CN117881422A - 克服禽类中的抗体干扰 - Google Patents
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Abstract
本发明提供重组蛋白和表达该蛋白的重组载体，由于禽类靶标中的抗体对该重组蛋白中包含的抗原具有特异性，所述重组蛋白和表达该蛋白的重组载体可用于血清反应阳性禽类的疫苗接种。还通过在重组蛋白中包含能与禽类抗原呈递细胞(APC)上的细胞表面蛋白结合的结构域，将抗原靶向该APC。已发现，这种类型的疫苗甚至在单剂量接种后、甚至在非常幼小的禽类中、以及甚至在抗体水平非常高的情况下，也能安全地克服抗体干扰的负面影响。
Description
本发明涉及禽类疫苗接种领域；更具体而言，本发明涉及用于保护禽类的方法的重组蛋白，该禽类具有对所述蛋白中的抗原有反应的抗体。特别地，本发明涉及重组蛋白、重组载体和用于所述方法的疫苗。此外，本发明涉及通过施用所述蛋白、载体或疫苗来治疗禽类的用途和方法。
作为一种营养丰富、价格实惠的蛋白质来源，禽类的肉和蛋是世界上大多数人口饮食的重要组成部分。出于这种经济目的而饲养的主要家禽品种有鸡、火鸡、鸭和鹅。为了大量饲养这些所需的禽类，同时保持它们的健康和福利，家禽业热衷于优化管理条件，并提供良好的兽医护理。这一策略的一个重要部分就是通过疫苗接种针对各种禽类病原体提供预防性保护，这些病原体可能会导致感染和疾病，有时会对动物福利和经营的经济效益造成毁灭性影响。多年来，市场上已有针对大多数可能影响经济相关禽类的病毒、细菌和寄生虫疾病的多种可用疫苗。这些疫苗可以是不同类型的，如减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒载体疫苗等。
特别是对于大量生产的家禽，即肉用型禽类(肉鸡)，通常的做法是尽早保护幼禽。然而，对免疫系统尚未成熟的幼禽进行主动免疫接种往往不是很成功。因此，一个有效的解决办法是在产蛋期前和产蛋期期间为雌禽接种疫苗。雌禽产生的母源抗体会随卵黄转移到蛋中，并被发育中的雏禽内化。这样，雏禽在孵化当天就能受到这些母源抗体(MDA)的被动保护，从而抵御各种病原体。然而，由于生物降解的原因，大多数MDA在3周的时间内会逐渐消失，因此还必须在最初几周后对生长中的雏禽本身进行主动免疫接种，以诱导适当的免疫保护。在主动免疫接种时，雏禽体内可能仍存在一些MDA。
在已存在抗体的情况下，类似的疫苗接种的情况出现在年龄较大的禽类中，其因先前接种疫苗而产生的抗体慢慢消失，因此需要进行加强疫苗接种，以将抗体滴度恢复到具有保护效应的水平。
一个重要的兽医学和科学难题在于，对于已经具有对使用的疫苗中包含的抗原有反应的抗体的禽类，何时可以为其接种疫苗。很明显，在抗体滴度几乎消失时接种疫苗为时已晚，因为这会在抗体滴度下降到保护水平以下和主动免疫的保护开始起作用之间留下一段缺口期。在这一缺口期，禽类很容易受到感染和患病。
然而，在禽类仍有相当高滴度的循环抗体时接种疫苗则为时过早，因为这通常会影响疫苗接种的效力；这种情况发生的原因可能是这些抗体以某种方式结合并隔绝疫苗抗原，这可以加速其降解和/或阻止其诱导适当的免疫反应。最后这一种现象被称为“抗体干扰”，当这涉及MDA时其变体为：“MDA-干扰”。这在针对影响全球家禽业的主要病原体进行有效疫苗接种中是一个众所周知的问题。这些主要病原体的示例为：传染性法氏囊病病毒(IBDV；又称甘布罗病病毒)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV；又称鸡瘟病毒)；后两种甚至是世界动物卫生组织(OIE)的法定传染病。
众所周知，对于这些疾病，抗体干扰会降低疫苗接种的效力，使禽类容易受到野外感染，尤其是当禽类饲养距离较近和/或在禽类病原体流行率较高的地区。
随着时间的推移，人们尝试了许多不同的方法来克服抗体干扰，以防止出现保护缺口，并优化血清反应阳性禽类的疫苗接种。更加直接的克服抗体干扰的尝试包括调整疫苗以增加抗原剂量和/或使用(更强的)佐剂。此外，还尝试了毒性更强，即减毒程度更低的活疫苗病原体毒株，寄希望于其可以突破较高的抗体滴度，从而可以更早接种。但这些方法总体上并不令人满意，因此测试了更复杂的方法。
在对幼禽进行针对IBDV的主动疫苗接种时，一种方法涉及通过对禽类样本进行血清学检测来监测其MDA水平，从而确定最佳疫苗接种日期。但结果是，只有在2-3周龄时才能进行有效的主动疫苗接种，并且由于大的群体内的变异，许多幼禽不可避免地会出现保护缺口。或者，在早期接种“复合IBDV疫苗”(与抗体结合的减毒活疫苗-病毒)，由此抗原只在稍后的时间释放。此外，还使用了病毒载体系统，例如使用禽痘或禽类疱疹病毒作为载体，来表达主要IBDV抗原——病毒蛋白2(VP2)。Müller等人对此进行了综述(2012,AvianPathol.,41,133-139)。
对于NDV，尽管已经采用了不同的疫苗接种方法，但抗体干扰在今天仍然是一个问题，参见综述：Dimitrov等人(2017,Vet.Microbiol.,206,126-136)。
即使使用重组载体疫苗也可能受到抗体干扰，例如在抗体与载体病毒本身和/或其表达的抗原发生反应的情况下，参见：Hu等人(2020,Vaccines,14,222,doi:10.3390)。对于作为载体的NDV，考虑的解决方案为例如改变NDV载体的血清学特征(Steglich等人,2013,PLoS One,8,e72530)或选择一种据称受抗-NDV抗体抑制程度较轻的NDV毒株(EP2998315)。
对于IBV，众所周知MDA会干扰1日龄雏鸡的疫苗接种，参见：Terregino等人,2008(Avian Pathol.,37,487-493)。
对于AIV，有效疫苗接种的意义甚至超出了兽医学领域，因为这种病毒可导致人类的人畜共患感染，并有大流行的可能性。这些年来，已经尝试了使用传统或重组AIV疫苗的许多不同的方法，并取得了不同程度的成功，参见：D.Swayne,2009(Comp.Imm.Microbiol.and Inf.Dis.,32,351-363)。然而，与其他几种疫苗的情况类似，解决AIV反应性抗体的干扰仍然是一个问题(Murr等人,2020,Avian Dis.,64,427-436)。
因此，尽管在禽类疫苗接种领域测试了许多不同的方法，但仍然迫切需要一种有效的方法来克服靶标动物体内预先存在的抗体对使用这些抗体可以结合的抗原进行疫苗接种的效力所产生的负面影响。
Shrestha等人(2018,Vaccines,6,75,doi:10.3390)回顾了通过选择性地靶向抗原到抗原呈递细胞(APC)来改善禽类靶标疫苗接种的方案。实现这种靶向的方法多种多样，例如：使用配体、抗体、纳米颗粒、病毒载体或细胞穿透肽。但没有描述或教导在禽类中克服抗体干扰的方法。
WO 2017/055235描述了向抗原呈递细胞(APC)的抗原靶向，但采用了抗原内化。所述疗法专门针对哺乳动物，特别是猫和狗，并且旨在减少过敏。没有讨论抗体干扰。
Jauregui等人(2017,Res.Vet.Sci.,111,55-62)描述了将AIV HA抗原靶向鸡树突状细胞。纯化的H5HA抗原与针对Dec-205中一个结构域的小鼠单克隆抗体进行了化学偶联。这种偶联物用于给21周龄的鸡接种疫苗。由于所有使用的鸡都是抗-HA抗体血清反应阴性(参见Jauregui，图7，第0天)，因此Jauregui等人没有描述或教导克服血清反应阳性禽类的抗体干扰。
因此，本发明的目的是通过提供有效的克服抗体干扰对禽类靶标疫苗接种的负面影响的方法来克服现有技术中的一个或多个缺点。
令人惊讶的是，通过提供保护具有对待施用的疫苗中所包含的抗原有反应的抗体的禽类的方法，即通过靶向抗原到禽类的APC，可以达到上述目的，从而克服现有技术中的一个或多个缺点。
在下文详细描述的实验中，抗体水平较高或水平中等的鸡接种了靶向疫苗或非靶向疫苗。结果表明疫苗接种的效力有显著差异，有利于靶向抗原。相反，非靶向疫苗和传统的对照疫苗在血清反应阳性禽类中几乎没有产生任何反应。因此，这种保护血清反应阳性禽类的方法能够有效克服抗体干扰对疫苗接种的负面影响，而且即使只单次接种，即使是在非常小的幼禽中也有意想不到的效果。
因此，发明人惊讶地发现，这种抗原靶向，尤其是在预先存在抗体的情况下，一方面即使是在免疫不成熟的禽类中也能很好地发挥作用，另一方面不会引起任何疫苗增强性疾病或疫苗诱导的免疫紊乱，例如免疫系统过度刺激、自身免疫或诱导耐受。
这种保护禽类的方法同样适用于不直接使用靶向抗原，而是使用表达重组蛋白的重组载体，例如DNA质粒、RNA分子或载体病毒。
此外，由于这种有利的效果被认为是由靶向性引起的，因此与所使用的抗原无关，完全可以想象使用不同的抗原这种方法也会同样成功。因此，这种方法使得能够针对进行疫苗接种通常会受到抗体干扰的各种禽类病原体，例如NDV、IBDV、AIV等提供保护。
目前还不十分清楚这种疫苗接种方法如何或为何能突破高抗体水平，并仍能诱导出如此有效的保护性免疫反应。虽然发明人不想受任何可以解释这些发现的理论或模型的约束，但他们推测，这是由于将抗原靶向APC，从而以某种方式减少了预先存在的抗体对抗原的清除。
使用抗原靶向APC为具有针对疫苗抗原的预先存在的抗体的禽类进行疫苗接种的成功，是完全无法从任何在先公开中预测的。这主要是因为抗体干扰的作用机制(疫苗抗原的阻断、掩蔽、交联、中和等)至今仍不十分清楚。禽类的抗体干扰尤其如此，因为禽类是一种研究较少的动物系统。
此外，虽然早在20世纪80年代就已经有了关于抗原靶向的首次研究，但这些研究都是针对人类癌症治疗的。后来，人们考虑在(主要是人类)疫苗接种中更广泛地使用该方法。Keler等人对此进行了综述(2007,Oncogene,26,3758-3767)。
此外，在某些情况下，(母源)抗体会通过抗体依赖性增强作用增强病毒性疾病，这就是所谓的疫苗增强性疾病。这种效应已在多种病毒中观察到，例如慢病毒和登革热病毒(Huisman等人,2009,Vaccine,27,505-512)，以及最近的SARS-CoV-2(Lee等人,2020,Nat.Microbiol.,5,1185-1191)。因此，人们确实担心靶向疫苗接种会在随后接触相应病原体时引起这种不希望的影响。
此外，从哺乳动物的情况转化到禽类的情况也远非直截了当，因为与哺乳动物/人类的免疫系统相比，有关禽类免疫系统功能的信息非常少。此外，Shrestha等人(同上)的综述并没有提供特定的方法，也没有消除技术人员在使用抗原靶向时的任何犹豫。这是因为人们可能担心它会引起某种免疫紊乱，和/或需要成熟的免疫系统。
由于缺乏信息，再加上可能出现的并发症，使得使用抗原靶向APC的方法来为具有对疫苗中的抗原有反应的高水平循环抗体的禽类接种疫苗成为一个不太可能的选项。此外，选择这种方法为幼禽接种疫苗尤其无法预测，因为禽类孵化时的免疫系统尚未成熟，无法预测禽类的APC是否已在其表面展示合适的靶蛋白，以及是否已成熟到足以将与该表面蛋白的结合转化为对动物免疫系统的有效刺激。
因此，在一个方面，本发明涉及重组蛋白，其包含抗原以及能够与禽类抗原呈递细胞(APC)上的细胞表面蛋白结合的结合结构域，用于在保护具有对所述抗原有反应的抗体的禽类免受病原体(所述抗原来源于该病原体)的方法中使用。
“重组蛋白”是其氨基酸序列为人工合成和人工制造的蛋白质。就本发明而言，重组蛋白可通过分子克隆和重组蛋白表达技术获得。表达后蛋白质可以从表达系统中分离出来，在需要时进行加工和纯化，随后可以配制成适合用于本发明保护方法的组合物。或者，如下所述，重组蛋白可以通过重组载体表达和递送，例如DNA质粒、RNA分子或病毒载体。
这种技术在本领域中是众所周知的，并且在标准教科书中有详细的公开，例如Sambrook&Russell：“Molecular cloning:a laboratory manual”(2001,Cold SpringHarbour Laboratory Press；ISBN:0879695773)；以及：Ausubel等人，在：CurrentProtocols in Molecular Biology(J.Wiley and Sons Inc,NY,2003,ISBN:047150338X)。
就本发明而言，术语“蛋白质”包含类似的术语，例如“肽”、“寡肽”和“多肽”。
根据本发明使用的重组蛋白是融合蛋白，由来自不同来源的多肽构成，例如抗原和结合结构域(两者均如本发明所定义的)，以及任选地一个或多个肽，如连接基、标志物等，全部连接在一条氨基酸链上。
本文所使用的术语“包含”(以及例如“包括”、“含有”和“所包含的”等变体)意指涵盖或包含在使用该术语的文本部分、段落、权利要求等中的所有元素和本发明可以想象到的任何可能的组合，即使这些元素或组合未被明确描述；而不意在排除此类元素或组合之外的任何元素或组合。
因此，任何此类文本部分、段落、权利要求等也可以涉及一个或多个实施方案，其中的术语“包含”(或其变体)被例如“由......组成(consisting of)”、“由......组成(consists of)”或“基本上由......组成(consist essentially of)”等术语所取代。
“抗原”通常是指能与例如抗体和淋巴细胞等免疫系统的元素相互作用的分子，这种相互作用可引起体液和/或细胞免疫反应。
抗原被免疫系统识别的部分称为“表位”，其可以是线性的或三维的。3D表位通常由较大的蛋白质折叠形成。线性表位需要有足够的大小，例如至少5个氨基酸，可以单独存在或与运载体(carrier)分子相连，例如包含在根据本发明使用的重组蛋白质中。
抗原是多肽(因此是抗原性多肽)，含有至少一个表位，且“来源”于病原体。就本发明而言，“来源”指的是选择特定抗原的编码序列的方式，通常是通过分析病原体的遗传信息及其蛋白质库进行。所选择的序列随后被重组到编码根据本发明使用的重组蛋白的构建体中。
就本发明而言，所选择的抗原因此可以是来自病原体的蛋白质的全部或部分，其中所述病原体选自病毒、细菌、寄生虫和真菌。
抗原可以来源于来自病原体的抗原的天然序列，也可以是组装体，例如：具有如下氨基酸序列，其为要表达的抗原的几个同源物的共有序列，例如，来源于病原体变异体的相同类型的蛋白质，例如不同的物种、血清型、亚型、毒株、分离株等。众所周知，要获得这样的共有序列，可以对氨基酸序列或编码氨基酸的核苷酸序列进行比较，并通过比较得出共有序列；例如，使用适当的计算机程序对几个H9HA核苷酸序列进行比对。
本发明的抗原也可以是嵌合抗原，由来自生物相关或不相关的不同抗原的组装部分组成。此外，还可以对编码抗原的序列进行“密码子优化”，如下所述。
就本发明而言，抗原选自能针对抗原来源的病原体产生保护性免疫反应的蛋白质。例如，选自：来自IBDV的VP2蛋白；NDV的融合(F)或血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白；传染性支气管炎病毒(IBV)的刺突蛋白；以及AIV的HA或神经氨酸酶(NA)蛋白。
本发明的“结合结构域”来源于免疫球蛋白分子的抗原结合位点，可以是包含一个或多个互补性决定区的抗体的一部分，例如可以是“单链可变片段”(scFv)多肽。
就本发明而言，结合结构域“能够结合”。这指的是特异性的结合，即具有足够的亲和力，有别于任何非特异性结合或背景结合。特异性结合与非特异性结合之间的区别是本领域技术人员所熟知的并且可以很容易地加以区分，例如，在体外结合试验中，通过稀释结合结构域或配体；任何非特异性结合通常都会迅速消失，例如，在1:10或1:100稀释度时，而特异性结合即使在更高的稀释度下仍然存在。
众所周知，“APC”是淋巴系统的一种细胞，能够加工抗原分子，并将这些分子(或部分分子)呈递给人或动物的免疫系统。这种呈递会诱导一连串的反应，导致免疫成熟和免疫刺激，这是保护性免疫反应的基础。APC为例如B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。
“禽类APC的细胞表面蛋白”是附着或锚定在APC细胞膜外侧的蛋白质。这些蛋白质在APC的感测和信号转导功能中发挥作用。APC上的许多细胞表面蛋白是免疫球蛋白超家族成员的蛋白。APC表面蛋白的示例为例如CD83和CD11c蛋白。其中，“CD”符号指的是“分化簇”，其为对淋巴系统细胞表面蛋白进行分类和鉴定的国际协议。
本发明中的“禽类”是任何具有经济或医学(兽医学)意义的分类学上的鸟纲动物。例如：鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、珍珠鸡、鹧鸪、野鸡、鸽子、猎鹰和鸵鸟。
术语“用于在保护禽类的方法中使用”是指根据本发明和本文所定义的重组蛋白的医学用途。所述用途可以是直接使用所述蛋白，或者可以是通过重组载体间接表达所述蛋白。
就本发明而言，所应用的“方法”指的是疫苗接种。
术语“保护”指的是本发明所述方法的效果，即通过所述方法，即通过疫苗接种诱导的保护性免疫反应。这种免疫反应保护接种疫苗的禽类免受由病原体引起的感染和/或疾病，所述抗原(存在于根据本发明使用的重组多肽中)来源于该病原体。
保护方法是指全部或部分减少病原体在易感禽类的细胞和器官中有效感染的建立或增殖，或减轻随后出现的疾病症状。例如，可以通过降低病原体的负荷或缩短病原体复制的持续期来实现。这进而会导致禽类中因感染病原体而引起的病变和相关疾病临床症状的数量、强度或严重程度的减轻。
这种感染或疾病的减轻可以很容易的被检测出来，例如通过监测使用根据本发明的重组蛋白接种疫苗后的免疫反应，以及通过检测接种疫苗的禽类(攻毒)感染后出现的临床症状或死亡率，例如通过监测禽类的疾病症状、临床评分、血清学参数，或通过重新分离感染性病原体。这些结果可与接种过模拟疫苗的禽类对类似感染的反应进行比较。评估主要禽类病原体感染和疾病症状的几种方法已为本领域所熟知。
通过本发明的方法产生针对感染或疾病的保护，提供获得免疫的禽类，其具有健康、福利和经济表现上的改善。这可以通过例如健康状况、存活率、生长率、饲料转化率和产蛋量的提高以及(兽医)保健成本的降低等参数来进行评估。
用本发明的方法保护的禽类“具有抗体”。这适用于应用本发明的方法的时间点：接种疫苗的时间。禽类是否真的具有这种抗体可以很容易地确定，例如，通过在接种疫苗的时间点抽取禽类的血液样本，并用标准的血清学方法确定针对抗原的抗体滴度。但是，这并不要求在接种疫苗的时间点完成预先存在抗体滴度值的确定，即完成对在接种疫苗的时间点采集的血清样本进行血清学检测和/或对检测结果进行分析和解释。同样，这也不妨碍根据疫苗接种前一段时间抽取的血清样本中测定的水平来计算和推断疫苗接种时预先存在的抗体滴度。
就本发明而言，当禽类血清中对抗原有反应的抗体滴度高于背景水平时，禽类就“具有”针对抗原的抗体。这种背景水平通常是对感兴趣的抗原或病原体未致敏的同类禽类中呈递的水平。就本发明而言，该背景水平可以方便地从例如相同年龄和物种的SPF(无特定病原体)禽类的血清中存在的滴度获得。
预先存在的抗体可以是被动转移的结果，典型的情况是通过卵黄从母体获得的抗体。这种血清反应阳性的禽类被称为“MDA阳性”或“MDA+”。这种情况适用于非常幼小的禽类，例如从孵化日起(即1日龄)到约3周龄的禽类。或者，预先存在的抗体可以来自待受保护的禽类早期接受的主动免疫(导致抗体的产生)；这种情况适用于约3周龄的禽类。
术语“对……有反应”或其同义词“对……具有特异性”描述了预先存在的抗体通过特异性免疫识别，与根据本发明使用的重组多肽中包含的抗原相互作用的能力。类似的术语还有“能与……结合”、“能识别……”等，因为这些术语都指特异性结合。
本发明预料不到的有利效果在(待受保护的禽类体内)预先存在的抗体与本发明重组蛋白中包含的抗原有反应的情况中十分显著。在这种情况下，通常会出现抗体干扰，其会降低保护效力。
术语“抗原来源的病原体”用来表示本发明的方法所要防御的病原体含有上文定义的抗原。这包括抗原的同源物和/或病原体的变异体。
正如技术人员所理解的，根据本发明使用的重组蛋白中的抗原与禽类要防御的病原体之间是匹配的，这形成诱导保护性免疫反应的基础。
下文将描述本发明的实施方案和其他方面的细节。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，禽类APC选自：B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。
使用标准的血清学和生化方法，例如使用基于具有CD名称的蛋白质的测定，可以清楚地区分每种细胞类型，如下所述。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个优选实施方案中，禽类APC是树突状细胞。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，禽类APC的细胞表面蛋白选自：分化簇83(CD83)、分化簇11c(CD11c)和树突状细胞内吞受体-205(Dec205)。
所有这些蛋白为本领域所熟知，且是APC的表面蛋白：CD11c是树突状细胞和一些其他APC上的跨膜蛋白，在中性粒细胞的活化中发挥作用。CD11c特异性scFv包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。
Dec-205是树突状细胞和淋巴细胞上的内吞受体。鸡Dec-205的示例在GenBank中的登录号为AJ574899。Dec-205特异性scFv包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
CD83是表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。它主要在树突状细胞上表达，在淋巴细胞和巨噬细胞上也有较小程度表达。它是成熟树突状细胞的一个公认标记物。禽类CD83的一个示例是GenBank中登录号为XP_040519591的蛋白质。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个优选实施方案中，细胞表面蛋白是CD83。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，结合结构域包含抗体的抗原结合位点。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个优选实施方案中，结合结构域是单链可变片段(scFv)。
众所周知，scFv是免疫球蛋白的最小部分，它保留了一个完整的抗原结合结构域，但缺少Fc部分。scFv是单肽，其本身就是融合构建体，包含一条可变轻链(vL)、连接基和一条可变重链(vH)。这些元件的顺序可以是vL-连接基-vH，也可以是vH-连接基-vL。在这两种情况下，可变链的取向(相对于彼此)都是尾部-对-头部，其中c-端侧为尾部。
在一个优选的实施方案中，scFv中元件的顺序是vH-连接基-vL。
scFv的连接基序列提供了柔性区域，使得两个可变链可以自我取向以形成抗原结合结构域。在一个优选的实施方案中，scFv的连接基序列包含甘氨酸和丝氨酸或苏氨酸，长度为10至50个氨基酸。在一个更优选的实施方案中，scFv的连接基序列包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(Gly4-Ser)4。
scFv的两条可变链的特异性可以相同或者各自针对不同的抗原。在一个优选的实施方案中，两条可变链具有相同的特异性。
在一个实施方案中，scFv对CD83具有特异性，换句话说，其是CD83-scFv。优选地，scFv对禽类树突状细胞上的CD83具有特异性；更优选地，scFv包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在结合结构域的实施方案中，scFv可以出现两次或更多次。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，病原体对禽类具有致病性。更优选地，病原体是病毒。甚至更优选地，病毒是RNA病毒。仍然更优选地，RNA病毒选自：IBDV、NDV、IBV和AIV。甚至仍然更优选地，病原体选自：IBDV、NDV和AIV。最优选地，病原体是AIV。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，抗原选自：IBDV VP2蛋白、NDVF蛋白、NDV HN蛋白、IBV刺突蛋白、AIV HA蛋白和AIV NA蛋白。更优选地，抗原选自AIV HA蛋白和AIV NA蛋白中的一种。甚至更优选地，抗原是AIV HA蛋白。仍然更优选地，抗原选自H5、H7或H9型AIV HA蛋白。
所有这些病毒蛋白抗原为本领域所熟知，其编码序列的许多版本都可以很容易地在例如NCBI的GenBank和EMBL的EBI等公共序列数据库中以数字形式获得。示例为：AIVH9HA：GenBank acc.nr.ACP50708.1；NDV F：GenBank acc.nr.AAK55550.1；NDV HN：GenBankacc.nr.MH614933.1；IBDV VP2：GenBank acc.nr.KX827589.1；以及IBV刺突：GenBankacc.nr.AAA66578.1。
此外，HA蛋白的详细信息可在结构生物信息学研究合作组织(RCSB)的蛋白质结构数据库(PDB)(网址：www.rcsb.org)和流感研究数据库(网址：www.fludb.org)中找到。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，其中所述抗原选自AIV HA蛋白，所述抗原仅包含HA蛋白的胞外结构域。这可以防止附着在用于表达根据本发明使用的重组蛋白的细胞的细胞膜上。
成熟AIV HA蛋白的胞外结构域包括N-端部分(不含信号序列)和HA蛋白的中心部分，因此包含HA1和HA2结构域，而不包含跨膜结构域和胞质结构域；通常，后两部分共同构成HA C-端的35-40个氨基酸。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，其中所述抗原是H5、H7或H9型AIV HA蛋白的胞外结构域，所述抗原包含具有选自SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列的蛋白质。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，其中所述抗原是来自AIV HA蛋白的胞外结构域，所述抗原还包含三聚化结构域。
这种三聚化结构域可以弥补HA跨膜结构域和胞质结构域的缺失，恢复其形成同源三聚体的能力，并与其天然3D结构相似。此外，它还提高了本发明中含HA胞外结构域抗原的重组蛋白的溶解性和稳定性。
就本发明而言，三聚化结构域是肽，可以是已知适用于这一功能的几种结构域之一，例如：酿酒酵母的GCN4转录激活因子的异亮氨酸拉链3结构域，或T4噬菌体fibritin蛋白的Foldon结构域(“Foldon”)。
在一个优选的实施方案中，所述三聚化结构域是Foldon；更优选地，Foldon包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，所述抗原是AIV HA蛋白的胞外结构域，并且所述抗原还包含三聚化结构域，所述三聚化结构域位于HA胞外结构域的C-端(下游)。
在一个优选的实施方案中，所述HA胞外结构域和三聚化结构域被置于根据本发明使用的重组蛋白中，不含中间氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述抗原包含AIV H9HA胞外结构域和Foldon，包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
在根据本发明使用的重组蛋白中，所述抗原和结合结构域可以相对于彼此以两种取向放置，所述抗原或结合结构域更加靠近根据本发明使用的重组蛋白的N-端。在这一点上，当所述抗原被选择为HA胞外结构域时，可使用的三聚化结构域被视为抗原的一部分。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，抗原位于所述重组蛋白中结合结构域的N-端(上游)。
在一个替代实施方案中，结合结构域位于所述重组蛋白中抗原的N-端(上游)。
在一个实施方案中，根据本发明使用的重组蛋白包含连接基，其位于所述抗原和结合结构域之间，或位于结合结构域和抗原之间，取决于它们彼此的取向。优选地，所述连接基的大小在1至30个氨基酸之间。更优选地，所述连接基包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸。甚至更优选地，所述连接基包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的重组蛋白包含选自以下的组合中的一个：
-AIV H5HA胞外结构域、三聚化结构域、连接基和CD83-scFv；
-AIV H7HA胞外结构域、三聚化结构域、连接基和CD83-scFv；以及
-AIV H9HA胞外结构域、三聚化结构域、连接基和CD83-scFv；
其中指示的元素以N-端到C-端的方向呈现。
在一个优选的实施方案中，所述AIV HA胞外结构域选自SEQ ID NO:3、4和5；所述三聚化结构域为SEQ ID NO:6；所述连接基为SEQ ID NO:8；及所述CD83-scFv为SEQ ID NO:2。
为了表达、收获、定量和(任选地)纯化根据本发明使用的重组蛋白，所述重组蛋白还可包含一个或多个肽，其作为生化或血清学标记物(或标签)。所述标记物可以相同或不同。所述标记物可以置于重组蛋白的不同位置。
众所周知的标记物为：亲和标签，例如麦芽糖结合蛋白(MBP)或组氨酸(His)标签；表位标签，例如Myc-、Ctag-、V5-或Flag-标签；或荧光蛋白标签，例如GFP或YFP，或其一部分；所有这些标签在本领域是众所周知的。
标记物可用于检测和定量，例如用于检测或与特异性抗体结合，例如在IFT或ELISA中。纯化可通过例如免疫或金属亲和层析来完成。
His-tag通常有4至10个组氨酸。优选地，His-tag是6x组氨酸标签，即有6个连续的组氨酸。
“Ctag”包含SEQ ID NO:9，并且是α-突触核蛋白的C-端，已知α-突触核蛋白会导致在神经系统疾病(例如帕金森病)中发现的聚集体。使用时，Ctag优选地包含在本发明重组蛋白的C-端。通过免疫亲和层析法纯化Ctag有时比纯化His-tag更有效，例如在存在来自表达系统培养物中的蛋白质的干扰的情况下。
V5标签来源于猿猴病毒5。优选地，V5标签包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明使用的重组蛋白包含标记物肽。更优选地，标记物肽是选自Ctag、His标签和V5标签中的一种或多种。甚至更优选地，所述重组蛋白包含选自Ctag、His标签和V5标签中的两种或更多种。
对于表达根据本发明使用的重组蛋白，根据需要可以做一些进一步的调整。这种微调或优化是常规的，也是本领域技术人员所熟知的。例如，根据表达系统的宿主细胞表达蛋白质的方式：在细胞内、在细胞表面或分泌到细胞外。在后两种情况下，可以在N-端侧提供信号序列，其信号在所用表达系统的细胞中功能良好。例如，在S2细胞中表达时，使用“黑腹果蝇免疫球蛋白重链结合蛋白”(BIP)信号序列来实现分泌。
在一个实施方案中，根据本发明使用的重组蛋白包含信号序列；优选地，信号序列是BIP信号序列；更优选地，BIP信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在构建用于提供表达根据本发明使用的重组蛋白的核酸的过程中，可以使用一个或多个限制酶(RE)位点。当这些RE位点位于重组蛋白的编码区时，其保留的核苷酸将翻译为几个氨基酸，后者将位于构成根据本发明使用的重组蛋白的一些元件之间。
例如，用于本发明的一种构建体利用RE位点KpnI和PacI来亚克隆H9HA胞外结构域-Foldon元件，并使用RE位点NotI和XbaI来亚克隆位于HA抗原-Foldon C-端侧的CD83-scFv，以及SEQ ID NO:8的连接基。
因此，根据本发明使用的重组蛋白的一个版本包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，其细节如表1所述。
表1：SEQ ID NO:12的组成
制备了不含连接基和CD83-scFv的对照构建体。该构建体缺少SEQ ID NO:12第545-802位氨基酸的区域，并且包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
与SEQ ID NO:12和13类似的构建体也可以很容易地使用其他HA抗原序列中的一个制成：H5HA或H7HA胞外结构域，例如分别如SEQ ID NO:4和5所呈现的。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，与抗原反应的所述抗体是母源抗体。
就本发明而言，可以很容易地确定预先存在的抗体是否为母源来源的：实际上，只有小于2-4周龄的雏鸡才会有MDA。此外，MDA主要由IgY组成，其为哺乳动物IgG的功能性同源物，但在结构上有所不同：与有3个重链恒定区的IgG相比，IgY有4个重链恒定区。
在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，待保护的禽类是家禽。更优选地，所述家禽选自：鸡、火鸡、鸭和鹅。甚至更优选地，家禽是鸡。
就本发明而言，所述禽类可以是任何类型、品种或变种，例如：蛋鸡、种鸡、肉鸡、混合品种或任何此类品种的亲本品系。优选的家禽类型选自：肉鸡、种鸡和蛋鸡。更优选的是肉鸡和蛋鸡类型的家禽。最优选的是肉鸡家禽。
如上所述，本发明提供用于在保护血清反应阳性禽类免受病原体侵害的方法中使用的重组蛋白。该方法既可有利地应用于因在先主动疫苗接种而有预先存在的抗体的老龄禽类，也可应用于预先存在的抗体为MDA的幼禽。
因此，在根据本发明使用的重组蛋白的一个实施方案中，待保护的禽类小于4周龄；优选地小于3周龄；更优选地小于2周龄；甚至更优选地小于1周龄，甚至仍然更优选地为1日龄(即孵化当天)。在一个实施方案中，待保护的禽类处于胚胎发育的18天左右(即在卵内)。
在根据本发明使用的重组蛋白的另一个实施方案中，待保护的禽类为2周龄或更大。
如上所述，根据本发明使用的重组蛋白同样可以通过间接使用进行应用，即通过重组载体(例如DNA质粒、RNA分子或病毒载体)表达重组蛋白。
因此，在另一个方面，本发明涉及能够表达根据本发明使用的重组蛋白的重组载体，其用于在保护具有对所述重组载体表达的重组蛋白中所包含的抗原有反应的抗体的禽类免受所述抗原来源的病原体侵害的方法中使用。
在本发明领域，“载体”是众所周知的分子结构，其携带用于编码多肽的遗传信息(核酸序列)，具有适当的信号，使其能在适当的条件下表达，例如在宿主细胞中。在本发明中，“表达”指的是通过转录和/或翻译的方式从遗传信息中表达蛋白质这一众所周知的原理。
已知这种载体的许多类型和变体，并且可用于本发明的从DNA或RNA等核酸分子，到病毒样颗粒和复制子颗粒等更复杂的结构，甚至到可复制的重组微生物(例如病毒)。
根据本发明使用的重组载体是“重组体”，因为它的分子组成是通过体外操作其遗传信息而改变的。所做的改变可用于提供、改善或适应载体和/或其表达的蛋白质的复制、表达、操作、纯化、稳定性和/或免疫学行为。上述以及其他的技术在标准的教科书中有更为详尽的描述，例如上文描述的Sambrook&Russell和Ausubel等人，以及：C.Dieffenbach&G.Dveksler：PCR primers:a laboratory manual(CSHL Press,ISBN 0879696540)和J.Bartlett和D.Stirling的PCR protocols(Humana press,ISBN:0896036421)。
根据所使用的载体类型，需要为其复制和表达提供或多或少的信号，可以是顺式的(即在重组载体本身中提供)，或者是反式的(即从单独来源提供)，这些都是众所周知的。
本领域技术人员完全有能力选择所需的信号并将其组合成可操作的组合，使根据本发明使用的重组载体在适当的条件下“能够表达”根据本发明使用的重组蛋白。除了辅助构建和克隆的元件(例如限制性酶识别位点或PCR引物)外，还可以从以下的一个或多个中选择众所周知的元件：启动子、终止密码子、终止信号、多聚腺苷酸信号、7-甲基鸟苷(7mG)帽结构和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
在根据本发明使用的重组载体的实施方案中，所述重组蛋白、所述用途、所述方法、所述保护、所述禽类、所述抗体、所述抗原和所述病原体的特征都如本文所体现的那样。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，其表达的重组蛋白包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列。
用于表达SEQ ID NO:12的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
因此，在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，所述载体包含SEQ IDNO:14的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13的对照蛋白由包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
SEQ ID NO:14和15均已根据黑腹果蝇S2细胞的密码子使用表进行了密码子优化，以优化其在此类细胞中的表达。详情如下。
如上所述，根据本发明使用的重组载体可以有几种不同的形式。
因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的重组载体选自核酸、病毒和复制子颗粒(RP)。
就本发明而言，核酸可以是DNA或RNA，可以是单链或双链，并且可以是天然的或合成的。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，其中载体是核酸，所述核酸是真核表达质粒。
“真核表达质粒”通常是DNA，具有适当的信号，用于表达插入质粒的异源基因，并受真核细胞中的活性启动子操作控制。随后，质粒可通过某种转染方法(例如使用生化物质作为运载体、机械方法或电穿孔)插入真核宿主细胞或宿主生物体，并使插入的异源基因进行表达。由于质粒缺乏与宿主细胞基因组稳定整合的信号，这种表达通常是瞬时的；因此，这种质粒通常不会在宿主或宿主细胞中转化或永远存在。所有这些材料和程序都是本领域所熟知的，并在手册中有所描述。
此类真核表达质粒可从多个供应商处购买，例如质粒系列：pcDNATM、pCR3.1TM、pCMVTM、pFRTTM、pVAX1TM、pCITM、NanoplasmidTM、pCAGGS等。
在一个优选的实施方案中，真核表达质粒是pFRT质粒(Thermo FisherScientific)或pCAGGS质粒(Niwa等人,1991,Gene,108,193-199)。
真核表达质粒可包含用于调节表达、纯化等的多个特征。一种可能的信号是抗生素抗性基因，其可在构建和克隆过程中用于选择。但是，当打算施用于人类或动物靶标时，由于担心产生抗生素耐药性，这种抗生素选择并不可取。
在根据本发明使用的重组载体的一个优选实施方案中，其中所述载体为核酸，并且所述核酸为真核表达质粒，质粒不包含抗生素抗性基因。
根据本发明使用的重组载体(以真核表达质粒的形式)可以被递送到宿主细胞或靶标生物体中，在宿主细胞中它将表达本发明的HA茎部多肽。表达质粒的递送可以有多种方式，例如通过机械或化学方法递送裸DNA，或用合适的(纳米颗粒)运载体包裹，例如蛋白质、多糖、脂质或聚合物。众所周知的核酸运载体的示例为树枝状聚合物、脂质纳米颗粒、阳离子聚合物和鱼精蛋白。
作为真核表达质粒，根据本发明使用的重组载体的一种特殊形式是质粒提供复制子RNA递送时。
因此，在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，其中所述载体是核酸，并且所述核酸是真核表达质粒，所述质粒编码复制子RNA。
“复制子RNA”是一种可自我复制的RNA，它除了含有编码本发明重组多肽的核酸外，还含有RNA复制所必需的元素，例如复制酶基因。然而，与复制子颗粒(RP)不同的是，复制子RNA没有病毒结构蛋白的包装，并因此自主进入宿主细胞的效率较低。
复制子RNA编码质粒可以以与蛋白质表达质粒一样的方式被递送到宿主细胞中。
用编码复制子RNA的真核表达质粒进行疫苗接种比用表达蛋白质的真核表达质粒进行疫苗接种更有优势，因为复制子RNA提供了扩增步骤：复制酶的翻译使复制子RNA产生编码本发明使用的重组蛋白的亚基因组信使RNA。这使得重组蛋白分别在靶标禽类中在宿主细胞大量表达。
在根据本发明使用的重组载体的一个优选实施方案中，其中所述载体是核酸，所述核酸是真核表达质粒，并且所述质粒编码复制子RNA，所述复制子RNA是基于阿尔法病毒(Alphavirus)的复制子RNA；更优选地，所述基于阿尔法病毒的复制子RNA是基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的复制子RNA。
编码VEEV复制子RNA的真核表达质粒的一个示例是例如pVAX质粒(Thermo FisherScientific)，其包含VEEV的非结构蛋白基因1-4，由真核启动子(例如人CMV即刻早期基因1启动子)驱动。
在根据本发明使用的重组载体的一个替代性实施方案中，其中所述载体是核酸，所述核酸是RNA分子。
本发明的RNA分子可以有不同的形式和功能，例如可以是mRNA，或者可以是复制子RNA。
根据本发明使用的重组载体(作为RNA分子)可以通过不同的方式递送到禽类或宿主细胞中，例如通过机械或化学方法，或用合适的(纳米颗粒)运载体包裹，例如本文所述的蛋白质、多糖、脂质或聚合物。为稳定RNA，可加入核苷酸类似物，或进行某些化学修饰，例如对核苷酸或其骨架进行。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，其中所述载体是核酸，并且所述核酸是RNA分子，所述RNA分子是mRNA。
“mRNA”(信使RNA)在本领域是众所周知的，通常具有5'端的7-甲基鸟苷(7mG)帽和3'聚-A尾。可通过转染和/或使用合适的运载体(例如聚合物或阳离子脂质)将mRNA递送到真核宿主生物体或宿主细胞中。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，其中所述载体是核酸，所述核酸是RNA分子，所述RNA分子是复制子RNA。
复制子RNA可以在体外产生，例如使用本文所述的pVAX质粒，然后使用任何合适的方法施用于宿主细胞或靶标生物体。
以复制重组病毒载体的形式表达和递送异源蛋白的重组载体在本领域是众所周知的。这些载体提供了高效的疫苗接种方法，因为病毒载体可以在靶标禽类体内复制和扩增。重组载体病毒的组装和修饰是常规的，并且可以通过使用标准分子生物学技术完成。
因此，在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，所述重组载体是病毒。
就本发明而言，病毒载体是在禽类体内复制的病毒。长期以来，许多不同种类的病毒被用作禽类的重组载体。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，其中所述载体是病毒，所述病毒选自疱疹病毒、痘病毒、副粘病毒和腺病毒。
可用于禽类的载体的合适的载体病毒的示例在本领域是众所周知的，并且为例如疱疹病毒：火鸡疱疹病毒(HVT)或血清型1或2的马立克氏病病毒(MDV)；痘病毒：鸡痘病毒；副粘病毒：NDV；及腺病毒中的：禽腺病毒。
在根据本发明使用的重组载体的一个优选实施方案中，其中所述载体是病毒，所述病毒是疱疹病毒，所述疱疹病毒选自：HVT、MDV1和MDV2。
WO 2012/052384和EP19218804.3中描述了表达和递送流感HA基因的重组病毒载体的示例：HVT作为载体。WO 2007/106882中描述了将NDV作为载体的示例。
就构建重组病毒载体而言，通常要将表达盒插入载体基因组中的基因座。有不同的技术可以控制插入的基因座和方向。例如，通过使用来自载体基因组的合适侧翼片段来通过同源重组过程引导表达盒的整合，例如通过使用如US 5961982中所述的重叠的Cosmid。或者通过使用CRISPR/Cas技术进行整合。
“表达盒”是包含至少一个异源基因和一个用于驱动该基因转录的启动子的核酸片段，以实现所编码蛋白质的表达。转录的终止可由表达盒的基因组插入位点提供的序列来完成，或者表达盒本身可以包含终止信号，例如转录终止子。在这样的表达盒中，启动子和终止子都需要靠近它们所调节表达的基因；这就是所谓的“可操作地连接”，即在它们之间没有明显的其他序列会干扰转录的有效启动和终止。对于本领域技术人员来说显而易见地是，表达盒是独立的表达模块，因此其相对于载体病毒基因组的读取方向的取向通常并不重要。
除了使用病毒作为根据本发明使用的载体外，根据本发明使用的重组载体也可以通过类似病毒体的大分子结构在禽类中进行递送和表达。示例为病毒样颗粒(VLP)或复制子颗粒(RP)。这些结构被称为“单循环”感染颗粒，含有感染宿主细胞和表达携带的异源基因必需的特征，但由于缺乏构建它们的病毒基因组(相关部分)，它们通常不能进行完全的病毒复制。这被作为一种内置的安全特征。
“RP”是众所周知的，并且目前已开发出几种RP作为表达和递送各种蛋白质的平台。阿尔法病毒是RP的有利基础，因为它的宿主范围广，并且复制速度快。当然，需要采取适当的安全措施来减弱和控制此类RP的感染，因为某些野生型形式的阿尔法病毒具有高致病性。具体可参见：Kamrud等人(2010,J.Gen.Virol.,91,1723-1727)和Vander Veen等人(2012,Anim.Health Res.Rev.,13,1-9.)的综述。
因此，在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，所述载体是RP。优选地，所述RP是阿尔法病毒RP。更优选地，所述阿尔法病毒RP是VEEV RP。
优选的阿尔法病毒RP以VEEV为基础，已被用作人、猪、家禽和鱼类的重组载体疫苗。构建、测试和使用以VEEV为基础的阿尔法病毒RP的方法和工具已众所周知并可供使用，参见例如：Pushko等人(1997,Virology,239,389-401)，以及WO 2019/110481。优选的VEEVRP技术是SirraVaxsm RNA颗粒技术(Harris vaccine)。
RP的RNA可以很方便地在体外产生：使用DNA质粒将基因翻译成RNA，然后将收获的RNA与反式编码VEEV结构蛋白的辅助RNA一起转染到宿主细胞中。
如上所述，根据本发明使用的重组载体可以有利地用于向禽类递送和表达根据本发明使用的重组蛋白，例如，作为给靶标接种疫苗的一种方式。这涉及在某一阶段将载体施用于禽类，例如在载体是核酸(例如DNA表达质粒或RNA分子)的情况下。
此外，可以在体外将载体导入宿主细胞，以扩增载体和/或表达重组蛋白，然后将宿主细胞(连同载体和/或蛋白)施用于禽类；例如，在载体是病毒载体(例如HVT)的情况下。
更进一步地，可以将载体导入用于表达重组蛋白的重组表达系统的细胞中，并从该细胞培养物中收获所述蛋白，并用于为如上所述的禽类接种疫苗。此外，用根据本发明使用的重组载体感染或转染的、以及含有和/或表达根据本发明使用的重组蛋白的宿主细胞本身也可用于本发明的保护方法，例如，被感染或转染的宿主细胞本身可用于禽类的疫苗接种。
根据所应用的载体类型，其导入宿主细胞可能需要运载体、某种转染方法，或可能由载体本身引导，如本文所述。
因此，本发明的另一个方面涉及体外培养的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明使用的重组蛋白和/或根据本发明使用的重组载体。
本发明中的“宿主细胞”是允许根据本发明使用的重组蛋白表达和/或允许根据本发明使用的重组载体复制的细胞。
本发明的宿主细胞可以是体外培养的原代细胞，并且可以是例如悬浮细胞、单层细胞或组织细胞。
或者，宿主细胞可以是体外培养的永生化细胞，例如来自已建立的细胞系的细胞，其几乎可以无限生长和分裂。根据宿主细胞的类型，本发明的HA茎部多肽的表达将包括或多或少的广泛翻译后加工，例如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化和/或脂质修饰。
原代和永生化的宿主细胞可以来自相同物种或不同物种。此外，这两种宿主细胞中的一种或两种均可以与作为本发明的保护方法的受试者的禽类属于相同物种或不同物种。
常用的宿主细胞为成纤维细胞和淋巴细胞。在使用HVT作为本发明的重组载体病毒时，宿主细胞优选为原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，其使用和储存方法如参见例如WO 2019/121888所述。
在本发明宿主细胞的一个实施方案中，所述宿主细胞优选为永生化禽类细胞。例如，在WO 97/044443和WO 98/006824中描述了几种永生化禽类细胞系；更优选地，本发明的永生化禽类宿主细胞是永生化CEF；甚至更优选地为WO 2016/087560中公开的永生化CEF。
在本发明宿主细胞的一个实施方案中，所述宿主细胞优选为重组表达系统的细胞。表达系统的细胞的示例为例如来自细菌、酵母、昆虫、禽类或哺乳动物的细胞。
来自细菌表达系统的细胞为例如来自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙门氏菌属、柄杆菌属(Caulobacter)或乳酸杆菌属的细胞。
来自酵母表达系统的细胞为例如来自酿酒酵母或毕赤酵母的细胞。
来自昆虫细胞表达系统的细胞为例如来自黑腹果蝇的细胞，例如Schneider 2(S2)细胞，或者用于杆状病毒-昆虫细胞表达系统的细胞：来自草地贪夜蛾，例如Sf21或Sf9细胞；或来自粉纹夜蛾，例如High FiveTM细胞。
来自哺乳动物表达系统的细胞为例如来自仓鼠的细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
所有这些细胞系及其在重组表达系统中的相应用途都是本领域众所周知的，并且可以使用常规技术和材料完成。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，编码根据本发明使用的重组蛋白的所述核酸是经过密码子优化的。
密码子优化是众所周知的，用于提高基因在表达系统中的表达水平，表达系统通常是一个与基因起源不同的环境。优化涉及调整核苷酸序列以编码预期的氨基酸，但是以对应于将表达序列的重组载体、宿主细胞或靶标生物体的密码子偏好(tRNA库)的方式。因此，应用的核苷酸突变是沉默突变。
因此，在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，根据本发明使用的重组蛋白是由核酸序列编码的，该核酸序列针对本发明的保护方法要保护的禽类生物体进行了密码子优化。优选地，针对家禽进行密码子优化。更优选地，针对选自鸡、火鸡、鸭和鹅的家禽进行密码子优化。
在根据本发明使用的重组载体的一个实施方案中，根据本发明使用的重组蛋白由核酸序列编码，该核酸序列针对重组表达系统的细胞进行了密码子优化，优选地针对来自细菌、酵母、昆虫、禽类或哺乳动物的细胞进行了密码子优化。更优选地，所述核酸序列针对昆虫细胞进行了密码子优化；甚至更优选地，针对黑腹果蝇Schneider 2(S2)细胞进行了密码子优化。
根据本发明使用的重组蛋白和重组载体两者也可以通过适合特定管辖区的其他用语来表征。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明使用的重组蛋白或根据本发明使用的重组载体用于制备保护禽类免受病原体侵害的疫苗中的用途，其中所述重组蛋白中包含的抗原或所述重组载体表达的重组蛋白中包含的抗原来源于所述病原体，其特征在于所述禽类具有对所述抗原有反应的抗体。
在根据本发明用于制备疫苗的重组蛋白或重组载体两者的实施方案中，所述重组蛋白、所述重组载体、所述保护、所述禽类、所述病原体、所述抗原和所述抗体的特征均如本文所述。
众所周知，“疫苗”是在药学上可接受的运载体中包含至少一种可以诱导保护性免疫作用的化合物的组合物。本发明中的“免疫活性化合物”是均根据本发明使用的重组蛋白或重组载体。
本发明疫苗的制备可以通过本领域众所周知的常规方法和程序完成。例如，政府指令和法规(Pharmacopoeia，9CFR)以及“Veterinary vaccinology”和“Remington”(均同上)等熟知手册中都描述了适用于按照众所周知的制药生产标准制备疫苗的一般技术和注意事项。这些疫苗通常是无菌制备的，并使用医药质量等级的辅料来制备。
这种制备将包括无菌的微生物检测和无外来试剂的检测，并可包括体内或体外研究，以确认其有效性和安全性。在完成质量、数量、无菌性、安全性和有效性检测后，疫苗可上市销售。所有这些都是本领域技术人员所熟知的。
例如，当根据本发明使用的重组蛋白是通过重组表达系统生产时，可以从表达系统培养物中收获蛋白，例如整个培养物。或者，收获物可以是这种培养物的一部分，例如细胞培养物离心后的上清液或细胞沉淀，或者过滤后的滤液或滞留物。上清液可以在培养物的重力沉降后获得，例如通过静置过夜或通过离心；滤液是过滤后通过过滤器的物质。
如上所述，均根据本发明使用的重组蛋白和重组载体通过包含所述重组蛋白和/或所述重组载体的疫苗实现保护禽类的优势效果。
因此，在另一个方面，本发明涉及疫苗，其包含根据本发明使用的重组蛋白，或包含根据本发明使用的重组载体，以及药学上可接受的运载体，用于在保护具有对包含在所述重组蛋白中或包含在由所述重组载体表达的重组蛋白中的抗原有反应的抗体的禽类对抗所述抗原来源的病原体的方法中使用。
在根据本发明使用的疫苗的实施方案中，所述重组蛋白、所述重组载体、所述用途、所述方法、所述保护、所述禽类、所述抗体、所述抗原和所述病原体的特征均如本文所述。
众所周知，“药学上可接受的运载体”有助于疫苗的稳定和施用，同时对于疫苗接种者是相对无害且耐受性良好的。例如，这种运载体可以是水或生理盐溶液。在更复杂的形式中，运载体可以是例如缓冲液，其可以包含更多的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。具体细节和示例如熟知手册所述，例如“Remington:the science and practice of pharmacy”(2000，Lippincott，USA，ISBN:683306472)以及“Veterinary vaccinology”(P.Pastoret等人编辑,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN 0444819681)。
当本发明的疫苗包含复制病毒的重组载体时，药学上可接受的运载体优选是稳定该病毒的组合物，或包含该病毒的宿主细胞。示例为若干病毒疫苗稀释剂和用于冷冻或冻干储存的稳定剂，通常包括例如糖、氨基酸、生理缓冲液(例如生理盐水、PBS或50mMHEPES)，以及通常为例如白蛋白、聚合物等的大分子化合物。例如，当疫苗包含重组HVT载体时，这种疫苗通常作为细胞相关产品销售。在这种情况下，药学上可接受的运载体优选为培养基、约10％的血清和约6％的DMSO的混合物。这种运载体还能在冷冻和冷冻储存期间使受HVT感染的宿主细胞保持稳定。血清可以是任何常规用于细胞培养的血清，例如胎牛血清或新生小牛血清。
当根据本发明的疫苗包含根据本发明使用的重组载体(为核酸或RP)时，药学上可接受的运载体可以是简单的缓冲液，例如含有5％w/v蔗糖的磷酸盐缓冲液。
此外，可以添加额外运载体，以稳定和/或递送用于本发明的重组载体，例如，用合适的(纳米颗粒)运载体(例如蛋白质、多糖、脂质或聚合物)包封为核酸或RP的根据本发明的重组载体。优选地，为RP的根据本发明的重组载体的额外运载体包括纳米凝胶，它是一种可生物降解的聚丙烯酸聚合物，如WO 2012/165953中所述。
显然，重组载体或包含这种载体的体外宿主细胞在本发明中都可以以活性形式(即可复制的)或以非活性形式(不可复制或失活)使用。相应地，只有一部分的重组载体或宿主细胞可以在本发明中使用，示例为：沉淀物、上清液、浓缩物、透析液、提取物、超声处理物、裂解液或者作为组成物的一部分，例如包含载体和/或宿主细胞的培养物。所有这些对于本领域技术人员来说都是众所周知的。
当根据本发明使用的疫苗包含根据本发明使用的重组蛋白时，所述疫苗可以包含佐剂，以刺激诱导免疫反应。
因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的疫苗包含佐剂。
“佐剂”是一种众所周知的疫苗成分，它能以非特异性的方式刺激目标的免疫反应。本领域已知许多不同的佐剂。佐剂的示例为：完全或不完全弗氏佐剂、维生素E或α-生育酚、非离子嵌段聚合物和多胺，例如右旋糖酐硫酸盐、CarbopolTM、吡喃、皂苷，例如：QuilATM或Q-vacTM。皂苷和疫苗成分可在ISCOMTM中组合。此外，还可以使用肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬素(tuftsin)。此外，铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝，也可用于佐剂，例如：AlhydrogelTM(Brenntag Biosector)、RehydragelTM(Reheis)和RehsorptarTM(ArmourPharmaceutical)。
常用的佐剂是油，例如矿物油，例如轻质(白色)矿物(石蜡)油；或非矿物油，例如：角鲨烯；角鲨烷；植物油或其衍生物，例如油酸乙酯。此外，例如ISATM(Seppic)或DiluvacForteTM和XsolveTM(均来自MSD Animal Health)等组合产品可以被有利地使用。
关于佐剂及其用途和效果的手册为“Vaccine adjuvants”(Methods inmolecular medicine,42,D.O’Hagan编辑,2000,Humana press,NJ,ISBN:0896037355)。
佐剂可以通过几种方式包含到根据本发明使用的疫苗中。当佐剂包含油时，疫苗可以以水溶液形式提供，并可以通过不同的方法与油一起配制成乳剂：油包水(W/O)、水包油(O/W)或双乳剂(W/O/W或O/W/O)。
“乳剂”是至少两种不相溶液体的混合物，其中一种液体分散在另一种液体中。分散相的液滴通常非常小，在微米或更小的范围内。制备任何规模乳剂的程序和设备是本领域众所周知的。为了稳定乳剂，可以使用一种或多种乳化剂。
“乳化剂”是具有两亲性的分子，同时具有疏水和亲水侧。许多乳化剂都具有不同的特性，且为本领域所熟知。大多数可以很容易地商购，并且纯度程度也有不同。常用的疫苗乳化剂有山梨糖醇单油酸酯(80)和聚氧乙烯-山梨糖醇-单油酸酯(聚山梨醇单油酸酯80或80)。
表征乳化剂(的混合物)性质的一种众所周知的方法是HLB值(亲水-疏水平衡；Griffin,1949,J.Soc.Cosm.Chem.,1,311-326)。通常情况下，HLB值低于10的乳化剂或乳化剂混合物有利于W/O乳剂，而HLB值为10-16的乳化剂(混合物)则有利于O/W乳剂。
此外，可以添加乳化稳定剂，示例为苯甲醇和三乙醇胺。
在根据本发明使用的疫苗的一个优选实施方案中，其中所述疫苗包含佐剂，所述佐剂包含油。更优选地，所述油包含矿物油。甚至更优选地，所述矿物油包含轻质(或白色)液体石蜡油。
轻质液体石蜡油的示例为：6VR(Penreco)、52(ExxonMobile)和(Sonneborn)。
在根据本发明使用的疫苗的一个优选实施方案中，其中所述疫苗包含佐剂，所述佐剂包含油，所述疫苗配制成油包水型乳剂。
以用于特定司法管辖区的其他用语，本发明的其他方面可定义如下：
在另一方面，本发明涉及根据本发明使用的重组蛋白，或根据本发明使用的重组载体，或根据本发明使用的疫苗，用于保护禽类免受病原体的侵害，其中所述重组蛋白中包含的抗原或所述重组载体表达的重组蛋白中包含的抗原来源于所述病原体，其特征在于所述禽类具有对所述抗原有反应的抗体。
在根据本发明的用途的一个实施方案中，所述用途包含对禽类施用重组蛋白、重组载体或疫苗，这些全部适用于本发明。
在根据本发明的用途的实施方案中，所述重组蛋白、所述重组载体、所述疫苗、所述用途、所述方法、所述保护、所述禽类、所述病原体、所述抗原和所述抗体的特征均如本文所述。
本发明的另一方面涉及保护禽类免受病原体侵害的方法，所述方法包含向所述禽类施用根据本发明使用的疫苗的步骤，其中所述疫苗中包含的抗原来源于所述病原体，并且所述禽类具有对所述抗原有反应的抗体。
根据本发明使用的疫苗通常以适合施用于禽类的形式制备，并且与所需的应用途径相匹配，并且具有所需的效果。
取决于根据本发明使用的疫苗的应用途径，可能需要调整疫苗的组成。这完全在本领域技术人员的能力范围之内，并且通常涉及疫苗有效性或安全性的微调。这可以通过调整疫苗的剂量、数量、频率、途径，通过以另一种形式或制剂使用疫苗，或通过调整疫苗的一种赋形剂(例如稳定剂或佐剂)来实现。
原则上，根据本发明的疫苗可以通过不同的途径施用，并在其生命中的不同时间点给予禽类；特别地，该疫苗可施用于具有对本发明使用的重组蛋白中的抗原有反应的抗体的任何年龄的禽类。
当需要尽早施用时，可以在孵化当天(“第1天”)，或者甚至在卵内，例如在胚胎发育的约18天施用，所有这些都是本领域众所周知的。
自动将疫苗注射到受精卵中的工业化规模设备可以通过商业途径获得。这样能尽早提供保护，同时最大限度地降低劳动力成本。已知不同卵内接种途径，例如接种到卵黄囊、胚胎或尿囊液腔中；这些可以在需要时进行常规优化。
根据本发明使用的疫苗可以配制成适合注射的注射液，可以是在卵内注射或者肠外注射。
在一个实施方案中，根据本发明使用的疫苗被配制成选自以下的液体：悬浮液、溶液、分散液和乳剂。
在一个实施方案中，根据本发明使用的疫苗通过肠外途径施用。优选地，肠外途径是肌内或皮下途径。
本发明的重组蛋白或重组载体的确切用量并不是至关重要的，并且可以很容易地通过比较不同用量的保护效果来确定。
此外，当根据本发明使用的疫苗包含病毒载体时，其可以在接受疫苗接种的禽类体内复制，并且只需以足够在禽类中产生有效感染的量来施用。
例如，当根据本发明使用的病毒载体是重组HVT时，合适的接种剂量为每动物剂量1×10^1至1×10^5空斑形成单位(pfu)的本发明的HVT；优选地，1×10^2至1×10^4pfu/剂量，甚至更优选地，500至5000pfu/剂量；最优选地，约1000至约3000pfu/剂量。计数本发明的HVT病毒颗粒的方法是众所周知的。
当根据本发明使用的HVT载体与细胞相关时，这些量的HVT包含在受感染的宿主细胞中。
根据本发明使用的疫苗对于每只动物的剂量可以根据预期的应用途径进行优化：在卵内接种通常以0.01至0.5ml/卵的体积给药，及禽类肠外注射通常以0.1至1ml/禽类的体积给药。
根据本发明确定疫苗的免疫有效量或优化每动物剂量的疫苗体积都完全在本领域技术人员的能力范围之内。
将根据本发明使用的疫苗施用于禽类的剂量方案可以是单剂量或多剂量，以与疫苗制剂相匹配的方式，并且以免疫有效的用量。
优选地，将根据本发明使用的疫苗接种的施用方案纳入靶标禽类可能需要的其他疫苗的现有接种计划中，以减少对动物的压力并降低劳动力成本。这些其他疫苗可以同时、并行或顺序施用，接种方式应符合其注册用途。
本文对本发明的各个方面和实施方案进行了描述。应该理解的是，这些方面和实施方案的任何组合都被认为在本发明的范围内。然而，仅仅为了简洁起见，本文并没有对每一种可能的组合进行全面概述。
现在将通过以下非限制性实例对本发明作进一步说明。
实例
实例1：产生AIV-MDA阳性鸡
1.1.简介
为了能够测试血清反应阳性鸡的疫苗接种情况，创建了一个与本领域实际情况相似的动物模型。具体而言，通过使用添加佐剂的灭活疫苗对亲代母鸡重复进行肌内注射接种疫苗，产生了AIV MDA阳性后代。目的是使后代的HI滴度达到与本领域相似的水平：至少在5到7Log2之间。
1.2.材料和方法
给SPF白来航鸡(White Leghorn)蛋鸡接种疫苗，以产生MDA阳性的雏鸡。所有鸡均饲养在带地板和围栏的隔离室中。实验期间，所有鸡均可自由进食和饮水，并接受兽医监控。
1.2.1.制备用于产生MDA的疫苗
灭活AIV疫苗是通过在10日龄具有胚胎的SPF鸡蛋中繁殖H9N2亚型甲型禽流感病毒制成的。具体而言其为AIV毒株：A/Chicken/Pakistan-/UDL 01/2008(UDL-01)，参见：GenBank：ACP50708.1，以及Iqbal等人(2009,PLoS One,4:e5788)。感染后72小时，将鸡蛋冷藏于4℃，收获尿囊液并在3000rpm下离心20分钟净化，获得病毒。通过空斑试验或在Madin-Darby canine kidney(MDCK)细胞中测定TCID50来滴定病毒。
使用0.1％β-丙内酯对病毒进行化学灭活，然后在10日龄的具有胚胎的SPF鸡蛋中进行三次盲法传代，以确认病毒被灭活。随后，收获灭活的病毒并在4℃下以27000rpm超速离心2小时浓缩病毒。接下来，用液体轻质石蜡油对灭活的病毒进行佐剂处理，并配制成油包水乳剂。所得疫苗具有1040血凝单位(HAU)/ml的滴度。
1.2.2.母鸡的疫苗接种和MDA+雏鸡的产生
使用了一组40只17周龄的SPF白来航鸡蛋鸡。这些鸡被单独标记。它们接种了0.5ml添加佐剂的灭活H9N2病毒疫苗，以520HAU/剂在腿部经肌内注射施用。首剂疫苗于17周龄(T＝0)接种，接着第二和第三剂疫苗分别于20周龄(T＝首剂后3周)和41周龄(T＝首剂后24周)接种。
在首剂疫苗后的第0天和第5、11、18、29和36周，从母鸡的翼静脉采集血液样本，用于对发展中的抗-AIV HI滴度进行血清学监测。受精组中包括五只SPF公鸡，但这些公鸡不在实际研究范围内。
受精的鸡蛋在首剂疫苗接种后36周收集，并将这些蛋孵化至孵出。在孵化日(D0)处死10只雏鸡，以确定其MDA水平。它们的同窝孵化同类被用于MDA疫苗接种实验。
1.2.3.HI测定
按照国际指南(WHO 676全球流感监测网络：流感实验室诊断和病毒学监测手册，153(2011))进行HI试验。简而言之：将25μL血清与25μL PBS混合，制备两倍系列稀释的血清。然后，向稀释后的血清中加入4HA单位的流感病毒，并在37℃下孵育1小时。最后，在血清-病毒混合物中加入50μL的1％鸡红细胞，室温孵育45分钟。HI滴度表示为完全抑制4单位的病毒凝血活性的抗血清最高稀释度的倒数。
HI试验中使用的病毒是AIV H9N2病毒的UDL-01毒株。
1.3.结果
对母鸡进行过度免疫以产生AIV MDA+后代的结果如图1所示。用同源的UDL-01毒株进行了HI滴定。
开始后18周，因为观察到母鸡血清中的HI滴度下降，因此进行了第三次免疫接种。这导致母鸡的HI滴度非常高，直到最后一个采样点都保持在这一水平。
受精鸡蛋是在开始后36周(53周龄)收集的，当时母鸡的平均(n＝10)HI滴度为4096(12Log2)。
从这些结果中可以清楚地看出，并且如图1所示，T＝11周和T＝18周的HI滴度之间存在显著差异(p<0.05)，T＝18周和T＝29周的HI滴度之间也存在显著差异(p<0.001)。
在孵化当天和随着时间的推移在孵化后第1、7、14、21、28、35、42、56、70和84天，对这些母鸡的后代(未接种疫苗)进行了MDA诱导的HI滴度测定。结果见图2。HI滴度是用同源的UDL-01毒株进行测量的。
第1天，鸡的HI滴度平均值(n＝10)为588(9.2Log2)。该滴度在7日龄时略有下降(不显著)，但在14日龄时下降了一半以上，为181(7.5Log2)，之后又迅速下降：在第35天时，平均(n＝10)HI滴度为16(4Log2)，并且在42日龄时已检测不到任何HI滴度。
根据世界动物卫生组织OIE(www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pdf)的规定，防止AIV死亡的国际标准是32(5Log2)的HI滴度。本实验中使用的雏鸡在28日龄时HI滴度仍在此值附近，但这些鸡开始时远高于正常MDA水平。因此，通常需要额外的主动免疫。
为了确认雏鸡的抗体滴度，还通过ELISA进行了检测，以确保检测到的抗体是针对AIV H9HA的。按照生产商的说明使用了一种商业试剂盒：IDInfluenzaH9Indirect kit(ID Vet)，这是一种间接ELISA。发现的ELISA评分与HI评分的模式密切匹配。这证实了在雏鸡中检测到的HI滴度来自AIV H9HA的特异性抗体。
实例2：为MDA+禽类制备疫苗
2.1.简介
在血清反应阳性的禽类的疫苗接种中使用了三种疫苗。
阳性对照是经典的全病毒灭活疫苗：Influenza H9N2+ND(MSD AnimalHealth)。这种商业疫苗含有灭活的H9N2亚型AIV，毒株为A/Chicken/UAE/415/99(UAE)，以及灭活的新城疫病毒，毒株为Clone 30。
AIV H9N2毒株UDL-01和UAE的HA蛋白在其全长上进行比对时有94％的氨基酸同一性。
灭活疫苗中的NDV成分被认为不会对AIV疫苗接种的效力产生任何重大影响。
此外，使用了基于重组HA抗原的两种变体的疫苗：一种是非靶向疫苗，并且另一种是通过与CD83-scFv融合而靶向CD83的疫苗。后者是根据本发明使用的重组蛋白。
2.2.材料和方法
2.2.1.制备HA抗原表达构建体
利用产生鸡CD83抗体的小鼠杂交瘤(GenBank acc.nr.XM_040663657.1)获得vL和vH链序列。含有vL和vH序列的合成cDNA通过(Gly4Ser)4连接基肽序列连接并由Geneart(Thermo Fisher Scientific)进行商业化生产。然后利用NotI和XbaI限制位点将vH-连接基-vL cDNA克隆到黑腹果蝇表达载体：pMT-BIP-V5-HisTM(Version A,Thermo FisherScientific)中。该载体提供了黑腹黑蝇金属硫蛋白(MT)启动子和黑腹黑蝇免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)分泌信号，用于在S2细胞中进行表达和分泌。此外，该质粒还提供了多个克隆位点、用于重组蛋白检测的V5表位和用于重组蛋白纯化的6×His标签。
由此产生的名为pMT-BIP-CD83-scFv-V5-His的载体被用来插入H9HA基因的胞外结构域，其缺乏HA基因信号肽和TM结构域。利用KpnI和PacI限制位点，加入了29个氨基酸的三聚化Foldon序列，该序列来源于T4噬菌体的三聚蛋白纤维蛋白。该质粒包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列，受MT启动子的可操作控制。
本研究中使用的H9HA是通过引入H9N2病毒HA的共有序列而合成产生的，后者来自使用Minimum Sphere Consensus方法(Kim等人,2015,German Conference onBioinformatics的摘要,Dortmund,2015年9月27-30日,海报20:PeerJ PrePrints 3:e1350v1)对G1样H9病毒谱系的公共数据库中的2000多个H9HA序列进行的分析，该方法也与COBRA技术(Giles等人,2011,Vaccine,29,3043-3054)密切相关。
该合成的HA与H9N2病毒毒株UDL-01的HA胞外结构域(GenBank登记号:ACP50708.1,HA1:aa 19-338以及HA2:aa 339-560)具有98％的氨基酸序列同一性，这使其具有同源性，并针对S2细胞进行了密码子优化。
用类似的方法制备了不含CD83靶向信号的H9HA-Foldon抗原，以提供pMT-BIP-H9HA-Foldon-V5-His质粒。该质粒包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列，受MT启动子的可操作控制。
2.2.2.重组昆虫细胞的产生和选择
S2细胞(Thermo Fisher Scientific)在施耐德昆虫培养基(Merck GmbH LifeScience)中培养，添加10％v/v胎牛血清并在28℃下生长。细胞每周传代一次，通过在1200rpm离心10分钟，然后将细胞重新悬浮于新鲜的完全S2细胞培养基中进行。
使用果蝇表达系统(Life Technologies)生产和纯化重组蛋白。简而言之：使用磷酸钙转染法将质粒pMT-BIP-rH9HA-V5-His和pMT-BIP-rH9HA-CD83-scFv-V5-His分别共转染到S2细胞中。转染前，将1×10^6/mL的S2细胞预种在5mL完全S2细胞生长培养基中，并在28℃下培养6至16小时。通过加入60μL 2M CaCl2、32μg表达质粒DNA、1.5μg潮霉素B抗性质粒(pCoHYGRO，Life Technologies)和无菌水使总体积达到500μL来制备转染溶液。将转染溶液缓慢加入等体积的2×Hepes缓冲生理盐水(HBS)中，并室温孵育30分钟。将得到的溶液缓慢滴加到预接种的S2细胞中，并在28℃下孵育24小时。转染后24小时，将转染培养基换成新鲜的完全S2细胞培养基，并在28℃再孵育3天。
通过抗生素选择产生稳定的S2转染细胞：每周添加含250μg/mL潮霉素B的完全生长培养基，持续至少4周。
随后，通过有限稀释获得单细胞克隆(Zitzmann等人,2010,Biotechnol.Reports,19,e00272)。简而言之：将2×10^3个转染后的S2细胞与10^6个伽马射线照射过的亲代S2细胞混合，后者作为饲养细胞。将100μL的该细胞混合物接种到96孔板的每个孔中。在28℃下培养4周后，每孔中的单克隆清晰可见。每个质粒构建体大约可筛选出10-15个单克隆。通过间接ELISA检测H9HA蛋白，选择表达最高量重组蛋白的单个克隆。
2.2.3.重组抗原的表达和纯化
然后对选择的转染S2细胞克隆进行大规模培养。简言之：表达大量HA重组蛋白的单个克隆在含有400mL Ex420无血清培养基(Merck GmbH Life Science)的2升滚瓶(Corning)中生长，用于表达和纯化。通过添加终浓度为500μM的CuSO4诱导所用质粒中的金属硫蛋白启动子。诱导后4天后，通过1200rpm离心20分钟来收获细胞上清液，并透析以除去过量的铜离子。总共收集约2升蛋白质表达上清液，并在纯化前通过0.22μM滤器(MerckGmbH Life Science)过滤。
His标签的使用允许通过金属亲和柱色谱法纯化重组蛋白。简而言之：将透析和过滤后的含有重组蛋白的上清液装入10mL ProfinityTMIMAC无电荷树脂柱(Bio-Rad)，并用5倍柱体积的洗涤缓冲液进行洗涤。然后用含不断增加的咪唑浓度(25、50、100或500mM)的洗脱缓冲液洗脱铜结合的蛋白质。纯化的蛋白质在10％PAA凝胶上进行SDS-PAGE分析，然后进行考马斯亮兰染色。将蛋白质组分合并，并使用15mL Amicon Ultra-15TM离心过滤柱(3kDaMWCO，Merck GmbH Life Science)，在4600rpm下离心30分钟进行浓缩。使用Pierce BCAProtein Assay KitTM(Life Technologies)试剂盒，根据制造商说明书测定所纯化蛋白质的浓度。
使用凝血试验确认所产生的重组蛋白的H9HA活性。简言之，将35μg重组蛋白在V底96孔板中在PBS中2倍系列稀释。将鸡红细胞在PBS中稀释至1％，然后加入每个孔中。然后将96孔板在4℃孵育1小时，在生物安全柜中倾斜90°以使凝血现象可视，并进行评分。
2.2.4.疫苗乳剂的制备
重组HA抗原疫苗配制成油包水型乳剂，以轻质液体石蜡油(52)作为佐剂，并包含聚山梨醇酯80(80)和山梨醇单油酸酯(80)作为乳化剂。疫苗的水:油重量比为45:55。所有疫苗在使用前均储存于4℃。
重组HA疫苗0.2毫升的每剂量中含有：35μg的非靶向HA抗原或49μg的靶向抗原。这一差异是为了提供等摩尔量，以补偿scFv的添加。
实例3：血清反应阳性禽类的疫苗接种
3.1.简介
由于对AIV感染和疾病的保护基本上是由血清学决定的，而主要的AIV中和抗体是针对HA抗原的抗体，因此针对抗HA抗体发展的血清学测试，即HI滴度测定，是体内AIV保护的极佳预测指标。
按实例1所述产生的雏鸡被用于疫苗接种实验：一组在第1天接种疫苗，这些雏鸡具有非常高的平均MDA HI滴度，为588(9.2Log2)，称为MDA++组。另一组在14日龄时才接种疫苗，此时MDA水平有所下降，这些雏鸡具有中等的平均MDA HI滴度，为181(7.5Log2)，称为MDA+组。
这种方法允许分别测试和比较抗体干扰对于靶向或非靶向HA抗原的疫苗接种的效果的“最坏情况”和“平均情况”。为了进行比较，加入了经典的H9N2灭活疫苗。此外，研究还包括一组未接种疫苗的雏鸡，以跟踪抗AIV H9HA MDA水平的自然下降情况。
3.2.材料和方法
3.2.1.动物、样本和疫苗接种
所使用的AIV H9HA MDA阳性雏鸡是按实例1所述方法获得的。所用疫苗如实例2所述。
为了避免环境中病原体的侵入，这些雏鸡被饲养在正压隔离室中，进入气流采用高效微粒空气(HEPA)过滤。
孵化后，只使用看起来健康正常的雏鸡。这些雏鸡在到手后被分配到各组，并被单独编号。每天进行临床观察，以监测健康状况和活动表现。每个试验组有10只动物。
所有疫苗在使用时都处于环境温度下，并在使用前充分混合以确保均匀性。
所有雏鸡只接受一次疫苗接种，在1日龄或14日龄时接种。疫苗施用采用此类疫苗的标准途径：皮下注射(sc)。使用0.25ml/剂体积的疫苗，因为这是注册的剂量；重组HA抗原疫苗以0.2ml/剂注射。
Nobilis流感H9N2+ND疫苗在第1天注射给MDA++雏鸡。H9HA-Foldon和H9HA-Foldon-CD83-scFv疫苗均在第1天注射给“MDA++”雏鸡，并且随后注射给14日龄的“MDA+”雏鸡。
实验开始后每周采集一次血样直至第6周，并且在开始后第8周、第10周和第12周每两周采集一次，以确定疫苗接种诱导的血清反应。
在安乐死后采集第1天和第7天的血样；第14天后血样从翼静脉采集。在动物体重允许的情况下，采集的血样量为2-3ml。血液样本被放置在室温下凝结，然后离心分离血清。血清样本在56℃下热灭活30分钟，并在-20℃下保存，直至使用。
3.3.结果
图3和图4分别显示了本实验中从MDA++和MDA+雏鸡采集的血清样品的HI滴定结果。
未接种疫苗的对照显示出HI滴度水平和降解模式，如实例1和图2所述。
阳性对照是在1日龄时接种全病毒灭活疫苗(Nobilis流感H9N2+ND)的MDA++雏鸡。尽管接种了疫苗，但它们的HI滴度仍持续下降，而且检测不到疫苗接种反应。这一点非常重要，因为经典疫苗中的MDA和HA抗原是异源的：MDA是针对与UDL-01毒株H9HA非常相似的HA抗原诱导的，而Nobilis疫苗中含有异源的H9HA抗原，即来自UAE毒株，它与UDL-01H9HA蛋白具有94％的氨基酸同一性。因此，由于HA抗原之间的这种差异，人们会预期抗体干扰水平较低。但显然，MDA++雏鸡体内的HI水平非常高，甚至干扰了异源H9HA疫苗的效果。
使用靶向(H9HA Foldon-CD83-scFv)和非靶向(H9HA Foldon)HA抗原进行疫苗接种，其诱导的HI滴度在MDA++和MDA+雏鸡中均显示出显著差异。
无论是MDA++雏鸡还是MDA+雏鸡，接种非靶向HA抗原的雏鸡的HI滴度稳步下降，并且在接种疫苗后的任何时间点其HI滴度都没有显著上升。
但是，靶向HA抗原可诱导非常高的HI滴度。在MDA++组中，HI滴度从很高的起始值(9.7log2)开始下降，但之后HI滴度显示出显著而稳定的增长：从疫苗接种后(p.v.)4周开始可见，p.v.5周时达到显著水平，并且p.v.12周时显著增长至9.7log2。这表明，即使在同源MDA水平非常高的情况下，也可以在1日龄接种这种疫苗，而且其仍然能够对AIV感染和疾病产生强大的保护作用。
在MDA+组中，靶向HA疫苗的HI滴度显示出从接种疫苗后一周开始高HI滴度的迅速诱导。接种疫苗后4周开始，HI滴度平均可达到1835(10.8Log2)。
在两个试验组中，靶向疫苗都是唯一能够诱导HI滴度显著升高的疫苗。此外，在靶向疫苗组中，MDA++和MDA+组测得的最低HI滴度分别为6.2Log2和6.9Log2。这表明，所有接种这种类型的疫苗的雏鸡在实验期间都保持远高于5Log2保护阈值。
这种免疫的快速起效，以及长持续时间完美地弥补了MDA水平的下降，且不会在保护方面留下缺口期。
我们再次对血清进行了间接ELISA，其证实所有抗体都是H9HA特异的。
实例4：靶向非HA抗原
实验与上述制备根据本发明使用的重组蛋白的实验基本相似，但包含除AIV HA之外的另一种抗原。它们是：AIV HN、NDV F、NDV HN、IBDV VP2和IBV刺突蛋白。简而言之：母鸡可以接种针对这些病原体之一的合适疫苗：AIV、NDV、IBDV或IBV；这些疫苗一般都可商购。
母鸡可接种2或3次疫苗接种，从产蛋前开始，并在产蛋期持续接种。可以检查母鸡的特异性抗体滴度是否足够高。然后收集并孵化鸡蛋，并且检查雏鸡针对所研究的病原体是否具有足够高的MDA水平。
如上所述，可以制备包含根据本发明使用的重组蛋白的疫苗，例如通过构建表达质粒，其包含编码待测试抗原之一的核苷酸序列。此外，还将包含一个结合结构域，例如针对禽类APC表面蛋白(例如CD83、CD11c或Dec-205)的scFv。可以制备没有结合结构域的相似构建体作为对照，以评估将抗原靶向APC的效果。
质粒可以如上所述转染到S2细胞中，这些细胞可以被选择、扩增并用来表达抗原(有或没有靶向信号)。然后可以收获重组蛋白。
CD83-scFv的一个示例是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽。对CD11c或Dec-205具有特异性的scFv的一个示例是包含SEQ ID NO:16或17所示的氨基酸序列的肽。
包含选自以下的氨基酸序列的要表达的抗原的示例为：
-对于AIV H5HA：SEQ ID NO:4；
-对于AIV H7HA：SEQ ID NO:5；
-对于NDV F：SEQ ID NO:18；
-对于NDV HN：SEQ ID NO:19；
-对于IBDV VP2：SEQ ID NO:20；
-对于IBV刺突蛋白：SEQ ID NO:21。
编码这些抗原的相应核酸序列优选地根据S2细胞的密码子使用表进行密码子优化。在表达构建物中，可以在需要时添加额外元素，例如信号序列、连接基和一个或多个标签，以促进表达、分泌和纯化。
接下来，将用这些重组蛋白给具有特定MDA的雏鸡进行疫苗接种，并随着时间的推移对它们的血清学进行监测。
由于已知这些病原体与体内保护相关的特异性抗体水平，因此在接种疫苗后的不同时间对抗体水平进行血清学检测，就能很好地了解对来自这些病原体的抗原呈血清反应阳性的禽类进行靶向疫苗接种的效果。
SEQ ID NO:4的H5HA序列来源于AIV分离株：A/duck/Egypt/SS19/2017，H5N8，GenBank acc.nr.AXY66755.1的HA。选取的是HA胞外结构域的511个氨基酸：HA1：17-340和HA2：346-530。多碱基切割序列被修饰：从PLR到PQG，并且减少了精氨酸的数量。
SEQ ID NO:5的H7HA序列来源于AIV分离株：A/chicken/Jiangian/JX4/2017，H7N9，GenBank acc.nr.ARG44105.1的HA。选取的是HA胞外结构域的507个氨基酸：HA1：19-339和HA2：1-186，具有修饰的多碱基切割序列：从PKR到PKG。
SEQ ID NO:18的NDV F序列是来自公共数据库中avian avulavirus 1序列中的1200多个F氨基酸序列的共有序列，使用了本文所述的MScon技术。共有F蛋白与最近的天然亲缘种：avian orthoavulavirus 1F蛋白，GenBank acc.nr.AHX74055.1具有98.5％的氨基酸相似度。从第31-500位氨基酸选择F蛋白的胞外结构域。
SEQ ID NO:19的NDV HN序列是一个共有序列，以GenBank acc.nr.AXK59828.1的Avian orthoavulavirus 1的HN蛋白为基础，结合公共数据库中的一些HN序列，使用本文所述的MScon技术得到。从HN中选取了第47-571位的氨基酸。
SEQ ID NO:20的IBDV VP2蛋白代表GenBank acc.nr.AMA19770.1的IBDV VP2蛋白的第9-452位氨基酸。
SEQ ID NO:21的IBV刺突蛋白代表GenBank acc.nr.ARS22410.1的IBV刺突蛋白的第1-1096位氨基酸。通过两个氨基酸置换：Q859P和L860P稳定了该刺突蛋白。
附图说明
图1
为产生AIV MDA+后代而过度免疫的母鸡的抗体滴度结果展示。详情见实例1。
纵轴表示在使用灭活-添加佐剂的AIV H9N2病毒疫苗(UDL 01/08)进行免疫接种后，通过HI试验测得的母鸡血清中HI滴度的平均值(n＝10)。横轴上的时间点以实验开始后的周数表示(第0天＝17周龄)。箭头表示在实验开始后的0、3和24周接种疫苗。
受精鸡蛋在实验开始后36周收集；方框表示母鸡产下用于后续实验的鸡蛋时血清中HI滴度的平均值(n＝10)：HI＝12Log2(4096)。
数据以平均数(柱)和标准差(误差条)表示。星号代表实验开始后11周和18周以及实验开始后18周和29周的HI抗体滴度之间存在显著差异，其中：*＝p<0.05，***＝p<0.001。
图2
来自三次接种疫苗的母鸡的未接种疫苗后代的MDA来源的HI滴度结果展示。详情见实例1。
抗-H9HA的MDA滴度是在孵化后第1、7、14、21、28、35、42、56、70和84天的血清样本中通过HI试验测定的。HI滴度表示为完全抑制4个HA单位病毒凝血活性的血清的最高稀释度的倒数。数据以均数±SD表示，并通过单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行分析。具有统计学意义的差异显示为：****＝p<0.0001。
水平虚线表示HI滴度为32的最低保护水平(5Log2)。
图3
在1日龄接种疫苗的雏鸡的HI滴度结果展示，这些雏鸡具有高水平的MDA(MDA++)。详情见实例3。
纵轴表示HI滴度，横轴表示接种疫苗后的天数。注：纵轴是间断的，以便显示检测到的极高HI滴度。
各组MDA++雏鸡(n＝10)在1日龄接种三种疫苗中的一种：全灭活病毒疫苗(Nobilis流感H9N2+ND)、非靶向HA抗原(H9HA Foldon)或CD83靶向HA抗原(H9HA Foldon-CD83-scFv)。作为对照，一组MDA++雏鸡未接种任何疫苗。
抗H9HA抗体滴度通过HI试验测定，在HI试验中使用UDL-01病毒。
数据以平均值(柱)和SD(误差条)表示。具有统计学意义的差异用星号表示，其中：***＝p<0.001，*＝p<0.1。
图4
在14日龄接种疫苗的雏鸡的HI滴度结果展示，这些雏鸡具有中等水平的MDA(MDA+)。详情见实例3。
与图3的展示类似，只是没有接种Nobilis疫苗的组。
Claims (12)
1.重组蛋白，其包含抗原和能够与禽类抗原呈递细胞(APC)上的细胞表面蛋白结合的结合结构域，用于保护具有对所述抗原有反应的抗体的禽类免受所述抗原来源的病原体侵害的方法中。
2.根据权利要求1所述使用的重组蛋白，其特征在于，所述禽类APC是树突状细胞。
3.根据权利要求1或2所述使用的重组蛋白，其特征在于，所述细胞表面蛋白是CD83。
4.根据权利要求1-3中任一项所述使用的重组蛋白，其特征在于，所述结合结构域是单链可变片段(scFv)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述使用的重组蛋白，其特征在于，所述抗原选自：传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2(VP2)、新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白、NDV血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白、传染性支气管炎病毒(IBV)刺突蛋白、禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)蛋白及AIV神经氨酸酶(NA)蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述使用的重组蛋白，其特征在于，所述抗原包含选自SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列。
7.重组载体，其能够表达如权利要求1-6中任一项所定义的重组蛋白，用于保护具有对所述重组载体表达的重组蛋白中所包含的抗原有反应的抗体的禽类免受所述抗原来源的病原体侵害的方法中。
8.权利要求1-6中任一项所定义的重组蛋白或权利要求7所定义的重组载体在制备用于保护禽类免受病原体侵害的疫苗中的用途，其中包含在所述重组蛋白中或包含在由所述重组载体表达的重组蛋白中的抗原来源于所述病原体，其特征在于所述禽类具有对所述抗原有反应的抗体。
9.疫苗，其包含权利要求1-6中任一项所定义的重组蛋白或包含权利要求7所定义的重组载体，以及药学上可接受的运载体，用于保护具有对包含在所述重组蛋白中或包含在由所述重组载体表达的重组蛋白中的抗原有反应的抗体的禽类免受所述抗原来源的病原体侵害的方法中。
10.根据权利要求9所述使用的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。
11.权利要求1-6中任一项所定义的重组蛋白、或权利要求7所定义的重组载体、或权利要求9或10所定义的疫苗保护禽类免受病原体侵害的用途，其中包含在所述重组蛋白中或包含在由所述重组载体表达的重组蛋白中的抗原来源于所述病原体，其特征在于所述禽类具有对所述抗原有反应的抗体。
12.保护禽类免受病原体侵害的方法，所述方法包括向所述禽类施用权利要求9或10中所定义的疫苗的步骤，其中所述疫苗中包含的抗原来源于所述病原体，并且其中所述禽类具有对所述抗原有反应的抗体。
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