grupo S-S-, donde la parte de alquilo del grupo alquil(hetero)arileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S.
30 [0031] Según otra forma de realización preferida de la presente invención, R2 se selecciona del grupo (a1) o grupo (b1), más preferiblemente grupo del grupo (a1), y en particular del grupo (a1) donde el grupo alquileno C1 -C40 se interrumpe por uno o varios grupos -S-S.
[0032] Según una forma de realización preferida, cuando R3 es alquilo C1 -C10 sustituido, el grupo alquilo es sustituido 35 por un grupo seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es
40 opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(c) cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
45 (d) arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
(e)
heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido;
(f)
alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente
50 interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; y
(g) alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente)
55 insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S.
[0033] Según una forma de realización preferida, cuando R3 es cicloalquilo C3 -C12 sustituido, el grupo cicloalquilo tiene un grupo pendiente seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7),-N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, 60 donde R7 es tal y como se ha definido anteriormente.
[0034] Según una forma de realización preferida, cuando R3 es arilo C6 -C12, heteroarilo C6 -C12, alquilarilo C7 -C14 o alquilheteroarilo C7 -C14 sustituido, el grupo alquilarilo o alquilheteroarilo es sustituido con, preferiblemente con uno, dos
o tres de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es tal y como se ha 65 definido anteriormente.
imagen9
[0035] En el polímero PA según la presente invención que está representado por las fórmulas generales (1) y (2), el núcleo polimérico POL se basa preferiblemente o se selecciona de un (co)polímero ramificado, hiperramificado, multibrazo, dentrítico o tipo estrella, dicho (co)polímero preferiblemente tiene 2 -64, más preferiblemente 2 -32, aún más preferiblemente 2 -16 grupos amino terminales, preferiblemente grupos amino primarios. Por consiguiente, a es 2 -64, preferiblemente 2 -32 y en particular 2 -16. Los (co)polímeros pueden comprender diferentes espaciadores lineales o ramificados que comprendan uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, preferiblemente O y N.
[0036] Según la presente invención, b es 1 -50, preferiblemente 1 -30 y en particular 1-10.
[0037] Es bien conocido en la técnica que los (co)polímeros dendríticos no son siempre perfectamente ramificados y pueden por lo tanto tener una estructura hiperramificada. El grado de ramificación (DB) se puede definir por:
imagen10
15 donde D es el número de dendríticas, L el número de lineales y T el número de unidades terminales. Dendrímeros perfectos tendrán un DB de 1, mientras que los (co)polímeros hiperramificados tienen típicamente un DB de 0,4 a 0,5 hasta aún 0,9. En esta solicitud de patente, el término "dendrímero" debe entenderse que incluye "dendrímeros perfectamente ramificados" al igual que "dendrímeros imperfectamente ramificados" que son también denominados "(co)polímeros hiperramificados". Alternativamente, el término "(co)polímeros hiperramificados" también puede comprender (co)polímeros hiperramificados "reales". Esto es, que estas macromoléculas se preparen deliberadamente para tener una estructura hiperramificada. El término "dendrímero" debe entenderse como que comprende tanto homopolímeros dendriméricos como copolímeros dendriméricos. El término "copolímero" incluye polímeros formados por al menos dos monómeros diferentes.
25 [0038] Polímeros hiperramificados se pueden obtener a partir de la polimerización aleatoria de monómeros en presencia de al menos un monómero polifuncional capaz de introducir ramificación. Tal esquema sintético es mostrado por Hawker and Devonport in "Step-Growth Polymers for High-Performance Materials : New Synthetic Methods," Hedrick, J. L. and Labadie, J. W., Eds., Am. Chem. Soc., Washington, D. C., 1996, pp. 191-193. Hult et al., in "Advances in Polymer Science," Vol. 143 (1999), Roovers, J., Ed., Springer, New York, pp. 1-34, presentan una reseña de los polímeros hiperramificados.
[0039] Los polímeros dendríticos altamente ramificados se discuten por ejemplo en "Polymeric Materials Encyclopedia", Vol. 5 (1996), J.C. Salamone, Ed., CRC Press, New York, pp. 3049-3053. Los polímeros dendríticos tienen
35 generalmente una arquitectura no lineal y son intrínsecamente globulares en su forma. Métodos de síntesis por etapas discretos se utilizan para preparar dendrímeros o compuestos puros altamente ramificados. Como mencionan Hawker and Devonport en "Step-Growth Polymers for High-Performance Materials: New Synthetic Methods", Hedrick, J. L. and Labadie, J. W., Eds., Am. Chem. Soc., Washington, D. C., 1996, pp. 186-196, si la macromolécula tiene ramificación altamente regular que sigue un patrón geométrico estricto, es un dendrímero. Los dendrímeros son típicamente monodispersos y se preparan en un método multifase con purificaciones en cada fase. La arquitectura de los dendrímeros es también discutida por Roovers and Comanita en "Advances in Polymer Science", Vol. 142 (1999), Roovers, J., Ed., Springer, New York, pp. 179 -228. Los dendrímeros consisten en una molécula de núcleo que define el centro de simetría de la molécula, y estratos de ramificación. Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 29 (1990), 138-175 divulgan dendrímeros de "starburst" que consisten en un núcleo iniciador y grupos de ramificación.
45 [0040] Preferiblemente, el núcleo polimérico POL se basa en PEI (disponible comercialmente de por ejemplo Denditrech, Inc.), polímeros Astramol® (DSM), polímeros JEFFAMINE® (Huntsman), polímeros PAMAM (a veces también llamados polímeros PANAM), polímeros PPI, polímeros PEAN y polímeros PEAC. El término "PEI" se refiere polietilenoiminas. El término "PAMAM" se refiere a polímeros de poli(amido amina) que están disponibles comercialmente bajo el nombre comercial Starburst®. El término "PPI" se refiere a polímeros de polipropileno imina. El término "PEAN" se refiere a polímeros de poli(éster amina). El término "PEAC" se refiere a polímeros de poli(éter amina). Todos estos polímeros se conocen en la técnica. Por consiguiente, se prefiere que el núcleo polimérico POL se base en o se seleccione del grupo que consiste en PEI, PAMAM, PPI, PEAN y PEAC.
55 [0041] Según la presente invención, se prefiere que el peso molecular promedio en peso Pm del núcleo polimérico POL sea de aproximadamente 300 a aproximadamente 5.000, más preferiblemente de aproximadamente 600 a aproximadamente 5.000.
[0042] Polímeros preferidos usados para el núcleo polimérico POL son los polímeros (poliéter aminas) de las series JEFFAMINE® T que están disponibles comercialmente con un peso molecular promedio en peso Pm en el rango de aproximadamente 440 a aproximadamente 5.000. Tipos adecuados de polímeros JEFFAMINE® T incluyen T-403 (Pm = 440) y T-3000 (Pm = 3.000).
imagen11
[0043] Otro grupo de polímeros preferidos que se pueden usar para el núcleo polimérico POL son los de PEI. PEI puede tener bien una estructura lineal o ramificada. PEI lineal está comercialmente disponible (jetPEI, Polyplus-Transfection Co.; Exgen 500, Fermentas Co.) y se prepara normalmente por hidrólisis de poli(2-etil-2-oxazolina. Los de PEI ramificado se obtienen a partir de aziridina y estos polímeros tienen una estructura altamente ramificada y comprenden aproximadamente 25% de grupos amina primaria, aproximadamente 50% grupos amina secundaria, y aproximadamente 25% grupos amina terciaria. Preferiblemente, el PEI tiene un peso molecular promedio en peso Mn de aproximadamente 600 a aproximadamente 3.000, más preferiblemente de aproximadamente 600 a aproximadamente
2.000. Los de PEI lineal se pueden representar por la fórmula general (5a):
imagen12
[0044] Los de PEI ramificado se puede representar por la fórmula general (5b):
imagen13
donde n es de manera que el PEI tiene un peso molecular promedio en peso Mn de aproximadamente 300 a
15 aproximadamente 5.000, más preferiblemente de aproximadamente 300 a aproximadamente 3.000, aún más preferiblemente de aproximadamente 600 a aproximadamente 2.500. Tales de PEI están por ejemplo disponibles de Sigma-Aldrich.
[0045] Otro grupo de polímeros preferidos usado para el núcleo polimérico POL son polímeros de poli(amido amina)
20 hiperramificados y dendrímeros, preferiblemente los de la primera y cuarta generación, más preferiblemente los de la primera y tercera generación. Estos polímeros están disponibles comercialmente de Dentritech, Inc., y tienen un peso molecular promedio en peso Pm en el rango de aproximadamente 1.400 (primera generación) a aproximadamente
15.000 (cuarta generación).
25 [0046] Otro grupo de polímeros preferidos usado para el núcleo polimérico POL son los polímeros representados por las fórmulas generales (6) -(9):
N(R8)3-n[(CR92)m-N(R10R11)n (6) 30 [(R10R11)N-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)m-N(R10OR11)]2 (7)
N(R8)3-n[(CR92)m-C(O)N(R9)-(CR92)m-N(R12R13)]n (8)
35 [(R12R13)N-(CR92)m-N(R9)C(O)-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)-C(O)NH-(CR92)m-N(R12R13)]2 (9)
imagen14
donde:
R8 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C20 lineal o ramificado o un grupo -[(CR142)q-X]o-R15, donde X es O o N(R8); 5 m es2,3o4; n es 2 o 3;
o es 1 -10; q es 2, 3 o 4; P es -(CR92)m-, un grupo arileno C6 -C12, un grupo cicloalquileno C6 -C12 o un grupo -[(CR142)q-X]p-C(R14)2]-, donde
10 X esOoN(R8) ypes1-10; R9 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R10 y R11 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR142)qNR16R17, siempre que R10 y R11 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R16 y R17 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo
15 de la fórmula -(CR142)qNR18R19, siempre que R16 y R17 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado; R18 y R19 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR142)qNR20R21, siempre que R18 y R19 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado; R20 y R21 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado, siempre que R20 y R21 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado;
20 R22 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, siempre que al menos un R22 sea un átomo de hidrógeno; R15 es un hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C20 lineal o ramificado o un grupo -[(CR142)q-X]o-R15 tal y como se ha definido anteriormente; R12 y R13 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R23R24), siempre que R12 y
25 R13 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado; R23 y R24 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R25R26), siempre que R23 y R24 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado; R25 y R26 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado o un grupo de
30 la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R27R28), siempre que R25 y R26 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado; R27 y R28 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado, siempre que R27 y R28 no sean ambos un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado.
35 [0047] En las fórmulas (6) -(9), unos polímeros de grupo preferidos usados para el núcleo polimérico POL es el grupo donde:
R8 y R15 es un átomo de hidrógeno o un grupo -[(CR142)q-X]o-R15, donde X es NH;
R9, R20, R21 y R21 son un átomo de hidrógeno; 2)qNR16R17
40 R10 y R11 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula -(CR14 ; 2)qNR18R19
R16 y R17 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula -(CR14 ; 2)qNR20R21
R18 y R19 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula -(CR14 ; R12 y R13 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)mN(R23R24);
45 R23 y R24 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)mN(R25R26); R25 y R26 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)mN(R27R28); y R27 y R28 son independientemente un átomo de hidrógeno.
50 [0048] En las fórmulas (6) -(9), también se prefiere que m y q sea 2:
[0049] Una clase más preferida de polímeros PA según la presente invención se pueden representar por las fórmulas generales (10) y (11):
imagen15
5 R1 se selecciona independientemente de H y CH3; Y es O u N(R); r es 2, 3 o 4; Z es S-S-;
10 R29 se selecciona independientemente del grupo que consiste en:
(a)
H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es
opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por 1, 2 o 3 heteroátomos, donde 15 los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(c)
cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende 1, 2 o 3 heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(d)
arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
20 (e) heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende 1, 2 o 3 heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido;
(f) alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por 1, 2 o 3 heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de
25 O,N yS;y
(g) alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende 1, 2 o 3 heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por 1, 2 o 3 heteroátomos, donde los
30 heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; el grupo alquilheteroarilo opcionalmente es sustituido, preferiblemente con 1, 2 o 3 de -OH, -OR29,-NH2 -NH(R29) o -N(R29)2;
R30 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
35 (a) H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(c)
cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente
40 (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(d)
arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
(e)
heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido;
(f)
alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente
imagen16
5 interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; y
(g) alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
R31 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
15 (a) H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado;
(c)
cicloalquilo C3 -C12;
(d)
arilo C6 -C12;
(e)
heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S;
(f)
alquilarilo C7 -C14; y
(g)
alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S;
25 R32 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
alquileno C1 -C12, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S;
(b)
cicloalquileno C3 -C12, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
(c)
arileno C6 -C12, donde el grupo arileno es opcionalmente sustituido;
(d) heteroarileno C6 -C12, donde el grupo heteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos 35 independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarileno es opcionalmente sustituido;
(e)
alquilarileno C7 -C14, donde el grupo alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y
(f)
alquilheteroarileno C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y
45 a = 2 -64; y b = 1 a 50.
[0050] Según una forma de realización preferida, cuando R30 es alquilo C1 -C10 sustituido, el grupo alquilo es sustituido por un grupo seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
H;
(b)
alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es
55 opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
(c)
cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
(d)
arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
(e)
heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido;
(f)
alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente
65 interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y
imagen17
(g) alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se
5 seleccionan independientemente de O, N y S.
[0051] Según una forma de realización preferida, cuando R30 es cicloalquilo C3 -C12 sustituido, el grupo cicloalquilo tiene un grupo pendiente seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7),-N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es tal y como se ha definido anteriormente.
[0052] Según una forma de realización preferida, cuando R30 es arilo C6 -C12, heteroarilo C6 -C12, alquilarilo C7 -C14 o alquilheteroarilo C7 -C14 sustituido, el grupo alquilarilo o alquilheteroarilo es sustituido con, preferiblemente con uno, dos
o tres de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es tal y como se ha definido anteriormente.
15 [0053] En una clase más preferida de polímeros PA según las fórmulas generales (10) y (11):
R1 se selecciona independientemente de H y CH3; Y es N(R1); r es 2; Z es S-S-; R29 se selecciona independientemente de H y alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
25 R30 se selecciona independientemente de H y alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; R31 se selecciona independientemente de H y alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado; y R32 es alquileno C1 -C10, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S.
[0054] En una clase aún más preferida de los polímeros PA según las fórmulas generales (10) y (11):
35 R1 es H; Y es N(R1); r es 2; Z es S-S-; R29 es H; R30 se selecciona independientemente de H y alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo es lineal y es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; R31 es H; y
45 R32 es alquileno C1 -C10, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado.
[0055] Todavía en una clase aún más preferida de los polímeros PA según las fórmulas generales (10) y (11):
R1 es H; Y es N(R1); r es 2; Z es S-S-; R29 es H;
R30
es alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo es lineal y es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres
55 heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; R31 es H; y R32 es alquileno C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado.
[0056] En una clase más preferida de los polímeros PA según las fórmulas generales (10) y (11):
Y es NH; r es 2; Z es S-S-; R29 es H;
65 R30 es alquilo C1 -C6; R31 es H; y R32 es alquileno C1 -C10, donde el grupo alquileno es lineal.
imagen18
[0057] En todas estas clases preferidas de los polímeros PA según las fórmulas (10) y (11), se prefiere que cuando R30 es alquilo C1 -C10 sustituido, el grupo alquilo se sustituya por un grupo seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7),
5 N(R7)2, -C(O)OR7,-C(O)R7, -C(O)NHR7, y -C(O)NR72, donde R7 es tal como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, el grupo alquilo es sustituido por -OH, -NH2, -NH(R7), o -N(R7)2; más preferiblemente por -OH o -NH2 sustituido.
Proceso para la preparación del polímero PA
10 [0058] Según una forma de realización de la presente invención, los polímeros PA según la presente invención como representados por las fórmulas generales (1) y (2) se pueden preparar por un proceso que comprende los pasos de:
(1) reaccionar un monómero (I) según la fórmula general (12): 15
imagen19
donde R1, A y R2 son tal y como se ha definido anteriormente, con un monómero (II) según la fórmula general (13)
o un monómero (III) según fórmula (14):
20 (H2N)-R3 (13)
HR3N-R5-NR3H (14)
25 donde R3 y R5 son tal como se ha definido anteriormente, en una proporción molar de monómero (I) : monómero
(II) de aproximadamente 1,5 : 1 a aproximadamente 10 : 1 para formar un macrómero según las fórmulas generales (15) o (16):
imagen20
donde b es tal y como se ha definido por encima; y
(2) reaccionar el macrómero según las fórmulas generales (15) o (16) con un polímero según la fórmula (17); [(R42)N]a-POL (17)
donde a, POL y R4 son tal y como se ha definido anteriormente y donde al menos un R4 es H.
[0059] Por lo tanto, en esta reacción, un grupo -C(O)-C(R1)=C reacciona con un grupo (R42)N de POL bajo la formación 5 de una fracción -C(O)-CH(R1)-CH2-N(R4)-(adición de Michael) como estará claro para experto en la técnica.
[0060] Por consiguiente, la presente invención también se refiere al polímero PA según las fórmulas generales (1) y (2) que se puede obtener por este proceso.
10 [0061] Según una forma de realización preferida de la presente invención, los polímeros PA según la presente invención como se representan por las fórmulas generales (10) y (11) también se puede preparar por este proceso que comprende los pasos de:
(1) reaccionar un monómero (III) según la fórmula general (18): 15
imagen21
donde R1, Y, R29 y r son tal y como se ha definido anteriormente, con un monómero (IV) según la fórmula general
(19) o un monómero (V) según la fórmula (20):
20 (H2N)-R30 (19)
HR30N-R32-NR30H (20)
25 donde R30 y R32 son tal como se ha definido anteriormente, en una proporción molar de monómero (I) : monómero
(II) de aproximadamente 1,5 : 1 a aproximadamente 10 : 1 para formar un macrómero según las fórmulas generales (21) o (22):
imagen22
donde b es tal y como se ha definido por encima; y
(2) reaccionar el macrómero según las fórmulas generales (21) o (22) con un polímero según la fórmula (23); [(R312)N]a-POL (23)
imagen23
donde a, POL y R31 son tal y como se ha definido anteriormente y donde al menos un R31 es H.
[0062] Según la presente invención, se prefiere que la etapa (1) del proceso se realice a una temperatura que vaya desde la temperatura ambiente a aproximadamente 100°C, preferiblemente de aproximadamente 30° a 5 aproximadamente 80°C.
[0063] Según la presente invención, se prefiere que la etapa (2) del proceso se realice a una temperatura que vaya desde la temperatura ambiente a aproximadamente 100°C, preferiblemente de aproximadamente 30° a aproximadamente 80°C.
10 La nanopartícula
[0064] La presente invención también se refiere a una nanopartícula. La nanopartícula según la presente invención está representada por las fórmulas generales (3) y (4):
15
imagen24
donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, A, POL, FG, a y b son como se ha descrito anteriormente.
[0065] Según una forma de realización preferida, la nanopartícula está representada por las fórmulas generales (24) y (25):
imagen25
imagen26
donde R1, R6, R29, R30, R31, R32, Y, Z, POL, FG, a, b y r tal y como se ha definido anteriormente. El grupo funcional FG es un sustituyente que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional complementario (CFG) de un reactivo para post-modificación. El grupo FG es preferiblemente seleccionado de grupos funcionales que permitan la formación de un enlace covalente con un grupo CFG, preferiblemente bajo condiciones de reacción biocompatibles, en
5 particular bajo condiciones de pH fisiológico y temperatura ambiente y en sistemas acuosos. Tales grupos FG son bien conocidos por el experto en la materia. En particular, el grupo FG se selecciona del grupo que consiste en un grupo seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a") H; (b") alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (c") cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente
15 (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (d") arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido; (e") heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido; (f") alquilarilo C7 -C14 donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo de alquilaril es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y (g") alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos
25 independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S.
[0066] El CFG es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en -OH, -OR7, -NH2;-NH(R7), -N(R7)2, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7, y -C(O)NR72, donde R7 es tal y como se ha definido anteriormente para FG. Por ejemplo, el FG puede ser -OH y el CFG puede ser -COOH.
[0067] Las nanopartículas según las fórmulas generales (3), (4), (24) y (25) se puede preparar por un proceso donde un
35 polímero PA según las fórmulas generales (1), (2), (10) o (11), respectivamente, se reaccionan con un reactivo según la fórmula (26a) o la fórmula (26b):
FG-R6-NHR30 (26a)
FG-R6-SH (26b)
donde FG y R6 son tal y como se ha definido anteriormente, FG opcionalmente es hidrógeno. Otros de FG útiles incluyen grupos biológicamente o farmacológicamente activos, por ejemplo oligo y polipéptidos. Ejemplos adecuados para los reactivos según la fórmula (26a) y (26b) son etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina,
45 tetraetilenopentamina, 1,6-diamino hexano, PEG terminado de amina, PPO terminado de amina, PEG terminado de tiol y PPO terminado de tiol.
[0068] Sin embargo, como será aparente para los expertos en la técnica, el reactivo según la fórmula (26b) puede no solo reaccionar con los grupos acrilato de los polímeros PA según cualquiera de las fórmulas (1), (2), (10) y (11), pero también con los grupos S-S-(en caso de existir) en R2 del polímero PA según la fórmula (1) o fórmula (2) o con el grupo S-S-como se representa por Z en los polímeros PA según la fórmula (10) o la fórmula (11). Adicionalmente, ya que R3 del polímero PA según la fórmula (1) o la fórmula (2) y R30 del polímero PA según la fórmula (10) o la fórmula (11) puede comprender grupos funcionales, también se puede prever que el reactivo según la fórmula (26a) pueda reaccionar con estos grupos funcionales. Además, en vez del reactivo según la fórmula (26a), también reactivos según
55 la fórmula FG-R6-RG pueden usarse, donde RG se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR7, -C(O)OR, C(O)R7,-C(O)NHR7, -C(O)NR72 y -SO2Cl, donde R7 es tal y como se ha definido anteriormente, cuando R3 y R30 comprenden por ejemplo un grupo amino primario o secundario.
El nanogel
[0069] La presente invención también se refiere a un nanogel. Los nanogeles según la presente invención tienen como ventajas importantes que son estables en forma disuelta y dispersa. Los nanogeles según la presente invención son también estables en almacenamiento. Las soluciones de los nanogeles se pueden congelar sin perder su integridad y se pueden liofilizar a una forma de polvo que puede fácilmente ser restituida a una solución sin pérdida de actividad o
65 integridad.
imagen27
[0070] El nanogel se prepara por reticulación del polímero PA según las fórmulas generales (1) y (2), donde la reticulación es preferiblemente realizada por radiación de UV, preferiblemente radiación de UV con una longitud de onda de aproximadamente 365 nm. La reacción de reticulación es preferiblemente realizada en presencia de un fotoiniciador. La reacción de reticulación es también preferiblemente realizada en una emulsión de agua en aceite. Es además
5 preferido que la reacción de reticulación se realice a un pH inferior a 7, preferiblemente menos de aproximadamente 6. Preferiblemente, el pH es superior a aproximadamente 1, preferiblemente superior a aproximadamente 2.
[0071] La presente invención por lo tanto también se refiere a un nanogel que es obtenible por el proceso descrito anteriormente que comprende la etapa de reticulación de un polímero PA según las fórmulas generales (1), (2), (10) y (11), preferiblemente sometiendo el polímero PA a radiación UV.
Nanogeles cargados
[0072] Según la invención, se prefiere que el nanogel comprenda además un componente biológicamente activo 15 seleccionado del grupo de ARN (en particular ARNsi) o derivados o fragmentos del mismo, ADN o derivados o fragmentos del mismo, (oligo)péptidos y derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas.
[0073] La carga del nanogel se realiza por el contacto del componente biológicamente activo con el nanogel en un sistema de solvente acuoso, preferiblemente un sistema de solvente acuoso tamponado, donde el sistema de solvente acuoso tiene preferiblemente un pH fisiológico. Métodos para la carga de los nanogeles se conocen en la técnica.
Modificación de superficie de los nanogeles
[0074] El nanogel según la presente invención, bien en la forma cargada o en la forma descargada, se puede además 25 funcionalizar por post-modificación.
[0075] Según una forma de realización preferida de la post-modificación, el nanogel que se puede obtener por los polímeros PA de reticulación según las fórmulas (1) o (2), donde R3 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a1) alquilo C1 -C10 sustituido, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos son independientemente seleccionados de O, N y S; (b1) cicloalquilo C3 -C12 sustituido, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o
35 opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (c1) arilo C6 -C12 sustituido; (d1) Heteroarilo C6 -C12 sustituido, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (e1) alquilarilo C7 -C14 sustituido, donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (f1) alquilheteroarilo C7 -C14 sustituido, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal
45 o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
donde los grupos anteriores (a) -(f) comprenden un grupo funcional (FG) como un sustituyente que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional complementario (CFG) de un reactivo para post-modificación R y donde los nanogeles opcionalmente comprenden un componente biológicamente activo, se reacciona con dicho reactivo R según el proceso:
imagen28
[0076] El grupo CFG es capaz de formar un enlace covalente con el grupo FG. Ejemplos adecuados para grupos FG y 55 CFG con bien conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, el FG puede ser un grupo -COOH mientras que el grupo CFG es un grupo -NH2.
[0077] Según una forma de realización preferida, el grupo funcional FG se selecciona del grupo que consiste en un grupo seleccionado de -OH, -OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2,-C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72, donde R7 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a") H; (b") alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos,
65 donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
imagen29
(c") cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (d") arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
5 (e") heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido; (f") alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y (g") alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se
15 seleccionan independientemente de O, N y S.
[0078] Según otra forma de realización preferida de la post-modificación, el nanogel que se puede obtener por reticulación de polímeros PA según las fórmulas (10) o (11), se reacciona con un reactivo para post-modificación R' según el proceso:
imagen30
[0079] Los grupos R y R' son preferiblemente 2-tioetilo, 2-hidroxietilo, y residuos de PEG (polietilenóxido) residuos o residuos de PPO (polipropilenóxido) que tienen un peso molecular de promedio en número Mn de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000. Como será aparente para los expertos en la técnica, el reactivo R'-SH puede también
25 reaccionar con los grupos S-S-(en caso de existir) en el nanogel como se ha descrito anteriormente para los polímeros PA según las fórmulas (1), (2), (10) y la fórmula (11).
[0080] La presente invención por lo tanto se refiere además a nanogeles de superficie modificada que son obtenibles por un primer proceso que incluye las etapas de:
(1)
reticular un polímero PA según las fórmulas generales (1), (2), (10) o (11), preferiblemente sometiendo el polímero PA a radiación UV para formar un nanogel;
(2)
opcionalmente cargar el nanogel con un componente biológicamente activo seleccionado del grupo de ARN (en
particular ARNsi) o derivados o fragmentos del mismo, ADN o derivados o fragmentos del mismo, (oligo)péptidos y 35 derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas; y
(3) reaccionar el nanogel con un reactivo R-CFG o R'-SH.
[0081] Los nanogeles de superficie modificada son también obtenibles por un segundo proceso que incluye las etapas de:
(1') reticular un polímero PA según las fórmulas generales (1), (2), (10) o (11), preferiblemente sometiendo el polímero PA a radiación UV para formar un nanogel; (2') reaccionar el nanogel con un reactivo R-CFG o R'-SH; y (3') opcionalmente cargar el nanogel con un componente biológicamente activo seleccionado del grupo de ARN
45 (en particular ARNsi) o derivados o fragmentos del mismo, ADN o derivados o fragmentos del mismo, (oligo)péptidos y derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas.
[0082] Los nanogeles de superficie modificada son también obtenibles por un tercer proceso que incluye las etapas de:
(1") reaccionar el nanogel con un reactivo R-CFG o R'-SH formando así un nanogel funcional; (2") reticular el nanogel funcionalizado, preferiblemente sometiendo el nanogel funcionalizado a radiación UV para formar un nanogel; y (3") opcionalmente cargar el nanogel con un componente biológicamente activo seleccionado del grupo de ARN (en particular ARNsi) o derivados o fragmentos de los mismos, ADN o derivados o fragmentos de los mismos,
55 (oligo)péptidos y derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas.
[0083] En la etapa (1) del primer proceso y la etapa (1') del segundo proceso, no todos los grupos acrilato necesitan ser reticulados de modo que los grupos acrilatos no reticulados pueden ser funcionalizados en la etapa (3) del primer proceso y la etapa (2) del segundo proceso, respectivamente. Asimismo, en la etapa (1") del tercer proceso, no todos los grupos acrilato necesitan ser funcionalizados a esos grupos acrilato no reticulados pueden todavía ser reticulados. Por consiguiente, el producto obtenido en cualquiera de estos tres procesos puede ser muy complejo. Según la presente invención, se prefiere incluso que cuando primero se realiza una etapa de funcionalización no todos los grupos acrilato sean funcionalizados así permitiendo más reticulación de los grupos acrilato restantes. Asimismo, también se prefiere cuando primero un paso de reticulación se realiza no todos los grupos acrilato son reticulados así permitiendo más 65 funcionalización de los grupos acrilato restantes. Un experto en la técnica será bien capaz de seleccionar las
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condiciones de reacción apropiadas, en particular seleccionando proporciones molares apropiadas de reactivos y materias primas, para controlar el grado de reticulación y funcionalización. Además, y como se ha descrito anteriormente, hay otros grupos reactivos en los polímeros PA, por ejemplo grupos S-S-, que puede ser funcionalizados conjuntamente con los grupos acrilato.
5 Aplicaciones
[0084] Los nanogeles según la presente invención son muy adecuados como portadores de entrega de fármacos debido a su alta capacidad de carga, alta estabilidad y receptividad a factores medioambientales, tales como fuerza iónica, 10 potencial de reducción, pH y temperatura. En particular, los nanogeles según la presente invención tienen beneficios adicionales para entregar componentes biológicamente activos sobre sistemas nanogranulosos poliméricos autoensamblados como vehículos de entrega, ya que en el caso de estos nanogeles todos los constituyentes poliméricos se incorporan en el nanogel de entrega mientras que en los sistemas nanogranulosos poliméricos autoensamblados normalmente el exceso de polímero libre en la solución es necesario debido a las condiciones de
15 equilibrio. Esto causa frecuentemente efectos de citotoxicidad no deseada y en la dilución de la desestabilización de la formulación de las nanopartículas.
Ejemplos
20 Materiales y métodos
[0085] Cistamina bisacrilamida (CBA, Polysciences, EE.UU.) fue comprada en el máximo grado de pureza y usada sin purificación adicional. Polietilenimina (PEI) de bajo peso molecular con peso molecular promedio en peso 800 Da (PEI800) se obtuvo de Aldrich. Un fotoiniciador Igracure 2959 fue comprado de Ciba. El surfactante ABIL EM 90 fue
25 comprado de Degussa-Goldschmidt (Evonik). ARNsi anti-luciferasa fue comprado de Eurogentec, AllStars. ARNsi de control negativo fue comprado de Qiagen. Todos otros productos químicos fueron comprados de Aldrich. Todos los reactivos y solventes fueron de grado reactivo y fueron usados sin purificación adicional. Espectros de RMN fueron registrados en Varian Unity 300 (1H NMR 300 MHz) utilizando tetrametilsilano (TMS) como estándar interno.
30 Ejemplo 1: síntesis de macrómero de diacriloilo (A-(CBA-ABOL)n-A).
[0086] Aproximadamente 0,48 g (0,0054 mol.) de 4-amino-1-butanol (ABOL) y 1,56 g (0,006 mol) de CBA (9/10 mol/mol proporción ABOL/CBA) se añadió a 3 ml de una solución de CaCl2 (0,4 M) en metanol-agua 3/1 (v/v) y el matraz de reacción fue sellado. La polimerización se efectuó a 50°C y la reacción se dejó proceder durante 30 h, produciendo una
35 solución viscosa. La reacción fue monitoreada siguiendo con 1H-NMR, las áreas integradas de dos picos de acriloilo (5,55 y 6,05) y dos picos de metileno de los grupos laterales de butanol (1,58 ppm y 1,78 ppm). Al final de la polimerización, las integraciones de RMN indicaron que el macrómero (A-(CBA-ABOL)n-A) contenía alrededor de seis unidades de ABOL por grupo de acriloilo, es decir n=12.
40 Ejemplo 2: síntesis de p(CBA-ABOL/PEI) hiperramificado
[0087] Un volumen de 2,12, 1,06, 0,53 o 0,26 ml de una solución de PEI 800 bajo peso molecular (100 mg/ml) se añadió a 1,34 g macrómero de A-p(CBA-ABOL)12-A diacriloilo en 3 ml metanol-agua 3/1 (v/v) para conseguir una proporción molar deseada de grupos acriloilo a PEI de 3/1, 6/1, 12/1 y 24/1, respectivamente. La mezcla fue diluida con una 45 solución 0,4 M de CaCl2 en metanol-agua 3/1 (v/v) a una concentración de PEI final de 10 mM para prevenir la gelificación durante la reacción. La reacción se efectuó a 50 C durante 24 h. Posteriormente, una mitad de la mezcla reactiva que contiene extremo encapsulado de p(CBA-ABOL)/PEI con grupos CBA acriloilo fue separada para la síntesis de los nanogeles. Para la segunda mitad de la mezcla reactiva un exceso de 10 veces de etilenodiamina (EDA) fue añadido para transformar todos los grupos CBA acriolilo terminales en aminas. La solución resultante de p(CBA
50 ABOL)/PEI de extremo recubierto con etilenodiamina fue diluida con agua a aproximadamente 30 ml, acidificado con 4 M HCl a pH ~ 4, y luego purificado utilizando una membrana de ultrafiltración (MWCO 1000 g/mol). Después de la liofilización, el polímero (CBA-ABOL)/PEI hiperramificado terminado con EDA fue recogido como HCI-sal. Rendimiento 30-50%. Las proporciones ABOL/Acriloilo para diferentes de p(CBA-ABOL)/PEI se resumen en la tabla 1.
55 Tabla 1
p(CBA-ABOL)/PEI13%
p(CBA-ABOL)/PEI7% p(CBA-ABOL)/PEI4% p(CBA-ABOL)/PEI 2%
Muestra nº
1 2 3 4
Contenido de PEI en el pienso, % en peso
13 7 4 2
Acriloil/PEI (mol/mol) en el pienso
3 6 12 24
ABOL / Acriloil (mol/mol) inp(CBA-ABOL)/PEI restante
>100 30 18 13
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Ejemplo 3: síntesis de p(CBA-ABOL)/PAMAM hiperramificado
[0088] Un volumen de 1,16, 0,87 o 0,58 ml de una solución de dendrímero PAMAM de segunda generación (G2) (100 mg/ml) se añadió a 1,34 g macrómero de A-p(CBA-ABOL)12-A diacriloilo en 3 ml metanol-agua 3/1 (v/v) para conseguir 5 una proporción molar deseada de grupos acriloilo a moléculas PAMAM de 10/1,15/1 y 20/1, respectivamente. La mezcla fue diluida por una solución 0,4 M de CaCl2 en metanol-agua 3/1 (vol./vol.) a una concentración final de PAMAM de 10 mM para prevenir la gelificación durante la reacción. La reacción se efectuó a 50°C durante 24 h. Posteriormente, una mitad de la mezcla reactiva que contenía extremo recubierto de p(CBA-ABOL)/PAMAM con grupos CBA acriloilo fue separada para la síntesis de nanogeles. A la segunda mitad de la mezcla reactiva un exceso de 10 veces de 10 etilenodiamina (EDA) fue añadido para transformar todos los grupos CBA acriolilo terminales en aminas. La solución resultante de p(CBA-ABOL)/PAMAM de extremo recubierto de etilenodiamina fue diluida con agua a aproximadamente 30 ml, acidificado con 4 M HCl a pH~4, y luego purificado utilizando una membrana de ultrafiltración (MWCO 1000 g/mol). Después de la liofilización, el polímero p(CBA-ABOL)/PAMAM hiperramificado terminado en EDA fue recogido como HCI-sal. Rendimiento 30-50%. Las proporciones ABOL/Acriloilo para diferentes composiciones de p(CBA
15 ABOL)/PAMAM son resumidas en la tabla 2
Tabla 2
p(CBA-ABOL)/PAMAM-8%
p(CBA-ABOL)/PAMAM-6% p(CBA-ABOL)/PAMAM-4%
Muestra nº
5 6 7
Contenido de PAMAM en el pienso (% en peso)
8 6 4
Acriloil/PAMAM en el de pienso (mol/mol)
10 15 20
ABOL/Acriloil en p(CBA-ABOL)/PAMAM (mol/mol) restante
23 14 13
20
Ejemplo 4: síntesis de p(CBA-ABOL)/oligoaminas hiperramificados terminado con EDA
[0089] Polímeros hiperramificados terminados con EDA fueron preparados por reacción de los polímeros hiperramificados de las tablas 1 y 2 con un exceso de EDA. Las reacciones se dejaron proceder hasta que se produjo la 25 desaparición completa de grupos acriloilo, como fue confirmado por RMN.
Tabla 3
Polímero hiperramificado
p(CBA-ABOL)/PEI13% p(CBA-ABOL)/PEI7% p(CBA-ABOL)/PEI4% p(CBA-ABOL)/PEI -2%
Muestra nº
1 2 3 4
Muestra nº de polímero hiperramificado terminado con EDA
8 9 10 11
30 Ejemplo 5: síntesis de nanogeles de p(CBA-ABOL)/oligoamina (NG-PAAs) [0090] Los siguientes polímeros hiperramificados (véase Tabla 3) fueron reticulados de la siguiente manera. Tabla 4
Polímero hiperramificado
p(CBA-ABOL)/PEI2% p(CBA-ABOL)/PEI4% p(CBA-ABOL)/PAMAM-6% p(CBA-ABOL)/PAMAM-4%
Muestra nº de NG-PAA
12 13 14 15
35
[0091] Una solución de 500 mg p(CBA-ABOL)/oligoamina terminada con acriloilo (oligoamina = PEI o PAMAM) fue acidificada a temperatura ambiente con 4 M HCl a pH 4. El metanol fue evaporado a partir de la solución de reacción en un flujo de nitrógeno. El volumen de la solución fue posteriormente ajustado a 4 ml con agua desionizada. Después de 40 la adición de 5 mg de fotoiniciador Igracure 2959, la fase acuosa fue emulsionada en 30 ml de aceite mineral que contenía 10% de surfactante ABIL EM 90 a través de ultrasonido (Bandelin Sonoplus GM 2070) durante 5 min (amplitud 75%). Inmediatamente después del ultrasonido, las nanogotitas fueron reticuladas por irradiación UV (5 mW/cm2 a 365 nm durante 1 h) bajo agitación. Para eliminar el fase continua, la emulsión fue diluida con 100 ml de mezcla de acetona/hexano 1/1 (v/v). Los nanogeles de p(CBA-ABOL)/oligoamina reticulada (con acrónimo NG-PAAs) fueron
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infragranulados por centrifugación (8000 r.p.m., 5 min), lavados a partir del surfactante cuatro veces con mezcla de acetona/hexano y redispersados en 30 ml de agua desionizada. Después de la purificación utilizando una membrana de ultrafiltración (MWCO 10000 g/mol) y liofilización, los NG-PAAs fueron almacenados a -20°C. Los rendimientos fueron 20-25%.
5
Ejemplo 6: síntesis de poli(etilenglicol)es tiol-funcionalizados (PEG-SH)
[0092] PEG tiol-funcionalizado (PEG-SH) con peso molecular de 2000 g/mol fue sintetizado a partir de metoxi PEG en una síntesis de tres pasos como se describe abajo.
PEG-mesilato
[0093] El grupo hidroxilo de metoxi PEG fue activado por mesilación según un procedimiento ligeramente modificado como fue publicado por Elbert et al. (D. L. Elbert, J. A. Hubbell, Biomacromolecules 2001, 2, 430). En un ejemplo típico
15 10,0 g (5 mmol, 1 eq) de metoxi PEG (Pm = 2000 g/mol) fue secado dos veces en una destilación azeotrópica de 70 ml de tolueno seco. Después del segundo paso de destilación, el PEG fue disuelto en 20 ml de diclorometano seco seguido por la adición de 6,6 ml (15 mmol, 3 eq) de trioctilamina. Posteriormente, la solución fue enfriada en un baño de hielo y 1,72 g de cloruro de mesilo fue añadido gota a gota. La reacción se dejó que procediera durante toda la noche a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno, seguido de precipitación en éter dietílico. PEG-mesilato fue finalmente recogido como un polvo blanco por filtración y secado al vacío. Rendimiento: 83%. 1H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3,08 (s, 3H, OSO2CH3); 3,37 (s, 3H, CH3OCH2); 3,40 (t, 2H, CH3OCH2); 3,52 -3,90 (m, 176H, PEG); 4,38 (t, 2H, CH2CH2OSO2CH3).
PEG-tioacetato
25 [0094] En el segundo paso el grupo mesilato fue convertido en un tioacetato según un procedimiento de bibliografía modificada (C. Woghiren, B. Sharma, S. Stein, Bioconjugate Chem. 1993, 4, 314). Por lo tanto, 3,0 g (1,5 mmol, 1 eq) de PEG-mesilato fue disuelto en 10 ml de piridina seca y separadamente 2,23 g (19,5 mmol, 13 eq) de tioacetato de potasio fue disuelto en 28 ml de una mezcla 2/1 (v/v) de piridina/metanol seco. La solución de PEG-mesilato y 2,6 ml de trioctilamina fue luego añadida a la solución de tioacetato de potasio y la mezcla reactiva fue agitada durante toda la noche a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno. Todos los solventes fueron evaporados, el residuo fue disuelto en 10 ml de solución salina y extraído cuatro veces con diclorometano. La fase orgánica fue secada de sulfato de magnesio, concentrada y precipitada dos veces en éter dietílico. PEG-tioacetato fue finalmente recogido como un polvo blanco por filtración y secado al vacío. Rendimiento: 78%. 1H NMR (CDCl3) δ (ppm): 2,33 (s, 3H, CH2SCOCH3);
35 3,08 (t, 3H, CH2SCOCH3); 3,37 (s, 3H, CH3OCH2); 3,40 (t, 2H, CH3OCH2); 3,52 -3,90 (m, 176H, PEG).
PEG-tiol (PEG-SH)
[0095] En el último paso el tioacetato estaba desprotegido para producir PEG-SH (O. B. Wallace, D. M. Springer, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2693). Por lo tanto, 2,3 g (1,2 mmol, 1 eq) de PEG-tioacetato fue disuelto en 10 ml de metanol bajo una atmósfera de nitrógeno. A esta solución 81 mg (1,2 mmol, 1 eq) de tiometoxideo de sodio disuelto en 1 ml de metanol fue añadido y la solución fue agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego la mezcla reactiva fue vertida en 20 ml de 0,1 M de ácido clorhídrico acuoso y extraída con diclorometano. La estrato orgánico se lavó con solución salina y todos los solventes fueron retirados por evaporación rotacional. Para eliminar las últimas
45 impurezas, PEG fue disuelto en 40 ml de agua desmineralizada que contenía 0,35 g de DTT (2,3 mmol, 2 eq) para reducir tiolos posiblemente oxidados y dializados por ultrafiltración con un corte de peso molecular de 1000 g/mol. PEG-SH fue finalmente obtenido como un polvo esponjoso blanco por liofilización. Rendimiento: 85%. 1H NMR (CDCl3) δ (ppm): 1,59 (t, 1H, CH2CH2SH); 2,68 (q, 2H, CH2CH2SH); 3,37 (s, 3H, CH3OCH2; 3,40 (t, 2H, CH3OCH2); 3,52 -3,90 (m, 176H, PEG).
[0096] La conversión total de hidroxilo en tiol fue determinada por el reactivo de Ellman y se comprobó que era 100%.
Ejemplo 7: preparación de ARNsi p(CBA-ABOL)/hiperramificado/poliplejos de oligoamina
55 [0097] Poliplejos fueron preparados a partir de CBA-ABOL (referencia, ejemplo 1), números de muestra 1 -4 (véase, Tabla 1) y 5 y 6 (véase, Tabla 2).
[0098] En el experimento típico, una solución de ARNsi fue preparada a una concentración final de 0,025 mg/ml en glucosa tamponada con HEPES (HBG) (pH 7,4). Una solución madre de p(CBA-ABOL)/oligoamina hiperramificada (1,25 mg/ml) en HBG (pH 7,4) fue preparada y fue usada para la preparación de poliplejos a 50/1 p/p proporción de polímero/ARNsi. Esta solución fue reiteradamente diluida 1:1 con HBG para preparar poliplejos con 25/1, 12/1 y 6/1 p/p proporción de polímero/ARNsi. Volúmenes típicamente iguales de ARNsi y soluciones de p(CBA-ABOL)/oligoamina de p(CBA-ABOL)/oligoamina hiperramificada fueron mezclados en un tubo de Eppendorf de 1 ml. Después de la mezcla, la solución de poliplejo fue incubada durante 20 min a temperatura ambiente. Para proporciones más altas (o dosis
65 aplicada) concentraciones aumentadas de los componentes fueron aplicadas.
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Ejemplo 8: carga de ARNsi de nanogeles NG-PAA
[0099] Los nanogeles del ejemplo 4 al igual que un nanogel obtenido a partir del macrómero de diacriloilo (A-(CBA5 ABOL)n-A) del ejemplo 1 fueron cargados con ARNsi.
[0100] En el experimento típico, una solución de ARNsi fue preparada a una concentración final de 0,025 mg/ml en glucosa tamponada con HEPES (HBG) (pH 7,4). Una dispersión de NG-PAAs (1,25 mg/ml) en HBG (pH 7,4) fue preparada y fue usada para la carga a 50/1 proporción en peso nanogel/ARNsi. La dispersión NG-PAA fue reiteradamente diluida 1:1 con HBG para preparar nanogeles cargados con ARNsi con 25/1, 12/1 y 6/1 proporción en peso de polímero/ARNsi. Volúmenes típicamente iguales de soluciones de ARNsi y nanogel fueron mezclados en un tubo Eppendorf de 1 ml e incubados durante 20 min a temperatura ambiente. Para proporciones más altas (o dosis aplicadas) concentraciones más altas de los componentes apropiados fueron aplicadas en los mismos volúmenes como se da por encima.
15
Ejemplo 9: ensayo de desplazamiento bromuro de etidio (EtBr)
[0101] La capacidad de los polímeros hiperramificados terminados con EDA del ejemplo 4 y los nanogeles NG-PAA del ejemplo 5 para condensar ARNsi fue estudiada utilizando un ensayo de bromuro de etidio (EtBr). El polímero de p(CBA-ABOL) (ejemplo 1) fue usado como una referencia.
[0102] Una solución del polímero hiperramificado o el nanogel NG-PAA fue añadida paso a paso a la solución de ARNsi (10 µg/mL) en HBG que contenía EtBr (0,4 µ g/mL). Después de cada paso, la intensidad de fluorescencia fue monitorizada ( λex= 510 nm, λem = 590 nm). La intensidad de fluorescencia de la solución de EtBr en presencia de
25 ARNsi libre correspondía a 0% de condensación, mientras que la intensidad de fluorescencia sin ARNsi correspondía a 100% de condensación de ADN.
[0103] Los resultados se muestran en las figuras 1 -3. La figura 1 muestra que el polímero p(CBA-ABOL) mismo tiene una eficiencia más bien baja en la complejación de ARNsi. Sin embargo, los polímeros hiperramificados terminados con EDA y nanogeles NG-PAA tienen una capacidad enlazante significativamente más alta. Los polímeros hiperramificados terminados con EDA y nanogeles NG-PAA que contenían PEI mostraron afinidad más alta a ARNsi que aquellos que contenían PAMAM (figuras 1 y 2). Los nanogeles NG-PAA tienen una capacidad más alta para condensar ARNsi que los polímeros hiperramificados terminados con EDA correspondientes (figura 3).
35 Ejemplo 10: silenciación génica in vitro
[0104] La caída de la eficiencia fue determinada silenciando la expresión de luciferasa en células NCI-H1299, expresando de forma estable luciferasa de luciérnaga (donada por el prof. G. Storm, University of Utrecht, Países Bajos). La caída y la viabilidad celular fueron evaluadas en dos sesiones paralelas, utilizando antiluciferasa y ARNsi no codificante, respectivamente. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos con una densidad de 8.000 células por pocillo. Después de 24 h de incubación a 37°C en una atmósfera humedecida conteniendo 5% de CO2, el medio fue sustituido con 100 µl medio sin suero fresco. Tanto el ARNsi de anti-luciferasa como el ARNsi no codificante fueron usados. Lipofectamine 2000 (LF) se usó como referencia y se prepararon complejos según el protocolo del fabricante. Poliplejos o nanogeles cargados con ARNsi (10 µl por pocillo) fueron adicionados a las células por triplicado después de
45 una hora de incubación con medio fresco, dando como resultado una concentración de ARNsi final de 72 nM. Después dos horas de transfección en el medio libre de suero, el medio de poliplejo fue sustituido por el medio de cultivo completo y las células fueron incubadas durante otras 48 h. Las células fueron lisadas en 50 µl de tampón de lisis y 20 µl del lisato celular fue mezclado con 50 µl de reactivo de ensayo de luciferasa que contenía la luciferina de sustrato. Después de 100 -220 segundos (en este plazo la luz emitida es constante) la actividad de luciferasa fue determinada por la medición de la luminiscencia a 25°C durante 4 segundos en un lector de placa PerkinElmer 1420 Victor3. La actividad de luciferasa de las células no tratadas fue definida como 100% de expresión.
[0105] Las figuras 4 -6 muestran el gen que silencia la eficiencia de las muestras número 1 -4 según el ejemplo 2 (figura 4), de las muestras número 5 y 6 según el ejemplo 3 (figura 5) y de los nanogeles NG-PAA según el ejemplo 5
55 (figura 6). Los números en el eje x representan la proporción de polímero/ARNsi. El polímero CBA/ABOL no mostró ninguna eficiencia en la entrega de ARNsi.
Ejemplo 11: medición de tamaño de partícula y potencial zeta.
[0106] Los tamaños de partícula y los potenciales de zeta de los poliplejos cargados y descargados y los nanogeles fueron medidos por dispersión de luz láser utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK).
[0107] A altas proporciones de mezcla de polímero/ARNsi (p/p 12 o más) no se observaron diferencias significativas en tamaño de las partículas de poliplejo formadas por polímeros hiperramificados terminados con EDA diferentes. Todos 65 los polímeros hiperramificados terminados con EDA formaron poliplejos pequeños con tamaños que oscilaban de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 nm y los potenciales de zeta fueron de aproximadamente 30 a
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5 [0108] La carga de nanogeles llevó a la deshinchazón y reducción gradual de sus tamaños tras la reducción de una proporción de mezcla. El tamaño de la muestra nº 12 disminuyó de aproximadamente 120 nm (descargado) a aproximadamente 90 nm (cargado p/p 50) a aproximadamente 75 nm (cargado p/p 12).
[0109] Otra reducción más de la proporción de mezcla (aumento de carga de ARNsi) llevó a la agregación de las
10 partículas de nanogel de forma similar fue observado para los polímeros hiperramificados terminados con EDA. Los potenciales de zeta de los nanogeles descendió ligeramente tras la carga. Para la muestra nº 12, el potencial de zeta disminuyó de aproximadamente 28 mV (descargado) a aproximadamente 26 mV (cargado p/p 50) a aproximadamente 20 mV (cargado p/p 12).
15 Ejemplo 12: citotoxicidad
[0110] Estudios de viabilidad celular fueron realizados con células NCI-H1299 en ausencia y en presencia de 10% de FBS. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos con una densidad de 8.000 células por pocillo 24 h antes de la transfección. Una serie de dilución de polímeros hiperramificados o soluciones de nanogel NG-PAA fueron 20 preparadas de 12,5 a 0,02 mg/ml y 10 µl de la solución se añadió a 100 µl de medio de crecimiento. Después de 24 horas de incubación, la viabilidad celular fue medida utilizando un ensayo XTT, donde el valor XTT para células no tratadas (células no expuestas a sistemas de transfección) fue tomado como 100% de viabilidad celular. Las curvas de viabilidad celular para las muestras número 4 y 12 en ausencia de suero se muestran en la figura 7. Se muestra que especialmente los nanogeles muestran la citotoxicidad más baja. Por comparación: la concentración polimérica es 0,055
25 mg/mL en transfecciones celulares a proporción de polímero/ARNsi 48/1.
Ejemplo 13: transfección in vitro bajo condiciones de suero
[0111] Estudios de transfección fueron realizados con células NCI-H1299 según un procedimiento similar como se
30 describe en el ejemplo 10. Sin embargo, en este caso, el medio de transfección también contenía 10% de FBS y las células fueron incubadas con nanogeles cargados con ARNsi durante 48 h antes de que se realizara el ensayo de luciferasa. Soluciones de muestra de nanogel cargado con ARNsi muestra nº 12 con dosis en aumento de ARNsi (dando como resultado 125, 250 y 500 ng de ARNsi por pocillo (100 µL) en el medio de incubación, es decir 72, 144 y 288 nM, respectivamente), o soluciones con dosis constante de ARNsi (72 nM) con proporción en aumento de nanogel
35 muestra nº 12 fueron preparadas según el procedimiento descrito en el ejemplo 8. Los resultados de la silenciación del gen de luciferasa para estas formulaciones diferentes se muestran en las figuras 8 y 9, respectivamente.
Ejemplo 14: modificación de superficie de formulaciones de nanogel NG-PAA
40 [0112] La superficie de la muestra nº 12 fue modificada por PEG utilizando una reacción de intercambio entre terminal -SH en las cadenas de PEG y grupo -S-S-en los nanogeles. En el experimento típico, la solución de ARNsi (0,05 mg/ml) fue mezclada con un volumen igual de solución de nanogel de 2,5 mg/ml en HBG (pH 7,4). Después de la mezcla, la solución de nanogel fue incubada durante 20 min a temperatura ambiente y un volumen igual de la solución de PEG-SH en HBG fue añadido. La concentración de PEG-SH varió de 0,125 mg/ml a 2,5 mg/ml para conseguir proporciones de
45 PEG-SH/nanogel de 0,1 a 2. Los tamaños y potenciales de zeta de las nanopartículas fueron posteriormente seguidos de DLS. Para estudios de estabilidades de coloide un volumen definido de la solución de NaCl (3,15 M) fue añadido 40 min después de la adición de PEG-SH para conseguir una concentración final de NaCl 150 mM. Después de esto, los tamaños de las partículas fueron monitorizados como una función de tiempo. Resultados para tamaño y potencial zeta se muestran en la tabla 4 antes y después de la modificación de superficie por PEG 2 kDa.
50 Tabla 5
10% p/p PEG
20% p/p PEG 40% p/p PEG 100% p/p PEG
0 min
40 min 0 min 40 min 0 min 40 min 0 min 40 min
Tamaño, nm
91 106 95 109 92 112 94 106
Zeta, mV
26 21 26 21 26 10,6 27 8,9
[0113] La Figura 10 muestra datos para entrega de ARNsi a células H1299 por la muestra nº 12 modificada con PEG. 55 Proporción de polímero/ARNsi 50 p/p. Condiciones libres de suero.
Ejemplo 15: estabilidad de las formulaciones de nanogel contra los ciclos de congelación-descongelación y liofilización
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[0114] Las formulaciones de propiedades con ARNsi de muestra nº 4 hiperramificada y muestra de nº 12 de nanogel después de los ciclos de congelación-descongelación y liofilización fueron estudiadas por DLS.
[0115] La congelación de las formulaciones de la muestra nº 4 dio como resultado la agregación de nanopartículas de
5 poliplejo. El tamaño de los poliplejos a proporción de mezcla de 50 p/p aumentó de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 600 nm después de un ciclo de congelación-descongelación. Tampoco fue posible reconstruir la formulación liofilizada por adición de agua de MilliQ. Después de 15 min de agitación en vórtex, una cantidad significativa de material insoluble estaba todavía presente en la solución.
10 [0116] En el caso de las formulaciones de nanogel de la muestra nº 12, sin embargo, prácticamente no se observó ningún cambio en el tamaño de las partículas después de tanto la congelación-descongelación como de la liofilización. Los tamaños de las partículas a 50 p/p de proporción de mezcla de la formulación inicial y los de después de un ciclo de congelación-descongelación y después de una liofilización fueron aproximadamente 91, aproximadamente 94 y aproximadamente 103 nm, respectivamente. Las formulaciones no perdieron su actividad después de estos procesos
15 (figura 11: las barras grises de la izquierda representan la formulación con ARNsi anti-LUC, la barra gris de la derecha es ARNsi sin sentido como control. Proporción de polímero/ARNsi 50 p/p. Condiciones libres de suero. Las tres formulaciones mostraron la misma eficiencia en la caída del gen objetivo.

Claims (16)

  1. imagen1
    Reivindicaciones
    1. Polímero según las fórmulas (1) y (2):
    imagen2
    donde:
    10 A es independientemente seleccionado de un enlace simple de carbono-carbono directo (es decir una estructura donde A está ausente), O, N(R1) y S; R1 se selecciona independientemente de H y CH3; R2 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
    15 (a) alquileno C1 -C40, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo alquileno se interrumpe por uno o varios grupos -S-S-;
    (b) cicloalquileno C3 -C40, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente
    20 (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo cicloalquileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S-fuera del anillo;
    (c) arileno C6 -C40, donde el grupo arileno es opcionalmente sustituido;
    (d) heteroarileno C6 -C40, donde el grupo heteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos 25 independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarileno es opcionalmente sustituido;
    (e) alquilarileno C7 -C40, donde el grupo alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarileno se interrumpe por uno
    30 o varios grupos -S-S-;
    (f) alquilheteroarileno C7 -C40, donde el grupo alquilheteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos,
    35 donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno se interrumpe por uno o varios grupos -S-S-; y
    (g) un grupo donde dos grupos (hetero)arileno C7 -C40 y/o grupos alquil(hetero)arileno C7 -C40 están conectados entre sí por un grupo -S-S-, donde la parte alquilo del grupo alquil(hetero)arileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios
    40 heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    R3 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
    (a)
    H;
    (b)
    alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    (c)
    cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente
    imagen3
    5 (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    (d)
    arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
    (e)
    heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido;
    (f)
    alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y
    15 (g) alquilheteroariloC7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    R4 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) H;
    (b) alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado; 25 (c) cicloalquilo C3 -C12;
    (d)
    arilo C6 -C14;
    (e)
    heteroarilo C6 -C14, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S;
    (f)
    alquilarilo C7 -C14; y
    (g)
    alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S;
    R5 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
    35 (a) alquileno C1 -C12, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S:
    (b)
    cicloalquileno C3 -C12, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    (c)
    arileno C6 -C12, donde el grupo arileno es opcionalmente sustituido;
    (d)
    Heteroarileno C6 -C12, donde el grupo heteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarileno es opcionalmente sustituido;
    (e)
    alquilarileno C7 -C12, donde el grupo alquilarileno es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de
    45 alquilo del grupo alquilarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y
    (f) alquilheteroarileno C7 -C12, donde el grupo alquilheteroarileno comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarileno es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarileno es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    POL representa un núcleo polimérico que tiene un peso molecular promedio en peso Pm de aproximadamente 300 55 a aproximadamente 25.000;
    a = 2 -64; y
    b =1 -50.
  2. 2.
    Polímero según la reivindicación 1, donde el peso molecular promedio en peso Pm del núcleo polimérico POL es de aproximadamente 300 a aproximadamente 5.000.
  3. 3.
    Polímero según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el núcleo polimérico POL se basa en o se selecciona
    de un (co)polímero ramificado, hiperramificado, multi-brazo, dentrítico o tipo estrella. 65
  4. 4.
    Polímero según la reivindicación 3, donde el (co)polímero tiene 2 -64 grupos amino terminales.
  5. 5.
    Polímero según la reivindicación 4, donde los grupos amino son grupos amino primarios.
  6. 6.
    Polímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, donde el núcleo polimérico POL se basa en o se selecciona del grupo que consiste en PEI, PAMAM, PPI, PEAN y PEAC.
  7. 7.
    Polímero según la reivindicación 6, donde el PEI se representa por las fórmulas generales (5a) y (5b):
    imagen4
    imagen5
    donde n es de manera que el PEI tiene un peso molecular promedio en peso Mn de aproximadamente 600 a aproximadamente 3.000. 15
  8. 8. Polímero según la reivindicación 6, donde el núcleo polimérico POL se basa en o se selecciona del grupo que consiste en los polímeros representados por las fórmulas generales (6) -(9):
    N(R8)3-n[(CR92)m-N(R10R11)]n (6) 20 [(R10R11)N-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)m-N(R10R11)]2 (7)
    N(R8)3-n[(CR92)m-C(O)N(R9)-(CR92)m-N(R12R13)]n (8)
    25 [(R12R13)N-(CR92)m-N(R9)C(O)-(CR92)m]2N-P-N[(CR92)-C(O)NH-(CR92)m-N(R12R13)]2 (9)
    donde:
    R8 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C20 lineal o ramificado o un grupo -[(CR142)q-X]o-R15, donde X 30 es O o N(R8); m es 2, 3 o 4;
    imagen6
    n es 2 o 3;
    o es 1 -10; q es 2, 3 o 4; P es -(CR92)m-, un grupo arileno C6 -C12, un grupo cicloalquileno C6 -C12 o un grupo [(CR142)q-X]p-C(R14)2]-, donde
    5 X esOoN(R8) ypes1-10; R9 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R10 y R11 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR142)qNR16R17, siempre que R10 y R11 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R16 y R17 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo
    10 de la fórmula -(CR142)qNR18R19, siempre que R16 y R17 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R18 y R19 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR142)qNR20R21, siempre que R18 y R19 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R20 y R21 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado, siempre que R20 y R21 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado;
    15 R22 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, siempre que al menos un R22 sea un átomo de hidrógeno; R15 es un hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C20 lineal o ramificado o un grupo -[(CR142)q-X]o-R15 tal y como se ha definido anteriormente; R12 y R13 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R23R24), siempre que R12 y R13 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6
    20 lineal o ramificado; R23 y R24 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R25R26), siempre que R21 y R22 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R25 y R26 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado o un grupo
    25 de la fórmula -(CR92)m-C(O)NH-(CR92)m-N(R27R28), siempre que R25 y R26 no son ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado; R27 y R28 son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado, siempre que R27 y R28 no sean ambos un grupo alquilo C1 -C6 lineal o ramificado.
    30 9. Proceso para la preparación de un polímero PA según las fórmulas generales (1) o (2), dicho proceso incluye las etapas de:
    (1) un monómero (I) según la fórmula general (12):
    imagen7
    35 donde R1, A y R2 son tal y como se define en la reivindicación 1, se reacciona con un monómero (II) según la fórmula general (13) o un monómero (III) según fórmula general (14):
    (H2N)-R3 (13) 40
    HR3N-R5-NR3H (14)
    donde R3 y R5 son tal y como se define en la reivindicación 1, en una proporción molar de monómero (I) :
    monómero (II) de aproximadamente 1,5 : 1 a aproximadamente 10 : 1 para formar un macrómero según las 45 fórmulas generales (15) o (16):
    imagen8
    5 donde b es tal y como se define en la reivindicación 1; y
    (2) reaccionando el macrómero según las fórmulas generales (15) o (16) con un polímero según la fórmula (17);
    [(R42)N]a-POL (17) 10 donde a y R4 son tal y como se define en la reivindicación 1 y donde al menos un R4 es H.
  9. 10. Polímero de PA según las fórmulas generales (1) o (2) obtenible por el proceso según la reivindicación 9. 15
  10. 11.
    Nanogel que comprende el polímero PA según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 o 10.
  11. 12.
    Nanogel según la reivindicación 11, donde el nanogel comprende un componente biológicamente activo.
    20 13. Nanogel según la reivindicación 12, donde el componente biológicamente activo se selecciona del grupo de ARN (en particular ARNsi y ARNmi) o derivados o fragmentos del mismo, ADN o derivados o fragmentos del mismo, (oligo)péptidos y derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas.
  12. 14.
    Proceso para la preparación del nanogel según la reivindicación 11, donde un polímero PA según las fórmulas 25 generales (1) o (2) es reticulado.
  13. 15. Proceso según la reivindicación 14, donde la reticulación se realiza por radiación UV.
  14. 16.
    Nanopartícula de las fórmulas generales (3) y (4): 30
    imagen9
    imagen10
    donde R1, R2, R3, R4, R5, A, POL, a y b son tal y como se define en la reivindicación 1; R6 es seleccionado del grupo que consiste en: 5
    (a) Alquileno C1 -C40, donde el grupo alquileno puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo alquileno se interrumpe por uno o varios grupos -S-S-; o
    10 (b) Cicloalquileno C3 -C40, donde el grupo cicloalquileno es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno o varios heteroátomos en el anillo, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S, y/o donde el grupo cicloalquileno se interrumpe por uno o varios grupos S-S-fuera del anillo; y
    15 FG es un grupo funcional que se selecciona del grupo que consiste en -OH,-OR7, -NH2; -NH(R7), -N(R7)2, C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)NHR7 y -C(O)NR72 donde R7 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
    (a") H;
    20 (b") alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (c") cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los
    25 heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; (d") arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido; (e") Heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido; (f") alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo
    30 del grupo de alquilaril es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y (g") alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente
    35 sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S.
  15. 17. Proceso para la preparación de una nanopartícula que comprende el paso de reaccionar un polímero PA según 40 fórmulas generales (1) o (2) con un reactivo según las fórmulas (26a) o (26b):
    FG-R6-NHR30 (26a)
    FG-R6-SH (26b) 45
    R30
    donde R6 y FG son tal y como se define en la reivindicación 16, FG es opcionalmente H, y es independientemente seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) H;
    50 (b) alquilo C1 -C10, donde el grupo alquilo puede ser lineal o ramificado y es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente (parcialmente) insaturado y/o es opcionalmente interrumpido por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    (c) cicloalquilo C3 -C12, donde el grupo cicloalquilo es opcionalmente sustituido y/o es opcionalmente
    (parcialmente) insaturado y/o opcionalmente comprende uno, dos o tres heteroátomos en el anillo, donde los 55 heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S;
    (d)
    arilo C6 -C12, donde el grupo arilo es opcionalmente sustituido;
    (e)
    heteroarilo C6 -C12, donde el grupo heteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido;
    (f)
    alquilarilo C7 -C14, donde el grupo alquilarilo es opcionalmente sustituido y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente) insaturada y/o es opcionalmente
    imagen11
    5 interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S; y
    (g) alquilheteroarilo C7 -C14, donde el grupo alquilheteroarilo comprende uno, dos o tres heteroátomos independientemente seleccionados de O, N y S y/o donde el grupo alquilheteroarilo es opcionalmente sustituido, y/o donde una parte de alquilo del grupo alquilheteroarilo es lineal o ramificada y es opcionalmente (parcialmente)
    10 insaturada y/o es opcionalmente interrumpida por uno, dos o tres heteroátomos, donde los heteroátomos se seleccionan independientemente de O, N y S.
  16. 18. Nanogel de superficie modificada obtenible por un proceso que incluye las etapas de:
    15 (1) reticular un polímero PA según las fórmulas generales (1) o (2);
    (2)
    opcionalmente cargar el nanogel con un componente biológicamente activo, preferiblemente seleccionado del grupo de ARN (en particular ARNsi) o derivados o fragmentos del mismo, ADN o derivados o fragmentos del mismo, (oligo)péptidos y derivados de los mismos, y proteínas y derivados de las mismas; y
    (3)
    reaccionar el nanogel con un reactivo R-CFG o R'-SH, donde:
    20 R y R' son seleccionados del grupo que consiste en 2-tioetilo, 2-hidroxietilo, residuos de PEG (polietilenóxido) y residuos de PPO (polipropilenóxido), donde los residuos de PEG y los residuos de PPO tienen un peso molecular promedio en número Mn de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000; CFG es un grupo capaz de formar un enlace covalente con un grupo FG, donde FG es tal y como se define
    25 en la reivindicación 16; y donde la secuencia de los pasos (1), (2) y (3) es: (1) -(2) -(3),.(1) -(3) -(2), o (3) -(1) -(2).
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